DE19949594A1

DE19949594A1 - Rekombinante attenuierte Listerien zur Immuntherapie

Info

Publication number: DE19949594A1
Application number: DE19949594A
Authority: DE
Inventors: Dirk Schadendorf; Annette Paschen; Trinad Chakraborty; Eugen Domann
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1999-10-14
Filing date: 1999-10-14
Publication date: 2001-04-26
Also published as: WO2001027295A1; AU1993701A; EP1228224A1

Abstract

Beschrieben werden Listeria-Expressionsvektoren, die die Expression der humanen Tumorantigene Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 und Trp-2 oder davon abgeleiteter antigener Epitope erlauben, sowie diese Expressionsvektoren enthaltende, attenuierte Listeria-Bakterien, wobei es sich vorzugsweise um Bakterien des Stamms Listeria monocytogenes handelt. Diese Bakterien können zur prophylaktischen, adjuvanten oder therapeutischen Immuntherapie, beispielsweise zur Behandlung des malignen Melanoms verwendet werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Listeria- Expressionsvektoren, die die Expression der humanen tumorassoziierten Antigene Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 und Trp-2 erlauben, sowie diese Expressionsvektoren enthaltende, attenuierte Listeria-Bakterien, wobei es sich vorzugsweise um Bakterien des Stamms Listeria monocytogenes handelt. Diese Bakterien können zur prophylaktischen, adjuvanten oder therapeutischen Immuntherapie, beispielsweise zur Behandlung des malignen Melanoms, verwendet werden.

Gegenwärtig stützt sich die Tumortherapie im wesentlichen immer noch auf die drei Hauptsäulen: Chirurgie, Chemo-, adjuvante Chemo- und Radiotherapie. Allerdings haben diese Therapien die folgenden gravierenden Nachteile: (a) Sie sind im metastasierenden Krankheitsstadium bzw. als vorbeugende Therapie nach Entfernung des Primärtumors kaum wirksam, d. h. eine Heilung im Metastasierungsstadium ist nicht mehr möglich, (b) sie sind im Bezug auf das klinische Ansprechen, auf die Dauer des rezidivfreien Intervalls, die Gesamtüberlebenszeit sowie die Lebensqualität des Patienten sehr unzureichend und (c) sie weisen eine Reihe von teilweise schwerwiegenden Nebenwirkungen auf, beispielsweise eine beträchtliche Schädigung von normalem Gewebe. Darüberhinaus gibt es bisher keine präventiven Möglichkeiten, die beispielsweise auf einer "Schutzimpfung" beruhen könnten. Dies wäre aber gerade hinsichtlich des malignen Melanoms sehr wünschenswert.

Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, Mittel zur Tumortherapie, insbesondere zur Therapie des malignen Melanoms, bereitzustellen, die nicht die vorstehend beschriebenen Nachteile der gegenwärtigen Therapieverfahren ausweisen, insbesondere eine präventive Anwendung erlauben, als Adjuvanz nach Entfernung eines Primärtumors wirksam sind bzw. im Stadium der Fernmetastasierung von therapeutischem Nutzen sind.

Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht.

Bei den erfindungsgemäßen Listeria-Expressionsvektoren bzw. den rekombinanten attenuierten Listeria-Bakterien handelt es sich um gentherapeutisch wirksame Konstrukte, die zur prophylaktischen oder im Rahmen einer adjuvanten oder therapeutischen Tumorbekämpfung, beispielsweise beim malignen Melanom, eingesetzt werden können. Dabei kann durch eine vorzugsweise orale Immunisierung eine tumorspezifische Immunantwort erzeugt, d. h. durch das körpereigene zelluläre Immunsystem kann eine gezielte Bekämpfung der Tumorzellen erreicht werden. Diese Behandlung kann außerdem bei Bedarf mit Behandlungsverfahren wie Chemotherapie oder Radiotherapie kombiniert werden, vorzugsweise ersetzt sie jedoch die letzteren Therapieformen.

Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Befund, daß mittels einer Immunisierung, vorzugsweise oralen Immunisierung, unter Verwendung der erfindungsgemäßen rekombinanten attenuierten Listerien als Synthese- und Transportvehikel für tumorassoziierte Antigene eine prophylaktische bzw. therapeutische Behandlung von Tumoren möglich ist. Die Expression der einzelnen tumorassoziierten Antigene erfolgt dabei bevorzugt als Fusionsproteine, bei denen beispielsweise eine Listerien-spezifische Signalsequenz an den N-Terminus des Antigens fusioniert ist. Nach Expression werden diese Fusionsproteine aus den Bakterienzellen in die Umgebung exportiert. Nach oraler Applikation passieren die Bakterien das mukosale Epithel des Intestinaltrakts im Bereich der Peyerschen Plaques und werden durch die dort lokalisierten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) des Immunsystems durch Phagocytose aufgenommen. Die Listerien liegen daher zunächst im Phagosom der infizierten Zelle vor, in das sie die Fusionsproteine sekretieren, die damit einer Prozessierung zur Generierung von HLA Klasse I und HLA Klasse II Peptiden zur Verfügung stehen. Aufgrund des natürlichen Infektionszyklus können sowohl das Wildtyp-Listerien-Bakterium als auch definierte attentuierte Mutamen (sofern sie keine Deletion des hly-Gens aufweisen) in das Cytosol der Zelle übertreten. Die ins Cytosol sekretierten Fusionsproteine sind wiederum einer Prozessierung zur Generierung von HLA-Klasse I Peptiden zugänglich. Die in beiden Zellkompartimenten (Phagosom und Cytosol) generierten Peptide stehen somit zur Beladung von HLA I bzw. HLA-Klasse II Molekülen zur Verfügung. Der Peptid-HLA- Komplex wird an der Zelloberfläche der APCs präsentiert und es wird eine spezifische T-Zellantwort (CD4+ und CD8+ T-Zellen) gegen die exprimierten tumorassoziierten Antigene induziert, d. h. eine zelluläre cytotoxische Immunantwort des körpereigenen Immunsystems gegen einen Tumor. Dadurch werden die Tumorzellen gezielt als entartet erkannt und abgetötet. Die Vorteile dieses Vorgehens liegen u. a. darin, daß das körpereigene Immunsystem gezielt in Richtung einer Zerstörung des Tumors mobilisiert wird. Es stellt ein einfaches Immunisierungsverfahren dar, da die APCs die tumorassoziierten Antigene mittels einer bakteriellen Infektion erhalten, d. h. bei dem erfindungsgemäßen Vorgehen ist keine arbeitsintensive ex-vivo-Modifikation autologer APCs erforderlich, da ein natürlich vorkommender Infektionsprozess zur Modifizierung der Zellen des Immunsystems ausgenutzt wird.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung einen Listeria- Expressionsvektor zur Immuntherapie, wobei der Listeria- Expressionsvektor folgende DNA-Sequenzen funktionell verknüpft umfaßt: (a) einen in Listeria aktiven Promotor; und (b) eine für humane Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 oder Trp-2 codierende DNA-Sequenz oder davon abgeleitete antigene Epitope.

Der hier verwendete Ausdruck "in Listeria aktiver Promotor" bezieht sich auf alle Promotoren, die in Listeria die Expression der tumorassoziierten Antigene erlauben. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Promotoren von Listeria- monocytogenes-Genen, beispielsweise konstitutive oder unter den Bedingungen der Infektion aktivierte Promotoren. Besonders bevorzugt sind Promotoren, die zu einer starken Expression des gewünschten Antigens führen. Dieser Begriff bezieht sich auch auf Promotor-Fragmente oder Promotoren mit modifizierten Sequenzen, die noch biologisch aktiv sind. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Promotor für die Listeria-Expressionsvektoren um einen Promotor des hly-, actA-, plcA-, plcB- oder mpl-Gens, die jeweils unter den Bedingungen der Infektion aktiv sind und die die Listeria- Proteine Haemolysin, ActA, Phosphotidylinositol-spezifische Phospholipase C, Phosphatidylcholin-spezifische Phospholipase C bzw. Metalloprotease codieren. Diese Promotoren sind bereits in der Literatur ausführlich beschrieben:

- actA/plcB-Promotor: Domann et al., (1992), EMBO J. 11: 1981-1990 (Die Transkription des actA- und des plcB-Gens wird durch einen gemeinsamen Promotor gesteuert)
- hly Promotor: Domann et al., (1989), Nucleic Acids Res. 17: 6406
- plcA-Promotor: Domann et al., (1991), Mol. Microbiol. 5: 361-366
- mpl-Promotor: Domann et al., (1991), Infect. Immun. 59: 65-72.

Der hier verwendete Ausdruck "für humane Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 oder Trp-2 codierende DNA-Sequenz" betrifft jede DNA-Sequenz, die das native Protein ganz oder teilweise codiert. Diese DNA-Sequenzen sowie die abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind beispielsweise beschrieben in:
humanes Tyrosinase-Gen: Genbank Accession Nr. M27160
humanes trp-1-Gen: Genbank Accession Nr.: AF001295
humanes trp-2-Gen: Genbank Accession Nr.: D17547
humanes MelanA/MART-1-Gen: Genbank Accession Nr.: U06452.
Hierzu wird außerdem auf die Fig. 1-4 verwiesen.

Bei den Antigenen Tyrosinase, Trp-1, Trp-2 und MelanA/MART-1 handelt es sich um Differenzierungsantigene melanocytären Ursprungs. Da diese Antigene ausschließlich in melanocytären Zellen (Melanocyten) im Rahmen der Melanogenese exprimiert werden, sind sie außerordentlich gut geeignet, um eine spezifische Immunantwort gegen Melanomzellen zu generieren. Diese Differenzierungsantigene haben zudem den Vorteil, daß sie von bis zu 100% der Zellen eines pigmentierten Tumors (Melanom) exprimiert werden, wohingegen nur ca. 50% der Melanome Cancer-Testis Antigene, wie z. B. MAGE-1, exprimieren. Die Enzyme Tyrosinase, Trp-1, Trp-2 katalysieren den Prozeß der Pigmentbildung (Malaninbiosynthese). Die Biosynthese findet in den spezifischen Organellen, den Melanosomen statt, in deren Matrix auch das MelanA/MART-1-Protein lokalisiert ist.

Der Ausdruck "für humane . . . codierende DNA-Sequenz" betrifft darüber hinaus auch DNA-Sequenzen, die solche Formen von humaner Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 bzw. Trp-2 codieren, die Veränderungen gegenüber der nativen Form, d. h. beispielsweise Deletionen, Additionen oder Austausche von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure(n) oder die Anheftung eines Ubiquitin-Restes aufweisen oder veränderte Oligosaccharidseitenketten, wobei ihre antigenen Eigenschaften ganz oder teilweise bzw. in der gewünschten Weise bleiben, d. h. sie weisen beispielsweise die in den nachstehenden Beispielen hinsichtlich der Behandlung eines Tumors beschriebenen Eigenschaften auf. Zu den Austauschen zählen vorzugsweise "konservative" Austausche von Aminosäureresten, d. h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z. B. die Substitution eines hydrophoben Rests (z. B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen hydrophoben Rest, oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z. B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäure gegen Asparaginsäure etc.). Zu den Austauschen zählen auch "nicht-konservative" Austausche, die die antigenen Eigenschaften der Proteine bzw. einzelner abgeleiteter Proteinfragmente (Peptide) erhalten oder sogar verstärken können. Dies kann durchaus die biologische bzw. enzymatische Aktivität des nativen Proteins verändern. Deletionen können zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen, d. h., denen beispielsweise Aminosäuren am N- oder C-Terminus fehlen. Die vorstehenden Varianten betreffen auch Varianten, die im Vergleich zu der ursprünglichen Form eine bessere Wirksamkeit hinsichtlich der Tumorbekämpfung aufweisen. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Aminosäuresequenz bzw. entsprechenden Nucleinsäuresequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989). Der Fachmann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nucleinsäuresequenz codiertes Protein bzw. Peptid noch über die erwünschten antigenen Eigenschaften der Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 bzw. Trp-2 (ganz oder teilweise) verfügt. Diese antigenen Eigenschaften lassen sich für die Proteine/Peptide anhand der Stimulierung Antigen-spezifischer cytotoxischer T- Zellinien feststellen. Im Falle der Peptide bietet sich außerdem eine Überprüfung ihrer HLA-Bindungseigenschaften im Rahmen von FACS-Analysen an. Vorzugsweise sollten die Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1, Trp-2 bzw. die vorstehenden Varianten codierenden DNA-Sequenzen eine Transkriptionsterminationssequenz und eine Translationsterminationssequenz zur Gewährleistung einer stabilen und korrekten Transkription bzw. Translation aufweisen.

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Listeria- Expressionsvektoren, u. a. zur Ligation der Fragmente für den Promotor und die tumorassoziierten Antigene und Insertion in den Vektor, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in-vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in-vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Ausubel und Frederick (1991), Current Protocols in Molecular Biology (J. Wiley & Sons, New York) beschrieben sind.

Am meisten bevorzugt sind Listeria-Expressionsvektoren, bei denen die für humane Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 bzw. Trp-2 codierende DNA-Sequenz mit einer ein Listeria- Protein(fragment) codierenden DNA-Sequenz so verknüpft ist, daß ein Fusionsprotein codiert wird. Vorzugsweise stellt der von dem Listeria-Protein stammende Anteil den N-terminalen Anteil des Fusionsproteins dar. Verschiedene Listeria-Proteine bzw. Fragmente davon sind zur Herstellung dieses Fusionsprotein geeignet, beispielsweise die vorstehend hinsichtlich der Listeria-Promotoren offenbarten Gene. Noch mehr bevorzugt sind Listeria-Expressionsvektoren, bei denen der Listeria-Protein-Anteil des Fusionsproteins von einem an der Lyse der Wirtsvakuolen oder an Bewegungen der Bakterien in der Wirtszelle beteiligten Protein stammt, vorzugsweise Listeriolysin O (Lyse), ActA (intrazelluläre Bewegung) oder PI-PLC (Lyse). Der Vorteil von Listeriolysin O, eine Listeria- Phospholipase oder das ActA-Protein zur Konstruktion von Fusionsproteinen einzusetzen, liegt darin, daß diese Proteine sekretiert werden. Im Falle einer Infektion gelangen diese Fusionsproteine daher bevorzugt ins Phagolysosom bzw. ins Cytosol der infizierten Zelle, d. h. in die Zellkompartimente, in denen die Generierung von HLA-Klasse I und HLA-Klasse II präsentierten Peptiden stattfindet. Die Fusionsproteine können vorzugsweise wie folgt aussehen:

a) lediglich die sekretorische Signalsequenz eines Listerien-spezifischen Proteins wird mit dem Antigen fusioniert
b) die sekretorische Signalsequenz inklusive eines Ausschnitts der sich daran anschließenden nativen Proteinsequenz wird mit dem Antigen fusioniert,
c) ein kurzes Fragment des Antigens wird unter Aufrechterhaltung des Leserahmens in die Sequenz des genannten Listerien-Proteins eingebaut.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Listeria- Expressionsvektoren, bei denen der Listeria-Protein-Anteil des Fusionsproteins eine Signalsequenz eines sezernierten Listeria-Proteins umfaßt. Vorzugsweise stammt die Signalsequenz vom Listeria-Haemolysin, einer Listeria- Phospholipase oder dem ActA-Protein.

Ausgangsvektor für die Herstellung des erfindungsgemäßen Listeria-Expressionsvektors ist jeder Vektor, der in Listeria zur Expression der gewünschten Antigene führt. Dabei kann es sich um einen autosomalen oder stabil in das Listeria-Genom inserierenden Vektor handeln. Vorzugsweise ist der Ausgangsvektor ein "Shuttle"-Vektor, der sich in einem weiteren Wirt, beispielsweise E. coli, vermehren läßt. Derartige Vektoren sind beispielsweise pKSV7 (Frankel et al., 1995, J. Immunol. 155: 4775-4782), pCGU34 (Paglia et al., 1997, Eur. J. Immunol. 27: 1570-1575), pAUL-A (Niebuhr et al., 1997, EMBO J. 16: 5444-5445) und pLIGA160.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die erfindungsgemäßen Listeria-Expressionsvektoren (autosomal oder stabil in das Genom integriert, beispielsweise über homologe Rekombination) enthaltende rekombinante, attenuierte Listeria-Bakterien, vorzugsweise Listeria monocytogenes oder Listeria innocua, wobei letzterer sich insbesondere zur Verstärkung einer Immunantwort eignet. Die Auswahl geeigneter Listerien kann für den Fachmann nach üblichen Kriterien hinsichtlich des Einsatzes von Bakterien für die Vakzinierung erfolgen, d. h. die für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendbaren Listerien sollten über Immunogenizität verfügen, jedoch ausreichend attenuiert sein, um die sichere Anwendung beim Menschen zu erlauben. Dazu ist es nötig, daß der Mutantenphänotyp der Listerien absolut stabil ist, was üblicherweise nur durch die Erzeugung chromosomaler Deletionen möglich ist. Zu den Beispielen für attenuierte Mutanten zählen Mutanten, die hinsichtlich der Ausbreitung von Zelle zu Zelle defizient sind, actA-negative Mutanten, die hinsichtlich des intrazellulären Wachstums defizient sind, hly2- (Listeriolysin)-negative Mutanten, sowie Mutanten, die zumindest hinsichtlich eines Phospholipase-Gens defizient sind (Guzmán et al., Infect. Immun. 63 (1995), 3665-3673). Zu den Beispielen für geeignete Listeria-Stämme zählen die Δmp12- Mutante (Paglia et al., Eur. J. Immunol. 27: 1570-1575). Geeignete attentuierte Listeria-Stämme sind auch in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP98/08096 beschrieben. Verfahren zur Transformation der vorstehenden Listerien mit den erfindungsgemäßen Listeria-Expressionsvektoren, beispielsweise Elektroporation, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der die tumorassoziierten Antigene (gegebenenfalls als Fusionsproteine) codierenden DNA-Sequenzen unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Listeria-Expressionsvektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein die erfindungsgemäßen rekombinanten attenuierten Listeria- Bakterien enthaltendes Arzneimittel (Impfstoff) bzw. deren Verwendung zur Immuntherapie. Diese Immuntherapie eignet sich zur Behandlung pigmentierter Tumorarten, vorzugsweise zur Therapie des malignen Melanoms oder des malignen Schwannoms (Untergruppe der Neuroblastome). Diese Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann beispielsweise zur oralen Verabreichung in Form eines Elixiers, einer Kapsel oder Suspension verabreicht werden. Die geeignete Dosierung und die Art der Verabreichung, vorzugsweise orale, intravenöse oder intraperitoneale Verabreichung werden von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängen von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium und Schweregrad des Tumors, der Art der Verabreichung etc. Jedenfalls muß die Verabreichung in einer wirksamen Menge erfolgen, d. h. einer Menge, daß das tumorassoziierte Antigen in einer Menge exprimiert wird, daß eine Immunantwort in T- Zellen gegenüber dem tumorassoziierten Antigen induziert wird, so daß dieses Antigen enthaltende Zellen zerstört werden. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann entweder allein verabreicht werden oder in Kombination mit weiteren Tumortherapien.

Erfindungsgemäße Expressionsvektoren wurden bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Mascheroder Weg 1b, Braunschweig jeweils am 5. Oktober 1999 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt. Die hinterlegten Proben haben folgende Hinterlegungsnummern erhalten:
Escherichia coli XL2-Blue pLIGA-trp2 DSM 13072
Escherichia coli XL2-Blue pLIGA-tyro DSM 13073
Escherichia coli XL2-Blue pLIGA-trp1 DSM 13074.

Die Figuren erläutern weiter die Erfindung.

Fig. 1 Darstellung der cDNA-Kodierregion von menschl. Tyrosinase und der daraus abgeleiteten Proteinsequenz,

Fig. 2 Darstellung der cDNA-Kodierregion von menschl. Trp-1 und der daraus abgeleiteten Proteinsequenz,

Fig. 3 Darstellung der cDNA-Kodierregion von menschl. Trp-2 und der daraus abgeleiteten Proteinsequenz,

Fig. 4 Darstellung der cDNA-Kodierregion von menschl. MART-1/MelanA und der daraus abgeleiteten Proteinsequenz.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung zweier verschiedener, die humane Tyrosinase exprimierender Listeria- Expressionsvektoren

Am 5'- und am 3'-Ende der für die menschliche tumorassoziierte Tyrosinase-Antigen codierenden cDNA (Genbank-Zugangsnummer: M27160) wurden mittels PCR (s. Tabelle 1) unter Verwendung der in Tabelle 1 und 2 angegebenen spezifischen Primer (tyr-5/2- LIGA+tyr/3-LIGA; tyr/5-LIGA+tyr/3-LIGA) eine NdeI- bzw. eine SalI-Erkennungssequenz eingeführt. Die Primerkombination tyr-5/2-LIGA und tyr/3-LIGA (Tab. 1) wurde zur Amplifizierung der vollständigen Tyrosinase cDNA-Sequenz eingesetzt. Die Primerkombination tyr/5-LIGA und tyr/3-LIGA (Tab. 2) wurde zur Amplifizierung einer 5'-deletierten Tyrosinase cDNA-Sequenz eingesetzt. Beide PCR-Amplifikate wurden dann wie folgt behandelt: Unter Ausnutzung der genannten Restriktionsschnittstellen wurde das Fragment in den Vektor pLIGA160 in frame stromabwärts der plasmidkodierten actA- Signalsequenz kloniert. Die Expression des resultierenden Fusionsgens wird durch den plasmidkodierten actA-Promotor gesteuert (Domann et al., 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank Accession: X59723). Die inserierte DNA-Sequenz sowie deren Übergangsstellen zum Vektor wurden zur Kontrolle sequenziert. Der resultierende Expressionsvektor erhielt die Bezeichnung pLIGA-tyrof (codiert gesamte Tyrosinase cDNA) bzw. pLIGA-tyro (codiert 5'-deletierte Tyrosinase cDNA). Letzterer wurde bei der DSMZ am 5. Oktober unter der Nummer DSM 13073 hinterlegt.

Beispiel 2 Herstellung zweier verschiedener, das humane trp-1- Protein exprimierender Listeria- Expressionsvektoren

Am 5'- und am 3'-Ende der für das menschliche tumorassoziierte Trp-1-Antigen codierenden cDNA (Genbank-Zugangsnummer: AF001295) wurden mittels PCR (s. Tabelle 1) unter Verwendung der in Tabelle 1 und 2 angegebenen spezifischen Primer (trp1-5/2- LIGA+trp1/3-LIGA; trp1/5-LIGA+trp1/3-LIGA) eine NdeI- bzw. eine Bgl-II-Erkennungssequenz eingeführt. Die Primerkombination trp1-5/2-LIGA und trp1/3-LIGA (Tab. 1) wurde zur Amplifikation der vollständigen trp-1-cDNA-Sequenz eingesetzt. Die Primerkombination trp1/5-LIGA und trp1/3-LIGA (Tab. 2) wurde zur Amplifikation einer 5'-deletierten trp-1- cDNA-Sequenz eingesetzt. Beide PCR-Amplifikate wurden dann wie folgt behandelt: Unter Ausnutzung der genannten Restriktionsschnittstellen wurde das Fragment in den Vektor pLIGA160 in frame stromabwärts der plasmidkodierten actA- Signalsequenz kloniert. Die Expression des resultierenden Fusionsgens wird durch den plasmidkodierten actA-Promotor gesteuert (Domann et al., 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank Accession: X59723) Die inserierte DNA-Sequenz sowie deren Übergangsstellen zum Vektor wurden zur Kontrolle sequenziert. Der resultierende Expressionsvektor erhielt die Bezeichnung pLTGA-trp1f (codiert die gesamte trp-1-cDNA) bzw. pLIGA-trp1 (codiert 5'-deletierte trp-1 cDNA). Letzterer wurde am 5. Oktober 1999 bei der DSMZ Braunschweig unter DSM 13074 hinterlegt.

Beispiel 3 Bereitstellung zweier verschiedener, das humane trp-2-Protein exprimierender Listeria-Expressionsvektoren

Am 5'- und am 3'-Ende der für das menschliche tumorassoziierte Trp-2 Antigen codierenden cDNA (Genbank-Zugangsnummer: D17547) wurden mittels PCR (s. Tabelle 1) unter Verwendung der in Tabelle 1 und 2 angegebenen spezifischen Primer (trp2-5/2- LIGA+trp-2/3-LIGA; trp2/5-LIGA+trp2/3-LIGA) eine NdeI- bzw. eine Sal-I-Erkennungssequenz eingeführt. Die Primerkombination trp2-5/2-LIGA und trp2/3-LIGA (Tab. 1) wurde zur Amplifikation der vollständigen trp-2-cDNA-Sequenz eingesetzt. Die Primerkombination trp2/5-LIGA und trp2/3-LIGA (Tab. 2) wurde zur Amplifizierung einer 5'-deletierten trp-2-cDNA-Sequenz eingesetzt. Beide PCR-Amplifikate wurde dann wie folgt behandelt: Unter Ausnutzung der genannten Restriktionsschnittstellen wurde das Fragment in den Vektor pLIGA160 in frame stromabwärts der plasmidkodierten actA- Signalsequenz kloniert. Die Expression des resultierenden Fusionsgens wird durch den plasmidkodierten actA-Promotor gesteuert (Domann et al., 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank Accession: X59723) Die inserierte DNA-Sequenz sowie deren Übergangsstellen zum Vektor wurden zur Kontrolle sequenziert. Der resultierende Expressionsvektor erhielt die Bezeichnung pLIGA-trp2f (codiert die gesamte trp-2-cDNA) bzw. pLIGA-trp2 (codiert 5'-deletierte trp-2 cDNA). Letzterer wurden am 5. Oktober 1999 bei der DSMZ Braunschweig unter DSM 13072 hinterlegt.

Beispiel 4 Herstellung eines, das humane MelanA/MART-1- Gen exprimierenden Listeria- Expressionsvektors

Am 5'- und am 3'-Ende der für das menschliche tumorassoziierte MelanA-Antigen codierenden cDNA (Genbank-Zugangsnummer: U06452) wurden mittels PCR (s. Tabelle 1) unter Verwendung der in Tabelle 1 angegebenen Primer (melanA-5/2-LIGA, melanA/3- LIGA) eine NdeI- bzw. eine Bgl-II-Erkennungssequenz eingeführt. Unter Ausnutzung der Restriktionsschnittstellen wurde das Fragment in den Vektor pLIGA160 in frame stromabwärts der plasmidkodierten actA-Signalsequenz kloniert. Die Expression des resultierenden Fusionsgens wird durch den plasmidkodierten actA-Promotor gesteuert (Domann et al., 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank Accession: X59723) Die inserierte DNA-Sequenz sowie deren Übergangsstellen zum Vektor wurden zur Kontrolle sequenziert.

Beispiel 5 Antigen-Expression in Listeria monocytogenes

Die in den vorstehenden Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Listeria-Expressionsvektoren wurde nach Amplifikation in dem E.-coli-Stamm XL2-Blue jeweils in den L. monocytogenes Stamm EGD sowie in die attentuierten Mutanten Δhly2 und ΔactA (Guzmann et al., 1995, Infect. Immun. 63: 3665-3573) mittels Elektroporation eingeführt. Die dazu angewandte Technik ist dem Fachmann hinreichend bekannt. Plasmidtragende Listerien wurden anhand der plasmidvermittelten Erythromycin-Resistenz identifiziert. Die Expression der tumorassoziierten Antigene wird dann unter Anwendung immunologischer Nachweisverfahren (z. B. immunologische Färbung, Western Blot) mittels spezifischer Antikörper (MelanA-AK erhältlich von Fa. Novocastra; Tyrosinase-AK erhältlich von Fa. BioTrend, Köln; Trp-1 AK beschrieben in Thomsen et al. 1985, J. Invest. Dermatol. 85: 169-174) bestimmt. Jedes der tumorassoziierten Antigene konnte nachgewiesen werden, d. h. der gewählte Expressionsweg war erfolgreich.

Beispiel 7 Immunisierung von Mäusen des transgenen Mäusestamms HLA-A2

Der im vorstehenden Beispiel 4 beschriebene Listeria- Expressionsvektor pLIGA-MelanA wurde nach Amplifikation im E.-coli-Stamm XL2-Blue in den L. monocytogenes Stamm EGD (Guzmán et al., 1995, Infect. Immun. 63: 3665-3573) mittels Elektroporation eingeführt. Diese Bakterien wurden über Nacht bei 37°C in BHI(Brain-Heart-Infusion)-Medium (Hersteller: Fa. Difco) angezüchtet. Es wurde eine 1: 50-Verdünnungskultur angelegt und das Wachstum der Bakterien bis zur mittleren 10 g- Phase fortgesetzt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation bei 3000 × g geerntet. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und in PBS resuspendiert. Zur Kontrolle wurden die das nicht-veränderte Plasmid pLIGA160 tragenden EGD-Bakterien ebenso behandelt und kultiviert.

Mäuse vom transgenen Stamm HLA-A2k^b (Vitiello et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 1007-1015) wurden mit den in PBS resuspendierten Bakterien (EGD-pLIGA-MelanA und EGD-pLIGA160) im 7-tägigen Intervall immunisiert. Die Mäuse erhielten jeweils eine orale Applikation von 1 × 10⁶ Bakterien an Tag 0 und 1 × 10⁷ Bakterien an Tag 7, 14, 21, usw.

Primäres Ziel der Immunisierungsexperimente ist die Erzeugung einer zellulären cytotoxischen T-Zellantwort. Die Antigen spezifische Aktivität cytotoxischer T-Zellen gilt als Grundlage einer effizienten antitumorösen Immunantwort.

Die Milzgin von je 3 immunisierten Mäusen werden 7 Tage nach der letzten Immunisierung entnommen, gepoolt und mechanisch bearbeitet, daß eine Einzelzellsuspension vorliegt. Die Milzzellen werden mit einer zur HLA-A2k^b transgenen Zellinie (C1R-A2k^b) restimuliert. Diese Zellinie ist mit dem MelanA- Antigen kodierenden Gen stabil transfiziert und kann daher zur Stimulierung der cytotoxischen Aktivität Antigen-spezifischer T-Zellen eingesetzt werden. Nach 5-7 Tagen werden die lebenden Zellen geerntet und im dem Fachmann hinreichend bekannten ⁵¹Cr- Freisetzungsexperiment auf ihre Fähigkeit hin überprüft, die genannten Antigen-exprimierenden Zielzellen zu lysieren.

Dargestellt ist die MHC-Klasse I Melan A restringierte Lyse von MelanA exprimierenden C1R-A2k^b-Zielzellen durch Lymphocyten die in vivo mit dem rekombinanten L. monocytogenes EGD pLIGA-MelanA Vakzinstamm primär stimuliert wurden. 7 Tage nach der letzten Immunisierung mit EGD-pLIGA-MelanA bzw. EGD-pLIGA160 (Negativkontrolle) wurden die Milzzellen an Tag 5 nach Entnahme in vitro restimuliert. Zur in-vitro-Restimulierung wurde die zum immunisierten HLA-A2k^b transgenen Mausstamm syngene C1R-A2k^b-Zellinie, die stabil mit dem humanen MelanA kodierenden Gen transfiziert wurde, eingesetzt. Zum Ende der Kultur wurden die Lymphocyten im ⁵¹Cr- Freisetzungsexperiment auf ihre Fähigkeit zur Lyse der C1R-A2k^b MelanA transfizierten Zellinie hin getestet.

Tabelle 1

Primer zur Amplifizierung der vollständigen Antigen kodierenden c-DNA

Tabelle 1 Primer zur Amplifizierung der Antigen-kodierenden c-DNA-Sequenzen

Fett markiert ist jeweils die Erkennungssequenz spezifischer Restriktionsenzyme, die für die Klonierung des PCR-Amplifikats in den Vektor pLIGA160 eingesetzt wurden. Unterstrichen ist der Anteil eines Primers, der an die komplementäre Sequenz der genannten c-DNA bindet.

PCR-Bedingungen zur Amplifizierung der genannten c-DNA Fragmente:

Initiale Denaturierung:	3 Min. bei 94°C
Zyklus (40 X):	0,5 Min. bei 94°C
1 Min. bei 55°C
1,5 Min. bei 68°C
abschließende Polymerisation:	7 Min. bei 68°C

Tabelle 2

Primer zur Amplifizierung der 5'-verkürzten Antigen-kodierenden c-DNA

Tabelle 2 Primer zur Amplifizierung der Antigen-kodierenden, 5'-deletierten c-DNA- Sequenzen

PCR-Bedingungen zur Amplifizierung der genannten c-DNA Fragmente

Claims

1. Listeria-Expressionsvektor zur Immuntherapie, wobei der Listeria-Expressionsvektor folgende DNA-Sequenzen funktionell verknüpft umfaßt:

a) einen in Listeria aktiven Promotor und
b) eine für humane Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 oder Trp-2 codierende DNA-Sequenz.

2. Listeria-Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei der in Listeria aktive Promotor der Promotor des hly-, actA-, plcA-, plcB- oder mpl-Gens ist.

3. Listeria-Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, zusätzlich eine ein Protein codierende DNA so enthaltend, daß ein ein Listeria-Protein und humane Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 oder Trp-2 umfassendes Fusionsprotein codiert wird.

4. Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei das Listeria- Protein ein an der Lyse der Wirtsvakuolen oder an der Wanderung der Wirtszelle beteiligtes Enzym ist.

5. Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei das Listeria- Protein Listeriolysin 0, PI-PLC oder ActA ist.

6. Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei das Listeria- Protein eine Signalsequenz eines sezernierten Listeria- Proteins umfaßt.

7. Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei die Signalsequenz von Haemolysin (Listeriolysin O), einer Phospholipase (PI-PLC) oder dem ActA-Protein stammt.

8. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, der von pKSV7, pAUL-A oder pLIGA160 stammt.

9. Rekombinantes attenuiertes Listeria-Bakterium, den Listeria-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthaltend.

10. Rekombinantes attenuiertes Listeria-Bakterium nach Anspruch 9, das Listeria monocytogenes ist.

11. Impfstoff, ein rekombinantes attenuiertes Listeria- Bakterium nach Anspruch 9 oder 10 enthaltend.

12. Verwendung des rekombinanten attenuierten Listeria- Bakteriums nach Anspruch 9 oder 10 zur Immuntherapie.

13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Immuntherapie die Therapie des malignen Melanoms ist.