MXPA06006266A - Proteina nmb1125 y su uso en formulaciones farmaceuticas - Google Patents

Abstract

Uso de un nuevo antígeno vacunal aplicado de manera preventiva o terapéutica contra enfermedades bacterianas, virales, cancerosas, o de otro origen;el objetivo técnico que se persigue esel desarrollo de formulaciones capaces de elevar el espectro protector de las vacunas ya existentes y extenderlo contra diferentes patógenos;para lograr este objetivo se aislóe identificóla proteína NMB1125 como componente de las preparaciones de membrana externa de Neisseria meningitidis, capaz de inducir actividad bactericida;adicionalmente, se clonóy expresóel gen codificante para la proteína NMB1125, la cual se purificóevaluándose luego su inmunogenicidad en biomodelos animales. El secuenciamiento de genes homólogos evidenció, por su elevado grado de conservación, su alto valor como antígeno inductor de una respuesta inmune cruzada cuando es presentado por diferentes vías. Las formulaciones resultantes de esta invención son aplicables en la industria farmacéutica como formulaciones vacunales para uso humano.

Description

PROTE1NA NMB1125 Y SU USO EN FORMULACIONES FARMACÉUTICAS MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención está relacionada con la rama de la medicina, particularmente con el desarrollo de nuevas formulaciones vacunales, de aplicación preventiva o terapéutica, que permitan un aumento en la calidad de la respuesta inmune contra antígenos vacunales contra enfermedades de origen diverso. Neissería meningitidis, un diplococo Gram negativo cuyo único hospedero es el hombre, es el agente causal de la meningitis meningocóccica. Usualmente esta bacteria se encuentra en estado de portador asintomático en la población, siendo esta la vía más común para su aislamiento microbiológico. En el mundo los niños menores de 2 años de edad son la población más susceptible a contraer la meningitis meningocóccica, sin embargo, los adolescentes jóvenes y la población de adultos mayores también pueden ser afectados. La enfermedad meningocóccica sin tratamiento es fatal en la mayoría de los individuos afectados, y la vacunación podría prevenir esta situación evitando incluso etapas tan tempranas como la colonización bacteriana.

Diversas estrategias se han desarrollado con el objetivo de obtener un preparado vacunal que satisfaga los requisitos necesarios para proteger a la población contra esta enfermedad. Para ello se han tenido en cuenta los antígenos capsulares cuya especificidad inmunológica ha permitido la clasificación de este microorganismo en serogrupos. En la actualidad se han definido 5 de estos serogrupos como los responsables de la mayoría de los casos de enfermedad meningocóccica en el mundo. El serogrupo A es el principal responsable de las epidemias en África subsahariana. Los serogrupos B y C están asociados a la mayor parte de los casos que ocurren en los países desarrollados. Los serogrupos Y y W135 están presentes en la mayoría de los casos remanentes de la enfermedad y de infección prevalente en algunas regiones de los Estados Unidos, con un marcado incremento en los últimos años. De ahí que los pollsacáridos capsulares hayan sido objeto de estudio y evaluación como candidatos vacunales. Una vacuna tetravalente, basada en pollsacáridos, que confiere protección contra los serogrupos A, C, Y, y W-135 ha sido licenciada en los Estados Unidos. Los anticuerpos que son generados tras la vacunación son serogrupo- específico (Rosenstein N. et al. 2001. Menningococcal disease. N. Engl. J. Med, 344, 1378-1388). El serogrupo B, a diferencia del resto, continúa siendo una importante causa de enfermedad menlngocóccica endémica y epidémica, en gran parte debido a la no existencia de vacunas efectivas contra el mismo. Se ha visto que el pollsacárido del serogrupo B posee una baja inmunogenicidad, además del riesgo teórico que existe de que vacunas basadas en este compuesto podrían desarrollar inmunotolerancia e inducir autoinmunidad dada su homología estructural con cadenas oligosacarídicas presentes en estructuras fetales humanas (Finne J. et al. 1987. An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tisúes. J. Immunol, 138: 4402-4407). Por este motivo, el desarrollo de vacunas contra el serogrupo B se ha concentrado en el uso de antígenos subcapsulares.

Vacunas de vesículas y proteínas de membrana externa En la década de los años 70 la producción de vacunas de proteínas de membrana externa (PME), estuvo basada en la eliminación del lipopolisacárido (LPS) de las preparaciones proteicas mediante la utilización de detergentes (Frasch CE and Robbins JD. 1978. Protection against group B meningococcal disease. III. Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity of protection in a guinea pig model. J Exp Med 147(3):629-44). Después, las PME fueron precipitadas para producir agregados resuspendidos en cloruro de sodio. A pesar de los buenos resultados obtenidos en estudios realizados en animales, estas vacunas no indujeron anticuerpos bactericidas ni en adultos ni en niños (Zollinger WD, eí al. 1978. Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animáis and humans. J. Infect. Dis. 137(6):728-39), resultado que fue atribuido a la desnaturalización de las proteínas presentes en la preparación como resultado de la precipitación. Los próximos pasos en la búsqueda de un nuevo candidato, fueron: diseñar una vacuna que presenta las proteínas en su conformación nativa formando vesículas de membrana externa (Zollinger WD, eí al. 1979. complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J. Clin. Invest. 63(5):836-48, Wang LY and Frasch CE. 1984. Development of a Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model. Infecí Immun. 46(2):408-14136). Las vacunas compuestas por vesículas de membrana externa (VME) fueron significativamente más inmunogénicas por vía parenteral que los agregados de PME, y esta inmunogenicidad fue explicada inicialmente por una mayor adsorción al adyuvante hidróxido de aluminio (Wang LY and Frasch CE. 1984. Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model.. Infect Immun. 46(2):408-14136). Varios estudios de eficacia se han llevado a cabo utilizando vacunas basadas en vesículas de membrana externa, en diferentes formulaciones. Las dos vacunas más ampliamente estudiadas fueron desarrolladas en los años 80 en respuesta a brotes de la enfermedad meningocóccica en Cuba (Sierra GV eí al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2): 195-210) y Noruega (Bjune G, eí al. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775): 1093-6), respectivamente. La vacuna producida por en Instituto Finlay en Cuba (comercialmente denominada VA-MENGOC-BC®) es producida a partir de la cepa B:4:P1.19,15 y está compuesta por una preparación de PME de dicha cepa y polisacárido capsular aislado del serogrupo C, adsorbidas a hidróxido de aluminio (Sierra GV eí al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2):195-210). Esta vacuna contribuyó a un rápido descenso de \a epidemia en Cuba (Rodríguez AP, et al. The epidemiológica! impact of antimeningococcal B vaccination in Cuba.1999. Mem Inst Oswaldo Cruz. 94(4):433-40). La vacuna producida por el Instituto Nacional de Salud Pública de Noruega (NIPH) fue inicialmente utilizada durante un período hiperendémico de la enfermedad causada por una cepa perteneciente al clon ET-5 (B:15:P1.7,16). Esta vacuna monovalente también fue producida a partir de VME purificadas y adsorbidas a hidróxido de aluminio (BjuneG, et al. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775): 1093-6). Las vacunas de VME parecen ser efectivas en la presentación de PME, dispuestas en su conformación natural, para permitir la generación de anticuerpos bactericidas, al menos en adolescentes y adultos. Las respuestas de anticuerpos generadas, incrementaron la opsonofagocitosis del meningococo. La formulación precisa de las vacunas (por ejemplo: contenido de PME, contenido de LPS y la presencia o ausencia del adyuvante) tiene un significativo impacto en la inmunogenicidad existiendo grandes diferencias de un productor a otro según la cepa y/o la metodología empleada (Lehmann AK, eí al. 1991. Immunization against serogroup B meningococci. Opsonin response in vaccinees as measured by chemiluminescence. APMIS. 99(8):769-72, Gómez JA, eí al. 1998. Effect of adjuvants in the isotypes and bactericida! activity of antibodies against the transferrin-binding proteins of Neisseria meningitidis. Vaccine.16(17):1633-9, Steeghs L, eí al. 1999. Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in a Lipopolysaccharide- Deficient Mutant of Neisseria meningltidls: Influence of Adjuvants on the Immune Response. Infecí Immun. 67(10):4988-93). Sin embargo, el perfil antigénlco de los aislamientos obtenidos de pacientes cambia rápidamente y una vacuna abarca sólo un limitado número de cepas, por tanto puede ser inefectiva en unos años si las cepas que la componen no se corresponden con la epidemia local existente. Hasta el momento, las vacunas de VME han sido más utilizadas que cualquier otra vacuna del serogrupo B y son útiles en el contexto de los brotes de la enfermedad causada por un solo tipo de cepa. Los ¡nmunógenos responsables de la reactividad cruzada inducida por este tipo de preparados no han sido completamente caracterizados, y muchos antígenos presentes en estos preparados restan por ser identificados. Estudios realizados con los sueros provenientes de ensayos clínicos del Instituto Finlay y el NIPH, sugieren que los anticuerpos contra la proteína de clase 1 (P1 , también llamadas PorA) y Opc (otra PME mayoritaria) (Wedege E, eí al. 1998. Immune Responses against Major Outer Membrane Antigens of Neisseria meningitidis in Vaccinees and Controls Who Contracted Meningococcal Disease during the Norwegian Serogroup B Protection Trial. Infecí Immun. 66(7): 3223-31), son importantes mediadores de la actividad bactericida del suero (fundamentalmente P1) y en ambas proteínas se observó una marcada variabilidad de cepa a cepa. La proteína P1 es un antígeno con un significativo nivel de variabilidad, el. cual parece experimentar variación continua entre y durante los brotes (Jelfs J, et al. 2000. Sequence Variation in the porA Gene of a Clone of Neisseria meningitidis during Epidemic Spread. Clin Diagn Lab Immunol. 7(3):390-5) y hacia el cual van dirigidos predominantemente los anticuerpos bactericidas después de la vacunación (y después de la enfermedad), por lo que la protección producto de la inmunización con vacunas de VME de una sola cepa (monovalentes), las cuales pudieran ser serosubtipo específica (por ejemplo dependientes del tipo de P1 ), se hace cuestionable. Para resolver este problema se desarrolló una vacuna de VME en Holanda, (RIVM) que contenía P1 de seis aislamientos patogénicos diferentes (Van Der Ley P and Poolman JT. 1992. Construction of a multivalent meningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membrane protein. Infecí Immun. 60(8):3156-61 , Claassen I, et al. 1996. Production, characterization and control of a Neisseria meningitidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine. Vaccine. 14(10):1001-8). En este caso las vesículas fueron extraídas de dos variantes de la cepa H44/76, genéíicameníe manipulada para expresar tres proteínas P1 independientes.

La búsqueda de un antígeno universal Aunque las proíeínas de membrana exíema (PME) pueden . inducir una respuesía inmune funcional coníra el serogrupo B, ninguna de las vacunas confiere una proíección universal, debido a la gran heíerogeneidad de las regiones expuesías en la superficie de las PME. La discrefa reacíividad cruzada inducida por las vacunas de vesículas de membrana exíerna (VME) ha inceníivado la búsqueda de un anfígeno de membrana exíerna (o de un grupo de aníígenos), que induzca anticuerpos funcionales y esté presente en todas las cepas del meningococo. Estos antígenos deben ser la base para una vacuna antimeningocóccica realmente universal, la cual eliminará el potencial problema de la modificación capsular en las cepas patogénicas, después de la vacunación con polisacárido. Debido a la variabilidad de la proteína inmunodominante P1 , su uso en una vacuna universal está limitado y por tanto otras PME mayoriíarias fueron consideradas candidaíos para una vacuna y muchas de ellas se encueníran en desarrollo. Algunas de las que han sido incluidas son: proteínas de clase 5 (Opc), NspA y proteínas reguladas por hierro (TbpA y B, FbpA y FetA). TbpB forma parte del complejo de unión de íransferrina, junio con TbpA. Recientes trabajos sugieren que la TbpA íiene una función más importante en la unión al hierro (Pintor M, eí al. 1998. Analysis of TbpA and TbpB functionality in defective mutants of Neisseria meningitidis.

J Med Microbiol 47(9): 757-60) y es un inmunogéno más efecíivo que la TbpB.

Una PME minoriíaria, alíameníe conservada, ha sido descubierta a íravés de una íécnica novedosa, la que consisíe en emplear combinaciones de PME provenieníes de difereníes cepas para inmunizar ratones (Martin D, et al. 1997. Hlghly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). Se utilizaron células B de ratones inmunizados para producir hibridomas, y los mAbs se examinaron para evaluar la reactividad cruzada contra múltiples cepas del meningococo. Como resultado se enconíró un aníicuerpo monoclonal con reacfividad cruzada que reconoció una PME de 22 kDa y fue designada como NspA, La inmunización con NspA indujo respuesía de anticuerpos bactericidas en ratones contra las cepas de los grupos A hasía C. Esía proíeína íambién proíege coníra la infección meningocóccica leíal (Martin D, et al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). La comparación de secuencias de NspA, genéíicameníe divergeníes, demosíró que la proteína está alíameníe conservada (97% homología) (Cadieux N, eí al. 1999. Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infecí Immun 67 (9): 4955-9). La presencia de NspA se deíecíó por ELISA en un 99.2% de las cepas íesíadas pertenecieníes a los serogrupos desde la A hasía la C, uíilizando aníicuerpos monoclonales (Martin D, et al. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). Se ha comprobado que estos aníicuerpos monoclonales presenían acílvidad bacíericida coníra numerosas cepas del menlngococo y son capaces de reducir la bacíerlemla provocada por esíe microorganismo en un modelo murino (Cadieux N, eí al. 1999. Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infecí Immun 67 (9): 4955-9). Aunque estos resulíados sugieren que la NspA es un promeíedor candidato vacunal capaz de conferir proíecclón coníra varios serogrupos, un suero policlonal de ratón confra la proíeína recomblnaníe, no se asoció a la superficie en un 35% de las cepas de menlngococo del serogrupo B, a pesar de la presencia del gen nspA en estos organismos (Moe GR eí al. 1999. Differences in Surface Expression of NspA among Neisseria meningitidis Group B Strains. Infecí Immun 67 (11 ): 5664-75).

Presentación de los antíqenos y la formulación de la vacuna. Los primeros írabajos sugirieron que la forma en que los aníígenos eran preseníados era muy importante para generar una respuesta inmune. Los epitopos presentes en las proteínas que se encueníran unidas a la membrana, en muchos casos, dependen de la correcía esírucíura terciaria y la misma a su vez, depende frecueníemeníe de los dominios hidrofóbicos unidos a la membrana. Esíe efecío se ha demosírado en preparaciones de PME que resulían inmunogénicas en humanos, sólo cuando se presenían en forma de vesículas (Zolllnger WD, eí al. 1979. complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J Clin Invesí 63 (5): 836-48, Zolllnger WD, eí al. 1978. Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animáis and humans. J Infecí Dis 137 (6): 728-39). Duraníe décadas se han uíilizado vacunas integradas por una sola proteína y generalmente han mosírado buena esiabilldad, pero la misma puede variar si se requiere la preseníación de las proíeínas en forma .de vesículas para lograr que los antígenos permanezcan unidos a la membrana. La inmunogenicldad y reactogenicidad de las VME puede variar con alíeraclones en la caníidad de proíeínas y LPS eliminadas duraníe el proceso de purificación. La consírucción de vesículas liposomales sintéíicas permiíe la opíimización y esíandarización de dichas vacunas (Chrisíodoulides M, eí al. 1998. Immunization with recombinant class 1 outer-membrane protein from Neisseria meningitidis: influence of liposomes and adjuvants on antibody avidity, recognitlon of native protein and the induction of a bactericidal immune response against meningococci. Microbiology 144(Pí 11 ):3027-37). Es decir, las PME han sido preseníadas en forma de vesículas y como proíeínas expresadas con un elevado grado de pureza, y en ambos casos se ha logrado desarrollar respuesía de aníicuerpos. La inyección iníramuscular de la vacuna aníimeningocóccica ha sido la vía ufilizada que permiíe la producción de inmunoglobulina G (IgG) sisíémica, aunque es importante la producción de IgA secretora, ya que duraníe la infección meningocóccica la invasión al hospedero ocurre por la vía del epitelio nasal.

Secuenciación del genoma de N. meningitidis La secuenciación del genoma de MC58 (una cepa de meningococo del serogrupo B) (Teítelin H, eí al. 2000. complete Genome Sequence of Neisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58. Science 287 (5459): 1809-15172) y de Z2491 (una cepa de serogrupo A) (Parkhill J, eí al. 2000. complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491. Naíure 404 (6777):502-6173) fueron publicadas duraníe el año 2000. La disponibilidad de las secuencias de ADN íiene una gran influencia en la investigación de una vacuna antimeningocóccica. Mieníras la secuenciación del genoma de MC58 coníinuaba su desarrollo, Pizza y colaboradores comenzaron ideníificando los marcos abiertos de lectora (ORFs) que fueron predichos para codificar las proteínas expuesías en la superficie, unidas a membrana y las que se exportan. Esíe grupo de invesíigadores ideníificaron 570 ORFs, amplificados a íravés de la reacción en cadena de la polimerasa y los clonaron en Escherichia coli, para permiíir la expresión de proíeínas de fusión con cola de hisíidina o gluíaíión S-íransferasa (Pizza M, eí al. 2000. Identification of Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus by Whole-Genome Sequencing. Science 287 (5459): 1816-20). El 61 % (350) de los ORFs seleccionados fueron expresados exiíosameníe, en la mayoría de los casos aquellos que no lograron expresarse, tenían más de un dominio hidrofóbico de íransmembraná. Las proíeínas recombinanfes fueron purificadas y se uíilizaron para inmunizar ratones. Los sueros obtenidos fueron evaluados por ELISA, ciíomeíría de flujo y se les determinó la acíivldad bactericida coníra 2 cepas. Posteriormente se seleccionaron 7 proíeínas que en los 3 ensayos resulíaron posiíivas. Las formulaciones vacunales empleando algunas de esías proíeínas combinadas con adyuvantes, indujeron íííulos significaíivos de aníicuerpos bactericidas coníra la cepa homologa (MC58), pero ninguno de ellos fue ían alto como los inducidos por una vacuna de VME de esfa misma cepa (Giuliani MM, eí al. 2000. Proceedings 12íh IPNC. p. 22). Por oíro lado, existen evidencias de que combinaciones de estas proíeínas resultan más inmunogénicas que cada proteína por separado (Santini L. et al. 2000. Proceedings 12íh IPNC. p. 25). Los numerosos ORFs excluidos en ese írabajo, quizás por la falía de la expresión proteica o por modificaciones de las propiedades inmunológicas, necesilan una invesíigación más profunda. Los componeníes de una vacuna deben seleccionarse en base a la coníribución de los aníígenos en la patogénesis de N. meningitidis. Los aníígenos por sí solos pueden ser efecíivos candidaíos vacunales, o alternativamente, los mutaníes atenuados pueden ser considerados integrantes de una vacuna. En esíe seníido, el empleo de candidaíos cuya secuencia esíé alíameníe conservada incluso eníre diferentes géneros de microorganismos patógenos, podria resulíar una solución a las afecíaciones producidas por los mismos en caso de que generen una conveniente respuesía por parte del sistema inmune.

El objeíivo técnico que se persigue con esía invención es precisamente el desarrollo de formulaciones capaces de elevar y/o ampliar la respuesía inmune del organismo coníra varios patógenos o coníra un especíro amplio de ariedades del mismo, siendo esíos. patógenos de carácter parasiíario, bacteriano, viral, canceroso u oíro.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En el írabajo objeto de la preseníe invención se reporta por primera vez el uso de la proíeína NMB1125 como componeníe de una formulación vacunal de carácter íerapeúíico o preveníivo coníra la enfermedad meningocóccica o cualquier infección provocada por un miembro del género Neisseria. El carácter novedoso de esía invención reside en el uso, previameníe no reportado, de la proteína NMB1125 en formulaciones con nuevas propiedades, capaces de inducir una respuesía inmune sisíémica y múcosal de amplío espectro protector, dado el carácter conservado de esía proteína en difereníes aislamientos de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Vector pM100 empleado en el clonaje y la expresión de la proíeína NMB1125. pTrlp, promotor íripíófano; N-íerm P64k, fragmento N-íermlnal de la P64k; T4 Terminaíor, íerminador de la íranscrlpción del bacteriófago T4. Figura 2. Consírucción final obtenida del clonaje de la secuencia nucleoíídica correspondiente al gen NMB1125 en el vector pM100. Figura 3. Análisis mediante SDS-PAGE de las fracciones obtenidas en la rupíura celular; carril 1 , células íoíales; carril 2, precipiíado de rupíura; carril 3, sobrenadante de rupíura. Figura 4. Análisis medianíe SDS-PAGE del proceso de purificación de la proleína NMB1125 a partir del sobrenadante de rupíura; carril 1 , proíeina resulíaníe; carril 2, proíeina coníaminanle de menor peso molecular que migra en oíro pico cromaíográfico; carril 3, muesíra aníes de aplicar. Figura 5. Niveles de aníicuerpos (IgG) coníra la proíeína recombinante NMB1125, obíenidos al inmunizar ratones con el mismo anlígeno por vía iníranasal o ¡níraperiíoneal. Se represenían los resulíados obíenidos en un ensayo íipo ELISA, que fueron expresados como el inverso del íííulo, calculado como la dilución de la muesíra donde se duplica la densidad ópíica de la muesfra preinmune.

Figura 6. Reconocimiento por Western blotting de la proteína NMB1125 presente en las PME de N. meningitidis uíilizando sueros de ratones inmunizados con la proíeína recombinaníe: La flecha indica la banda correspondiente a la proíeína NMB1125 inmunoideníificada. Figuras 7A y 7B. Respuesta de anlicuerpos IgA coníra la proteína recombinaníe NMB1125, a nivel mucosal, en ratones inmunizados con el anlígeno por vía iníranasal. Los resulíados se expresan como el inverso del íííulo, calculado como aquella dilución de la muesíra donde se duplica la densidad ópíica de la muesíra preinmune. (A) Respuesía dé aníicuerpos IgA en saliva. (B) Respuesía de aníicuerpos IgA en lavados pulmonares Figura 8. Resulíados de la búsqueda de similiíud enlre el gen que codifica para la proteína NMB1125 ("query") y las secuencias anoíadas de los genomas de diferentes serogrupos de Neisseria meningitidis ("Sbjcí") empleando el programa BLAST. Figura 9. Reconocimiento de la proíeína NMB1125 en diferentes cepas de N. meningitidis, por sueros producidos coníra el aníígeno recombinaníe. En el gráfico sólo se muesíran los valores obtenidos cuando se inmunizó con la proíeína semípurificada por vía iníraperiíoneal, aunque en el resío de los casos se observó un comportamiento similar. Los resulíados fueron expresados como el inverso del íífulo, calculado como la dilución del suero donde se duplica la densidad ópíica del suero preinmune.

Figura 10. Comparación eníre los sueros obíenidos inmunizando con la proíeína obtenida por dos procedimientos, adminisírada por vía iníraperííoneal, en el experimento de protección pasiva coníra infección meningocóccica, en el modelo de raía infante. Figura 11 : Reconocimiento de la proíeína NMB1125, y de un panel de aníígenos no relacionados, por los mAbs generados (mAbs H8/92, 3H2764 y 7D2/15). P1, proteína de clase 1 de Neisseria meningitidis cepa B:4:P1.15; P64k, subunidad E3 de la enzima piruvaío deshidrogenasa de Neisseria meningitidis; T.T, íoxoide tetánico; HBsAg, antígeno de superficie del virus de la Hepatiíis B. Figura 12. Reconocimiento de la proteína NMB1125 por sueros de pacieníes convalecientes de la enfermedad meningocóccica. Como conírol negaíivo se emplearon sueros de donaníes sanos. Los resulfados se represenían como la absorbancia (492nm) en un ensayo íipo ELISA. Figura 13. Tííulos de anticuerpos aníi-pépíido JY1 correspondieníes a los sueros de los animales inmunizados con el pépíido libre (JY1), la proíeína recombinaníe (NMB 1125) y el conjugado JY1-NMB1125.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN EJEMPLO 1 Detección de la proteína NMB1125 en preparaciones de vesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis, serogrupo B.

Con el objeíivo de estudiar las proíeínas presentes en preparaciones de vesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis serogrupo B (cepa B:4:P1.19,15), se realizó una elecíroforesis bidimensional según lo descrito en la liíeraíura (Gorg A, eí al. 1985. Elecírophoresis 6:599-604). A coníinuación se realizó una digesíión enzimáíica de las proteínas exíraídas del gel empleando la enzima íripsina (Promega, Madison, Wl, E.U). Los pépfidos generados durante la digesíión fueron exíraídos de la solución empleando microcolumnas (ZipTips, Millipore, MA, E.U). Previo al análisis por especíromefría de masas los pépíidos fueron eluídos de las microcolumnas con solución de aceíoniírilo al 60% y 1% de ácido fórmico e ínmediaíameníe la mezcla se cargó en nanoagujas (Profana, Dinamarca). Las mediciones se realizaron en un especfrómeíro de masas híbrido con cuadrupolo y íiempo de vuelo (QTof-2™, Manchesíer, Reino Unido), equipado con una fueníe de ionización (nanoESI). Los especíros de masas fueron adquiridos en un rango de m/z desde 400 hasía 2000 en 0.98 segundos y uíilizando 0.02 segundos enfre cada uno de los barridos. La adquisición y procesamiento de los datos fue realizada a íravés del programa MassLynx (versión 3.5, Micromass). La idenfificación de proíeínas basada en los especíros ESI-MS se realizó empleando el programa ProFound (Zhang W and Chaií BT. 2000. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem 72:2482-2489. http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound). La búsqueda se subscribió a las secuencias de genes y proíeínas de bacterias contenidas en las bases de datos SwissProí (http://www.ebi. ac.uk/swissprot/) y NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), considerando la oxidación de meíioninas, la desamídación y la carboxiamidomeíilación de cisíeínas como posibles modificaciones presentes. La ideníificación de las proíeínas basada en los especfros MS/MS se realizó a través del programa MASCOT (Perkins DN, eí al. 1999. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20:3551-3567. http://www.mairixscience.com/). Eníre los parámeíros de búsqueda se incluyó la modificación de cisteínas así como las posibles oxidaciones y desam.daciones. A partir del análisis de los datos obtenidos de la idenlificación de las proíeínas presentes en preparaciones de vesículas de membrana exíerna se seleccionó para evaluar como posible candidato vacunal a la proteína NMB1125 de la cual fue idenfificado mediante especlromeíría de masas 1 pépíido.

EJEMPLO 2 Análisis de homología de ia proteína NMB1125 con productos génicos reportados en bases de datos Para el análisis de homología de la proíeína NMB1125, se realizó una búsqueda de similiíud de secuencias en la base de datos del NCBI empleando el programa BLAST ( Alíschul SF, eí al. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Los resultados de este procedimiento señalaron como homólogos, además de a las correspondientes proteínas de otros serogrupos de Neisseria, a varios productos génicos de oíros microorganismos eníre los cuales se encuenfran proteínas hipoíéíicas de los géneros Ralstonia, Yersinia y Pseudomonas. La conservación de esía proíeína en esíos genomas, ha dado lugar a que se reúnan como grupo de proíeínas ortólogas en un dominio conservado reportado en la NCBI r(qnllCDD|13507, COG4259, Uncharacíerized proiein conserved in bacteria [Function unknown)], lo cual indica un común ancesíro filogenéíico para íodas ellas. El análisis de la vecindad del gen que codifica para la proíeína NMB1125 empleando la base de datos MBGD (Uchiyama, I. 2003. MBGD: microbial genome datábase for comaprative análisis. Nucleic Acids Res. 31 , 58-62.), reveló una significaíiva similiíud en la organización génica con los genes de los microorganismos aníes mencionados, io que unido a los datos anteriores, nos conduce a confirmarlos como homólogos en los respecíivos genomas.

EJEMPLO 3 Clonaje y expresión del gen NMB1125, codificante para la proteína NMB1125 de N. meningitidis en Escherichia coli.

Para realizar el clonaje y la expresión del gen NMB1125 se utilizó el vector pM-100, dicho vector permiíe realizar el clonaje empleando diferentes enzimas de resíricción, y obtener elevados niveles de expresión de proíeínas heíerólogas en forma de cuerpos de inclusión ciíoplasmáíicos en E. coli. El vector pM-100 (Figura 1) cuenía con los siguientes elementos principales: promotor íripíófano, secuencia correspondiente al segmentó esíabilizador N-terminal del aníígeno P64k de N. meningitidis cepa B:4:P1.19,15 codificante para 47 a. a, secuencia correspondieníe al íerminador de la íranscripción del bacteriófago T4 y secuencia correspondieníe al gen que confiere resisíencia a ampicillina como marcador de selección. A partir de la secuencia nucleoíídica correspondieníe al gen que codifica para la proíeína NMB1125 (Ejemplo 1 ) se procedió a diseñar un par de oligonucleóíidos (7738 y 7739) para amplificar el segmento de dicho gen sin la secuencia que codifica para el pépíido señal, uíilizando el ADN genómico de la cepa B:4:P1.19,15. Bgin 7738: 5' TTAGATCTCTATCCCGATACCGTCTATGAAGG '3 (No. Ideníificación de secuencia: 1) 7739: 5' AAGCTCGAGTCGTTTGCCTCCTTTACC 3" Xhol (No. Ideníificacíón de secuencia: 2) Para la predicción del péplido señal se uíilizaron los métodos descritos en el SignalP World Wide Web server (hiíp://www.cbs.díu.dk/services/SignalP-2.0). A coníinuación de la amplificación del gen de la proleína NMB1125 medianíe la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) (Randall K, eí al. 1988. Science 42394:487-491 ) ufilizando los oligonucleóíidos 7738 y 7739, se digirió dicho producío de RCP empleando las enzimas Bglll y Xhol, y se clonó en el vecíor pM-100 digerido previameníe de la misma forma. La consírucción final obtenida se muesíra en la Figura 2, la proíeína NMB1125 se expresa fusionada con el segmento N-íerminal de la P64k. La secuenciación del segmento del gen NMB1125 clonado se realizó empleando el secuenciador auíomáfico ALFexpressIl (Termo Sequenase™ Cy™ 5 Dye Termínador Kif, Amersham Biosciences) y los oligonucleoíidos 1573 (No. Idenííficación de secuencia: 8) y 6795 (No. Ideníificacíón de secuencia: 9), que hibridan en la secuencia correspondiente al segmento estabilizador de la P64k y en el íerminador de la íranscripción del bacteriófago T4, respecíivamenfe. El plasmidio obtenido se nombró pM-238 para su posterior uíilización. Para la expresión del gen NMB1125 se íransformó por el méíodo químico la cepa de E. coli GC 366 con el plasmidio pM-238 (Figura 2). El experimento de expresión se realizó en medio mínimo salino M9 (Miller JH. 1972. Experimenís ¡n Molecular Geneíics, Cold Spring Harbor Laboraíory Press, NEW York, USA) suplemenfado con giicerol al 1 %, hidrolizado de caseína al 1 %, CaCI2 0.1 mM, MgSO 1 mM y ampicillina 50 ug/mL. Los cultivos se incubaron duraníe 12 h a 37°C a 250 r.p.m. Al cabo de esíe íiempo se cenírifugaron y se realizó la rupíúra del precipiíado celular medianíe disrupción ulírasonica (IKA LABORTECHNIK). Fracciones de sobrenadante y precipiíado obtenidas fueron analizadas mediante elecíroforesis desnaíuralizaníe en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Naíure 277:680) y íinción con Azul Brillante de Coomassie R-250; analizándose el porcienío de expresión mediante densiíomeíría del gel (LKB Bromma 2202 Ulírascan láser densitomeíer; Amersham Pharmacia Bioíech, Reino Unido). La proíeína NMB1125 se obluvo en el sobrenadante de rupíura, represeníando un 60% del íoíal de las proíeínas presentes eh esía fracción (Figura 3). A coníinuación la fracción que contenía a la proíeína se díalizó para quedar en Buffer A (25mM de Tris-hidroximeíil amino metano) y se purificó la proteína NMB1125 mediante una cromatografía de intercambio iónico empleando una columna monoQ 5/5 (Amersham Biosciences) con un gradiente de 0 a 100% de NaCI en 1 h [BufferA como buffer de equilibrio y BufferB (BufferA+1 M de NaCI) para crear el gradiente] con lo cual finalmente se obíuvo con un 80% de pureza como se muesíra en la Figura 4.

EJEMPLO 4 Evaluación de la respuesta inmune inducida por la proteína NMB1125 por vía intraperitoneal e íntranasal.

Para evaluar la ¡nmunogenicidad de la proíeína NMB1125, se diseñó un esquema de inmunización en ratones, en el que se adminisíró la misma proíeína obtenida por dos métodos diferentes. El primero consisfió en exíraer la banda de un gel de poliacrilamida (Castellanos L, eí al. 1996 A procedure for protein elution from reverse-stained poiyarcylamide gels applicable at the low picomole level: An alternative route to the preparation of low abundance proteins for microanalysis. Electroforesis 17: 1564-1572) y el segundo se refirió en el Ejemplo 3, cuyo producto se denotó como proteína semipurificada. Con esías preparaciones se inmunizaron ratones Balb/c hembras, de 8 a 10 semanas de edad, los cuales fueron divididos en 4 grupos de 8 ratones cada uno. Se realizaron 3 inmunizaciones por vía iníranasal o iníraperiíoneal, separadas por un intervalo de 15 días. La proíeína adminisírada por vía iníraperiíoneal fue emulsificada con adyuvante de Freund. En el cuadro 1 se describe la composición de los grupos: CUADRO 1 Grupos de ratones Balb/C utilizados para la inmunización Los íííulos de aníicuerpos (IgG) coníra la proteína recombinanfe y la proíeína homologa preseníe en la bacteria se determinaron medianíe un ensayo íipo ELISA, en sueros obíenidos después de la íercera inoculación. En la Figura 5 se muesíran los íííulos de anficuerpos de cada uno de los animales coníra la proíeína recombinaníe. Después de la segunda inoculación se deíecían niveles de aníicuerpos, aunque fueron superiores luego de la tercera -inoculación. También se realizó la ideníificación inmunológíca por Western blotting, deíecíándose el reconocimiento de la banda correspondieníe a la proíeína. Los grupos inmunizados por vía iníraperiíoneal preseníaron íííulos de aníícuerpos significaíivameníe superiores a los grupos inoculados por vía intranasal. Para el análisis esíadísíico de los resultados se uíilízó el méíodo no paraméírico de análisis de varianza de clasificación simple por rangos de Kruskal-Wallis, debido a que las varianzas enlre los grupos no eran homogéneas según la Prueba de Bartleíf. En la comparación de las medias de los íratamieníos, en las combinaciones necesarias, se empleó la prueba de comparación múltiple de Dunn. Los sueros obíenidos después de inmunizar con la profeína recombinaníe reconocieron a la proíeína naíural presente en un preparado de proíeínas de membrana externa (PME) de la cepa CU385. Esíos resulíados son expuestos en la Figura 6. Para analizar la respuesía a nivel mucosal se evaluaron muesíras de saliva y lavados pulmonares. En las Figuras 7A y 7B sólo se muesíran los grupos inmunizados por vía iníranasal y se observa un incremenío en el título de IgA en el grupo al cual se le administró la proteína semipurificada.

EJEMPLO 5 Caracterización de la secuencia del gen codificante para la proteína NMB1125 en distintas cepas de N. meningitidis.

Para analizar la conservación de la secuencia del gen codificante para la proteína NMB1125 eníre las disíinías cepas de Neisseria meningitidis se realizó una búsqueda de similiíud con los genomas de Neisseria meningitidis (serogrupos A, B y C) anoíados en la base de daíos del NCBI (NC 003116.1 , NC 003112.1 , NC 003221 , SANGER 135720|Coniiq1 ) empleando el programa BLAST (Alíschul SF, eí al. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410. http://www.ncbl.nlm.nih.gov/BLAST/). La Figura 8 muesíra los resultados de la comparación de secuencias para aquellas secuencias que producen un alineamiento significativo en cada uno de los genomas analizados. Dichas secuencias presentan un 100% de ideníidad en los serogrupos A y B, y un 99% de identidad en el serogrupo C, con la secuencia del gen codificante para la proíeína NMB1125 obtenida (No. Ideníificación de secuencia: 3). Adicionalmente se determinó la secuencia nucleoíídica del gen en cuesílón para 3 aislamientos cubanos (No. Ideníificación de secuencia: 5-7) pertenecientes al serogrupo B (B:4:P1.19,15) y se realizó un alineamiento de secuencia empleando el programa ClusíalX (http://www.ebi.ac.uk/clusialw/). Los resulíados del alineamiento evidencian que existe una gran conservación en la secuencia nucleoíídica del gen NMB1125 eníre las disíinías cepas analizadas. El empleo de. la proíeína NMB1125 como candidato vacunal, tomando en cuenía el alio grado de similiíud existente entre las secuencias anteriormente citadas, permiíiría generar una respuesta inmune efectiva y de amplio especíro de protección (producío de la reaclividad cruzada), coníra la enfermedad meningoccócica.

EJEMPLO 6 Caracterización de la respuesta inmune de amplio espectro de acción inducida por la inmunización de ratones Balb/c con la proteína NMB1125.

Con el objetivo de evaluar si la inmunización con la proteína NMB1125 induce una respuesta de amplia reactividad cruzada con otras cepas de Neisseria, se realizó un ensayo tipo ELISA en el que las placas de poliestireno se recubrieron con células totales de 7 cepas de Neisseria pertenecientes a diferentes serotipos y serosubtipos. Las placas se incubaron con la mezcla de los sueros obíenidos conira la proteína NMB1125 por dos rutas de inmunización, según se describe en el Ejemplo 4. En la Figura 9 se muesíran los resultados obtenidos con los sueros producidos coníra la proíeína semipurificada adminisírada por la rula inlraperiíoneal. Como se observa los sueros inmunes reconocieron la proíeína preseníe en diferentes cepas, con niveles semejantes al encontrado en la cepa CU385. El resío de los sueros tuvieron un comportamiento similar en este ensayo.

EJEMPLO 7 Protección inducida por los sueros murinos generados contra la proteína NMB1125, contra cepas homologas y heterólogas, en el modelo de rata infante Para determinar la actividad funcional de los antisueros obtenidos, se realizó un ensayo de protección en el modelo de infección meningocóccica en ratas infantes. En dicho ensayo se emplearon 24 ratas de 5 a 6 días de nacidas, divididas en grupos de 6 animales cada uno. Se determinó si los sueros que se administraron por la ruta iníraperitoneal protegían a las ratas de la infección por la bacteria (cepa CU385), inoculada por la misma ía una hora después. Los sueros de cada grupo de raíones inmunizados se mezclaron aníes de ser inoculados en rafas infantes y se diluyeron 1/10 en PBS estéril. Cuaíro horas después del reto, los animales se sacrificaron y se hizo un coníeo de las bacterias viables en la sangre. Para la interpretación de los resulíados se realizó un Análisis de Varianza (Anova) seguido de un análisis de comparación múltiple de Dunnet, donde se comparan los grupos en esíudio con el conírol negaíivo. Como se observa en la Figura 10 los grupos que recibieron los aníisueros coníra la proíeína NMB1125 mosíraron diferencias significaíivas respecto al conírol negaíivo, o sea fueron protectores en esíe modelo.

Un ensayo similar fue realizado infectando las ratas infantes con las cepas H44/48 y 120/90, aisladas de pacieníes en Cuba, cuya clasificación serológica es homologa a la cepa B385. Además, se realizaron experimentos de reto con las cepas 233 (C:2a: P1.5) del serogrupo C y la cepa H44/76 ( B:15:P1.7,16) del serogrupo B. En iodos los casos los antisueros protegieron a las ratas infantes contra la infección meningocóccica.

EJEMPLO 8 Generación de anticuerpos monoclonales contra la proteína NMB 125 capaces de mediar actividad bactericida contra Neisseria meningitidis Con el objetivo de generar anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos coníra la proíeína NMB1125, y esíudiar su capacidad funcional de mediar actividad bactericida coníra cepas homologas y heíerólogas de N. meningitidis, se empleó en un esquema de inmunización una preparación de la proíeína NMB1125 con un porcienío de pureza superior al 80% (Ejemplo 3). El esquema de inmunización se realizó en ratones Balb/c (H-2d , sexo femenino, 5-6 semanas) y contó con un total de 4 dosis distribuidas de la siguiente manera: los días 0, 15 y 30 del esquema 10 µg del antígeno NMB1125 por ratón ( volumen total 100 µl), administrados por vía subcutánea, emulsificada la primera dosis con Adyuvante completo de Freund, y las restantes dosis con Adyuvante Incompleto de Freund; el día 50, 10 µg del antígeno por ratón en solución tampón fosfato (NaCI 140 mM, KCl 270 mM, KH2PO4. 1.5 mM, Na2HP04 x 2H2O 6.5 mM, pH 7.2) por vía ¡ntraperiíoneal. Las extracciones se realizaron los días 0 y 45 del esquema. Los esplenocitos del animal de mejor íítulo, evaluados mediante un ELISA indirecto empleando la proteína NMB1125 (Ejemplo 3) en el recubrimiento, se fundieron con las células de mieloma X63 Ag8 653 y los hibridomas resultantes se aislaron y pesquisaron según métodos establecidos (Gavilondo JV. 1995. Anticuerpos Monoclonales: Teoría y Prácíica, Elfos Scientiae, La Habana, Cuba). La reactividad de los anticuerpos secretados por los hibridomas obtenidos coníra la proíeína NMB1125, así como su reacíividad cruzada coníra un grupo de anfígenos no relacionados, se evaluó medianíe un ELISA indirecto empleando en el recubrimiento 5 µg/ml de cada uno de los aníígenos, e igual conceníración de cada uno de los mAbs a ensayar. La Figura 11 muesfra los resulíados obíenidos en esíe experimento, en íoíal se obíuvieron 3 clones posiíivos (mAbs H8/92, 3H2/64 y 7D2/15) que reconocen específicamente la proíeína NMB1125, y no a la secuencia aminoacídica correspondiente al segmento N-íerm de la P64k, tampoco al resío del panel de aníígenos no relacionados ensayados. Para deíerminar la capacidad de los mAbs generados coníra la proíeína NMB1125 de mediar respuesía bactericida coníra cepas homologas y heíerólogas de Neisseria meningitidis se realizó un ensayo bactericida. El íííulo de aníicuerpos bactericidas fue- expresado como el recíproco de la mayor dilución de aníicuerpos evaluada, capaz de matar el 50% ó más de las bacterias; dos de los mAbs generados (3H2/64 y 7D2/15) tuvieron íííulos bactericidas superiores a 1 :128 coníra la cepa homologa B:4:P1.19,15 y uno (H8/92) superior a 1 :80. Además íuvieron íííulos superiores a 1 :64 coníra las cepas heíerólogas B:15:P1.7,16 y C:2a:P1.5.

EJEMPLO 9 Caracterización de las regiones blanco de la respuesta inmune murina contra la proteína NMB1125 Con el objeíivo de identificar las regiones dentro de la proteína, que son más reconocidas por los antisueros murinos generados coníra el aníígeno recombinaníe se realizó un ensayo de fipo SPOTScan. Una serie de pépfidos sobrelapados que cubren la secuencia de la proíeína se siníeíizaron sobre un soporte de celulosa y la membrana se incubó con una mezcla de sueros diluida 1:100. La reacción aníígeno-anlicuerpo se detectó medianíe la incubación con un conjugado anli-lnmunoglobulina G murina- fosfaíasa alcalina, seguido de la adición de una solución que contenía el susíraío Bromo-Cloro-Indolil-Fosfaío. Se observaron varías regiones aníigénicas comunes presentes en la proíeína, con independencia de la preparación que se empleó en la inmunización. No obstante, se apreció que en los grupos inmunizados con proíeína adyuvada con Adyuvante de Freund se obíuvo un paírón de reconocimiento mucho más amplio.

EJEMPLO 10 Reconocimiento de la proteína NMB1125 por sueros humanos.

Una batería de sueros humanos, provenientes de individuos convalecientes se empleó en este estudio, que se realizó en un ensayo tipo ELISA. Las placas se recubrieron con la proteína NMB1125 obtenida medianíe elecíroforesis preparaíiva (5 µg/ml). Después de bloquear las placas con leche descremada en polvo al 3% en PBS con Tween-20, los sueros se diluyeron (1 :50) en la misma solución y se incubaron en las placas. El ¡nmunoensayo prosiguió como ha sido ampliamente reportado. Como conírol negativo se emplearon sueros de donantes sanos. También se empleó como confrol no relacionado una mezcla de sueros de vacunados con vacuna recomblnaníe coníra la Hepaliíis B (daíos no mosírados). La Figura 12 muesíra los resulíados obtenidos con 5 sueros de convalecieníes en este ensayo. Como se aprecia, los sueros humanos reconocieron la proíeína lo que indica que la misma se expresa duraníe la infección meningocócclca y que es inmunogénica.

EJEMPLO 11 Proteína NMB1125 como portadora de un péptido.

Para demostrar la capacidad portadora de la proteína recombinante NMB1125, se conjugó a la misma un pépíido sintético de 15 residuos aminoacídicos, derivado de la región V3 de la proíeína gp120 del VIH-1 , aislamiento JY1. La conjugación se realizó por el méíodo del gluíaraldehído. El pépíldo JY1 libre, la proíeína recombinaníe NMB1125 y el conjugado JY1-NMB1125, se adminisíró a raíones adultos en un esquema de 3 dosis, donde los inmunógenos se emulsificaron con Adyuvante de Freund.

Dos semanas después de la tercera dosis se obíuvieron muesíras del suero de los animales inmunizados, los que se analizaron por ELISA para determinar los niveles de anficuerpos anfi-pépíido. Para ello las placas se recubrieron con el pépíido libre (20µg/ml) y el inmunoensayo prosiguió como se ha descrito previamente. Los resulíados del experimenío (Figura 13) evidencian la capacidad portadora de la proíeína NMB1125, capaz de potenciar significaíivameníe la respuesía de aníicuerpos coníra el pépíido JY1 , iras su conjugación al mismo.

Claims (30)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Antígeno capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por bacterias del género Neisseria caracterizado por ser la proteína de N. meningitidis denominada NMB1125 y por tener la secuencia aminoacídica identificada en el listado de secuencias como Secuencia 4.

2.- El antígeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además por estar codificado por el gen NMB1125 identificado en el listado de secuencias como Secuencia 3.

3.- Proteína o péptido obtenido por tecnología recombinante o por síntesis química caracterizada por la secuencia de la proteína NMB1125 y ser capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por bacterias del género Neisseria de conformidad con la reivindicación 1.

4.- Formulación farmacéutica caracterizada porque coníiene la profeína o el pépíido de las reivindicaciones 1 , 2 y 3.

5.- La formulación farmacéuíica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque es una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora conira infecciones causadas por bacterias del género Neisseria.

6.- La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 4 y 5 caracterizada además porque es una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesía protectora contra infecciones causadas por Neisseria meningitidis.

7.- La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 4 y 5 caracterizada además porque es una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra infecciones causadas por Neisseria gonorrhoeae.

8.- La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 4, 5, 6 y 7, caracterizada además por ser una formulación profiláctica o terapéutica.

9.- La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 4, 5, 6 y 7, caracterizada además porque es una formulación combinada conteniendo uno o varios antigenos de naturaleza antigénica diferente, obtenidos por vía recombinante, por vía sintética o producidos de manera natural.

10.- La formulación farmacéuíica de conformidad con las reivindicaciones 4, 5, 6 y 7, caracterizada además porque conliene aníígenos polisacáridicos.

11.- La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 4, 5, 6 y 7, caracterizada además porque uno de los componentes de la formulación es un po.lisacárido capsular de N. meningitidis.

12.- La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracíerizada además porque coníiene un conjugado proíeína-polisacárido, cuya porción polisacarídica se corresponde con un polisacárido bacteriano.

13.- La formulación farmacéuíica de conformidad con las reivindicaciones 4, 5, 6 y 7, caracterizada además porque contiene uno o varios microorganismos ¡nactivados.

14.- La formulación farmacéuíica de conformidad con las reivindicaciones 4, 5, 6 y 7, caraclerizada además porque contiene antígenos peptídicos.

15.- La formulación farmacéuíica de conformidad con las reivindicaciones 4 y 5, caracíerizada además porque contiene hormonas.

16.- La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 4 y 5, caracterizada además porque contiene factores de crecimiento.

17.- La formulación farmacéuíica de conformidad con las reivindicaciones de la 4 a la 16, caracterizada además porque es una formulación para ser administrada por vía parenteral.

18.- La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones de la 4 a la 16 caracterizada además porque es una formulación para ser adminisírada por vía mucosal.

19.- La formulación farmacéuíica de conformidad con las reivindicaciones de la 4 a la 16, caracterizada además porque es una formulación para ser adminisírada por vía oral.

20.- La formulación farmacéuíica de conformidad con las reivindicaciones de la 4 a la 19 caracíerizada además por ser una formulación inmunoesíimulaníe o inmunopofenciadora.

21.- La formulación farmacéuíica de conformidad con las reivindicaciones de la 4 a la 20 caracterizada además porque conliéne pépíidos o fragmentos del antígeno NMB1125.

22.- La formulación farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones de la 4 a la 20 caracterizada además porque contiene mimotopos del anfígeno NMB1125.

23.- Organismo genéíicameníe modificado caracterizado porque coníiene el gen que codifica para la profeína de la reivindicación 1 , o parte de esíe, solo o incluido en otra secuencia génica.

24.- Formulación farmacéutica caracíerizada porque coníiene el organismo genéíicameníe modificado, de conformidad con la reivindicación 23, vivo, atenuado o un preparado de esíe.

25.- Formulación farmacéulica caracíerizada porque coníiene la proíeína expresada por el organismo de la reivindicación 23, y es capaz de generar en el organismo recepíor una respuesía protectora coníra infecciones causadas por bacterias del género Neisseria.

26.- Formulación farmacéuíica caracíerizada porque coníiene la proíeína o el pépíido de las reivindicaciones 1, 2 y 3, como portadora de aníígenos de diversa naíuraleza.

27.- Componeníe farmacéuíico caracterizado porque coníiene la profeína NMB 1125 de las reivindicaciones 1 y 2, o fragmentos de esta y es capaz de permitir- la delección, solo o de conjunío con oíros componeníes, la enfermedad meningocóccica en humanos.

28.- Componeníe farmacéuíico caracterizado porque coníiene el gen de la reivindicación 3, o fragmeníos de este y es capaz de permitir la deíección, solo o de conjunío con oíros componeníes, la enfermedad meningocóccíca en humanos.

29.- Uso de la profeína NMB1125 o fragmeníos de esta, de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, en biosensores u oirás aplicaciones farmacéuíicas o biotecnológicas.

30.- Uso del gen que codifica para la proíeína de la reivindicación 1 , o sus fragmeníos de este, en biosensores u otras aplicaciones farmacéuticas o biotecnológicas.