COMPOSICION FARMACEUTICA ESTABLE QUE CONTIENE FACTOR VIII
Descripción de la Invención La invención se relaciona con una nueva composición farmacéutica estable que contiene el factor VIII. El factor VIII es una proteína plasmática bien conocida que es esencial para el proceso de coagulación sanguínea y por lo tanto se utiliza en el tratamiento contra la hemofilia. Se han utilizado o pretenden utilizarse varias formas del factor VIII como principios activos para el tratamiento contra hemofilia. Estos incluyen el factor VIII (como los principios activos de Húmate8 P, Monoclate8 P, Immunatee o Hemofil* M) , factor VIII recombinante de humano (como r-VIII SQ que se describe en la solicitud de patente pct O 91/09122 (el principio activo de ReFacto®) o los prmcipios activos de Kogenate o Recombmate ) , factor VIII ® porcino (que es el principio activo del producto Hyate-C comercializado por Ipsen, Inc., EUA) o factor VIII recombinante de porcino (por ejemplo una forma modificada sin dominio-B del factor VIII porcino como el que se describe en la solicitud de patente WO 01/68109 y se identifica como "POL1212" o la proteína de SEQ.ID.NO.38 de la misma solicitud de patente) . La estabilidad de la formulación siempre ha sido un
Ref. 158495 problema para la industria farmacéutica que lidia con las composiciones farmacéuticas del factor VIII. Normalmente se utiliza la albúmina en estas formulaciones. Sin embargo, a pesar de su efecto estabilizador interesante, la albúmina presenta el inconveniente de ser costosa y también presenta el riesgo de transportar especies infecciosas como priones. Por estas razones, la industria farmacéutica ha buscado en los últimos años reemplazar la albúmina por otros agentes estabilizadores en las composiciones farmacéuticas del factor VIII. El experto en la técnica ya conoce varias composiciones farmacéuticas estables libres de albúmina. Por ej emplo : Patente de EE.UU. Núm. 5,565,427 muestra una solución estabilizada libre de albúmina con factor VIII -C que contiene actividad del factor VIII-C, un aminoácido o una de sus sales u homólogos y un detergente (como el polisorbato 80 o T een8 80) o un polímero orgánico (como el polietilenglicol ) . Patente de EE.UU. Núm. 5,605,884 se relaciona con una composición estable de factor VIII que comprende factor VIII y un medio de resistencia altamente iónico, que preferiblemente comprende una solución acuosa que comprende una mezcla de cloruro de sodio, cloruro de calcio e histidina como un ión amortiguante.
Las patentes de EE.UU. Núms . 5,763,401 y 5,874,408 describen ambas una composición estable y libre de albúmina de factor VIII recombinante que comprende un factor VIII recombinante, glicina, histidina, sacarosa, cloruro de sodio y cloruro de calcio. La patente de EE.UU. Núm. 5,962,650 muestra una composición estable y libre de albúmina de factor VIII recombinante que comprende una solución acuosa con una concentración reducida de oxígeno que comprende factor VIII recombinante, un cloruro de calcio similar a sal de calcio y preferiblemente un antioxidante, un tensoactivo no iónico, cloruro de potasio o sodio, un aminoácido y un mono o disacárido. La patente de EE.UU. Núm. 5,972,885 se relaciona con una formulación farmacéutica para su administración subcutánea, intramuscular o intradermica que comprende factor VIII recombinante muy concentrado (al menos 1,000 IU/ml) y preferiblemente, uno o más elementos seleccionados a partir del grupo que comprende (notablemente) cloruro de potasio o sodio, cloruro de calcio, un tensoactivo no iónico (por ejemplo un poloxámero) , un mono o disacárido (preferiblemente sacarosa) y antioxidantes (por ejemplo ácido cítrico) . La solicitud de patente pct WO 89/09784 describe un método para la producción de un concentrado del factor VIII termoestable que comprende una filtración en gel de una solución amortiguadora que comprende el factor VIII y tris (hidroximetil) metilamina, citrato trisódico, cloruro de sodio, sacarosa y cloruro de calcio seguido de liofilización del concentrado obtenido. El factor VIII que se produce de esta forma es capaz de soportar temperaturas de hasta 80°C durante un periodo de hasta 72 horas . La solicitud de patente PCT WO 94/07510 describe una composición de factor VIII que se estabiliza mediante un tensoactivo no iónico (por ejemplo un poloxámero como el polisorbato 80) . Esta composición puede comprender uno o más elementos seleccionados a partir del grupo constituido (notablemente) por cloruro de potasio o sodio, cloruro de calcio, un aminoácido, un mono o disacárido como sacarosa. El Solicitante ha descubierto inesperadamente que una composición farmacéutica sólida obtenida mediante liofilización de una solución desprovista de aminoácidos que comprenden los siguientes componentes: (a factor VIII; (b un tensoactivo; (c cloruro de calcio; (d sacarosa; (e cloruro de sodio; (f citrato trisódico; y (g un amortiguador desprovisto de aminoácidos; la composición farmacéutica con un pH que abarca de 6 a 8 antes de su liofilización y después de su reconstitución en agua para inyección, también muestra estabilidad durante un periodo de tiempo. En esta solicitud, el término factor VIII significa el factor VIII humano, factor VIII humano recombinante, factor VIII porcino, factor VIII porcino recombinante o más generalmente cualquier factor VIII recombinante que pueda utilizarse para reemplazar los anteriores. Preferiblemente, el factor VIII comprendido en las composiciones según la invención, se ha de seleccionar a partir del factor VIII porcino o factor VIII porcino recombinante. Aún más preferiblemente, el factor VIII comprendido en las composiciones según la invención, será el factor VIII porcino recombinante, especialmente una forma modificada sin el dominio-B del factor VIII porcino como el descrito en la solicitud de patente O 01/68109, es decir ,el factor VIII porcino modificado que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. O.1:
Met Gln Leu Glu Leu Ser Thr Cys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro Leu 1 5 10 15
Gly Phe Ser Ala lie Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Arg Gln Ser Glu Leu Leu Arg Glu Leu His Val Asp Thr 3S 40 45 Arg Phe Pro Ala Thr Ala Pro Gly Ala Leu Pro Leu Gly Pro Ser Val 50 55 60 Leu Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Phe Thr Asp Gln Leu Phe Ser 65 70 75 " 80
Val Ala Arg Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr lie 85 90 95
Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val al Val Thr Leu Lys Asn Met Ala 100 105 110 Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Phe Trp Lys Ser 11S 120 125 Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Glu Asp His Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu 130 135 140 Asp Asp Lys Val Leu Pro Gly Lys Ser Gln Thr Tyr Val Trp Gln Val 145 150 . 155 160
Leu Lys Glu Asn Gly Pro Thr Ala Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr 165 170 175
Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu 180 185 190 lie Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Thr Arg Glu Arg 195 200 205 Thr Gln Asn Leu His Glu Phe Val Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu 210 215 220 Gly Lys Ser Trp His Ser Ala Arg Asn Asp Ser Tro Thr Arg Ala Met 225 230 235 240
Asp Pro Ala Pro Ala Arg Ala Gln Pro Ala Met His Thr Val Asn Gly 245 250 255
Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu lie Gly Cys His Lys Lys Ser 260 265 270 Val Tyr Trp His Val lie Gly Met Gly Thr Ser Pro Glu Val His Ser 275 280 285 lie Phe Leu Glu Gly Eis Thr Phe Leu Val Arg His His Arg Gln Ala 290 295 300 Ser Leu Glu lie Ser Pro Leu Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Phe Leu 305 310 315 320
Ket Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His lie Ser Ser His His 325 330 335
His Gly Gly Met Glu Ala His val Arg Val Glu Ser Cys Ala Glu Glu 340 345 350 Pro Gln Leu Arg Arg Lys Ala Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Asp Asn 355 360 365 Leu Tyr Asp Ser Asp Met Asp Val Val Arg Leu Asp Gly Asp Asp Val 370 375 380 Ser Pro Phe lie Gln lie Arg Ser Val Ala Lys Lys Hia Pro Lys Thr 385 390 395 400
Trp Val His Tyr lie Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415
Ala Val Pro Ser Pro Ser Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Leu Tyr Le Asn 420 425 430 Ser Gly Pro Gln Arg- lie Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Ala Arg Phe Val 435 440 445 Ala Tyr Thr Asp Val Thr Phe Lys Thr Arg Lys Ala lie Pro Tyr Glu 450 45S 460 Ser Gly lie Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 455 470 475 480
Leu lie lie ?he Lys Asn Lys Ala Ser Arg Pro Tyr Asn lie Tyx Pro 485 490 495
Eia Gly lie Thr Asp Val Ser Ala Leu K s Pro Gly Arg Leu Leu Lys 500 505 510 Gly Trp Lys His Leu Lys Asp Me Pro lie Leu Pro Gly Glu Thr Phe 515 520 525 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser lie Asn Leu Glu Lys
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu lie Gly Pro Leu Leu He Cys Tyr Lys Glu 565 570 575
Ser val ASO Gln Arg Gly Asn Gln Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590 lie Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Gln Ser Trp Tyr Leu Ala Glu 595 600 605 Asn lie Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Asp Gly Leu Gln Pro Gln Asp 610 615 620 Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn lie Met His Ser lie Asn Gly Tyr Val 625 630 635 €40 Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 €50 655
Tyr lie Leu Ser Val Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 6BS Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Leu Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Tyr Ser Cys Asp Arg Asp lie Gly Asp 725 730 735
Tyr Tyr Asp Asn Thr Ty Glu Aep lie Pro Gly Phe Leu Leu Ser Gly 740 74S 750 Lys Asn Val lie Glu Pro Arg Ser Phe Ala Gln Asn Ser Arg Pro Pro 755 760 755 Ser Ala Ser Ala Pro Lys Pro Pro Val Leu Arg Arg His Gln Arg Asp 770 775 780 lie Ser Leu Pro Thr Phe Gln Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp Tyr Asp 785 790 795 800
Asp lie Phe Ser Thr Glu Thr Lys Gly Glu Asp Phe Asp lie Tyr Gly 805 810 815
Glu Asp Glu Asn Gln Asp Pro Arg Ser Phe Gln Lys Arg Thr Arg His 820 825 330 Tyr Phe lie Ala Ala Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Glu 835 840 845 Ser Pro Arg Ala Leu Arg Asn Arg Ala Gln Asn Gly Glu Val Pro Arg 850 855 860 Phe Lys Lys Val Val Phe Arg Glu Phe Ala Asp Gly Ser Phe Thr Gilí. 865 870 875 880
Pro Ser Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Lys His Leu Gly Leu Leu Gly Pro 885 890 895
Tyr lie Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn lie Met Val Thr Phe Lys Asn 900 905 910 Gln. Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu lie Ser Tyr Pro 915 920 925 Aso Asp Glu Glu Gln Gly Ala Glu Pro Arg His Asn Phe Val Gln Pro 930 935 940 Asn Glu Thr Arg Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro 945 950 95S 960
Thr Glu Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val 965 970 975
Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu lie Gly Pro Leu Leu lie 980 985 990 Cys Arg Ala Asn Thr Leu Asn Ala Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val 995 1000 1005 Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr lie Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp 1010 1015 1020 Tyr Phe Thr Glu Asn Val Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys His Leu 1025 1030 1035 1040
Gln Met Glu Asp Pro Thr Leu Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala lie 1045 1050 1055
Asn Gly Tyr Val Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asn 1060 1065 1070 Gln Arg lie Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn lie 107S 1080 1085 His Ser lie His Phe Ser Gly His al Phe Ser Val Arg Lys Lys Glu 1090 1095 1100 Glu Tyr Lys Met Ala Val Tyr Asa Leu Tyr Pxo Gly Val Phe Glu Thr 1105 1110 1115 1120
Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Val Gly lie Trp Arg lie Glu Cys Leu 1125 1130 1135 lie Gly Glu His Leu .Gln Ala Gly Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Tyr 1140 ' 1145 1150 Ser Lys Glu Cys Gln Ala Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly Arg lie Arg . 1155 1160 1165 Aso Phe Gln lie Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys ~1170 1175 1180 Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser lie Asn Ala Trp Ser Thr Lys 1185 1190 1195 1200
Asp Pro His Ser Trp lie Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met lie lie 1205 1210 1215 His Gly lie Met Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr 1220 1225 1230 lie Ser Gln Phe lie lie Met Tyr Ser Leu Asp Gly Arg Asn Trp Gln 1235 1240 1245 Ser Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn
1250 1255 1260 Val Asp Ala Ser Gly lie Lys His Asn lie Phe Asn Pro Pro lie Val 1265 1270 1275 1280
Ala Arg Tyr lie Arg Leu His Pro Thr Kis Tyr Ser lie Arg Ser Thr 1285 1290 1295
Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro 1300 1305 1310 Leu Gly Met Gln Asn Lys Ala He Ser Asp Ser Gln lie Thr Ala Ser 1315 1320 1325 Ser His Leu Ser Asn lie Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Gln Ala Arg 1330 1335 1340 Leu Eis Leu Gln Gly Arg Thr Asn Ala Trp Arg Pro Arg Val Ser Ser 1345 1350 1355 1360
Ala Glu Glu Trp Leu Gln Val Asp Leu Gln Lys Thr Val Lys Val Thr 1365 1370 1375
Gly lie Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Ser Ser Met Tyr Val 1380 1385 1390 Lys Glu Phe Leu Val Ser Ser Ser Gln Asp Gly Arg Arg Trp Thr Leu 1395 1400 1405 Phe Leu Gln Asp Gly His. Thr Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser 1410 1415 1420 Ser Thr Pro Val Val Asn Ala Leu Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr 1425 1430 1435 1440
Leu Arg lie His Pro Tr Ser Trp Ala Gln His lie Ala Leu Arg Leu 1445 1450 1455
Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln . Asp Leu Tyr 1460 1465 Preferiblemente, el tensoactivo ha de ser un tensoactivo no iónico. Los tensoactivos no iónicos incluyen notablemente polisorbatos y copolímeros de bloque como poloxámeros (es decir, copolímeros de polietileno y propilenglicol ) . Según una variante preferida de la invención, el tensoactivo será un polisorbato. Con mayor preferencia, un polisorbato incluido en una composición según la presente invención tendrá un grado promedio de polimerización desde 20 a 100 unidades monoméricas (preferiblemente de aproximadamente 80) y es por ejemplo, el polisorbato 80. También preferiblemente, el polisorbato deberá ser derivado de productos vegetales. Preferiblemente, el amortiguador desprovisto de aminoácidos será tris (hidroximetil) metilamina (de aquí en adelante abreviado como "tris"). También preferiblemente, el pH de la composición farmacéutica antes de su liofilización y después de . su reconstitución en agua para inyección será de 6.5 a 7.5 y con mayor preferencia de aproximadamente 7.0. Preferiblemente, una composición sólida de conformidad con la invención tendrá tales características que pueda obtenerse mediante liofilización de una solución desprovista de aminoácidos que comprende: (a) una concentración de factor VIII que abarca de 50 a 10,000 unidades internacionales/ml para humano o factor VIÍI humano recombinante o de 50 a 10,000 unidades porcinas/ml para el factor VIII porcino o porcino recombinante; (b) una concentración de un tensoactivo que abarca mayor a una concentración micelar crítica hasta 1% v/v; (c) una concentración de cloruro de calcio que abarca de 0.5 a 10 mM; (d) una concentración de sacarosa que abarca de 5 a
50 mM; (e) una concentración de cloruro de sodio que abarca de 0.15 a 0.5M; (f) una concentración de citrato trisódico que abarca de 1 a 50 mM,- y (g) una concentración de amortiguador desprovisto de aminoácidos que abarca de 1 a 50 mM. Para evaluar la actividad en términos de unidades internacionales de factor VIII, el producto a ser analizado se valora con respecto a un Patrón de Concentrado, como sería el patrón de norma del Reino Unido "United Kingdom standard NIBSC" 95/608 (NIBSC para Instituto Nacional de Patrones y Control Biológico "National Institute of Biological Standards and Control" ) . El concepto de unidad porcina del factor VIII significa la unidad nacional estándar del Reino Unido que se mantiene por NIBSC del Reino Unido. Para evaluar la actividad en cuanto a unidades de factor VIII porcino, el producto a ser analizado se valora con respecto al estándar nacional porcino del Reino Unido NIBSC 86/514. En lo concerniente al factor VIII porcino recombinante, deberá entenderse que una unidad de actividad para el factor VIII porcino recombinante es equivalente a 1 unidad de actividad de factor VIII porcino . Con mayor preferencia, una composición sólida de conformidad con la invención será tal que pueda obtenerse mediante liofilización de una solución desprovista de aminoácidos que comprende al menos alguna de las siguientes características : • una concentración de factor VIII que abarca de 100 a 5,000 unidades internacionales/ml para factor ' VIII humano o humano recombinante o 100 a 5,000 unidades porcinas/ml para factor VIII porcino recombinante o porcino; • una concentración de tensoactivo que abarca de 0.002% a 0.04% v/v; • una concentración de cloruro de calcio que abarca de 1 a 5 mM; • una concentración de sacarosa que abarca de 5 a
mM; • una concentración de cloruro de sodio que abarca de 0.2 a 0.4 M; · una concentración de citrato trisódico que abarca de 1 a 20 mM; o • una concentración de amortiguador desprovisto de aminoácidos que abarca de 1 a 20 mM. Incluso con mayor preferencia, una composición sólida de conformidad con la invención será tal que pueda obtenerse mediante liofilización de una solución desprovista de aminoácidos que comprende al menos una de las siguientes características : • una concentración de factor VÍII que abarca de 200 a 2,000 unidades internacionales/ml (y notablemente aproximadamente 1,000 unidades internacionales/ml) para factor VIII humano recombinante o humano o de 200 a 2,000 unidades porcinas/ml (y notablemente aproximadamente 1,000 unidades porcinas/ml) para factor VIII porcino recombinante o porcino; • una concentración tensoactivo que abarca de aproximadamente 0.002% a 0.02% v/v (y notablemente de aproximadamente 0.01% v/v); • una concentración de cloruro de calcio que abarca de 1 a 3 mM (y notablemente de aproximadamente 2 mM) ; • una concentración de sacarosa que abarca de 5 a 15 mM (y notablemente de aproximadamente 11.7 mM) ; • una concentración de cloruro de sodio que abarca de 0.25 a 0.35 M (y notablemente aproximadamente 0.3 M) ; · una concentración de citrato trisódico que abarca de 1 a 20 raM (y notablemente aproximadamente 10 mM) ; o • una concentración de amortiguador desprovisto de aminoácidos que abarca de 5 a 15 mM (y notablemente aproximadamente 10 mM) . Las composiciones sólidas del factor VIII según la invención pueden prepararse al liofilizar una solución que comprende cantidades apropiadas de los componentes identificados anteriormente como (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) y (g) según los procedimientos convencionales de fabricación (condiciones estériles, etc.) Por ejemplo, puede determinarse la estabilidad de una composición durante un cierto periodo de tiempo mediante el método descrito a continuación en la parte titulada "Métodos analíticos", o mediante cualquier otro método que sea apropiado para el experto en la técnica. Una composición según la invención se considera estable durante cierto periodo de tiempo si 70% a 130% (y preferiblemente 80% a 120%) de la actividad inicial del factor VIII, como se evalúa usando el método descrito en la parte titulada "Métodos analíticos" se mantiene durante ese periodo de tiempo. Preferiblemente, las composiciones sólidas de la invención son estables durante al menos 6 ó 12 meses cuando se mantienen a una temperatura de 2 a 8°C. Con mayor preferencia, serán estables durante al menos 6 ó 12 meses cuando se mantengan a una temperatura de 30 a 22°C. Las composiciones sólidas del factor VIII según la invención pueden diluirse con agua estéril que contenga opcionalmente cloruro de sodio y la composición farmacéutica líquida resultante puede inyectarse directamente en el paciente que la necesite. La composición farmacéutica líquida resultante, así como las composiciones farmacéuticas líquidas obtenibles mediante dilución de las composiciones sólidas del factor VIII según la invención con agua estéril que opcionalmente contenga cloruro de sodio, también son parte de la invención. Los métodos de tratamiento contra hemofilia que comprenden la administración de una composición líquida según la invención en un paciente que la necesite también se encuentran dentro del alcance de la invención. El modo de administración contemplado para composiciones líquidas según la invención actual preferiblemente será la administración intravenosa. La dosis de la composición de conformidad con la invención actual que se haga administrar será determinada por el veterinario o médico que atiende, tomando en consideración la severidad de la enfermedad en cada paciente. En esta descripción, el término "aproximadamente" se refiere a un intervalo aproximado al valor considerado. Como se utiliza en esta solicitud de patente, el término "aproximadamente X" significa un intervalo desde X menos 10% de X a X más 10% de X, y preferiblemente un intervalo de X menos 5% de X a X más 5% de X. Al menos que se definan en forma diferente, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado el cual se entiende normalmente por el especialista común en el campo al cual pertenece la invención. Similarmente , todas las publicaciones, solicitudes •de patente, todas las patentes y otras referencias mencionadas aquí se incorporan a manera de referencia. Se presentan los siguientes ejemplos para ilustrar lo anterior y en ningún caso se deberán considerar como limitantes del alcance de la invención.
Ejemplos Ej emplo 1 : Se prepara una solución en 0.5 mi de agua estéril que contiene los siguientes componentes:
Factor VIII porcino modificado de 800 unidades secuencia SEQ.ID.NO.l porcinas/ml Polisorbato 80 derivado de vegetales 0.01% v/v Cloruro de calcio 2 mM Sacarosa 11.7 mM Cloruro de sodio 0.3 M Citrato trisódico 10 mM Factor VIII porcino modificado de 800 unidades secuencia SEQ.ID.N0.1 porcinas/ml Amortiguador tris 10 mM pH 7.0 mezcla se liofiliza en un frasco estéril que luego se sella. La composición sólida obtenida ha sido analizada y demuestra ser estable a una temperatura de 2 a 8°C durante al menos 18 meses y a 30 a 32°C durante al menos seis meses cuando se analiza para determinar la actividad del factor VIII. No hubo indicación de una formación de componentes de elevado peso molecular según se evalúa mediante una HPLC de exclusión por tamaño (SEC HPLC) o fragmentos como se evalúa mediante SDS PAGE. La mezcla liofilizada obtenida se reconstituye normalmente con 1.0 mi de agua estéril antes de inyectarse en el paciente.
Ejemplo 2 Se prepara una solución en 1.0 mi de agua estéril que contiene los siguientes componentes:
Factor VIII porcino modificado de 400 unidades secuencia SEQ.ID.NO.l porcinas/ml Polisorbato 80 derivado de vegetales 0.002% v/v Factor VIII porcino modificado de 400 unidades secuencia SEQ.ID.N0.1 porcinas/ml Cloruro de calcio 2 mM Sacarosa 11.7 mM Cloruro de sodio 0.3 M Citrato trisódico 10 mM Amortiguador tris 10 mM, PH 7.0 La mezcla se liofiliza en un frasco esterilizado que luego se sella. La mezcla liofilizada obtenida normalmente se reconstituye con 2.0 mi de agua estéril antes de inyectarse en el paciente.
Ejemplo 3 Se preparó la solución en 0.5 mi de agua estéril que contiene los siguientes componentes:
Factor VIII porcino derivado de 100 unidades plasma porcinas/ml Polisorbato 80 derivado de vegetales 0.01% v/v Cloruro de calcio 2 mM Sacarosa 11.7 mM Cloruro de sodio 0.3 M Factor VIII porcino derivado de 100 unidades plasma porcinas/ml Citrato trisódico 10 mM Amortiguador tris 10 mM pH 7.0 La mezcla se liofiliza en un frasco esterilizado que luego se sella. La mezcla liofilizada obtenida normalmente se reconstituye con 1.0 mi de agua estéril antes de inyectarse en el paciente. Métodos Analíticos Valoración Cromogénica La actividad del factor VIII se determina mediante una valoración cromogénica modificada (Technochrom FVIII-C juego de reactivos, Technoclone) . La generación del factor X activado mediante el factor IX se estimula por el factor VIII que actúa como un cofactor en la reacción. La liberación de p-nitroanilina del sustrato cromogénico se cataliza mediante el factor X activado. La cantidad de p-nitroanilina que se libera se mide fotométricamente a 405 nm y la valoración proporciona una correlación lineal entre la cantidad de p-nitroanilina generada y el contenido de F-VIII. sec hplc Los componentes solubles de elevado peso molecular y sus fragmentos se determinan mediante una filtración en gel llevada a cabo en un instrumento de HPLC usando una columna pre-empacada TosoHaas TSK G3000 S XL, 0.78 x 30 era con un detector de fluorescencia (Waters LC Module 1 plus) . La longitud de onda de excitación es 280 nm y la longitud de onda de emisión es 340 nm. La evaluación de los resultados se lleva a cabo mediante la integración de las áreas pico. Valoración SDS Page Se utilizó SDS PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida usando un sistema de electroforesis de lecho plano (Multiphor II LKB) y geles prefundidos al 7.5% (EXCELGEL SDS, Pharmacia) para determinar productos del desdoblamiento de la molécula FVIII . Las bandas de proteína se pudieron visualizar mediante una tinción de azul de Coomassie. Valoración de Estabilidad Se puede valorar la estabilidad llevando a cabo las valoraciones descritas con anterioridad en diferentes momentos sobre una muestra de la misma composición que se mantiene a la temperatura seleccionada (que puede ser de alrededor de + 4°C ó + 31°C) . Una vez que la actividad del factor VIII haya caído a más de 30%, se considera que la composición ha perdido su estabilidad. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.