MXPA04009036A - Uso de agonistas del receptor ep4 selectivos para el tratamiento de la insuficiencia hepatica, perdida de permeabilidad del ductus arterioso, glaucoma o hipertension ocular. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere procedimientos para el tratamiento de la insuficiencia hepatica, perdida de permeabilidad del ductus arterioso, glaucoma o hipertension ocular, que comprenden la administracion al paciente en necesidad del mismo de una cantidad terapeuticamente efectiva de un agonista del receptor EP4 selectivo de formula (ver formulas I, II)en las que las variables A, B, Q, =U Y R2 para la formula I; y las variables Ar, =M, =N, R, W y Z para formula II son como se definen en la memoria descriptiva.

Description

USO DE AGONISTAS DEL RECEPTOR ??? SELECTIVOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA INSUFICIENCIA HEPATICA. PERDIDA DE PERMEABILIDAD DEL DUCTUS ARTERIOSO, GLAUCOMA O HIPERTENSION OCULAR CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a procedimientos de uso de agonistas de la prostaglandina (PGE2) selectivos al receptor para el tratamiento de la insuficiencia hepática, pérdida de permeabilidad del ductus arterioso, glaucoma o hipertensión ocular en animales, de forma particular en mamíferos. Más específicamente, la presente invención se refiere a los procedimientos que emplean agonistas de la prostaglandina (PGE2) selectivos del receptor tipo 4 (EP4).

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las prostaglandinas de origen natural comprenden varias entidades biológicas que incluyen PBD, PGE, PGF, PGG, PGH y PGI. Se encuentra bien documentado que las prostaglandinas producen efectos sobre muchos de los órganos y sistemas del cuerpo. Se sabe que la prostaglandina E2 (de forma abreviada PGE2 en el presente documento) es un metabolito de oxidación inducido por la ciclooxigenasa en la cascada del ácido araquidónico, y se encuentra bien documentado que las prostaglandinas, incluyendo la PGE2 , producen efectos sobre muchos de los órganos y sistemas del cuerpo. Por ejemplo, se sabe que la PGE2 presenta una actividad de protección citológica, actividad de contracción uterina, efecto de inducción del dolor, efecto de promoción de la peristalsis digestiva, efecto de excitación, efecto de inducción al sueño, efecto de supresión de la secreción de ácido gástrico, actividad hipotensiva y actividad diurética. En estudios previos se ha encontrado que el receptor de la PGE2 presenta varios subtipos, jugando cada uno de ellos distintos papeles fisiológicos. Igualmente se sabe que el receptor de la PGE2 tiene cuatro subtipos primarios denotados por EP-i , EP2, EP3 y EP4, respectivamente, cada uno de los cuales media en diferentes efectos en distintos tejidos y células (Coleman, R. A. y col., Pharm. Rev. 1994, 46(2), 205 a 229). El receptor EP4 está distribuido en órganos tales como el timo, corazón, riñon, hígado, intestino, útero, ductus arterioso y hueso, y se sabe que el receptor EP4 está relacionado con la relajación del músculo liso, la diferenciación y proliferación de linfocitos, la proliferación de células mesangiales y con la producción de colágeno de los fibroblastos. Tanto en el cerdo como en el perro, se caracteriza la modulación del receptor EP4 con la relajación de la vena safena, y en el conejo tiene lugar la relajación de la vena yugular (Coleman, R. A. y col., Prostaglandins 1994, 47, 151 ). Se ha demostrado en numerosos estudios la acción protectora de la prostaglandina E1 sobre modelos experimentales de daño hepático y sobre pacientes con hepatitis viral fulminante, con la PGE1 actuando de muchas formas diferentes para llevar a cabo este efecto (Liu, X. L. Y col., World J. Gastroenterol. 2000, 6(3), 326 a 329). Por ejemplo, la PGE1 podría actuar sobre el receptor de la PGEi de vasos dañados para dilatarlos y aumentar el flujo venoso portal, mejorar la microcirculación del hígado, limpiar los metabolitos de las células del hígado y aumentar el suministro de oxígeno a los tejidos del hígado. El receptor EP4 se expresa también en el ductus arterioso (Bhattacharya, M. Y col., Circulation 1999, 100, 1751 -1756). El ductus arterioso es una conexión arterial en el feto, la cual dirige la sangre desde la circulación pulmonar hacia la placenta donde tiene lugar la oxigenación (Heymann, M. A.; Rudolph, A. M. Physiol. Rev. 1975, 55, 62 a 78). En un modelo propuesto el receptor EP4 en el ductus arterioso actúa como un sensor que responde a la gota perinatal con cantidades en circulación de PGE2 mediante activación del cierre del ductus arterioso (Nguyen, M. Y col., Nature 1997, 390, 78 a 81 ). El cierre del ductus arterioso fue observado en un modelo de oveja fetal in vivo tras la administración de un antagonista del EP4 selectivo (solicitud internacional PCT WO 01/42281 , publicada el 14 de junio de 2001 ). Es deseable mantener el ductus arterioso en el estado abierto o estado permeable en el feto y en niños con ciertos tipos de defectos cardíacos congénitos en los que el flujo sanguíneo pulmonar o sistémico dependa de la permeabilidad del ductus arterioso. También puede ser deseable mantener la permeabilidad del ductus arterioso en niños con ciertos tipos de otras enfermedades cardíacas congénitas tales como coartación de la aorta, transposición de las arterias grandes y anomalía de Ebstein. Por ejemplo, los niños con coartación de la aorta, una afección que constituye de un 7% a un 8% de los defectos cardíacos congénitos pueden presentar un comienzo repentino de insuficiencia cardíaca, colapso cardiovascular y acidosis metabólica grave, ya que el ductus arterioso se cierra y se compromete la perfusión distal. En casos como estos, se han empleado infusiones de PGE-i para reabrir y mantener la permeabilidad del ductus arterioso hasta la solución quirúrgica del defecto. Un exceso de humor acuoso en la cámara anterior del ojo puede originar una presión intraocular elevada o hipertensión ocular. La hipertensión ocular es un síntoma y/o un factor de riesgo para el glaucoma, una enfermedad que puede dañar el nervio óptico y causar ceguera. Se ha encontrado el receptor EP4 en tejidos oculares involucrados en la producción del humor acuoso, tales como células epiteliales ciliares humanas y células del músculo ciliar humano (Mukhopadhyay y col., Biochem. Pharmacol. 1997, 53, 1249 a 1255). Se sabe que las células de la malla trabecular humana están involucradas en la regulación de la presión intraocular (Clark y col., Investigative Opthalmology & Visual Science 1994, 35, 281 a 294; y Lutjen-Drescoll, Progress in Retinal and Eye Research 1998, 18, 91 a 1 19). Se ha encontrado también el receptor EP4 en células de la malla trabecular humana y se ha propuesto que la activación de los receptores EP4 en las células de la malla trabecular puede originar una relajación de estar célula, con lo que se disminuye la presión intraocular (solicitud de patente internacional PCT WO 00/38667, publicada el 6 de julio de 2000). Ya que la PGE1 y la PGE2 se une a los cuatro subtipos de receptor de la PGE2 (EPi, EP2, EP3, EP4) puede resultar varias actividades fisiológicas, algunas de las cuales puede ser un efecto secundario no deseado debido a la falta de selectividad en la unión a los subtipos de receptor de la PGE2. Se han asociado efectos secundarios graves con el tratamiento con PGE2. W.S.S. Jee, W.S.S. y Ma, Y.F. Bone, 1997, 21, 297 a 304. La memoria descriptiva de la patente de Gran Bretaña 1 553 595 describe compuestos de fórmula en la que los dobles enlaces son cis o trans y las variables se definen tal como se establece en dicho documento. Tales compuestos se describen como poseedores de actividad espasmogénica y espasmolítica, por ejemplo efectos bronquiodilatadores y antihipertensivos. Los compuestos se describen también como útiles en la inhibición de la secreción de jugo gástrico y efectos abortivos. La patente de Estados Unidos No. 4,1 15,401 describe compuestos de la fórmula en la que las variables se definen como se establece en dicho documento. Estos compuestos se describen como poseedores de efectos espasmogénicos, cardiovasculares y bronquiodilatadores. La patente de Estados Unidos No. 4,1 13,873 describe compuestos de fórmula en la que las variables se definen tal como se establece en el presente documento. Tales compuestos se describen como útiles como bronquiodilatador, como agente antihipertensivo, como potenciador de la contracción espontánea del útero y para el tratamiento de trastornos gastrointestinales o úlceras gástricas. La memoria descriptiva de la patente de Gran Bretaña 1 583 163 describe compuestos de fórmula en la que las variables se definen tal como se establece en dicho documento. Tales compuestos se describen como poseedores de propiedades espasmogénicas, bronquiodilatadoras, vasoconstrictoras, vasodilatadoras y abortivas así como de utilidad en la inhibición de la secreción acida gástrica. La patente de Estados Unidos No. 4,177,346 describe compuestos de fórmula I en la que las variables se definen tal como se establece en dicho documento. Estos compuestos se describen como poseedores de actividad vasodilatadora, antihipertensiva, broquiodilatadora, antifertilidad y antisecreción. Las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos No. US 2001/0041729, publicada el 15 de noviembre de 2001 y US 2001/0047105, publicada el 29 de noviembre de 2001 describen procedimientos de tratamiento con compuestos de fórmula en la que las variables se definen tal como se describe en dicho documento. Los procedimientos de tratamiento descritos en la solicitud US 2001/0041729 incluyen el tratamiento de insuficiencia o disfunción renal aguda o crónica, o una afección provocada por la misma, tal como hipertensión, insuficiencia cardíaca congestiva, glomerulonefritis, uremia o insuficiencia renal crónica. Los procedimientos de tratamiento descritos en el documento US 2001/0047105 incluyen el tratamiento de afecciones que se presentan con baja masa ósea, de forma particular osteoporosis, fragilidad, una fractura osteoporótica, un defecto óseo, pérdida ósea idiopática en la infancia, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea mandibular, fractura ósea asociada con periodontitis o encarnamiento protésico. La solicitud de patente de Estados Unidos No. 09/990,556 que se presentó el 21 de noviembre de 2001 describe compuestos de fórmula en la que las variables son como se definen en dicho documento. Los compuestos son útiles para el tratamiento de afecciones que se presentan con poca masa ósea, tales como osteoporosis, fragilidad osteoporótica, un defecto óseo, pérdida ósea idiopática en la infancia, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea mandibular, fractura ósea, osteotomía, pérdida ósea asociada con periodontitis o encarnamiento protésico o disfunción renal. La patente de Estados Unidos No. 3,932,389 proporciona 2-descarboxi-2-(tetrazol-5-i!)- 1 -desoxi-15-sustituido-o pentanorprostaglandinas con actividad vasodilatadora, actividad antihipertensiva, actividad bronquiodilatadora, actividad antifertilidad y actividad antiulcerosa, La solicitud de patente europea EP 1 1 14816 describe derivados de fenilprostaglandinas E ?-sustituidas útiles para el tratamiento de enfermedades inmunes, asma, formación ósea anormal, muerte de neurocitos, pulmopatía, hepatopatía, trastornos del sueño y coagulaciones de las plaquetas etc. En las patentes de Estados Unidos No. 5,892,099 y 6,043,275 se describen ciertos derivados del ácido 3,7-diatiaprostanoico útiles para el tratamiento o prevención de enfermedades inmunológicas, asma, formación ósea anormal, muerte celular neuronal, lesión hepática, nefritis, hipertensión, isquemia de miocardio etc. La solicitud de patente Internacional PCT No. WO 99/02164 describe procedimientos y composiciones para el tratamiento de la impotencia o la disfunción eréctil empleando prostaglandinas que son agonistas del receptor prostanoide EP2 o EP4 selectivos.

Se han descrito en la patente de Estados Unidos No. 5,462,968 y 5,698,598 ciertos agonistas del receptor EP2, útiles como agentes para la disminución de la tensión intraocular. Se han descrito en la solicitud de patente internacional PCT No. WO 00/38667, publicada el 6 de julio de 2000, ciertos agonistas de prostaglandina E útiles para el tratamiento de glaucoma.

? BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona procedimientos para el tratamiento de la insuficiencia hepática, pérdida de permeabilidad del ductus arterioso, glaucoma o hipertensión ocular en un mamífero que comprende administrar al mencionado mamífero un agonista del receptor EP4 selectivo, un isómero del mismo, precursor farmacológico del mencionado agonista o isómero, o una sal farmacéuticamente aceptable del mencionado agonista, isómero o precursor farmacológico. Los agonistas del receptor EP4 selectivos útiles en los procedimientos de la presente invención son las 2-pirrolidonas ,5-disustituidas de fórmula I o las 2-descarboxi-2-(tetrazol-5-il)-11-desoxi-15- sustituido-co-pentanor-prostaglandinas de fórmula II. Los compuestos de 2- pirrolidona 1 ,5-disustituidos de fórmula I se pueden preparar tal como se describe en la patente de Estados Unidos No. 4,177,346 y en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US 2001/0047105, publicada el 29 de noviembre de 2001. En la patente de Estados Unidos No. 3,932,389 se describe la preparación de las 2-descarboxi-2-(tetrazol-5-il)-1 1-desoxi-15-sustituido-co-pentanor-prostaglandinas de fórmula II. Un grupo preferido de los agonistas del receptor EP4 selectivos para su uso en los procedimientos de la presente invención son compuestos de la fórmula I: precursores farmacológicos del mismo o sales farmacéuticamente aceptables de los mencionados compuestos o precursores farmacológicos, en las que: Q es COOR3, CONHR4 o tetrazol-5-ilo; A es un enlace simple o doble cis; B es un enlace simple o doble trans; =U es =0, H^"""OH , ??^'? , o ???? ; R2 es a-tienilo, fenilo, fenoxi, fenilo monosustituido o fenoxi monosustituido, seleccionándose los mencionados sustituyentes del grupo constituido por cloro, fluoro, fenilo, metoxi, trifluorometilo y alquilo (C1-C3); R3 es hidrógeno, alquilo (C1-C5), fenilo o p-bifenilo; R4 es COR5 o S02R5; y R5 es fenilo o alquilo (CrC5).

Un grupo preferido de agonistas del receptor EP4 selectivos de fórmula I son aquellos compuestos de fórmula I en la que Q es 5-tetrazolilo. Los compuestos preferidos de forma particular dentro de este grupo incluyen la 5-(3-hidroxi-4-fenil-but-1-enil)-1 -[6-(1 H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona y la 5-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-1-[6-(1 H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona. Otro grupo preferido de agonistas del receptor EP4 selectivos de fórmula I son aquellos compuestos de fórmula I en la que Q es COOH. Los compuestos particularmente preferidos dentro de este grupo incluyen el ácido 7-[2-(3-hidroxi-4-fenil-but-1-enil)-5-oxo-pirrol¡din-1 -il]-heptanoico y el ácido 7-[2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1 -il)-heptanoico. Otro grupo preferido de agonistas del receptor EP4 selectivos para su uso en los procedimientos de la presente invención son los compuestos de fórmula II: precursores farmacológicos de los mismos o sales farmacológicos de los mencionados compuestos o precursores farmacéuticos, en las que: Ar es a- o ß-tienilo, 5-fenil-a- o ß-tienilo, 5-alquilo inferior-a- o ß-tienilo, a- o ß-naftilo, tropilo, fenilo, 3,5-dimetilfenilo, 3,4-dimetoxifenilo, 3,4-metilendioxifenilo, 3,4-diclorofenilo o fenilo monosustituido en el que el mencionado sustituyente es bromo, cloro, fluoro, trifluorometilo, fenilo, alquilo inferior o alcoxi inferior; R es hidrógeno o metilo; W es un enlace simple o un enlace doble cis; Z es un enlace simple o un enlace doble trans; y =M y =N son cada uno independientemente =0, H^"""OH , ??^"""? , o ???? ; Otro grupo preferido de agonistas del receptor EP4 selectivos para su uso en los procedimientos de la presente invención son los compuestos de fórmula II, en la que =M y =N son cada uno =0. Otro grupo preferido de agonistas del receptor EP4 selectivos para su uso en los procedimientos de la presente invención son compuestos de fórmula II en la que =M es ?^' ' ? , o HO * H ; y =N es O. Otro grupo preferido de agonistas del receptor EP4 selectivos para su uso en los procedimientos de la presente invención son compuestos de fórmula II en la que =M es OH , o HO """"H ; y =N es H "OH , Aún otro grupo preferido de agonistas del receptor EP4 selectivos para su uso en los procedimientos de la presente invención son compuestos de fórmula II en la que =M es =0 y =N es H^"'""OH , DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los términos "tratar" o "tratamiento" tal como se usan en el presente documento incluyen el tratamiento preventivo (por ejemplo profiláctico), paliativo y curativo. El término "farmacéuticamente aceptable" significa que el portador, vehículo, diluyente, excipiente y/o sales deben ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación y no ser perjudiciales para el paciente. La expresión "precursor farmacológico" se refiere a un compuesto que es un precursor farmacológico que, tras la administración, libera el fármaco in vivo mediante algunos procesos químicos o fisiológicos (por ejemplo un precursor farmacológico tras alcanzar el pH fisiológico o mediante la acción enzimática se transforma en la forma de fármaco deseada). Los precursores farmacológicos típicos liberan tras la escisión los correspondientes compuestos fármacos La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales aniónicas no tóxicas que contienen aniones tales como, pero sin limitarse a éstos, cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, bisulfato, fosfato, acetato, maleato, fumarato, oxalato, lactato, tartrato, citrato, gluconato, metanosulfonato, y 4-toluensulfonato. La expresión también se refiere a sales catiónicas no tóxicas como, pero sin limitarse a, de sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio o benzatina protonada (?,?'-dibenciletilendiamina), colina, etanolamina, dietanolamina, etilendiamina, meglamina (N-metil-glucamina), benetamina (N-bencilfenetilamina), piperazina y trometamina (2-amino-2-hidroximetil-1 ,3-propanodiol). El término "agonista del receptor EP selectivo" tal como se usa en el presente documento es un compuesto de fórmula I o de fórmula II que presenta una afinidad de unión superior por el receptor EP4 que por los receptores EPi, EP2 y EP3. Un grupo preferido de agonistas del receptor EP4 selectivos son aquéllos compuestos de fórmulas I y II con una IC50 en el receptor EP1 , EP2 y EP3 al menos 10 veces mayor que la IC50 en el subtipo de receptor EP4. De acuerdo con lo anterior, los compuestos a emplear en los procedimientos de la presente invención se caracterizan por una alta selectividad o especificidad por el receptor EP4, en comparación con otros receptores de prostaglandina. Igualmente, la selectividad de receptor de los compuestos a emplear en los procedimientos de la presente invención da lugar a la disminución o eliminación de los efectos secundarios no deseados provocados por los agentes no selectivos.

Los procedimientos de la presente invención también incluyen el uso de compuestos marcados isotópicamente, los cuales son idénticos a aquéllos citados en la fórmula I o fórmula II, si no fuera por el hecho de que uno o más átomos están reemplazados por un átomo que presenta una masa atómica o un número másico diferente de la masa atómica o número másico que se encuentra normalmente en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos que se pueden incorporar a los compuestos de fórmula I o fórmula II incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y cloro, tales como 2H, 3H, 3C, 14C, 15N, 180, 170, 3 P, 32P, 35S, 18F y 36CI, respectivamente. Los procedimientos de tratamiento con compuestos de fórmula I o fórmula II, precursores farmacológicos de los mismos, y sales farmacéuticamente aceptable de los mismos, y sales farmacéuticamente aceptable de los mencionados compuestos y de los mencionados precursores farmacológicos, y mezclas de este reo i someros y diastereómeros de los mencionados compuestos, precursores farmacológicos y sales, que contienen los isótopos anteriormente mencionados y/o otros isótopos de otros átomos, están dentro del alcance de la presente invención. Son útiles en ensayos de distribución de fármaco y/o tejido substrato ciertos compuestos marcados isotópicamente de fórmula I o fórmula II, por ejemplo aquéllos en los que se incorporan isótopos radiactivos tales como 3H y 14C. Los isótopos tritiados, es decir, 3H, y el carbono 14, es decir 14C, son particularmente preferidos por su facilidad de preparación y detectabilidad. Además, la sustitución con isótopos más pesados tales como deuterio, es decir, 2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una estabilidad metabólica superior, por ejemplo mayor semivida in vivo o menores requerimientos de dosificación y, por ello, se pueden preferir en algunas circunstancias. Los compuestos marcados isotópicamente de fórmula I o de fórmula II y precursores farmacológicos de los mismos se pueden preparar, por lo general, llevando a cabo los procedimientos descritos en la patente de Estados Unidos No. 4,177,346, publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US 2001/0047105, publicada el 29 de noviembre de 2001 y en la patente de Estados Unidos No. 2,932,389, mediante la sustitución de un reactivo no marcado isotópicamente por un reactivo marcado isotópicamente fácilmente disponible. Los compuestos de fórmula I o de fórmula II empleados en los procedimientos de la presente invención presentan átomos de carbono asimétricos, y por lo tanto, son enantiómeros o diastereómeros. Las mezclas diastereoméricas se pueden separar en sus diastereómeros individuales sobre la base de sus diferencias fisicoquímicas por procedimientos conocidos per se, por ejemplo, por cromatografía y/o cristalización fraccionada. Los enantiómeros se pueden separar transformando la mezcla enantiomérica en una mezcla diastereomérica por reacción con un compuesto ópticamente activo adecuado (por ejemplo alcohol), separando los diastereómeros y transformado (por ejemplo hidrolizando) los diastereómeros individuales en los enantiómeros puros correspondientes. Los enantiómeros y diastereómeros de los compuestos de fórmula I o fórmula II pueden prepararse también mediante la utilización de materiales de partida enriquecidos enantioméricamente adecuados, o mediante reacciones asimétricas o diastereoselectivas para introducir los átomos de carbono asimétricos con la estereoquímica correcta. Todos estos isómeros, incluyendo los diastereómeros, enantiómeros y mezclas de los mismos, se consideran como compuestos de fórmula I o fórmula II y pueden emplearse en los procedimientos de la presente invención. Algunos de los compuestos de fórmula I o fórmula II son ácidos, y por lo tanto pueden formar una sal con un catión farmacéuticamente aceptable. Todas estas sales están dentro del alcance de los compuestos de fórmula I o fórmula II, y se pueden preparar por procedimientos convencionales. Por ejemplo, se puede preparar la sal poniendo en contacto simplemente las entidades ácidas y básicas, normalmente en una relación estequiométrica, bien en un medio acuoso, no acuoso o parcialmente acuoso, tal como sea apropiado. Las sales se recuperan bien por filtración, por precipitación con un no disolvente seguido de filtración, por evaporación del disolvente, o, en el caso de soluciones acuosas, mediante liofilización, tal como sea apropiado. Los antagonistas de receptor EP4 selectivos empleados en los procedimientos de la presente invención pueden adaptarse a uso terapéutico en animales, por ejemplo, mamíferos, y de forma particular humanos. La utilidad de los agonistas del receptor EP4 selectivos empleados en los procedimientos de la presente invención como agentes médicos en el tratamiento de la insuficiencia hepática, pérdida de permeabilidad del ductus arterioso, glaucoma o hipertensión ocular en animales, por ejemplo, mamíferos, en especial humanos, se demuestra mediante la actividad de estos agonistas en ensayos convencionales, incluyendo el ensayo de unión al receptor EPi, EP2, EP3, EP4, el ensayo de AMP cíclico, y se puede demostrar mediante la actividad en ensayos in vivo, incluyendo el modelo de insuficiencia hepática, todos los cuales se describen a continuación. Pueden emplearse modelos in vivo, tales como aquellos descritos en las patentes de E.U.A. No. 5,462,968 5,968,598, para demostrar el efecto hipotensivo ocular de los compuestos de las fórmulas I y II. Los mencionados ensayos también proporcionan un medio por el que las actividades de los agonistas del receptor EP4 selectivos pueden compararse unas con otras y con las actividades de otros compuestos y composiciones conocidas. Los resultados de estas comparaciones son útiles para la determinación de los niveles de dosificación en animales, por ejemplo mamíferos, incluyendo humanos, para el tratamiento de las mencionadas enfermedades. La administración de un agonista del receptor EP4 selectivo de acuerdo con los procedimientos de la presente invención pueden efectuarse mediante cualquier modo disponible que libere el agonista del receptor EP4 selectivo de forma sistémica y/o local (por ejemplo en el hígado, ductus arterioso u ojos). Estos procedimientos incluyen la vía oral, parenteral, intraduodenal etc. Por lo general, los compuestos de la presente invención se administran de forma oral, pero se puede utiliza administración parenteral (por ejemplo intravenosa, intramuscular, transdérmica, subcutánea, rectal o intramedular), por ejemplo, cuando la administración oral no sea adecuada para el objetivo o cuando el paciente sea incapaz de ingerir el fármaco. Los procedimientos de la presente invención se emplean para el tratamiento de la insuficiencia hepática, pérdida de permeabilidad del ductus arterioso, glaucoma o hipertensión ocular y se pueden llevar a cabo bien por aplicación sistémica o local (por ejemplo al ductus arterioso, hígado u ojos) de los agonistas del receptor EP4 selectivos. Los agonistas del receptor EP4 selectivos útiles en los procedimientos de la presente invención se aplican a lugares del ductus arterioso o del hígado, por ejemplo, bien por inyección del compuesto en un disolvente adecuado, o en casos de cirugía abierta, por aplicación local a los mismos de los compuestos en un vehículo, portador o diluyente adecuado. Para la administración al ojo, se pude emplear una preparación oftálmica tal como un gel, ungüento, solución o suspensión. En cualquier caso, la cantidad y la distribución temporal del compuesto administrado dependerá del paciente a tratar, de la gravedad de la afección, de la forma de administración y de la opinión del facultativo encargado. Por tanto, debido a la variabilidad de un paciente a otro, las dosificaciones dadas en el presente documento son una directriz y el facultativo puede graduar las dosis de compuesto farmacológico para conseguir el tratamiento (por ejemplo tratar la insuficiencia hepática, pérdida de permeabilidad del ductus arterioso, glaucoma o hipertensión ocular) en la forma que el facultativo considere adecuada para el paciente. Considerando el grado de tratamiento deseado, el facultativo debe sopesar diversos factores tales como la edad del paciente, peso corporal del paciente, síntomas, presencia de enfermedades preexistentes, efecto terapéutico deseado, la vía de administración y la duración del tratamiento etc. En un humano adulto, las dosis por persona y dosis generalmente de 1 µ9 a 100 mg por administración oral, de una vez a varias veces al día, y de 0.1 µ9 a 10 mg, por administración parenteral (preferiblemente de forma intravenosa) de una vez a varias veces al día, o por administración continua de 1 a 24 horas por día mediante infusión intravenosa. Para el tratamiento de recién nacidos la dosificación tendrá que ajustarse conforme a este hecho debido a la poca edad y al bajo peso corporal del paciente. En general, en los procedimientos de la presente invención se emplea una cantidad de agonista del receptor EP4 selectivo (compuesto de fórmulas I y II) de modo que sea suficiente para tratar la insuficiencia hepática, la pérdida de permeabilidad del ductus arterioso, glaucoma o hipertensión ocular. Ya que las dosis de administrar dependen de varias condiciones, hay casos en los que se pueden emplear dosis inferiores o superiores a las de los intervalos especificados anteriormente. Los compuestos agonistas del receptor EP4 selectivos empleados en los procedimientos de la presente invención se administran por lo general en forma de una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los compuestos de la presente invención junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Por tanto, el compuesto agonista del receptor EP4 selectivo se puede administrar de forma individual de cualquier forma convencional, tal como formas de dosificación oral, intranasal, parenteral, rectal o transdérmica. Para la administración oral la composición farmacéutica puede tomar la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pildoras, cápsulas, polvos y similares. Se emplean comprimidos que contienen diversos excipientes tales como citrato de sodio, carbonato de calcio y fosfato de calcio junto con distintos disgregantes tales como almidón, preferiblemente almidón de patata o de tapioca, y ciertos silicatos complejados, junto con agentes ligantes tales como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y goma arábiga. De forma adicional son frecuentemente muy útiles los agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco para la formación de comprimidos. Se pueden emplear también composiciones sólidas de tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina blanda o dura rellenas; los materiales preferidos a este respecto también incluyen lactosa o azúcar de la leche así como también polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se desean para la administración oral suspensiones y/o elixires acuosos, se pueden combinar composiciones de la presente invención con diferentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes, agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión, así como también diluyentes como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y distintas combinaciones similares de los mismos. Los compuestos se pueden administrar también de forma oral en solución sólida con lípidos tales como acetato de colesterol. La inclusión de lípidos en la formulación aumenta de forma notable la absorción del compuesto o análogo. La preparación de las mencionadas formulaciones se describe con detalle en la patente de los Estados Unidos No. 3,828,106 de Rudel. Para los propósitos de administración parenteral, se pueden emplear soluciones en aceite de sésamo o de cacahuete o en propilenglicol acuosos, así como también soluciones acuosas estériles de las sales solubles en agua correspondientes. Las mencionadas soluciones acuosas pueden tamponarse de forma adecuada si fuese necesario, y se hace en primer lugar el diluyente líquido ¡sotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas son especialmente adecuadas para los propósitos de inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles empleados se obtienen también fácilmente mediante técnicas convencionales bien conocidas por los especialistas en la técnica. Las composiciones a administrar de forma intravenosa o por inyección se pueden preparar como soluciones de los compuestos en, por ejemplo, una solución acuosa isotónica, una solución alcohólica, una solución salina en etanol o una solución en etanol-dextrosa. El etanol se puede añadir a la solución para incrementar la solubilidad y se pueden incluir otros aditivos tales como metilparabeno u otros ingredientes tales como cargas, colorantes, aromatizantes, diluyentes y similares. La composición se puede administrar también como una suspensión del compuesto o análogo en un medio acuoso 0 no acuoso. Entre las formulaciones preferidas para la administración intravenosa o por inyección están los complejos del ingrediente activo con -ciclodextrina. La preparación de complejos de compuestos y análogos con clatratos de a-ciclodextrina se describen detalladamente en la patente de los Estados Unidos No. 4,054,736 de Hayashi y col. Son especialmente preferidos los complejos en los que la relación de a-ciclodextrina a compuesto de la presente invención es de 97:3. Para los propósitos de administración transdérmica (por ejemplo, tópica), se preparan soluciones acuosas o parcialmente acuosas estériles diluidas (normalmente de aproximadamente un 0.1 % a un 5% de concentración), por lo demás similares a las soluciones parenterales anteriores. Para los propósitos de administración oftálmica, se prefiere por lo general una solución acuosa del compuesto de fórmula I ó fórmula II (el intervalo de concentración típica es de 0.001 a aproximadamente un 1 % en peso/volumen). La solución acuosa se puede administrar luego mediante instilación de gotas de la solución a los ojos del paciente (normalmente de 1 a 2 gotas administradas de 1 a 4 veces al día). Para los compuestos de fórmula 1 ó fórmula II con menor solubilidad en agua se puede preferir una suspensión acuosa. Se pueden emplear otras composiciones oftálmicas conocidas en la técnica, tales como geles viscosos o semiviscosos, u otros tipos de composiciones sólidas o semisólidas que contengan compuestos de fórmula I ó fórmula II. Las composiciones oftálmicas pueden contener también un conservante tal como cloruro de benzalconio, clorobutanol, edetáto de disodio, alcohol feniletílico, acetato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, metilparabeno, propilparabeno, poliquaternium-1 , ácido sórbico, timerosal u otros conservantes conocidos (el intervalo de concentración típica del conservante es de un 0.001 a un 1.0% en peso/volumen). Se puede emplear un agente tensioactivo, tal como Tween 80, en la composición oftálmica. Se pueden emplear para la composición oftálmica diferentes vehículos, tales como alcohol polivinílico, povidona, hidroxipropilmetilcelulosa, poloxámeros, carboximetilcelulosa, ciclodextrina hidroxietilcelulosa y agua. La tonicidad de la composición oftálmica se puede ajusfar empleando un ajustador de la tonocidad tal como cloruro de sodio, cloruro de potasio, manitol o glicerina. La composición oftálmica puede tamponarse, preferiblemente a un intervalo de 4.5 a 8.0, empleando tampones, tales como tampones de acetato, tampones de citrato, tampones de fosfato y tampones de borato. El pH de la composición oftálmica se puede ajustar, preferiblemente a un intervalo entre 4.5 y 8.0 empleando un ácido o base adecuado. Los antioxidantes, tales como el metabisulfito de sodio, el tiosulfato de sodio, la acetilcisteína, el Hidroxianisol butilado y el Hidroxitolueno butilado pueden también emplearse en la composición oftálmica.

Se conocen procedimientos de preparación de diferentes composiciones farmacéuticas con una cierta cantidad de ingrediente activo, o bien se harán evidentes a la luz de la presente descripción para los especialistas en la técnica. Para ejemplos de procedimientos de preparación de composiciones farmacéuticas véase Reminqton: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso T. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19a edición (1995). Por tanto, tal como se describe anteriormente, los compuestos de la presente invención se pueden administrar a los pacientes en cualquiera de las formulaciones o modos de administración conocidos. La terapia de combinación se puede emplear también en los procedimientos de la presente invención para el tratamiento del glaucoma o la hipertensión ocular, los agonistas del receptor EP4 selectivos de fórmula I ó fórmula II se pueden combinar con otros medicamentos conocidos por ser útiles para el tratamiento del glaucoma (agentes anti-galucoma), tales como los agentes de bloqueo ß-adrenérgicos, los inhibidores de anhidrasa carbónica, mióticos y simpatomiméticos. Por ejemplo, se puede combinar agentes ß-adrenérgicos, tales como betaxolol, incluyendo su sal clorhidrato, y timolol, incluyendo su sal maleato, con los agonistas del receptor EP4 selectivos de fórmula I ó fórmula II. Algunos ejemplos de inhibidores de anhidrasa carbónica específicos que se pueden emplear en combinación con los agonistas del receptor EP4 selectivos de fórmula I ó fórmula II incluyen brinzolamida, diclorofenamida y dorzolamida, incluyendo su sal clorhidrato. Se pueden emplear también mióticos, tales como el bromuro de demecario en combinación con los agonistas del receptor EP4 selectivos de fórmula I o fórmula II. Se pueden emplear en combinación con los agonistas del receptor EP4 selectivos de fórmula I o fórmula II los simpatomiméticos, tales como brimonidina, incluyendo su sal tartrato, feniramina, incluyendo su sal maleato y fenilefrina, incluyendo su sal clorhidrato. De forma ventajosa, la presente invención también proporciona kits para el uso por un consumidor para tratar la insuficiencia hepática, la pérdida de permeabilidad del ductus arterioso, glaucoma o hipertensión ocular. Los kits comprenden a) una composición farmacéutica que comprende un agonista del receptor EP4 selectivo (compuesto de fórmula I ó II); b) instrucciones que describen los procedimientos de uso de las composiciones farmacéuticas para tratar la insuficiencia hepática, la pérdida de permeabilidad del ductus arterioso, glaucoma o hipertensión ocular; y c) un recipiente. Para los procedimientos de tratamiento del glaucoma o hipertensión ocular el kit puede contener también un agente anti-glaucoma tal como se describió anteriormente. Un "kit" tal como se usa en la presente solicitud incluye un recipiente para contener las composiciones farmacéuticas y puede incluir también recipientes divididos tales como una botella o un envase de lámina metalizada dividido. El recipiente puede ser de cualquier forma convencional tal como se conocen en la técnica, hecho de un material farmacéuticamente aceptable, por ejemplo una caja de papel o cartón, una botella o frasco de vidrio o plástico, una bolsa con autocierre (por ejemplo para alojar una "reserva" de comprimidos para colocar en un recipiente distinto), o un envase blíster con dosis individuales para extraer por presión del envase de acuerdo con el programa terapéutico. El recipiente empleado puede depender de la forma de dosificación exacta involucrada, por ejemplo una caja de cartón convencional no se emplearía por lo general para alojar una suspensión líquida. Es factible que más de uno de los recipientes se puedan emplear juntos en un envase único para comercializar una forma de dosificación única. Por ejemplo, los comprimidos pueden estar contenidos en una botella, la cual está contenida a su vez dentro de una caja. Un ejemplo del mencionado kit es el denominado envase blíster.

Los envases blíster son bien conocidos en la industria del envasado y se emplean ampliamente para el envase de formas de dosificación unitarias farmacéuticas (comprimidos, cápsulas y similares). Los envases blíster consisten por lo general en una lámina de material relativamente duro cubierta con una lámina de un material plástico de preferiblemente transparente. Durante el proceso de envasado, se forman alvéolos en la lámina de plástico. Los alvéolos presentan el tamaño y la forma de los comprimidos o cápsulas individuales a envasar o pueden presentar el tamaño y forma para acomodar múltiples comprimidos y/o cápsulas a envasar. A continuación, los comprimidos o cápsulas se colocan en los alvéolos de acuerdo con lo anterior y se sella la lámina de material relativamente duro contra la lámina de plástico en el lado de la lámina opuesto a la dirección en la que se formaron los alvéolos. Como resultado, los comprimidos o cápsulas se sellan de forma individual o colectiva, tal como se desee, en los alvéolos entre la lámina de plástico y la lámina. Preferiblemente, la resistencia de la lámina es tal que los comprimidos o cápsulas se pueden extraer del envase blister de forma manual, aplicando presión sobre el alvéolo con lo que se forma una abertura en la lámina en el lugar del alvéolo. El comprimido o cápsula se puede extraer luego por la mencionada abertura. Puede ser deseable el proporcionar un recordatorio escrito, siendo el recordatorio escrito del tipo que contiene información y/o instrucciones para el facultativo, farmacéutico u otro profesional de la salud, o paciente, por ejemplo, en forma de números cercanos a los comprimidos o cápsulas correspondientes los números con los días de la pauta con la que se deben ingerir los comprimidos o cápsulas así especificados o una tarjeta que contenga el mismo tipo de información. Otro ejemplo del mencionado recordatorio es un calendario impreso en la tarjeta, por ejemplo, como sigue "primera semana, lunes, martes",... etc. ... "segunda semana, lunes, martes...", etc. Otras variantes del recordatorio serán fácilmente evidentes. Una "dosis diaria" puede ser un comprimido o cápsula única o varios comprimidos o cápsulas a tomar en un día dado. Otra modalidad específica de un kit es un dispensador diseñado para dispensar las dosis diarias de una por vez. Preferiblemente, el dispensador está equipado con un recordatorio, de modo que facilite adicionalmente el cumplimiento del régimen. Un ejemplo del mencionado recordatorio es un contador mecánico que indique el número de dosis diarias que han sido dispensadas. Otro ejemplo del mencionado recordatorio es una memoria de microprocesador accionado con batería acoplada con un lector externo de cristal líquido, o una señal de recuerdo sonora que, por ejemplo, lea la fecha en la que se ha tomado la última dosis diaria y/o la recuerde a uno cuando se debe tomar la próxima dosis. Los documentos citados en el presente documento, incluyendo cualquier patente o solicitud de patente, se incorporan al presente documento como referencias.

Sección experimental Ensayos in vitro Los compuestos de fórmula I o II, que son útiles en los procedimientos de la presente invención, se unen al receptor tipo 4 (receptor EP4) de la prostaglandina E2. La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EPi humano se prepara de acuerdo con el procedimiento de Funk y col., Journal of Biological Chemistry, 1993, 268, 26767 a 26772. El receptor EP2 de rata de secuencia completa se prepara de acuerdo con el procedimiento de Nemoto y col., Prostaglandins and other Lipid Mediators, 1997, 54, 713 a 725. La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP3 humano se prepara de acuerdo con el procedimiento de Regan y col., British Journal of Pharmacology, 1994, 1 12, 377 a 385. La secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP4 de rata se prepara de acuerdo con el procedimiento de Sando y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1984, 200, 1329 a 1333. Estos receptores de longitud completa se emplean para prepara células 293S que expresan los receptores EPi humano, EP2 de rata, EP3 humano o EP4 de rata.

Ensayo de unión al receptor EPi humano, EP? de rata, EP3 humano, EP de rata Los receptores de longitud completa descritos anteriormente se emplean para preparar células 293S que expresan los receptores EPi, EP2, EP3 y EP4. Las células 293S que expresan cada uno de los receptores EP humano, EP2 de rata, EP3 humano o EP4 de rata de la prostaglandina E2, se generan de acuerdo con los procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica. Típicamente se preparan cebadores PCR (reacción en cadena con polimerasa) correspondientes a los extremos 5' y 3' del receptor de longitud completa publicado, de acuerdo con los procedimientos bien conocidos descritos anteriormente, y se emplean en una reacción RT-PCR (reacción en cadena con polimerasa transcriptasa inversa) empleando el ARN total de riñon humano (para el EP-i), riñon de rata (para el EP2), pulmón humano (para el EP3) o riñon de rata (para el EP4) como fuente. Se clonan los productos de la PCR por el procedimiento de extremo protuberante TA en pCR2.1 (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA) y se confirma la identidad del receptor clonado mediante secuenciación de ADN. Para la expresión del receptor EP2 de rata, se subclona el cADN confirmado en el vector de expresión PURpCI de mamífero, un vector generado por subclonación del marcador genético para impartir resistencia a la puromicina en el vector de expresión pCI de mamífero (Promega, Madison, Wl). Se transfectan células 293S con cada uno de los receptores EPi o EP3 humanos en pcADN3 por electroporación. Las líneas celulares estables que expresan el receptor EP1 o EP3 humanos se establecen tras la selección de las células transfectadas con G418. Se transfectan células 293S con el receptor EP2 de rata clonado en PURpCi por transfección mediada por lípidos. Las líneas celulares estables que expresan el receptor EP2 de rata se establecen tras la selección de las células transfectadas con puromicina. Se transfectan las células 293S con el receptor EP4 de rata clonado en pcADN3 por transinfección mediada por lípidos. Se establecen líneas celulares estables que expresan el receptor EP4 de rata tras la selección de células transfectadas con Geneticin® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las líneas celulares clónales que expresan el número máximo de receptores se eligen tras un ensayo de unión a 3H-PGE2 de células totales empleando PGE2 no marcado como competidor.

Preparación de la membrana: Todas las operaciones se llevan a cabo a 4°C. Se recogen las células transfectadas que expresan receptores de prostaglandinas E2 de tipo 1 , tipo 2, tipo 3 o tipo 4 (EPi , EP2, EP3, EP4, respectivamente) y se suspenden a dos millones de células por mi en tampón A [tris-HCI 50 nM (pH 7.4), MgCI2 10 mM, EDTA 1 mM, péptido Pefabloc 1 mM (Boehringer Mannheim Corp., Indianápolis, IN), péptido Phosporamidon 10 µ? (Sigma, St. Louis, MO), péptido pepstatina A 1 µ? (Sigma, St. Louis, MO), péptido elastatinal 10 µ? (Sigma, St. Louis, MO), péptido antidolor 100 µ? (Sigma, St. Louis, MO)]. Se alisan las células mediante ultrasonidos con un dispositivo de ultrasonidos Branson (Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) en dos intervalos de quince segundos. Se retiran las células no lisadas y el residuo mediante centrifugación a 100 x g durante 10 minutos. Se recogen luego las membranas mediante centrifugación a 45,000 x g durante 30 minutos. Las membranas sedimentadas se suspenden de nuevo a 3 - 10 mg de proteína por mi, determinándose la concentración de proteína por el procedimiento de Bradford [Bradford M., Anal. Biochem. 1976, 72, 248]. Las membranas resuspendidas se almacenan luego congeladas a -80°C hasta su uso.

Ensayo de unión: Las membranas congeladas preparadas tal como se establece anteriormente se descongelan y diluyen hasta 1 mg de proteína por mi en el tampón A anterior. Se combinan 00 µ? de la preparación de membrana celular con 5 µ? de una solución del compuesto de ensayo de fórmula I o II (diluido en DMSO a una concentración de 40 veces la concentración final deseada) y con 95 µ? de 3H-prostaglandina E2 3 nM (Amersham, Arlington Heights, IL) en el tampón A. Se incuba la mezcla (200 µ? de volumen total) durante una hora a 25°C. Las membranas se recuperan luego por filtración a través de filtros de fibra de vidrio del tipo GF/C (Wallac, Gaithersburg, MD) empleando un recolector Tomtec (Tomtec, Orange, CT). Las membranas con 3H-prostaglandina E2 unida quedan atrapadas por el filtro, mientras que el tampón y la 3H-prostaglandina E2 no unida pasa a través del filtro al residuo. Cada muestra se lava luego tres veces con 3 mi de [tris-HCI 50 nM (pH 7.4), MgCI2 10 mM, EDTA 1 mM]. Los filtros se secan luego mediante calentamiento en un horno de microondas. Para determinar la cantidad de 3H-prostaglandina unida a las membranas, se colocan los filtros secos en bolsas de plástico con fluido de centelleo y se someten a recuento en un lector LKB 1205 Betaplate (Wallac, Gaithersburg, MD). Se determinan los IC50 a partir de la concentración del compuesto de ensayo requerida para desplazar un 50% de la 3H-prostaglandina E2 unida de forma específica.

Determinación de la elevación del AMP cíclico en el ensayo de receptores EP4 de rata recombinantes que sobreexpresan de forma estable las líneas de células 293S Se genera el cADN que representa la fase abierta de lectura completa del receptor EP de rata mediante reacción en cadena de polimerasa transcripta inversa empleando cebadores de oligonucleótidos basados en secuencias publicadas. Se prepara la secuencia de codificación de longitud completa para el receptor EP4 de rata de acuerdo con el procedimiento de Sando y col, Biochem, Biophys. Res. Comm. 1994, 200, 1329 a 1333, y ARN a partir de riñon de rata (EP4) como molde. Las células 293S se transfectan con el receptor EP4 de rata clonado en pcADN3 mediante transfección mediada por lípidos. Se establecen las líneas celulares estables que expresan el receptor EP4 de rata tras la selección de células transfectadas con Geneticin® (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Se eligen líneas de células clónales que expresan el número máximo de receptores tras un ensayo de unión de 3H-PGE2 de células total empleando PGE2 no marcada como competidor. Los transfectantes que muestren altos niveles de unión específica a 3[H]-PGE2 se caracterizan adicionalmente por análisis Scatchard para determinar Bmax y Kds para la PGE2. Las líneas seleccionadas para la evaluación del compuesto tienen aproximadamente 256,400 receptores por célula y una Kd = 2.9 nm, para la PGE2 (EP4). La expresión constitutiva del receptor en las células 293-S parentales es despreciable. Se cultiva una línea celular estable que contiene el receptor EP4 de rata en un medio Tagle modificado por Dulbecco/ F12 (DMEM/F12) que contiene un 10% de suero bovino fetal y G418 (500 pg/ml) hasta en un 80% de confluencia. Se determinan las respuestas a cA P en las líneas 293-S/EP por separación de las células de los matraces de cultivo en 1 mi de solución salina tamponada con fosfato (PBS) deficiente en calcio (Ca++) y magnesio (Mg++) mediante agitación vigorosa y luego lavando células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) deficiente en calcio (Ca++) y magnesio (Mg++). Se suspenden las células nuevamente en MEM (medio esencial mínimo), BSA (albúmina de suero bovino) al 1 %, HEPES 50 mM (ácido N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[2-etanosulfónico)] a 37°C. Se somete a recuento la suspensión de células en un hemacitómetro y se diluye mediante la adición de E (medio esencial mínimo) a una concentración final de 1 x 106 células/ml, y mediante adición de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) a una concentración final de 1 mM. Inmediatamente se añaden alícuotas de 200 microlitros de suspensión de células a tubos individuales y se incuban durante 10 minutos, sin cubrir, a 37°C, con CO2 al 5% y un 95% de humedad relativa. El compuesto de fórmula I o II a ensayar, bien en dimetilsulfóxido (DMSO) o en etanol, se añade luego a las células a diluciones de 1 :100 de forma que la concentración de DMSO o etanol final sea de un 1 %. De forma típica, las células se tratan con 6-8 concentraciones diferentes (en incrementos de un log, tales como aquéllos descritos a continuación) de los compuestos de fórmula I o II. Las concentraciones típicas del compuesto de fórmula I o II en este ensayo están entre 10~5 M y 10"10 M. Por ejemplo el ensayo de respuesta a dosis de compuesto de seis puntos prueba el compuesto de fórmula I o II á concentraciones de 10-5 M, 10~6 M, 10"7 M, 10~8 M, 10"9 M y 10~10 M. Inmediatamente tras la adición del compuesto de ensayo, se cubren los tubos, se mezcla invirtiendo dos veces, y se incuba a 37°C durante 12 minutos. Se lisan las muestras luego por incubación a 100°C durante 10 minutos y se enfrían inmediatamente en hielo durante 5 minutos hasta aproximadamente 4°C. El residuo celular se sedimenta por centrifugación a 3500 x g durante 5 minutos a aproximadamente 4°C, y se transfieren los lisados aclarados a tubos limpios. Las concentraciones de AMPc se determinan empleando un kit de radioinmunoensayo (RIA) de AMPc-1251 (NEK-033, Perkin-Elmer Life Sciences, Inc., Boston, MA). Se diluyen los lisados aclarados a 1 :100 en tampón de ensayo de RIA de APMc (incluido en el kit) y se centrifuga de nuevo. Se transfieren 50 microlitros del sobrenadante resultante a un tubo de vidrio de 12 x 75 mm y se recogen los datos por recuento de centelleo empleando un contador Wallac Cobra II Gama (Perkin-Elmer Wallac, Inc., Gaithersburg, MD). Los cálculos de EC50 se llevan a cabo en un ordenador empleando análisis de regresión lineal en la parte lineal de las curvas de respuesta a la dosis o empleando un Data Fitter.

Ensayos in vivo Los agonistas del receptor EP4 selectivos de fórmula I o fórmula II se pueden evaluar en distintos modelos de insuficiencia hepática in vivo conocidos en la técnica, tales como un modelo de insuficiencia hepática de rata in vivo (Kazuhiro, Kasal y col., Gastroenterology 2001 , 120 (Suppl. 1 ), A-541 ).

Modelo de daño hepático agudo in vivo Procedimientos: La insuficiencia hepática aguda en ratas puede inducirse por inyección intraperitoneal de uno de tetracloruro de carbono (CCI4, 1 mg/kg), dimetilnitrosamina (DMN, 50 mg/kg), D-galactosamina (D-gal, 1 g/kg) o D-galactosamina con lipopolisacárido (LPS), (D-gal, 1 g/kg, LPS 100 µ?/kg). Inmediatamente tras la inyección intraperitoneal de tetracloruro de carbono, dimetilnitrosamina, D-galactosamina o D-galactosamina con lipopolisacárido, se administra el compuesto de ensayo de fórmula I o II o solución salina (como control). El compuesto de ensayo (un agonista del receptor EP4 selectivo de fórmula I o II) se puede administrar a diferentes dosis tales como 0.01 , 0.05, 0.1 ó 0.2 mg/kg. 24 horas después de la administración del compuesto de ensayo de fórmula I o I I, se puede extraer el hígado para el estudio histológico y se puede obtener suero para la determinación de la bilirrubina total, aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT). Se observa necrosis hepática masiva con elevaciones marcadas en los niveles de T-bil, AST y ALT en el grupo de control tratado con solución salina. La efectividad del compuesto de ensayo en los modelos anteriores se puede determinar por comparación de los resultados de histología y suero obtenidos con los animales tratados con el compuesto de ensayo con los resultados correspondientes del grupo de control tratado con solución salina.

EJEMPLOS Se pretende que los ejemplos presentados en el presente documento ilustren modalidades particulares de la invención, y no se pretende que limiten la memoria a las reivindicaciones en modo alguno.

EJEMPLOS 1 A 10 Se emplea el ensayo de unión al receptor EPi humano, EP2 de rata, EP3 humano, EP4 de rata in vitro y la determinación de la elevación del AMP cíclico en el ensayo de receptores EP4 de rata recombinantes de sobreexpresión estable de líneas de células 293S, descritos anteriormente, para evaluar los siguientes compuestos. Los compuestos empleados en los ejemplos 1 a 8 y 10 se prepararon tal como se describe en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos 2001/0047105, publicada el 29 de noviembre de 2001.

EJEMPLO 1 Se encuentra que el ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidro-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico, preparado de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1 en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos US 2001/0047105, presenta unos IC50s de 22 nm (EP4 de rata) y más de 3,200 nm (EP2 de rata, EP^ EP3 humanos) en el ensayo de unión, y un EC50 de 8.8 nm en el ensayo de elevación de AMPc (EP4 de rata).

EJEMPLO 2 Se encuentra que el ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico, preparado de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 2 en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos US 2001/0047105, presenta unos IC5o de 21 nm (EP de rata) y 2,760 nm (EP2 de rata) y mayores de 3,200 nm (EP-i, EP3 humanos) en el ensayo de unión, y EC50 de 13.2 nm en el ensayo de unión, y un EC50 de 13.2 nm en el ensayo de elevación de AMPc (EP4 de rata).

EJEMPLO 3 Se encuentra que la 5S-[4-(3-cloro-fenil})-3-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil-pirrolidin-2-ona, preparada de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 3 en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos US 2001/0047105, presenta unos IC50 de 38 nm (EP4 de rata), 2,370 nm (EP4 de rata) y más de 3,200 nm (EP-i, EP3 humanos) en el ensayo de unión, y un EC50 de 33.1 nm en el ensayo de elevación de AMPc (EP de rata).

EJEMPLO 4 Se encuentra que la 5S-[3R-h¡droxi-4-(3-tr¡fluorometil-fen¡l)-butil]-1 -[6-(2H-tetrazol-5-il)-hex¡l]-pirrolid¡n-2-ona, preparada de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 4 en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos US 2001/0047105, presenta unos IC5o de 33 nm (EP4 de rata) y mayores de 3,200 nm (EP4 de rata, EP-i, EP3 humanos) en el ensayo de unión, y un EC50 de 70.2 nm en el ensayo de elevación de AMPc (EP4 de rata).

EJEMPLO 5 Se encuentra que la 5-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona, preparada de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 5 en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos US 2001/0047105, presenta unos ICso de 508 nm (EP de rata) y mayores de 3,200 nm (EP2 de rata, EPi, EP3 humanos) en el ensayo de unión.

EJEMPLO 6 Se encuentra que la 5-(4-bifenil-3-il-3-hidroxi-butil)-1 -[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona, preparada de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 6 en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos US 2001/0047105, presenta unos IC50 de 508 nm (EP4 de rata) 3,050 nm (EP2 de rata) y mayores de 3,200 nm (EP-i , EP3 humanos) en el ensayo de unión, y un EC50 de 175 nm en el ensayo de elevación de A Pc (EP4 de rata).

EJEMPLO 7 Se encuentra que la 5-[4-(3-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona, preparada de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 7 en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos US 2001 /0047105, presenta unos IC50 de 96 nm (EP4 de rata) y mayores de 3,200 nm (EP2 de rata) en el ensayo de unión, y un EC50 de 200 nm en el ensayo de elevación de AMPc (EP de rata).

EJEMPLO 8 Se encuentra que la 5S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona, preparada de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 8 en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos US 2001/0047105, presenta unos IC50 de 28 nm (EP4 de rata) y mayor de 3,200 nm (EP2 de rata) en el ensayo de unión, y un EC50 de 24.6 nm en el ensayo de elevación de AMPc (EP4 de rata).

EJEMPLO 9 Se encuentra que el ácido 7-(2-(3-hidroxi-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1 -il)-heptanoico presenta unos IC5o de 54 nm (EP4 de rata) y mayores de 3,200 nm (EP2 de rata, EP^ EP3 humanos) en el ensayo de unión, y un EC50 de 32.5 nm en el ensayo de elevación de AMPc (EP4 de rata).

EJEMPLO 10 Se encuentra que el ácido 7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il)-heptanoico preparado de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 10 en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos US 2001/0047105, presenta unos IC50 de 536 nm (EP4 de rata) y mayor de 3,200 nm (EP2 de rata) en el ensayo de unión.

Claims (5)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 .- El uso de un compuesto de fórmula I: un precursor farmacológico o una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de precursor farmacológico en el que: Q es COOR3, CONHR4 o tetrazol-5-ilo; A es un enlace simple o doble cis; B es un enlace simple o doble trans; =U es =0, OH , HO^""'"H , o ???? ; R2 es oc-tienilo, fenilo, fenoxi, fenilo monosustituido o fenoxi moriosustituido, seleccionándose los mencionados sustituyentes del grupo constituido por cloro, fluoro, fenilo, metoxi, trifluorometilo y alquilo (CrC3); R3 es hidrógeno, alquilo (C1-C5), fenilo o p-bifenilo; R4 es COR5 o S02oR5; y R5 es fenilo o alquilo (Ci-C5), en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la insuficiencia hepática, pérdida de permeabilidad del ductus arterioso, glaucoma o hipertensión ocular en un paciente. 2 - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en el que Q es 5-tetrazolilo. 3 - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en el que el compuesto de fórmula I es la 5-(3-hidroxi-4-fenil-but-1-enil)-1-[6-(1 H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona, la 5-(3-hidroxi-4-fenil-butil-1 -[6-(1 H-tetrazol-5-il)-hexil-pirrolidin-2-ona, la 5S-[4-(3-cloro-fenil)-3-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona, la 5S-[4-(3-cloro-fenil)-3R-hidroxi-butil]-1-[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona, 5S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil-1 -[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona, la 5-[4-(4-fluoro-fenil)-3-hidroxi-butil]-1 -[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona, la 5-(4-bifenil-3-il-3-h¡droxi-butil)-1 -[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona o 5-[4-(3-fluoro-fenil)-3-hidroxí-butil]-1 -[6-(2H-tetrazol-5-il)-hexil]-pirrolidin-2-ona. 4.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en el que Q es COOH. 5.- El uso como se reclama en la reivindicación 4, en el que el compuesto de fórmula I es el ácido 7-(2-(3-hidrox¡-4-fenil-butil)-5-oxo-pirrolidin-1 -il)-heptanoico, el ácido 7-[2-(3-hidroxi-4-fenil-but-1 -enil)-5-oxo-pirrolidin-1 -il]-heptanoico, el ácido 7-{2S-[4-(3-cloro-fenil)-3-R-h¡droxi-butil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico, el ácido 7-{2S-[3R-hidroxi-4-(3-trifluorometil-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1 -il}-heptanoico o el ácido 7-{2S-[3-hidroxi-4-(3-fenoxi-fenil)-butil]-5-oxo-pirrolidin-1-il}-heptanoico. 6.- El uso de un compuesto de fórmula II: un precursor farmacológico del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable del mencionado compuesto o precursor farmacológico, en el que: Ar es a- o ß-tienilo, 5-fenil-a- o ß-tienilo, 5-alquilo inferior-a- o ß-tienilo, a- o ß-naftilo, tropilo, fenilo, 3,5-dimetilfenilo, 3,4-dimetoxifenilo, 3,4-metilendioxifenilo, 3,4-diclorofenilo o fenilo monosustituido en el que el mencionado sustituyente es bromo, cloro, fluoro, trifluorometilo, fenilo, alquilo inferior o alcoxi inferior; R es hidrógeno o metilo; W es un enlace simple o un enlace doble cis; Z es un enlace simple o un enlace doble trans; y =M y =N son cada uno independientemente =0, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la insuficiencia hepática, pérdida de permeabilidad del ductus arterioso, glaucoma o hipertensión ocular en un paciente. 7.- El uso como se reclama en la reivindicación 6, en el que =M y =N son cada uno =0. El uso como se reclama en la reivindicación 6, en el que H^"""OH , o HO *"""H ; y =N es =0. 9. - El uso como se reclama en la reivindicación 6, en el que =M es H OH , o HO *"""H ; y =N es ?^""?? , 10. - El uso como se reclama en la reivindicación 6, en el que =M es =0; y =N es """OH , 1 1. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en el que el medicamento es para el tratamiento de la insuficiencia hepática. 12. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en el que el medicamento es para el tratamiento de la pérdida de permeabilidad del ductus arterioso. 13. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en el que el medicamento es para el tratamiento de glaucoma o hipertensión ocular. 14. - El uso como se reclama en la reivindicación 6, en el que el medicamento es para el tratamiento de la insuficiencia hepática. 15. - El uso como se reclama en la reivindicación 6, en el que el medicamento es para el tratamiento de la pérdida de permeabilidad del ductus arterioso, glaucoma o hipertensión ocular.