MX2008008580A - Composiciones farmaceuticas que contienen la proteina nma0939 - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la medicina, particularmente con el desarrollo de composiciones farmacéuticas que contienen la proteína NMA0939;las composiciones de la presente invención confieren protección contra diferente enfermedades, causadas o no por patógenos;la proteína NMA0939 se identificócomo componente de las preparaciones de vesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis, se obtuvo mediante la tecnología del ADN recombinante y se evaluósu inmunogenicidad y actividad protectora en modelos animales;por el elevado grado de conservación del gen que codifica para la proteína NMA0939, las composiciones que la contienen poseen alto valor como antígeno inductor de una respuesta inmune de amplia reactividad;las composiciones de esta invención son aplicables en la medicina humana.

Description

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE CONTIENEN LA PROTEINA NMA0939 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está relacionada con la rama de la medicina, particularmente con el desarrollo de composiciones farmacéuticas, de aplicación preventiva o terapéutica, que permitan un aumento en la calidad de la respuesta inmune contra antígenos vacunales característicos de enfermedades de origen diverso.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Neisseria meningitidis, un diplococo Gram negativo cuyo único hospedero es el hombre, es el agente causal de la enfermedad meningocóccica. Usualmente esta bacteria se encuentra en la nasofaringe de personas que son portadores asintomátícos, siendo esta la vía más común para su aislamiento microbiológico. En el mundo los niños menores de 2 años de edad son la población más susceptible a contraer la meningitis meningocóccica, sin embargo, los adolescentes jóvenes y la población de adultos mayores también pueden ser afectados.

La enfermedad meningocóccica sin tratamiento es fatal en la mayoría de los individuos afectados, y la vacunación podria prevenir esta situación evitando incluso la colonización bacteriana. Diversas estrategias se han desarrollado con el objetivo de obtener un preparado vacunal que satisfaga los requisitos necesarios para proteger a la población contra esta enfermedad. Para ello se han tenido en cuenta los antígenos capsulares cuya especificidad inmunológica ha permitido la clasificación de este microorganismo en serogrupos. En la actualidad se han definido 5 de estos serogrupos como los responsables de la mayoría de los casos de enfermedad meningocóccica en el mundo. El serogrupo A es el principal responsable de las epidemias en África subsahariana. Los serogrupos B y C están asociados a la mayor parte de los casos que ocurren en los países desarrollados. Los serogrupos Y y W135 están presentes en la mayoría de los casos remanentes de la enfermedad y de infección prevalente en algunas regiones de los Estados Unidos, con un marcado incremento en los últimos años. De ahí que los polisacáridos capsulares hayan sido objeto de estudio y evaluación como candidatos vacunales. Una vacuna tetravalente, basada en polisacáridos, que confiere protección contra los serogrupos A, C, Y, y W-135 ha sido licenciada en los Estados Unidos. Los anticuerpos que son generados tras la vacunación son serogrupo- específico (Rosenstein N. et al. (2001 ). Meningococcal disease. N. Engl. J. Med 344: 1378-1388). El serogrupo B, a diferencia del resto, continúa siendo una importante causa de enfermedad meningocóccica endémica y epidémica, en gran parte debido a la no existencia de vacunas efectivas contra el mismo. Se ha visto que el polisacárido del serogrupo B posee una baja inmunogenicidad, además del riesgo potencial que existe de que vacunas basadas en este compuesto puedan desarrollar inmunotolerancia y/o inducir autoinmunidad dada su homología estructural con cadenas oligosacarídicas presentes en estructuras fetales humanas (Finne J. et al. (1987). An IgG monoclonal antíbody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tisúes. J. Immunol 138: 4402-4407). Por este motivo, el desarrollo de vacunas contra el serogrupo B se ha concentrado en el uso de antígenos subcapsulares.

Vacunas de vesículas y proteínas de membrana externa En la década de los años 70 la producción de vacunas de proteínas de membrana externa (PME), estuvo basada en la eliminación del lipopolisacárido (LPS) de las preparaciones proteicas mediante la utilización de detergentes (Frasch CE and Robbins JD. (1978). Protection against group B meningococcal disease. III. Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity of protection in a guinea pig model. J Exp Med 147(3): 629-44). Después, las PME fueron precipitadas para producir agregados resuspendidos en cloruro de sodio. A pesar de los buenos resultados obtenidos en estudios realizados en anímales, estas vacunas no indujeron anticuerpos bactericidas ni en adultos ni en niños (Zollinger WD, et al. (1978). Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animáis and humans. J. Infecí. Dis 137(6):728-39), resultado que fue atribuido a la desnaturalización de las proteínas presentes en la preparación, como resultado de la precipitación. Los próximos pasos en la búsqueda de un nuevo candidato fueron: diseñar una vacuna que presenta las proteínas en su conformación nativa formando vesículas de membrana externa (VME) (Zollinger WD, et al. (1979). Complex of meningococcal group B polysacchañde and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J. Clin. Invest. 63(5): 836-48; Wang LY and Frasch CE. (1984). Development of a Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation ¡n a mouse model. Infecí Immun. 46(2):408-14136). Las vacunas compuestas por vesículas de membrana externa fueron significativamente más inmunogénicas por vía parenteral que los agregados de PME, y esta inmunogenicidad fue explicada inicialmente por una mayor adsorción al adyuvante hidróxido de aluminio (Wang LY and Frasch CE. (1984). Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model. Infecí Immun. 46(2): 408-14136). Varios estudios de eficacia se han llevado a cabo utilizando vacunas basadas en VME, en diferentes formulaciones. Las dos vacunas más ampliamente estudiadas fueron desarrolladas en los años 80, en respuesta a brotes de la enfermedad meningocóccica en Cuba (Sierra GV ef al. (1991 ). Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2): 195-210) y Noruega (Bjune G, ei al. (1991 ). Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet 338(8775): 1093-6), respectivamente. La vacuna producida por el Instituto Finlay en Cuba (comercialmente denominada VA-MENGOC-BC®) es producida a partir de la cepa B:4,7:P1.19,15 y está compuesta por una preparación de VME de dicha cepa y polisacárido capsular aislado del serogrupo C, adsorbidas a hidróxido de aluminio (Sierra GV eí al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningiiidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2): 195-210)r Esta vacuna contribuyó a un rápido descenso de la epidemia en Cuba (Rodríguez AP, ei al. (1999). The epidemiological impact of antimeningococcal B vaccination in Cuba. Mem Insf Oswaldo Cruz. 94(4):433-40). La vacuna producida por el Instituto Nacional de Salud Pública de Noruega (NIPH) fue inicialmente utilizada durante un período hiperendémíco de la enfermedad causada por una cepa perteneciente al clon ET-5 (B:15:P1.7,16). Esta vacuna monovalente también fue producida a partir de VME purificadas y adsorbidas a hidróxido de aluminio (Bjune G, ei al. (1991 ). Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775): 1093-6). Las vacunas de VME parecen ser efectivas en la presentación de las PME, dispuestas en su conformación natural, para permitir la generación de anticuerpos bactericidas, al menos en adolescentes y adultos. Las respuestas de anticuerpos generadas incrementaron la opsonofagocitosis del meningococo. La formulación precisa de las vacunas (por ejemplo: contenido de PME, contenido de LPS y la presencia o ausencia del adyuvante) tiene un significativo impacto en la inmunogenicidad, existiendo grandes diferencias de un productor a otro según la cepa y/o la metodología empleada (Lehmann AK, et al. (1991 ). Immunization against serogroup B meningococci. Opsonin response in vaccinees as measured by chemíluminescence. APMIS. 99(8):769-72; Gómez JA, et al. (1998). Effect of adjuvants in the isotypes and bactericidal activity of antibodies agaínst the transferrin-binding proteins of Neisseria meningitidis. Vaccine .16 (17):1633-9 ; Steeghs L, et al. (1999). Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in a Lipopolysaccharide-Deficient Mutant of Neisseria meningitidis: Influence of Adjuvants on the Immune Response. Infect Immun. 67(10):4988-93). Sin embargo, el perfil antigénico de los aislamientos obtenidos de pacientes cambia rápidamente y una vacuna abarca sólo un limitado número de cepas, por tanto puede ser inefectiva en unos años, si las cepas que la componen no se corresponden con la epidemia local existente. Hasta el momento, las vacunas de VME han sido más utilizadas que cualquier otra vacuna del serogrupo B y son útiles en el contexto de los brotes de la enfermedad causada por un solo tipo de cepa. Los inmunógenos responsables de la reactividad cruzada inducida por este tipo de preparados no han sido completamente caracterizados, y muchos antígenos presentes en estos preparados restan por ser identificados. Estudios realizados con los sueros provenientes de ensayos clínicos del Instituto Finlay y el NIPH, sugieren que los anticuerpos contra la proteína de clase 1 (P1 , también llamada PorA) y Opc (otra PME mayoritaria) (Wedege E, et al. (1998). Immune Responses against Major Outer Membrane Antigens of Neisseria meningitidis in Vaccinees and Controls Who Contracted Meningococcal Disease during the Norwegian Serogroup B Protection Trial. Infecí Immun. 66(7): 3223-31 ), son importantes mediadores de la actividad bactericida del suero (fundamentalmente P1 ) y en ambas proteínas se observó una marcada variabilidad de cepa a cepa. La proteína P1 es un antígeno con un significativo nivel de variabilidad, el cual parece experimentar variación continua entre y durante los brotes (Jelfs J, et al. (2000). Sequence Variation ¡n the porA Gene of a Clone of Neisseria meningitidis during Epidemic Spread. Clin Diagn Lab Immunol. 7(3):390-5). Hacia este antígeno van dirigidos predominantemente los anticuerpos bactericidas después de la vacunación y después de la enfermedad. Sin embargo su variabilidad hace cuestionable que la protección producto de la inmunización con vacunas de VME de una sola cepa (monovalentes) sea de amplío espectro. Para resolver este problema, se desarrolló una vacuna de VME en Holanda (RIVM) que contenía P1 de seis aislamientos patogénicos diferentes (van der Ley P and Poolman JT. (1992). Construction of a multivalent meningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membrane protein. Infecí Immun. 60(8):3156-61 ; Claassen I, ei al. (1996). Production, characterization and control of a Neisseria meningiíidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine. Vaccine 14 (10):1001-8). En este caso las vesículas fueron extraídas de dos variantes de la cepa H44/76, genéticamente manipulada para expresar tres proteínas P1 independientes.

La búsqueda de un antíqeno universal Aunque las PME pueden inducir una respuesta inmune funcional contra el serogrupo B, ninguna de las vacunas confiere una protección universal, debido a la gran heterogeneidad de las regiones expuestas en la superficie de las PME. La discreta reactividad cruzada inducida por las vacunas de VME ha incentivado la búsqueda de un antígeno de membrana externa (o de un grupo de antígenos), que induzca anticuerpos funcionales y esté presente en todas las cepas del meningococo. Estos antígenos deben ser la base para una vacuna antimeningocóccíca realmente universal, la cual eliminará el potencial problema de la modificación capsular en las cepas patogénicas, después de la vacunación con polisacárido. Debido a la variabilidad de la proteína inmunodominante P1 , su uso en una vacuna universal está limitado y por tanto otras PME mayoritarias fueron consideradas candidatos para una vacuna y muchas de ellas se encuentran en desarrollo. Algunas de las que han sido incluidas son: proteínas reguladas por hierro (TbpA y B, FbpA y FetA), NspA y proteínas de clase 5 (Opc). TbpB forma parte del complejo de unión de transferrina, junto con TbpA. Recientes trabajos sugieren que la TbpA tiene una función más importante en la unión al hierro (Pintor M, ef al. (1998). Analysis of TbpA and TbpB functionality in detective mutants of Neisseria meningiiidis. J Med Microbiol 47(9): 757-60) y es un inmunogéno más efectivo que la TbpB. La proteína NspA, una PME minoritaria, altamente conservada, ha sido descubierta a través de una técnica novedosa, la que consiste en emplear combinaciones de PME provenientes de diferentes cepas para inmunizar ratones (Martin D, ei al. (1997). Highiy Conserved Neisseria meningiiidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). Para producir hibridomas se utilizaron células B de ratones inmunizados, y los mAbs se examinaron para detectar la reactividad cruzada contra múltiples cepas del meningococo. Como resultado se encontró un anticuerpo monoclonal con reactividad cruzada que reconoció una PME de 22 kDa y fue designada como NspA. La inmunización de ratones con NspA indujo respuesta de anticuerpos bactericidas contra cepas de los grupos A hasta C. Esta proteína también protege contra la infección meningocóccica letal (Martin D, et al. (1997). Highiy Conserved Neisseria meningitidis Surface Proteín Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). La comparación de secuencias de NspA genéticamente divergentes, demostró que la proteína está altamente conservada (97% homología) (Cadieux N, ef al. (1999). Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningiíidis NspA Outer Membrane Protein. Infecí Immun 67 (9): 4955-9).

La presencia de NspA se detectó por ELISA en un 99.2% de las cepas evaluadas pertenecientes a los serogrupos desde la A hasta la C, utilizando anticuerpos monoclonales (Martin D, ef al. (1997). Highiy Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). Se ha comprobado que estos anticuerpos monoclonales presentan actividad bactericida contra numerosas cepas del meningococo y son capaces de reducir la bacteriemía provocada por este microorganismo en un modelo murino (Cadieux N, et al. (1999). Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infecí Immun 67 (9): 4955-9). Aunque estos resultados sugieren que la NspA es un prometedor candidato vacunal capaz de conferir protección contra varios serogrupos, un suero policlonal de ratón contra la proteína recombinante no se asoció a la superficie en un 35% de las cepas de meningococo del serogrupo B, a pesar de la presencia del gen nspA en estos organismos (Moe GR ei al. (1999). Dífferences in Surface Expression of NspA among Neisseria meningiíidis Group B Strains. Infecí Immun 67 (11 ): 5664-75).

Secuenciación del qenoma de Neisseria meninqitidis y su impacto en el desarrollo de vacunas La secuenciación del genoma de MC58, una cepa de meningococo del serogrupo B fue publicada durante el año 2000 (Tettelin H, et al. (2000). Complete Genome Sequence of Neisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58. Science 287 (5459): 1809-15172), y de Z2491 , una cepa de serogrupo A (Parkhill J, et al. (2000). Complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491. Nature 404 (6777):502-6173). La disponibilidad de las secuencias de ADN ha tenido una gran influencia en la investigación de una vacuna antimeníngocóccica. Mientras la secuenciación del genoma de MC58 continuaba su desarrollo, Pizza y colaboradores comenzaron identificando los marcos abiertos de lectura (ORFs) que según las predicciones codificaban para las proteínas expuestas en la superficie, las unidas a membrana y las que se exportan. Este grupo de investigadores identificó 570 ORFs, amplificados a través de la reacción en cadena de la polímerasa y los clonó en Escherichia coli, para permitir la expresión de proteínas de fusión con cola de histídina o glutatión S-transferasa (Pizza M, ei al. (2000). Identification of Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus by Whole-Genome Sequencing. Science 287 (5459): 1816-20). El 61 % (350) de los ORFs seleccionados fueron expresados exitosamente. En la mayoría de los casos, aquellos que no lograron expresarse tenían más de un dominio hidrofóbico de transmembrana. Las proteínas recombinantes fueron purificadas y se utilizaron para inmunizar ratones. Los sueros obtenidos fueron evaluados por ELISA, citometría de flujo y se les determinó la actividad bactericida contra 2 cepas. Posteriormente se seleccionaron 7 proteínas que en los 3 ensayos resultaron positivas. Las formulaciones vacunales empleando algunas de estas proteínas combinadas con adyuvantes, indujeron títulos significativos de anticuerpos bactericidas contra la cepa homologa (MC58), pero ninguno de ellos fue tan alto como los inducidos por una vacuna de VME de esta misma cepa (Giulianí MM, ei al. 2000. Proceedings 12th IPNC. p. 22). Por otro lado, existen evidencias de que combinaciones de estas proteínas resultan más inmunogénicas que cada proteína por separado (Santini L. ei al. (2000). Proceedings 12th IPNC. p. 25). Los numerosos ORFs excluidos en ese trabajo, por la falta de la expresión proteica o por modificaciones de las propiedades ¡nmunológicas, necesitan una investigación más profunda. Los componentes de una vacuna deben seleccionarse en base a la contribución de los antígenos en la patogénesis de N. meningitidis. Los antígenos por sí solos pueden ser efectivos candidatos vacunales, o alternativamente, los mutantes atenuados pueden ser considerados integrantes de una vacuna. Un importante problema de la prevención y/o la terapia de la enfermedad meningocóccíca es que ninguna de las vacunas disponibles hasta la fecha confiere una protección universal, debido a la gran heterogeneidad de los antígenos del meníngococo que se han empleado como vacuna.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención contribuye a resolver el problema antes mencionado al proporcionar composiciones farmacéuticas que contienen una proteína cuya secuencia está altamente conservada, incluso entre diferentes géneros de microorganismos patógenos. El objetivo técnico que se persigue con esta invención es precisamente el desarrollo de composiciones capaces de elevar y/o ampliar la respuesta inmune sistémica y mucosal del hospedero contra varios patógenos, o contra un espectro amplio de variedades del mismo. Se reporta por primera vez el uso de la proteína NMA0939 en composiciones farmacéuticas de carácter terapéutico o preventivo. Más particularmente la invención se refiere a composiciones farmacéuticas, que contienen dicha proteína, para prevenir o tratar cualquier infección provocada por una bacteria del género Neisseria. En una modalidad particular de la invención, las composiciones farmacéuticas que contienen dicho antígeno son útiles para la prevención o el tratamiento de enfermedades causadas por N. meningitidis y N. gonorrhoeae, respectivamente. En otra materialización de la invención las composiciones farmacéuticas que contienen la proteína NMA0939, pueden contener también uno o varios antígenos de naturaleza sintética, recombinante o natural. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas combinadas contienen antígenos polisacarídicos, incluyendo los polisacáridos bacterianos. Más particularmente la invención se refiere a los polisacáridos capsulares de N. meningitidis. La composición farmacéutica de la presente invención puede contener conjugados proteína-polisacárido, cuyo componente polisacarídico se corresponda con un polisacárido bacteriano.

En otra modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas que contienen NMA0939, contienen antígenos de naturaleza peptídica, con el fin de ampliar el espectro de protección de las mismas. Las composiciones de la presente invención son administradas por ruta parenteral, o por ruta mucosal, incluyendo la administración por vía oral. En otra materialización de la invención, la proteína N A0939 puede ser empleada como ¡nmunopotenciadora o portadora de péptidos, polisacáridos u otros antígenos de menor inmunogenicidad, con el fín de potenciar la respuesta inmune contra los mismos. El ejemplo 11 ilustra que la proteína mencionada anteriormente es capaz de elevar significativamente los niveles de anticuerpos contra un péptido derivado de un antígeno viral, una vez que han sido conjugadas ambas moléculas. También es parte de la presente invención, que los determinantes protectores para un antígeno proteico dado sean insertados dentro de la secuencia de la proteína NMA0939, con el fin de inducir una repuesta inmune aumentada contra los mismos, dando lugar a proteínas híbridas que formen parte de una composición farmacéutica. En otra modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener fragmentos de la proteína NMA0939, que sean capaces de generar en el hospedero una respuesta protectora contra el meningococo u otra bacteria del género Neisseria. En una modalidad particular de la invención, las composiciones farmacéuticas contienen mimotopos o péptidos miméticos de la proteína NMA0939, en forma sintética u obtenidos mediante tecnología del ADN recombinante. El término "mimotopo" significa cualquier péptido que sea capaz de generar anticuerpos que se combinen con la proteína NMA0939, y por esa vía sean capaces de producir una respuesta protectora contra Neisseria. También es parte de la presente invención la detección de la enfermedad meningocóccica mediante el empleo de componentes farmacéuticos que contengan la proteína NMA0939, o el gen codificante para la misma, ya sea por sí solos o en combinación con otros componentes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Vector pM238 empleado en el clonaje y la expresión de la proteína NMA0939. Figura 2. Construcción final obtenida del clonaje de la secuencia nucleotídica correspondiente al gen nma0939 en el vector pM238. Figura 3. Análisis mediante SDS-PAGE de las fracciones obtenidas en la ruptura celular; carril 1 , células totales; carril 2, precipitado de ruptura; carril 3, sobrenadante de ruptura. PM: patrón de peso molecular. Figura 4. Análisis de la pureza de las diferentes fracciones del proceso de purificación de la proteína recombinante NMA0939, a partir del precipitado de ruptura, mediante SDS-PAGE: Carril 1 , precipitado de solubilización con urea 2M en tampón carbonato-bicarbonato; carril 2, sobrenadante de solubílización; carril 3, fracción no adsorbida a la matriz de purificación; carril 4, contaminante de menor peso molecular que eluye en otro pico cromatográfico; carril 5, proteína purificada. PM: patrón de peso molecular. Figura 5. Niveles de anticuerpos (IgG) contra la proteína recombinante NMA0939, obtenidos al inmunizar ratones con el mismo antígeno adyuvado con Adyuvante de Freund (Freund), hidróxido de Aluminio (Alum) o polisacárido C (PsC) de N. meningitidis, por vía intraperitoneal. Se representan los resultados obtenidos en un ensayo tipo ELISA, que fueron expresados como el inverso del título, calculado como la dilución de la muestra de suero donde se duplica la densidad óptica de la muestra de suero preinmune. Figura 6. Reconocimiento de determinantes antigénicos presentes en las PME de N. meningitidis, cepa CU385, utilizando sueros de ratones inmunizados con la proteína recombinante NMA0939 adyuvada con Adyuvante de Freund (Freund), hidróxido de Aluminio (Alum) o polisacárido C (PsC) por vía intraperitoneal. Los resultados fueron expresados como el inverso del título, calculado como la dilución del suero donde se duplica la densidad óptica del suero preínmune. Figura 7. Resultados de la búsqueda de similitud entre el gen que codifica para la proteína NMA0939 ("query") y las secuencias anotadas de los genomas de diferentes serogrupos de N. meningitidis ("Sbjct") empleando el programa BLAST.

Figura 8. Reconocimiento de antígenos presentes en 5 cepas de N. meningitidis, por sueros producidos después de la inmunización con la proteína recombinante NMA0939 mezclada con polisacárido C de N. meningitidis por vía intraperitoneal. Los sueros generados después de la inmunización de la proteína con otros adyuvantes tuvieron un comportamiento similar. Los resultados fueron expresados como el inverso del título, calculado como la dilución del suero donde se duplica la densidad óptica del suero preinmune. Figuras 9A y 9B. Experimentos de protección pasiva contra infección meningocóccica en el modelo de rata infante, utilizando los sueros obtenidos inmunizando con la proteína recombinante NMA0939 con Adyuvante de Freund (Freund), con hidróxido de Aluminio (Alum) o mezclada con el polisacárido C (PsC) de N. meningitidis. A: Infección con la cepa CU385, y B: Infección con la cepa 233 (C: 2a: P1.5). C-: mezcla de sueros de animales no tratados, C+: suero de ratón inmunizado con vesículas de membrana externa de N. meningitidis de la cepa CU385 o 233, según corresponda con el experimento. El símbolo * representa una diferencia estadísticamente significativa respecto al grupo control negativo (C-), en cuanto a los niveles de bacteremia expresados como unidades formadoras de colonias por mililitro (ufc/ml). Figura 10: Reconocimiento de la proteína recombinante NMA0939 y de un panel de antígenos no relacionados, por los mAbs generados (mAbs H10/67, 3H3/24 y 7D6/18). Antígenos: P1 , proteína de clase 1 de N. meningiíidis cepa B:4:P1.15; P64k, proteína de N. meningitidis; T.T, toxoide tetánico; HBsAg, antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B. Los resultados se representan como la absorbancía (492nm) en un ensayo tipo ELISA. Figura 11. Reconocimiento de la proteína recombinante NMA0939 por sueros de pacientes convalecientes de la enfermedad meningocóccica. Como control negativo se emplearon sueros de donantes sanos. Los resultados se representan como la absorbancia (492nm) en un ensayo tipo ELISA. Figura 12. Títulos de anticuerpos anti-péptido JY1 correspondientes a los sueros de los animales inmunizados con el péptido libre (JY1 ), la proteína recombínante (NMA0939) y el conjugado JY1-NMA0939. Figura 13. Niveles de anticuerpos (IgA) contra la proteína recombinante NMA0939 presentes en muestras de lavados pulmonares de ratones inmunizados por vía intranasal con la proteína mezclada con polisacárido C de N. meningitidis (NMA0939+PsC) o con la proteína incorporada en liposomas (NMA0939_Lip).

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN EJEMPLO 1 Detección de la proteína NMA0939 en preparaciones de vesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis, serogrupo B Con el objetivo de estudiar las proteínas presentes en preparaciones de vesículas de membrana externa de N. meningitidis serogrupo B (cepa CU385, clasificación B:4:P1.19,15), se realizó una electroforesis bídimensional según lo descrito en la literatura (Sabounchi-Schutt F, et al. (2000). An immobiline DryStrip application method enabling high-capacity two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 21 : 3649-3656. A continuación se realizó una digestión enzimática de las proteínas extraídas del gel empleando la enzima tripsina (Promega, Madison, Wl, E.U). Los péptidos generados durante la digestión fueron extraídos de la solución empleando microcolumnas (ZipTips, Millipore, MA, E.U). Previo al análisis por espectrometría de masas los péptidos fueron eluídos de las microcolumnas con solución de acetonitrilo al 60% y 1 % de ácido fórmico e inmediatamente la mezcla se cargó en nanoagujas (Protana, Dinamarca). Las mediciones se realizaron en un espectrómetro de masas híbrido con cuadrupolo y tiempo de vuelo (QTof-2™, Manchester, Reino Unido), equipado con una fuente de ionización (nanoESI). Los espectros de masas fueron adquiridos en un rango de m/z desde 400 hasta 2000 en 0.98 segundos y utilizando 0.02 segundos entre cada uno de los barridos. La adquisición y procesamiento de los datos fue realizada a través del programa MassLynx (versión 3.5, Micromass). La identificación de proteínas basada en los espectros ESI-MS se realizó empleando el programa ProFound (Zhang W and Chait BT. (2000). ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem 72:2482-2489; http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound). La búsqueda se subscribió a las secuencias de genes y proteínas de bacterias contenidas en las bases de datos SwissProt (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) y NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), considerando la oxidación de metioninas, la desamidación y la carboxiamídometilacíón de cisternas como posibles modificaciones presentes. La identificación de las proteínas basada en los espectros MS/MS se realizó a través del programa MASCOT (Perkins DN, ei al. (1999). Probability-based proteín identificatíon by searching sequence databases using mass spectrometry data. Elecirophoresis 20:3551 -3567. http://www.matrixscience.com/). Entre los parámetros de búsqueda se incluyó la modificación de cisteínas así como las posibles oxidaciones y desamidaciones. A partir del análisis de los datos obtenidos de la identificación de las proteínas presentes en preparaciones de vesículas de membrana externa se seleccionó para secuenciar un grupo de péptidos. A partir de la secuenciación por espectrometría de masas de uno de ellos se verificó la existencia en el serogrupo B de un homólogo de la proteína NMA0939, que no estaba identificado ni predicho a partir de los genomas de serogrupo B. Este candidato homólogo al NMA0939, es denominado NMA0939 a lo largo de todo el documento.

EJEMPLO 2 Análisis de homología de la proteína NMA0939 con productos génicos reportados en bases de datos Para el análisis de homología de la proteína NMA0939, se realizó una búsqueda de similitud de secuencias en la base de datos del NCBI empleando el programa BLAST (Altschul SF, ei al. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Con este procedimiento se identificó el correspondiente homologo en el caso de N. gonorrhoeae y el de serogrupo A de N. meningitidis, no siendo así en el caso de la cepa MC58 del serogrupo B de esta especie. Sin embargo, la modalidad de una búsqueda de homología empleando la secuencia nucleotídica del gen nma0939 sí demostró la presencia del mismo en dicha cepa, lo que indica en este caso un error de anotación para el correspondiente genoma. El gen en cuestión anotado se corresponde con el ORF nma0939, con homólogos presentes también en N. gonorrhoeae (NGO0306). En el serogrupo B el homólogo a esta proteína está codificado en la región de ADN comprendida entre las posiciones 761673 y 762295, ubicada inmediatamente a continuación del gen nmb0729 y antes del gen nmb0730. Este es, por tanto, el primer reporte de la existencia de un homólogo de la proteína NMA0939 en el serogrupo B. En otros microorganismos no se logró identificar ninguna proteína con valores significativos de similitud, lo que indica a un posible antígeno género específico.

EJEMPLO 3 Clonaje y expresión del gen nma0939, codificante para la proteína NMA0939 de Neisseria meningitidis, en Escherichia coli Para realizar el clonaje y la expresión del gen nma0939 se utilizó el vector pM238. Dicho vector permite realizar el clonaje empleando diferentes enzimas de restricción, y obtener elevados niveles de expresión de proteínas heterólogas en forma de cuerpos de inclusión en el citoplasma de E. coli. El vector pM238 (Figura 1 ) cuenta con los siguientes elementos principales: promotor triptófano, secuencia correspondiente al segmento estabilizador N-terminal del antígeno P64k de N. meningitidis cepa CU385 (codificante para 47 a. a), secuencia que codifica para una cola de histidina C-termínal, secuencia correspondiente al terminador de la transcripción del bacteriófago T4 y secuencia correspondiente al gen que confiere resistencia a ampicillina como marcador de selección. Además, este vector permite la selección de los recombinantes mediante la coloración azul o blanca de las colonias, producto de la presencia del gen lacZ subunidad alfa. A partir de la secuencia nucleotídica correspondiente al gen que codifica para la proteína NMA0939 (Ejemplo 1) se procedió a diseñar un par de oligonucleótidos (704467U y 704467L) para amplificar el segmento de dicho gen sin la secuencia que codifica para el péptido señal, utilizando el ADN genómico de la cepa CU385 (B:4:P1.19, 15). Xba-I Bql-ll 704467U: 5"GTGGTATCTAGATCTGCCAGCCAGAAACTC '3 (SEQ ID No. 1 ) 704467L: 5' CAACCCGGGATCCTTCCTTGTCCAAATC 3" BamH-l (SEQ ID No. 2) Para la predicción del péptido señal se utilizaron los métodos descritos en el SignalP World Wide Web server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SiqnalP-2.0). A continuación de la amplificación del gen codificante para la proteína NMA0939 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) (Saiki R K, et al. (1988). S Primer-directed enzymatic amplífication of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487-491 ), utilizando los oligonucleótidos 704467U y 704467L, se digirió dicho producto de RCP, empleando las enzimas Bglll y BamH-l, y se clonó en el vector pM238 digerido previamente de la misma forma. La construcción final obtenida se muestra en la Figura 2, la proteína recombinante NMA0939 se obtuvo fusionada al segmento N-terminal de la P64k. La secuenciación del segmento del gen nma0939 clonado se realizó empleando el secuenciador automático ALFexpressIl (Termo Sequenase™ Cy™ 5 Dye Terminator Kit, Amersham Biosciences) y los oligonucleotidos 1573 (SEQ ID No. 8) y 6795 (SEQ ID No. 9), que hibridan en la secuencia correspondiente al segmento estabilizador de la P64k y en el terminador de la transcripción del bacteriófago T4, respectivamente. El plasmidio obtenido se nombró pM NMA0939 para su posterior utilización. Para la expresión del gen nma0939 se transformó por el método químico la cepa de E. coli GC 366 con el plasmidio pM NMA0939 (Figura 2). El experimento de expresión se realizó en medio mínimo salino M9 (Miller JH. (1972). Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, EU) suplementado con glucosa al 1 %, hidrolizado de caseína al 1%, extracto de levadura 0.1 %, CaCI2 0.1 mM, MgSO4 1 mM y ampicillina 50 µg/mL. Los cultivos se incubaron durante 12 h a 37°C a 250 r.p.m. Al cabo de este tiempo se centrifugaron y se realizó la ruptura del precipitado celular mediante disrupción ultrasónica (IKA LABORTECHNIK). Fracciones de sobrenadante y precipitado obtenidas se analizaron mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE, del inglés Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) (Laemmii UK. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277:680) y tinción con Azul Brillante de Coomassie R-250; analizándose el por ciento de expresión medíante densitometría del gel (LKB Bromma 2202 Ultrascan láser densitometer; Amersham Pharmacia Bíotech, Reino Unido). La proteína NMA0939 se obtuvo en el precipitado de ruptura, representando un 20% del total de las proteínas presentes en esta fracción (Figura 3). Muestras del precipitado celular se solubilizaron con tampón carbonato-bicarbonato (carbonato de sodio 0.1 M, hidrógeno carbonato de sodio 0.1 M) conteniendo urea disuelta a diferentes molaridades (2M, 4M, 6M y 8M). Cuando se utilizó el tampón antes descrito que contiene disuelto urea 2M, se solubiliza la proteína NMA0939 presente en el precipitado de ruptura. El sobrenadante después de la solubilización se sometió a una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos para realizar la purificación de la proteína de interés y se obtuvo una muestra con un 80% de pureza, como se muestra en la Figura 4. Por último se realizó una diálisis y se procedió a su evaluación en animales de laboratorio.

EJEMPLO 4 Evaluación de la respuesta inmune inducida por la proteína NMA0939 por vía intraperitoneal Para evaluar la inmunogenicidad de la proteína NMA0939, se diseñó un esquema de inmunización en ratones, en el que se administró la proteína adyuvada con hidróxido de aluminio, adyuvante de Freund o polisacárido C de N. meningiiidis. Con estas preparaciones se inmunizaron ratones Balb/c hembras, de 8 a 10 semanas de edad, los cuales fueron divididos en 3 grupos de 8 ratones cada uno. Se realizaron 3 inmunizaciones por vía intraperitoneal, separadas por un intervalo de 7 días. Se empleó un grupo control que recibió PBS en las tres primeras inmunizaciones, pero al igual que el resto de los grupos recibió una dosis de refuerzo con la proteína adyuvada con hidróxido de Aluminio, a los 45 días después de iniciado el experimento. En el cuadro se describe la composición de los grupos: CUADRO 1 : Grupos de ratones Balb/C utilizados para la inmunización Los títulos de anticuerpos (IgG) contra la proteína recombinante y contra antígenos presentes en la bacteria se determinaron mediante un ensayo tipo ELISA, en sueros obtenidos después de la dosis de refuerzo. En la Figura 5 se muestran los títulos de anticuerpos de cada uno de los animales contra la proteína recombinante. Desde la segunda inoculación se detectan anticuerpos capaces de reconocer el antígeno administrado (datos no mostrados), aunque fueron superiores luego de la última inoculación.

También se realizó la identificación inmunológica por Western blotting, detectándose el reconocimiento de la banda correspondiente a la proteína (datos no mostrados). Los sueros obtenidos después de inmunizar con la proteína recombinante reconocieron determinantes antigénicos presentes en un preparado de PME de la cepa CU385. Estos resultados se representan en la Figura 6. Para el análisis estadístico se transformaron los títulos de anticuerpos obtenidos para lograr distribución normal de los valores y/o homogeneidad de varianza. En general, la significación estadística de las diferencias entre los grupos se analizó por análisis de varianza de clasificación simple, seguido por la prueba de rangos múltiples de Newman Keuls.

EJEMPLO 5 Caracterización de la secuencia del gen codificante para la proteína NMA0939 en distintas cepas de Neisseria meningitidis y en Neisseria gonorrhoeae Para analizar la conservación de la secuencia del gen codificante para la proteína NMA0939 entre distintas cepas, se realizó una búsqueda de similitud con los genomas de N. meningiíidis (serogrupos A y B) y N. gonorrhoeae anotados en la base de datos del NCBI (NC 003116.1.

NC 003112.1. NC 002946). empleando el programa BLAST (Altschul SF, et al. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). La Figura 7 muestra los resultados de la comparación para aquellas secuencias que producen un alineamiento significativo en cada uno de los genomas analizados. Dichas secuencias presentan un 99% de identidad en el serogrupo B, un 100% de identidad en el serogrupo A y un 96% en el caso de N. gonorrhoeae, con la secuencia del gen codificante para la proteína NMA0939 obtenida (SEQ ID No. 3). Adicionalmente, se determinó la secuencia nucleotídica del gen en cuestión para 3 aislamientos cubanos (SEQ ID No. 5-7) pertenecientes al serogrupo B (B:4:P1.19,15) y se realizó un alineamiento de secuencia empleando el programa ClustalX (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Los resultados del alineamiento evidencian que existe una gran conservación en la secuencia nucleotídíca del gen nma0939 entre las distintas cepas analizadas y de manera general en el género Neisseria. El empleo de la proteína NMA0939 como candidato vacunal, tomando en cuenta el alto grado de similitud existente entre las secuencias anteriormente citadas, permitiría generar una respuesta inmune efectiva y de amplio espectro de protección contra la enfermedad meningoccócíca, producto de la amplia reactividad.

EJEMPLO 6 Caracterización de la respuesta inmune de amplio espectro de acción inducida por la inmunización de ratones Balb/c con la proteína NMA0939 Con el objetivo de evaluar si la inmunización con la proteina NMA0939 induce una respuesta de amplia reactividad con diversas cepas de Neisseria, se realizó un ensayo tipo ELISA en el que las placas de poliestireno se recubrieron con células completas de 5 cepas de Neisseria pertenecientes a diferentes serogrupos, serotipos y serosubtipos. Las placas se incubaron con la mezcla de los sueros obtenidos contra la proteína NMA0939 mezcladas con diferentes adyuvantes, según se describe en el Ejemplo 4. En la Figura 8 se muestra el reconocimiento de antígenos presentes en cepas de los serogrupos A, B y C de N. meningiiidis, por los sueros obtenidos después de la inmunización con la proteína recombínante NMA0939 mezclada con el polisacárido C de N. meningitidis. Los sueros generados después de la inoculación de la proteína con los otros adyuvantes tuvieron un comportamiento similar.

EJEMPLO 7 Protección inducida por los sueros murinos generados contra la proteína NMA0939 en el modelo de rata infante Para determinar la actividad funcional de los antisueros obtenidos, se realizó un ensayo de protección pasiva en el modelo de infección meningocóccica en ratas infantes. En dicho ensayo se emplearon 24 ratas de~5 a 6 días de nacidas, divididas en grupos de 6 animales cada uno. Se determinó si los sueros que se administraron por la ruta intraperitoneal protegían a las ratas de la infección meningocóccica causada por la cepa CU385, inoculada por la misma ruta una hora después. Los sueros de cada grupo de ratones inmunizados se mezclaron antes de ser inoculados en ratas infantes y se diluyeron 1 :10 en PBS estéril. Cuatro horas después del reto, los animales se sacrificaron y se hizo un conteo de las bacterias viables en su sangre. Para la interpretación de los resultados se realizó una pueba f de student de una sola cola, donde se compara cada grupo en estudio con el control negativo (mezcla de sueros de animales no tratados). Como se observa en la Figura 9A el grupo que recibió anticuerpos de los ratones que fueron inmunizados con la proteína NMA0939 mezclada con polisacárido C de N. meningitidis mostró diferencias significativas respecto al control negativo, o sea los anticuerpos fueron protectores en el modelo de rata infante. Los anticuerpos generados después de la inmunización con la proteína mezclada con Hidróxido de Aluminio también fueron protectores en este modelo (datos no mostrados). Un ensayo similar fue realizado infectando las ratas infantes con la cepa 233 (C:2a: P1.5) y los resultados se muestran en la Figura 9B detectándose al igual que en el experimento anterior que los anticuerpos de ratones inmunizados con la proteína adyuvada con Hidróxido de Aluminio ó polisacárido C protegieron a las ratas de la infección meningocóccíca en el modelo utilizado. Se realizaron otros ensayos infectando a las ratas con las cepas H44/48 y 120/90, aisladas de pacientes en Cuba, cuya clasificación serológica es homologa a la de la cepa CU385. Además, se realizó un experimento de reto con la cepa H44/76 (B:15:P1.7,16) del serogrupo B. En todos los casos los antisueros de ratones inmunizados con la proteína NMA0939 adyuvada con Hidróxido de Aluminio o mezclada con polisacárido C de N. meningiiidis protegieron a las ratas infantes contra la infección meningocóccica.

EJEMPLO 8 Generación de anticuerpos monoclonales contra la proteína NMA0939, capaces de mediar actividad bactericida contra Neisseria meninojitidis Con el objetivo de generar anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos contra la proteína NMA0939, y estudiar su capacidad funcional de mediar actividad bactericida contra cepas homologas y heterólogas de N. meningitidis, se empleó en un esquema de inmunización una preparación de la proteína NMA0939 con un porciento de pureza del 80% (Ejemplo 3). El esquema de inmunización se realizó en ratones Balb/c (H-2d , sexo femenino, 5-6 semanas) y contó con un total de 4 dosis distribuidas de la siguiente manera: los días 0, 15 y 30 del esquema se inocularon 10 µg del antígeno NMA0939 por ratón (volumen total 100 µl), administrados por vía subcutánea, emulsificada la primera dosis con Adyuvante completo de Freund, y las restantes dosis con Adyuvante Incompleto de Freund; el día 50, se administraron 10 µg del antígeno por ratón en solución tampón fosfato (NaCI 140 mM, KCI 270 mM, KH2PO4 1.5 mM, Na2HPO4 x 2H2O 6.5 mM, pH 7.2) por vía intraperitoneal. Las extracciones se realizaron los días 0 y 45 del esquema. Los esplenocitos del animal de mejor título, evaluados mediante un ELISA indirecto empleando la proteína NMA0939 en el recubrimiento, se fundieron con las células de mieloma X63 Ag8 653 y los hibridomas resultantes se aislaron y pesquisaron según métodos establecidos (Gavilondo JV. (1995). Anticuerpos Monoclonales: Teoría y Práctica, Elfos Scientiae, La Habana, Cuba). La reactividad de los anticuerpos secretados por los híbridomas obtenidos contra la proteína NMA0939, así como su reactividad contra un grupo de antígenos no relacionados, se evaluó mediante un ELISA indirecto empleando en el recubrimiento 5 µg/ml de cada uno de los antígenos, e igual concentración de los mAbs a ensayar. La Figura 10 muestra los resultados obtenidos en este experimento, en total se obtuvieron 3 clones positivos (mAbs H10/67, 3H3/24 y 7D6/18) que reconocen específicamente la proteína NMA0939, y no a la secuencia aminoacídica correspondiente al segmento N-term de la P64k, tampoco al resto del panel de antígenos no relacionados ensayados. Para determinar la capacidad de los mAbs generados contra la proteína NMA0939 de mediar actividad bactericida contra cepas homologas y heterólogas de N. meningitidis se realizó un ensayo bactericida. El título de anticuerpos bactericidas fue expresado como el recíproco de la mayor dilución de anticuerpos evaluada, capaz de matar el 50% ó más de las bacterias; dos de los mAbs generados (3H3/24 y 7D6/18) tuvieron títulos bactericidas superiores a 1 :128 contra la cepa homologa B:4:P1.19,15 y uno (H10/67) superior a 1 :80. Además tuvieron títulos superiores a 1 :64 contra las cepas heterólogas cuyas clasificaciones son B:15:P1.7,16 y C:2a:P1.5, respectivamente.

EJEMPLO 9 Caracterización de las regiones blanco de la respuesta inmune murina contra la proteína NMA0939 Con el objetivo de identificar las regiones dentro de la proteína, que son más reconocidas por los antisueros murinos generados contra el antígeno recombinante se realizó un ensayo de tipo SPOTScan. Una serie de péptidos sobrelapados que cubren la secuencia de la proteína se sintetizaron sobre un soporte de celulosa y la membrana se incubó con una mezcla de sueros diluida 1 :100. La reacción antígeno-anticuerpo se detectó mediante la incubación con un conjugado anti-lgG murina- fosfatasa alcalina, seguido de la adición de una solución que contenía el sustrato Bromo-Cloro-Indolil-Fosfato. Se observaron varias regiones antigénicas comunes presentes en la proteína, con independencia de la preparación que se empleó en la inmunización (datos no mostrados). No obstante, se apreció que en los grupos inmunizados con proteína adyuvada con Adyuvante de Freund se obtuvo un patrón de reconocimiento mucho más amplio.

EJEMPLO 10 Reconocimiento de la proteína NMA0939 por sueros humanos Una batería de sueros humanos, provenientes de individuos convalecientes se empleó en este estudio, que se realizó en un ensayo tipo ELISA. Las placas se recubrieron con la proteína NMA0939 obtenida mediante electroforesis preparativa (5 µg/ml). Después de bloquear las placas con leche descremada en polvo al 3% en PBS con Tween-20, los sueros se diluyeron (1 :50) en la misma solución y se incubaron en las placas. El inmunoensayo prosiguió como ha sido ampliamente reportado. Como control negativo se emplearon sueros de donantes sanos. También se empleó como control no relacionado una mezcla de sueros de vacunados con vacuna recombinante contra la Hepatitis B (datos no mostrados). La Figura 11 muestra los resultados obtenidos con 5 sueros de convalecientes en este ensayo. Como se aprecia, los sueros de convalescientes reconocieron la proteína lo que indica que la misma se expresa durante la infección meningocóccica y que es inmunogénica.

EJEMPLO 11 Proteína NMA0939 como portadora de un péptido Para demostrar la capacidad portadora de la proteína recombinante NMA0939, se conjugó a la misma un péptido sintético de 15 residuos amínoacídicos, derivado de la región V3 de la proteína gp120 del VIH-1 , aislamiento JY1. La conjugación se realizó por el método del glutaraldehído. El péptido JY1 libre, la proteína recombinante NMA0939 y el conjugado JY1-NMA0939, se administró a ratones adultos en un esquema de 3 dosis, donde los inmunógenos se emulsificaron con Adyuvante de Freund. Dos semanas después de la tercera dosis se obtuvieron muestras del suero de los anímales inmunizados, los que se analizaron por ELISA para determinar los niveles de anticuerpos anti-péptido. Para ello las placas se recubrieron con el péptido libre (20µg/ml) y el ¡nmunoensayo prosiguió como se ha descrito previamente. Los resultados del experimento (Figura 12) evidencian la capacidad portadora de la proteína NMA0939, capaz de potenciar significativamente la respuesta de anticuerpos contra el péptido JY1 , tras su conjugación al mismo.

EJEMPLO 12 Evaluación de la respuesta inmune inducida por la proteína NMA0939, por vía mucosal Para evaluar la inmunogenicidad de la proteína NMA0939 por vía mucosal, se diseñó un esquema de inmunización en ratones, en el cual se adiministró la proteína encapsulada en liposomas o mezclada con polisacárido C de N. meningitidis. Los liposomas se obtuvieron por el método de deshidratación-rehidratación como ha sido descrito previamente (Carménate T, et al. (2001 ). Recombinant Opc protein from Neisseria meningitidis reconstituted into liposomes elicits opsonic antibodies following immunization. Biotechnol. Appl. Biochem. 34: 63-69). Con ambas preparaciones se inmunizaron ratones Balb/c hembras, de 8 a 10 semanas de edad, los cuales recibieron 3 dosis de 50 µg de la proteína por vía ¡ntranasal, separadas por un intervalo de 15 días. Para realizar un análisis de la respuesta a nivel rnucosal se detectaron anticuerpos IgA presentes en muestras de lavados pulmonares de los ratones inmunizados. En la Figura 13 se muestran los niveles de anticuerpos IgA detectados en los dos grupos analizados.

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de infecciones provocadas por una bacteria del género Neisseria caracterizada porque comprende la proteína NMA0939, identificada como SEQ ID NO 4.

2.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la bacteria del género Neisseria es Neisseria meningitidis o Neisseria gonorrhoeae.

3.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque contiene además uno o varios antígenos de diferente naturaleza, obtenidos por vía recombinante, sintética o natural.

4.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque contiene antígenos polisacarídicos, incluyendo los polísacáridos bacterianos.

5.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque contiene polisacáridos capsulares de Neisseria meningiiidis.

6.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque contiene conjugados proteína- polísacárido, en cuyo componente polisacarídíco se encuentra un polisacárido bacteriano.

7.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque contiene antígenos peptídicos.

8.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se administra por vía parenteral o mucosal.

9.- La composición~farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la proteína NMA0939 es un adyuvante o un portador para antígenos de diversa naturaleza.

10.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada por contener fragmentos peptídicos o péptidos miméticos del antígeno de proteína NMA0939.

11.- Herramienta de diagnóstico en donde la proteína NMA0939 identificada como SEQ ID NO 4, se utiliza en la detección de la enfermedad meningocóccica en humanos, de forma independiente o en conjunto con otros componentes.

12.- Herramienta de diagnóstico en donde el gen codificante NMA0939, identificado como SEQ ID NO 3, se utiliza en la detección de la enfermedad meningocóccica en humanos, de forma independiente o en conjunto con otros componentes.