MXPA05001599A - Compuestos de union a p-selectina. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con derivados de compuestos que se unen selectivamente a la molecula de adhesion P-selectina humana, y particularmente a estos derivados que comprenden una entidad peptidica o un equivalente funcional de la entidad peptidica y se representan por X(Ax)mA3A1A2A1Y. Ademas, la invencion se relaciona con los metodos para preparar estos compuestos, con el uso de estos compuestos en metodos terapeuticos o de diagnostico y en composiciones farmaceuticas, para moleculas aglutinantes que se unen a los compuestos y con un metodo para determinar si un compuesto es capaz o no de unirse a P-selectina.

Description

COMPUESTOS DE UNIÓN A P-SELECTINA CAMPO DE IA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con compuestos que se unen selectivamente a la molécula de adhesión P-selectina humana, con los métodos para preparar estos compuestos, con el uso de estos compuestos en métodos terapéuticos o de diagnóstico y en composiciones farmacéuticas, para moléculas aglutinantes que se unen a los compuestos y con un método para determinar si un compuesto es capaz o no de unirse a P-selectina.

ANTECEDENTES DE IA INVENCIÓN En años recientes, las moléculas de adhesión a la superficie celular se han reconocido como mediadores clave en muchos procesos celulares incluyendo crecimiento celular, diferenciación, transmigración de células inmunes y respuesta y metástasis del cáncer. Se han identificado cuatro categorías principales de moléculas de adhesión: las moléculas de adhesión celular (CAM, por sus siglas en inglés) de la superfamilia inmunoglobulina, caderinas, integrinas y selectinas . Las selectinas representan una familia de tres transmembranas, glucoproteínas de unión a carbohidratos: E-selectinas "endotelial", L-selectina "leucocitos" y P-selectina "plaquetas". Las tres selectinas son un catión divalente (por ejemplo, calcio) que depende y posee un dominio extracelular con un motivo de reconocimiento con carbohidratos, un motivo similar al factor de crecimiento epidérmico y algunos dominios más pequeños relacionados con proteínas reguladoras complementarias. La P-selectina humano (también denominada como GMP-140, LECAM-3, PADGEM, CD62 y CD62P) se expresa mediante plaquetas y células endoteliales . Cuando se expresa sobre las superficies de estas células, su efecto más notable es el retraso de leucocitos a medida que estos dejan los capilares y entran a las vénulas post-capilares, las últimas que representan el sitio principal de adhesión de leucocitos-endotelio . El proceso de retraso se observa a media que los leucocitos se enrollan, lo que significa una adhesión inicial con afinidad relativamente baja. La adhesión firme de leucocitos enrollados se suministra principalmente por integrinas . En las células endoteliales, la P-selectina se almacena en cuerpos eibel-Palade; en plaquetas, se encuentran en los ct-gránulos. Después de la activación, la P-selectina se mueve a las superficies celulares en unos cuantos minutos en respuesta a una variedad de agentes inflamatorios o trombogénicos . La función principal de la P-selectina endotelial. es reunir leucocitos en las vénulas post-capilares, mientras que la P-selectina en plaquetas también da por resultado en la formación de trombina. Uno de los ligandos naturales actualmente conocido de P-selectina es PSGL-1 (ligando-1 de la glucoproteina P-selectina) , una sialoproteina 120 kDa expresada sobre la superficie de leucocitos donde se concentra en el uropod. Las descripciones más detalladas de la estructura y funciones de P-selectina se encuentra en muchas publicaciones (por ejemplo, J. Panes, Pathophysiology _5: 271 (1999); F. Chamoun et al., Frontiers in Bioscience _5: el03 (1 de noviembre de 2000) y S. -I. Hayachi, Circulation 102: 1710 (2000)). Los procesos de inflamación e inflamatorios desempeñan una función principal en la patofisiologia de muchas enfermedades y condiciones. Las condiciones del cerebro en el cual se encontraron niveles aumentados de selectina y que por lo tanto pueden estar implicados en los eventos patofisiológicos suministrados por selectina, incluyen: lesión cerebral traumática severa, esclerosis múltiple que remite a recaídas, oclusión de la arteria cerebral, isquemia y apoplejía. Las condiciones del corazón en las cuales se sugiere que las selectinas desempeñan una función incluyen: infarto miocárdico agudo, lesión arterial, tal como por ejemplo, la producida por angioplastia e isquemia. De manera similar, las selectinas están implicadas en las condiciones de los ríñones, tales como por ejemplo, lesión renal a partir de isquemia y reperfusión, e insuficiencia renal. Además, las selectinas parecen desempeñar una función en el rechazo al transplante de órganos, isquemia por frío, choque hemorrágico, choque séptico, metástasis tumoral, inflamación crónica, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, aterosclerosis , restenosis, angiogénesis, coagulación intravascular diseminada, síndrome de estrés respiratorio en adultos y choque circulatorio . De esta forma, parecería factible mejorar estas y otras condiciones que implican la activación de células endoteliales y leucocitos, y específicamente la movilización y expresión de P-selectina al interrumpir específicamente las cascadas de P-selectina. Esto se puede realizar, por ejemplo, mediante la administración de ligandos que se unan selectivamente a la P-selectina humana, pero que no posean su bioactiviad. Mediante este método, la P-selectina movilizada se podría inactivar y evitar el daño a tejidos inducido por leucocitos. Potencialmente, se podría alcanzar el mismo efecto mediante terapia génica, con la condición de que el ligando o antagonista de P-selectina sea un péptido o un péptido modificado. De acuerdo con este método, las células somáticas de una persona que necesita de la terapia se podrían transfectar con un vector de expresión que porte una secuencia de ADN que codifique para un antagonista de P-selectina. Los ligandos o antagonistas de P-selectina también se pueden utilizar para la prevención de las enfermedades y condiciones descritas anteriormente. Además, estos ligandos también pueden ser útiles en el diagnóstico in vivo o in vitzo de estas enfermedades. En años recientes se han hecho varios intentos por identificar o crear estos ligandos selectivos a P-selectina. Hasta el momento, se han probado varias sustancias, aunque en ninguno de los estudios clínicos todavía se ha proporcionado evidencia concluyente de que cualquiera de estos compuestos produzcan los efectos clínicos deseados mientras que sean tolerables en términos de efectos secundarios. Por ejemplo, los anticuerpos para P-selectina que se produjeron y probaron en modelos animales, se encontró que protegían a los ríñones de lesión por reperfusión isquémica (H. C. Rabb et al., JASN 5_: 907 (1997) y la US-A-6,033, 667). En otro estudio, se utilizó una forma soluble recombinante del ligando-1 de glucoproteína de P-selectina (rPSGL-Ig) para inhibir la trombosis en gatos (M. J. Eppihimer et al., Arteriesclerosis , Thrombosis, and Vascular Biology 20 2483 (2000) ) . La WO-96/09309 expone estructuras de oligosacáridos que son ligandos para la E- y P-selectina. La WO-99/41363 expone proteínas similares a podocalixina que se unen a selectinas. La WO-00/41711 describe diversos péptidos más pequeños o secuencias peptidicas que se unen a miembros de la familia de selectina humana. La mayoría de las secuencias comprenden una o más unidades de leucina o isoleucina. Como otra propuesta para inhibir la cascada de P-selectina, se encontró que diversos péptidos derivados del dominio lectina de la familia selectina inhiben la adhesión neutrofílica a P-selectina (por ejemplo, la US-A-6,111,065 y la US-A-5, 916, 876) ; estos péptidos probablemente se unen a los receptores de P-selectina en leucocitos . En la WO-94/05269, se describen péptidos que inhiben la unión de selectinas tales como por ejemplo, P-selectina, E-selectina y L-selectina. Estos péptidos tienen como sus porciones de región nuclear de la secuencia de 11-18 aminoácidos de P-selectina, E-selectina o L-selectina. Además, la WO-95/31210 se relaciona con péptidos y compuestos que se unen a selectinas incluyendo la molécula 1 de adhesión a leucocitos endotélicos (ELAM-1) . Estos péptidos se utilizan para bloquear la adhesión de leucocitos a las selectinas, es decir, en especial E-selectina, aunque también P-selectina o L-selectina, con el fin de inhibir la inflamación. En la solicitud de patente europea no pre-publicada No. 01203314.8, los compuestos, que comprenden la secuencia peptidica ??^?^??? o un equivalente funcional de la misma y tienen afinidad selectiva a la P-selectina humana, se han expuesto en donde: Ai es una D- o L-cisteina (C) , D- o L-metionina (M) , D- o L-valina (V) o un análogo de los mismos; A2 es un ácido D- o L-aspártico (D) o un análogo del mismo; A3 es una D- o L-fenilalanina (F) , D- o L-tirosina (Y) o D- o L-tryptófano (W) o un análogo de los mismos ; Ax es un D- o L-aminoácido; X marca el lado N-terminal de la secuencia e Y marca el lado C-terminal de la secuencia o X e Y juntos pueden formar un sistema cíclico. El compuesto E VDV descrito en la solicitud mencionada anteriormente tiene una afinidad para P-selectina, según se expresa por un valor IC50 de aproximadamente 2 µ?. Su tetrámero o estreptavidina tiene un IC50 de aproximadamente 2 µ?.

A pesar de los esfuerzos mencionados anteriormente, todavía existe una necesidad por sustancias con afinidad selectiva a P-selectina, que se puedan utilizar para prepara composiciones farmacéuticas para el diagnóstico, prevención y tratamiento de diversas enfermedades y condiciones que incluyen la adherencia de leucocitos a células endoteliales vasculares o a plaquetas. Para uso in vivo podría ser bastante conveniente tener compuestos relativamente simples con una afinidad muy alta para P-selectina. También existe una necesidad por ligandos de P-selectina, que se puedan utilizar como moléculas o entidades blanco en composiciones farmacéuticas para la dirección de los fármacos o material genético hacia tejidos que expresan P-selectina .

SOMft IO DE IA INVENCIÓN Por lo tanto, un objetivo de la invención es proporcionar compuestos con afinidad selectiva a P-selectina humana. En particular, un objetivo de la invención es proporcionar compuestos que actúen como antagonistas o antagonistas parciales de P-selectina. Otro objetivo de la invención es proporcionar compuestos que actúen como ligandos blanco con una capacidad para dirigir fármacos y material genético hacia células y tejidos que expresen P-selectina. Un objetivo adicional de la invención es la provisión de los métodos para preparar estos compuestos. Todavía otro objetivo es la presentación de los usos de estos compuestos, y de las composiciones que contengan los compuestos .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra las estructuras químicas de las entidades acilo 1-7 introducidas a la secuencia núcleo del compuesto 8. La Figura 2 es una representación esquemática de la síntesis en fase de sólidos de la biblioteca de compuestos 10. El compuesto de la secuencia núcleo 8 se sintetizó utilizando química Fmoc estándar sobre resina Tentagel S-N¾ con enlazante HMPA. El péptido núcleo luego se derivó en el término N (después de la eliminación del Fmoc) o sobre el término C (después de a eliminación selectiva del grupo DDE mediante hidracina al 2%) con 7 diferentes ácidos carboxílicos (véase la Figura 1) . Los péptidos se liberaron de la resina mediante escisión de TFA que da por resultado en la biblioteca del compuesto 10. Fmoc, N- ( 9-fluoroenil) metoxi-carbonilo; HMPA, ácido 4-hidroximetilfenoxiacético; Boc, N- (t-butoxicarbonilo) ; tBu, ter-butilo; TFA, ácido trifluoroacético; DDE, 4,4-dimetil-2, 6-dioxociclohex-l~iliden) etilo. La Figura 3 es una representación gráfica de la capacidad de los péptidos derivados HP20-HP77 para inhibir la unión de ligandos a P-selectina humana. Los péptidos derivados crudos se probaron en un análisis de competición para su capacidad para desplazar la unión de TMll-PO a P-selectina humana. Cada barra representa la unión de TMll-PO en presencia del péptido derivado (5 µ?, n = 3-5) . Los péptidos se codificaron HPíj en el cual i y j se refieren a la entidad acilo 1-7, según se muestra en la Figura 1 y se unen al término N y C, respectivamente. Los grupos amino N/C-sin modificar se indican por 0. Las Figuras 4A-D muestran la estructura química (Figura 4?) y la actividad biológica de la biblioteca de compuestos 14 (Figuras B-D) . La biblioteca de péptido crudo 14 (1 µ?) se probó en un análisis de competición de TMll-PO que se une a P-selectina humana. Se utilizaron tres separadores diferentes entre la entidad acilo y la secuencia núcleo WVDV (¾) ; sin separador (barras blancas), un separador de glicilo (barras grises) y separador aminobutírico (barras negras) . La estructura química de la modificación de acilo introducida (R2) se representa más adelante por estas barras. La Figura 5 muestra una representación gráfica de la competición de la unión de biotin-PAA-Lea-S03 a P-selectina humana ( ¦ ) , P-selectina de ratón (?) , L-selectina humana (A) y E-selectina humana (T) mediante el péptido 28. Las paredes se recubrieron con cada selectina (0.3 pg/ml) que se incubaron con 0.33 µg/ml de biotin-PAA-Lea-S03 con o sin el péptido 28 según se describe en el Ejemplo 3. La Figura 6 es una representación gráfica de la competición de la unión celular HL-60 a las células CHO-P mediante el péptido 28 (¦) o EWVDV (·) . Las células CHO-P se sembraron en 96 cavidades, se incubaron con células HL-60 marcadas con calceina en presencia del péptido 28 o EWVDV. Los puntos de datos son las medias de los puntos de datos 12 por cuadruplicado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA. INVENCIÓN Los compuestos de la presente invención tienen afinidad selectiva para P-selectina humana y son derivados de péptidos o equivalentes funcionales de los mismos, tales como por ejemplo, péptidos modificados, análogos peptidicos o peptidomiméticos . Los derivados se representan por X (Ax ) mA3AiA2AiY , en donde: Ai es un D- o L-aminoácido seleccionado del grupo que consiste de cisterna (C) y valina (V) , o un análogo o mimético de las mismas; - A2 es un ácido D- o L-aspártico (D) o un análogo o mimético del mismo; A3 es un D- o L-aminoácido seleccionado del grupo que consiste de fenilalanina (F) y triptófano (W) o un análogo o mimético del mismo; Ax es cualquier D- o L-aminoácido seleccionado del grupo que consiste de ácido glutámico, ácido aspártico, glicina, cisteina y análogos o miméticos de los mismos ; - X es un grupo N terminal o secuencia y es hidrógeno o un residuo que comprende de 1 hasta 6 D- o L-aminoácidos o análogos de los mismos; Y es un grupo C terminal o secuencia y es -OH o residuos que comprende de 1 hasta 11 D- o L-aminoácidos o análogos de los mismos; y se caracteriza porque ya sea X o Y, o tanto X como Y, se sustituyen con el grupo: R1-(Z)n en donde: Z se selecciona del grupo que consiste de -C0-, -0-,-NR2- y -CO-NR2-; -R1 y R2 se seleccionan independientemente de: H; un grupo (Ci-Cg) alquilo; - un grupo (C2-C3) alquilo en el cual al menos un átomo C sustituido con hidrógeno se reemplaza con un átomo de N-, oxigeno- o azufre sustituido con hidrógeno; un grupo (C5-Ci4) arilo se puede sustituir con al menos un grupo seleccionado del grupo que consiste de un átomo de halógeno, (Ci-C3) alquilo, CF3, -OH, -0-(d- C6) alquilo, -COOH, -C00- (Ci-C6) alquilo, -N02, -NH2, -NH- (d~ C6) alquilo, -N- ( (d-C6) alquil) 2 y -SO3H; - un grupo heteroarilo que se selecciona de sistemas de anillo de 5 ó 6 miembros y sistemas de anillo benzocondensado, que tiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de nitrógeno, oxigeno y azufre, en donde el grupo heteroarilo se puede sustituir con al menos un grupo seleccionado del grupo que consiste de un halógeno, - (Ci-Ce) alquilo, -CF3, -OH, -O- (Cj-C6) alquilo, -COOH, -COO- (Ci-C6) alquilo, -N02, -NH2, -NH- (d-C6) alquilo, -N- ( (d~Cs) alquil) 2 y -S03H; o un grupo aralquilo que comprende un grupo alquilo según se definió anteriormente y un grupo arilo o grupo heteroarilo según se definió anteriormente. Los índices m y n representan números enteros seleccionados independientemente de 0 y 1. Sin embargo, n no es 0 cuando R1 es H. Además, un compuesto de la invención comprende un derivado de un péptido o una estructura molecular que se relaciona con un péptido, en la presente denominado como equivalente funcional.

Los péptidos se definen como amidas que se derivan de dos o más aminoácidos mediante la combinación del grupo amino de un ácido con el grupo carboxilo de otro (Merriam Webster Medical Dictionary 2001) . En el sentido en el que se utiliza en la presente, un péptido también puede hacer referencia a una estructura peptidica dentro de una molécula. Típicamente, los péptidos se componen de L-cc-aminoácidos, que se presentan naturalmente, que son alanina (Ala o A) , arginina (Arg o R) , asparagina (Asn o N) , ácido aspártico (Asp o D) , cisterna (Cys o C) , glutamina (GIn o Q) , ácido glutámico (Glu o E) , glicina (Gly o G) , histidina (His o H) , isoleucina (lie o I) , leucina (Leu o L) , lisina (Lys o ) , metionina (Met o M) , fenilalanina (Phe o F) , prolina (Pro o P) , serina (Ser o S) , treonina (Thr o T) , triptófano (Trp o W) , tirosina (Tyr o Y) y valina (Val o V) . Los equivalentes funcionales de los péptidos de la invención son moléculas proteinaceas , que comprenden la misma actividad de unión a P-selectina humana en este tipo, aunque no necesariamente en la cantidad, y por ejemplo, pueden ser péptidos modificados peptoides, análogos peptídicos o peptidomiméticos . Los péptidos modificados son moléculas derivadas de péptidos mediante la introducción de sustituyentes o grupos funcionales que no están presentes en aminoácidos que se presentan naturalmente. El término también incluye compuestos que se obtienen mediante la reacción de péptidos con moléculas provenientes de otras categorías químicas, ya sea que estas moléculas se presenten o no naturalmente. Por ejemplo, los péptidos biotinilados, glucoproteinas y lipoproteinas con frecuencia se encuentran en la naturaleza, mientras que los péptidos modificados con polietilenglicol tales como por ejemplo, interferón a-2b pegilado (Peg-Intron®) , son ejemplos de péptidos modificados químicamente que se han diseñado para alterar algunas propiedades aunque no todas las de los péptidos . Los peptóides, similares a péptidos, son típicamente amidas de dos o más aminoácidos. Sin embargo, con frecuencia no se derivan directamente de aminoácidos que se presentan naturalmente, sino que más bien de diversos tipos de L- o D-aminoácidos sintetizados químicamente . Los peptidomiméticos, en su más amplio alcance, son compuestos que son en su estructura funcional más o menos similares a un péptido, pero que pueden contener enlaces no peptídicos en la estructura, o D-aminoácidos. En general, los peptidomiméticos sirven como sustitutos para péptidos naturales en la interacción con receptores y enzimas (Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D. J. A.

Crommelin and R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 138). Pseudopéptidos, una clase de peptidomiméticos , son compuestos que contienen isoésteres con enlace amida en lugar de enlaces amida (ibid., pp. 137-140) . De acuerdo con la invención, las dos unidades de Ai dentro de las secuencias se seleccionan independiente; las mismas pueden ser idénticas o diferentes entre si. De preferencia, al menos una de las unidades ? representa valina (V) . De mayor preferencia, ambas unidades Ai son valina (V) . En otra modalidad, Ai es un análogo o mimético de cisteina (C) , metionina (M) o valina (V) . Las técnicas para seleccionar los análogos o miméticos adecuados de aminoácidos que se presentan naturalmente son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, el enfoque de pseudopéptidos apunta a alcanzar una estabilidad química o enzimática mayor de un péptido mientras que mantenga su bioactividad . Los enlaces peptídicos que experimentan degradación rápida ín vivo se remplazan' por otros grupos funcionales para crear bioisoésteres o sustitutos de enlace amida. Los ejemplos de grupos bioisoestéricos son N-metilamida, tioéster, tioamida, cetometileno, metilenamino, amida retroinversa, grupos metilentio y metilenoxi {ibid., pp.138-139). Un enfoque para mejorar la selectividad de un péptido es introducir restricciones conformacionales a la estructura, lo cual disminuya el número de receptor potencial o interacciones enzimáticas. Las restricciones con mayor frecuencia se alcanzan mediante la introducción de dobles enlaces carbono-carbono (análogos olefinicos) en estructuras de anillo (ibid.) . Un método adicional para identificar análogos que imiten la estructura funcional de un aminoácido tales como por ejemplo, cisteina (C) , metionina (M) o valina (V) es un modelado auxiliado por computadora. Las estructuras miméticas preferidas poseen una cadena lateral con carga similar o electronegatividad, hidrofobicidad y orientación espacial a los aminoácidos. En otra modalidad, una o ambas unidades Ax son análogos de D-aminoácido de cisteina (C) , metionina (M) o valina (V) . Como se menciona, la presente invención también abarca los equivalentes funcionales derivados de los péptidos. Los equivalentes, entre otros, se pueden encontrar mediante sustitución de aminoácidos utilizando cambios de aminoácidos conservadores. En particular, la invención también abarca un método para determinar si un compuesto es capaz de unirse a P-selectina humana, que comprende sustituir en un compuesto de acuerdo con la invención, un aminoácido para un aminoácido conservador y determinar si el compuesto resultante es capaz de unirse a la P-selectina. De acuerdo con la invención, A2 es un ácido D- o L-aspártico con una cadena lateral expuesta a solventes que porta una carga negativa a pH fisiológico, o un análogo o mimético del mismo. Para identificar los análogos adecuados, se aplican los mismos principios como los que se han establecido con respecto a A3 es un D- o L-aminoácido con una cadena lateral aromática seleccionada del grupo que consiste de fenilalanina (F) y triptófano (W) , o un análogo o mimético de los mismos. De mayor preferencia, A3 es un L-aminoácido seleccionado de este grupo. Se prefiere en mayor medida triptófano (W) . En otras modalidades, A3 es una estructura análoga relacionada con fenilalanina (F) o triptófano (W) según se definió anteriormente. Ax es un D- o L-aminoácido, según se definió anteriormente, o un análogo o mimético del mismo. En una de las modalidades preferidas, Ax es un ácido D- o L-glutámico (E) , o un análogo o mimético del mismo. Se debe observar que las 2 unidades de Ai se seleccionan independientemente, es decir, pueden ser idénticas o diferentes entre si. X marca el grupo N-terminal . X puede ser simplemente un átomo de hidrógeno. En otra modalidad, X es una secuencia de hasta 6 aminoácidos, o análogos o miméticos de los mismos. El tipo de aminoácidos por supuesto no se verá afectado por ejemplo, mediante el cambio de la configuración del péptido o mediante el cambio de la orientación espacial del ácido carboxílico terminal con respecto al péptido núcleo, el reconocimiento medíante P-selectina es de forma que, el efecto dirigido ya no se obtiene. Los análogos adecuados incluyen, ácidos carboxilicos aminosustituidos , por ejemplo, ácido aminociclohexanoico, ácido aminobonzoico y ácido aminocaproico . Y marca el grupo C terminal. Y puede ser un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, Y es un residuo que comprende de 1 hasta 11 aminoácidos que portan un grupo hidróxido terminal. El reconocimiento mediante P-selectina es más tolerante a los sustituyentes en el término C. también se prefiere que al menos un aminoácido con una cadena lateral cargada negativamente esté presente en Y, de preferencia que se separen de la secuencia X (Ax) mA3AiA2Ai restante por uno a tres aminoácidos. En una modalidad particularmente preferida de la invención, Y es D- o L-lisina (K) , o comprende D- o L-lisina (K) . El compuesto de la invención puede poseer una estructura cíclica o de otra manera restringida. En tal caso, X+Y juntos se pueden enlazar adecuadamente a través de una unión S-S, aunque, por supuesto, también pueden estar presentes otros tipos de enlaces (químicos) , tales como por ejemplo una unión con amida, una unión con tioéter, una unión con carbamato o una unión con éster. La longitud del grupo X+Y no es particularmen e decisiva siempre y cuando la secuencia del núcleo se reconozca por P-selectina. En general, la longitud mínima de X+Y corresponde con la longitud de 5-6 aminoácidos. El grupo R1- {Z} n- con el cual X o Y, o tanto X como Y independientemente, se sustituyen, se puede seleccionar de los grupos R-CO en donde R es un grupo alquilo, arilo o heteroarilo. El grupo alquilo de preferencia tiene 2 hasta 8 átomos de carbono, al menos uno de los cuales se puede reemplazar por una entidad nitrógeno, oxígeno o azufre. Un grupo arilo tiene de preferencia de 6 hasta 14 átomos de carbono, y el grupo se puede sustituir con al menos un grupo seleccionado del grupo que consiste OH, COOH, N02, NH2, S03H y CF3. También son adecuadas las sustituciones en este grupo seleccionadas de -NHR, -CO(NHR), -CN(NHR), -N3, -(CH2)p-0H, y - (C¾) p-COOH, en donde R es como se definió anteriormente, mientras que p es un número entero de 1-8. El grupo heteroarilo tiene la misma definición como el grupo arilo con excepción de que al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno y azufre se incorpore en lugar de un átomo de carbono. De preferencia, el grupo heteroarilo se basa en un sistema de anillo de 5- o 6- miembros o un sistema de anillo benzo-condensado. Los ejemplos de los compuestos son aquellos en donde Z es -C0-, y R1 y/o R2 representan independientemente entre si los siguientes grupos: 4-hidroxifenilcarbonilo, 3, 5-dihidroxifenilcarbonilo, 3-hidroxi-5-carboniloxifenilcarbonilo, 3,4, 5-tri-metoxi-fenilcarbonilo, 3, 5-di-nitro-fenilcarbonilo, 4-carboxifenilcarbonilo, ácido 3-carbonilbutirico, 2-hidroxi-5-sulfonilfenilcarbonilo, 3-carboxifenilcarbonilo, 3, 5-difluorofenilcarbonilo, 1-sulfonil-2-aminoetilcarbonilo, 3, 5-di (trifluorometil) fenilcarbonilo , hidroximetilcarbonilo y 4-nitrofenilcarbonilo . Sin embargo, los grupos especialmente preferidos son los grupos acilo y más particularmente los grupos 3,5-dicarboxifenilcarbonilo y 3 , , 5-trihidroxifenilcarbonilo . Además, también se prefieren las modificaciones con base en ácido tánico, ácido cafeinico, grupos oligohidroxilarilo y grupos oligocarboxi-arilo asi como también derivados de los mismos, en especial en el grupo X. El grupo 3 , 4 , 5-trihidroxifenilcarbonilo sin embargo, se puede utilizar ventajosamente tanto en el grupo X con en el grupo Y. Se supone que la modificación R1-{Z)a confiere interacción adicional del compuesto peptidico con la unión de P-selectina en la P-selección, posiblemente mediante interacción electrostática o formación de puente con H. Esto conduce a la ganancia de poca afinidad para P-selectina . Se obtienen muy buenos resultados para aquellos compuestos que tienen una función amida N-terminal. También se obtienen muy buenos resultados cuando se utiliza un enlazante entre el grupo sustituyente N-terminal y el aminoácido Ax o ?3 en la secuencia de aminoácidos de los compuestos de la invención. Los enlazantes o separadores adecuados son glicina y ácido aminobutirico . Los compuestos de la invención poseen estructuras lineales ramificadas ciclicas o restringidas . Por ejemplo, los péptidos o equivalentes funcionales con al menos dos unidades cisteina (C) se pueden ciclizar mediante oxidación. Si un compuesto se cicliza vía este enlace disulfuro, se prefiere que las unidades de cisteina participantes san miembros de X e Y, respectivamente. Las estructuras cíclicas, de hecho, son un ejemplo de estructuras conformacionalmente restringidas. También se pueden introducir otros tipos de estructuras restringidas para disminuir la flexibilidad conformacional del compuesto. En especial, la presencia de enlaces olefínicos o pequeñas estructuras de anillo en la estructura sirve para este fin. Los ejemplos de estas restricciones se proporcionan en Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D. J. A. Crommelin and R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 139f. En uno de las modalidades preferidas, los compuestos de la invención se proporcionan como multimeros de los péptidos derivados o equivalente funcionales de los mismos . En otro tipo de multimero que se puede crear para formar los compuestos de la invención, el péptido derivado individual o las cadenas peptoideas de acuerdo con la invención se acoplan a una proteina biocompatible, tal como por ejemplo, albúmina de suero humana, anticuerpos humanizados, liposomas, miscelas, polímeros sintéticos, nanopartículas y fagos. Los multimeros también pueden representar péptidos derivados que se acoplan en serie entre si vía separadores, es decir, concatámeros o dendrímeros o grupos . Los compuestos en general se pueden preparar mediante los métodos que se conocen para la preparación de péptidos y sustancias similares y derivados de los mismos. Los compuestos menores que contienen sólo unos cuantos aminoácidos o unidades similares, y de preferencia no más a 30-50 unidades, se pueden preparar mediante técnicas de ligación química y/o enzimática, ya sea utilizando el procedimiento clásico en el cual las reacciones se llevan a cabo en solución o suspensión, o al emplear el procedimiento en fase sólida más moderno, en el cual el péptido se ensambla mientras que se ancla a una superficie sólida, tal como por ejemplo, una perla polimérica. Los compuestos mayores se sintetizan típicamente mediante sintetizadores peptídicos en fase sólida automática. Los compuestos obtenidos luego se modifican mediante la reacción con una fuente de R^ZJn- adecuada, de preferencia un grupo Ri(Z)n-OH. La fuente reacciona con un grupo de amina primaria en el compuesto peptídico. Cuando la secuencia de péptidos en los compuestos de acuerdo con la invención se realiza mediante la química Fmoc estándar y el grupo Fmoc protector se elimina, el término N está inmediatamente disponible para la reacción que introduce el grupo R1(Z)n. Cuando el término C no tiene amina libre disponible, la fuente se puede hacer reaccionar con lisina agregada, la lisina se puede agregar adecuadamente como su derivado de DDE. DDE es , -dimetil-2 , 6-dioxociclohex-l-iliden) -etilo; se puede eliminar selectivamente con hidracina al 2% sin afectar los grupos protectores de cadena lateral de ácido lábil. Algunos resúmenes más exhaustivos de los métodos que se pueden aplicar en la preparación de los compuestos se describen en: W. F. Anderson, Nature 392 Supp . , 30 de abril de 1998, p. 25-30; Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D. J. A. Crommelin and R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 53-70, 167-180, 123-152,8-20; Protein Synthesis: Methods and Protocols, Ed. R. Martin, Humana Press, 1998, p. 1-442; Solid-Phase Peptide Synthesis, Ed. G. B. Fields, Academic Press, 1997, p. 1-780; Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford üniversity Press, 1997, p. 1-89. Las sales de los derivados de los péptidos o equivalentes funcionales de los mismos se preparan mediante métodos conocidos, que típicamente implican el mezclando del derivado del péptido o peptoide con ya sea un ácido farmacéuticamente aceptable para formar una sal de adición de ácido, o con una base farmacéuticamente aceptable para formar una sal de adición de base.

Dependiendo del uso pretendido, los ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos orgánicos e inorgánicos, tales como por ejemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido propionico, ácido láctico, ácido glicolico, ácido oxálico, ácido pirúvico, ácido succinico, ácido maleico, ácido malonico, ácido cinámico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico y ácido tiociánico, que forman sales de amonio con grupos ámino libres de los péptidos derivados y equivalentes funcionales de los mismos. Las bases farmacéuticamente aceptables, que forman sales de carboxilato con los grupos carboxílicos libres de los péptidos derivados y equivalente funcionales, de los mismos, incluyen etilamina, metilamina, dimetilamina, trietilamina, isopropilamina, diisopropilamina y otros mono-, di- y trialquilaminas, asi como también, arilaminas . Además, también se abarcan los solvatos farmacéuticamente aceptables . Los multimeros del péptido derivado o peptoide de acuerdo con la invención, por ejemplo, se pueden preparar de una forma similar como los multimeros de péptidos, por ejemplo, al biotinilar las cadenas N-terminales y con la posterior complej ación con estreptavidina, con lo cual si se considera necesario ajustar el método a los compuestos específicos. A medida que la estreptavidina es capaz de unirse a 4 moléculas de biotina o conjugado con alta afinidad, mediante este método se pueden formar complejos peptidicos tetramedicos muy estables. Los multimeros se pueden componer de péptidos derivados idénticos o diferentes o equivalente funcionales. De preferencia, sin embargo, los multimeros de la invención se componen de dos o más péptidos derivados idénticos o equivalentes funcionales de los mismos.

Los compuestos de la invención tienen una afinidad a la P-selectina humana, una glucoproteina membranosa expresada por células endoteliales vasculares y plaquetas, que se implica en la adhesión de leucocitos al endotelio y plaquetas. La afinidad o características de unión de los compuestos a P-selectina se puede cuantificar, por ejemplo, en los términos del valor IC50. Típicamente, un valor IC50 de aproximadamente 50-100 µ? o menos se podría considerar como evidencia para la afinidad y unión. Más conveniente para los ligandos son las sustancias con valores IC50 de aproximadamente 10 µ? o menos. El valor IC5o que se puede obtener para los enlaces de tipo no covalente que desempeñan una función en las interacciones o uniones de acuerdo con la presente invención es de aproximadamente 10~15 M. En general, sin embargo, los valores IC50 son mayores a aproximadamente 10"12 M y en la mayoría de los casos mayores a aproximadamente 10"9 M. Los compuestos de la invención tienen valores IC50 micromolares bajos o nanomolares bajos hacia P-selectina, lo que los hace aproximadamente igualmente potentes como el ligando de la glucoproteína-1 de P-selectina de ligando natural. Se encontró que los compuestos modificados N-terminalmente de la invención fueron más eficaces (potentes y/o específicos) que los compuestos modificados C-terminalmente correspondientes que contenían las mismas modificaciones. Se obtuvieron muy buenos resultados con la modificación mediante ácido 1, 3, 5-tricarboxílico o ácido gálico. Además de esto, los compuestos de acuerdo con la invención pueden hacer que los péptidos sean más estables contra proteasas, en particular contra N-exopeptidasas, debido a la derivación. Los compuestos además pueden tener una especificidad mejorada para P-selectina y por lo tanto modular una acción farmacológica tal como por ejemplo, la interacción entre monocitos y plaquetas que entre monocitos y células endoteliales que entre células de plaquetas y células de plaquetas. De esta forma se pueden disminuir los efectos secundarios potenciales. Los compuestos podrían ser reactivos cruzados en muchas especies . Un aspecto adicional de la invención se refiere a los usos de los compuestos expuestos. Debido a que los compuestos se unen selectivamente a P-selectina, los mismos pueden, dependiendo de su tipo de interacción con P-selectina después de la unión, funcionar como antagonistas, antagonistas parciales, o como simples medios blanco para dirigir las sustancias conjugadas hacia células y tejidos que expresan P-selectina. De esta forma, los compuestos se pueden utilizar ventajosamente en composiciones f rmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos de la invención se pueden adaptar para varias rutas de administración, tales como por ejemplo, parenteral, oral, transmucosas, nasal o pulmonar. Las mismas también pueden contener agentes para dirigir el fármaco, agentes intensificadores de biodisponibilidad o ingredientes activos distintos a los compuestos de la invención, y proporcionar una nivelación inmediata o modificada . En el sentido en el que se utiliza en la presente el término "composición farmacéutica" se refiere a composiciones terapéuticas y de diagnóstico, asi como también, a medicamentos y diagnósticos que contienen estas composiciones. Las composiciones terapéuticas y medicamentos se utilizan para la prevención o tratamiento de enfermedades y otras condiciones de mamíferos en los cuales se desea la mejora de las condiciones. Los diagnósticos y las composiciones para diagnóstico se utilizan para el diagnóstico de esas enfermedades in vivo e in vitro. Un uso preferido de los compuestos es para preparar composiciones terapéuticas o medicamentos para prevenir o mejorar enfermedades y condiciones que implican la adhesión de leucocitos, tales como por ejemplo, monocitos y neutrófilos, al endotelio vascular y a las plaquetas. Los compuestos también se pueden utilizar en composiciones por tratar enfermedades en las cuales es conveniente la inhibición de la señalización intracelular suministrada por P-selectina. Por ejemplo, las composiciones que contienen uno o más compuestos de la invención pueden contribuir a controlar los procesos inflamatorios suministrados por leucocitos. Se sabe que los leucocitos activados liberan moléculas tóxicas que pueden dañar el tejido normal. Estas respuestas inflamatorias, algunas de las cuales también implican activación de plaquetas suministrada por P-selectina, son parte de diversas condiciones patológicas, tales como por ejemplo, rechazo a trasplantes, isquemia por frío, choque hemorrágico, choque séptico, metástasis tumoral, trombosis, inflamación crónica, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, aterosclerosis , restenosis, angiogénesis, coagulación intravascular diseminada, síndrome de estrés respiratorio en adultos, choque circulatorio, lesión cerebral traumática severa, esclerosis múltiple que remite a recaídas, oclusión de la arteria cerebral, isquemia, apoplejía, infarto miocárdico agudo, trombosis de la vena profunda, lesión arterial, tal como por ejemplo, la producida por angioplastia, isquemia miocárdica, lesión renal a partir de isquemia y reperfusión, y deficiencia renal . En otra modalidad, los compuestos se utilizan en la preparación de composiciones o productos para diagnóstico. Estas composiciones se pueden utilizar para pruebas in vitro para cuantificar las concentraciones de P-selectina en fluidos corporales como marcadores para las enfermedades y condiciones descritas anteriormente. Los mismos también se pueden utilizar para procedimiento de formación de imagen de diagnóstico in vivo para supervisar la aterosclerosis producida por P-selectina, aneurismas, restenosis después de la angioplastia coronaria transluminar percutánea (restenosis post-PTCA) y otras condiciones seleccionadas de aquellas en las cuales se inmoviliza la P-selectina. Como una opción para este uso, un compuesto de acuerdo con la invención se puede conjugar con un quelante, que se compleja posteriormente con una marca isotrópica que se puede detectar mediante el sistema de supervisión seleccionado. Otro uso de los compuestos es el de una herramienta en investigación. Por ejemplo, se pueden utilizar para probar la afinidad de unión de las moléculas a P-selectina o los equivalentes funcionales de P-selectina. Para conducir este método de prueba, P-selectina o un equivalente funcional de P-selectina se podría poner en contacto e incubar con una molécula que será probada para afinidad de unión y con un compuesto de la invención. Una unión reducida del compuesto de la invención podría indicar una afinidad de la molécula a P-selectina .

Los compuestos también se pueden utilizar como moléculas blanco o conjugados en las composiciones farmacéuticas para la dirección de los fármacos o material genético hacia tejidos que expresen P-selectina. Como conjugados, los compuestos se pueden acoplar directamente con las moléculas activas o ácidos nucleicos que se suministrarán a estos tejidos. Alternativamente, se pueden incorporar o anclar en la superficie de liposomas u otras vesículas lípidas, gotitas de emulsión, polímeros, nano- o micropartículas para obtener vehículos dirigidos hacia fármacos o material genético que se suministre a los tejidos que expresan P-selectina. Las composiciones farmacéuticas de preferencia contienen uno o más compuestos con afinidad de P-selectina según se expone en la presente y al menos un portador o excipiente. En el sentido en el que se utiliza en la presente, un portador o excipiente es cualquier sustancia farmacéuticamente aceptable o mezcla de sustancias que no tengan actividad farmacológica sustancial, que se puedan utilizar como un vehículo o como una sustancia auxiliar para formular un compuesto en forma de dosificación que sea estable y fácil de administrar. Los ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables se encuentran en las monografías de todas las principales farmacopeas. En una modalidad, la composición se formula y se procesa para inyección parenteral, de preferencia para inyección intravascular, tal como por ejemplo, administración intravenosa o intra-arterial, aunque también para administración intramuscular, subcutánea, intralesión, intraperitoneal u otras vías de administración parenteral. Los mismos principios que rigen la formulación de otros fármacos para estas vías de administración también mostraran a aquellos expertos en las técnicas la forma de preparar estas composiciones.

Por ejemplo, uno de los requerimientos de las formas de dosificación parenteral es su esterilidad. Otros requerimientos se describen en todas las principales farmacopeas, tales como por ejemplo, en la ÜSP 24, en la monografía "General Requirements for Tests and Assays. 1.

Injections", p. 1775- 1777. Para aumentar la estabilidad de la formulación parenteral, pude ser necesario proporcionar una forma de dosificación deshidratada que se deba reconstituir antes de que se pueda administrar. Un ejemplo de esta forma de dosificación es una formulación de secado por congelación o liofilizada. Puede ser conveniente administrar un compuesto de la invención como una forma de dosificación de liberación controlada parenteral para evitar inyecciones frecuentes y mejorar la eficacia y conveniencia de la terapia. Se conocen diversos métodos para preparar estas formulaciones para depósito. La liberación prolongada se puede proporcionar mediante implantes sólidos nanoparticulas, nanocápsulas , microparticulas, microcápsulas , emulsiones, suspensiones, suspensiones oleosas, liposomas o estructuras similares. Los excipientes que son particularmente útiles para la preparación de las formulaciones parenterales son solventes, cosolventes y portadores líquidos o semisólidos, tales como por ejemplo, agua estéril, etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, butandiol, aceites grasos, triglicéridos de cadena corta y media, lecitina, derivados de aceite de ricino y polioxietileno; sustancias para ajustar la osmolaridad y el pH, tales como por ejemplo, azúcares, en especial glucosa, alcoholes de azúcar, en especial manitol, cloruro de sodio, carbonato de sodio, ácido cítrico, acetato, fosfato, ácido fosfórico, ácido clorhídrico, idróxido de sodio, etc.; estabilizantes, antioxidantes y conservadores tales como por ejemplo, ácido ascórbico, sulfito sódico o sulfito de hidrógeno, EDTA, alcohol bencílico, etc.; otros excipientes y auxiliares de liofilización tales como por ejemplo, albúmina, dextrano etc. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas se pueden diseñar para administración oral y por consiguiente se pueden procesar. Las formas de dosificación oral adecuadas incluyen tabletas, cápsulas duras, cápsulas suaves, polvos, gránulos, formas de dosificación para desintegración oralmente, jarabes, gotas, suspensiones, tabletas efervescentes, tabletas masticables, películas orales, formas de dosificación liofilizada, formas de dosificación para liberación sostenida y formas de dosificación para libración controlada. En una de las modalidades preferidas, la forma de dosificación oral es una forma de dosificación sólida recubierta entéricamente para proporcionar la protección del compuesto del entorno ácido y proteolítico del estómago. También puede ser ventajoso administrar un compuesto de la invención en una forma de dosificación transmucosas. Esta vía de administración no es invasiva y no produce daño al paciente; al mismo tiempo puede conducir a una biodísponibilidad mejorada del compuesto en comparación con la administración oral, especialmente si el compuesto no es estable en los fluidos del sistema digestivo, o si es demasiado grande para ser absorbido del intestino eficazmente. La administración transmucosas es posible vía, por ejemplo, formas de dosificación nasal, bucal, sublingual, gingival o vaginal. Estas formas de dosificación se pueden preparar mediante técnicas conocidas; las mismas se pueden formular para representar gotas o rocíos nasales, insertos, películas, parches, geles, ungüentos o tabletas. De preferencia, los excipientes utilizados para la forma de dosificación transmucosas incluyen una o más sustancias que proporcionen mucoadhesión, prolongando así el tiempo de contacto de la forma de dosificación con el sitio de absorción y aumentando potencialmente con esto el grado de absorción . En una modalidad adicional, los compuestos se administran vía la ruta pulmonar, utilizando un inhalador de dosificación medida, un nebulizador, un rocío por aerosol o un inhalador de polvo seco. Las formulaciones adecuadas se pueden preparar mediante métodos y técnicas conocidas. La administración transdérmica, rectal u ocular también puede ser factible en algunos casos. Puede ser ventajoso utilizar métodos para suministro o dirección de fármacos para suministrar un compuesto de la invención más eficazmente. Por ejemplo, si se selecciona una vía de administración no parenteral, una forma de dosificación adecuada puede contener un agente intensificador de biodisponibilidad, que puede ser cualquier sustancia o mezcla de sustancias que aumente la disponibilidad del compuesto. Esto se puede alcanzar, por ejemplo, mediante la protección del compuesto de la degradación, tal como por e emplo, mediante un inhibidor enzimático o un antioxidante. De mayor preferencia, el agente intensificador aumenta la biodisponibilidad del compuesto al aumentar la permeabilidad del portador de absorción, que es típicamente una mucosa. Los intensificadores de permeación pueden actuar vía diversos mecanismos; algunos aumentan la fluidez de las membranas mucosas, mientras otros abren o dilatan las uniones de abertura entre las células de las mucosas. Todavía otros reducen la viscosidad del moco que cubre la capa celular de la mucosa. Entre los intensificadores de biodisponibilidad preferidos están las sustancias amfifílicas tales como por ejemplo, derivados de ácido cólico, fosfolípidos, etanol, ácidos grasos, ácido oleico, derivados de ácido grasos, EDTA, carbómeros, policarbofilo y quitosan. En un aspecto adicional, las moléculas capaces de unirse a los compuestos expuestos anteriormente están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, la tecnología de hibridación estándar se puede aplicar para preparar anticuerpos monoclonales específicos para un compuesto. Otras técnicas están disponibles para diseñar y preparar moléculas más pequeñas capaces de unirse a un compuesto de la invención. Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención, aunque no pretenden limitar su alcance a las modalidades presentadas en la presente.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Síntesis química del compuesto 9 de la secuencia núcleo unida por resina El compuesto 9 de la secuencia núcleo (resina FmocHN-Glu(OtBu) -Trp (Boc) -Val-Asp (OtBu) -Val-Lys (DDE) -GABA-HMPA; véase la Figura 1) se sintetizó en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems 9050 (Warrington, UK) utilizando química Fmoc estándar. En resumen, se proporcionó Tentagel S-N¾ (carga 0.26 mmol/g) con ácido 4-hidroximetilfenoxiacético (HMPA) como un enlazante, dando por resultado en el compuesto 8 (véase la Figura 1) .

El Fmoc-GABA-OH (10 eq. ) se unió a la resina 8 de HMPA bajo la agencia de N, N' -diciclohexilcarbodiimida (DCC, 5 eq.) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 0.5 eq.). Todos los otros aminoácidos, con la protección de cadena lateral de ácido lábil si es necesario, se unieron mediante acoplamiento en presencia de HOBt/TBTU/Dipea (4/4/8 eq. ) . Después del acoplamiento, la resina se lavó con DMF, isopropanol y dietiléter y posteriormente se secó.

Ejemplo 2 Síntesis del compuesto 10 La síntesis en fase de sólidos de la biblioteca de compuestos 10 (véase la Figura 1) se realizó utilizando un sistema Flexchem© (Robbins Scientífic, Sunnyvale U.S.A.). Después de la eliminación del grupo Fmoc N-terminal del compuesto 9 mediante piperidina al 20% en DMF, la resina se lavó (DMF) y se secó. La resina se distribuyó en 10 mg de cantidades sobre una placa de filtro de 48 cavidades resistente a solvente. Después de lavar con DMF, se agregó una mezcla del ácido carboxílico deseado (40 eq. ) , BOP (20 eq. ) , HOBt (20 eq. ) y NMM (100 eq.) (volumen total 300 µ?) y la resina suspendida se incubó durante 3 horas bajo transpiración continua con ¾ . Posteriormente, la resina se lavó con DMF y se incubó tres veces durante 3 minutos con hidracina mono idratada (2% en DMF) para eliminar el grupo DDE (4, 4-dimetil-2, 6-dioxociclonhex-l-iliden) etilo) . Después de lavar con DMF, se agregó una mezcla del segundo ácido carboxílico, BOP, HOBt y NMM (mismas cantidades según se describió anteriormente) y una vez nuevamente se incubó durante 3 horas. Los péptidos derivados, que se modificaron únicamente en la lisina C-terminal (HP0I-HPC7 véase más adelante) , se N-bocularon con di-t-butil-dicarbonato ( (t-Boc)2 0; 0.25 M) y Dipea (0.125 M en NMP) antes de la reacción para proteger la función amina N-terminal. Después de la eliminación del solvente, los péptidos se extrajeron por escisión de la resina con una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA) , triisopropilsilano (TIS) y mezcla de agua (95:2.5:2.5 v/v/v) . Cada muestra se liofilizó y se almacenó a -20°C hasta su utilización.

Ejemplo 3 Síntesis de los compuestos 11-13 , la biblioteca de compuestos 14 y los compuestos 27-33 Los péptidos derivados 11-13, la biblioteca de compuestos 14 y los péptidos derivados 27-33 se prepararon en la misma forma según se describió para la biblioteca 10 a partir de la resina unida a la secuencia de núcleos de la resina FmocHN-Trp (Boc) -Val-Asp (OtBu) -Val-HMPA. El péptido derivado 11 se acetiló utilizando anhídrido acético (0.25 M) y Dipea (0.125 M) en NMP.

Ejemplo 4: Análisis de competición con TM11-PO Los compuestos de acuerdo con la invención, según se prepararon en los ejemplos 1, 2 y 3 y algunos compuestos peptidicos de referencia se analizaron para su capacidad de inhibir la unión TM11-P0 a P-selectina humana. TM11-P0, un complejo TMll/strepPO tetramérico, que anteriormente se mostró se une con alta afinidad y especificidad a P-selectina humana (Molenaar et al., Blood 2002, 100, 3570-3577) , se preparó recientemente al incubar estreptavidina-peroxidasa (strep-PO (Amersham Life Science, Little Chalfont, Reino Unido), 8.4 µ?, 2.0 µ?) y TM11-biotina (biotina-CDVEWVDVSSLEWDLPC (sintetizada por Dr. Van der Zee, Department of Immunology, üniversity of Utrecht, Utrecht, los Países Bajos), 1.5 µ? 190 mM) durante 2 horas a temperatura ambiente en un amortiguador de análisis (20 mm de HEPES , 150 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2, pH 7.4). Para estudios de competición, una placa microtituladora de 96 cavidades (alta unión, fondo plano, Costar, Corning U.S. A.) se recubrió durante la noche a 4°C con 10 µg/ml de IgG anti-humano de cabra (Fe específico) (Sigma-Aldrich Z ijndrecht, los Países Bajos) en amortiguador de recubrimiento (50 mM de NaHC03, pH 9.6).

Posteriormente, las cavidades se lavaron con amortiguador de análisis y se incubaron durante 1 hora a 37 °C con amortiguador de bloqueo (BSA al 3% en amortiguador de análisis) . Después de lavar con el amortiguador de análisis, las cavidades se incubaron durante 2 horas a 3 °C con la quimera IgG-Fc de P-selectina humana (R & D Systems Europe Ltd., Abingdon, Reino Unido) (0.3 g/ml) . Posteriormente, las cavidades se lavaron con amortiguador de análisis y se incubaron durante 1 hora a 4°C con el complejo TM11-PO. Las cavidades se lavaron seis veces con amortiguador de lavado (0.1% Tween 20 en amortiguador de análisis). Se agregó 3, 3' , 5, 5' -tetrametilbenzamidina (TMB) /peróxido de hidrógeno (H202) (Pierce, Rochford, U.S.A.) y las cavidades se incubaron a temperatura ambiente durantQ 15 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de H2S04 2 M y la absorbancia se midió a 450 nm. Para los resultados véanse las siguientes tablas y la Figura 3.

Tabla 1: Péptido derivado e IC50 (M) HP24 1. 02 HP16 0. 31 HP17 0. 45 HP61 0. 19 HP 62 0. 28 HP63 3. 40 HP 65 2. 35 HP50 1. 10 HP06 6. 00 Los péptidos derivados se codificaron para HPij, en donde i y j se refieren a las entidades acilo R1 y R2 unidas al término N y C, respectivamente, de la fórmula 10 (Figura 1). El grupo amino sin modificar se indica por 0. Las entidades acilo de 1 hasta 7 se muestran en la Figura 2. La afinidad de los compuestos se confirmó mediante un análisis de adhesión celular en el cual se incubaron células de ovario de hámster chino que expresan P-selectina humana con células HL60 valoradas de los compuestos que expresan PSGL-1 en la presencia de cantidades de los compuestos.

Tabla 2 : Péptidos derivados y sus valores IC50 para P-selectina humana según se determina mediante Elisa de competición Péptido Secuencia IC50 (uM) a TM11 CDVEWVDVSSLEWDLPC 2b A29 E VDV 8fa A129 D VDV 16b A130 WVDV 28b A131 AWVDV 27b A138 WVDV >1000b 11 Ac-WVDV 27 12 GA-WVDV O .037 13 GA-EWVDV 0.031 los resultados son el promedio de al menos 3 experimentos a 8 concentraciones diferentes del péptido según se determina en ELISA de competición TM11-PO (materiales y métodos) a partir de la solicitud de patente europea no pre- publicada 01203314,8, Tabla 3 : Péptidos derivados de ácido gálico , y sus IC5Q para P-selectina humana según se determina mediante Elisa de competición Péptido Estructura IC50 (nM)a los valores son la media de al menos 3 experimentos a 8 concentraciones diferentes del péptido según se determina en ELISA de competición TMll-PO (materiales y métodos) .

Ejemplo 5 Análisis de competición con PAA-Lea-S03H Para ser capaz de probar la unión de los compuestos de acuerdo con la invención, también se utilizó otro miembro de la familia selectina (es decir, E- y L-selectina) , biotina-PAA-Lea-S03H (Synthesone, Munich, Alemania) en lugar de TMll-PO como el ligando en el análisis de competición. Este polímero con base de poliacrilamida (PAA) con grupos sulfo-Lewis A unidos, es un ligando de selectina establecido. Experimentalmente, se utilizó el mismo procedimiento del ejemplo 1, sin embargo, con las Siguientes diferencias. Dsspues de lavar con amortiguador de análisis, las cavidades se incubaron durante 2 horas a 37 °C con la quimera IgG-Fc de P-selectina humana, la quimera IgG-Fc de P-selectina de ratón la quimera IgG-Fc de L-selectina humana y la quimera IgG-Fc de E-selectina humana respectivamente (todas de R & D Systems Europe Ltd., Abingdon, Reino Unido) (0.3 pg/ml) . Posteriormente, las cavidades de la placa microtituladora se incubaron con biotina-PAA-Lea-S03H (0.33 pg/ml) durante 2 horas a 37 °C, en lugar del complejo TM11-PO. Para los resultados véase la Figura 5.

Ejemplo 6 Inhibición de las interacciones dinámicas entre células HL60 y P-selectina humana que expresan las células ováricas de hámster chino Las células ováricas de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) transfectadas establemente con P-selectina humana (CHO-P, por sus siglas en inglés) se donaron amablemente por el Dr. Modderman (University of Amsterdam, Amsterdam, los Países Bajos) . Las células se desarrollaron en DMEM (Bio Whittaker Europe, Verviers, Bélgica) conteniendo suero de ternera fetal al 10% (FCS, por sus siglas en inglés) (Bio itthaker) , L-glutamina 5 mM, 20,000 unidades de penicilina/estreptomicina (Bio Whittaker) y aminoácidos no esenciales 5 mM (Gibco, Paisley, Reino Unido) . Los matraces con las células se incubaron a 37 °C en C02 al 5% durante 3 ó 4 días hasta que las células se hubieran desarrollado casi confluentes. Las células HL60 provinieron de ATCC y se desarrollaron en medio RPMI 1640 (Bio Whittaker) con GCS al 10% L-glutamina 5 mM y 20,000 unidades de penicilina/estreptomicina. Las células HL-60 se marcaron fluorescentemente mediante incubación durante 30 minutos a 37 °C con calceina-AM 5 µ? (Molecular Probes, Leiden, los Países Bajos) en RPMI. Estas células (50, 000/cavidad) se agregaron a células CHO cultivadas que expresan P-selectina (células CHO-P, cultivadas en DMEM con FCS al 10%, aminoácidos no esenciales 5 mm, L-glutamina 5 mm y 20.000 U de penicilina/estreptomicina), se sembraron en placas de 96 cavidades en presencia o ausencia de los antagonistas de P-selectina (1 h, 4°C) (16). Después de un lavado leve con RPMI, se midió la fluorescencia asociada con CHO-P (???a 485Aem 530 nm) . Para los resultados véase la Figura 6..

Claims (27)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un compuesto con afinidad para P-selectina humana, que es un derivado de un péptido o un equivalente funcional del péptido representado por X (Ax) p^?^???, en donde : Ai es una D- o L-cisteina (C) o una D- o L-valina (V) o un análogo de las mismas; A2 es ácido D- o L-aspártico (D) o un análogo del mismo; A3 es D- o L-fenilalanina (F) o un D- o L-triptófanc (W) , o un análogo de los mismos ; - Ax es D- o L-aminoácido seleccionado del grupo que consiste de ácido glutámico, ácido aspártico, glicina y cisteina; X marca el lado N-terminal de la secuencia y es hidrógeno o un residuo que comprende de 1 hasta 6 D-o L-aminoácidos o análogos de los mismos; Y marca el lado C-terminal de la secuencia y es -OH o un residuo que comprende de 1 hasta 11 D- o L-aminoácidos o análogos de los mismos; en donde X e Y, juntos pueden formar un sistema cíclico; caracterizado porque al menos uno de X e Y o X+Y se sustituye con el grupo en donde: Z se selecciona de -C0-, -0-, -NR2- y -C0-NR2- y en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente de : a) H; b) un grupo (Ci-C8) alquilo; c) un grupo (C2-C8) alquilo, en donde al menos un átomo de C se remplaza con un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre; d) un grupo (C6-C1 ) arilo que se puede sustituir con al menos un grupo seleccionado de un halógeno, (Ci-C6) alquilo, CF3, -OH, -0- (Ci-C5) alquilo, -C00H, -C00- (Ci-C6) alquilo, -NC¡2, -N¾, -NH- (Ci-Cg) alquilo, -N- ( (Ci-C6) alquil) 2 y -S03H; e) un grupo heteroarilo que se selecciona de sistemas de anillo de 5 ó 6 miembros y sistemas de anillo benzocondensado, y tiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno y azufre, en donde el grupo heteroarilo se puede sustituir con al menos un grupo seleccionado del grupo que consiste de un halógeno, - (Cx-Cg) alquilo, -CF3, -OH, -0-(Ci-C6) alquilo, -C00H, -C00- (Ci-C6) alquilo, -N02, -N¾, -NH-(Ci-C6) alquilo, -N- ( (Ci-C6) alquil) 2 y -S03H; f) un grupo aralquilo que comprende un grupo alquilo según se definió en b) o c) y un grupo arilo o grupo heteroarilo según se definió en d) o e) ; y en donde m y n son números enteros seleccionados independientemente de 0 y 1, con la condición de que n no sea 0 cuando R1 es H.
2. 2. El compuesto según la reivindicación 1, caracterizado porque Ax representa ácido D- o L-glutámico (E) o ácido D- o L-aspártico.
3. 3. El compuesto según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque Ai representa D- -o L-valina (V) .
4. 4. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque A3 es D-o L-triptófano (W) .
5. 5. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque Y es un residuo que comprende D- o L-lisina.
6. 6. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque R1 es fenilo sin sustituir o fenilo sustituidos con al menos un sustituyente según se definió en la reivindicación 1.
7. 7. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque n es 0 y R1 es 3, 4, 5-trihidroxifenilcarbonilo o 3,5-dicarboxifenilcarbonilo .
8. 8. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque X no comprende aminoácidos e Y comprende D- o L-lisina.
9. 9. El compuesto según la reivindicación 8, caracterizado porque n es 0 y R1 es 3,4,5-trihidroxifenilcarbonilo o 3, 5-dicarboxifenilcarbonilo .
10. 10. El compuesto según la reivindicación 1, caracterizado porque m es 0, en donde Z es -CO-, y en donde Z está unido a Y vía una D- o L-glicina o un separador de ácido aminobutirico .
11. 11. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende una estructura cíclica o restringida.
12. 12. Una composición caracterizada porque comprende uno o más derivados de los péptidos o equivalentes funcionales de los mismos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
13. 13. Un método para la preparación de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende una secuencia de pasos en donde los monómeros de aminoácidos, oligómeros de aminoácidos, o mono- u oligómeros de análogos de aminoácidos o miméticos se ensamblan mediante ligación química o enzimática, y en donde los pasos se realizan en una fase líquida y/o en la interfaz para una fase de sólidos functionaliSed.
14. 14. El método según la reivindicación 13, caracterizado porque comprende hacer reaccionar el enlazante HMPA de la fórmula 8 (Figura 1) mediante química Fmoc estándar para proporcionar un compuesto de la secuencia X (Ax) p??3?1?2?1?, en donde X, Ax, A3, ??, A2, Y y m son como se definieron en la reivindicación 1, y en donde los grupos aminos se protegen inicialmente mediante grupos protectores, y R-CO se introduce al reemplazar los grupos protectores utilizando métodos estándar.
15. 15. El uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, como una medicina o diagnóstico .
16. 16. El uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para la fabricación de un medicamento para inhibir la unión de leucocitos a plaquetas y/o células endoteliales .
17. 17. El uso según la reivindicación 15 ó 16, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención, o diagnóstico de trastornos inflamatorios crónicos, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, aterosclerosis, restenosis, isquemia, lesión por reperfusión incluyendo deficiencia renal, metástasis tumoral, sepsis bacteriana, coagulación intravascular diseminada, síndrome de estrés respiratorio en adultos, apoplejía, angiogénesis, rechazo a trasplantes, trombosis o choque circulatorio.
18. 18. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
19. 19. La composición farmacéutica según la reivindicación 18, caracterizada porque se formula y se procesa para administración parenteral, de preferencia para inyección intravascular, intramuscular, subcutánea o intralesional .
20. 20. La composición farmacéutica según la reivindicación 18, caracterizada porque se formula y se procesa para administración oral, de preferencia en la forma de una tableta, una cápsula, gránulos, una forma de dosificación sólida, entérica, una forma de dosificación sólida que proporciona libración sostenida o controlada o una forma de dosificación para desintegración oralmente.
21. 21. La composición farmacéutica según la reivindicación 18, caracterizada porque se formula y se procesa para administración transmucosal , tal como por ejemplo, administración nasal, bucal, sublingual o vaginal .
22. 22. La composición farmacéutica según la reivindicación 18, caracterizada porque se formula y se procesa para administración pulmonar a través de un inhalador de dosificación medida, un nebulizador, un surtidor de roció en aerosol o un inhalador de polvo seco.
23. 23. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizada además porque comprende un agente para dirigir fármacos y/o un agente intensi icador de biodisponibxlidad.
24. 24. Un método para determinar si una molécula comprende una afinidad de unión para P-selectina, caracterizado porque comprende poner en contacto P-selectina o un equivalente funcional de la misma con la molécula y con un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y determinar si se reduce la unión del compuesto a P-selectina o el análogo funcional de la misma .
25. 25. Una molécula de unión capaz de unirse específicamente a un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
26. 26. Una molécula de unión según la reivindicación 25, caracterizada porque comprende un anticuerpo o una porción funcional, derivado y/o análogo del mismo.
27. 27. Un método para determinar si un compuesto es capaz de unirse a P-selectina humana, caracterizado porque comprende sustituir en un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, y el aminoácido para un aminoácido conservador y determinar si el compuesto resultante es capaz de unirse a la P-selectina.