MXPA06006503A - Uso del gen de amiloide a del suero en el diagnostico y el tratamiento del glaucoma y la identificacion de agentes anti-glaucoma. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona composiciones y metodos para tratar el glaucoma, metodos para diagnosticar el glaucoma, y metodos para identificar agentes que pueden ser utiles en el tratamiento del glaucoma. Mas especificamente, la presente invencion describe el uso de agentes que modulan la expresion del amiloide A del suero.

Description

USO DEL GEN DE AMILOIDE A DEL SUERO EN EL DIAGNOSTICO Y EL TRATAMIENTO DEL GLAUCOMA Y LA IDENTIFICACIÓN DE AGENTES ANTI- GLAUCOMA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo del diagnostico y el tratamiento del glaucoma. Más específicamente, la invención proporciona métodos y composiciones para diagnosticar y tratar el glaucoma y para identificar agentes útiles potencialmente para el tratamiento del glaucoma. 2. Descripción de la Técnica Relacionada Existe un número de condiciones oculares que son provocadas o agravadas por el daño a la cabeza del nervio óptico, la degeneración de los tejidos oculares, y/o la presión infraocular elevada. Por ejemplo', los "glaucomas" son un grupo de enfermedades debilitantes del ojo los cuales son una causa principal de la ceguera irreversible en los Estados Unidos y otras naciones desarrolladas. Glaucoma Primario de Ángulo Abierto ("POAG") es la forma más común de glaucoma. La enfermedad se caracteriza por la degeneración de la malla trabecular, que lleva a la obstrucción de la habilidad normal del humor acuoso para abandonar el ojo sin el cierre del espacio (por ejemplo, el "ángulo") entre el iris y la cornea (Vaughan, D. et al., (1992)). Una característica de tal obstrucción en esta enfermedad es una presión intraocular elevada ("IOP") , que resulta en la pérdida visual progresiva y ceguera si no se trata apropiadamente y de' manera oportuna. Se estima que la enfermedad afecta entre el 0.4% y 3.3% de todos los adultos mayores de 40 años (Leske, M. C. et al., (1986); Bengtsson, B. (1989); Strong, N. P. (1992)). Además, la preponderancia de la enfermedad surge con la edad para más del 6% de aquellas personas de 75 años o mayores (Strong N.P., (1992) ) . El glaucoma afecta tres tejidos separados en el ojo. La IOP elevada asociada con la POGA se debe a los cambios morfológicos y bioquímicos en la malla trabecular (TM) , un tejido localizado en el ángulo entre la cornea y el iris. La mayoría del humor acuoso nutritivo sale al segmento anterior del ojo a través de la TM. La pérdida progresiva de células del TM y la acumulación de desechos extracelulares en la TM de los ojos glaucomatosos lleva a resistencia aumentada a las secreciones acuosas, elevando por lo tanto la IOP. La IOP elevada, así como otros factores tales como la isquemia provocan cambios degenerativos en la cabeza del nervio óptico (ONH) llevando al "ahondamiento" progresivo de la ONH y la pérdida de las células ganglionares y axones. Se desconocen los mecanismos moleculares detallados responsables del daño glaucomatoso a la TM, la OHB, y las células ganglionares de la retina. Hace veinte años, la interacción de la hipertensión ocular, la isquemia y distorsión mecánica de la cabeza del nervio óptico se han debatido profusamente como los factores principales que provocan la progresión de la pérdida del campo visual en el glaucoma. Desde entonces, otros factores que incluyen la excitotoxicidad, el óxido nítrico, la ausencia de factores neurotróficos vitales, la interacción glial/neuronal anormal y la genética se han implicado en el proceso de la enfermedad degenerativa. La consideración de la genética molecular amerita alguna discusión en tanto que esta pueda definir a fin de cuentas el mecanismo de la muerte celular, y hace posible la discriminación de varias formas de glaucoma. En los últimos 10 años, se han mapeado 16 diferentes genes del glaucoma y se han identificado 7 genes del glaucoma. Estos incluyen seis genes mapeados (GLC1A-GLC1F) y dos genes identificados (MYOC y OPTN) para el glaucoma de ángulo abierto primario, dos genes mapeados (GLC3A-GLC3B) y un gen identificado para el glaucoma congénito (CYP1B1) , dos genes mapeados para el glaucoma de dispersión pigmentaria/pigmentario, y varios genes para las formas evolutiva o sindrómica de glaucoma (F0XC1, PITX2, LMX1B, PAX6) . Por lo tanto, cada forma de glaucoma puede tener una patología única y por consiguiente se puede requerir un enfoque terapéutico distinto para el manejo de la enfermedad. Por ejemplo, un fármaco que afecte la expresión de las enzimas que degradan la matriz extracelular de la cabeza del nervio óptico probablemente no prevendría la muerte del RGC provocada por la excitotoxicidad. En el glaucoma, la muerte de RGC ocurre por un proceso llamado apoptosis (muerte celular programada) . Se ha especulado que diferentes tipos de insultos que pueden provocar la muerte pueden hacerlo convergiendo en unas cuantas vías comunes. La determinación del objetivo corriente abajo a una vía común es una estrategia que puede ampliar la utilidad de un fármaco y aumenta la probabilidad de que este puede tener utilidad en el manejo de las diferentes formas de la enfermedad. Sin embargo, es más probable que los fármacos que afectan varias vías metabólicas produzcan efectos secundarios indeseables. Con la llegada de equipos de diagnóstico basados en genes para identificar las formas específicas de glaucoma, se pueden evaluar los agentes neuroprotectores selectivos, con el objetivo de reducir el grado de variación sobre la respuesta medida.

El glaucoma se diagnostica actualmente con base en los signos de la enfermedad (cambios característicos de la cabeza del nervio óptico y la pérdida del campo visual) . Sin embargo, más de la mitad de la población con glaucoma no están concientes de que tienen esta enfermedad cegadora y para cuando se diagnostica, estos han perdido ya irreversiblemente aproximadamente el 30-50% de sus células ganglionares de la retina. Por lo tanto, son necesarios métodos mejorados para el diagnostico temprano del glaucoma. La terapia actual de glaucoma se dirige a bajar la IOP, un factor de riesgo principal para el desarrollo y la progresión del glaucoma. Sin embargo, ninguna de las terapias reductoras de la IOP de hecho intervienen en el proceso de la enfermedad glaucomatosa responsable de la IOP elevada y continúa el daño progresivo al segmento anterior. Esta es una posible razón por la cual muchos pacientes se vuelven "resistentes" a las terapias convencionales de glaucoma. Por lo tanto, lo que se necesita es un método terapéutico para alterar (inhibiendo o incluso invirtiendo) el proceso de la enfermedad. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención supera estas y otras desventajas de la técnica previa al proporcionar métodos para diagnosticar y composiciones para tratar el glaucoma. En un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar el glaucoma administrando a un paciente en necesidad del mismo, una cantidad efectiva terapéuticamente de una composición que comprende un agente que interactúa con un gen que codifica la proteína amiloide A del suero (SAA) , o con la secuencia promotora del gen. La interacción entre el agente y el gen que codifica la SAA, o con su secuencia promotora, modula la expresión de la SAA, de manera tal que se trata la condición glaucomatosa del paciente. En las modalidades preferidas, el agente será una proteína, péptido, mimético de péptido, molécula pequeña o ácido nucleico. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar el glaucoma administrando a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva terapéuticamente de una composición que comprende un agente que inhibe la interacción de la proteína amiloide A del suero (SAA) con su receptor. Preferiblemente, el agente será un receptor agonista del receptor a activado por el proliferador de peroxisomas (PPARa) , péptidos de taquicinina y sus análogos no peptídicos o ácido a-lipoico. Más preferiblemente, el agente será fenofibrato, Wy-14643, (ácido 4-cloro-6- (2, 3-xilidino) 2-pirimidiniltiol) -acético, ciprofibrato, ácido 2- bromohexadecanoico, benzafibrato y ciglitazona, bafilo icina, concanamicina o ácido pseudolaurico B. La presente invención proporciona además una composición farmacéutica para tratar el glaucoma, que comprende una cantidad efectiva terapéuticamente de un antagonista de la proteína amiloide A del suero (SAA) y un portador farmacéutico. El antagonista contenido en la composición puede ser algunos de los compuestos identificados arriba. Aun en otra modalidad, la presente invención proporciona un método para diagnosticar el glaucoma por medio de los siguientes pasos: a) obtener una muestra biológica de un paciente; y b) analizar dicha muestra por un nivel anormal, bioactividad anormal o mutaciones del gen que codifica la proteína amiloide A del suero (SAA) o su región promotora o sus productos genéticos, en donde dicho gen que codifica la SAA comprende la secuencia definida en la SEC ID NO: 3, en donde su región promotora comprende la secuencia definida en la SEC ID NO: 12 o la SEC ID NO: 13, y en donde la SAA comprende la secuencia definida en la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 4. en donde el nivel anormalmente alto, la bioactividad anormalmente alta o las mutaciones de los genes de SAA o los productos genéticos, indica un diagnostico del glaucoma.

En los aspectos preferidos, la muestra biológica es de tejido ocular, lágrimas, el humor acuoso, el fluido cerebroespinal, nasal, o un raspado de mejilla o suero. Más preferiblemente, la muestra biológica comprende células de la malla trabecular. Alternativamente, la presente invención proporciona un método para diagnosticar el glaucoma en un paciente, mediante los pasos de: a) recolectar las células de un paciente; b) aislar el ácido nucleico de las células; c) poner en contacto la muestra con uno o más cebadores los cuales hibridizan específicamente 5' y 3' con al menos un alelo de la SEC ID NO:l, la SEC ID NO: 3, la SEC ID NO: 12 o la SEC ID 'NO: 13 bajo las condiciones tales que ocurra la hibridación y la amplificación del alelo; y d) detectar el producto de la amplificación; en donde el nivel anormal o las mutaciones de la SEC ID NO:l, la SEC ID NO: 3, la SEC ID NO: 12, o la SEC ID NO: 13 en la muestra indican un diagnóstico de glaucoma. La presente invención también proporciona un método para identificar los agentes potencialmente útiles para tratar el glaucoma, mediante los pasos de: a) obtener células que expresan SAA (SEC ID NO: o SEC ID NO: 2) o células que contienen el gen promotor/reportero de SAA tales que se expresa el gen reportero; b) mezclar una sustancia candidata con las células; y c) determinar el nivel de la proteína SAA (SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4) o el nivel de la expresión genética en las células; en donde un aumento o una disminución de la producción de la proteína SAA o la expresión del gen en presencia de dicha sustancia candidata indica un agente potencialmente útil para el tratamiento del glaucoma. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar un agente potencialmente útil para tratar el glaucoma, mediante los pasos de: a) formar una mezcla de reacción que comprende: (i) una proteína SAA o células que expresen la SAA o un gen reportero activado por un promotor de SAA; (ii) una pareja de enlace de la proteína SAA; y (iii) un compuesto de prueba; y b) detectar la interacción de la proteína SAA y la pareja de enlace o el nivel de los productos del gene reportero en presencia del compuesto de prueba y en ausencia del compuesto de prueba; en donde un aumento o una disminución en la interacción de la proteína SAA con su pareja de enlace en presencia del compuesto de prueba, con relación a la interacción en ausencia del compuesto de prueba indica un agente potencialmente útil para el tratamiento del glaucoma. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar un agente potencialmente útil para tratar el glaucoma. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar un agente potencialmente útil para tratar el glaucoma, mediante los pasos de: a) formar una mezcla de reacción que comprende: (i) células que comprenden la proteína SAA recombinante (SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 4) o células que comprenden los vectores de expresión SEC ID NO:l o SEC ID NO: 3; y (ii) un compuesto de prueba; y b) detectar el efecto sobre la señalización corriente arriba (IL-8) en presencia del compuesto de prueba y en ausencia del compuesto de prueba; en donde una reducción o un aumento en la señalización corriente arriba en presencia del compuesto de prueba, con relación a la interacción en ausencia del compuesto de prueba indica un agente potencialmente útil para tratar el glaucoma.

En los aspectos preferidos, las células que contienen la proteína de SAA o los vectores de expresión serán células HL- 60. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos forman parte de la especificación presente y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor por la referencia a estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas aquí. FIG. 1. Análisis QPCR de la expresión de SAA en 12 tejidos de TM con glaucoma vs . 11 normales. NTM y GTM representan los niveles de expresión promedio del gen en los grupos normal y de glaucoma, respectivamente. FIG. 2A. análisis QPCR de la expresión de SAA en líneas celulares de TM. NTM y GTM representan los niveles de expresión promedio del gen en los grupos normal y de glaucoma, respectivamente . FIG. 2B. análisis QPCR de la expresión de SAA en tejidos la cabeza del nervio óptico. NTM y GTM representan los niveles de expresión promedio del gen en los grupos normal y de glaucoma, respectivamente. FIG. 3. Proteína SAA en los tejidos de TM de donadores normales y con glaucoma (n=6) . Se observó un aumento significativo (el triple) de SAA en los tejidos de TM con glaucoma, en comparación con los tejidos normales (p=0.031). las barras muestran la media +/- s.e.m. FIG. 4. Proteína SAA determinada por ELISA en el humor acuoso de humanos de individuos normales y glaucomatosos. Los valores se expresan como la SAA promedio en ng/ml de humor acuoso, +/- s.e.m. (p=0.005). FIG. 5. Secreción de IL-8 por las células HL-60 en respuesta a las concentraciones crecientes de rhSAA. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS El glaucoma es un grupo heterogéneo de neuropatías ópticas que comparten ciertas características clínicas. La pérdida de la visión en el glaucoma se debe a la muerte selectiva de las células ganglionares de la retina, la cual se diagnostica clínicamente por los cambios característicos en el campo visual, defectos de la capa de fibras nerviosas, y un ahondamiento progresivo de la ONH. Uno de los factores de riesgo principales para el desarrollo del glaucoma es la presencia de hipertensión ocular (presión intraocular elevada, IOP) . La IOP también parece estar involucrada en la patogénesis del -glaucoma de tensión normal cuando los pacientes tienen la que con frecuencia se considera ser la IOP normal. La IOP elevada asociada con el glaucoma se debe a la resistencia elevada a la salida de humor acuoso en la malla trabecular (TM) , un tejido pequeño especializado localizado en el ángulo del iris-cornea de la cámara ocular anterior. Los cambios glaucomatosos en la TM incluyen una pérdida en las células de la TM y la deposición y acumulación de desechos extracelulares que incluyen materiales similares a placas proteínicas. Además, también hay cambios que ocurren en la cabeza del nervio óptico (ONH) glaucomatosa. En los ojos glaucomatosos, existen cambios morfológicos y de movilidad en las células glial de la ONH. En respuesta a la IOP elevada y/o insultos isquémicos transitorios, hay un cambio en la composición de la matriz extracelular de la ONH y alteraciones en las morfologías de los axones de las células gliales y las células ganglionares de la retina. Los inventores presentes han descubierto que la expresión de mARN de proteína Amiloide A del Suero (SAA) y la proteína se sobrerregulan significativamente en los tejidos y células de TM glaucomatosas . Los inventores han verificado la expresión diferencial de mARN observada usando porciones pequeñas o chips genéticos Affymetrix por la reacción de la cadena de polimerasa cuantitativa (QPCR) , en tiempo real y los niveles aumentados de proteína SAA por SAA ELISA. Esta es la primera vez que se ha demostrado que la SAA se expresa en la TM.

La SAA humana comprende un número de apolipoproteínas pequeñas, expresadas diferencialmente, codificadas por los genes localizados en el brazo del cromosoma 11. Existen cuatro isoformas de las SAAs . SAAl (SEC ID N0:2), codificada por la SEC ID N0:1, y SAA2 (SEC ID NO: 4), codificada por la SEC ID NO: 3, se conocen como reactivos de fase aguda, similares a la proteína C-reactiva, es decir, estas se sobrerregulan dramáticamente por las citocinas proinflamatorias. Las regiones promotoras 5'UTR de los genes SAAl y SAA2 también se proporcionan (SEC ID NO: 12 y SEC ID NO: 13, respectivamente. SAA3 (SEC ID NO: 5) es un pesudogen y SAA4 (SEC ID NO: 6) es un gen expresado constitutivamente de bajo nivel que codifica la SAA4 constitutiva (SEC ID NO: 7). SAA2 tiene dos isoformas, SAA2a (SEC ID NO: 9), codificada por la SEC ID NO: 8, y SAAß (SEC ID NO:ll), codificada por la SEC ID NO:10, las cuales difieren sólo en un amino ácido. Las proteínas SAAl y SAA2 son 93.5% idénticas a nivel de aminoácidos (SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 4, respectivamente) y estos genes son 96.7% idénticos a nivel de nucleótidos (SEC ID 1.0:1 y SEC ID NO: 3, respectivamente) . La SAA es un • reactivo de fase aguda cuyo nivel en la sangre se eleva aproximadamente 1000 veces como parte de las respuestas corporales a varias lesiones, incluyendo traumatismos, infecciones, inflamación y neoplasias. Como un reactivo de fase aguda, se ha considerado al hígado como el sitio principal de expresión. Sin embargo, inicialmente se describió la expresión extrahepática de SAA en tejidos de ratón, y después en células de lesiones ateroscleróticas humanas (O'Hara et al., 2000). Subsecuentemente, el mARN de SAA se encontró expresado ampliamente en muchos tejidos humanos histológicamente normales. La expresión localizada se noto en varios tejidos, incluyendo los senos, el estomago, los intestinos grueso y delgado, los pulmones, páncreas, riñones, amígdalas, tiroides, pituitaria, la placenta, la epidermis de la piel, y las neuronas cerebrales. También se observó la expresión en los linfocitos, las células del plasma, y las células endoteliales . La expresión de la proteína SAA co-localizada con la expresión de mARN de SAA también se ha reportado en tejidos extrahepáticos humanos histológicamente normales. (Liang, et al., 1997; Urieli-Shoval, et al., 1998). Las isoformas de SAA son apolipoproteínas que se vuelven un componente principal de la lipoproteína de alta densidad (HDL) en el plasma sanguíneo de los mamíferos y desplaza la A-I (ApoA-I) y los fosfolípidos de las partículas de HDL (Miida et al., 1999). La SAA se enlaza al colesterol y puede servir como una proteína transitoria de enlace a colesterol. Además, la sobreexpresión de la SAAl o la SAA2 lleva a la formación de fibrillas lineales en los depósitos amiloides, lo cual puede llevar a la patogénesis (Uhlar y Whitehead 1999; Liang et al., 1997). La SAA juega un papel importante en las infecciones la inflamación, y en la estimulación de la reparación de tejidos. La concentración de SAA puede aumentar hasta 1000 veces enseguida de la inflamación, las infecciones, la necrosis, y declina rápidamente enseguida de la recuperación. Por lo tanto la concentración de SAA del suero se considera ser un marcador útil con el cual monitorear la actividad de las enfermedades inflamatorias. La biosíntesis hepática de SAA se sobrerregula por las citocinas proinflamatorias, llevando a una respuesta de fase aguda. Las concentraciones de SAA elevadas crónicamente son un prerrequisito para la patogénesis de las amiloidosis secundaria, una enfermedad progresiva y algunas veces fatal caracterizada por la deposición en los órganos principales de placas insolubles compuestas principalmente de SAA dividida proteolíticamente. Este mismo proceso también puede llevar a la aterosclerosis. Existe un requerimiento por mecanismos de control tanto positivos y negativos para mantener la homeostasis. Estos mecanismos permiten la inducción rápida de la expresión de SAA para desempeñar las funciones de protección al anfitrión, pero estos también deben asegurar que la expresión de SAA regrese rápidamente a los niveles de línea base para prevenir la amiloidosis. Estos mecanismos incluyen la modulación de la actividad del promotor que involucra, por ejemplo, el factor nuclear inductor kB (NFkB) y su inhibidor IKB, la sobrerregulación de los factores de trascripción del factor nuclear para la familia de interleucinas-6 (NF-IL6) , y los represores de la trascripción tales como yin y yang 1 (YY1) . La modulación posttranscripción que involucra cambios en la estabilidad del mARN y la eficiencia de la traducción permiten que se logre el control adicional de la sobre y la subrregulación de la síntesis de proteína SAA. En las ultimas etapas de la respuesta AP, la expresión de la SAA se subrregula efectivamente vía la producción aumentada de antagonistas de citocina, tales como el antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lRa) y de receptores de citocina soluble, resultando en menos transducción de señales activada por las citocinas proinflamatorias (Jensen y Whitehead 1998) . Hay varios reportes los cuales sugieren que la amiloidosis primario puede estar asociada con el glaucoma. Por ejemplo, se encontró que el amiloide se depositó en varios tejidos oculares incluyendo el cuerpo vitreo, la retina, la coroides, el iris, el cristalino, y el TM en pacientes de amiloidosis sistémica (Schwartz et al.,, 1982). Ermilov et al., (1993) reportó que en 478 ojos de 313 pacientes, con edades de 25 a 90 años, con cataratas, glaucoma, y/o diabetes azucarada, 66 (14%) de los ojos contenían amiloide-amiloide pseudoproliferativa (PEA). Krasnov et al., (1996) reportaron que 44.4% de 115 pacientes con glaucoma de ángulo abierto revelaron deposiciones extracelulares de amiloide. La amiloidosis se reveló en la esclerótica en el 82% de los casos y en el iris en el 70% de los casos. Varias condiciones clínicas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, exhiben depósitos anormales en tejidos asociados con la enfermedad. Sin embargo, los amiloides son molecularmente heterogéneos y se codifican por diferentes genes amiloideos. Los reportes previos son poco claros con respecto a cuales amiloides podrían estar asociados con el glaucoma. Los inventores presentes han demostrado, por primera vez, que la expresión del gen de SAA se eleva significativamente en los tejidos de TM glaucomatosos. La SAA elevada puede estar involucrada en la generación de IOP elevada y el daño al nervio óptico que lleva a la pérdida de visión en los pacientes de glaucoma. La invención presente proporciona métodos para usar una detección de expresión elevada de SAA para diagnosticar el glaucoma. La presente invención proporciona además métodos para identificar los agentes que pueden alterar la expresión o las funciones de la SAA para identificar los agentes potencialmente anti-glaucomatosos . En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos y composiciones para usar los agentes que antagonizan las acciones de la SAA y/o las interacciones con otras proteínas, para el tratamiento del glaucoma. Diagnosticando el Glaucoma Con base en el descubrimiento de los inventores de que ciertos sujetos con glaucoma tienen niveles elevados de expresión de SAA, la presente invención proporciona una variedad de métodos para diagnosticar el glaucoma. Ciertos métodos de la invención pueden detectar las mutaciones en las secuencias de ácidos nucleicos, las cuales resultan en niveles inadecuadamente altos de proteína SAA. Estos diagnósticos se pueden desarrollar con base en la secuencia conocida del ácido nucleico de la SAA humana, o la secuencia de aminoácido codificada (véase Miller 2001) . Se pueden desarrollar otros métodos con base en la secuencia genomita de la SAA humana o de la secuencia de los genes que regulan la expresión de la SAA. Aun otros métodos se pueden desarrollar con base en un cambio en el nivel de la expresión del gen de SAA a nivel del mRNA. En las modalidades alterativas, los métodos de la invención pueden detectar la actividad o el nivel de las proteínas de señalización de SAA o los genes que codifican las proteínas de señalización de la SAA. Por ejemplo, se pueden desarrollar métodos que detectan la actividad de señalización de SAA inadecuadamente baja, incluyendo, por ejemplo, las mutaciones que resultan en el funcionamiento inadecuado de los componentes de señalización de SAA, incluyendo la inducción por SAA de IL-8. Además, las técnicas no basadas en ácidos nucleicos se pueden usar para detectar las alteraciones en la cantidad o la actividad específica de cualquiera de estas proteínas de señalización de SAA. Actualmente se encuentran disponibles varios medios para que los técnicos especializados detecten los niveles o las actividades anormales de los genes y los productos genéticos. 'Estos métodos son bien conocidos y se han vuelto rutinarios para los especialistas. Por ejemplo, se encuentran disponibles muchos métodos para detectar los alelos específicos en los locus polimórficos. El método preferido para detectar un alelo polimórfico especifico dependerá en parte de la naturaleza molecular del polimorfismo. Las varias formas alélicas del locus polimórfico puede diferir en un sólo par de bases individuales del ADN. Tales polimorfismos de nucleótidos individuales (o' SNPs) con contribuyentes principales para la variación genética, que comprende algunos del 80% de todos los polimorfismos conocidos, y se estima que su densidad en el genoma humano es en promedio 1 por 1,000 pares de bases. Se encuentran disponibles una variedad de métodos para detectar la presencia de un alelo polimórfico particular de un sólo nucleótido en un individuo. Los avances en el campo han proporcionado el genotipo de SNP a gran escala exacto, fácil, y barato. Por ejemplo, véase la Patente Norteamericana No. 4,656,127; la Patente Francesa 2,650,840; la Solicitud PCT No. WO91/02087; la Solicitud PCT No. W092/15712; Komher et al., 1989; Sokolov 1990; Syvanen et al., 1990; Kuppuswamy et al., 1991; Prezant et al., 1992; Ugozzoli, et al., 1992; Nyren et al., 1993; Roest et al., 1993 y van der Luijt, et al., 1994). Se puede utilizar cualquier tipo de células o tejidos para obtener las muestras de ácido nucleico para usarse en el diagnóstico descrito aquí. En una modalidad preferida, la muestra de ADN se obtiene de un fluido corporal, por ejemplo, la sangre, obtenido por las técnicas conocidas (por ejemplo, venopunción), o células bucales. Más preferiblemente, las muestras para usarse en los métodos de la presente invención se obtendrán de la sangre o células bucales. Alternativamente, las pruebas de ácidos nucleicos se pueden llevar a cabo sobre muestras secas (por ejemplo, cabello o piel) . Los procedimientos de diagnóstico también se pueden llevar a cabo in situ sobre secciones de tejido (fijadas y/o congeladas) del tejido del paciente, obtenido de biopsias o remociones quirúrgicas, de modo tal que no es necesaria la purificación del ácido nucleico. Los reactivos de ácidos nucleicos se pueden usar como sondas y/o cebadores para tales procedimientos in situ (véase, por ejemplo, Nuevo 1992) .

Además, los métodos que se enfocan principalmente en la detección de una secuencia de ácido nucleico, los perfiles también se pueden evaluar en tales esquemas de detección. Los perfiles de huella digital también se pueden generar, por ejemplo, utilizando un procedimiento de despliegue diferente, análisis Northern y/o RT-PCR. Un método de detección preferido es la hibridación específica de alelos usando sondas que traslapan una región de al menos un alelo del componente de señalización de SAA que es indicativo del glaucoma y que tiene aproximadamente 5, 10, 20, 25, o 30 nucleótidos contiguos alrededor de la mutación o la región polimorfita. En una modalidad preferida de la invención, varias sondas capaces de hibridarse específicamente a otras variantes alélicas involucradas en el glaucoma se enlazan a un soporte en fase sólida, por ejemplo, una porción pequeña o "chip" (el cual puede sostener aproximadamente 250,000 oligonucleótidos). Los oligonucleótidos se pueden enlazar a un soporte sólido por medio de una variedad de procesos, incluyendo litografía. El análisis de detección de mutaciones usando estos chips que comprende oligonucleótidos, también llamados "arreglos de sondas de ADN" se describen, por ejemplo, en Cronin et al., (1996). En una modalidad, una porción pequeña o chip comprende todas las variantes alélicas de al menos una región polimorfita de un gen. El soporte en fase sólida se pone en contacto entonces con un ácido nucleico de prueba y se detecta la hibridación a las sondas específicas. Por consiguiente, la identidad de numerosas variantes alélicas de uno o más genes se puede identificar en un experimento de hibridación simple. Estas técnicas pueden incluir además el paso de amplificar el ácido nucleico antes del análisis. Las técnicas de amplificación son conocidas por aquellas personas experimentadas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, clonación, reacción de la cadena de polimerasa (PCR) , reacción de la cadena de polimerasa de alelos específicos (ASA) , reacción de la cadena de ligasa (LCR) , reacción de la cadena de polimerasa anidada, replicación de secuencias auto-sostenida (Guatelli et al., 1990), el sistema de amplificación de trascripción (Kwoh, et al., 1989), y Q-Beta Replicasa (Lizardi, et al., 1988). Los productos de la amplificación se pueden analizar en una variedad . de maneras, incluyendo análisis de tamaño, digestión de restricción seguido por el análisis de tamaño, detectar cebadores de oligonucleótidos etiquetados específicos en los productos de reacción, e hibridación de oligonucleótidos específicos del alelo, detección de 5' endonucleasa específica del alelo, secuenciación, hibridación, SSCP, y los similares.

Los medios de detección basados en PCR pueden incluir la amplificación múltiple de una pluralidad de marcadores simultáneamente. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica seleccionar cebadores de PCR para generar productos de PCR que no se traslapan en tamaño y pueden ser analizados simultáneamente. Alternativamente, es posible amplificar diferentes marcadores con cebrados que se etiquetan diferencialmente y por lo tanto se puede detectar cada uno diferencialmente. Por supuesto, los medios de detección basados en hibridación permiten la detección diferencial de varios productos PCR en una muestra. Se conocen otras técnicas en el arte para permitir análisis múltiples de varios marcadores. En una modalidad meramente ilustrativa, el método incluye los pasos de (i) recolectar una muestra de células de un paciente, (ii) aislar el ácido nucleico (por ejemplo, geonómico, mARN o ambos) de las células de la muestra, (iii) poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores los cuales se hibridan específicamente a 5' y 3' a al menos un alelo de la SAA que es indicativo del glaucoma bajo las condiciones tales que ocurra la hibridación y la amplificación del alelo, y (iv) detectar el producto de amplificación. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácidos nucleicos si tales moléculas están presentes en números muy bajos. En una modalidad preferida del ensayo objetivo, los niveles o actividades anormales de la SAA que son indicativos del glaucoma se identifican por las alteraciones en los patrones de escisión de enzimas de restricción. Por ejemplo, el ADN de muestra y de control se aislan, se amplifican (opcionalmente) , se digieren con una o más endonucleasas de restricción, y se determinan las longitudes de los fragmentos por electroforesis. En aun otra modalidad, cualquiera de una variedad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica se puede usar para secuenciar directamente el alelo. Las reacciones de secuenciación ejemplares incluyen aquellas basadas en las técnicas desarrolladas por Maxim y Gilbert (1979) o Sanger (1977) . También se contempla que cualquiera de una variedad de procedimientos de secuenciación automática se pueda utilizar cuando se llevan a cabo los ensayos del sujeto. Incluyendo la secuenciación por espectrometría de masas (véase, por ejemplo WO94/16101; Cohén et al., 1996; Griffin et al., 1993). Será evidente para una persona experimentada en la técnica que para ciertas modalidades, la aparición de sólo uno, dos o tres de las bases de ácido nucleico necesitan ser determinadas en la reacción de secuenciación. Por ejemplo, A-Track o los similares, por ejemplo, cuando se detecta sólo un ácido nucleico, se puede llevar a cabo. En una modalidad adicional, la protección de los agentes de escisión (tales como una nucleasa, hidroxilamina o tetraoxido de osmio y con piperidina) se puede usar para detectar bases incompatibles en el heteroduplos de ARN/ARN o ARN/ADN ADN/ADN (Myers, et al., 1985b; Cotton et al., 1988; Saleeba et al., 1992). En una modalidad preferida, el ADN o ARN de control se pueden etiquetar para la detección. Aun en otra modalidad, la reacción de escisión diferencial emplea una o más proteínas que reconocen los pares de bases incompatibles en el ADN de doble hebra (llamadas enzimas de "reparación de ADN incompatible") . Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde A en los desajustes de G/A y la timidina ADN glicosilasa de células HeLa escinde los desajustes T y G/T (Hsu, et al., Patente Norteamericana No. 5,459,039) . En otras modalidades, las alteraciones en la movilidad electroforética se usaran para identificar los niveles o actividades anormales de la SAA que son indicativos del glaucoma. Por ejemplo, el polimorfismo de conformación de hebra individual (SSCP) se puede usar para detectar las diferencias en la movilidad electroforética entre los ácidos nucleicos mutantes y del tipo silvestre (Arita et al., 1989; Cotton 1993; Hayashi 1992; Keen, et al., 1991). En aun otra modalidad, el movimiento de los alelos en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de desnaturalizante, se analizan usando electroforesis en gel por gradiente de desnaturalizante (DGGE) (Myers, et al., 1985a). En una modalidad adicional, se utiliza un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente de agente desnaturalizante para identificar las diferencias en la movilidad del ADN de control y de muestra (Rosembaum y Reissner 1987) . Los ejemplos de otras técnicas para detectar los alelos incluyen, pero no se limitan a hibridación selectiva de oligonucleótidos, amplificación selectiva, o extensión selectiva del cebador. Por ejemplo, se pueden preparar cebadores de oligonucleótido en los cuales la diferencia conocida de la mutación o el nucleótido (por ejemplo, en las variantes alélicas) se coloca centralmente y después se hibridiza con el ADN objetivo bajos las condiciones que permitan la hibridación sólo si se encuentra una correspondencia perfecta (Saiki et al., 1986; Saiki et al., 1989) . Tales técnicas de hibridación de oligonucleótidos específica del alelo se pueden usar para evaluar una mutación o región polimorfita por reacción cuando se hibridan los oligonucleótidos al ?DN objetivo amplificado por PCR o varias mutaciones o regiones polimorfitas cuando los oligonucleótidos se enlazan a la membrana de hibridación y se hibridizan con el ADN objetivo etiquetado. Alternativamente, la tecnología de amplificación específica del alelo la cual depende de la amplificación PCR selectiva se puede usar en conjunción con la presente invención. Los oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación específica puede transportar la mutación o la región polimorfita de interés en el centro de la molécula (de modo tal que la amplificación depende de la hibridación diferencial) (Gibas et al., 1989) o en el extremo 3' de un cebador, bajo las condiciones apropiadas, la incompatibilidad puede prevenir, o reducir la extensión de la polimerasa (Prossner 1993) . Además puede ser deseable introducir un nuevo sitio de restricción en la región de la mutación para crear la detección basada en la escisión (Gasparini, et al., 1992). Se anticipa que en ciertas modalidades la amplificación también se puede llevar a cabo usando Taq ligasa para la amplificación (Barany 1991) . En tales casos la ligación ocurrirá sólo si existe una correspondencia perfecta en el extremo 3' de la secuencia 5' haciendo posible detectar la presencia de una mutación conocida en un sitio específico, buscando la presencia o ausencia de la amplificación.

En otra modalidad, la identificación de una variante alélica se lleva a cabo usando un ensayo de ligación de oligonuleótidos (OLA) como se describe, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 4,998,617 y en Landegren et al., 1988). Nickerson et al., han descrito una ensayo de detección de ácidos nucleicos que combina los atributos de la PCR y OLA (Nickerson et al., 1990). En este método, la PCR se usa para lograr la amplificación exponencial del ADN objetivo, el cual se detecta usando OLA. Se han desarrollado varias técnicas basadas en este método OLA y se pueden usar para detectar niveles o actividades anormales de la SA? que son indicativas del glaucoma. Por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,593,826 y Tobe et al., (1996), describen tales técnicas que se usan frecuentemente . En una modalidad, el fenofibrato, el agonista de receptor a activado por el proliferador de peroxisomas (PPARa) , se puede formular en una composición farmacéuticamente aceptable y se usa para tratar el glaucoma modulando la expresión de SAA. Los estudios han demostrado que el tratamiento con fenofibrato y WY 14643 reduce la concentración de SAA del plasma (Yamazaki et al., 1002). Se cree que otros agonistas de PPARa, tales como el ciprofibrato, ácido 2-bromohexanodecanoico, benzafibrato, ciprofibrato y ciglitazona también pueden ser útiles para el tratamiento del glaucoma . Los inventores presentes postulan además que los agentes que previenen la muerte celular inducida por amiloides pueden ser útiles para proteger a TM y otras células oculares en la úvea interior y el fondo del ojo, en especial la retina y la cabeza del nervio óptico. Los compuestos de esta invención se pueden incorporar en varios tipos de formulaciones oftálmicas para administración al ojo (por ejemplo, tópicamente, intracameralmente, o vía un implante) . Los Compuestos preferiblemente se incorporan en formulaciones oftálmicas tópicas para administración al ojo. Los compuestos se pueden combinar con conservadores, oftalmológicamente aceptables, surfactantes, mejoradores de viscosidad, mejoradores de penetración, amortiguadores, cloruro de sodio, y agua para formar una suspensión o solución oftálmica estéril, acuosa. Las formulaciones de soluciones oftálmicas se pueden preparar disolviendo un Compuesto en un amortiguador isotónico fisiológicamente aceptable. Además, la solución oftálmica puede incluir un surfactante oftalmológicamente aceptable para ayudar a disolver el Compuesto. Además, la solución oftálmica puede contener un agente para aumentar la viscosidad, tales como, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, o los similares, para mejorar la retención de la formulación en el pliegue conjuntival. Los agentes de gelificación también se pueden usar, incluyendo, pero no limitados a, gelano y goma de xantano. Para preparar formulaciones de ungüentos oftálmicos estériles, el ingrediente activo se combina con un conservador en un vehiculo apropiado, tales como, aceite mineral, lanolina liquida, o petrolato blanco. Las formulaciones de geles oftálmicos estériles se pueden preparar suspendiendo el Compuesto en una base hidrofilita preparada de la combinación de, por ejemplo, carbopol-974, o los similares, de acuerdo a las formulaciones publicadas para las preparaciones oftálmicas análogas; se pueden incorporar conservadores y agentes de tonicidad. Los compuestos se formulan preferiblemente como suspensiones oftálmicas tópicas o soluciones, con un ph de aproximadamente 4 a 8. El establecimiento de un régimen de dosificación específico para cada individual se deja a la discreción de los médicos. Los Compuestos normalmente están contenidos en estas formulaciones en una cantidad de 0.01% a 5% en peso, pero preferiblemente en una cantidad de 0.05% a 2% y más preferiblemente en una cantidad de 0.1 a 1.0% en peso.

La forma de dosificación puede ser una solución, microemulsión de suspensión. Por lo tanto, para la presentación tópica, 1 o 2 gotas de estas formulaciones se administrarían a la superficie del ojo 1 a 4 veces por día, de acuerdo con la discreción de un medico experimentado. Los compuestos también se pueden usar en combinación con otros agentes para tratar el glaucoma, tales como, pero no limitados a bloqueadores ß, prostaglandinas, inhibidores de anhidrasa carbónica, agonistas de a2, mioticos y neuroprotectores. Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Se debería apreciar por aquellas personas experimentadas en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan las técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la practica de la invención, y por lo tanto se considera que constituyen los modos preferidos para su practica. Sin embargo, aquellas personas experimentadas en la técnica apreciarán, a la luz de la presente descripción, que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas las cuales se describen y aun obtener un resultado igual o similar son apartarse del espíritu y el ámbito de la invención.

Ejemplo 1. Expresión aumentada de SAAl y SAA2 en células y tejidos de TM glaucomatosos. Conjuntos de ARN de tejidos de TM de 13 donadores normales vs. Donadores con glaucoma se usaron para determinar la expresión del gen usando el equipo Affymetric GeneChips (HG-UI33) . Se identificó que la expresión de amiloide A2 aumento 4 veces en el glaucoma en comparación con aquella en los tejidos normales. Para confirmar este resultado, se llevó a cabo una QPCR usando ARN individual de 12 tejidos glaucomatosos y 11 normales. Cinco de los 12 tejidos TM glaucomatosos (42%) mostraron un aumento significativo en la expresión de SAA1/2. El promedio de expresión en los 12 TM de glaucomatosos fue de 5.4 veces el de los 11 TM normales (FIG. 1) . Además, se observó una tendencia similar de la expresión diferencial de SAA en las células TM con glaucoma o los tejidos de la cabeza del nervio óptico. Hubo un incremento promedio de 5.4 veces en las células de TM con glaucoma (14 líneas celulares de TM con glaucoma vs . 11 normales, FIG. 2A) y 118 veces en los tejidos de la cabeza del nervio óptico con glaucoma (14 con glaucoma vs. 12 normales, Fig. 2B) en comparación con los normales, respectivamente. El análisis ELISA de la SAA en los tejidos de TM de 6 donadores normales y 6 con glaucoma mostró que la proteína SAA también se elevó significativamente en los tejidos TM con glaucoma en comparación con los normales . Hubo una diferencia de tres veces la concentración de SAA en el tejido glaucomatoso en comparación con el tejido normal (11.3 y 3.8 µg/mg de proteína respectivamente). Estos datos se muestran en la FIG. 3. ' Se demostró además una asociación de la expresión aumentada de SA? con el glaucoma en el humor acuoso humano. La proteína SAA se midió por ELISA en el humor acuoso de 16 individuos normales y 20 glaucomatosos. Se encontró que la SAA fue casi 3 veces mayor en el humor acuoso glaucomatoso que en las muestras normales (10.0 ng/ml vs . 3.7 ng/ml, respectivamente). Los resultados se muestran en la FIG. 4. EJEMPLO 2. Formulación de Fenofibrato para aplicación tópica: Las suspensiones de fibrato al 1% para aplicación tópica reducen la SAA y bajan la IOP en el ojo.

Descripción Conc. Unidades Propósito Fenofibrato (AL18543, NOC 1% %P/V ingrediente activo hidroxipropil metilcelulosa 0.5% %P/V modificador de viscosidad (2910)(E4M), USP fosfato de sodio dibásico 0.2 % %P/V agente amortiguador (anhidro), usp cloruro de sodio, usp . 0.75% %P/V agente de tonicidad edta disódico 0.01% %P/V agente quelante (edetato disódico), usp polisorbatoo 80, nf 0.05% %P/V agente humectante cloruro de benzalconio, nf 0.01% %P/V conservador hidróxido de sodio, nf q.s. pH %P/V ajuste de pH ácido clorhídrico, nf q.s. pH %P/V ajuste de pH agua purificada, usp q.s. 100% %P/V vehículo Ejemplo 3. Procedimiento para seleccionar e identificar los compuestos que alteran la expresión del mARN de SAA o las proteinas SAA Un método que se puede usar para seleccionar los agentes que alteran la expresión y la función de SAA es determinar los cambios en los niveles de la proteína SAA. Los equipos para el ensayo in vitro para la determinación cuantitativa del Amiloide A del Suero (SAA) en el suero, plasma, soluciones amortiguadas, medios de cultivo celular, y extractos de tejido o células están disponibles comercialmente. El ensayo es un Ensayo Inmuno-Sorbente Enlazado a un Enzima (ELISA) intercalado. Un anticuerpo monoclonal específico para la SAA se ha revestido sobre los pozos de una placa de microtitulación. Las muestras, que incluyen los estándares de contenido conocido de SAA, o las incógnitas, se agregan a estos pozos junto con un anticuerpo secundario conjugado con la fosfatasa alcalina o peroxidasa. Los anticuerpos se construyen de modo tal que ninguno de los dos interfiere con el epitope de enlazamiento del otro. La SAA se captura sobre la placa por el anticuerpo inmovilizado y también se etiqueta con el segundo anticuerpo conjugado en un procedimiento de un paso. Después de un periodo de incubación, la placa se lava para remover todo el material no enlazado y se agrega un substrato (PNPP o peróxido) . La intensidad de los productos coloreados es proporcional a la concentración de SAA presente en la muestra incógnita. Ejemplo 4. Inducción de la SAA en lineas celulares cultivadas por los compuestos seleccionados que alteran la expresión del mARN de SAA o la proteina. La línea de células humanas, HepG2, se usa ampliamente para estudios sobre la inducción de SAA por las citocinas, para la transfección con plásmidos, y ensayos reporteros. La síntesis de mARN de SAA y la proteína se puede inducir por varias citocinas en varias líneas celulares de hematoma humanas, incluyendo PCL/PRF/5, HepB y HepG2 (Uhlar y Whitehead 1999) . La síntesis de SAA por las células del músculo liso aórtico humano (HASMC) se induce por las hormonas glucocorticoides y no por las citocinas proinflamatorias, IL-1, IL-6 y TNF-a, las cuales estimulan la producción de SAA por los hepatocitos (Ku on et al., 2002b; Kumon et al., 2001; Thorn y Whitehead 2002) . La SAA estimuló la migración quimiotáctica de HASMC en una manera dependiente de la dosis cuando se ensayó usando una cámara de cultivo Chemotaxicell (Kumon et al., 2002a). La expresión de mARN de SAA y la producción de proteína se demostró en los cultivos primarios en sinoviocitos de artritis reumatoide (O'hara et al., 2000).

Ejeemplo 5. Análisis funcional de SAA en células cultivadas . Las propiedades similares a la citocina de la SAA incluyen la inducción de la secreción de IL-8 por los neutrófilos. (Furlaneto y Campa, 2002; He et al., 2003). Se identificó que las células HL-60, una línea de células promielociticas, responden a la SAA con secreción aumentada de IL-8 , y se pueden usar para ensayos in vitro de la función de SAA. Las células HL-60 se trataron por cuatro horas con concentraciones crecientes de SAA humana recombinante, y se midió la IL-8 en el medio por ELISA. La secreción de IL-8 aumentó de IL-8 en una manera dependiente de la dosis (FIG. 5) . Las células HL-60 se pueden usar como una línea celular substituta para ensayos funcionales, para identificar los agentes que alteran la función y los niveles de expresión de la SAA. Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicados aquí se pueden hacer y ejecutar sin experimentación excesiva, a la luz de la presente descripción. En tanto que las composiciones y los métodos de esta invención se han descrito en términos de las modalidades preferidas, será aparente para aquellas personas experimentadas en la técnica, que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/o los métodos y en los pasos o en la secuencia de los pasos del método descrito aquí, sin apartarse del concepto, el espíritu y el ámbito de la invención. Más específicamente, será aparente que ciertos agentes los cuales están relacionados tanto químicamente y estructuralmente se pueden sustituir por los agentes descritos aquí, para lograr resultados similares. Todas las tales substituciones y modificaciones aparentes para aquellas personas experimentadas en la técnica se consideran dentro del espíritu, el ámbito y el concepto de la invención como se define por las reivindicaciones anexas. Referencias Las siguientes referencias, en la extensión en la medida que estas proporcionan procedimientos ejemplificantes u otros detalles complementarios a aquellos establecidos aquí, se incorporan aquí específicamente como referencia. Patentes Norteamericanas Libros Otras Publicaciones Furlenato, CJ, y Campa A, A novel functíon of serum amyloid A: a potent stimulus for the reléase of tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1 beta, and interleukin-8 by human blood neutrophil, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN 268:405-408 (2002) .

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Claims (13)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para tratar el glaucoma, dicho método que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo, una cantidad efectiva terapéuticamente de una composición que comprende un agente que interactúa con un gen que codifica la proteína amiloide A del suero (SAA) , caracterizado porque dicha interacción modula la expresión de la SAA.
2. 2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, dicho agente es una proteína, péptido, mimético de péptido, molécula pequeña o ácido nucleico.
3. 3. Un método para tratar el glaucoma, dicho método, caracterizado porque, comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva terapéuticamente de una composición que comprende un agente que inhibe la interacción de la proteína amiloide A del suero (SAA) con su receptor.
4. 4. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque, dicho agente es un agonista del receptor a activado por el proliferador de peroxisomas (PPARa) , péptidos de taquicinina y sus análogos no peptídicos o ácido a-lipoico.
5. 5. El método de la reivindicación 4, caracterizado porque, el agente es fenofibrato, Wy-14643, ácido (4-cloro-6- (2, 3-xilidino) -2-pirimidniltiol) -acético) , ciprofibrato, ácido 2-bromohexadecanoico, benzafibrato y ciglitizona, bafilo icina, concanamicina o ácido pseudolarico B.
6. 6. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva terapéuticamente de un antagonista de la proteína amiloíde A del suero (SAA) y un portador farmacéuticamente aceptable.
7. 7. Un método para diagnosticar el glaucoma, dicho método, caracterizado porque comprende: c) obtener una muestra biológica de un paciente; y d) analizar dicha muestra en cuanto a los niveles, bioactividad o mutaciones anormales del gen que codifica la proteína amiloide A del suero (SA?) , su región promotora, o los productos genéticos, en donde dicho gen que codifica la SAA comprende la secuencia establecida en la SEC ID N0:1 o la SEC ID NO: 3; dicha región promotora comprende la secuencia establecida en la SEC ID NO: 12 o la SEC ID NO: 13, y en donde la SAA comprende la secuencia establecida en la SEC ID NO: 2 o la SEC ID NO: 4; en donde el nivel o bioactividad anormalmente altos o las mutaciones de los genes de SAA o los productos genéticos indica un diagnóstico de glaucoma.
8. 8. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque, la muestra biológica es tejido ocular, lagrimas, humor acuoso, fluido cerebroespinal, nasal, o raspado de mejilla o suero.
9. 9. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque, la muestra biológica comprende células de la malla trabecular.
10. 10. Un método para diagnosticar el glaucoma en un paciente, dicho método caracterizado porque, comprende: e) recolectar células de un paciente; f) aislar el ácido nucleico de las células; g) poner en contacto la muestra con uno o más cebadores los cuales hibridan específicamente el 5' y 3' con al menos un alelo de la SEC ID N0:1, la SEC ID N0:3, la SEC ID NO: 12, o la SEC ID NO: 13, bajo las condiciones tales que ocurre la hibridación y la amplificación del alelo; y h) detectar el producto de la amplificación; en donde el nivel anormal o las mutaciones de la SEC ID NO:l o la SEC ID NO: 3 en la muestra indican un diagnóstico de glaucoma.
11. 11. Un método para identificar agentes potencialmente útiles para tratar el glaucoma, dicho método, caracterizado porque comprende los pasos de: a) obtener células que expresan la SAA (SEC ID N0:1 o SEC ID NO: 2) o células gue contienen el gen promotor/reportero de SAA tal que se expresa el gen reportero; b) mezclar una sustancia candidata con las células; y c) determinar el nivel de proteína SAA (SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4) o el nivel de expresión del gen en las células; en donde un aumento o reducción de la producción de proteína SAA o la expresión del gen en presencia de dicha sustancia candidata indica un agente potencialmente útil para el tratamiento del glaucoma.
12. 12. Un método para identificar un agente potencialmente útil para tratar el glaucoma, dicho método caracterizado porque comprende los pasos de: a) formar una mezcla de reacción que comprende: (i) células que comprenden la proteína recombinante SAA (SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4) o células que comprenden los vectores de expresión que comprenden la SEC ID NO:l o la SEC ID NO: 3; y (ii) un compuesto de prueba; y b) detectar el efecto sobre la señalización corriente abajo (IL-8) en presencia del compuesto de prueba y en ausencia del compuesto de prueba; en donde una reducción o aumento en la señalización corriente abajo en presencia del compuesto de prueba, con relación a la interacción' en ausencia del compuesto de prueba indica un agente potencialmente útil para tratar el glaucoma.
13. 13. Un método para identificar un agente potencialmente útil para tratar el glaucoma, dicho método, caracterizado porque comprende : c) formar una mezcla de reacción que comprende: (iii) una proteína SAA o células que expresan la SAA o un gen reportero activado por un promotor de SAA; (iv) una pareja de enlace de la proteína SAA; y (v) un compuesto de prueba; y d) detectar la interacción de la proteína SAA y el pareja de enlace o el nivel de los productos del gen reportero en presencia del compuesto de prueba y en ausencia del compuesto de prueba; en donde una reducción o aumento en la interacción de la proteína SAA con su pareja de enlace en presencia del compuesto de prueba, con relación a la interacción en ausencia del compuesto de prueba indica un agente potencialmente útil para tratar el glaucoma.