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MXPA04006554A - Composiciones y metodos para diagnostico y tratamiento de tumor. - Google Patents

Composiciones y metodos para diagnostico y tratamiento de tumor.

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Publication number
MXPA04006554A
MXPA04006554A MXPA04006554A MXPA04006554A MXPA04006554A MX PA04006554 A MXPA04006554 A MX PA04006554A MX PA04006554 A MXPA04006554 A MX PA04006554A MX PA04006554 A MXPA04006554 A MX PA04006554A MX PA04006554 A MXPA04006554 A MX PA04006554A
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MX
Mexico
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antibody
seq
polypeptide
tat
nos
Prior art date
Application number
MXPA04006554A
Other languages
English (en)
Inventor
Phillips Heidi
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of MXPA04006554A publication Critical patent/MXPA04006554A/es

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Abstract

La presente invencion se dirige a composiciones de materia utiles para el diagnostico y tratamiento de tumores en mamiferos y a metodos para utilizar esas composiciones de materia para los mismos.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE TUMOR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a composiciones de materia útiles para el diagnóstico y tratamiento de tumor en mamíferos y a métodos para utilizar las composiciones de materia para los mismo. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa principal de muerte en los E.U.A., después de la enfermedad cardíaca (Boring y colaboradores, CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). El cáncer se caracteriza por el incremento en el número de células anormales, o neoplásticas, derivadas de un tejido normal que proliferan para formar una masa de tumor, la invasión de tejidos adyacentes por estas células de tumor neoplásticas, y la generación de células malignas que eventualmente se dispersan por la sangre o sistema linfático a nodos linfáticos regionales y a sitios distantes mediante un proceso denominado metástasis. En un estado canceroso, una célula prolifera bajo condiciones en donde las células normales no crecerían. El cáncer se manifiesta por sí mismo en una amplia variedad de formas, caracterizado por grados diferentes de invasión y agresividad.
En un intento por descubrir objetivos celulares efectivos para diagnóstico y terapia de cáncer, los investigadores han buscado identificar polipéptidos transmembrana u otros polipéptidos asociados con membrana que se expresan específicamente en la superficie de uno o más tipos particulares de células de cáncer en comparación con una o más células no cancerosas normales. A menudo, estos polipéptidos asociados a membrana son expresados de manera más abundante en la superficie de las células de cáncer en comparación con en la superficie de las células no cancerosas. La identificación de estos polipéptidos de antígeno en la superficie celular asociados con tumor ha dado lugar a la capacidad para hacer blanco específicamente en células de cáncer para destrucción mediante terapias basadas en anticuerpos. En este aspecto, se nota que la terapia basada en anticuerpos ha demostrado ser muy efectiva en el tratamiento de ciertos cánceres. Por ejemplo, HERCEPTIN® y RITUXA ® (ambas de Genentech Inc., South San Francisco, California) , son anticuerpos que se han utilizado exitosamente para tratar cáncer de mama y linfoma no-Hodgkin, respectivamente. De forma más específica, HERCEPTIN® es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que liga selectivamente al dominio extracelular del proto oncógeno receptor factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) . La sobre expresión de proteína HER2 se observa en 25 a 30% de los cánceres de mama primarios. RITUXAN® es un anticuerpo monoclonal humano/murino quimérico de ingeniería genética contra el antígeno CD20 que se encuentra en la superficie de linfocitos B normales y malignos. Ambos de estos anticuerpos se producen de manera recombinante en células CHO. En otros intentos por descubrir blancos u objetivos celulares efectivos para diagnóstico y terapia de cáncer, los investigadores han buscado identificar (1) polipéptidos no asociados a membrana que se produzcan específicamente por uno o más tipos particulares de células de cáncer en comparación por uno o más tipos particulares de células normales no cancerosas; (2) polipéptidos que se producen por células de cáncer a un nivel de expresión que es significativamente superior al de uno o más de las células no cancerosas normales; o (3) polipéptidos cuya expresión se limita específicamente sólo a un tipo sencillo (o un número muy limitado de diferentes) tipos de tejido, tanto en el estado canceroso como no canceroso (por ejemplo, tejido de tumor de próstata y próstata normal) . Estos polipéptidos pueden permanecer localizados intracelularmente o pueden ser secretados por la células de cáncer. Aún más, estos polipéptidos pueden ser expresados no por la propia célula de cáncer, sino más bien por las células que producen y/o secretan polipéptidos que tienen un efecto potenciador o mejorador de crecimiento en células de cáncer. Estos polipéptidos secretados a menudos son proteínas que proporcionan células de cáncer con una ventaja de crecimiento frente a células normales e incluyen cosas tales como, por ejemplo, factores angiogénicos , factores de adhesión celular, factores de crecimiento y semejantes. La identificación de antagonistas de estos polipéptidos no asociados con membrana se esperará que sirva como agentes terapéuticos efectos para el tratamiento de estos cánceres. Además, la identificación de patrón de expresión de estos polipéptidos será útil para el diagnóstico de cánceres particulares en mamíferos. A pesar de los avances anteriormente identificados en terapias de cáncer de mamíferos, hay una gran necesidad por agentes de diagnóstico y terapéuticos adicionales capaces de detectar la presencia de tumor en un mamífero e inhibir efectivamente el crecimiento celular neoplástico, respectivamente. De acuerdo con esto, un objetivo de la presente invención es identificar: (1) polipéptidos asociados con membrana celular que se expresan más abundantemente en uno o más tipos de células de cáncer en comparación con células normales o en otras células de cáncer diferentes; (2) polipéptidos no asociados con membrana que se producen específicamente por uno o más tipos particulares de células de cáncer (o por otras células que producen polipéptidos que tienen un efecto potenciador en el crecimiento de células de cáncer) en comparación con uno o más tipos particulares de células normales no cancerosas; (3) polipéptidos no asociados con membrana que se producen por células de cáncer a un nivel de expresión significativamente superior que aquel de uno o más células no cancerosas normales; o (4) polipéptidos cuya expresión se limita específicamente a un sólo tipo de tejido (o un número muy limitado de diferentes tipos de tejidos) tanto en estado canceroso como no canceroso (por ejemplo, tejido de próstata normal y tumor de próstata) , y a utilizar estos polipéptidos, y sus ácidos nucleicos de codificación, para producir composiciones de materia útiles en la detección de diagnóstico y tratamiento terapéutico de cáncer en mamíferos. También, un objetivo de la presente invención es identificar los polipéptidos secretados o los intracelulares asociados con membrana celular cuya expresión se limita a un solo o un número muy limitado de tejidos, y a utilizar estos polipéptidos, y sus ácidos nucleicos de codificación para producir composiciones de materia útiles en el tratamiento terapéutico y detección para diagnóstico de cáncer en mamíferos. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN 1. Modalidades En la presente especificación, los solicitantes describen por primera vez que la identificación de diversos polipéptidos celulares (y sus ácidos nucleicos de codificación o sus fragmentos) que se expresan en un mayor grado en la superficie de o por uno o más tipos de células de cáncer, en comparación en la superficie de o por uno o más tipos de células no cancerosas normales. En forma alterna, estos polipéptidos se expresan por células que producen y/o secretan polipéptidos que tienen un efecto potenciador o mej orador de crecimiento en células de cáncer. De nuevo en forma alterna, estos polipéptidos pueden no ser sobre -expresados por células de tumor en comparación con células normales del mismo tipo de tejido, sino más bien pueden ser expresados específicamente tanto por células de tumor como células normales de solo un tipo de tejido sencillo o un número muy limitado de tipos de tejido (de preferencia tejidos que no son esenciales para la vida, por ejemplo, próstata, etc.) . Todos los polipéptidos anteriores aquí se refieren como polipéptidos objetivo antigénicos asociados a tumor (polipéptidos "TAT"= Tumor-associated Antigenic Target) y se expresn para servir como blancos efectivos para terapia y diagnóstico de cáncer en mamíferos . De acuerdo con esto, en una modalidad en la presente invención, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipeptido objetivo antigénico asociado a tumor o su fragmento (un polipéptido "TAT"). En ciertos aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, en forma alterna cuando menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de ácido nucleico, para (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido TAT de longitud íntegra que tiene una secuencia de aminoácidos como aquí se describe, una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT que carece del péptido de señal, como aquí se describe, un dominio extracelular de un polipéptido TAT transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se describe aquí y cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos polipéptido TAT de longitud íntegra como se describe aquí o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) . En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene cuando menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, en forma alterna cuando menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de ácido nucleico, para (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia de codificación de un cADN polipéptido TAT de longitud íntegra como se describe aquí, la secuencia de codificación de un polipéptido TAT carece de péptido de señal como se describe aquí, la secuencia de codificación de un dominio extracelular de un polipéptido TAT transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se describe aquí o la secuencia de codificación de cualquier otro fragmento específicamente definido de la secuencia aminoácido polipéptido TAT de longitud íntegra como se describe aquí, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) . En aspectos adicionales, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene cuando menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, en forma alterna al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia de ácido nucleico para (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por la región de codificación de longitud íntegra de cualquiera de los cADNs de proteína humana depositados con la ATCC como se describe aquí, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) . Otro aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido TAT que ya es eliminado del dominio transmembrana o inactivado del dominio de transmembrana, o es complementario a esta secuencia de nucleótidos de codificación, en donde el o los dominios de transmembrana de estos polipeptidos aquí se describen. Por lo tanto, se contemplan dominios extracelulares solubles de los polipéptidos TAT aquí descritos. Sn otros aspectos, la presente invención se dirige a moléculas de ácido nucleico aisladas que hibridizan a (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido TAT que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud íntegra como aquí se describe, una secuencia de amino de polipéptido TAT que carece de péptido de señal como se describe aquí, un dominio extracelular de un polipeptido TAT de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se describe aquí o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT de longitud íntegra como se describe aquí, o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) . En este aspecto, una modalidad de la presente invención se dirige a fragmentos de una secuencia de codificación de polipéptido TAT de longitud íntegra, o su complemento, como se describe aquí, que puede encontrar uso, por ejemplo, para sondas de hibridización útiles por ejemplo como sondas de diagnóstico, sondas oligonucleótido antisentido o para codificar fragmentos de un polipéptido TAT de longitud íntegra que puede codificar en forma opcional un polipéptido que comprende un sitio de enlace para un anticuerpo polipéptido anti-TAT, Un oligopéptido de enlace TAT u otra molécula orgánica pequeña que liga a un polipéptido TAT. Estos fragmentos de ácido nucleico usualmente son cuando menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 , o 1000 nucleótidos de longitud, en donde en este contexto , el término "aproximadamente" significa la longitud de secuencia de nucleótidos de referencia más o menos 10% de esta longitud referida. Se nota que los fragmentos novedosos de una secuencia de nucleótidos que codifican polipéptido TAT pueden determinarse en una forma rutinaria al alinear la secuencia de nucleótidos que codifican polipéptido TAT con otras secuencias de nucleótidos conocidas utilizando cualquiera de una cantidad de programa de alineamiento de secuencia bien conocidos y determinar cuales fragmentos de secuencia de nucleótidos que codifica polipéptido TAT son novedosos. Todos estos fragmentos novedosos de secuencia de nucleótidos que codifican polipéptidos TAT se contemplan aquí. También se contemplan los fragmentos de polipéptidos TAT codificados por estos fragmentos de moléculas de nucleótido, de preferencia aquellos fragmentos de polipéptido TAT que comprenden un sitio de enlace para un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de enlace TAT u otra molécula orgánica pequeña que se liga a un polipéptido TAT. En otra modalidad, la invención proporciona polipéptidos TAT aislados codificados por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas previamente identificadas . En un cierto aspecto, la invención se refiere a un polipéptido TAT aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identidad de secuencia de aminoácidos, a un polipéptido TAT que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud íntegra como se describe aquí, una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT carece del péptido de señal como se describe aquí, un dominio extracelular de una proteína polipéptido TAT transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se describe aquí, una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aquí descritas o cualquier otro fragmento definido específicamente de una secuencia de aminoácidos polipéptido TAT de longitud íntegra como se describe aquí . En un aspecto adicional, la invención se refiere a un polipéptido TAT aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácido, en forma alterna cuando menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% identidad de secuencia de aminoácido, a una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los cADNs de proteína humana depositadas con ATCC como se describe aquí . En un aspecto específico, la invención proporciona un polipéptido TAT aislado sin la secuencia de señal N-terminal y/o sin la metionina de inicio y se codifica por la secuencia de nucleótidos que codifica en esta secuencia de aminoácidos como se describe previamente. También se describen aquí los procesos para producir los mismos, en donde estos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de codificación apropiada bajo condiciones adecuadas para expresar le polipéptido TAT y recuperar el polipéptido TAT del cultivo celular.
Otro aspecto de la invención proporciona un polipéptido TAT aislado que ya es eliminado del dominio de transmembrana o inactivado del dominio de transmembrana. También aquí se describen los procesos para producir los mismos, en donde estos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de codificación apropiada bajo condiciones adecuadas para expresión del polipéptido TAT y recuperar el polipéptido TAT del cultivo celular. En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos previamente descritos. También se proporcionan las células huésped que comprenden cualquiera de estos vectores. A manera de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células de E. coli, o células de levadura. Además se proporciona un proceso para producir cualquiera de los polipéptidos previamente descritos y comprenden cultivar células huésped bajo condiciones adecuadas para expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado del cultivo celular. En otras modalidades, la invención proporciona polipéptidos quiméricos aislados que comprenden cualquiera de los polipéptidos TAT previamente descritos fusionados a un polipéptido heterólogo (no-TAT) . Ejemplos de estas moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los polipéptidos TAT aquí descritos fusionados a un polipéptido heterólogo tal como, por ejemplo, una secuencia de epítope o una región Fe de una inmunoglobulina . En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo que liga, de preferencia específicamente, a cualquiera de los polipéptidos descritos con anterioridad o a continuación. En forma opcional, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo de cadena sencilla o anticuerpo que inhibe en forma competitiva el enlace de un anticuerpo polipéptido anti-TAT a su epítope antigénico respectivo. Anticuerpos de la presente invención puede conjugarse opcionalmente a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, una maitansinoide , una calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica, o semejantes. Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o células bacterianas y de preferencia inducen muerte de una célula a la cual se ligan. Para propósitos de diagnóstico, los anticuerpos de la presente invención pueden etiquetarse en forma detectable, conectados a un soporte sólido o semej antes . En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los anticuerpos aqui descritos. También se proporciona una célula huésped que comprende cualquiera de estos vectores. A manera de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células E. coli, o células de levadura. Además se proporciona un proceso para producir cualquiera de los anticuerpos previamente descritos, y comprende cultivar células huésped bajo condiciones adecuadas para expresión del anticuerpo deseado y recuperar el anticuerpo deseado del cultivo celular . En otra modalidad, la invención proporciona oligopéptidos (oligopéptidos de enlace "TAT") que ligan, de preferencia específicamente, cualquiera de los polipéptidos TAT descritos anteriormente o a continuación. En forma opcional, los oligopéptidos se liga al TAT de la presente invención puede conjugarse a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, una maitansinoide o una calicheamicina, un antibiótico, isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o semejante. Los oligopéptidos de enlace TAT de la presente invención pueden opcionalmente producirse en células CHO o células bacterianas y de preferencia inducen muerte de una célula a la cual se ligan. Para propósitos de diagnóstico, los oligopéptidos de enlace TAT de la presente invención pueden etiquetarse en forma detectable, conectarse en un soporte sólido o semejantes. En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los oligopéptidos de enlace TAT aquí descritos. También se proporcionan las células huésped que comprenden cualquiera de estos vectores. A manera de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células de E. coli, o células de levadura. Además se proporciona un proceso para producir cualquiera de los oligopéptidos de enlace TAT aquí descritos y comprende cultivar células huésped bajo condiciones adecuadas para expresión del oligopéptido deseado y recuperar el oligopéptido deseado del cultivo celular. En otra modalidad, la invención proporciona pequeñas moléculas orgánicas ("moléculas orgánicas de enlace TAT") que ligan, de preferencia específicamente, a cualquiera de los polipéptidos TAT descritos anteriormente o a continuación. En forma opcional, las moléculas orgánicas de enlace TAT de la presente invención pueden ser conjugadas a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide o calicheamicina , un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica , o semejantes. Las moléculas orgánicas de enlace TAT de la presente invención de preferencia inducen muerte de una célula a la cual se ligan. Para propósitos de diagnóstico, las moléculas orgánicas de enlace TAT de la presente invención pueden etiquetarse en forma detectable, conectarse a un soporte sólido o semejantes. En una modalidad aún más adicional, la invención se refiere a una composición de materia que comprenden un polipéptido TAt como se describe aquí, un polipéptido TAT quimérico como se describe aquí, un anticuerpo anti-TAT como se describe aquí, un oligopéptido de enlace TAT como se describe aquí, o una molécula orgánica de enlace TAT como se describe aquí, en combinación con un portador. Opcionalmente , el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Todavía en otra modalidad, la invención se refiere al artículo de manufactura que comprenden un recipiente y una composición de materia contenida en el recipiente, en donde la composición de materia puede comprender un polipéptido TAT como se describe aquí, un polipéptido TAT quimérico como se describe aquí, un anticuerpo anti-TAT como se describe aquí, un oligopéptido de enlace TAT como se describe aquí, o una molécula orgánica de enlace TAT como se describe aquí. El artículo además puede comprender opcionalmente una etiqueta fija al recipiente, o un inserto de empaque incluido en el recipiente, que se refiere al uso de la composición de materia para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un tumor. Otra modalidad de la presente invención se dirige al uso de un polipéptido TAT como se describe aquí, polipéptido TAT quimérico como se describe aquí, un anticuerpo polipéptido anti-TAT como se describe aquí, un oligopéptido de enlace TAT como se describe aquí, o una molécula orgánica de enlace TAT como se describe aquí, para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una condición que responde al polipéptido TAT, polipéptido TAT quimérico, anticuerpo polipéptido anti-TAT, oligopéptido de enlace TAT, o molécula orgánica de enlace TAT. 2. Modalidades Adicionales Otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa un polipéptido TAT, en donde el método comprende contactar la célula con un anticuerpo, un oligopéptido o molécula orgánica pequeña que liga al polipéptido TAT, y en donde el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica al polipéptido TAT provoca inhibición del crecimiento de la célula que expresa el polipéptido TAT. En modalidades preferidas, la célula es una célula de cáncer y el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica al polipéptido TAT, provoca la muerte de las células que expresan el polipéptido TAT. Opcionalmente , el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, o anticuerpo de una sola cadena. Anticuerpos, oligopéptidos de enlace TAT y moléculas orgánicas de enlace TAT empleados en los métodos de la presente invención, pueden conjugarse opcionalmente a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maitansinoide o calicheamicina , un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica, o semejante. Los anticuerpos y oligopéptidos de enlace TAT empleados en los métodos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o células bacterianas. Todavía en otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende células que expresan un polipéptido TAT, en donde el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, un oligopéptido o una molécula orgánica pequeña que liga al polipéptido TAT, de esta manera resultando en el tratamiento terapéutico efectivo del tumor. Opcionalmente , el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, o anticuerpo de cadena sencilla. Anticuerpos, oligopéptidos de enlace TAT y moléculas orgánicas de enlace TAT empleados en los métodos de la presente invención pueden conjugarse opcionalmente a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico, tal como una toxina, incluyendo por ejemplo, un maitansinoide o calicheamicina , un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica , o semejantes. Los anticuerpos y oligopéptidos empleados en los métodos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en las células CHO o células bacterianas. Todavía en otra modalidad, la presente invención se dirige a un método para determinar la presencia de un polipéptido TAT en una muestra que se sospecha contiene el polipéptido TAT, en donde el método comprende exponer la muestra a un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña que liga al polipéptido TAT y determina el enlace del anticuerpo. oligopéptido o molécula orgánica al polipéptido TAT en la muestra, en donde la presencia de este enlace es indicativa de la presencia del polipéptido TAT en la muestra. Opcionalmente , la muestra puede contener células (que pueden ser células de cáncer) que se sospecha expresan el polipéptido TAT. El anticuerpo, oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT empleados en el método pueden opcionalmente ser etiquetados en forma detectable, conectados a un soporte sólido o semejantes. Una modalidad adicional de la presente invención se dirige a un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, en donde el método comprende detectar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido TAT (a) en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero, y (b) en una muestra de control de células no cancerosas normales conocidas del mismo origen o tipo de tejido, en donde un nivel superior de expresión del polipéptido TAT en la muestra de prueba, en comparación con la muestra de control, es indicativo de la presencia de tumor en el mamífero del cual se obtiene la muestra de prueba. Otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, en donde el método comprende (a) contactar una muestra de prueba que comprende células de tejido obtenidas del mamífero con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña que liga a un polipéptido TAT y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña y el polipéptido TAT en la muestra de prueba, en donde la formación de un complejo es indicativa de la presencia de un tumor en el mamífero. Opcionalmente , el anticuerpo, oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT empleado de etiqueta en forma detectable, conecta a un soporte sólido, o semejantes y/o la muestra de prueba de la célula de tejido se obtiene de un individuo que se sospecha tiene un tumor canceroso . Todavía otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para tratar o evitar un desorden proliferativo celular asociado con expresión o actividad alteradas, de preferencia incrementadas de un polipéptido TAT, el método comprende administrar a un sujeto que requiere este tratamiento, una cantidad efectiva de un antagonista de un polipéptido TAT. De preferencia, el desorden proli erativo celular es cáncer y el antagonista del polipéptido TAT es un anticuerpo de polipéptido anti-TAT, oligopéptido de enlace TAT, molécula orgánica de enlace TAT u oligonucleótido antisentido. El tratamiento o prevención efectivo del desorden proliferativo celular puede ser el resultado de exterminio o directo o inhibición de crecimiento de las células que expresan un polipéptido TAT o al antagonizar la actividad de potenciación del crecimiento celular de un polipéptido TAT. Todavía otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para enlazar un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña a una célula que expresa un polipéptido TAT, en donde el método comprende contactar una célula que expresa un polipéptido TAT con el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña bajo condiciones que son adecuadas para enlazar el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña con el polipéptido TAT y permitir enlace entre ellos. Otras modalidades de la presente invención se dirigen al uso de (a) un polipéptido TAT, (b) un ácido nucleico que codifica un polipéptido TAT o un vector o células huésped que comprende un ácido nucleico, (c) un anticuerpo polipéptido anti-TAT, (d) un oligopéptido de enlace TAT, o (e) una molécula orgánica pequeña que enlaza TAT en la preparación de un medicamento útil para (i) el tratamiento terapéutico o detección para diagnóstico de un cáncer o tumor, o (ii) el tratamiento terapéutico o prevención de un desorden proliferativo celular . Otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para inhibir el crecimiento de una célula de cáncer, en donde el crecimiento de las células de cáncer cuando menos es parcialmente dependiente del o los efectos potenciadores de crecimiento de un polipéptido TAT (en donde el polipéptido TAT puede expresarse ya sea por la propia célula de cáncer misma o una célula que produce polipéptido (s) que tienen un efecto potenciador de crecimiento en las células de cáncer) , en donde el método comprende contactar el polipéptido TAT con un anticuerpo, un oligopéptido o una molécula orgánica pequeña que liga al polipéptido TAT, de esta manera antagonizando la actividad potenciadora de crecimiento del polipéptido TAT, y a su vez, inhibiendo el crecimiento de la célula de cáncer. De preferencia, el crecimiento de la célula de cáncer se inhibe completamente. Aún más preferible, el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pequeña al polipéptido TAT induce la muerte de la célula de cáncer. Opcionalmente , el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, o anticuerpo de cadena sencilla. Anticuerpos, oligopéptidos de enlace TAT y moléculas orgánicas de enlace TAT empleados en los métodos de la presente invención pueden conjugarse opcionalmente a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo por ejemplo, un maitansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolític , o semejante. Los anticuerpos y oligopéptidos de enlace TAT empleados en los métodos de la presente invención opcionalmente pueden producirse en células CHO o células bacterianas. Todavía otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento del tumor es al menos en parte dependiente del o los efectos potenciadores de crecimiento de un polipéptido TAT, en donde el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, un oligopéptido o una molécula orgánica pequeña que liga al polipéptido TAT, de esta manera antagonizando la actividad potenciadora de crecimiento del polipéptido TAT y resultando en el tratamiento efectivo terapéutico del tumor. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, o anticuerpo de cadena sencilla. Los anticuerpos, los oligopéptidos de enlace TAT y las moléculas orgánicas de enlace TAT empleados en los métodos de la presente invención pueden conjugarse opcionalmente a un agente inhibidor de crecimiento o agente citotóxico, tal como una toxina, incluyendo por ejemplo un maitansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica, o semejantes. Los anticuerpos y oligopéptidos empleados en los métodos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o células bacterianas. 3. Modalidades Adicionales En modalidades aún adicionales, la invención se dirige al siguiente conjunto de reivindicaciones potenciales para esta solicitud: 1. Ácido nucleico aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene cuando menos 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico a: (a) una molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95); (b) una molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (c) una molécula de ADN que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , con sus péptidos de señal asociados; (d) una molécula de ADN que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su péptido de señal asociado ,- (e) la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94) ; (f) la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94) ; o (g) el complemento de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) o (f ) . 2. ácido nucleico aislado que tiene: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95); (b) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su péptido de señal asociado; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (e) la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94) ; (f) la región de codificación de longitud íntegra la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90 , 91 O 94) ; O (g) el complemento de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) o (f ) . 3. Ácido nucleico aislado que hibridiza a: (a) un ácido nucleico que codifica la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95); (b) un ácido nucleico que codifica la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95, que carece de su péptido de señal asociado; (c) un ácido nucleico que codifica un dominio intracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95, con su péptido de señal asociado ; (d) un ácido nucleico que codifica un dominio intracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95, que carece de su péptido de señal asociado; (e) la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS-.1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94) ; (f) la región de codificación de longitud íntegra de la secuencias de nucleotide mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94) ; o (g) el complemento de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) o (f) . 4. El ácido nucleico de la reivindicación 3, en donde la hibridización ocurre bajo condiciones estrictas . 5. El ácido nucleico de la reivindicación 3, que es al menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud . 6. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 o 3. 7. Un vector de expresión 6, caracterizado porque el ácido nucleico se enlaza operativamente con secuencias de control reconocidas por una célula hospedera transformada con el vector. 8. La célula hospedera que comprende el vector de expresión de la reivindicación 7. 9. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque es una célula CHO una célula de E. coli o una célula de levadura. 10. Proceso para producir un polipéptido que comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8, bajo condiciones adecuadas para expresión del polipéptido y recupera el polipéptido del cultivo celular. 11. Un polipéptido aislado que tiene cuando menos 80% de identidad de secuencia de amino ácido a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) ; (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS: 23 -41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94); o (f) un polipéptido codificado por región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94) . 12. Un polipéptido aislado que tiene: (a) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95) ; (b) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su secuencia de señal de péptido asociada; (c) una secuencia amino ácidos de un dominio extracelular del polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia amino ácidos de un dominio extracelular del polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carecen de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de amino ácidos codificada por la secuencia de nucleótido mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94); o (f) una secuencia de amino ácidos codificada por la región de longitud integra de la secuencia de nucleótido mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94) . 13. Un polípéptido quimérico que comprende el polípéptido de la reivindicación 11 o 12, fusionado a un polípéptido heterólogo. 14. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido heterologo es una secuencia de epí ope o una región Fe de una inmunoglobulina. 15. Un anticuerpo aislado que liga a un polipéptido que tiene cuando menos 80% e identidad de secuencia de amino ácido a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) ; (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95) ; (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipeptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94); o (f) un polipéptido codificado por región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94). 16. Un anticuerpo aislado que liga a un polipéptido que tiene: (a) la secuencia de amino ácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92 , 93 o 95) ; (b) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su secuencia de péptido de señal asociado: (c) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS.23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su secuencia de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociado ; (e) una secuencia de amino ácido codificada por la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94); O (f) una secuencia de amino ácido codificada por región de longitud íntegra de la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94). 17. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 o 16, que es un anticuerpo monoclonal. 18. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 o 16, que es un fragmento de anticuerpo . 19. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 o 16, que es un anticuerpo quimérico o humanizado . 20. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 o 16, que está conjugado a un agente inhibidor de crecimiento. 21. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 o 16, que está conjugado a un agente citotóxico . 22. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, en donde el agente citotóxico se elige del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, is+otopos radioactivos y enzimas nucleoliticas . 23. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, en donde el agente citotóxico es una toxina . 24. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, en donde la toxina se elige del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina . 25. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, en donde la toxina es un maitansinoide . 26. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 o 16, que se produce en bacteria. 27. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 o 16, que se produce en células CHO. 28. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 o 16, que induce muerte de una de la célula a la cual liga. 29. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 o 16, que se etiqueta en forma detectable. 30. Un ácido nucleico aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que codifican el anticuerpo de la reivindicación 15 o 16. 31. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 30, enlazado operativamente con secuencias de control que se reconocen por una célula huésped trasformada con el vector. 32. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 31. 33. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque es una célula CHO una célula de E. coli o una célula de levadura. 34. Proceso para producir un polipéptido que comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 32, bajo condiciones adecuadas para expresión del anticuerpo y recuperar el anticuerpo del cultivo celular. 35. Un oligonucleótido aislado que liga a un polipéptido tiene cuando menos 80% de identidad de secuencia de amino ácido a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23 -41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95) ; (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95, que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95, con su péptido de señal asociado ; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95, que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94); o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94) . 36. Un oligopéptido aislado que liga a un polipéptido que tiene: (a) la secuencia de amino ácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) ; (b) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su secuencia de péptido de señal asociado: (c) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , con su secuencia de de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociado ; (e) una secuencia de amino ácido codificada por la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94); o (f) una secuencia de amino ácido codificada por región de longitud íntegra de la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94). 37. El oligopéptido de la reivindicación 35 o 36 que se conjuga a un agente inhibidor de crecimiento. 38. El oligopéptido de la reivindicación 35 o 36 que se conjuga a un agente citotoxico. 39. El oligopéptido de la reivindicación 38, en donde el agente citotoxico se elige del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleoliticas . 40. El oligopéptido de la reivindicación 38, en donde el agente citotoxico es una toxina. 41. El oligopéptido de la reivindicación 40, en donde la toxina se elige del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina . 42. El oligopéptido de la reivindicación 40, en donde la toxina es un maitansinoide. 43. El oligopéptido de la reivindicación 35 o 36 que induce muerta de una célula a la cual se liga. 44. El oligopéptido de la reivindicación 35 o 36 que se etiqueta en forma detectable. 45. Una molécula orgánica de enlace TAT que liga a un polipéptido que tiene cuando menos 80% de identidad de secuencia de amino ácido a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95) ; (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado ,- (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94) ; O (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94). 46. La molécula orgánica de la reivindicación 45 que se liga a un polipéptido que tiene: (a) la secuencia de amino ácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) ; (b) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su secuencia de péptido de señal asociado: (c) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , con su secuencia de de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociado ,- (e) una secuencia de amino ácido codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94); o (f) una secuencia de amino ácido codificada por la región de codificación de longitud integra de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS: 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94). 47. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 45 o 46 que está conjugada a un agente inhibidor de crecimiento. 48. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 45 o 46 que está conjugada a un agente citotóxico . 49. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 48 que el agente citotóxico se elige del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 50. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 48 que el agente citotóxico es una toxina. 51. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 50, que la toxina se elige del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina . 52. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 50, que la toxina es un maitansinoide. 53. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 45 o 46 que induce muerte a una célula a la cual se liga. 54. La molécula orgánica de conformidad con la reivindicación 45 o 46 que se etiqueta en forma detectable . 55. Una composición de material que comprende: (a) el polipéptido de la reivindicación 11; (b) el polipéptido de la reivindicación 12; (c) el polipéptido quimérico de la reivindicación 13; (d) el anticuerpo de la reivindicación 15; (e) el anticuerpo de la reivindicación 16; (f) el oligopéptido de la reivindicación 35; (g) el oligopéptido de la reivindicación 36; (h) la molécula orgánica de enlace TAT de la reivindicación 45; o (i) la molécula orgánica de enlace TAT de la reivindicación 46; en combinación con un portador. 56. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. 57. Un artículo de manufactura que comprende: (a) un recipiente; y (b) la composición de material de conformidad con la reivindicación 55 contenida en el recipiente. 58. El articulo de manufactura de la reivindicación 57, caracterizado porque además comprende una etiqueta fija al recipiente, o un inserto de paquete incluido en el recipiente, con referencia al uso de la composición de materia para tratamiento terapéutico o de detección de diagnóstico de cáncer. 59. Un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa una proteína que tiene cuando menos el 80% de identidad de secuencia de amino ácido a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) ; (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su péptido de señal asociado ,- (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1- 22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID N0S:1- 22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94); o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94), el método se caracteriza porque comprende contactar la célula con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que liga a la proteína, la unión o liga del anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica a la proteína y de esta manera provoca una inhibición de crecimiento de la célula. 60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 61. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 62. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 63. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente inhibidor de crecimiento. 64. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente citotóxico . 65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el agente citotóxico se elige del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleol iticas . 66. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina. 67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la toxina se elige del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicin . 68. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide . 69. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo se produce en bacterias. 70. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo se produce en células CHO. 71. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la célula es una célula de cáncer. 72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la célula de cáncer además se expone a tratamiento con radiación o un agente quimioterapeutico. 73. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la célula de cáncer se elige del grupo que consiste de una célula de cáncer de pecho, una célula de cáncer colorectal, una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer de ovarios, una célula de cáncer del sistema nervioso central, una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer de vejiga, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer cervical, una célula de melanoma y una célula de leucemia. 74. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la proteína se expresa más abundantemente por la célula de cáncer en comparación con una célula normal del mismo origen de tej ido . 75. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque provoca la muerte de la célula. 76. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la proteína tiene : (a) la secuencia de amino ácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23 -41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) ; (b) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su secuencia de péptido de señal asociado: (c) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , con su secuencia de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS-.23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociado ; (e) una secuencia de amino ácido codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94); o (f) una secuencia de araino ácido codificada por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94). 77. Método para tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor canceroso, que comprende células que expresan una proteína que tiene cuando menos 80% de identidad de secuencia de amino ácido a: (a) el polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) ; (b) el polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su péptido de señal asociado ; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94); o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS: 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94), el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que liga la proteína, de esta manera tratando efectivamente al mamífero. 78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 79. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 80. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 81. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente inhibidor de crecimiento. 82. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente citotóxico . 83. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el agente citotóxico se elige del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 84. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina. 85. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la toxina se elige del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina . 86. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide . 87. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el anticuerpo se produce en bacteria. 88. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el anticuerpo se produce en células CHO. 89. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el tumor además se expone a tratamiento con radiación o un agente quimioterapéutico . 90. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el tumor es un tumor de pecho, un tumor colorectal, un tumor de pulmón, un tumor de ovarios, un tumor de sistema nervioso central, un tumor de hígado, un tumor de ve iga, un tumor pancreático o un tumor cervical . 91. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la proteína se expresa más abundantemente por las células cancerosas del tumor en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. 92. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la proteína tiene : (a) la secuencia de amino ácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95) ; (b) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su secuencia de péptido de señal asociado: (c) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , con su secuencia de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociado ,- (e) una secuencia de amino ácido codificada por la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94); o (f) una secuencia de amino ácido codificada por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS: 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94). 93. Método para determiner la presencia de una proteína en una muestra que se sospecha que contiene la proteína, con lo que la proteína tiene al menos 80% de identidad de secuencia de amino ácido a: (a) el polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23 -41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) ; (b) el polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95) , que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94 (SEQ ID N0S:1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94); o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS.-1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94), el método comprende exponer la muestra a un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que liga a la proteína y determinar la unión del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína en una muestra, con lo que la unión del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína es significativo a la presencia de la proteína de la muestra. 94. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque la muestra comprende una célula que se sospecha que expresa la proteína. 95. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque la célula es una célula de cáncer. 96. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se etiqueta en forma detectable . 97. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque la proteína tiene : (a) la secuencia de amino ácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) ; (b) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociado: (c) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95) , con su secuencia de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociado ; (e) una secuencia de amino ácido codificada por la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS: 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94); o (f) una secuencia de amino ácido codificada por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94) . 98. Método para diagnosticar la presencia de un tumor de un mamífero, el método se caracteriza porque comprende determinar el nivel de expresión de un gen que codifica una proteína que tiene cuando menos 80% de identidad de secuencia de amino ácido a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23 -41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su péptido de señal asociado ; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94 (SEQ ID N0S:1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94); O (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94), en una muestra de células de tejidos que se obtienen del mamífero y en una muestra de control de células normales conocidas del mismo origen de tejido, en donde un nivel superior de expresión de la proteína en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control, que es indicativo en presencia de tumor en un mamífero del cual se obtiene la muestra de prueba. 99. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la etapa de determinar el nivel de expresión de un gen que codifica la proteína comprende emplear un oligonucleótido en una hibridización in situ o análisis RT-PCR. 100. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la etapa de determinar el nivel de expresión de un gen que codifica la proteína comprende emplear un anticuerpo en un análisis de técnica Western o inmunohistoquímica . 101. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la proteína tiene : (a) la secuencia de amino ácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS: 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92 , 93 O 95) ; (b) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociado: (c) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS: 23 -41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95) , con su secuencia de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociado; (e) una secuencia de amino ácido codificada por la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94); o (f) una secuencia de amino ácido codificada por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94). 102. Método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, el método se caracteriza porque comprende contactar una muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que liga a una proteína que tiene cuando menos 80% de identidad de secuencia de amino ácido a: (a) el polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23 -41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) ; (b) el polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polípéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94); O (f) un polipeptido codificado por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94), y detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica y la proteína en la muestra de prueba, en donde la formación de un complejo es indicativa de la presencia de un tumor en el mamífero. 103. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se etiquetan en forma detectable . 104. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque la muestra de prueba de célula de tejido se obtiene de un individuo que se sospecha que tiene un tumor canceroso. 105. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque la proteína tiene : (a) la secuencia de amino ácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92 , 93 o 95) ; (b) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociado: (c) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , con su secuencia de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociado; (e) una secuencia de amino ácido codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94); o (f) una secuencia de amino ácido codificada por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94). 106. Método para tratar o evitar un desorden proliferativo celular asociado con una expresión incrementada o actividad de una proteína que tiene cuando menos 80% de identidad de secuencia de amino ácido a: (a) el polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 57-112, 114, 116, 118 o 120 (SEQ ID NOS: 57-112 , 114, 116, 118 o 120); (b) el polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su péptido de señal asociado ; (c) un dominio extracelular del polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polípéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79- 83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipeptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID N0S:1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94); o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94), el método comprende administrar a un sujeto que requiere este tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de la proteína, de esta manera tratando o evitando efectivamente el desorden proliferativo celular. 107. El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque el desorden proliferativo celular es cáncer. 108. El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque el antagonista es un anticuerpo polipéptido anti-TAT, oligopéptido de enlace TAT, molécula orgánica de enlace TAT u oligonucleótido antisentido. 109. El método para enlazar un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a una célula que expresa una proteína que tiene cuando menos 80% de identidad de amino ácido a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S-.23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) ; (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS.-23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94 (SEQ ID NOS : 1 -22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94); O (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94), el método se caracteriza porque comprende contactar la célula con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que liga a la proteína y permitir el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica a la proteína que ocurra, de esta manera enlazando el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica con la célula. 110. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 111. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 112. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 113. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente inhibidor de crecimiento. 114. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente citotóxico. 115. El método de conformidad con la reivindicación 114, caracterizado porque el agente citotóxico se elige del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 116. El método de conformidad con la reivindicación 114, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina. 117. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque la toxina se elige del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina . 118. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide . 119. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo se produce en bacterias. 120. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo se produce en células CHO. 121. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la célula es una célula de cáncer. 122. El método de conformidad con la reivindicación 121, caracterizado porque la célula de cáncer además se expone a tratamiento con radiación un agente quimioterapéutico . 123. El método de conformidad con la reivindicación 121, caracterizado porque la célula de cáncer se elige del grupo que consiste de una célula de cáncer de pecho, una célula de cáncer colorectal, una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer de ovario una célula de cáncer de sistema nervioso central, una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer d e vejiga, una célula de cáncer pancreática, una célula de cáncer cervical, una célula de melanoma y una célula de a leucemia . 124. El método de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque la proteína se expresa más abundantemente por la célula de cáncer en comparación con la célula normal y el mismo origen de tej ido 125. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque provoca la muerte de la célula. 126. Uso de un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 30 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de cáncer. 127. Uso de un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 30 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumor . 128. Uso de un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 30 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un desorden proliferativo celular. 129. Uso de un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 o 31 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de cáncer. 130. Uso de un vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 o 31 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumor. 131. Uso de un vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 o 31 en la preparación de un medicamento para prevención de un desorden proliferativo celular. 132. Uso de una célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 32, o 33 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de cáncer. 133. Uso de una célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 32, o 33, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor . 134. Uso de una célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 32, o 33, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un desorden proliferativo celular. 135. Uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de cáncer. 136. Uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor . 137. Uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un desorden proliferativo celular. 138. Uso de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de cáncer. 139. Uso de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 140. Uso de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un desorden proliferativo celular. 141. Uso de un oligopéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 44, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer. 142. Uso de un oligopéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 44, en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 143. Uso de un oligopéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 44, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un desorden proliferativo celular. 144. Uso de una molécula orgánica de enlace ??? de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 54 , en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer . 145. Uso de una molécula orgánica de enlace TAT de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 54, en la preparación de un medicamento para tratamiento de tumor. 146. Uso de una molécula orgánica de enlace TAT de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 54, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un desorden proliferativo celular . 147. Uso de una composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55 o 56, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer. 148. Uso de una composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55 o 56 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor . 149. Uso de una composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55 o 56, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un desorden proliferativo celular . 150. Uso de un artículo de manufactura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 57 o 58, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección de diagnóstico de un cáncer . 151. Uso de un artículo de manufactura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 57 o 58 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor . 152. Uso de un artículo de manufactura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 57 o 58, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un desorden proliferativo celular . 153. Un método para inhibir el crecimiento de células, en donde el crecimiento de las células al menos en parte depende de un efecto potenciador de crecimiento de una proteína que tiene al menos 80% identidad de secuencia de amino ácido con: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) ; (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular de el polipéptido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS-.23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su péptido de señal asociado ; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID N0S:1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94); o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94), el método comprende contactar la proteína con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que liga dicha proteína, de esta menra inhibiendo el crecimiento de las células. 154. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque las células son células de cáncer. 155. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque la proteína se expresa por la célula. 156. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica con la proteína antagoniza una actividad potenciadora de crecimiento de célula de dicha proteína. 157. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica con la proteína induce la muerte de las células. 158. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 159. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 160. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo dimérico o humanizado. 161. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente inhibitorio de crecimiento. 162. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente citotóxico . 163. El método de conformidad con la reivindicación 162, caracterizado porque el agente citotóxico se elige del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 164. El método de conformidad con la reivindicación 162, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina. 165. El método de conformidad con la reivindicación 164, caracterizado porque la toxina se elige del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina . 166. El método de conformidad con la reivindicación 164, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide . 167. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo es producido en bacterias. 168. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque el anticuerpo es producido en células CHO. 169. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque la proteína tiene : (a) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92 , 93 o 95) ; (b) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su secuencia de péptido de señal asociado; (c) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su secuencia de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular de el polipéptido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociado ; (e) una secuencia de amino ácido codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS : 1 - 22 , 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94); O (f) una secuencia de amino ácido codificada por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94) . 170. Un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento del tumor al menos en parte depende de un efecto potenciador de crecimiento de una proteína que tiene al menos 80% identidad de secuencia de amino ácido con: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95) ; (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95 ( SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), con su péptido de señal asociado ; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID N0S:1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94); o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94), el método comprende contactar la proteína con un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica que liga la proteína, de esta manera tratando efectivamente el tumor. 171. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque la proteína se expresa por células del tumor. 172. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el enlace del anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica con la proteína antagoniza una actividad potenciadora de crecimiento de célula de dicha proteína. 173. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 174. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 175. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 176. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente inhibitorio de crecimiento. 177. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente citotóxico. 178. El método de conformidad con la reivindicación 177, caracterizado porque el agente citotóxico se elige del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 179. El método de conformidad con la reivindicación 177, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina. 180. El método de conformidad con la reivindicación 179, caracterizado porque la toxina se elige del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina . 181. El método de conformidad con la reivindicación 179, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide . 182. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo es producido en bacterias. 183. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque el anticuerpo es producido en células CHO. 184. El método de conformidad con la reivindicación 170, caracterizado porque la proteína tiene : (a) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) ; (b) la secuencia de amino ácido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su secuencia de peptido de señal asociada; (c) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular de el polipéptido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID N0S:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 O 95) , con su secuencia de peptido de señal asociada; (d) una secuencia de amino ácido de un dominio extracelular de el polipéptido mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS:23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) , que carece de su secuencia de peptido de señal asociada; (e) secuencia de amino ácido codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 O 94); O (f) una secuencia de amino ácido codificada por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94 (SEQ ID NOS:l-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94) . Sin embargo, adicionales modalidades de la presente invención serán evidentes a una persona con destreza en la especialidad ante lectura de la presente especificación . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N0:1) de un TAT257 cADN, en donde SEQ ID N0:1 es un clon aquí designado como "DNA274297". La Figura 2 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2) de un TAT258 cADN, en donde SEQ ID NO:2 es un clon aquí designado como "DNA47369" . La Figura 3 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) de un TAT259 cADN, en donde SEQ ID NO:3 es un clon aquí designado como "DNA226027". La Figura 4 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: ) de un TAT260 cADN, en donde SEQ ID NO:4 es un clon aquí designado como "DNA226713". La Figura 5 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 5) de un TAT261 cADN, en donde SEQ ID NO:5 es un clon aquí designado como "DNA86517".
¡ La Figura 6 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 6) de un TAT262 cADN, en donde SEQ ID N0:6 es un clon aquí designado como "DNA88126". La Figura 7 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 7) de un TAT263 cADN, en donde SEQ ID N0:7 es un clon aquí designado como "DNA103464". La Figura 8A-B muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 8) de un TAT264 cADN, en donde SEQ ID N0:8 es un clon aquí designado como "DNA194776". La Figura 9A-C muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 9) de un TAT265 cADN, en donde SEQ ID N0:9 es un clon aquí designado como "DNA288204". Figures 10 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 10) de un TAT266 cADN, en donde SEQ ID NO: 10 es un clon aquí designado como "DNA257354". Figures 11 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 11) de un TAT267 cADN, en donde SEQ ID NO: 11 es un clon aquí designado como "DNA98566". La Figura 12 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 12) de un TAT268 cADN, en donde SEQ ID NO:12 es un clon aquí designado como "DNA227212". La Figura 13 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 13) de un TAT269 cADN, en donde SEQ ID NO:13 es un clon aquí designado como "DNA227461".
La Figura 14A-B muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 14) de un TAT270 cADN, en donde SEQ ID N0:14 es un clon aquí designado como "DNA150762". La Figura 15 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 15) de un TAT271 cADN, en donde SEQ ID N0:15 es un clon aquí designado como "DNA86382". La Figura 16 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 16) de un TAT272 cADN, en donde SEQ ID N0:16 es un clon aquí designado como "DNA256608". Las Figuras 17 muestran una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 17) de un TAT273 cADN, en donde SEQ ID N0:17 es un clon aquí designado como "DNA19902". Las Figuras 18 muestran una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 18) de un TAT274 cADN, en donde SEQ ID N0:18 es un clon aquí designado como "DNA182764". Las Figuras 19A-B muestran una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 19) de un TAT275 cADN, en donde SEQ ID NO: 19 es un clon aquí designado como "DNA225727". La Figura 20 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 20) de un TAT276 cADN, en donde SEQ ID NO:20 es un clon aquí designado como "DNA119500". La Figura 21 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 21) de un TAT277 cADN, en donde SEQ ID NO:21 es un clon aquí designado como "DNA19362".
La Figura 22 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 22) de un TAT278 cADN, en donde SEQ ID NO:22 es un clon aquí designado como "DNA226446". La Figura 23 muestra una secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO:23) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 2 mostrada en la Figura 2. La Figura 24 muestran una secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 24) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 3 mostrada en la Figura 3. La Figura 25 muestran una secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 25) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 4 mostrada en la Figura 4. La Figura 26 muestran una secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 26) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 6 mostrada en la Figura 6. La Figura 27 muestran una secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 27) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 7 mostrada en la Figura 7. Las Figuras 28A-B muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 28) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO : 8 mostrada en las Figuras 8A-B. La Figura 29 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 29) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 9 mostrada en las Figuras 9A-C. La Figura 30 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 30) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 10 mostrada en la Figura 10. La Figura 31 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 31) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 11 mostrada en la Figura 11. La Figura 32 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 32) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 12 mostrada en la Figura 12. La Figura 33 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:33) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 13 mostrada en la Figura 13. La Figura 34 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:34) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 14 mostrada en la Figura 14A- B. La Figura 35 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 35) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 16 mostrada en la Figura 16. La Figura 36 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 36) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 17 mostrada en la Figura 17.
La Figura 37 muestran una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 37) derivada de la .secuencia de codificación de SEQ ID NO: 18 mostrada en la Figura 18. La Figura 38 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 38) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 19 mostrada en las Figuras 19A-B. La Figura 39 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:39) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 20 mostrada en la Figura 20. La Figura 40 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:40) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 21 mostrada en la Figura 21. La Figura 41 derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 22 mostrada en la Figura 22. La Figura 42 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 42) de un TAT240 cADN, en donde SEQ ID N0:42 es un clon aquí designado como "DNA172363". Las Figuras 43A-B muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 43) de un TAT241 cADN, en donde SEQ ID NO:43 es un clon aquí designado como "DNA227465". La Figura 44 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 44) de un TAT242 cADN, en donde SEQ ID NO:44 es un clon aquí designado como "DNA227943".
La Figura 45 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 45) de un TAT243 cADN, en donde SEQ ID NO:45 es un clon aquí designado como "DNA82306". La Figura 46 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 46) de un TAT244 cADN, en donde SEQ ID NO:46 es un clon aquí designado como "DNA227019" . La Figura 47 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 47) de un TAT245 cADN, en donde SEQ ID NO-.47 es un clon aquí designado como "DNA96942". La Figura 48 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:48) de un TAT246 cADN, en donde SEQ ID NO:48 es un clon aquí designado como "DNA42551". La Figura 49 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 49) de un TAT135 cADN, en donde SEQ ID NO:49 es un clon aquí designado como "DNA68885". Las Figuras 50A-B muestran una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 50) de un TAT249 cADN, en donde SEQ ID NO:50 es un clon aquí designado como "DNA59619" . La Figura 51 muestran una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 51) de un TAT250 cADN, en donde SEQ ID NO:512 es un clon aquí designado como "DNA227205". La Figura 52 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 52) de un TAT251 cADN, en donde SEQ ID NO-.52 es un clon aquí designado como "DNA175959" .
La Figura 53 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 53) de un TAT252 cADN, en donde SEQ ID NO:53 es un clon aquí designado como "DNA48227". La Figura 54 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 54) de un TAT253 cADN, en donde SEQ ID NO:54 es un clon aquí designado como "DNA59612". Las Figuras 55A-B muestran una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 55) de un TAT254 cADN, en donde SEQ ID NO:55 es un clon aquí designado como "DNA226917". La Figura 56 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:56) de un TAT255 cADN, en donde SEQ ID NO:56 es un clon aquí designado como "DNA125219". La Figura 57 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 57) de un TAT256 cADN, en donde SEQ ID NO:57 es un clon aquí designado como "DNA151291". La Figura 58 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 58) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO:42 mostrada en la Figura 42. La Figura 59 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 59) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 43 mostrada en las Figuras 43A-B. La Figura 60 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 60) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 44 mostrada en la Figura 44.
La Figura 61 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 61) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 45 mostrada en la Figura 45. La Figura 62 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 62) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO-.46 mostrada en la Figura 46. La Figura 63 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 63) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 47 mostrada en la Figura 47. La Figura 64 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 64) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 48 mostrada en la Figura 48. La Figura 65 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 65) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 49 mostrada en la Figura 49. La Figura 66 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 66) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 50 mostrada en la Figura 50. La Figura 67 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 67) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 51 mostrada en la Figura 51. La Figura 68 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 68) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 52 mostrada en la Figura 52.
La Figura 69 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 69) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 53 mostrada en la Figura 53. La Figura 70 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 70) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 54 mostrada en la Figura 54. La Figura 71 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 71) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 55 mostrada en las Figuras 55A-B . La Figura 72 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 72) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 56 mostrada en la Figura 56. La Figura 73 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 73) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 57 mostrada en la Figura 57. Las Figuras 74A-B muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 74) de un TAT279 cADN, en donde SEQ ID NO:74 es un clon aquí designado como "DNA227583". La Figura 75 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 75) de un TAT280 cADN, en donde SEQ ID NO:75 es un clon aquí designado como "DNA194838". Las Figuras 76A-B muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 76) de un TAT290 cADN, en donde SEQ ID NO: 76 es un clon aquí designado como "DNA290924".
Las Figuras 77A-B muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 77) de un TAT281 cADN, en donde SEQ ID NO:77 es un clon aquí designado como "DNA227708 " . Las Figuras 78A-B muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 78) de un TAT282 cADN, en donde SEQ ID NO: 78 es un clon aquí designado como "DNA226859". La Figura 79 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 79) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 74 mostrada en las Figuras 74A-B. La Figura 80 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 80) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 75 mostrada en la Figura 75. La Figura 81 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 81) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 76 mostrada en las Figuras 76A-B. La Figura 82 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 82) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 77 mostrada en las Figuras 77A-B. La Figura 83 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 83) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 78 mostrada en las Figuras 78A-B.
La Figura 84 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 84) de un TAT283 cADN, en donde SEQ ID NO:84 es un clon aquí designado como "DNA290812". La Figura 85 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 85) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 84 mostrada en la Figura 84. La Figura 86 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 86) de un TAT286 cADN, en donde SEQ ID NO:86 es un clon aquí designado como "DNA292996". Las Figuras 87A-C muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 87) de un TAT288 cADN, en donde SEQ ID NO:87 es un clon aquí designado como "DNA254932". La Figura 88 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 88) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 86 mostrada en la Figura 86. Las Figuras 89A-B muestran la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 89) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 87 mostrada en las Figuras 87A-C. La Figura 90 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 90) de un TAT287 cADN, en donde SEQ ID NO:90 es un clon aquí designado como "DNA254340". La Figura 91 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 91) de un TAT373 cADN, en donde SEQ ID NO:91 es un clon aquí designado como "DNA299882".
La Figura 92 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 92) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 90 mostrada en la Figura 90. La Figura 93 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 93) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 91 mostrada en la Figura 91. La Figura 94 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 94) de un TAT289 cADN, en donde SEQ ID NO:94 es un clon aquí designado como "DNA288313". La Figura 95 muestra la secuencia de amino ácidos (SEQ ID NO: 95) derivado de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 94 mostrada en la Figura 94. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS I . Definiciones Los términos "polipéptido TAT" y "TAT" como se emplea aquí y cuando son seguidos inmediatamente por una designación numérica, se refiere a diversos polipéptidos, en donde la designación completa (es decir TAT/número) se refiere a secuencias de polipéptido específicas como se describe aquí. Los términos "polipéptido TAT/número" y "TAT/número" en donde el término "número" se proporciona como una designación numérica actual como se utiliza aquí, abarca polipéptidos de secuencia nativa, variantes de polipéptido y fragmentos de polipéptidos de secuencia activa y variantes de polipéptido (que se definen más adelante aquí) . Los polipéptidos TAT descritos aquí pueden ser aislados de una variedad de fuentes, tales como de tipo de tejido humano o de otra fuente, o prepararse por métodos recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido TAT", se refiere a cada polipéptido TAT/número individual aquí descrito. Todas las descripciones en esta especificación que se refieren al polipéptido "TAT", se refieren a cada uno de los polipéptidos individualmente así como en forma conjunta. Por ejemplo, descripciones de la preparación de, purificación de, derivación de, formación de anticuerpos con o contra, formación de oligopéptidos de enlace TAT a o contra, formación de moléculas orgánicas de enlace TAT a o contra, administración de, composiciones que contienen, tratamiento de una enfermedad con, etc., se refieren a cada polipéptido de la invención individualmente. El término "polipéptido TAT" también incluye variantes de los polipéptidos número/TAT aquí descritos . Un "polipéptido TAT de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de amino ácidos que el polipéptido TAT correspondiente derivado de la naturaleza. Estos polipéptidos TAT de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido TAT de secuencia nativa" específicamente abarca formas secretadas o truncadas de origen natural o secretadas del polipéptido TAT específico (por ejemplo una secuencia de dominio extracelular) , formas variantes de origen natural (por ejemplo, stl en forma alterna) y variantes alélicas de origen natural del polipéptido. En ciertas modalidades de la invención, los polipéptidos TAT de secuencia nativa aquí descritos son polipéptidos de secuencia nativa de longitud íntegra o maduros que comprenden las secuencias de amino ácido de longitud íntegra mostradas en las Figuras acompañantes. Codones de inicio y parada se ilustran con negritas y subrayados en las Figuras. Residuos de ácidos nucleicos indicados como "N" en las Figuras acompañantes son cualquier residuo de ácido nucleico. Sin embargo, mientras que los polipéptidos TAT descritos en las Figuras acompañantes se ilustra que empiezan con residuos metionina aquí designados como posición de amino ácido 1 en las Figuras, se concibe y es posible que otros residuos de metionina ubicados ya sea corriente arriba o corriente abajo de la posición amino ácido 1 en las Figuras, pueden ser empleados como residuos amino ácido de partida para los polipéptidos TAT .
El "dominio extracelular" o "ECD" de polipéptido TAT se refiere a una forma del polipéptido TAT que está esencialmente libre de los dominios citoplásmico y transmembrana. De manera ordinaria, un ECD polipéptido TAT tendrá menos de 1% de estos dominios citoplásmicos y/o de transmembrana y de preferencia tendrá menos de 0.5% de estos dominios. Se entenderá que cualesquiera dominios transmembrana identificados para los polipéptidos TAT de la presente invención, se identifican de acuerdo con criterios empleados rutinariamente en la técnica para identificar este tipo de dominio hidrofóbíco. Las fronteras exactas de un dominio transmembrana pueden variar pero muy probablemente no más de aproximadamente 5 amino ácidos en cualquier extremo del dominio, como se identifica inicialmente aquí. Opcionalmente , por lo tanto un dominio extracelular de un polipéptido TAT puede contener de aproximadamente 5 o menos amino ácidos en cualquier lado de la frontera del dominio extracelular/dominio de transmembrana como se identifica en los Ejemplos o especificación y estos polipéptidos, con o sin el péptido de señal asociado, y el ácido nucleico que los codifica, se contemplan por la presente invención. La ubicación aproximada de los "péptidos de señal" de los diversos polipéptidos TAT descritos aquí, puede mostrarse en la presente especificación y/o en las Figuras acompañantes. Se nota, sin embargo, que la frontera C-terminal de un péptido de señal puede variar, pero muy probablemente en no más de aproximadamente 5 amino ácidos en cualquier lado de la frontera C-terminal del péptido de señal como se identifica inicialmente aquí, en donde la frontera C-terminal del péptido de señal puede identificarse de acuerdo con criterios empleados rutinariamente en la técnica para identificar este tipo de elemento de secuencia de amino ácido (por ejemplo, Nielsen y colaboradores, Prot . Eng. 10: 1-6 (1997) y von Heinje y colaboradores, Nucí. Acids . Res. 14: 4683-4690 (1986)). Aún más, también se reconoce que, en algunos casos, la escisión de una secuencia de señal de un polipéptido secretado no es totalmente uniforme, resultando en más de una especie secretada. Estos polipéptidos maduros, cuando se escinde el péptido de señal con no más de aproximadamente 5 amino ácidos en cualquier lado de la frontera C-terminal del péptido de señal como aquí se identifica, y los polinucleótidos o rayos codificados, se contemplan por la presente invención. "Variante de polipéptido TAT" significa un polipéptido TAT, de preferencia un polipéptido TAT activo, como se define aquí que tiene cuando menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de amino ácido con una secuencia de polipéptido TAT de secuencia nativa de longitud íntegra como aquí se describe, una secuencia de polipéptido TAT que carece del péptido de señal como aquí se describe, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin el péptido de señal, como se describe aquí o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido TAT de longitud íntegra, como se describe aquí (tal como aquellos codificados por un ácido nucleico que representa sólo una porción de la secuencia de codificación completa para un polipéptido TAT de longitud íntegra) . Estas variantes de polipéptido TAT incluyen, por ejemplo polipéptidos TAT en donde uno o más residuos amino ácido se agregan, o eliminan, en el extremo-C o -N de la secuencia de amino ácido nativo de longitud íntegra. Ordinariamente, una variante de polipéptido TAT tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de amino ácido, en forma alterna cuando menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% O 99% de identidad de secuencia de amino ácido, a una secuencia de polipéptido TAT de secuencia nativa de longitud íntegra como se describe aquí, una secuencia de polipéptido TAT que carece del péptido de señal como se describe aquí, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin el péptido de señal, como se describe aquí o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de polipéptido TAT de longitud íntegra como se describe aquí. De manera ordinaria, polipéptidos variantes TAT son al menos de aproximadamente 10 amino ácidos de longitud, en forma alterna cuando menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 8 0, 90, 100 , 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 , 280 , 290, 300, 310 , 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460 , 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 amino ácidos de longitud o más .
Opcionalmente , polipéptidos variantes TAT no tendrán más de una substitución de amino ácido conservadora en comparación con la secuencia de polipéptido TAT nativo, en forma alterna no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 substituciones de amino ácidos conservadoras en comparación con la secuencia de polipéptido TAT nativo. "Por ciento (%) de identidad de secuencia de amino ácido" con respecto a las secuencias de polipéptido TAT identificadas aquí, se define como el por ciento de residuos amino ácido en una secuencia candidato que son idénticos con los residuos amino ácido en la secuencia de polipéptido TAT específica, después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario, para lograr el por ciento de la identidad de secuencia máximo, y no considerar ningunas substituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para propósitos de determinar por ciento de identidad de secuencia de amino ácido puede lograrse en varias formas que están dentro de la destreza en la especialidad, por ejemplo utilizando soporte lógico de computadora públicamente disponible tales como los soportes lógicos BLAST, BLAST-2 , ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos con destreza en la especialidad pueden determinar parámetros apropiados para medir alineamiento, incluyendo cualesquiera algoritmos requeridos para lograr máximo alineamiento sobre toda la longitud de las secuencias comparadas. Para los presentes propósitos, sin embargo, valores de % de identidad de secuencia de amino ácido se generan utilizando el programa de computadora para comparación de secuencia ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa de computadora para comparación de secuencia ALIGN-2 es de autoría por Genentech, Inc., y el código fuente mostrado en la Tabla 1 a continuación se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los E.U.A., Washington D. C, 20559, en donde fue registrado bajo el número de Derechos de Autor de los E.U.A. No. TXU510087.
El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede ser compilado a partir del código fuente que se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa ALIGN-2 deberá ser compilado para utilizar en un sistema operativo UNIX, de preferencia UNIX V4. OD digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones en donde ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencia de amino ácido, el % de identidad de secuencia de amino ácido de una secuencia de amino ácido determinada A para, con, o contra una secuencia de amino ácidos determinada B (que puede redactarse en forma alterna como una secuencia de amino ácidos determinada A que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de amino ácido para, con, o contra una secuencia de amino ácido determinada B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos amino ácido calificados como correspondencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2, en que ese alineamiento de programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos amino ácido en B. Se apreciará que cuando la longitud de secuencias de amino ácido A no es igual a la longitud de secuencias de amino ácido B, el % de identidad de secuencias de amino ácido de A a B no será igual al % de identidad de secuencias de amino ácido de B a A. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencia de amino ácido utilizando este método, las Tablas 2 y 3 demuestran como calcular el % de identidad de secuencia de amino ácido de la secuencia amino ácido designada "Proteína de Comparación" a la secuencia de amino ácido designada "TAT", en donde "TAT" representa la secuencia de amino ácido de un polipéptido TAT hipotético de interés, "Proteína de Comparación" representa la secuencia amino ácido de un polipéptido contra el cual el polipéptido "TAT" de interés se compara, y "X", "Y" y "Z" cada uno representan diferentes residuos amino ácido hipotéticos. A menos de que se establezca específicamente de otra forma, todos los valores de % de identidad de secuencia de amino ácido aquí empleados, se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2. "Polinucleótido variante TAT" o "secuencia de ácido nucleico variante TAT" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido TAT, de preferencia un polipéptido TAT activo como se define aquí, y que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptido TAT con secuencia nativa de longitud íntegra como se describe aquí, una secuencia de polipéptido TAT de secuencia nativa de longitud íntegra que carece el péptido de señal como se describe aquí, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin el péptido de señal como se describe aquí o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido TAT de longitud íntegra como se describe aquí (tal como aquellos codificados por un ácido nucleico que representa sólo una porción de la secuencia de codificación completa para un polipéptido TAT de longitud íntegra) . Ordinariamente, un polinucleótido variante TAT tendrá cuando menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, en forma alterna cuando menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptido TAT de secuencia nativa de longitud íntegra como se describe aquí, una secuencia de polipéptido TAT de secuencia nativa de longitud íntegra que carece del péptido de señal como se describe aquí, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin la secuencia de señal, como se describe aquí o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido TAT de longitud íntegra como se describe aquí . Variantes no abarcan la secuencia de nucleotidos nativo. Ordinariamente, polinucleótidos variantes TAT son al menos de aproximadamente 5 nucleotidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, o 1000 nucleotidos de longitud, en donde en este contexto, el término "aproximadamente" significa la longitud de secuencia nucleótido referida más o menos 10% de la longitud referida . "Por ciento (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto a las secuencias de ácido nucleico que codifican-TAT identificadas aquí, se define como el por ciento de nucleótidos en una secuencia candidato que son idénticos con los nucleótidos en esa secuencia de ácido nucleico TAT de interés, después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario, para lograr por ciento de identidad de secuencia máximo. El alineamiento para propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de ácido nucleico puede lograrse en diversas formas que están dentro de la destreza de la especialidad, por ejemplo utilizando soporte lógico de computadora disponible al público tales como el soporte lógico BLAST, BLAST-2 , ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Para los presentes propósitos, sin embargo valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico se generan utilizando el programa de computadora para comparación de secuencia ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa de computadora para comparación de secuencia ALIGN-2 es de autoría de Genentech, Inc., y el código fuente mostrado en la Tabla 1 a continuación se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los E.U.A., Washington D. C., 20559, en donde está registrado bajo el número de Derechos de Autor E.U.A. No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede ser compilado del código fuente que se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa ALIGN-2 deberá ser compilado para utilizar en un sistema operativo UNIX, de preferencia UNIX V4. OD digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones en donde ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencia de ácido nucleico, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico determinada C para, con, o contra una secuencia de ácido nucleico determinada D (que puede redactarse en forma alterna como una secuencia de ácido nucleico determinada C que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácido nucleico para, con, o contra una secuencia de ácido nucleico determinada D) se calcula como sigue: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos calificados como correspondencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencia ALIGN-2, en ese alineamiento de programa de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que cuando la longitud de secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de secuencia de ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C a D no es igualará al % de identidad de secuencia de ácido nucleico de D a C. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencia de ácido nucleico, las Tablas 4 y 5 demuestran como calcular el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico designada "ADN de Comparación" a la secuencia de ácido nucleico designada "ADN-TAT", en donde "ADN-TAT" representa una secuencia de ácido nucleico de codificación TAT hipotética de interés, "ADN de Comparación" representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico contra la cual la molécula de ácido nucleico "TAT-ADN" de interés se compara y "N", "L" y "V" cada uno representan diferentes nucleótidos hipotéticos. A menos de que se establezca específicamente de otra forma, todos los valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico aquí empleados, se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2. En otras modalidades, polinucleótidos variantes TAT son moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido TAT y que son capaces de hibridizar, de preferencia bajo severas condiciones de lavado e hibridización, a secuencias de nucleótido que codifican un polipéptido TAT de longitud íntegra, como se describe aquí. Polipéptidos variantes TAT pueden ser aquellos que se codifican por un polinucleotido variante TAT. El término "región de codificación de longitud íntegra" cuando se utiliza en referencia a un ácido nucleico que codifica un polipéptido TAT, se refiere a a la secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido TAT de longitud íntegra de la invención (que a menudo se ilustra entre los codones de inicio y parada, incluyendo los mismos en las Figuras acompañantes) . El término región de codificación de longitud íntegra "cuando se utiliza con referencia a un ácido nucleico depositado con la ATCC se refiere a la corrección de codificación de polipéptido TAT del cADN que se inserta en el vector depositado con la ATCC (que ninguno se ilustra entre los codones de inicio y parada incluyendo los mismos, en las Figuras acompañantes) . "Aislado", cuando se emplea para describir los diversos polipéptidos TAT aquí descritos, significa polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que típicamente interfieren con los usos de diagnóstico o terapéutico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el polipéptido se purificará (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de amino ácidos internos o L- erminales por el uso de un secuenciador de copa centrífuga, o (2) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o de preferencia tinción con plata. Polipéptido aislado incluye polipéptido in si tu con células recombinantes , ya que al menos un componente del ambiente natural del polipéptido TAT no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo el polipéptido aislado se preparará por al menos una etapa de purificación. Un ácido nucleico que codifica polipéptido TAT "aislado" u otro ácido nucleico que codifica polipéptido, es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado es diferente en la forma o configuración en la que se encuentra en la naturaleza. Moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptido aisladas, por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico que codifica polipéptido específica como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico que codifica polipéptido aislada incluye moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptido contenidas en células que expresan ordinariamente el polipéptido, cuando por ejemplo la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosomal diferente de aquella de células naturales. El término "secuencias de control" se refiere a una secuencia de ADN, necesaria para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operativamente en un organismo hospedero particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de enlace de ribosomas. Células eucarióticas se conoce que utilizan promotores, señales de poliadelinacion y mejoradores. Ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN, para un líder secretorio o de pre-secuencia, se enlaza operativamente con ADN para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador se enlaza operativamente con una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosoma se enlaza operativamente con una secuencia de codificación si se ubica para facilitar la traducción. En general, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN enlazadas son contiguas y en el caso de un líder secretorio, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los mej oradores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra por ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, se utilizan los enlazadores o adaptadores oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional. "Severidad" de reacciones de hibridización se determina fácilmente por una persona con destreza ordinaria en la especialidad y en general es un cálculo empírico que depende de longitud de sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general, sondas más largas requieren temperaturas superiores para adecuado alineado o fijado mientras que sondas más cortas requieren menores temperaturas. La hibridización generalmente depende de la capacidad de ADN desnaturalizado para volver a fijar cuando hebras complementarias están presentes en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Entre más alto sea el grado de homología deseada entre la sonda y secuencia hibridizable, será superior la temperatura relativa que puede emplearse. Como resultado, se concluye que temperaturas relativas superiores tenderán a ser más estrictas o severas las condiciones dé reacción, mientras que temperaturas inferiores, menos. Para detalles y explicación adicional de severidad de reacciones de hibridización, ver Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, (Protocolos Actuales en Biología Molecular) Wiley Interscience Publishers, (1995) . "Condiciones severas" o "condiciones de alta severidad", como se define aquí, pueden identificarse por aquellas que: (1) emplean baja concentración iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M, citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio 0.1% a 50 grados C; (2) emplean durante hibridización, un agente de desnaturalización tal como formaldehído, por ejemplo formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0.1%/Ficoll 0.1%/polivinilpirrolidona a 0.1%/amortiguador fosfato de sodio 50mM a pH 6.5 y cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio a 75 mM a 42 grados C; o (3) hibridización durante la noche en una solución que emplea 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio a 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio 0.1%, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml) , SDS 0.1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42 grados C, con un lavado de 10 minutos a 42 grados C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) seguido por un lavado de alta severidad de 10 minutos que consiste de EDTA que contiene 0.1 x SSC a 55 grados C. "Condiciones moderadamente severas" pueden ser idenfificadas como se describe por Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio) New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluye el uso de solución de lavado y condiciones de hibridización (por ejemplo temperatura, fuerza iónica y % SDS) menos estrictas que aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente severas es incubación durante la noche a 37 grados °C en una solución que comprende: 20% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5 X, sulfato de dextrano al 10%, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cizallado, desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50 grados C. La persona con destreza reconocerá como ajustar la temperatura, concentración iónica, etc., según sea necesario para ajustar factores tales como longitud de sonda y semej antes . El término "epítope etiquetado", cuando se emplea aquí, se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT fuisionado a un "polipéptido de etiqueta" . El polipéptido de etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el cual puede elaborarse un anticuerpo, sin embargo es suficientemente corto de manera tal que no interfiera con la actividad del polipéptido al cual se fusiona. El polipéptido de etiqueta, de preferencia también es substancialmente único, de manera tal que el anticuerpo no reacciona en forma substancialmente cruzada con otros epítopes. Polipéptidos de etiqueta convenientes en general tienen cuando menos seis residuos aminoácido y usualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos aminoácidos (de preferencia, entre aproximadamente 10 y 20 residuos aminoácidos) . "Activo" o "actividad" para los presentes propósitos se refieren a una o varias formas de un polipéptido TAT, que retienen una actividad biológica y/o inmunológica de TAT de origen natural o nativo, en donde actividad "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibitoria o estimulatoria) provocada por TAT de origen natural o nativo diferente a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por un TAT de origen natural o nativo y una actividad "inmunológica" se refiere a la habilidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por un TAT de origen natural o nativo . El término "antagonista" se emplea en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea inhibe o neutraliza parcial o completamente, una actividad biológica de un polipeptido TAT nativo aquí descrito. En una forma similar, el término "agonista" se emplea en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido TAT nativo aquí descrito. Moléculas agonistas o antagonistas convenientes específicamente incluyen anticuerpos agonistas o antagonistas o fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes de secuencias de aminoácido de polipéptidos TAT nativos, péptidos, oligonucleótidos antisentido, pequeñas moléculas orgánicas, etc. Métodos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido TAT pueden comprender el contactar un polipéptido TAT con una molécula agonista o antagonista candidato y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido TAT. "Tratamiento" O "tratar" o "alivio" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas, en donde el objetivo es evitar o frenar (reducir) el desorden o condición patológica objetivo. Aquellos que requieren tratamiento incluyen aquellos que ya están con el desorden, así como aquellos tendientes a tener el desorden o aquellos en quienes el desorden se va a evitar. Un sujeto o mamífero se "trata" exitosamente para un cáncer que expresa el polipéptido TAT si, después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo anti-TAT, el oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT de acuerdo con los métodos de la presente invención, el paciente muestra una reducción observable y/o medible en o ausencia de uno o más de los siguientes : reducción en el número de cáncer de seno o mama o ausencia de cáncer de seno; reducción en el tamaño de tumor; inhibición (es decir frenar en cierta proporción y de preferencia detener) la infiltración de células de cáncer en órganos periféricos incluyendo la dispersión de cáncer en tejido suave y huesos; inhibición (es decir frenado de cierta proporción y de preferencia detener) metástasis de tumor; inhibición en cierta proporción de crecimiento de tumor; y/o alivio en cierta proporción de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; reducida morbidez y mortalidad, y mejora en aspectos de calidad de vida. En la proporción en que el anticuerpo anti-TAT u oligopéptido de enlace TAT puedan evitar el crecimiento y/o exterminar células existentes de cáncer, puede ser citostático y/o citotóxico. La reducción de estos signos o síntomas también puede sentirse o percibirse por el paciente. Los parámetros anteriores para estimar tratamiento y mejora exitosos en la enfermedad, se miden fácilmente por procedimientos rutinarios familiares o aún médicos. Para terapia de cáncer, la eficacia puede medirse, por ejemplo al estimar el tiempo para avance de la enfermedad (TTP) y/o determinar la velocidad de respuesta (R ) . La metástasis puede determinarse al preparar pruebas y por exploración de hueso y pruebas para el nivel de calcio y otras enzimas para determinar la dispersión al hueso. Exploraciones CT también pueden realizarse para buscar dispersión a la pelvis y nodos linfáticos en el área. Rayos X de pecho y medición de niveles de enzima en el hígado por métodos conocidos se utilizan para buscar metástasis a los pulmones e hígado, respectivamente. Otros métodos rutinarios para supervisar la enfermedad incluyen ultra sonografía tranrectal (TRUS) vía transrectal (TRUS= transrectal ultrasonography) y biopsia con aguja transrectal (TRND= transrectal leedle biopsy) . Para cáncer de vejiga, que es un cáncer más localizado, métodos para determinar avance de la enfermedad incluyen evaluaciones sicológica ordinaria por citoscopia, supervisando la presencia de sangre en la orina, visualización del tracto uroterial por sonografía o un pielograma intravenoso, tomografía por computadora (CT= computer tomography) y formación de imagen por resonancia magnética (MRI) . La presencia de las metástasis distantes puede estimarse por CT del abdomen, rayos X de pecho, o formación de imagen de radionúclidos del esqueleto. Administración "crónica" se refiere a la administración del o los agentes en un modo continuo en oposición a un modo agudo, para mantener el espectro (actividad) terapéutico inicial por un periodo prolongado de tiempo. Administración "intermitente" es el tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupción, sino más bien es de naturaleza cíclica. "Mamífero" para propósitos del tratamiento de, aliviar los síntomas de, o diagnóstico de un cáncer, se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológicos, deportivos o mascotas tales como perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. De preferencia el mamífero es humano. Administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden . "Portadores" como se emplea aquí incluyen portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables, que no son tóxicos a la célula o mamífero expuesto a los mismos a las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una solución amortiguadora de pH acuosa. Ejemplos de los portadores fisiológicamente aceptables incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulina; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina, o lisina; monosacáridos ; disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcar alcoholes tales como manítol o sorbitol; contra iones formadores de sal tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEENMR, polietilen glicol (PEG) , y PLURONICSMR. Por "fase sólida" o "soporte sólido" se entiende una matriz no acuosa a la cual un anticuerpo, oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT de la presente invención puede adherirse o conectarse. Ejemplos de fases sólidas abarcadas aquí incluyen aquellas formadas parcial o totalmente de vidrio (por ejemplo vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo agarosa) , poliacrilamidas , poliestireno, alcohol polivinílico y silicona. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pozo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación, (por ejemplo una columna de cromatografía por afinidad) . Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como aquellas descritas en la patente de los E.U.A. No. 4,275,149. Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante que es útil para suministrar una droga (tal como un polipéptido TAT, un anticuerpo del mismo, o un poligopéptido de enlace TAT) a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación bicapa similar al arreglo de lípidos de membranas biológicas. Una molécula "pequeña" o molécula orgánica se define aquí que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 500 Daltons.
Una "cantidad efectiva" de un polipéptido, anticuerpo, oligopeptido de enlace TAT, molécula orgánica de enlace TAT o un antagonista o agonista de los mismos como se describe aquí, es una cantidad suficiente para levar a cabo un propósito específicamente establecido. Una "cantidad efectiva" puede determinarse empíricamente y en forma rutinaria relación a propósito establecida. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipéptido, oligopéptido enlace TAT, molécula orgánica de enlace TAT u otra droga efectiva para "tratar" una enfermedad, un desorden en un sujeto o mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapeutcamente efectiva de la droga puede reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir frenar en cierta proporción y de preferencia parar) la infiltración de células de cáncer en órganos periféricos; inhibir (es decir frenar en cierta proporción y de preferencia parar) la metástasis del tumor; inhibir, en cierta proporción, el crecimiento del tumor; y/o aliviar en cierta proporción uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. La definición presente de "tratar" . En la extensión la droga puede evitar el crecimiento y/exterminar células de cáncer existentes, puede ser citostática y/o citotóxica.
Una "cantidad inhibitoria de crecimiento" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT, oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de la célula, especialmente de tumor, por ejemplo células de cáncer, ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad inhibitoria de crecimiento" y un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT, oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT para los propósitos de inhibir el crecimiento de células no plásticas puede determinarse empíricamente y en una forma rutinaria. Una "cantidad citotóxica" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT, oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT es una cantidad capaz de provocar la destrucción de la célula, especialmente tumor, por ejemplo célula de cáncer, ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad citotóxica" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT, oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT para propósitos de inhibir crecimiento celular no plástico puede determinarse empíricamente y en forma rutinaria. El término "anticuerpo" se emplea en el sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo anticuerpos monoclonales anti-TAT sencillos (incluyendo agonista, antagonista y anticuerpos neutralizantes) , composiciones de anticuerpo anti -TAT con especificidad polietópica, anticuerpos policlonales , anticuerpos anti-TAT de cadena sencilla y fragmentos de anticuerpos anti-TAT (ver a continuación) siempre que exhiban la actividad biológica o inmunológica deseada. El término " inmunoglobulina" (Ig) se emplea en forma intercambiable con anticuerpo aquí. Un "anticuerpo aislado" es aquél que se ha identificado y separado y/recuperado y un componente de su ambiente natural. Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con usos de diagnóstico terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más de 95% en peso de anticuerpo, se determina por el método Lowry, y más preferiblemente más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de amino ácido interna o N-terminal o por el uso de un secuenciador de copa giratoria, o centrifugada o (3) a homogeneidad por SDS page bajo condiciones de reducción o no reducción utilizando azul de Coomassie o de preferencia tinción con plata. Anticuerpo aislado incluye un anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo anticuerpo aislado se preparará por cuando menos una etapa de purificación. La unidad de anticuerpo de cadena básico 4 es una glicoproteína heterotetramédica compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consiste de cinco de las unidades heterotetraméricas básicas junto con un polipéptido adicional denominado cadena J y por lo tanto contiene 10 sitios de enlace de antígeno, mientras que anticuerpos IgA secretados pueden polimerizarse para formar asi polivalentes que comprenden 25 de las 4 unidades de cadena básicas junto con la cadena J) . En el caso de IgGs, las cuatro unidades de cadena generalmente son de aproximadamente 150,000 daltons. Cada cadena L se enlaza a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están enlazadas entre si por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también tienen fuentes disulfuro intracadena espaciadas regularmente. Cada cadena H tiene en el extremo N, un dominio variable (VH) seguido por tres dominios constantes (CH) por cada una de las cadenas alfa y gamma y cuatro dominios CH para isotipos mu y épsilón. Cada cadena L tiene en el extremo L un dominio variable (VL) seguido por un dominio constante (CL) en su otro extremo. El VL se alinea con VH y el CL se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) . Residuos amino ácidos particulares se considera que forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El apareamiento o formación de par de VH y VL juntos forman un sitio de enlace de antígeno sencillo. Para la estructura y propiedades de las clases diferentes de anticuerpos, ver por ejemplo Basic and Clinical Immunology, (Inmunología Básica y Clínica) octava edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y capítulo 6. La cadena L de cualquier especie vertebrada puede ser asignada o uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, con base en las secuencias de amino ácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH) , las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, que tienen cadenas pesadas designadas alfa, beta, épsilon, gamma, y mu, respectivamente. Las clases gamma y alfa más se dividen en subclases en base a diferencias relativamente menores en secuencia y función CH, por ejemplo los humanos expresan las siguientes subclases: IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4, IgAl, y IgA2. El término variable se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpo. El dominio V media enlace de antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de la extensión de 110 aminoácidos de los dominios variables. En su lugar, las regiones V consisten de tramos relativamente invariantes denominadas regiones de marco (FRs) de 15 a 30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas "regiones hipervariables " que son cada una de 9 a 12 aminoácidos de largo. Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligera nativas cada una comprenden 4 FRs, adoptando substancialmente una configuración de hoja beta conectada por tres regiones hipervariables que forman bucles conectando, y en algunos casos formando parte de, la estructura de hoja beta. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen unidas en proximidad inmediata por los FRs y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación de sitio de enlace de antígeno de anticuerpos (Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest (Secuencias de proteínas de interés inmunológico) , Quinta Edición. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ) . Los dominios constantes no están involucrados directamente para enlazar un anticuerpo con un antígeno, pero exhibe diversas funciones efectuadas tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC = Antibody dependent cellular cytoxicity) . El término "región hipervariable " cuando se utiliza aquí se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables por el ácido antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos aminoácido de "región para determinar complementariedad" o "CDR" (por ejemplo alrededor de aproximadamente residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en VL, y aproximadamente 1-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en VH; Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico) 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable", (por ejemplo los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el VL, y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el VH; Chothia y Lesk J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)).
El término "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones de origen natural posibles, que pueden estar presentes en cantidades menores. Anticuerpos monoclonales son altamente específicos, se dirigen contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con reparaciones de anticuerpo policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que pueden sintetizarse sin contaminación por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no se considerará que requiera producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención puede prepararse por la metodología de hibridoma y luego descrita por Kohler y colaboradores, Nature, 256:495 (1975) , o puede elaborarse utilizando métodos de ADN recombinante en células bacterianas, eucarióticas de animales o plantas (por ejemplo ver, Patente de los E.U.A. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden mencionarse de bibliotecas de anticuerpo fago utilizando las técnicas descritas por Clackson y colaboradores, Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y colaboradores, J. Mol. Biol . , 222:581-597 (1991) , por ej emplo . Los anticuerpos monoclonales presentes incluyen anticuerpos "quiméricos" en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenece a una subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto del lado las cadenas es idéntico con u homólogo con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra clase o subclase de anticuerpo así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre que exhiben la actividad biológica deseada (ver Patente de los E.U.A. No. 4,816,567; y Morrison y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 8JL: 6851-6855 (1984)) . Anticuerpos quiméricos de interés aquí incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de enlace de antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo Mono del Viejo Mundo, Simio, etc.), y secuencias de revisión constante humanas . Un anticuerpo "intacto" es aquél que comprende un sitio de enlace de antígeno así como un CL y cuando menos dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de secuencia nativa humana) o su variante secuencia aminoácido. De preferencia, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras. "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, de preferencia la región variable o de enlace antígeno del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab' , F(ab')2/ Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (ver la Patente de los E.U.A. No. 5,641,870, Ejemplo 2 Zapata y colaboradores, Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]),- moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. Digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", y un fragmento "Fe" residual, una designación que refleja la capacidad por cristalizarse fácilmente. El fragmento Fab consiste de una cadena L completa junto con un dominio de región variable de la cadena H (VH) , y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1) . Cada fragmento Fab es monoalente con respecto al enlace de antígeno, es decir, tiene un sólo sitio de enlace de antígeno. Tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un solo fragmento grande F(ab')2 que corresponde aproximadamente con dos fragmentos Fab enlazados disulfuro que tienen actividad de enlace de antígeno bivalente y es capaz de entrelazar antígeno. Fragmentos Fab' difieren de fragmentos Fab al tener unos cuantos residuos adicionales en el extremo carboxi de "CH1 incluyendo uno o más cisteínas de la región bisagra anticuerpo. Fab'-SH es la designación presente para Fab1 en donde en o los residuos cisteína de los dominios constantes contienen un grupo tiol libre. Fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo también se conocen. El fragmento Fe comprende las porciones carboxi -terminales de ambas cadenas H unidas en conjunto por disulfuros. Las funciones efectoras de anticuerpo se determinan por secuencias en la región Fe, esta región también es la parte reconocida por los receptores Fe (FcR) que se encuentran en ciertos tipos de células. "Fv" es el fragmento anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento- y enlace- antígeno completo. Este fragmento consiste de un dímero, de un dominio de región variable de cadena pesada y/o de cadena ligera en una asociación cerrada, no-covalente . Del plegado de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (tres bucles de cada uno de cadena H y L) que contribuyen a los residuos aminoácidos por el ácido antígeno y contienen especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo 3 CDRs específicos para un antígeno) tiene la capacidad por reconocer y ligar el antígeno, aunque a una afinidad inferior que el sitio de enlace completo. "Fv de cadena sencilla" también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados en una sola cadena polipéptido. De preferencia, el polipéptido sFv además comprende un enlazador polipéptido entre los dominios VH y VL que permiten al sFv formar la estructura deseada para enlace de antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies (La farmacología de anticuerpos monoclonales) , vol . 113, Rosenburg y Moore eds . , Springer-Verlag, New York, págs . 269-315 (1994) ; Borrebaeck 1995, arriba. El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo preparados al construir fragmentos sFv (ver párrafo precedente) con enlazadores cortos (aproximadamente 5 a 10 residuos) entre los dominios Vh y VL tal que la formación de pares intercadena pero no intracadena de los dominios V se logra, y resultando en un fragmento equivalente, por ejemplo fragmento que tiene dos sitios de enlace de antígeno. Diacuerpos diespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "de cruce", en donde los dominios de VH y VL de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipéptido. Diacuerpos se describen más completamente por ejemplo en EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 90 :6444-6448 (1993) . Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen mínima secuencia derivada del anticuerpo no humano. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en donde residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tales como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen la deseada especificidad y capacidad de anticuerpo. En algunas instancias, a residuos de región de marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el desempeño de anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables en donde todo o substancialmente todo de los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o substancialmente todos los FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá cuando menos una porción y una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para adicionar detalles ver Jones y colaboradores, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op . Struct. Biol . 2 :593-596 (1992) . Un "anticuerpo dependiente de especie", por ejemplo un anticuerpo IgE antihumano mamífero es un anticuerpo que tiene una más fuerte actividad de enlace para un antígeno de una primer especie mamífera que para un homólogo de ese antígeno de una segunda especie mamífera. Normalmente, el anticuerpo dependiente de especie "se liga específicamente" a un antígeno humano (es decir tiene un valor de actividad de enlaze (Kd) no mayor a 1 x 10~7 M, de preferencia no mayor a aproximadamente 1 x 10"8 y más preferiblemente no mayor a a aproximadamente 1 x 10"9 ) pero tiene una actividad de enlace para un homólogo del antígeno de una segunda especie mamífera no humana que es al menos de aproximadamente 50 veces, o cuando menos aproximadamente 500 veces, o cuando menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de enlace para el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de especie puede ser cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos como se define anteriormente pero de preferencia es un anticuerpo humanizado o humano. Un "oligopéptido de enlace TAT" es un oligopéptido que liga, de preferencia específicamente a un polipéptido TAT como se describe aquí. Oligopéptidos de enlace TAT pueden sintetizarse químicamente utilizando metodología de síntesis de oligopéptidos conocida o pueden prepararse y purificarse utilizando tecnología recombinante . Oligopéptidos de enlace TAT usualmente son al menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 , 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 aminoácidos de longitud o más , en donde estos oligopéptidos son capaces de ligar, de preferencia específicamente a un polipéptido TAT como se describe aquí. Oligopéptidos de enlace TAT pueden identificarse sin indebida experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se nota que técnicas para monitorear bibliotecas de oligopéptidos que son capaces de enlazar específicamente a un objetivo polipéptido son bien conocidos en la especialidad (ver por ejemplo las patentes de los E.U.A. Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publicaciones del PCT Nos. WO 84/03506 y O84/03564; Geysen y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. U.S. A., 81:3998 4002 (1984); Geysen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 82:178 182 (1985) ; Geysen y colaboradores, en "Synthetic Peptides as Antigens" (Péptidos sintéticos como antígenos) , 130-149 (1986) ; Geysen y colaboradores, J. Immunol . Meth. , 102:259 274 (1987); Schoofs y colaboradores, J. Immunol., 140:611 616 (1988), Cwirla, S. E. y colaboradores (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. y colaboradores (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. y colaboradores (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. y colaboradores (1991), J. Mol. Biol . , 222:581; Kang, A.S. y colaboradores (1991) Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2 : 668) . Una "molécula orgánica de enlace TAT" es una molécula orgánica diferente a un oligopéptido o anticuerpo como se define aquí que liga, de preferencia específicamente a un polipéptido TAT como se describe aquí. Moléculas orgánicas de enlace TAT pueden ser identificadas y sintetizadas químicamente utilizando metodología conocida (ver por ejemplo las publicaciones del PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Moléculas orgánicas de enlace TAT usualmente son menos de aproximadamente 2000 daltons en tamaño, en forma alterna menores a aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltons en tamaño, en donde estas moléculas orgánicas que son capaces de enlazar, de preferencia específicamente a un polipéptido TAT como se describe aquí, pueden identificarse sin indebida experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se nota que técnicas para monitorear bibliotecas de moléculas orgánicas por moléculas que son capaces de enlazar a un objetivo polipéptido son bien conocidas en la especialidad ver por ejemplo las publicaciones del PCT Nos. WOOO/00823 y WOOO/39585) . Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "liga" un antígeno de interés, por ejemplo un blanco de antígeno de polipeptido asociado a tumor, es aquél que liga el antígeno con suficiente afinidad de manera tal que el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica sea útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico para hacer blanco una célula o tejido que expresa el antígeno, y no reacciona en forma cruzada significativamente con otras proteínas. En estas modalidades, la extensión de enlace del anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica con una proteína "no objetivo" será menos de aproximadamente 10% del enlaze del anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica a su proteína objetiva particular como se determina por análisis de monitoreación celular activado por fluorescencia (FACS = Fluorescent Activated Cells) o radioinmunoprecipitación (RIA) . Con respecto al enlace de un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica con una molécula objetivo, el término "enlace específico" o "enlace específicamente con" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítope en un objetivo polipeptido particular, significa el enlace que es diferente medible de una interacción no específica. El enlace específico puede ser medido, por ejemplo al determinar el enlace de una molécula comparada con el enlace de una molécula de control, que generalmente es una molécula de estructura similar que tiene actividad de enlace. Por ejemplo, el enlace específico puede ser determinado por competencia con una molécula de control que es similar al objetivo, por ejemplo un exceso de un objetivo no etiquetado. En este caso, el enlace específico se indica si el enlace del objetivo etiquetado a una sonda se inhibe en forma competitiva por un objetivo no etiquetado en exceso. El término "enlace específico" o "se enlaza específicamente a" o "es específico para" un particular polipéptido o un epítope en un objetivo polipéptido particular - como se emplea aquí- puede ser exhibido, por ej emplo , por una molécula que tiene una Kd para el objetivo de al menos aproximadamente 10"4 M en forma alterna al menos aproximadamente 10"5 M, en forma alterna al menos aproximadamente 1CT6 M, en forma alterna al menos aproximadamente io-7 M, en forma alterna al menos aproximadamente 1CT8 M, en forma alterna al menos aproximadamente 1CT9 M, en forma alterna al menos aproximadamente lO"10 M, en forma alterna al menos aproximadamente 1CT11 M, en forma alterna al menos aproximadamente 1CT12 M, o mayor. En una modalidad, el término "enlace específico" se refiere al enlace donde una molécula se enlaza o liga con un polipéptido o epítope particular en un polipéptido particular, sin ligar o enlazar substancialmente a cualquier otro polipéptido o epítope polipéptido. Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "inhibe el crecimiento de células de tumor que expresan un polipéptido TAT" o un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica "inhibitoria de crecimiento" es una que resulta en una inhibición de crecimiento medible de células de cáncer que expresan o sobreexpresan el polipétido TAT apropiado. El polipéptido TAT puede ser un polipéptido transmembrana expresado en la superficie de una célula de cáncer o puede ser un polipéptido que se produce y secreta por una célula de cáncer. Los anticuerpos, los oligopéptidos o las moléculas orgánicas anti-TAT o inhibidores de crecimiento preferidos, inhiben el crecimiento de células de tumor que expresan TAT en más de 20%, de preferencia de aproximadamente 20 a aproximadamente 50%, y aún más preferible en más de 50% (por ejemplo aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) en comparación con el control apropiado, el control típicamente son células de tumor que no se tratan con el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que se prueba. En una modalidad, la inhibición de crecimiento puede medirse a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.1 a 30 /xg/ml o aproximadamente 0.5 nM a 200 nM en cultivo celular, en donde la inhibición de crecimiento se determina 1-10 días después de exposición de las células de tumor al anticuerpo. La inhibición de crecimiento de las células de tumor in vivo puede determinarse en varias formas tales como se describe en la sección de ejemplos experimentales a continuación. El anticuerpo es inhibidor de crecimiento in vivo y la administración del anticuerpo anti-TAT de aproximadamente 1 /¿g/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, resulta en reducción en tamaño de tumor o proliferación de células de tumor dentro de aproximadamente 5 días a tres meses de la primera administración del anticuerpo, de preferencia de aproximadamente 5 a 30 días. Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "induce apoptosis" es aquel que induce muerte celular programada como se determina al enlazar anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento de células, dilatación de retículo endoplásmico, fragmentación de células y/o formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos apoptósicos) . La célula usualmente es aquella que sobreexpresa un polipéptido TAT. De preferencia, la célula es una célula de tumor, por ejemplo una célula de próstata, mama, ovario, estómago, endometrio, pulmón, riñon, colon, vejiga. Diversos métodos están disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con apoptosis. Por ejemplo, traslocación de fosfatidil serina (PS) puede medirse por enlace de anectina; la fragmentación de ADN puede evaluarse a través de escalonamiento de ADN; y condensación nuclear/cromatina junto con la fragmentación de ADN puede evaluarse por cualquier incremento en células hipodiploides . De preferencia, el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que induce apoptosis es aquel que resulta en aproximadamente 2 a 50 veces, de preferencia aproximadamente 5 a 50 veces, y más preferible aproximadamente 10 a 50 de inducción de enlace de anexina respecto a célula no tratada y en un ensayo de enlace de anexina. Las "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas que se atribuyen a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o región Fe variante de secuencia de aminoácido) de un anticuerpo, y varía con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: enlace de Clq y citotoxicidad dependiendo de complemento; enlace receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B) ; y activación de célula B. La " citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en donde Ig detectado ligado en receptores Fe (FcRs) presenta en ciertas células citotóxicas (por ejemplo células destructoras naturales (NK = Natural Killer, neutrofilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas liguen específicamente a una célula objetivo que contiene antígeno y subsecuentemente extermina la célula objetivo con citotoxina. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y se requieren absolutamente para este exterminio. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FcgammaRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcgammaRI , FcgammaRII y FcgammaRIII. La expresión FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . , 9:457-92 (1991) . Para estimar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo ADCC in vi tro, tal como el descrito en las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,500,362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PB C = peripheral blood mononuclear cells) y células destructoras naturales (NK) . En forma alterna, o adicionalmente , la actividad ADCC de la molécula de interés puede estimarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito por Clynes y colaboradores (USA) 95:652-656 (1998) . El "Receptor Fe " o "FcR" describe un receptor que liga a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Aún más, un FcR preferido es aquel que liga un anticuerpo IgG (un receptor gama) e incluye receptores de las sub-clases y FcgammaRI , FcgammaRII y FcgammaRIII, incluyendo variantes alélicas y formas de escición alternativamente de estos receptores. Receptores FcgammaRII incluyen FcgammaRI IA (un receptor de "activación") y FcgammaRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen similares secuencias de aminoácidos que difieren primordialmente en sus dominios citoplásmicos . El receptor de activación FcgammaRIIA contiene un motivo de activación basado en inmuno receptor tirosina (ITAM = tyrosine-based activation motif) en su dominio citoplásmico . El receceptor de inhibición FcgammaRIIB contiene un motivo inhibidor basado en inmuno receptor tirosina y (ITIM immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) en su dominio citoplásmico (ver la revisión por . en Daéron, Annu. Rev. Inmuno1. 15:203-234 (1997)). FcRs se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel y colaboradores, Im unomethods (Inmuno métodos) 4 : 25-34 (1994); y de Haas y colaboradores, J\_ Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo aquellos que se identificarán en el futuro, están abarcados por el término "FcR" aquí. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable por la transferencia de IgGs maternales al feto (Guyer y colaboradores, J. Immunol . 117:587 (1976) and Kim y colaboradores, J. Immunol . 24:249 (1994)). Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcgammaRIII y realizan función efectoras ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células destructoras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos ; con células PBMCs y NK preferidas. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo de la sangre. La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en la presencia de complemento. La activación de la ruta de complemento clásica se inicia al ligar el primer componente del sistema de complemento (Clq) con anticuerpos (de la sub-clase apropiada) que se ligan a su antígeno connato. Para estimar activación de complemento, puede realizarse un ensayo CDC por ejemplo, como se describe por Gazzano-Santoro y colaboradores, J. Inmuno1. Methods 202 : 163 (1996). Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o malignidades linfoides. Más ejemplos particulares de estos cánceres incluyen cáncer en la célula escamosa (por ejemplo cáncer en la célula escamosa epitelial) , cáncer de pulmón incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular , cáncer gástrico o estomacal incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorectal, carcinoma uterino o endometrial, carcinoma de glándula salivar, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer tiroideo, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, melanoma, mieloma múltiple, y linfoma de células B, cáncer de cerebro así como de la cabeza y del cuello, y metástasis asociadas . Los términos "desorden proliferativo celular" y "desorden proliferativo" se refieren a desórdenes que están asociados con algún grado de proliferación celular anormal. En una modalidad, el desorden de proliferación celular es cáncer. "Tumor", como se emplea aquí, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásticas, ya sea maligno o benigno, y todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos . Un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica que "induce muerte celular" es aquel que provoca que una célula viable se vuelva no viable. La célula es aquella que expresa un polipéptido TAT, de preferencia una célula que sobre expresa un polipéptido, TAT en comparación con una célula normal del mismo tipo de tejido. El polipéptido TAT puede ser un polipéptido de transmembrana expresado en la superficie de una célula de cáncer o puede ser un polipéptido que se produce y secreta por una célula de cáncer. De preferencia, la célula es una célula de cáncer, por ejemplo una célula de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñon, colon, tiroides, pancreática o de vejiga. La muerte celular in vi tro puede determinarse en la ausencia de complemento y células inmunoefectoras para distinguir la muerte celular inducida por citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . De esta manera, el ensayo para muerte celular puede realizarse utilizando suero inactivado con calor (es decir, en la ausencia de complemento) y en la ausencia de células inmuno efectoras. Para determinar si el anticuerpo, el oligopéptido u otra molécula orgánica es capaz de inducir muerte celular, la pérdida de integridad de membrana como se evalúa por la absorción de yoduro de propidio (PI) , azul de triptano (ver Moore y colaboradores, Cytotechnology ( Ci to ecnología) 17:1-11 (1995)) o 7AAD puede estimarse respecto a las células no tratadas. Los anticuerpos que inducen muerta celular, los oligopéptidos preferidos u otras moléculas orgánicas son aquellas que inducen absorción de PI en el ensayo de absorción PI en células BT474. Una "célula que expresa TAT" es una célula que expresa a un polipéptido TAT endógeno o transfectado ya sea en la superficie de la célula o en una forma secretada. Un "cáncer que expresa TAT" es un cáncer que comprende células que tiene un polipéptido de TAT presente en la superficie celular o que produce y secreta un polipeptido TAT. Un "cáncer que expresa TAT" opcionalmente produce suficientes niveles de polipéptido TAT en la superficie de sus células, de manera tal que un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido u otra molécula orgánica puede ligarse y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. En otra modalidad, un "cáncer de expresión de TAT" opcionalmente produce y secreta suficientes niveles de polipéptido TAT de manera tal que un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica anti-TAT antagonista puede ligarse al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. Con respecto a este último, el antagonista puede ser un oligonucleótido antisentido que reduce, inhibe o evita la producción y secreción del polipéptido TAT secretado por células de tumor. Un cáncer que "sobre expresa" un polipéptido TAT es aquel que tiene niveles significativamente superiores del polipéptido TAT en superficie celular, o produce y secreta en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Esta sobre expresión puede ser provocada por amplificación de genes, o por transcripción o traducción incrementada. La sobre expresión de polipéptido TAT puede determinarse en un ensayo de diagnóstico o pronóstico al evaluar niveles incrementados de la proteína TAT presente en la superficie de una célula, o secretada por la célula (por ejemplo mediante un ensayo de inmuno histoquímica utilizando anticuerpos anti-TAT preparados contra un polipéptido TAT aislado que puede prepararse utilizando tecnología de ADN recombinante , a partir de un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido TAT; análisis FACS, etc.). En forma alterna o adicionalmente , se pueden medir niveles del ácido nucleico que codifica polipéptidos TAT o mARN en la célula, por ejemplo mediante hibridización in situ fluorescente utilizando una sonda basada en ácido nucleico que corresponde a un ácido nucleico que codifica TAT o su complemento; (FISH; ver WO 98/45479 publicada en octubre, 1998) , Técnica Southern, técnica Northern o reacción de cadena polimerasa (PCR = Polymerase Chain Reaction) ) técnicas, tal como PCR cuantitativo en tiempo real (RT-PCR) . También se puede estudiar sobre expresión de polipéptido TAT por medición de antígeno de muda en un fluido biológico tal como suero, por ejemplo utilizando ensayos basados en anticuerpo (ver también, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 4,933,294 otorgada en junio 12, 1990; O91/05264 publicada en abril 18, 1991; la Patente de los E.U.A. No. 5,401,638 otorgada en marzo 28, 1995; y Sias y colaboradores, J. Immunol . Methods 132:73-80 (1990)). Aparte de los ensayos anteriores, están disponibles diversos ensayos in vivo para el practicante con destreza. Por ejemplo, se pueden exponer células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que está opcionalmente etiquetado con una etiqueta detectable, por ejemplo, un isótopo radioactivo y puede evaluarse la unión o enlace del anticuerpo con las células en el paciente, por ejemplo, por exploración externa de radioactividad o análisis de una biopsia tomada a un paciente previamente expuesto al anticuerpo. Como se emplea aquí, el término " inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpo que combinan la especificidad de enlace de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina . Estructuralmente, la inmunoadhesina comprende una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de enlace deseada que es diferente al sitio de enlace y reconocimiento de antígeno de un anticuerpo (es decir "heterólogo" ) y una secuencia dominios constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de enlace de un receptor o un ligando. La secuencia dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina tal como los sub-tipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, o ígG-4, IgA (incluyendo IgA-1 y IgA-2) , IgE, IgD o IgM. La palabra "etiqueta" cuando se emplea aquí, se refiere a un compuesto o composición detectables, que se conjuga directa o indirectamente para generar un anticuerpo anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica "etiquetada". La etiqueta puede ser detectable por si misma (por ejemplo etiquetas de radioisótopo o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, pueden catalizar alteración química de un compuesto o composición substrato que es detectable. El término "agente citotóxico", como se emplea aquí, se refiere a una substancia que inhibe o evita la función de células y/o provoca destrucción de la célula. El término se pretende que incluya y isótopos adhesives (por At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimio terapéuticos, por ejemplo metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina , vinblastina, etoposido) , doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y sus fragmentos, tales como enzimas nucleoliticas antibióticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano fungal de placas o animales, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos, y los diversos agentes antitumor o anticáncer descritos a continuación. Otros agentes citotóxicos se describen a continuación. Un agente tumoricida provoca destrucción de células de tumor . Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se emplea aquí, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula de cáncer que sobre expresa TAT ya sea in vitro o in vivo. De esta manera, el agente inhibidor de crecimiento puede ser aquel que reduce significativamente el por ciento de células que sobre expresan TAT fase S. Ejemplos de agentes inhibitorios de crecimiento incluyen agentes que bloquean avance del ciclo celular (en un sitio diferente a la fase S) , tales como agentes que inducen freno Gl y freno de fase M. Los bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos, e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido, y bleomicina. Aquellos agentes que frenan Gl también se derraman sobre el freno fase S, por ejemplo, agentes de alquilación de ADN tales como Tamoxifen y Prednisona, Dacarbazino, eclorethamina , Cisplatina, Metotrexato, 5-fluorouracil , y Ara-C. Mayor información puede encontrarse en The Molecular Basis of Cáncer (La Base Molecular del Cáncer) Mendelsohn e Israel, eds . , Capítulo 1; con título "Cell cycle regulation, oncogens , and antineoplastic drugs" (Regulación de ciclo celular, oncogenes y drogas antíneoplásticas) por Murakami y colaboradores {WB Saunders : Philadelphia, 1995), especialmente en la página 13. Los taxanos (Paclitaxel y Docetaxel) son drogas anticáncer tanto derivadas del árbol yew. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del vew Europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . El Paclitaxel y el docetaxel promueven el armado de microtúbulos de dímeros de tubulina y estabilizan microtúbulos al evitar despolimerización que resulta en inhibición de mitosis en células . "Doxorubicina" es un antibiótico de antraciclina . El nombre químico completo de doxorubicina es (8S-cis) -10- [ (3-amino-2 , 3 , 6-trideoxi-alfa-L-lixo-hexapiranosilo) oxi] -7,8,9, 10-tetrahidro-6 ,8,1 l-trihidroxi-8- (hidroxiacetil ) -l-metoxi-5 , 12-naftacendiona . El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan en otras células como mediadores intercelulares. Ejemplos de estas citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas de polipéptidos tradicionales. Incluidos entre las citocinas están las hormonas del crecimiento tal como hormona de crecimiento humano, hormona de crecimiento humano N-metionilo, y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroide ; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; pro-relaxina hormonas de glicoproteína tales como hormona de estímulo de folículos (FSH = Follicle Stimulating Hormone) , hormona estímulo de tiroide (TSH = Thyroid Stimulating Hormone) y hormona luteinizante (LH = Luteinizing Hormone); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno de placenta; factores alfa y beta de necrosis de tumor; sustancia inhibidora muleriana; péptido asociado con gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento de nervios tales como NGF-beta; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento de transformación (TGFs) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factores de crecimiento tipo insulina I y II; eritropoyetina (EPO) ,- factores osteoinductivos ; interferonas tales como interferona-alfa, -beta y -gama; factores estimuladores de colonias (CSFs) , tales como CSF-macrófago ( -CSF) ; CSF- de granulocito-macrófago (GM-CSF) ; y CSF-granulocito (G-CSF) ; interleucinas (ILs) tales como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9 , IL- 11 , IL-12; un factor de necrosis de tumor tal como TNF-alfa o TNF-beta,-y otros factores de polipéptido que incluyen LIF y ligando de equipo (KL = Kit Ligand) . Como se emplea aquí, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante , y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa. El término "inserto de empaque" se emplea para referirse a instrucciones usualmente incluidas en empaques comerciales de productos terapéuticos que contienen información respecto a las especificaciones, uso, dosis, administración, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de estos productos terapéuticos . Tabla 1 /* *C-C incremento de 12 a 15 *Z es promedio de EQ *B es promedio de ND ^correspondencia con parada es _M; stop-stop = 0; J (joker) match =0 */ #define _M -8 /*valor de una correspondencia con una parada */ int _day[26][26] = { /* A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z */ /* A */ { 2, 0,-2, 0, 0,-4, 1,-1,-1, 0,-1,-2,-1, 0,_M, 1, 0,-2, 1, 1, 0, 0,-6, 0,-3, 0}, /* B */ { 0, 3,-4, 3, 2,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 2,_M,-1, 1, 0, 0, 0, 0,-2,-5, 0,-3, 1}, /* C */ {-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2, 0,-5,-6,-5,-4,_M,-3,-5,-4, 0,-2, 0,-2,-8, 0, 0,-5}, /* D */ { 0, 3,-5, 4, 3,-6, 1, 1,-2, 0, 0,-4,-3, 2,_M,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 2}, /* E */ { 0, 2,-5, 3, 4,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 1,_M,-1, 2,-1, 0, 0, 0,-2,-7, 0,-4, 3}, /* F */ {-4,-5,-4,-6,-5, 9,-5,-2, 1, 0,-5, 2, 0,-4,_M,-5,-5,-4,-3,-3, 0,-1, 0, 0, 7,-5}, /* G */ { 1, 0,-3, 1, 0,-5, 5,-2,-3, 0,-2,-4,-3, 0,_M,-l,-l,-3, 1, 0, 0,-1,-7, 0,-5, 0}, /* H */ {-1, 1,-3, 1, 1,-2,-2, 6,-2, 0, 0,-2,-2, 2,_M, 0, 3, 2,-1,-1, 0,-2,-3, 0, 0, 2}, /* I */ {-1,-2,-2,-2,-2, 1,-3,-2, 5, 0,-2, 2, 2,-2,_M,-2,-2,-2,-l, 0, 0, 4,-5, 0,-1,-2}, 1* *1 { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, /* K */ {-1, 0,-5, 0, 0,-5,-2, 0,-2, 0, 5,-3, 0, 1,_M,-1, 1, 3, 0, 0, 0,-2,-3, 0,-4, 0}, /* L */ {-2,-3,-6,-4,-3, 2,-4,-2, 2, 0,-3, 6, 4,-3,_M,-3,-2,-3,-3,-l, 0, 2,-2, 0,-1,-2}, /* M */ {-1,-2,-5,-3,-2, 0,-3,-2, 2, 0, 0, 4, 6,-2,_M,-2,-l, 0,-2,-1, 0, 2,-4, 0,-2,-1}, /* N */ { 0, 2,-4, 2, 1,-4, 0, 2,-2, 0, 1,-3,-2, 2,_M,-1, 1, 0, 1, 0, 0,-2,-4, 0,-2, 1}, /* O */ {_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M, 0,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M}, /* P */ { 1,-1,-3,-1,-1,-5,-1, 0,-2, 0,-l,-3,-2,-l,_M, 6, 0, 0, 1, 0, 0,-1,-6, 0,-5, 0}, /* Q */ { 0, 1,-5, 2, 2,-5,-1, 3,-2, 0, 1,-2,-1, 1,_M, 0, 4, 1,-1,-1, 0,-2,-5, 0,-4, 3}, /* R */ {-2, 0,-4,-1,-1,-4,-3, 2,-2, 0, 3,-3, 0, 0,_M, 0, 1, 6, 0,-1, 0,-2, 2, 0,-4, 0}, /* S */ { 1, 0, 0, 0, 0,-3, 1,-1,-1, 0, 0,-3,-2, 1,_M, 1,-1, 0, 2, 1, 0,-1,-2, 0,-3, 0}, /* T */ { 1, 0,-2, 0, 0,-3, 0,-1, 0, 0, 0,-1,-1, 0,_M, 0,-1,-1, 1, 3, 0, 0,-5, 0,-3, 0}, /* U */ { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, /* V */ { 0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2, 4, 0,-2, 2, 2,-2,_M,-l,-2,-2,-l, 0, 0, 4,-6, 0,-2,-2}, /* W */ {-6,-5,-8,-7,-7, 0,-7,-3,-5, 0,-3,-2,-4,-4,_M,-6,-5, 2,-2,-5, 0,-6,17, 0, 0,-6}, /* X */ { 0, 0, O, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, O, 0, 0}, /* Y */ {-3,-3, 0,-4,-4, 7,-5, 0,-1 , 0,-4,-1,-2,-2,_?,-5,-4,-4,-3,-3, 0,-2, 0, 0, 10,-4}, 1* 1 *1 { 0, 1 ,-5, 2, 3,-5, 0, 2,-2, 0, 0,-2,-1, 1 ,_M, 0, 3, 0, 0, 0, 0,-2,-6, 0,-4, 4} }; /* */ ¿include < stdio.h > ¿include < ctype.h > ¿define MAXJMP 16 /* saltos máximos en una diag */ ¿define MAXGAP 24 /*no continué penalizando espacios más grandes que este */ ¿define JMPS 1024 /* saltos máximos en una ruta */ ¿define MX 4 /Aguarda si hay al menos MX-1 bases desde el último salto*/ define DMAT 3 /* valor de bases correspondientes */ ¿define DMIS 0 /* penalidad por bases que no coinciden*/ ¿define DINSO 8 /* penalidad por un espacio */ ¿define DINS1 1 /* penalida por base */ define PINSO 8 /* penalidad por un espacio */ ¿define PINS1 /* penalidad por residuo */ struct jmp { short n[MAXJMP]; /* tamaño de salto (neg for dely) */ unsigned short x[MAXJMP] ; /* no. base de salto en sec. x */ /* limita sec. a 2A 16 -1 */ diag { int score; /* marca el último salto */ long offset; /* desplazamiento de bloque previo short ijmp; /* actual índice de salto */ struct jmp jp; /* lista de saltos */ struct path { int spc; /* número de espacios delanteros*/ short n[JMPS]; /* tamaño de salto (espacio) */ int x[JMPS]; /* loe. de salto (último elem. antes de espacio) */ char *ofile; /* salida de nombre de archivo */ char *namex[2] ; /* nombres sec : getseqs() */ char *prog; /* prog nombre para mensajes de error */ char *seqx[2]; /* secs: getseqs() */ int dmax; /* mejor diag: nw() */ int dmaxO; /* final diag */ int dna; /* set if dna: main() */ int endgaps; /* ajusta si penaliza end gaps */ int gapx, gapy; /* total de espacios (gaps) en secs (seqs) */ int lenO, lenl ; /* seq lens */ int ngapx, ngapy; /* tamaño total de espacios (gaps) */ int smax; /* calif. máx: nw() */ int *xbm; /* mapa de bits para correspondencia */ long offset; /* desplazamiento actual en archivo jmp */ struct diag *dx; /* mantiene diagonals */ struct path PP[2] ; /* mantiene ruta para sec (seqs) */ char *calloc(), *malloc(), *index(), *strcpy(); char *getseq(), *g_calloc(); /* "programa de alineamiento Needleman-Wunsch * * uso: progs filel file2 * donde filel y file2 son dos secuencias de proteínas o dos dna. * Las secuencias pueden ser en mayúsculas o minúsculas y pueden contener ambiguidad * Cualquier línea que empiece con ';', '>' o ' < ' se ignora * Longitud máxima de archivo es 65535 (limitado por x corta sin firma en la estructura de salto) * Una secuencia con 1/3 o más de sus elementos ACGTU se considera que es DNA * Salida en el archivo "align.out" * * El programa puede crear un archivo temporal (tmp) en /tmp para mantener info respecto a traceback. * Versión original desarrollada bajo BSD 4.3 en una vax 8650 */ #mclude "nw.h" include "day.h" static _dbval[26] = { 1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0 }; static _pbval[26] = { 1, 2|(1< <('D'-'A,))|(1< <('N,-'A')), 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, OxFFFFFFF, 1< < 10, 1< < 11, 1< < 12, 1< < 13, 1< < 14, 1< <15, 1< <16, 1< <17, 1< <18, 1< < 19, 1< <20, 1< <21, 1< <22, 1< <23, 1< <24, 1< <25|(1< <(?,-?,))|(1< <('Q,-,A')) }; main(ac, av) main int ac; char *av[]; { prog = av[0]; if (ac ! - 3) { fprintf(stderr, "usage: %s filel file2\n", prog); fprintf(stderr, "where filel and file2 are two dna o two protein sequences. \n"); fprintf(stderr,"The sequences can be in upper- o lower-case\n"); fprintf(stderr,"Any lines beginning with ' ; ' o ' < ' are ignored\n"); fprintf(stderr, "Ourput is in the file \"align.out\"\n"); exit(l); } namex[0] = av[l]; namex[l] = av[2]; seqx[0] = getseq(namex[0], &len0); seqx[l] = getseq(namex[l], &lenl); xbm = (dna)? dbval : jpbval; endgaps = 0; /* 1 para penalizar endgaps */ ofile = "align.out"; /* archivo de salida */ nw(); /* llenar la matriz, obtener los posibles jmps */ readjmps(); /* obtener los actuales jmps */ print(); /* imprimir estadísticas, alineamiento */ cleanup(O); /* desligar cualesquiera archivos tmp */} /* realizar el alineamiento, regresar mejor marcador: main() * dna: valores en Fitch y Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983 * pro: PAM 250 valores * Cuando los marcadores son iguales, preferimos apareamientos incorrectos a cualq espacio, se prefiere * un nuevo espacio a extender un espacio en curso, y se prefiere u nespacio en seqx * a un espacio en seq y. */ nw() { char *px, *py; /* seqs y ptrs */ int *ndely, *dely; /* mantener seguimiento de dely */ int ndelx, delx; /* mantener seguimiento de delx */ int *tmp; /* para intercambio de rowO, row 1 */ int mis; /* marca para cada tipo */ int insO, insl ; /* inserción de penalidades */ register id; /* índice diagonal */ register ?; /* salta índice (jmp índex) */ register *col0, *coll; /* marca para actual, última hilera */ register xx, yy; /* índice en seqs */ dx = (struct diag *)g_calloc("to get diags" , lenO+lenl + 1 , sizeof(struct diag)); ndely = (int *)g_calloc("to get ndely" , lenl + 1 , sizeof(int)); dely = (int *)g_calloc("to get dely", lenl + 1 , sizeof(int)); colO = (int *)g_ca11oc("to get colO" , lenl + 1 , sizeof(int)); coll = (int *)g_calloc("to get coll ", lenl + 1, sizeof(int)); insO = (dna)? DINSO : PINSO; insl = (dna)? DINS1 : PINS1 ; smax = -10000; if (endgaps) { for (colO[0] = dely[0] = -insO, yy = 1; yy < = lenl ; yy + +) { colO[yy] = delyfyy] = colO[yy-l] - insl ; ndely[yy] = yy; } colO[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */ } else for (yy = 1 ; yy < = lenl; yy + +) dely[yy] = -insO; /* llena la matriz de apareamiento */ for (px = seqx[0], xx = 1 ; xx < = lenO; px+ + , xx+ +) { /* inicia primer entrada en col */ if (endgaps) { if (xx = = 1) coll[0] = delx = -(insO+insl); else coll[0] = delx = col0[0] - insl; ndelx = xx; } else { coll[0] = 0; delx = -insO; ndelx = 0; } ...nw for (py = seqx[l], yy = 1 ; yy < = lenl; py+ + , yy+ +) { mis = col0[yy-l]; if (dna) mis + = (xbm[*px-'A*]&xbm[*py-'A'])? DMAT : DMIS; else mis + = _day[*px-'A'][*py-'A']; /* actualiza penalización para del in x seq; * favorece nuevo del over ongong del * ignora MAXGAP si se ponderan endgaps */ ¡f (endgaps | | ndely[yy] < MAXGAP) { if (col0[yy] - insO > = dely[yy]) { dely[yy] = col0[yy] - (insO+insl); ndely[yy] = 1; } else { dely[yy] -= insl ; ndely[yy] + + ; } } else { if (col0[yy] - (insO+insl) > = dely[yy]) { dely[yy] = colO[yy] - (insO+insl); ndelyfyy] = 1 ; } else ndely[yy] + + ; } /* actualiza penalización para del in y seq; * favorece nuevo del over ongong del */ if (endgaps | | ndelx < MAXGAP) { if (coll[yy-l] - insO > = delx) { delx = coll [yy-l] - (insO+insl); ndelx = 1; } else { delx - = insl ; ndelx+ + ; } } else { if (coll[yy-l] - (insO+insl) > = delx) { delx = coll[yy-l] - (insO+insl); ndelx = 1 ; } else ndelx + + ; > /* selecciona el marcado máximo; favorecemos * mis sobre cualquier del y delx sobre dely ..nw id = xx - yy + lenl - 1; if (mis > = delx && mis > = dely[yy]) coll[yy] = mis; else if (delx > = dely[yy]) { coll[yy] = delx; ij = dx[id].ijmp; if (dx[id].jp.n[0] && (!dna | | (ndelx > = MAXJMP && xx > dx[id] .jp.x[ij] +MX) mis > dx[id] .score +DINSO)) { dx[id] .ijmp + + ; if ( + + ij > = MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id]. offset = offset; offset + = sizeof(struct sizeof(offset); } dx[id].jp.n[ij] = ndelx; dx[id].jp.x[ij] = xx; dx[id].score = delx; else { coll[yy] = dely[yy]; ij = dx[id].ijmp; if (dx[id].jp.n[0] && (!dna | | (ndely[yy] > = MAXJMP && xx > dx[id] .jp.x[ij] + MX) mis > dx[id].score + DINSO)) { dx[id].ijmp+ + ; if ( + +ij > = MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id] . offset = offset; offset + = sizeof(struct jmp) + sizeof (offset); } dx[id].jp.n[ij] = -ndely[yy]; dx[id] .jp.x[ij] = xx; dx[id] .score = dely[yy] ; } if (xx = = lenO && yy < lenl) { /* last col */ if (endgaps) coll[yy] - = insO + insl*(lenl-yy); if (coll[yy] > smax) { smax = collfyy]; dmax = id; } } } if (endgaps && xx < lenO) coll[yy-l] -= insO+insl*(lenO-xx); if (coll[yy-l] > smax) { smax = coll [yy-l]; dmax = id; } tmp = colO; colO = coll ; coll = tmp; } (void) free((char *)ndely); (void) free((char *)dely); (void) free((char *)colO); (void) free((char *)coll); } /* * * print() - solo rutina visible fuera de este módulo * * static: * getmat() -- seguimiento de regreso a la mejor ruta, cuenta apareamientos: print() * pr_align() - imprime alineamiento de lo descrito en hilera p[] : print() * dumpblock() - descarga un bloque de líneas con nñumeros, stars: pr_align() * nums() ~ extrae una línea de número: dumpblockQ * putline() — saca una línea (ñame, [num], seq, [num]): dumpblock() * stars() - -pon una línea de estrellas: dumpblock() * stripnameO ~ desmonta cualquier ruta y prefijo de un seqname */ #include "nw.h" define SPC 3 #deflne P_LINE 256 /* línea de salida máxima */ #defíne P_SPC 3 /* espacio entre ñame o num y seq */ extern _day[26][26] ; int olen; /* establece longitud de línea de salida */ FILE *fx; /* archivo de salida */ print() print { int lx, ly, firstgap, lastgap; /* traslapo */ if ((fx = fopen(ofile, "w")) = = 0) { fprintf(stderr, " %s: can't write %s\n", prog, ofile); cleanup(l); } fprintf(fx, " < first sequence: %s (length = d)\n" , namex[0] , lenO); fprintf(fx, " < second sequence: %s (length = %d)\n" , namex[l], lenl); olen = 60; lx = lenO; ly = lenl ; firstgap = lastgap = 0; if (dmax < lenl - 1) { /* espacio delantero en x */ pp[0].spc = firstgap = lenl - dmax - 1 ; ly - = pp[0] .spc; } else if (dmax > lenl - 1) { /* espacio delantero en y */ pp[l].spc = firstgap = dmax - (lenl - 1); lx - = pp[l] .spc; } if (dmaxO < lenO - 1) {/* espacio trasero en x */ lastgap = lenO - dmaxO -1; lx - = lastgap; } else if (dmaxO > lenO - 1) { /* espacio trasero en y */ lastgap = dmaxO - (lenO - 1); ly -= lastgap; } getmat(lx, ly, firstgap, lastgap); pr_align(); } /* * seguimiento de regreso a la mejor ruta, cuenta apareamientos */ static getmat(lx, ly, firstgap, lastgap) int lx, ly; /* "core" (minus endgaps) */ int firstgap, lastgap; /* traslapo delantero trasero { int nm, iO, il , sizO, sizl; char outx[32] ; double pct; register nO, nl ; register char *p0, *pl ; /* obtener total de apareamientos, marcador */ iO = il = sizO = sizl = 0; pO = seqx[0] + pp[l] .spc; pl = seqx[l] + pp[0].spc; nO = pp[l].spc + 1; nl = pp[0].spc + 1; nm = 0; while ( *p0 && *pl ) { if (sizO) { pl + + ; nl + + ; sizO-; } else if (sizl) { p0+ + ; n0+ + ; sizl--; } else { if (xbm[*pO-'A']&xbm[*pl-'A']) nm+ + ; if (nO++ == pp[0].x[iO]) sizO = pp[0].n[iO + +]; if(nl + + ==pp[l].x[il]) sizl = pp[l].n[il + +]; pO+ + ; pl + + ; } } /* homología pct: * si penaliza endgaps, base es la más corta seq * de otra forma, nulifica extensiones y toma el núcleo más corto */ if (endgaps) lx = (lenO < lenl)? lenO : lenl; else lx = (lx < ly)? lx : ly; pct = 100.*(double)nm/(double)lx; fprintf(fx, "\n"); fprintf(fx, " < %d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarityVn nm, (nm == 1)? "" : "es", lx, pct); fprintf(fx, "<gaps in first sequence: %d", gapx); if (gapx) { (void) sprintf(outx, " (%d %s%s)", ngapx, (dna)? "base":"residue", (ngapx == 1)? "":"s"); fprintf(fx,"%s", outx); fprintf(fx, ", gaps in second sequence: %d", gapy); if (gapy) { (void) sprintf(outx, " ( d %s%s)", ngapy, (dna)? "base":"residue", (ngapy == 1)? "":"s"); íprintf(fx," s", outx); } if (dna) fprintf(fx, "\n<score: %d (match = d, mismatch = %d, gap penalty = %d + %d per base)\n", smax, DMAT, DM1S, DINSO, DINS1); else fprintf(fx, "\n<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penalty = %á + %d per residue)\n", smax, PINSO, PINS1); if (endgaps) fprintf(fx, "< endgaps penalized. leftendgap: d %s%s, rightendgap: %d %s s\n", firstgap, (dna)? "base" : "residue", (ñrstgap == 1)? "" : "s", lastgap, (dna)? "base" : "residue", (lastgap == 1)? "" : "s"); else fprintf(fx, "< endgaps not penalized\n"); } static nm; /* apareamientos en núcleo ~ para verificar */ static lmax; /* tramos de nombres de archivo desprendidos */ static ij[¾ ; /* salta índice para una ruta */ static nc[2]; /* número al inicio de línea actual */ static ni[2]; /* número de elemento actual — para formar espacios static siz[2]; static char *ps[2]; /* ptr a elemento actual */ static char *po[2] ; /* ptr a siguiente output char slot */ static char out[2][P_LINE]; /* línea de salida */ static char star[P_LINE]; /* ajuste por stars() */ /* * imprime alineamiento de descrito en ruta struct pp[] */ static pr_align() pr align { int nn; /* cuenta de char */ int more; register i; for (i = 0, lmax = 0; i < 2; i+ +) { nn = stripname(namex[i]); if (nn > lmax) lmax = nn; nc[i] = 1 ; ni[i] = 1; siz[i] = ij[i] = 0; ps[i] = seqx[i]; po[i] = out[i]; } = nm = 0, more = 1 ; more; ) { for (i = more = 0; i < 2; i+ +) { /* * hay más de esta secuencia? */ if (!*ps[i]) continué; more+ + ; if (pp[i] .spc) { /* espacio delantero */ *po[i] + + = 1 ' ; pp[i].spc~; } else if (siz[i]) { /* en un espacio */ *po[i] + + = '-' ; siz[i]~; } else { /* ponemos un elemneto de */ *po[i] = *ps[i]; if (islower(*ps[i])) *ps[i] = toupper(*ps[i]); po[i] + + ; ps[i] + + ; /* * estamos en el siguiente espacio para esta seq? */ if(ni[i] ==pp[i].x[ij[i]]){ /* * necesitamos fusionar todos los espacios * en esta ubicación */ siz[i] = pp[i].n[ij[i] + +]; while (ni[i] = = pp[i].x[ij[i]]) siz[i] += pp[i].n[ij[i] + +]; } ni[i] + + ; } } if (+ +nn = = olen | | !more && nn) { dumpblock(); for (i = 0; i < 2; i++) po[i] = out[i]; nn = 0; } } } /* * descargar un bloque de líneas, incluyendo números, stars: pr_align() */ static dumpblock() { registeri; for (i = 0; i < 2; i++) *po[.]~ = '\0'; (void) putc('\n', fx); for (i = 0; i < 2; i++) { if(*out[i] && (*out[i] != ' ' I I *(??[G if(i ==0) nums(i); if (i = = 0 && *out[l]) stars(); putline(i); if (i = = 0&& *out[l]) fprintf(fx, star); if(i == 1) nums(i); } > } /* * sacar un línea de números: dumpblock() */ static nums(ix) nums int ix; /* índice en out[] que contiene línea de seq */ { char nline[P_LINE]; register register char *pn, *px, *py; for (pn = nline, i = 0; i < lmax+P_SPC; i+ + , pn++) *pn = for (i = nc[ix], py = out[ix]; *py; py + + , pn++) { if (*py = = ' ' II *py = = '-') *pn = ' '; else { if (i%10 = = 0 I I (i = = 1 &&nc[ix] != !)){ j = (i < 0)? -i : i; for (px = pn; j; j / = 10, px~) *px = j 10 + ?'; if (i < 0) } else *pn = ; i+ + ; } } *pn = '\0'; nc[ix] = i; for (pn = nline; *pn; pn++) (void) putc(*pn, fx); (void) putc('\n', fx); } /* * sacar una línea (ñame, [num], seq, [num]): dumpblock() */ static putline(ix) int ix; .putline int i; register char *px; for (px = namex[ix], i = 0; *px && *px != ':'; px+ + , i++) (void) putc(*px, fx); for (; i < lmax+P_SPC; i++) (void) putc(' ', fx); /* estos cuentan desde 1 : * ni[] es el elemento actual (desde 1) * nc[] es el número al inicio de la línea actual */ for (px = out[ix]; *px; px+ +) (void) putc(*px&0x7F, fx); (void) putc('\n', fx); } /* * poner una línea de estrellas (seqs siempre en out[0], out[l]): dumpblock() */ static stars() { int i; register char *p0, *pl, ex, *px; if (!*out[0] I I (*out[0] = = ' " && *(po[0]) = = ' ') I I !*out[l] I I (*out[l] = = ' ·&& *(po[l]) = = ' ')) return; px = star; for (i = lmax+P SPC; i; i-) *px++ = ' '; for (pO = out[0], pl = out[l]; *p0 && *pl; p0+ + , pl + +) { if (isalpha(*p0) && isalpha(*pl)) { if (xbm[*pO-'A']&xbm[*pl-'A']) { ex = '*'; nm+ + ; } else if (!dna && _day[*pO-'A,][*pl-' A'] > 0) ex = else } else ex = "; *px+ + = ex; } *px+ + = '\?'; *px = *\0'; } /* * extraer ruta o prefijo de pn, regresar len: pr_align() */ static stripname(pn) stripname char *pn; /* nombre de archivo (puede ser ruta) */ { register char *px, *py; py = 0; for (px = pn; *px; px++) if(*px == V) py = px + 1; if(py) (void) strcpy(pn, py); return(strlen(pn)); } /* *cleanup() — limpieza de cualquier archivo tmp * getseqO — leer seq, ajustar dna, len, maxlen * g_calloc() -- calloc() con comprobación de error * readjmps() ~ obtener los buenos jmps, del archivo tmp de ser necesario * writejmps() - escribir una hilera llena de jmps en un archivo tmp: nw() */ #include "nw.h" #include <sys/file.h> char *jname = tmp/homgXXXXXX"; /* archivos tmp para jmps FILE *fj; int cleanupO; /* limpieza de archivo tmp */ long lseek(); /* * elimina cualquier archivo tmp si fallamos */ cleanup(i) int i; { if(fj) (void) unlinkfjname); exit(i); } /* * leer, regresar ptr a seq, ajustar dna, len, maxlen * salata líneas que empiezan con ';', '<', o ' >' * seq en mayúscula o minúsculas */ char * getseq(file, len) getseq char *file; /* nombre de archivo */ int *len; /* seq len */ { char line[1024], *pseq; register char *px, *py; int natgc, tlen; FILE *fp; if ((fp = fopen(file,"r")) == 0) { fprintf(stderr,"%s: can't read %s\n", prog, file); exit(l); } tlen = natgc = 0; while (fgets(line, 1024, fp)) { if (*line == ';' | | *line == '<' | | *line = = '>') continué; for (px = line; *px != '\?'; px++) if (isupper(*px) | | islower(*px)) tlen+ + ; } if ((pseq = malloc((unsigned)(tlen+6))) == 0) { fprintf(stderr," %s: mallocQ failed to get %d bytes for %s\n", prog, tlen+6, file); exit(l); } pseq[0] = pseq[l] = pseq[2] = pseq[3] = '\0'; ...getseq py = pseq + 4; *len = tlen; rewind(fp); while (fgets(line, 1024, fp)) { if (*line = = ';' | | *line = = ' < ' 11 *line == '>') continué; for (px = line; *px ! = '\?'; px+ +) { if (isupper(*px)) *py+ + = *px; else if (islower(*px)) *py++ = toupper(*px); if (index( "ATGCU " , *(py - 1 ))) natgc + 4- ; } } *py+ + = ·\0'; *py = '\0'; (void) fclose(fp); dna = natgc > (tlen/3); return(pseq+4); } char * g_calloc(msg, nx, sz) g calloc char *msg; /* programa, rutina de llamada */ int nx, sz; /* número y tamaño de elementos */ { char *px, *calloc(); if ((px = calloc((unsigned)nx, (unsigned)sz)) = = 0) { if (*msg) { fprintf(stderr, " s: g_calloc() failed %s (n= %d, sz= %d)\n", prog, msg, nx, sz); exit(l); } } return(px); } /* * obtener jmps finales de dx[] o archivo tmp, ajusta pp[], reinicia dmax: main() ¦*/ readjmpsO readjmps { int fd int registeri, j, xx; if (fj) { (void) fclose(fj); if ((fd = openOname, O RDONLY, 0)) < 0) { fprintf(stderr, " %s: can't open() %s\n" , prog, jname); cleanup(l); } } for (i = iO = il = 0, dmaxO = dmax, xx = lenO; ; i+ +) { while (l) { for (j = dx[dmax] .ijmp; j > = 0 && dx[dmax] .jp.x j] > = xx; j~) ...readjmps if (j < 0 && dx[dmax]. offset && fj) { (void) lseek(fd, dx[dmax] . offset, 0); (void) read(fd, (char *)&dx[dmax] .jp, sizeof(struct jmp)); (void) read(fd, (char *)&dx[dmax]. offset, sizeof(dx[dmax] .offset)); dx[dmax].ijmp = MAXJMP-1 ; } else break; } if (i > = JMPS) { fprintf(stderr, " %s: demasiados espacios en alineamiento \n", prog); cleanup(l); } if(j >=0){ siz = dx[dmax].jp.n[j]; xx = dx[dmax].jp.x[j]; dmax + = siz; if (siz < 0) { /* espacio en segunda seq */ pp[l].n[il] = -siz; xx += siz; /* id = xx - yy + lenl - 1 */ pp[l].x[il] = xx - dmax + lenl - 1; gapy++; ngapy -= siz; ignora MAXGAP al hacer endgaps */ siz = (-siz < MAXGAP | | endgaps)? -siz : MAXGAP; il + + ; } else if (siz > 0) { /* espacio en primer seq */ pp[0].n[i0] = siz; pp[0].x[i0] = xx; gapx+ + ; ngapx += siz; ignora MAXGAP al hacer endgaps */ siz = (siz < MAXGAP | | endgaps)? siz : MAXGAP; Í0+ + ; } } else break; } /* invierte el orden de jmps */ for 0 =0, i0~; j < iO; j + + , i0~) { i = pp[0].n[j]; pp[0].n[j] = pp[0].n[iO]; pp[0].n[iO] i = pp[0].x[j]; pp[0].x[j] = pp[0].x[i0]; pp[0].x[i0] } for(j = 0, il— ; j < il;j + + , il--) { i = pp[l].n[j]; pp[l].n[j] = pp[l].n[il]; pp[l].n[il] i = pP[i].x[j]; ??[?].??] = ??[?]·?[??]; PP_I].X[ÍI] } if (fd > = 0) (void) close(fd); if(fj){ (void) unlink(jname); fj = 0; offset = 0; } } /* * escribe un jmp struct offset lleno del previo (de haber): nw() */ ritejmps(ix) int ix; { char *mktemp(); if (!fj) { if (mktemp(jname) < 0) { fprintf(stderr, " %s: can't mktempO %s\n" , prog, jname); cleanup(l); } if ((fj = fopen(jname, "w")) = = 0) { fprintf(stderr, " %s: can't write %s\n" , prog, jname); exit(l); } } (void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1, fj); (void) f rite((char *)&dx[ix] . offset, sizeof(dx[ix] . offset), 1 , fj); } Tabla 2 TAT XXXXXXXXXXXXXXX (Longitud = 15 amino ácidos) Proteína XXXXXYYYYYYY (Longitud = 12 amino ácidos) de Comparación % identidad de secuencia de amino ácido = (el número de residuos amino ácido de apareado idéntico entre las dos secuencias polipéptido como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de residuos amino ácido del polipéptido TAT) = 5 dividido por 15 = 33.3 % Tabla 3 TAT XXXXXXXXXX (Longitud = 10 amino ácidos) Proteína de Comparación XXXXXYYYYYYZZYZ (Longitud = 15 amino ácidos) % identidad de secuencia de amino ácido = (el número de residuos amino ácido de apareado idéntico entre las dos secuencias polipeptido como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de residuos amino ácido del polipeptido TAT) = 5 dividido por 10 = 50% Tabla 4 DNA-TAT NNNMn HSn n ^ (Longitud = 14 nucleotidos) ADN de Comparación NNNNNNLLLLLLLLLL (Longitud = 16 nucleotidos) % identidad de secuencia de amino ácido = (el número de nucleotidos de apareado idéntico entre las dos secuencias de ácido nucleico como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleotidos de la secuencia de ácido nucleico ADN-TAT) = 6 dividido por 14 = 42.9% Tabla 5 ADN-TAT mNNTtfNl^^ (Longitud = 12 nucleotidos) DNA de comparación N NLLLW (Longitud = 9 nucleotidos) % de identidad de secuencia de ácido nucleico = (el número de nucleótidos apareados o alineados idénticos entre las dos secuencias de ácido nucleico como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico ADN-TAT) = 4 dividido por 12 = 33.3 %. II . Composiciones y Métodos de la Invención A. Anticuerpos anti-TAT En una modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos anti-TAT que pueden encontrar uso aquí como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales , humanizados, biespecífieos , y heteroconjugados . 1. Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos policlonales de preferencia se desarrollan en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil el conjugar el antígeno relevante (en especial cuando se emplean péptidos sintéticos) a una proteína que es inmunogénica en la especie a inmunizar. Por ejemplo el antígeno puede conjugarse con hemocianina de erizo de mar (KLH) , albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina soya, utilizando un agente bifuncional o derivatizante , por ejemplo, maleimidobenzoil sulfosucinimida éster (conjugación a través de residuo cisteina) , N-hidroxisucinimida (a través de residuos lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son diferentes grupos alquilo. Se inmunizan animales contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados al combinar por ejemplo 100 /xg o 5 f¿g de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con tres volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 la cantidad original de péptido conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a catorce días después, los animales se les toma sangre y al suero se ensaya por título del anticuerpo. Los animales se refuerzan hasta que el título alcanza una meseta. Los conjugados también pueden elaborarse en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteína. También, agentes de agregación tales como alumbre también son convenientemente empleados para mejorar la inmuno respuesta. 2. Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos monoclonales pueden elaborarse utilizando el método de hibridoma primero descrito por Kohler y colaboradores, ature, 256:495 (1975), o pueden elaborarse por métodos de ADN recombinante (Patente de los E.U.A. No. 4,816,567). En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedero apropiado tal como un hámster, se inmuniza como se describió anteriormente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que ligarán específicamente la proteína utilizada para inmunización. En forma alterna, pueden inmunizarse in vitro linfocitos. Después de inmunización, se aislan linfocitos y luego fusionan con una línea celular de mieloma, utilizando un agente de fusión conveniente tal como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice (Anticuerpos monoclonales : principios y prácticas), pp. 59-103 (Academic Press, 1986) . Las células de hibridoma así preparadas se siembran y desarrollan en un medio de cultivo conveniente; este medio de preferencia contiene una o más substancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas (también referidas como socio de fusión) . Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosilo transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo selectivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT) , estas substancias evitan el crecimiento en células deficientes de HGPRT. Las células de mieloma socias de fusión preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan producción de alto nivel estable de anticuerpo por células productoras de anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio selectivo que se elige contra las células parentales no fusionadas. Líneas celulares de mieloma preferidas son de mieloma murino tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y SP-2 y derivados por ejemplo, células X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Líneas de células de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J . Immunol . , 133:3001 (1984); y Brodeur y colaboradores, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Técnicas y aplicaciones de producción de anticuerpos monoclonales) , pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Medio de cultivo en donde células de hibridoma se desarrollan y ensayan para producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. De preferencia, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmuno especificación o por un ensayo de enlace in vitro tal como radio inmuno ensayo (RIA) o ensayo inmuno absorbente enlazado por enzima (ELISA = Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) . La afinidad de enlace del anticuerpo monocolonal puede por ejemplo ser determinada por el método Scatchard descrito por unson y colaboradores, Anal. Biochem. , 107:220 (1980). Una vez que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseadas, los ciónos pueden ser subclonados por procedimientos de dilución limitados y desarrollados por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (Anticuerpos monoclonales: principios y prácticas) , pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Medios de cultivo convenientes para este propósito incluyen por ejemplo medio D- EM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vivo como tumores ascitos en un animal, por ejemplo por inyección i.p. de las células en ratones. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones, se separan convenientemente del medio de cultivo, fluido de ascitos o suero por procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales tales como por ejemplo cromatografía de afinidad, (por ejemplo utilizando proteína A o proteína G-Sepharose) o cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel , diálisis, etc. ADN que codifica los anticuerpos monoclonales fácilmente se aisla y secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo al utilizar sondas de oligonucleótido que son capaces de enlazar específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vector de expresión que luego se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de Hámster chino (CHO) , o células de mieloma, que de otra forma no producen proteína anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpo monoclonales en las células hospederas recombinantes . Artículos de revisión en la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra y colaboradores, Curr. Opinión in Immunol., 5:256-262 (1993) and Plückthun, Immunol . Revs . 130 : 151-188 (1992) .
En una modalidad adicional, anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas de fago de anticuerpo generadas utilizando la técnica descrita por McCafferty y colaboradores, ature, 348:552-554 (1990). Clackson y colaboradores, ature, 352:624-628 (1991) y arks y colaboradores, J. Mol. Biol . , 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos respectivamente, utilizando bibliotecas fago. Subsecuentes publicaciones describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) por entremezclado de cadena (Marks y colaboradores, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construcción de bibliotecas de fago muy grandes (Waterhouse y colaboradores, Nuc . Acids. Res . 21:2265-2266 (1993)). De esta manera, estas técnicas son alternatives viables a técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para aislamiento de anticuerpos monoclonales. El ADN que codifica el anticuerpo puede ser modificado para producir polipéptidos de anticuerpo de fusión o polipéptidos, por ejemplo, al substituir secuencias de dominio constante de cadena pesada y cadena ligera humanos (CH y CL) por las secuencias murinas homologas (Patente de los E.U.A. No. 4,816,567; y orrison, y colaboradores, Proc . Nati Acad. Sci . USA, 81:6851 (1984)), o por fusión de la secuencia de inmunoglobulina con todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no- inmunoglobulina (polipéptido heterólogo) . Las secuencias de polipéptido no inmunoglobulina pueden substituir los dominios constantes del anticuerpo, o se substituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio en combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. 3. Anticuerpos humanos y humanizados Los anticuerpos anti-TAT de la invención además pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina u otros fragmentos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de enlace antígeno de anticuerpos) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. Anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en donde residuos de una región de determinación complementaria (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tienen las deseadas especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, residuos de marco Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias de marco. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en donde todo o substancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todo o substancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado en forma óptima también comprenderá cuando menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones y colaboradores, Nature , 321 : 522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature, 332 :323-329 (1988); y Presta, Curr. O . Struct. Biol . , 2 :593-596 (1992) ] . Métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la especialidad. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos amino ácido introducidos de una fuente que es no humana. Estos residuos amino ácidos no humanos son a menudo referidos como residuos de "importación", que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse esencialmente de acuerdo con el método de Winter y colaboradores [Jones y colaboradores, Nature , 321 : 522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature, 332 : 323-327 (1988); Verhoeyen y colaboradores, Science, 239 : 1534-1536 (1988)], al substituir secuencias de CDR o CDRs roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los E.U.A. No. 4,816,567), en donde substancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha substituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en donde algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se substituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos roedores. La selección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para utilizarse en producir los anticuerpos humanizados, es muy importante para reducir la antigenicidad y respuesta HAMA (anticuerpo anti -ratón human) cuando el anticuerpo se pretende para uso terapéutico humano. De acuerdo con el asi denominado método de "major ajuste", la secuencia del dominio variable del anticuerpo roedor se monitorea contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variables humanas conocidas. La secuencia de dominio humano V que es más cercana a la de un roedor se identifica y la región de marco humano (FR) dentro de la cual aceptadas para el anticuerpo humanizado (Sims y colaboradores, J. Immunol . 151:2296 (1993); Chothia y colaboradores, J. Mol. Biol . , 196:901 (1987)). Otro método utilize una región de marco particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un sub-grupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta y colaboradores, J. Immunol. 151:2623 (1993)). @@@ Es además importante que se humanicen los anticuerpos con retención de alta afinidad de enlace para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos bidimensionales de las secuencias parental y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos con destreza en la especialidad. Están disponibles programas de computadora que ilustran y exhiben estructuras de conformación tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas selectas. Inspección de estas exhibiciones permite análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir el análisis de residuos que influencian esta capacidad de la inmunoglobulina candidato para ligar a su antígeno. De esta manera, residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias de receptor e importación de manera tal que la característica de anticuerpo deseada tal como afinidad incrementada para el o los antígenos objetivos se logre. En general, los residuos de región hipervariable están directa y más substancialmente involucrados para influenciar el enlace de antígeno. Diversas formas de un anticuerpo anti-TAT humanizado se contemplan. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo tal como Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos a fin de generar un inmuno conjugado. En forma alterna, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto tal como un anticuerpo IgGl intacto. Como una alternativa a humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, ante inmunización, de producir un repertorio complete de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homozigota de la región de gen de región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes de línea germinal y quiméricos, resultan en inhibición completa de producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de línea germinal en estos ratones mutantes de línea germinal, resultará en la producción de anticuerpos humanos ante ataque de antígeno. Ver por ejemplo Jakobovits y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y colaboradores al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann y colaboradores, Year in Immuno. 7:33 (1993); Patentes de los E.U.A. Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todas de GenPharm) ; 5,545,807; y WO 97/17852. En forma alterna, la tecnología de exhibición de fago (McCafferty y colaboradores, Nature 348:552-553 [1990] ) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, de repertorios genéticos del dominio variable de inmunoglobulina (V) de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, genes de dominio de anticuerpo V se clonan en-cuadro ya sea en un gen de proteína de revestimiento mayor o menos de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y exhiben como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma de fago, selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe estas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de las células B. La exhibición de fago puede realizarse en una variedad de formatos, revisados por ejemplo Johnson, Kevin S. y Chis ell, David J., Current Opinión in Structural Biology (Opinión actual en biología estructural) 3:564-571 (1993) . Varias fuentes de segmentos de gen de V pueden utilizarse para exhibición de fago. Clackson y colaboradores, Nature, 352:624-628 (1991) aisló un cojunto diverso de anti cuerpos anti -oxazolona de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados puede construirse y pueden aislarse anticuerpos a un conjunto diverso de antígenos (incluyendo anti-antígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks y colaboradores, J. Mol. Biol . 222:581-597 (1991), o Griffith y colaboradores, EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver también las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,565,332 y 5, 573, 905. Como se discutió anteriormente, anticuerpos humanos también pueden generarse por células B activadas in vitro (ver Patentes de los E.U.A. Nos. 5,567,610 y 5,229,275) . 4. Fragmentos de Anticuerpo En ciertas circunstancias, hay ventajas al utilizar los fragmentos de anticuerpo en vez de todos los anticuerpos. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite una rápida liberación y puede llevar a un acceso mejorado a tumores sólidos. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo.
Tradicionalmente , estos fragmentos se derivaron mediante digestión proteólitica de anticuerpos intactos (ver poe ejemplo Mor moto y colaboradores, Journal of Biochemical and Biophysical Methods (Revista de métodos bioquímicos y biofísicos) 24:107-117 (1992); y Brennan y colaboradores, Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por células hospederas recombinantes . Fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv todos pueden expresarse en y secretarse de E. coli, de esta manera permitiendo la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas fago de anticuerpo y discutidas anteriormente. En forma alterna, fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter y colaboradores, Bio/Technology (Bio/tecnología) 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de cultivos de células hospederas recombinantes. El fragmento Fab y F(ab')2 con vida media in vivo incrementada que comprende un receptor salvaje que puentea residuos epítopes se describen en la Patente de los E.U.A. No. 5,869,046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán aparentes a la persona con destreza en la especialidad. En otras modalidades, el anticuerpo de selección es un solo fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) . Ver WO 93/16185; Patente de los E.U.A. No. 5,571,894; y Patente de los E.U.A. No. 5,587,458. Fv y sFv son las púnicas especies con sitios de combinación intactos que están carentes de regions constants; de esta manera son adecuadas para enlace no específico reducido durante uso in vivo. Las proteínas de fusión sFv pueden construirse para dar fusión de una proteína efectora ya sea en el extreme amino o carboxi de un sFv. Ver antibody Engineering (ingeniería de anticuerpos) , ed. Borrebaeck, arriba. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo como se describe en la Patente de los E.U.A. No. 5,641,870 por ejemplo. Estos fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecífieos o biespecíficos . 5. Anticuerpos Biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para cuando menos dos epítopes diferentes. Anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden ligar a dos epítopes diferentes de una proteína TAT como se describe aquí. Otros de estos anticuerpos pueden combinar un sitio de enlace TAT con un sitio de enlace para otra proteína. En forma alterna, un brazo anti-TAT puede combinarse con un brazo que liga a una molécula de disparo en un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo CD3) , o receptors Fe para IgG (FcgammaR) , tales como FcgammaRI (CD64) , FcgammaRII (CD32) y FcgammaRIII (CD16) , para enfocar y localizar mecanismos de defensa celular a la célula que expresa TAT. Anticuerpos biespecificos también pueden utilizarse para localizar agentes citotóxicos a células que expresan TAT. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace TAT y un brazo que liga el agente citotóxico (por ejemplo saporina, anti-interferona-a, vinca alcaloide, cadena ricina A, hapteno isótopo radioactivo o metotrexato) . Anticuerpos biespecificos pueden prepararse como anticuerpos de longitud íntegra o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecificos F(ab')2)- WO 96/16673 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-FcgammaRIII biespecífico y la patente de los E.U.A. No. 5,837,234 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-FcgammaRI biespecífico. Un anticuerpo anti-ErbB2/Fca biespecífico se ilustra en WO98/02463. La Patente de los E.U.A. No. 5,821,337 ilustra un anticuerpo anti-ErbB2/anti-CD3 biespecífico. Métodos para producir anticuerpos biespecificos se conocen en la especialidad. Producción tradicional de anticuerpos biespecificos de longitud íntegra se basa en la co-expresión de dos pares de cadenas ligeras, cadenas pesadas de inmunoglobulina , en donde las dos cadenas tienen diferentes (Millstein y colaboradortes , Nature 305:537-539 (1983)). Debido a la ASS1 aleatoria de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, estos hibridomas (quadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. Purificación de molécula correcta que usualmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es más bien problemática, y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, y en Traunecker y colaboradores, EMBO J. 10 :3655-3659 (1991) . De acuerdo con un enfoque que es diferente, dominios de variable de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constantes de inmunoglobulina . De preferencia, la fusión es con el dominio constante de cadena pesada Ig que comprende cuando menos parte de la bisagra, regiones CH2, y CH3. Se prefiere el tener la primer región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para enlace de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y son co-transfectados en una célula huésped conveniente. Estos proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modalidades en donde proporciones desiguales de las tres cadenas polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecifico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas polipéptido en un solo vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipéptido en proporciones iguales resulta con altos rendimientos o cuando las proporciones no tienen efecto significante en el rendimiento de la combinación de cadena deseada. En una modalidad preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecífieos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primer especificidad de enlace en un brazo, y un par de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de enlace (en el otro brazo) . Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecifico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina indeseadas ya que la presencia de la cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma de separación f cil. Este enfoque se describe en WO 94/04690. Para mayores detalles de generar anticuerpos biespecífieos ver por ejemplo Suresh y colaboradores, Methods in Enzymology (Métodos en Enzimología) 121:210 (1986). De acuerdo con otro enfoque descrito en la Patente de los E.U.A. No. 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede someterse a ingeniería para el máximo de por ciento de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante . La interfase preferida comprende cuando menos una parte en dominio CH3. En este método, una o más pequeñas cadenas laterales de amino ácido de la interfase de la primer molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico a o las cadenas del lado grande se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar grandes cadenas laterales de amino ácidos con más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales indeseados tales como homodímeros . Anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrelazados o "heteroconj ugados " . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse con avidina, el otro a biotina. Estos anticuerpos por ejemplo se han propuesto para ser blanco en células de sistema immune entre las células indeseadas (Patente de los E.U.A. No. 4,676,980), y para tratamiento de infección HIV (WO 91/00360, O 92/200373, y EP 03089). Anticuerpos heteroconjugados pueden elaborarse utilizando cualesquiera métodos de entrelazamiento convenientes. Agentes de entrelazamiento adecuados son bien conocidos en la especialidad y se describen en la Patente de los E.U.A. No. 4,676,980, junto con una cantidad de técnicas de entrelazamiento. Técnicas para generar anticuerpos biespecífieos para fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecificos pueden prepararse utilizando un enlace químico. Brennan y colaboradores, Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab' )2-Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente de ditiol, arsenito de sodio, para estabilizar ditioles vecinales y evitar formación de disulfuro intermoleculares. Los fragmentos Fab 1 generados luego se convierten a derivados tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB luego se reconvierte a Fab1 -tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado Fab '-TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecificos producidos pueden emplearse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Reciente avance ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que puede acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecificos . Shalaby y colaboradores, J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describe la producción de una molécula F(ab')2 anticuerpo biespecifico totalmente inmunizada. Cada fragmento Fab 1 fue secretado separadamente de E. coli y sometido a acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo biespecifico . El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de ligar a células que sobre expresan el receptor ErbB2 y células T humanas normales así como disparar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de mama humano. Diversas técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo biespecificos directamente del cultivo cellular recombinante también se han descrito. Por ejemplo, anticuerpos biespecificos se han propuesto utilizando cremalleras de leucina. Kostelny y colaboradores, J. Immunol . 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos cremalleras de leucinas de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión de gen. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y luego volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alterno para producir fragmentos de anticuerpo biespecífieos . Los fragmentos comprenden un VH conectado a un VL por un enlazador porque es muy corto para permitir formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con esto, los dominios VH y VL de un fragmento se forzan para formar pares con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, de esta manera formando dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo inespecífico por el uso de dímeros de cadena sencilla Fv (sFv) también se han reportado. Ver Gruber y colaboradores, J . Immunol . , 152:5368 (1994). Anticuerpos con más de dos valencias se contemplan. Por ejemplo anticuerpos triespecífieos pueden prepararse. Tutt y colaboradores, J. Immunol. 147:60 (1991) . 6. Anticuerpos Heteroconjugados Anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Anticuerpos heteroconj gados están compuestos por dos anticuerpos unidos en forma covalente. Estos anticuerpos por ejemplo se han propuesto para hacer blanco en células de sistema inmune a células indeseadas [Patente de los E.U.A. No. 4,676,980], y para tratamiento de infección HIV [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando métodos conocidos en química de proteína sintética, incluyendo aquellos que involucran agentes de entrelazamiento. Por ejemplo, pueden construirse inmuno toxinas utilizando una reacción de intercambio disulfuro o al formar un enlace equivalente. Ejemplos de reactivos convenientes para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos descritos por ejemplo en la Patente de los E.U.A. No. 4 , 676 , 980. 7. Anticuerpos Multivalentes Un anticuerpo multivalente puede ser internalizado y/o catabolizado) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al cual se ligan los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (son diferentes para la clase IgM) con tres o más sitios de enlace antígeno (por ejemplo anticuerpos tetravalentes) , que pueden producirse fácilmente por expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de enlace de antigeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste de) una región Fe o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de enlace antígeno amino terminales a la región Fe. El anticuerpo multivalente preferido aquí comprende (o consiste de) tres a aproximadamente 8, pero de preferencia 4 sitios de enlace antígeno. El anticuerpo multivalente comprende cuando menos una cadena polipéptido (y de preferencia dos cadenas polipéptido) , en donde la o las cadenas polipéptido comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la o las cadenas polipéptido pueden comprender VD1- (XI) „-VD2- (X2) n-Fc , en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena polipéptido de una región Fe, XI y X2 representan un amino ácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la o las cadenas polipéptido pueden comprender: región VH-CHl-enlazado flexible-VH-CH1-Fc ; o cadena de región VH-CHl-VH-CHl-Fc . El anticuerpo multivalente aquí de preferencia además comprende cuando menos dos (y de preferencia 4) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Este anticuerpo multivalente puede por ejemplo comprender de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de cadena ligera y opcionalmente además comprenden un dominio CL. 8. Ingeniería de función efectora Puede ser conveniente el modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo para mejorar citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse al introducir uno o más substituciones de amino ácido en una región FC del anticuerpo. En forma alterna o adicional, pueden introducirse uno o varios residuos cisteína en la región Fe, de esta manera permitiendo formación de enlace disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o incrementado exterminio de células mediadas por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Ver Carón y colaboradores, J. Exp ed. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B . J . Immunol . 148:2918-2922 (1992). Anticuerpos homodiméricos con mejorada actividad anti tumor también pueden prepararse utilizando entrelazadores heterobifuncionales como se describe por Wolff y colaboradores, Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). En forma alterna, un anticuerpo puede ser procesado a ingeniería que tenga dobles regions Fe y de esta manera tener lisis de complemento mejorada y capacidades ADCC. Ver Stevenson y colaboradores, Anti -Cáncer Drug Design 3 :219-230 (1989) . Para incrementar la vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítope de enlace para receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la Patente de los E.U.A. No. 5,739,277, por ejemplo. Como se emplea aquí, el término "epítope de enlace receptor de rescate" se refiere a un epítope de la región Fe de una molécula IgG (por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3 , o IgG4) que es responsable por incrementar la vida media en suero índigo de la molécula IgG. 9. Immunoconj ugados La invención también se refiere a inmunoconj ugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, una toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fungal, de planta o animal, o sus fragmentos) , o un isótopo radioactivo (es decir un radiocon ugado) . Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de estos inmuno conjugados se han descrito anteriormente. Toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden emplearse incluyen cadena difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena ricina A, cadena abrina A, cadena modeccina A, alfa sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínsas de phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica carantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos . Una variedad de radionuclidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re. Conjugados del anticuerpo y agente citotoxico se elaboran utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL) , esteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexanediamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil ) -etilenediamina) , diisocianatos (tales como toluen 2 , 6-diisocianato) , y compuestos bis-flúor activo (tales como 1 , 5-difluoro- 2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina resina puede prepararse como se describe por Vitetta y colaboradores, Science, 238: 1098 (1987). ácido l-isotiocianatobencil-3 -metildietilen triaminpentaacético (MX-DTPA) etiquetado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para conjugar radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026. Conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de moléculas pequeñas tales como calicheamicina, maitansinoides , un tricoteno, y CC1065, y derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan aquí. Maitansina y maitansinoides En una modalidad preferida, un anticuerpo anti-TAT (longitud de íntegra o fragmentos) de la invención se conjuga con una o más moléculas de maitansinoide.
Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan al inhibir polimerización de tubulina. La maitansina primero fue aislada del arbusto africano Maitenus serrata (Patente de los E.U.A. No. 3,896,111). Subsecuentemente se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y esteres de maitansinol C-3 (Patente de los E.U.A. No. 4,151,042). Maitansinol sintético y derivados y sus análogos se describen por ejemplo en la patente de los E.U.A. Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533, las descripciones de las cuales aquí se incorporan expresamente por referencia. Conjugados de anticuerpo-maitansinoide En un intento por mejorar su índice terapéutico, maitansina y maitansinoides se han conjugado con anticuerpos que ligan específicamente a antígenos de de células de tumor. Inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico se describen por ejemplo en las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,208,020, 5,416,064 y la Patente Europea EP 0 425 235 Bl, las descripciones de las cuales aquí se incorporan expresamente por referencia. Liu y colaboradores, Proc .
Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describen inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorectal humano. Se encontró que el conjugado es altamente citotoxico hacia células de cáncer de colon cultivadas y mostró actividad ante tumor, en un ensayo de crecimiento de tumor in vivo. Chari y colaboradores, Cáncer Research 52:127-131 (1992) describen inmunoconjugados en donde se conjugó un maitansinoide mediante un enlazador disulfuro al anticuerpo murino A7 que liga a un antígeno de líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.l que liga el oncógeno HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA.1-maitansonoide se probó in vitro en la linea de células de cáncer de pecho humano SK-BR-3, que expresan antígenos de superficie3 x 105 HER-2 por células. El conjugado de droga logró un grado de citotoxicidad similar a la droga maitansinoide libre, que puede incrementarse al aumentar el número de moléculas de maitansinoide por moléculas de anticuerpo. El conjugado A7 -maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones. Conjugados maitansinoide anti -anticuerpo con polipéptido anti-TAT (inmunoconjugados) Conjugados maitansinoidé-anticuerpo-TAT se preparan al enlazar químicamente un anticuerpo anti-TAT con una molécula maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica de cualquiera del anticuerpo o la molécula cualquiera del anticuerpo o la molécula maitansinoide. Un promedio de 3-4 moléculas maitansinoide conjugadas por moléculas de anticuerpo ha mostrado eficacia para mejorar citotoxicidad de células objetivo sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque incluso una molécula de toxina/anticuerpo se esperaría que mejore la citotoxicidad sobre el uso de anticuerpos desnudos. Los maitansinoides son bien conocidos en la técnica y pueden sintetizarse por técnicas conocidas o aisladas de Fuentes naturals. Se describen maitansinoides convenientes por ejemplo en la Patente de los E.U.A. No. 5,208,020 y en las otras patentes y publicaciones que no son de patente referidas previamente. Maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula maitansinol tales como diversos ésteres de maitansinol. Hay muchos grupos de enlace en la técnica para producir conjugados de maitansinoide-anticuerpo incluyendo por ejemplo aquellos descritos en la patente de los E.U.A. No. 5,208,020 o la Patente EP 0 425 235 Bl, y Chari y colaboradores, Cáncer Research 52:127-131 (1992) . Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos ácido lábil, grupos, fotolabil, grupos peptidasa lábil, o grupos esterasa lábil, como se describe en las patentes anteriormente identificadas, se prefieren grupos disulfuro y tioéter. Conjugados del anticuerpo y maitansinoide pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales N-succinimidil-3- (2 -piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4 - (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL) , estere activos tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutareldehidos) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil ) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como toluen 2 , 6 -diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N- succinimidil-3- (2 -piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson y colaboradores, Biochem. J. 173:723-737 [1978]) y N-succinimidil-4- (2 -piridiítio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro. El enlazador puede conectarse a la molécula maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace ester puede formarse por reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición C-3 del maitansinol o un análogo de maitansinol. Calicheamicina Otro inmuno conjugado de interés comprende un anticuerpo anti-TAT conjugado a una o más moléculas de calicheamicina. La familia calicheamicina de antibióticos es capaz de producir interrupciones de AND de doble hebra a concentraciones sub-picomolar . Para la preparación de conjugados de la familia calicheamicina ver patentes de los E.U.A: Nos. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas de American Cyanamid Company) . Análogos estructurales de calicheamicina que pueden utilizarse incluyen pero no están limitados a gammai1, alfa2I, alfa3i, N-acetil-gammai1, PSAG y theta1! (Hinman y colaboradores, Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode y colaboradores, Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes de los E.U.A. anteriormente mencionadas otorgadas a American Cyanamid) . Otra droga antitumor que el anticuerpo con la que puede conjugarse el anticuerpo es QFA que es un antifolato. Tanto la calicheamicina y FA tienen sitios intracelulares de acción y no cruzan fácilmente la membrana de plasma. Por lo tanto, la absorción celular de estos agentes a través de internalización mediada por anticuerpo mejora enormemente sus efectos citotóxicos. Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumor que pueden conjugarse a los anticuerpos anti-TAT de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristma y 5-fluorouracil , la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 descrita en las patentes de los E.U.A. Nos. 5,053,394, 5,770,710, así como esperamicinas (patente de los E.U.A. 5,877,296). Toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden emplearse incluyen cadena difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena ricina A, cadena abrina A, cadena modeccina A, alfa sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de fitolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver por ejemplo WO 93/21232 publicado en octubre 28, 1993. La presente invención además contempla un inmunoconjugado formado de un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo una ribonucleasa o un ADN endonucleasa tal como deoxiribonucleasa; DNasa) . Para destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de anticuerpos anti-TAT radioconjugados . Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado se utiliza para diagnóstico, puede comprender un átomo radioactivo para estudios escintigráficos ejemplo tc99m o I123, o una etiqueta spin para formación de imagen por resonancia magnética nuclear (RNM) (también conocida como formación de imagen por resonancia magnética, mri) , tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, yodo-111, florina-19, carbono- 13, nitrógeno-15 , oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Las radio u otras etiquetas pueden incorporarse en el conjugado en forma conocida. Por ejemplo, el peptide puede ser biosintetizado o puede sintetizarse por síntesis de química de amino ácidos utilizando precursores de amino ácido convenientes que involucran por ejemplo flúor-19 en lugar de hidrógeno. Etiquetas tales como tc99m o I123, Re186, Re188 y In111 pueden conectarse mediante un residuo cisteína en el péptido. Itrio- 90 puede conectarse mediante un residuo lisina. El método IODOGEN (Fraker y colaboradores (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 puede utilizarse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Anticuerpos monoclonales en inmunoescintigrafía) (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle. Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil ) ciclohexan-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (talews como dimetil adipimidato HC1) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2 , 6 -diisocianato) , y compuestos de flúores bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe por Vitetta y colaboradores, Science 238:1098 (1987). Ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminpentaacético etiquetado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugar radionucleótido al anticuerpo. WO94/11026. El enlazador puede ser un "emlazador escindible" que facilita la liberación de la droga citotóxica en la célula. Por ejemplo, un enlazador ácid-labil, enlazador peptidasa-sensible , enlazador fotolábil, enlazador dimetil o enlazador que contiene disulfuro (Chari y colaboradores, Cáncer Research 52:127-131 (1992); Patente de los E.U.A. No. 5,208,020) puede emplearse. En forma alterna, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo anti-TAT y agente citotóxico puede elaborarse, por ejemplo por técnicas recombinantes o síntesis de péptido. La longitud de ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado ya sea adyacente es entre sí o separado con una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado. Todavía en otra modalidad, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en pre-blanco de tumor en donde el conjugado anti -cuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por remoción del conjugado no ligado de la circulación utilizando un agente de liberación y luego administrar un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido) . 10. Inmunoliposomas Los anticuerpos anti-TAT descritos aquí pueden también formularse como un inmunolíposomas . Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactantes que es útil para suministro de una droga a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación bicapa, similar al arreglo de lípidos de membranas biológicas. Liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la especialidad tal como se describe por Epstein y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang y colaboradores, Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); Patentes de los E.U.A. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicadas en octubre 23, 1997. Liposomas con tiempo de circulación mejorados se describen en la Patente de los E.U.A. No. 5,013,556. Liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación en fase inversa con una composición lípida que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizda con PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros con tamaño de poros definidos para dar liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse a los liposomas como se describe por Martin y colaboradores, J. Biol . Chem. 257:286-288 (1982) mediante una reacción de un intercambio disulfuro. Un agente quimioterapéutico se ha contenido opcionalmente dentro del liposoma. Ver Gabizon y colaboradores, J. National Cáncer Inst . 81 (19) :1484 (1989). B . Oligopéptidos de enlace TAT Oligopéptidos se enlace TAT de la presente invención son oligopéptios quie ligan de preferencia específicamente un polipéptido TAT como se describe aquí. Oligopéptidos de enlace TAT pueden sintetizarse químicamente utilizando metodología de síntesis de oligopéptido conocida o pueden prepararse y purificarse utilizando tecnología recombinante . Oligopeptidos de enlace TAT usualmente tienen cuando menos aproximadamente 5 amino ácidos en longitud, en forma alterna cuando menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 amino ácidos de longitud o más, en donde estos oligopéptidos que son capaces de enlace, de preferencia específicamente a un polipéptido TAT como aquí se describe. Oligopéptidos de enlace TAT pueden identificarse sin indebida experimentación utlizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se nota que técnicas para monitorear bibliotecas de oligopéptido para oligopéptidos que son capaces de enlazar específicamente a un objetivo polipéptido, son bien conocidas en la especialidad (por ejemplo Patentes de los E.U.A. Nos. ,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publicaciones de PCT Nos. WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen y colaboradores Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A., 81:3998 4002 (1984); Geysen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 82:178 182 (1985); Geysen y colaboradores, en Synthetic Peptides as Antigens, (Péptidos sintéticos como antígenos) 130 149 (1986) ; Geysen y colaboradores, J . Immunol. Meth. , 102:259 274 (1987); Schoofs y colaboradores, J . Immunol . , 140:611 616 (1988), Cwirla, S. E. y colaboradores (1990) Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. y colaboradores, (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. y colaboradores (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. y colaboradores, (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. y colaboradores, (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2 : 668) . En este aspecto, exhibición de bacteriófago (fago) es una técnica bien conocida que permite monitorear grandes bibliotecas de oligopéptido para identificar uno o varios miembros de esas bibliotecas que son capaces de enlazar específicamente con un objetivo polipéptido. Exhibición de fago es una técnica por la cual polipéptidos variantes se exhiben como proteína de fusión a la proteína de revestimiento en la superficie de las partículas de bacteriófago (Scott, J.K. y Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). La utilidad de exhibición de fago se encuentra en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteínas aleatorizadas selectivamente (o cADNs clonadas al azar) pueden monitorearse en forma rápida y eficiente para aquellas secuencias que ligan a una molécula objetivo con alta afinidad. Exhibición de péptido (Cwirla, S. E. y colaboradores (1990) Proc . Nati. Acad. Sei. USA, 87:6378) o proteína (Lowman, H.B. y colaboradores (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. y colaboradores (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. y colaboradores, (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. y colaboradores, (1991) Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 88:8363) en fago se han utilizado para monitorear millones de polipéptidos u oligopéotidos por aquellos con propiedades de enlace específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2:668). La monitoreación de bibliotecas de fago de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construcción y propagación de una gran cantidad de variantes, un procedimiento para purificación de afinidad utilizando el receptor objetivo y medios para evaluar los resultados de enriquecimientos de enlace. Patentes de los E.U.A. Nos. 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, y 5,663,143. Aunque la mayoría de los métodos de exhibición de fago han utilizado fago filamentoso, sistemas de exhibición de fago lambdoide (WO 95/34683; patente de los E.U.A. No. 5,627,024), sistemas de exhibición de fago T4 (Ren, Z-J. y colaboradores (1998) Gene 215:439; Zhu, Z. (1997) CAN 33:534; Jiang, J. y colaboradores (1997) can 128:44380; Ren, Z-J. y colaboradores (1997) CAN 127:215644; Ren, Z-J. (1996) Protein Sci. 5:1833; Efimov, V. P. y colaboradores (1995) Virus Genes 10:173) y sistemas de exhibición de fago T7 (Smith, G. P. and Scott, J.K. (1993) Methods in Enzymology, 217, 228_257; patente de los E.U.A. No. 5,766,905) se conocen. Muchas otras mejoras y variaciones del concepto de exhibición de fago básico ahora se han desarrollado. Estas mejoras son para la habilidad de sistemas de exhibición en monitorear bibliotecas de péptido por enlace a moléculas objetivo selectas y exhibir proteínas funcionales con el potencial de monitorear las proteínas por propiedades deseadas. Dispositivos de reacción combinatoria para reacciones de exhibición fago se han desarrollado (WO 98/14277) y bibliotecas de exhibición fago se han utilizado para analizar y controlar interacciones bimoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales (WO 98/20036) . WO 97/35196 describe un método para aislar un ligando de afinidad en donde una biblioteca de exhibición de fago se contacta con una solución en donde el ligando se unirá a una molécula objetivo y una segunda solución en donde el ligando de afinidad no ligará a la molécula objetivo, para aislar selectivamente ligandos de enlace. WO 97/46251 describe un método para bio- selección de una biblioteca de exhibición fago aleatoria con un anticuerpo o purificado por afinidad y luego aislar el fago de enlace, seguido por un proceso de micro-selección pozos de microplacas para aislar fago de enlace de alta afinidad. El uso de proteína A de Staphylococcus aureus como una etiqueta de afinidad también se ha reportado (Li y colaboradores (1998) Mol Biotech. , 9:187). WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de sustracción de substrato para distinguir especificidad de la enzima utilizando una biblioteca combinatoria que puede ser una biblioteca de exhibición de fago. Un método para elegir enzimas adecuados para utilizar en detergentes utilizando exhibición de fago se describe en WO 97/09446. Métodos adicionales para seleccionar proteínas de enlace específicas, se describen en las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,498,538, 5,432,018, y WO 98/15833. Métodos para generar bibliotecas fago y monitorear estas bibliotecas también se exhiben en las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, y 5,723,323. C . Moléculas orgánicas de enlace TAT Moléculas orgánicas de enlace TAT son moléculas orgánicas diferentes a oligopéptidos o anticuerpos como se define aquí que ligan de preferencia específicamente a un polipéptido TAT como se describe aquí. Moléculas orgánicas de enlace TAT pueden identificarse y sintetizarse químicamente utilizando metodología conocida (ver por ejemplo, publicaciones de PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Moléculas orgánicas de enlace TAT usualmente tienen menos de aproximadamente 2000 daltons de tamaño, en forma alterna menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 en tamaño, en donde estas moléculas orgánicas son capaces de enlazar, de preferencia específicamente a un polipéptido TAT como aquí se describe puede identificarse sin indebida experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se nota que técnicas para monitorear bibliotecas de moléculas orgánicas para moléculas que son capaces de enlazar a un objetivo polipéptido son bien conocidas en la especialidad (ver por ejemplo publicaciones PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Moléculas orgánicas de enlace TAT pueden ser por ejemplo aldehidos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas , carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidracinas N-substituidas, hídrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos , ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acétales, tioacetales, aril haluros, aril sulfonatos, alquil haluros, alquil sulfonatos, compuestos aromáticos heterocíclicos , anilinas, alquenos, alquinos, dioles, amino alcoholes, oxazolidinas , oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas , epoxidos, aziridinas, isocianatos, cloruro de sulfonilos, compuestos diazo, cloruros de ácido o semejantes. D . Monitoreo por anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos de enlace TAT y moléculas orgánicas de enlace TAT con las propiedades deseadas. Técnicas para generar anticuerpos, oligopéptidos y moléculas orgánicas que ligan a polipéptidos TAT se han descrito anteriormente. Además se pueden seleccionar anticuerpos, oligopéptidos u otras moléculas orgánicas con ciertas características biológicas según se desee. Los efectos inhibitorios de crecimiento de un anticuerpo anti-TAT oligopeptido u otra molécula orgánica de la invención pueden estimarse por métodos conocidos en la especialidad, por ejemplo utilizando células que expresan un polipéptido TAT ya sea en forma endógena o después de transfección con el gen TAT. Por ejemplo, líneas celulares de tumor apropiadas y células transíectadas con TAT pueden tratarse con un anticuerpo monoclonal oligopeptido u otra molécula orgánica anti-TAT de la invención a diversas concentraciones por unos cuantos días (por ejemplo 2 a 7 días y teñirse con violeta cristal o TT o analizarse por algún otro ensayo colorimétrico . Otro método para medir proliferación sería al comparar absorción de 3H-timidina por las células tratadas en la presencia o ausencia de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT de la invención. Después de tratamiento, las células se cosechan y la cantidad de radioactividad incorporada en el ADN se cuantifica en un contador de destelleo. Controles positivos apropiados incluyen tratamiento de una línea de células selecta con un anticuerpo inhibidor de crecimiento que se conoce y mide el crecimiento de esa línea celular. La inhibición de crecimiento de las células de tumor in vivo puede ser determinada en formas diversas conocidas en la especialidad. De preferencia, la célula de tumor es aquella que sobre expresa un polipéptido TAT. De preferencia, el anticuerpo anti-TAT, oligopéptido enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT inhibirá la proliferación celular de una célula de tumor que expresa TAT in vitro o in vivo en aproximadamente 25 a 100% en comparación con la célula de tumor in tratar, más preferible en aproximadamente 30 a 100% y aún más preferible en aproximadamente 30-100%, y aún más preferible en aproximadamente 50-100% o 70-100%, en una modalidad a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 Puede medirse la inhibición de crecimiento a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µg/ml o aproximadamente 0.5 nM a 200 nM en cultivo celular, en donde la inhibición de crecimiento se determina 1-10 días después de exposición de las células de tumor al anticuerpo. El anticuerpo se desarrolla inhibitorio in vivo si la administración del anticuerpo anti-TAT a aproximadamente 1 ¿g/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, resulta en reducción en tamaño de tumor o reducción de la proliferación del tumor en aproximadamente 5 días hasta tres meses de la primer administración de anticuerpo, de preferencia dentro de aproximadamente 5 a 30 días. Para seleccionar un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de enlace ??? o molécula orgánica de enlace TAT que induce muerte cellular, pérdidad de integridad de membrane como se indica por, por ejemplo absorción de yoduro de propidio (PI), azul triptano o 7AAD puede evaluarse respecto a control. Puede realizarse un ensayo de absorción PI en la ausencia de células efectoras inmunes y complemento. Células de tumor que expresan polipéptido TAT se incuban con medio solo o medio que contiene el anticuerpo anti-TAT apropiado (por ejemplo a aproximadamente 10 µ?/t??) , oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT. LAs células se incuban por un periodo de tiempo de tres días. Después de cada tratamiento, las células se lavan y toman alícuotas en tubos de 12 x 75 tapados con ceraso de 35 mm (1 mi por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para remoción de grumos celulares. Los tubos luego recibir PI (10 9/p?1) . Las muestras pueden analizarse utilizando un citómetro de flujo FACSCAN® y soporte lógico FACSCO VERT® CellQuest (Becton Dickinson) .
Aquellos anticuerpos anti-TAT, oligonupéptidos de enlace TAT o moléculas orgánicas de enlace TAT que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte cellular como se determ, ina por absorción de PI, puede seleccionarse como anticuerpos anti-TAT que inducen muerte cellular, oliggopéptidos de enlace TAT o moléculas orgánicas de enlace TAT. Para monitorear anticuerpos, oligopéptidos u otras moléculas orgánicas que ligan a un epítope en un polipéptido TAT ligado por un anticuerpo de interés, un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual (Anticuerpos, un manual de laboratorio) , Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow y David Lañe (1988), puede realizarse. Este ensayo puede emplearse para determinar si un anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica de prueba liga el mismo sitio o epítope como un anticuerpo anti-TAT conocido. En forma alterna, o adicionalmente, el mapeo de epítope puede realizarse por métodos conocidos en la especialidad. Por ejemplo, la secuencia de anticuerpos puede ser mutagenizada tal como por exploración de alanina, para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante inicialmente se prueba para enlazar con anticuerpo policlonal para asegurar ligado adecuado. En un método diferente, péptidos que corresponden a diferentes secciones de un polip ptido TAT, pueden realizarse en ensayos competitivos, con los anticuerpos de prueba o con un anticuerpo de prueba y un anticuerpo con un epítope caracterizado o conocido. E . Terapia de prodroga mediada por enzimas dependientes de anticuerpo (ADEPT = Antibody Dependent Enzyme Mediated Prodrug Therapy) Los anticuerpos de la presente invención también pueden utilizarse en ADEPT al conjugar el anticuerpo a una enzima activadora por droga que convierte una prodroga (por ejemplo un agente quimioterapéutico peptidilo, ver O81/01145) a una droga anticáncer activa. Ver por ejemplo, O 88/07378 y la patente de los E.U.A. No. 4,975,278. El componente de enzima de inmunocon ugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en una prodroga de manera tal que la convierta en su forma citotóxica más activa. Enzimas que son útiles en el método de esta invención, incluyen pero no están limitadas a, fosfatasa alcalina, útil para converter prodroga que contiene fosfato en drogas libres; aril fosfatasa útil para converter prodrogas que contienen sulfato en drogas libres; citosina deaminasa útil para convertir 5- fluorocitosina no tóxica en la droga anticáncer, 5-fluorouracilo ; proteasas tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir prodrogas que contienen péptido en drogas libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir prodrogas que contienen sustituyentes D-amino ácido, enzimas que escinden carbohidratos tales como beta-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir prodrogas glicosiladas en drogas libres; beta-lactamasa útil para convertir drogas derivatizadas con beta-lactamas en drogas libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir drogas derivatizadas en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente en drogas libres, En forma alterna, anticuerpos con actividad enzimatica, también conocidas en la especialidad como "aczimas", pueden utilizarse para convertir la prodroga de la invención en drogas activas libres (ver por ejemplo Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Conjugados de anticuerpos-aczima pueden prepararse como se describe aquí para el suministro de la aczima a una población de células de tumor. Las enzimas de esta invención pueden ligarse covalentemente a los anticuerpos anti-TAT por técnicas bien conocidas en la especialidad tales como el uso de los reactivos de entrelazamiento heterobifuncionales discutidos anteriormente. En forma alterna, proteínas de fusión comprenden cuando menos la región de enlace de antígeno del anticuerpo de la invención enlazada cuando menos a una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención, puede construirse utilizando técnicas de ADN recombinantes bien conocidas en la especialidad (ver por ejemplo Neuberger y colaboradores, Nature 312 : 604-608 (1984) . F . Polipéptidos TAT de longitud íntegra La presente invención también proporciona secuencias de nucleótido recientemente identificadas y aisladas que codifican polipéptidos referidos en la siguiente solicitud como polipéptido TAT. En particular, cADNs (parciales y de longitud íntegra) que codifican diversos polipéptidos TAT se han identificado y aislado, como se describe con más detalle en los siguientes ejemplos. Como se describe en los siguientes ejemplos, diversos ciónos de AND se han depositado con ATCC. Las secuencias de nucleotides actuales de estos ciónos pueden determinarse fácilmente por la persona con destreza en la especialidad por secuenciado del clon depositado utilizando métodos rutinarios en la especialidad. La secuencia de amino ácidos pronosticada pueden determinarse a partir de la secuencia de nucleotides utilizando destreza rutinaria. Para los polipéptidos TAT y se codifican ácidos nucleicos aquí descritos, en algunos casos los solicitantes se han identificado lo que se considera que es el marco de lectura más identificable que con la información de secuencia disponible al momento . G . Variantes de polipéptido TAT y anticuerpo Anti-TAT Además de los anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT de secuencia nativa íntegros descritos aquí, se contempla que el anticuerpo anti-TAT y las variantes de polipéptido TAT pueden prepararse. Variantes de polipéptido anti-TAT y anticuerpo Anti-TAT pueden prepararse al introducir cambios de nucleotide apropiados en el ADN de codificación y/o por síntesis del anticuerpo o polipéptido deseado. Aquellos con destreza en la especialidad apreciarán que cambios de amino ácidos pueden alterar procesos de post -traducción del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT, tal como cambiar el número o posición de sitios de glicosilación o alterar las características de anclado de membrana. Variaciones en los anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT aquí descritos pueden realizarse por ejemplo utilizando cualquiera de las técnicas y guías para mutaciones conservadoras y no conservadoras establecidas por ejemplo en la Patente de los E.U.A No. 5,364,934. Variaciones pueden ser una substitución, eliminación o inserción de uno o más codones que codifican el anticuerpo o polipéptido que resulta en un cambio en la secuencia de amino ácidos como se compara con el polipéptido o anticuerpo de secuencia nativa. Opcionalmente , las variaciones por substitución de al menos un amino ácido con cualquier otro amino ácido en uno o más de los dominios del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. Guía para determinar que reciba amino ácido, puede insertarse, substituirse o eliminarse sin afectar adversamente la actividad deseada, puede encontrarse al comparar la secuencia del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con la de moléculas de proteína conocidas homologas y minimizar el número de cambios de secuencia de amino ácidos realizados en regiones de alta homología. Substituciones de amino ácido puede ser el resultado de reemplazar un amino ácido con otro amino ácido que tiene propiedades químicas y/o estructuras similares, tales como el reemplazo de una leucima con una serina, es decir reemplazos de amino ácido concervadores . Inserciones o eliminaciones pueden opcionalmente estar en el rango de aproximadamente 1 a 5 amino ácidos. La variación permitida puede ser determinada al hacer sistemáticamente inserciones, eliminaciones o substituciones de amino ácidos en la secuencia y probar las variantes resultantes por actividad que se exhibirá por la secuencia nativa madura o de longitud integra. Fragmentos de polipéptido TAT y Anticuerpo Anti-TAT se proporcionan aquí. Estos fragmentos pueden ser truncados en el extremo N o extremo C o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo cuando se comparan con proteína o anticuerpo nativo íntegro.
Ciertos fragmentos carecen de residuos amino ácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. Fragmentos de polipéptido TAT y Anticuerpo Anti-TAT pueden prepararse por cualquiera de una cantidad de técnicas convencionales. Fragmentos péptido deseados pueden sintetizarse químicamente. Un enfoque alterno involucra generar fragmentos de polipéptido o anticuerpo por digestión enzimatica, por ejemplo a tratar la proteína con una enzima que se conoce escinde proteínas en sitios definidos por residuos amino ácidos particulares, o por digestión del ADN con enzimas de restricción convenientes y aislar el fragmento deseado. Todavía otra técnica conveniente involucra aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifica un fragmento polipéptido o anticuerpo deseado, por reacción de cadena polimerasa (PCR) . Oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento AND se emplean en los cebadores 5' y 3' de la PCR. De preferencia, fragmentos de polipéptidos TAT y anticuerpo anti-TAT comparten al menos una actividad inmunológica y/o biológica con el polipéptido TAT o anticuerpo ANTI-TAT nativo aquí descrito. En modalidades particulares, substituciones conservadoras de interés se muestran en la Tabla 6 bajo el encabezado de substituciones preferidas. Si estas substituciones resultan en un cambio en actividad biológica, entonces más cambios substanciales, denominaos substituciones ejemplares en la Tabla 6, o como se describe más a continuación con referencia a clases de amino ácidos, se introducen y los productos se clasifican . Tabla 6 Residuo Substituciones Substituciones Original Ej emplares Preferidas Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg lie (I) leu; val; met ; ala; phe; norleucina leu Leu (L) norleucina; ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) t p; phe; thr; ser phe Val (V) ile ; leu met ; phe; ala; norleucina leu Modificaciones substanciales en identidad inmunológica del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se logran al seleccionar substituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura principal del polipéptido en el área de la substitución, por ejemplo, como una hoja o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) la masa o el volumen de la cadena lateral . Residuos de origen natural se dividen en grupos con base en propiedades de cadena lateral comunes: (1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicas neutras: cys, ser, thr; (3) acídica: asp, glu; (4) básica: asn, gln, his, lys, arg,- (5) residuos que influencian orientación de cadena: gly, pro ; y (6) aromáticas: trp, tyr, phe . Substituciones no conservadoras involucrarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Estos residuos substituidos también pueden introducirse en los sitios de substitución conservadores o más preferiblemente en los sitios restantes (no conservados) . Las variaciones pueden realizarse utilizando métodos conocidos en la especialidad tales como mutagenesis mediada por oligonucleótido (dirigida por sitio) , exploración de alanina, y mutagenesis PCR. Mutagenesis dirigida por sitio [Cárter y colaboradores, Nucí. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller y colaboradores, Nucí. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagenesis de cásete [Wells y colaboradores, Gene, 34:315 (1985)], mutagenesis de selección de restricción [Wells y colaboradores, Philos. Trans. R. Soc . London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas, pueden realizarse en el área de clonado para producir el anticuerpo anti-TAT o AND varíente clonado para producir el anticuerpo anti-TAT o ADN variante de polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT. Análisis de exploración de amino ácido también puede emplearse para identificar uno o más amino ácidos sobre una secuencia continua. En los amino ácidos de exploración preferidos están amino ácidos neutros relativamente pequeños. Estos amino ácidos incluyen alanina, glicina, serina, y cisteina. Alanina típicamente es un amino ácido de exploración preferido entre este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que alteren la conformación de cadena principal de la varfiante [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. Alanina también se prefiere típicamente debido a que es el amino ácido más común. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones encerradas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol . , 150:1 (1976)]. Si la substitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variantes, puede utilizarse un amino ácido isóterico. Cualquier residuo de cisteina no involucrado para mantener la conformación adecuada del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT también puede ser substituido generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar entrelazamiento aberrante. Por el contrario, enlaces de cisterna pueden agregarse al anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuedrpo tal como un fragmento Fv) .
Un tipo particularmente preferido de variantes de substitución involucra sustituir uno o más residuos de región intervariable de un anticuerpo padre (por ejemplo anticuerpo humanizado o humano) . En general, la o las variantes resultantes seleccionada para mayor desarrollo, tendrán propiedades biológicas mejoradas respecto al anticuerpo padre del cual se generaron. una forma conveniente para generar estas variante de substitución involucra una duración de afinidad utilizando exhibición de fago. Brevemente, varios sitios de región intervariable (por ejemplo 6 a 7 sitios) se mutan para generar todas las sustituciones amino posibles en cada sitio. La variante de anticuerpo así generada se exhiben en una forma monovalente a partir de partículas fago filamentosas como fusiones a producto de gen III de M13 empacado en cada partícula. Las variantes exhibidas por fago luego se clasifican por su actividad biológica (por ejemplo afinidad de enlace como aquí se describe) . A fin de identificar sitios de región intervariable candidatos para modificación, puede realizarse mutagenesis de exploración de alanina para identificar duración de alanina para identificar residuos de región intervariable que contribuye significativamente al enlace de antígeno. En forma alterna o adicionalmente, puede ser benéfico el analizar una estructura de cristal de complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el polipéptido TAT humano y anticuerpo. Estos residuos de contacto y residuos vecinales son candidatos para sustitución de acuerdo con la técnica aquí elaborada. Una vez que estas variants se generan, el panel de variantes se somete a clasificación como se describe aquí y anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para mayor desarrollo. Moléculas de ácido Nucleico que docifican variants de secuencia de amino ácido del anticuerpo anti-TAT se preparan por una variedad de métodos conocidos enla especialidad. Estos métodos incluyen pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variants de secuencia de amino ácidos de origen natural (o preparación por mutagenesis mediada por oligonuucleotido) o dirigida por sitio) , mutagenesis PCR y mutagenesis de cásete de una variante previamente preparada o una versión no variante del anticuerpo Anti- TAT. H . Modificaciones de polipéptidos TAT y anticuerpos Anti-TAT Modificaciones covalentes de anticuerpos anti- TAT y polipéptidos TAT se inclluyen dentro del alcance de la invención. Un tipo de modificación covalente incluye el reaccionar residuos de amino ácido objetivo de un polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales selectas o los residuos terminales N o C del polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT. Derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo para entrelazar polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT con una matriz de soporte insoluble en agua o superficie para utilizar en el método para purificar anticuerpos anti-TAT y viceversa. Agentes de entrelazamiento comúnmente empleados incluyen por ejemplo 1, 1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehido, N-hidroxisuccinimida ésteres, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicilico , imidoésteres homobifuncionales , incluyendo disuccinimidil ésteres tales como 3,3' -ditiobis (succinimidilpropionato) , maleimidos bifuncionales tales como bis-N-maleimido- 1 , 8-octano y agentes tales como metil-3 - [ (p-azidofenil) ditio] propioimidato . Otras modificaciones incluyen deamidación def rewsiduos glutaminilo y asparaginilo con los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, metilación de los grupos a-amino de lisina, arginina, y cadenas laterales histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties (proteínas: estructura y propiedades moleculares), W.H. Freeman & Co . , San Francisco, pp. 79-86 (1983)] , acetilación de la amina N- terminal , amidación de cualquier grupo carboxilo C-terrminal . Otro tipo de modificación covalente del polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT incluido dentro del alcance de esta invención, comprende alterar el patrón de glicolización activo del anticuerpo o polipéptidos "Alterar el patrón de glicosilación nativo" se pretende para los presentes propósitos que significa eliminar una o más porciones carbohidrato que se encuentran en el polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT de secuencia nativa (ya sea al eliminar el sitio de glicosilación adyacente o al eliminar la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos) , y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT de secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas natives que involucran un cambio en la naturaleza y proporciones de las diversas porciones carbohidrato presentes.
Glicosilación de anticuerpos y otros polipéptidos típicamente ya está N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la conexión de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier amino ácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para conexión enxzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral asparagina. De esta manera, la presencia se cualquiera de estas secuencias tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicolización potencial. Glicozilación O-enlazadas se refiere a la conexión de uno de los azúcares N-acetilgalactosa amina, galactosa, o xilosa a un hidroxiamino ácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede emplearse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . Adición de sitios de glicozilación al polipéptido TAT o anticuerpo TAT se logra convenientemente alterando la secuencia de amino ácido de manera tal que contenga uno o más de las secuencias tripéptido anteriormente descritas (para sitios de glicolización N-enlazado) . La alteración también puede realizarse por la adición de, o substitución por, uno o más residuos serina o triamina a la secuencia del polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT original (para sitios de glicolización O-enlazados) . La secuencia de amino ácidos de polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT puede alterarse opcionalmente a través de cambios a nivel ADN, particularmente al notar el ADN que codifica el anticuerpo amti-TAT o polipéptido TAT en bases preseleccionadas de manera tal que se generan codones que se producirán en los amino ácidos deseados.
Otro medio para incrementar porciones carbohidrato en el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT por acoplamiento químico o enzimático de glicosidos polipéptido. Estos métodos se describen en la técnica, por ejemplo en WO 87/05330 publicada 11 de septiembre 1987, y en Aplin and Wriston, CRC Crit . Rev. Biochem. , pp. 259-306 (1981) . La remoción de porciones carbohidrato presentes en el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT puede lograrse química o enzimáticamente o por substitución mutacional de codones que codifican residuos amino ácidos que sirven como objetivos para glicosilación . Técnicas de desglicosilación química se conocen en la especialidad y describen por ejemplo por Hakimuddin, y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) and by Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). Escisión enzimática de porciones carbphidrato en polipéptidos puede lograrse por el uso de una variedad de endo-y exo-glicosidas como se describe por Thotakura y colaboradores, Meth. Enzymol., 138:350 (1987). Otro tipo de modificación covalente de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT comprende enlazar el anticuerpo o polipéptido con uno de una variedad de polímeros no proteinaceos por ejemplo polietilen glicol (PEG) , polipropylen glicol, o polioxialquilenos , en la forma establecida en las patentes de los E.U.A. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337. El anticuerpo o polipéptido también puede ser atrapado en micro cápsulas preparadas por ejemplo por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo hidroximetilcelulosa o microcápslas de gelatina y microcápsulas de poli (metilmetactilato , respectivamente), en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas) , o en macroemulsiones . Las técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed. , (1980). El anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT de la presente invención también puede modificarse en una forma para constituir moléculas quiméricas que comprenden un anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAt considerados con otro polipéptido heterologo o secuencia de amino ácidos. En una modalidad, esta molécula quimérica comprende una fusión del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con un polipéptido de etiqueta que proporciona un epítope al cual puede ligarse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta . La etiqueta epítope generalmente se coloca en el extreme amino o carboxilo del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. La presencia de estas formas etiquetadas con epítope del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT puede detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido de etiqueta. También el suministro de la etiqueta epítope permite que el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se purifique fácilmente mediante purificación definida utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que liga a la etiqueta epítope. Diversos polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en la especialidad. Ejemplos incluyen etiquetas poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gli) tags; el polipéptido etiqueta HA de catarro y su anticuerpo 12CA5 [Field y colaboradores, Mol. Cell . Biol . , 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc tag y sus anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, (Biología miolecular y cellular) 5:3610-3616 (1985)] ; y la etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus de Herpes Simplex y su anticuerpo [Paborsky y colaboradores, Protein Engineering (Ingeniería de proteína), 3 (6): 547-553 (1990)]. Otros polipéptidos de etiqueta incluyen polipéptidos bandera [Hopp y colaboradores, BioTechnology, (Biotecnología) 6:1204-1210 (1988)]; El péptido epítope KT3 [Martin y colaboradores, Science, (Ciencia) 255:192-194 (1992)]; y un péptido epítope de a-tubulina [Skinner y colaboradores, J. Biol . Chem. , 266:15163-15166 (1991)]; y la etiqueta péptidos proteína gen T7 10 [Lutz-Freyermuth y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 87:6393-6397 (1990) ] . En una modalidad alterna, la molécula quimérica puede comprender una fusión del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como una "inmunoadhesina" esta fusión puede ser a la región Fe de una molécula y GG. Las fusiones Ig de preferencia incluyen la sustitución de una forma soluble (dominio de transmembrana eliminado o inactivado) de un anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones de bisagra CH2 y CH3, o la bisagra CH1, CH2 y CH3 de una molécula IgGl . Para la producción de fusiones de inmunoglobulina ver también la Patente de los E.U.A. No. 5,428,130 otorgada en junio 27 de 1995. I . Preparación de Anticuerpos Anti-TAT y Polipéptidos TAT. La siguiente descripción se refiere primordialmente a la producción de anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT al cultivar células transformadas o transíectadas con un vector que contiene ácido nucleico que codifica -polipéptido TAT y -anticuerpo anti-TAT. Por supuesto se contempla que métodos alternos que son bien conocidos en la especialidad, pueden ser empleados para preparar anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT. Por ejemplo, la secuencia de amino ácidos apropiada, o sus porciones, puede producirse por síntesis directa de péptidos utilizando técnicas de fase sólida [ver por ejemplo, Stewart y colaboradores, Solid-Fase Peptide Synthesis (Síntesis de Péptidos en Fase Sólida), W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154 (1963)]. Síntesis de proteína in vitro puede realizarse utilizando técnicas manuales o automatizadas. Síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo utilizando un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Diversas porciones del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT pueden sintetizarse químicamente por separado y combinadas utilizando métodos químicos o enzimáticos para producir el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. 1. Aislamiento de ADN que codifica Anticuerpo Anti-TAT o polipéptido TAT. ADN que codifica anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT puede obtenerse de una biblioteca cADN preparada a partir de tejido que se considera posee el mAR de polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT y para expresarlo a un nivel detectable. De acuerdo con esto, ADN de polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT humano pueden obtenerse convenientemente de una biblioteca cADN preparada a partir del tejido humano. El gen que codifica polipéptido TAT o -anticuerpo anti-TAT también puede obtenerse de una biblioteca genómica o por procedimientos científicos conocidos (por ejemplo síntesis de ácidos nucleicos automatizada) . Las bibliotecas pueden ser clasificadas con sondas (tales como oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20 a 80 bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el . La clasificación del cADN o biblioteca genómica con la sonda selecta puede conducirse utilizando procedimientos standard, tales como se describe por Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un medio alterno para aislar el gen que codifica el polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT es utilizar metodología PCR [Sambrook y colaboradores, arriba; Dieffenbach y colaboradores, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)] . Técnicas para supervisar una biblioteca cADN son bien conocidas en la especialidad. Las secuencias de oligonucleótidos selectas como sondas deberán ser de longitud suficiente y suficientemente no ambiguas que se minimicen falsos positivos. El oligonucleótido de preferencia se etiqueta de manera tal que puede ser detectado ante hibridización en ADN en la biblioteca que se supervisa. Métodos para etiquetar son bien conocidos en la especialidad e incluyen el uso de radio-etiquetas como ATP frente a 32P-etiquetado, biotinilación o etiquetado de enzima. Condiciones de hibridización, incluyendo severidad moderada y alta severidad, se proporcionan por Sambrook y colaboradores, arriba. Secuencias identificadas en estos métodos de supervisión de biblioteca pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank, u otras bases de datos de secuencia privada. La identidad de secuencia (en cualquiera del nivel amino ácido o nucleótido) con regiones definidas de la molécula o a través de toda la secuencia íntegra pueden determinarse ustilizando métodos conocidos en la especialidad y como se describe aquí. Ácido nucleico que tiene secuencia de codificación de proteína puede obtenerse por supervisión de bibliotecas genómicas o cADN selectas utilizando la secuencia de amino ácidos deducida descrita aquí por primera vez y de ser necesario utilizando procedimientos de extensión de cebador como se describe por Sambrook y colaboradores, arriba, para detectar precursores e intermediarios de procedimiento de mARN que pueden no haber sido transcritos en forma inversa en cADN. 2. Selección y Transformación de Células Hospederas Las células hospederas se transfectan o transforman con vector de clonación o expresión descritos aquí para producción de polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT y cultivados en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo tales como medio, temperatura, f y semejantes, pueden seleccionarse por una persona con destreza en la especialidad sin indebida experimentación. En general, principios, protocolos y técnicas prácticas para llevar al máximo la productividad de cultivos celulares pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (Biotecnología de Células de Mamífero: un Enfoque Práctico) , M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook y colaboradores, arriba. Métodos de transfección de células eucarióticas y transformación de células procarióticas se conocen para la persona con destreza ordinaria en la especialidad, por ejemplo CaCl2, CaP04, mediada por liposoma y electroporación. Dependiendo de la célula hospedera empleada, la transformación se realiza utilizando técnicas standard apropiadas a estas células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe por Sambrook y colaboradores, arriba, o electroporación generalmente se utiliza para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens, se utiliza para transformación de ciertas células de planta como se describe por Shaw y colaboradores, Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para células de mamíferos sin estas paredes celulares, el método de precipitación de fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology (Virología), 52:456-457 (1978) puede emplearse. Aspectos generales de transfecciones de sistemas hospederos de células de mamífero se han descrito en la patente de los E.U.A. No. 4,399,216. Transformaciones en levadura típicamente se llevan a cabo de acuerdo con el método de Van Solingen y colaboradores, J. Bact . , 130:946 (1977) y Hsiao y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, otros métodos para introducir ADN en células tales como por microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas o policationes, por ejemplo polibreno, poliornitrina, también pueden ser empleados. Para diversas técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown y colaboradores, Methods in Enzymology (Métodos en Enzimología) , 185:527-537 (1990) y Mansour y colaboradores, Nature, 336:348-352 (1988). Células hospederas convenientes para clonar o expresar el ADN en los vectores presentes, incluyen células de procariota, levadura o eucariota superior. Procariotas convenientes incluyen pero no están limitadas a aubacterias, tales como organizmos Gram-negativos o Gram-positivos , por ejemplo Enterobacteriaceae tales como E. coli. Diversas cepas de E. coli están disponibles públicamente, tales como la cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31,446); E . coli X1776 (ATCC 31,537); cepa E. coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células hospederas procarióticas convenientes incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella tyfimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de abril de 1989) , Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces . Estos ejemplos son ilutrativos más que limitantes. La cepa W3110 es un hospedero padre u hospedero particularmente preferido debido a que es una cepa hospedera común para fermentaciones de producto de ADN recombinante . De preferencia, la célula hospedera secreta cantidades mínimas de enzimas protiolíticas . Por ejemplo, la cepa W3110 puede ser modificada para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al hospedero, con ejemplos de estos huéspedes que incluyen la cepa E. coli W3110 1A2 , que tiene el genotipo completo tonA; la cepa E. coli W3110 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 ; la cepa E. coli W3110 27C7 (ATCC 55,244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 foA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr; la cepa E. coli W3110 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 foA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; la cepa E. coli W3110 40B4, es que la cepa 37D6 con una mutación para eliminación degP no resistente a canamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante descrita en la patente de los E.U.A. No. 4,946,783 otorgada el 7 de agosto de 1990. En forma alterna, son convenientes métodos invitro de clonación, por ejemplo reacciones PCR u otras de polimerasa de ácido nucléico. Anticuerpo de longitud íntegra, fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión de anticuerpo pueden producirse en bacterias, en particular cuando no se requieren función efectuada a Fe y glicosilación, tal como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado por sí mismo muestra efectividad en destrucción de célula de tumor. Anticuerpos de longitud íntegra tienen mayor vida media en circulación. La producción en E. coli es más rápida y más eficiente en costos. Para expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, ver por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 5,648,237 (Cárter y colaboradores), patente de los E.U.A. No. 5,789,199 (Joli y colaboradores), y patente de los E.U.A 5,840,523 (Simmons y colaboradores) que describen secuencias de señal y región de inicio y traducción (TIR = translation initiation región) para optimizar la expresión y secreción, estas patentes se incorporan aquí por referencia. Después de expresión, el anticuerpo se aisla de la pasta de células de E. coli en una fracción soluble y puede purificarse a través de por ejemplo una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. Puede llevarse a cabo purificación final similar al proceso para purificar anticuerpos expresado por ejemplo en células CHO. Además de procariotas, microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras son hospederos de expresión o clonación convenientes para vectores que codifican-polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo hospedero eucariótico menor comúnmente empleado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 publicado en mayo 2 de 1985); hospederos Kluyveromyces (patente de los E.U.A. No. 4,943,529; Fleer y colaboradores, Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt y colaboradores, J. Bacteriol., 154 (2) : 737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosofilarum (ATCC 36,906; Van den Berg y colaboradores, Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans , y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna y colaboradores, J. Basic icrobiol . , 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces such as Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicado el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolipocladium (WO 91/00357 publicado el 10 de enero de 1991) , y hospederos de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance y colaboradores, Biochem. Biofys. Res. Commun. , 112:284-289 [1983]; Tilburn y colaboradores, Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelli y Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985] ) . Levaduras metilotrópicas son convenientes aquí e incluyen pero no están limitadas a levadura capaz de crecimiento en metanol seleccionado de los géneros qeu consisten de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces , Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ejemplares de esta clase de levaduras puede encontrarse en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982) . Células hospederas convenientes para la expresión de anticuerpo anti-TAT glicosilado o péptido TAT se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células invertebradas incluyen células de insectos tales como Drosofila S2 y Spodoptera Sf9, así como células de plantas tales como cultivos celulares de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tomate y tabaco. Numerosas cepas y variantes de baculovirus y células hospederas de insecto permisivas correspondientes de hospederos tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosofila melanogaster (mosca de las frutas) , y Bombyx mori se han identificado. Una variedad de cepas virales para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo la variante L-l de Autógrafa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y estos virus pueden emplearse como los virus presentes de acuerdo con la presente invención, particularmente para transección de células de Spodoptera frugiperda . Sin embargo, el interés ha sido lo más grande en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultura de tejido) se ha vuelto un procedimiento rutinario. Ejemplos de lineas celulares hospederas de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñon de simio transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonados para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham y colaboradores, J. Gen Virol . 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovarios de hámster Chino/ -DHFR (CHO, Urlaub y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de ratón sertoli (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de simio (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de simio verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano ( 138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2 , HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather y colaboradores, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 ; y línea de hepatoma humano (Hep G2) . Células hospederas se transforman con los vectores de clonación o expresión anteriormente descritos para producción de polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT y cultivan en el nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. 3. Selección y Uso de un Vector Replicable El ácido nucleico (por ejemplo, cADN o ADN genómico) que codifica polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT puede insertarse en un vector replicable para clonación (amplificción del ADN) o para expresión. Diversos vectores están disponibles públicamente. El vector puede por ejemplo estar en la forma de un plásmido, cosmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector por una variedad de procedimientos. En general, se inserta ADN en uno o varios sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas en la especialidad. Componentes de vector generalmente incluyen pero no están limitados a, uno o más de una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mej orador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores convenientes que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación standard que se conocen para la persona con destreza en la especialidad. El TAT puede producirse en forma recombinante no solo en forma directa, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia de seña u otro polipéptido que tiene sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN que codifica-polipéptido TAT o -anticuerpo anti-TAT que se inserta en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica selecta, por ejemplo del grupo de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o líderes de enterotoxina II termoestable . Para secreción de levadura, la secuencia de señal puede ser por ejemplo el líder de invertasa de levadura, líder de factor alfa (incluyendo líderes de factor-a de Saccharomyces y Kluyveromyces , este último se describe en la patente de los E.U.A. No. 5,010,182), o líder de fosfatasa ácida, el líder glucoamilasa de C. albicans (EP 362,179 publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en WO 90/13646 publicada el 15 de noviembre de 1990. En expresión de células de mamíferos, pueden emplearse secuencias de señal de mamífero para dirigir expresión de la proteína, tales como secuencias de señal de polipéptidos secretados de la misma o especies relacionadas así como líderes de secretorios virales .
Tanto vectores de expresión como clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicar en una o más células huésped selectas. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas , el origen del plásmido 2µ es adecuado para levadura, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos. Los vectores de expresión y clonación típicamente contendrán un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable . Genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina , (b) complementan deficiencias auxotrópicas , o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilos. Un ejemplo de marcadores seleccionadores convenientes para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para tomar el ácido nucleico que codifica -polipéptido TAT o - anticuerpo anti-TAT, tales como DHFR o timidina cinasa. Una célula huésped apropiada, cuando se emplea DHFR de tipo silvestre es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparado y propagado como se describe por Urlaub y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección conveniente para utilizar en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb y colaboradores, Nature, 282:39 (1979); Kingsman y colaboradores, Gene, 7:141 (1979); Tschemper y colaboradores, Gene, 10:157 (1980) ] . El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la habilidad por desarrollarse en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics (Genética), 85:12 (1977) ] . Vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor enlazado en forma operable con la secuencia de ácido nucléico que codifica -polipéptido TAT o -anticuerpo anti-TAT para dirigir síntesis de mARN. Promotores reconocidos por una variedad de células hospederas potenciales son bien conocidos. Promotores adecuados para utilizar con hospederos procarióticos incluyen el sistema promotor lactosa y beta-lactamasa [Chang y colaboradores, Nature, 275:615 (1978); Goeddel y colaboradores, Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)] . Promotores para utilizar el sistema bacteriano también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada al ADN que codifica polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT. Ejemplos de secuencias promotoras convenientes para utilizar con hospederos de levadura incluyen los promotores para 3 -fosfoglicerato cinasa [Hitzeman y colaboradores, J. Biol . Chem. , 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess y colaboradores, J. Adv. Enzyme Reg. , 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldeido-3 - fosfato dehidrogenasa , hexocinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructocinasa , glucosa-6-fosfato isomerasa, 3 - fosfoglicerate mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucocinasa. Otros promotores de levadura que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento son las regiones promotoras para alcohol dehidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneina , gliceraldehido-3 - fosfato dehidrogenasa y enzimas responsables para utilización de maltosa y galactosa.
Vectores y promotores convenientes para utilizar en la expresión de levadura además se describen en EP 73,657. Transcripción de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT de vectores en células hospederas de mamífero se controla por ejemplo por promotores que se obtienen de los genomas de virus tales como virus polioma, virus de pustulación avícola (UK 2,211,504 publicado el 5 de julio de 1989) , adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviario, citomegalovirus , un rotavirus, virus de hepatitis-B y Virus de Simio 40 (SV40) , de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo el promotor actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, siempre que estos promotores sean compatibles con el sistema de célula hospedera. La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT por eukariotas superiores puede incrementarse al insertar una secuencia mejoradora en el vector. Los mej oradores son elementos de acción cis de ADN, usualmente de aproximadamente 10 a 300 bp, que actúan en un promotor para incrementar su transcripción. Muchas secuencias mej oradoras ahora se conocen de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina-, alf -fetoproteina, e insulina) . Típicamente sin embargo, se utilizará un mejorador de un virus de célula eucariótica. Ejemplos incluyen el me orador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (bp 100-270) , el mej orador de promotor temprano de citomegalovirus , el mej orador de polioma, en el lado tardío del origen de replicación y mejoradores de adenovirus. El mejorador puede ser escindido en el vector en una posición 5' o 3' respecto a la secuencia de codificación de anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT, pero de preferencia se localiza en un sitio 5' del promotor. Vectores de expresión utilizados en células hospederas eucarióticas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilizar el mAR . Estas secuencias están comúnmente disponibles de las regiones 51 y ocasionalmente 3 ' no traducidas de ADNs eucarióticos o virales o AD s . Estas regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida de mARN que codifica anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. Todavía otros métodos, vectores y células hospederas adecuadas para adaptación en la síntesis de anticuerpo anti-TAT o polipéptidos TAT en cultivo celular de vertebrados recombinante se describen en Gething y colaboradores, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei y colaboradores, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; y EP 117, 058. 4. Cultivar las Células Hospederas Las células hospederas utilizadas para producir el anticuerpo anti-TAT o polipéptido de TAT de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Medios comercialmente disponibles tales como Ham's FIO (Sigma) , Medio Esencial Mínimo ( (MEM = Minimal Essential Médium) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y Medio Eagle Modificado con ( (DMEM = Modified Eagle 1 s Médium Dulbecco) , sigma) ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células hospederas. Además, cualquiera de los medios descritos por Ham y colaboradores, Meth. Enz . 58:44 (1979), Barnes y colaboradores, Anal. Biochem.102 :255 (1980), patente de los E.U.A. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; O 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o patente de los E.U.A. No. 30,985 pueden utilizarse como medios de cultivo para las células hospederas. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferina, o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como la droga GENTAMICINA) , elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualrrtente presentes a concentraciones finales en el rango micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera otros suplementos necesarios también pueden ser incluidos a concentraciones apropiadas que serán conocidas por aquellos con destreza en la especialidad. Las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH y semejantes son aquellas primeramente empleadas con la célula hospedera selecta para expresión y serán aparentes a la persona con destreza ordinaria en la especialidad. 5. Detección de Expresión/Amplificación de Gen Expresión y/o amplificación de genes puede vendidos en una muestra directamente, por ejemplo por técnicas Southern convencional, técnica Northern para cuantificar la transcripción de mARN [Thomas, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201 5205 (1980)], transferencia punto (análisis de ADN) , o hibridización in situ utilizando una sonda etiquetada apropiadamente, con base en las secuencias que se proporcionan. En forma alterna, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos de ADN ARN o dúplex de proteína ADN.
Los anticuerpos a su vez pueden etiquetarse y el ensayo llevarse a cabo cuando el dúplex se liga a una superficie, de manera tal que al formar el dúplex en la superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo ligado al dúplex. Expresión de genes en forma alterna puede ser medida por métodos inmunológicos , tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo del cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto de gen. Anticuerpos útiles para tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos muestras ya puede ser monoclonal o policlonal y puede prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido TAT de secuencia reactiva o contra un péptido sintético con base en las secuencias de ADN que aquí se proporcionan o contra una secuencia exógena fusionada al ADN TAT y codificar un epitope anticuerpo específico . 6. Purificación del Anticuerpo Anti-TAT y Polipéptido TAT Formas de anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT pueden recuperarse del medio de cultivo o de lisados de células hospederas. De estar ligados a membrana, pueden liberarse de la membrana utilizando una solución de detergente conveniente (por ejemplo Triton-X 100) o por escisión enzimática. Células empleadas para expresar el anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT pueden modificarse o desprenderse por diversos medios físicos y químicos tales como ciclos de congelamiento-descongelamiento, sonicación, ruptura mecánica o agentes de lisis celular. Se puede desear el purificar anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT de polipéptidos y proteína celular recombi ante . Los siguientes procedimientos son ejemplares de adecuados procedimientos de purificación: al fraccionar en una columna de intercambio de iones; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio de cationes tales como DEAE; cromatoenfoque ; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; fijación de gel utilizando por ejemplo Sefadex G-75; columnas de proteína A Sefarose para retirar contaminantes tales como IgG; y columnas de quelación de metal para ligar formas etiquetadas con epitope del anticuerpo anti-TAT y polipéptido TAT. Diversos métodos de purificación de proteínas pueden emplearse y estos métodos se conocen en la especialidad y describen por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology (Métodos en Enzimología Deutscher) , 182 (1990); Scopes, Protein Purification : Principies y Practice (Purificación de Proteínas: Principios y Práctica), Springer-Verlag, New York (1982). La o las etapas de purificación selectas dependerán por ejemplo de la naturaleza del proceso de producción empleado y en anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT producido. Cuando se utilizan técnicas recombinantes , el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o directamente secretado en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primer etapa, los desechos de partículas, ya sean células huésped o fragmentos lisados se retiran por ejemplo por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio peripásmico de E. coli. Brevemente, pasta celular se descongela en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) sobre aproximadamente 30 minutos. Desechos celulares pueden retirarse por centrifugación. Cuando se secreta el anticuerpo en el medio, sobrenadantes de estos sistemas de expresión en general primero se concentran utilizando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir proteolisis y antibióticos pueden incluirse para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios . La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse utilizando por ejemplo cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel , diálisis y cromatografía de afinidad, con cromatografía definida que es la técnica de purificación preferida. La conveniencia de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio de inmunoglobulina Fe que está presente en el anticuerpo. Proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas gammal , gamma2 o gamma4 humanas (Lindmark y colaboradores, J. Immunol . Meth. 62:1-13 (1983)). Se recomienda proteína G para todos los isotipos de ratón y para gamma3 humano (Guss y colaboradores, EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual el ligando de afinidad se conecta es más a menudo agarosa, pero estás disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil ) benceno permiten más rápidos gastos de flujo y más cortos tiempos de procesamiento que los que pueden lograrse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3 , la resina Bakerbond ABX (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteínas tales como fraccionación en una columna de intercambio de iones, precipitación con etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina, cromatografía de SEPHAROSE en una resina de intercambio de aniones o cationes (tal como columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio, también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar. Siguiendo cualquier o cualesquiera etapas de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH utilizando un amortiguador de elusión a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, de preferencia realizado a bajas concentraciones de sal, (por ejemplo de aproximadamente 0 a 0.25M de sal) . J . Formulaciones Farmacéuticas Formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos de enlace TAT, moléculas orgánicas de enlace TAT y/o polipéptidos TAT utilizados de acuerdo con la presente invención, se preparan para almacenamiento al mezclar el anticuerpo, polipéptido, oligopéptido o molécula orgánica que tiene el grado de pureza deseado con portadores excipientes estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol , A. Ed. (1980) ) , en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores, excipientes, o estabilizantes aceptables no son tóxicos a los receptors a las dosis y concentraciones empleadas, incluyen amortiguadpres tales como acetato, Tris, fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservaores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol de butil o bencil; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol); bajo peso molecular (menos que aproximadamente 10 residuos) polipep idos ; proteínas tlaes como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofilicos tales como polivinilpirrolidona ; amino ácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidína, arginina, o lisina; monosacaridos , disacaridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; tonificantes tales como trealosa y cloriuro de sodio; azúcares tales como sacarosa, manitol, trealosa o sorbitol; surfactantes tales como polisorbato; contra iones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de proteína n) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilen glicol (PEG) . El anticuerpo de preferencia comprende el anticuerpo a una concentración entre mg/ml, de preferencia 10-100 mg/ml. Las presentes formulaciones también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, de preferencia aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente entre si. Por ejemplo, además de un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica TAT, puede ser conveniente el incluir en la formulación un anticuerpo adicional por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-TAT liga a un epítope diferente en el polipéptido TAT o anticuerpo en algún otro objetivo tal como factor de crecimiento que afecta el crecimiento de cáncer particular. En forma alterna o adicionalmente , la composición también puede comprender un agente quimoterapéutico, agente citotóxico, citosina, agente inhibidor de crecimiento, agente anti-hormonal y/o cardioprotector . Estas moléculas están convenientemente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido. Los ingredientes activos también puede ser tratados en microcapsules preparadas por ejemplo por técnicas de coaservación o por polimerización interfacial, por ejemplo hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de suministro coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) . Preparaciones de liberaciones sostenidas pueden ser elaboradas. Ejemplos convenientes de preparación de liberación sostenida incluyen matrices semi permeables, polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, estas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogels (por ejemplo, poli (2 -hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , polilactidas (Patente de los E.U.A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutamico y gamma etil-L-glutamato, etilen vinil acetato no-degradable polímero de ácido láctico-glicólico degradable tales como LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-glicólico y acetato de leuprolida) , y ácido poli-D- ( - ) -3 -hidroxibutirico .
Las formulaciones a utilizarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente con filtración a través de filtración estériles . K. Diagnósticos y Tratamiento con anticuerpos Anti-TAT( oligopéptidos de enlace TAT moléculas orgánicas de enlace TAT. Para determinar expresión TAT en el cáncer, diversos ensayos de diagnóstico están disponibles. En una modalidad, puede analizarse sobre expresión de polipéptidos TAT por inmunohistoquímica (IHC) . Secciones de tejido incrustadas en parafina de una biposia de tumor pueden someterse al ensayo IHC y otorgárseles un criterio de intensidad de tinción con proteína TAT como sigue: Calificación 0 - sin tinción se observa o tinción de membrana se membrana se observa en menos de 10% de las células de tumor. Calificación 1+ - Una membrana tiene/difícilmente perceptible cuya tinción se detecta en más de 10% de las células de tumor. Las células solo se tiñen en parte de su membrana. Calificación 2+ - una tinción de membrana débil a moderada completa se observa en más de 10% de las células de tumor.
Calificación 3+ - una tinción de membrana moderada fuertemente completa se observa en más de 10% de las células de tumor Aquellos con calificación a 0 o 1+ para expresión de polipéptido TAT pueden caracterizarse como que no sobre expresan TAT, mientras que aquellos tumors con calificaciones 2+ o 3+ pueden caracterizarse que sobre expresan TAT. En forma alterna, o adicionalmentee , ensayos FISH tales como el INFORM® (vendido por Ventana, Arizona) o PATHVISION® (Vysis, Illinois) pueden llevarse a cabo o en tejido de tumor fijo con formalina, incrustado en parafina para determinar la extensión (de haber) sobre expresión TAT en el tumor. La amplificación o sobre expresión TAT puede evaluarse utilizando un ensayo de diagnóstico in vivo por ejemplo al administrar una molécula (tales como un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica) que liga la molécula a detectarse y se marca con una etiqueta detectable (por ejemplo un isótopo radioactivo) o una etiqueta fluorescente) y explorar externamente al paciente para la ubicación de la etiqueta. Como se describió anteriormente, los anticuerpos anti-TAT, oligopéptidos o moléculas orgánicas de la invención tienen diversas aplicaciones no terapéuticas. Los anticuerpos, oligopéptidos o moléculas orgánicas anti-TAT de la presente invención pueden ser útiles para diagnóstico y escalonar cánceres que expresan polipéptidos TAT (por ejemplo en radioformación de imagen). LOs anticuerpos, oligopéptidos y moléculas orgánicas también son útiles para purificación o inmunoprecipitación de polipéptidos TAT a partir de células, para detección y cuantificación de polipéptidos TAT in vitro, por ejemplo en una ELISA o una técnica Western, para exterminar y eliminar células que expresan TAT de una población de células mixtas como una etapa en la purificación de otras células. Actualmente, dependiendo de la etapa del cáncer, el tratamiento de cáncer involucra uno o una combinación de las siguientes terapias: cirugía para retirar el tejido canceroso, terapia de radiación y quimioterapia. Terapia de anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica anti-TAT puede ser especialmente conveniente en pacientes mayores que no toleran la toxicidad y efectos secundarios de quimioterapia y enfermedad metastática en donde la terapia de radiación tiene utilidad limitada. Los anticuerpos oligopéptidos y moléculas orgánicos anti-TAT que hacen blanco al tumor de la invención son útiles para aliviar cánceres que expresan TAT ante diagnóstico inicial de la enfermedad o durante relapso. Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo anticuerpo o molécula orgánica anti-TAT puede utilizarse solo o en terapia en combinación con por ejemplo hormonas, anti angiogenos, o compuestos radioetiquetados con cirugía, quimioterapia y/o radioterapia. Tratamiento de anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica anti-TAT puede administrarse en conjunto con otras formas de terapia convencional, ya sea consecutivamente con terapia pre-o pos -convencional . Drogas quimioterapéuticas tales TAXOTERE® (docetaxel) , TAXOL® (palictaxel) , estramustina y mitoxantrone se utilizan en tratamiento de cáncer en particular cin pacientes de buen riesgo. En el presente método de la invención para tratar o aliviar cáncer, el paciente de cáncer puede ser administrado con anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica anti-TAT en conjunto con tratamiento con uno o más de los agentes quimioterapéuticos precedentes. En particular en terapia en combinación con palictaxel y derivados modificados (ver por ejemplo, EP0600517) se contempla. El anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica anti-TAT sera administrado con una dosis terapéuticamente efectiva del agente quimioterapéutico . En otra modalidad, el anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica anti-TAT se administra en conjunto con quimioterapia para mejorar la actividad y eficacia en agente quimioterapéutico, por ejemplo aplicación. La referencia de el consultorio médico (PDR = Physicians' Desk Reference) descfribe dosis de estos agentes que han sido utilizados en el tratamiento de diversos cánceres. El régimen de dosificación y las dosis de estas drogas quimioterapéuticas anteriormente mencionadas que son terapéuticamente efectivas dependerán del cáncer particular a tratar, la extensión de la enfermedad y otros factores familiares al médico con destreza en la especialidad y pueden ser determinados por el doctor. En una modalidad particular, un conjugado que comprende un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica conjungada con un agente citotóxico se administra al paciente. De preferencia, el inmuno conjugado ligado a la proteína TAT se internializa por la formula, resultando en una eficacia terapéutica incrementada del inmuno conjugado para exterminar la célula de cáncer a la cual se liga. En una modalidad preferida, el agente citotóxico hace blanco o interfiere con el ácido nucleico en la célula de cáncer. Ejemplos de estos agentes citotóxicos se describen anteriormente e incluyen maitansinoides , caliceamicinsa, ribonucleasas y endonucleasas de ADN.
Los anticuerpos oligopéptidos y moléculas orgánicas anti-TAT o conjugados de toxina de los mismos se suministran a un paciente humano, de acuerdo con métodos conocidos tales como administración intravenosa, por ejemplo como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por rutas intramusculares, intraperitoneales , intracerebroespinales , subcutáneas, intracelulares, intrasinoviales , intratecales , orales, tópicas, o de inhalación. Administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo o, oligopéptido o molécula orgánica se prefiere Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con la administración del anticuerpo oligopéptido molecular orgánica anti-TAT. La administración combinada incluye co-administración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica sencilla y administración consecutiva en cualquier orden, en donde de preferencia hay un periodo de tiempo mientras que ambos (o todos) ingredientes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. De preferencia, esta terapia combinada resulta en un efecto terapéutico sinergistico. También puede ser conveniente el combinar administración del anticuepro o anticuerpos, oligopéptidos o moléculas orgánicas anti-TAT con adminisración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno de tumor asociado con el cáncer particular. En otra modalidad, los métodos de tratamiento terapéutico de la presente invención involucran la administración combinada de un anticuerpo (o anticuerpos) , oligopéptidos o moléculas orgánicas anti-TAT y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores de crecimiento, incluyendo co-administración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Agentes quimioterapéuticos incluyen estramustina fosfata, prednimustina , cisplatina, 5-fluorouracilo, melphalan, ciclofosfamida , hidroxiurea e hidroxiureataxanos (tales como paclitaxel y doxetaxel) y/o antibióticos de antraciclina . Programas de dosificación y preparación para estos agentes quimioterapéuticos pueden utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por la persona con destreza en la especialidad. Programas de dosificación y preparación para esta quimioterapia también se describen Chemotherapy Service Ed. , M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . El anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pueden combinartse con un compuesto anti- hormonal ; por ejemplo un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifen; una anti -progesterona tal como onapristona (ver EP 616 812) ; o un anti-androgeno tal como flutamida, en dosis conocidas tal como estas moléculas . El cáncer a tratar es un c ncer independiente de androgeno independente puede haber sido sometido previamente a la terapia anti-androgeno y despuews de que el cáncer se vuelve independiente de androgeno, el anticuerpo, oligopeptido o molécula orgánica anti-TAT y adicionalmente otros agentes como se describe aquí pueden ser administrados al paciente. En ocasiones, puede ser benéfico también co-administrar un cardioprotector (para evitar o reducir disfunción miocardiaca asociada con la terapia) o una o más citoxinas al paciente. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede ser sometido a remoción quirúrgica de células de cáncer y/o terapia de radiación, antes, simultáneamente con o post-terapia de anticuerpo o molécula orgánica. Dosis convenientes para cualquiera de los agentes co-administrados anteriores son aquellas actualmente amplificadas y pueden reducirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo oligopéptido molécula orgánica anti-TAT. Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosis y modo de administración se seleccionarán por el médico de acuerdo con criterios conocidos. La dosis apropiada de anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica dependerá del tipo de enfermedad a tratar, como se definió anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad, ya se que el anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se administra para estar o propósitos terapéuticos, previo a terapia, historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, oligopéptido de molécula orgánica, y la discreción del médico que atiende. El anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se administra convenientemente al paciente en una vez o de una serie de tratamientos. De preferencia, el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica se administra por infusión intravenosa o por inyecciones cutáneas. Dependiendo del tipo y seriedad de la enfermedad, aproximadamente 1 Mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo aproximadamente 0. l-15mg/kg/dosis) de anticuerpo puede ser una dosis candidato inicial para administración del paciente, ya sea por ejemplo por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo anti-TAT. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. Una dosis diaria típica puede estar en el rango de aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas por varios días o más, dependiendo de la condición, se mantiene el tratamiento hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. El avance de esta terapia puede supervisarse fácilmente por métodos y ensayos convencionales y con base en criterios conocidos por el médico u otra persona con destreza en la especialidad. Además de la administración de la proteína de anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo por terapia genética. Esta administración de ácido nucleico que codifica el anticuerpo es abarcada por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpop" . Ver por ejemplo WO96/07321 publicada en marzo 14 de 1996 referente al uso de terapia de genes para generar anticuerpos intracelulares . Hay dos enfoques principales para llevar el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) a las células del paciente, in vivo y ex vivo. Para suministro in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, usualmente en sitio en donde el anticuerpo se requiere. Para tratamiento in vivo, las células del paciente se retiran, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y las células modificada se administran al paciente ya sea directamente o, por ejemplo encapsuladas en membranas porosas que se implantan en el paciente (por ejemplo las Patentes de los E.U.A. Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Hay una variedad técnicas disponibles para introducir ácido nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro o in vivo en las células del hospedero pretendido. Técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el grupo de liposomas, electroporación, microinyección, fusi+on celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. UN vector comúnmente empleado para suministro ex vivo del gen es un vector retroviral . Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de Herpes simplex I, o virus adeno-asociado) y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para transferencia mediada por lípido del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . Para reviser los protocolos de terapia de gen y marca de gen actualmente conocidos ver Anderson y colaboradores, Science 256:808-813 (1992). Ver también O 93/25673 y las referencias ahí citadas. Los anticuerpos anti-TAT de la invención pueden estar en diferentes formas abarcadas pro la definición de "anticuerpo" presente. De esta manera, los anticuerpos incluyen anticuerpos de longitud integra o intacta, fragmentos de anticuerpos, anticuerpo de secuencia nativa o variantes de amino ácidos, anticuerpos humanizados quiméricos o de fusión, inmunocon ugados , y sus fragmentos funcionales. En anticuerpos de fusión, una secuencia de anticuerpos se fusiona a una secuencia d polipéptido heterologo. Los anticuerpos pueden modificarse en la región Fe para proporcionar soluciones efectoras deseadas. Como se discute con más detalle en las secciones presentes, o en las regiones Fe apropiadas, el anticuerpo desnudo ligado en las superficie celular puede inducir la toxicidad, por ejemplo mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o por complementos de reclutamiento en citotoxicidad dependiente de complemento o algún otro mecanismo. En forma alterna, cuando es deseable el eliminar o reducir función efectora, para minimizar efectos secundarios o complicaciones terapéuticas, pueden emplearse ciertas otras regiones Fe.
En una modalidad, el anticuerpo compite por el enlace o enlaza substancialmente con el mismo epítope que los anticuerpos de la invención. Anticuerpos que tienen las características biológicas de los presentes anticuerpos anti-TAT de la invención también se contemplan, específicamente incluyendo el blanco de tumor in vivo y cualesquiera inhibición de proliferación celular o características citotóxicas. Métodos para producir los anticuerpos anteriores se describen aquí en detalle. Los presentes anticuerpos oligopéptidos o moléculas orgánicas anti-TAT útiles para tratar un cáncer que expresa TAT o alivia uno o más síntomas del cáncer en un mamífero. Este cáncer incluye cáncer de próstata, cáncer del tracto urinario, cáncer de pulmón, cáncer mamario, cáncer de colon y cáncer de ovario, más específicamente adenocarcinoma de próstata, carcinoma de células renales, adenocarcinomas colorectales , adenocarcinomas de pulmón, carcinomas escamosas de pulmón, y mesotelioma pleural. Los cánceres abarcan cánceres metastáticos de cualquiera de los precedentes. El anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es capaz de ligar al menos una porción de las células de cáncer que expresan polipéptido TAT en el mamífero. En una modalidad preferida, el anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica es efectivo para destruir o exterminar las células de tumor que expresan TAT o inhibir el crecimiento de esta célula de tumor, in vitro o in vivo al ligar el polipéptido TAT en las células. Este anticuerpo incluye un anticuerpo anti-TAT desnudo (no conjugado con ningún agente) . Anticuerpos desnudos que tienen propiedades inhibidoras de crecimiento de células o citotóxicas pueden ser adicionalmente equipados con un agente citotóxico para hacerlos aún más potentes en destrucción de células de tumor. Propipiedades citotóxicas pueden ser conferidas a un anticuerpo anti-TAT por ejemplo al conjugar el anticuerpo con un agente citotóxico, para formar un inmunoconjugado como aquí se describe. El agente citotóxico o un agente inhibidor de crecimiento de preferencia es una molécula pequeña. Toxinas tales calicheamicina o un maitansinoide y sus análogos o derivados son preferibles. La invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica anti-TAT de la invención y un portador. Para los propósitos de tratar cáncer, pueden administrar composiciones del paciente que requiere este tratamiento, en donde la composición puede comprender uno o más anticuerpos anti-TAT recientes como un inmunoconjugado o como el anticuerpo desnudo. En una modalidad adicional, las composiciones pueden comprender estos anticuerpos, oligopéptidos o moléculas orgánicas en combinación con otros agentes terapéuticos tales como agentes inhibidores de crecimiento o citotóxicvos , incluyendo agentes quimioterapéuticos . La invención también proporciona formulaciones que comprenden un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica anti-TAT de la invención, y un portador. En una modalidad, la formulación es una formulación terapéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de la invención son ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpoa anti-TAT. Ácidos nucleicos que codifican ambas cadenas HIL y especialmente los residuos de región Inter, variable, cadenas que codifican el anticuerpo de secuencia nativa así como variantes, modificaciones y versiones humanizadas del anticuerpo trabajan. La invención también proporciona métodos útiles para tratar un cáncer que expresa polipéptido TAT o aliviar uno o más síntomas de cáncer en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica al mamífero. Las composiciones terapéuticas de anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica pueden administrarse en corto plazo (agudo) o crónico o en forma intermitente como se instruye por médico. También se disponen métodos para inhibir el crecimiento de, y exterminar las células que expresan polipéptido TAT. La invención también proporciona equipos y artículos de manufactura que comprenden cuando menos un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánica. Equipos que contienen anticuerpos oligopéptidos o moléculas orgánicas anti-TAT encuentran uso, por ejemplo para ensayos de exterminio de células TAt , para purificación o inmuno precipitación de polipéptido TAT de células. Por ejemplo, para aislamiento y purificación de TAT, el equipo puede contener un anticuerpo anti-TAT, oligopéptido o molécula orgánico acoplado anti-TAT acoplado a perlas (por ejemplo perlas de sepharose) . Pueden proporcionarse equipos que contienen los anticuerpos, oligopéptidos o moléculas orgánicas para detección o cuantificación de TAT in vitro, por ejemplo en una ELISA o técnica Western. Este anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica para detección puede proporcionarse, modifica tal como una fluorescente o radioetiqueta . L . Artículos de Manufactura y equipos Otra modalidad de la invención es un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de cáncer que expresa anti-TAT. Otra modalidad de la invención el artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserta el paquete en o asociado con el recipiente. Recipientes convenientes incluyen por ejemplo botellas, ampolletas, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es efectiva para tratar la condición de cáncer y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o una ampolleta que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Cuando menos un agente activo en la composición es un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica anti-TAT de la invención. El inserto del paquete o etiqueta indica que la composición se utilize para trata cáncer. El inserto de paquete o etiqueta además comprende instrucciones para administrar la composición de anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica al paciente de cáncer. Adicionalmente , el artículo de manufactura además puede comprender un Segundo recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable tal como agua, bacteria estática para inyección (BWFI) , salino amortiguador por fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales que son convenientes desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes filtros agujas y jeringas. También se proporcionan equipos que son útiles para diversos propósitos, por ejemplo para ensayos de exterminio de células que expresan TAT, para purificación o inmuno precipitación de polipeptido TAT de células. Para aislamiento y purificación de polipéptido TAT, el equipo puede contener un anticuerpo, oligopéptido o molécula orgánica anti-TAT acoplado a perla (por ejemplo perlas de sepharose) . Pueden proporcionarse equipos que contienen los anticuerpos, oligopéptidos moléculas orgánicas para detección y cuantificacion de polipéptido TAT in vitro, por ejemplo en una ELISA o técnica huésped. Como con el artpiculo de manufactura, el equipo comprfende un recipiente y un inserto de paquete o etiqueta en o asociado con el recipiente. El recipiente contiene una composición que comprende al menos un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica anti-TAT de la invención. Recipientes adicionales pueden incluirse que contienen por ejemplo diluyentes y amortiguadores, anticuerpos de control . El inserto de paquete o etiqueta puede proporcionar una descripción de la composición así como instrucciones para el pretendido in vitro o de diagnóstico.
M. Usos para polipéptidos TAT y ácidos nucleicos que codifican polipéptido TAT. Secuencias de nucleótido (o su complemento) que codifican polipéptidos TAT tienen diversas aplicaciones en la técnica de biología molecular, incluyendo usos, como sondas de irrigación, en cromosomas y mapeo de genes y la generación de sondas ADN y ARN antisentido. Ácido nucleico que codifica TAT también será útil para la preparación de polipéptidos TAT por las técnicas recombinantes aquí descritas, en donde aquellos polipéptidos TAT pueden encontrar uso, por ejemplo en la preparación de anticuerpos anti-TAT como se describe aquí . El gen TAT de secuencia nativa de longitud íntegra o sus porciones, puede utilizarse como sondas de irrigación para una biblioteca cADN para aislar el cADN TAT de longitud íntegra o para aislar todavía otros cADNs (por ejemplo aquellas que codifican variantes de origen natural de TAT o TAT de otras especies (que tienen una identidad de secuencia deseada a la secuencia TAT nativa aquí descrita. En forma opcional, la longitud de las sondas serán aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridizacion pueden derivarse de al menos regiones parcialmente nuevas de la secuencia de nucleótidos nativos de longitud íntegra, en donde esas regiones pueden determinarse sin indebida experimentación o a partir de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos mej oradores e intrones de ??? de secuencia nativa. A manera de ejemplo, un método de supervisión comprenderá aislar la región de codificación del gen TAT utilizando la secuencia ADN conocida para sintetizar una sonda selecta de aproximadamente 40 bases. Ondas de hibridización pueden ser etiquetadas por una variedad de etiquetas incluyendo radionucleótidos tales como 32P o 35S, o etiquetas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda mediante sistemas de acoplamiento avidita/biotina . Sondas etiquetadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen TAT de la presente invención, pueden utilizarse para supervisar bibliotecas de cADN humano, ADN genómico o mARN para determinar que miembros de estas bibliotecas hibridiza la sonda. Técnicas de iuridización se describen con mayor detalle en los siguientes ejemplos. Cualesquiera secuencias EST descritas en la presente solicitud pueden emplearse en forma similar como sondas, utilizando los métodos aquí descritos. Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de codificación TAT incluyen oligonucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de una sola hebra (ya sea ARN o ADN) capaz de ligar a las secuencias mARN TAT objetivo (sentido) o ADN TAT (antisentido) . Oligonucleótidos antisentido o sentido de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región de codificación de ADN TAT. Este fragmento en general comprende cuando menos aproximadamente 14 nucleótidos, de preferencia de aproximadamente 14 a 30 nucleótidos. La capacidad en derivar un poligonucleótido antisentido o sentido, con base en una secuencia cADN que codifica una proteína determinada, se describe por ejemplo por, Stein y Cohén (Cáncer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol y colaboradores (BioTechniques 6:958, 1988). El enlace de oligonucleótidos antisentido o sentido con secuencias de ácido nucleico objetivo resulta en la formación de dúplex que bloquean la transcripción o traducción de la secuencia objetivo por uno de varios medios, incluyendo degradación mejorada de los dúplex, terminación prematura de transcripción o traducción o por otros medios, estos métodos se abarcan por la presente invención. Los oligonucleótidos antisentido de esta manera pueden utilizarse para bloquear expresión de proteínas TAT, en donde esas proteínas TAT pueden jugar un papel en la inducción de cáncer en mamíferos. Oligonucleótidos antisentido o sentido además comprenden poligonucleótidos que tienen estructuras principales azúcar-pospoliester modificadas (u otros enlaces azúcar tales como aquellos descritos en O 91/06629) y en donde estos enlaces azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Estos oligonucleótidos con enlaces azúcar resistentes son estables en vivo (es decir capaces de resistir degradación enzimática) pero retienen especificidad de secuencia para poder ligar a secuencias de nucleótidos objetivo. Sitios intragénicos preferidos para enlace antisentido incluyen la región que incorpora el codón de inicio/arranque de traducción (5' AUG / 5 ' -ATG) o el codón de la terminación/parada (5' UAA, 5' UAG y 5 UGA / 5' TAA, 5' TAG y 5' TGA) de el marco de lectura abierto (ORF) del gen. Estas regiones se refieren a una porción del gen mR A o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir 5' o 3') de un codón de inicio o terminación de traducción. Otras regiones preferidas para enlace antisentido incluyen: intrones; exones; uniones nitrón- exón; el marco de lectura abierto (ORF) o "región de codificación" , que es la región entre el codón de inicio de traducción y el codón de terminación de traducción; la tapa o el extremo 5' de un mARN que comprende un residuo guanosina es decir N7 metilado unido al residuo más lejano de 5' del mARN mediante un enlace trifosfano 5' 5' e incluye la propia estructura de tapa 5' así como los primeros 50 nucleotidos adyacentes a la tapa; la región no traducida 5' (5' UTR) la porción de un mARN en la dirección 5' del codón de inicio de producción y de esta manera incluyendo nucleotidos entre el sitio de extremo 5' y el codón de inicio de traducción de un mARN o nucleotidos correspondientes en el gen; y la región 3' no producida (3' UTR) , la porción de un mARN en la dirección 3' del codón determinación de producción y de esta manera incluye nucleotidos entre el codón derminación traducción y el extremo 3' de un mARN o nucleotidos correspondientes en el gen. Ejemplos específicos de compuestos antisentido preferidos útiles para inhibir la expresión de proteínas TAT incluyen oligonucleótidos que contienen estructuras principales modificadas o enlaces internucleosido no naturales. Oligonucleótidos que tienen estructuras principales modificadas, incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en la estructura principal y aquello que no tienen un átomo de fósforo en la estructura principal. Para propósitos de esta especificación, y como en algunas veces se requiere en la técnica, oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura principal internucleosido, también pueden considerarse como oligonucleosido .
Estructuras principales de oligonucleótido modificadas preferidas incluyen por ejemplo fósforo tioatos, fósforo tioatos quirales, fósforo ditioatos, fósfotilesteres , amino alquil fosfotriésteres metil y otros alquil fosfonatos incluyendo 3' alquilen fosfonatos, 5' alquilen fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3' amino fósforo amidato y amino alquil fósforo amidatos, ionofosforamidatos, alquil fosfonatos, -alquil fosfotriésteres , seleno fosfatos y borano fosfatos que tienen enlaces 3' 5' normales, análogos enlazados 2' 5' de estos y aquellos que tienen polaridad invertida en donde uno o más enlaces internucleótido es un enlace 3' a 5', 5' a 5' o 2' a 2'. Oligonucleótidos preferidos que tienen polaridad invertida comprenden un solo enlace 3' a 3' en el enlace internucleótido más al extremo 3', es decir un solo residuo nucleosido invertido que puede ser abásico (la núcleo base falta o tiene un grupo hidroxilo en su lugar) . Diversas sales, sales mixtas y formas de ácidos libres también se incluyen. Patentes de los E.U.A. representativas que ilustran la preparación de enlaces que contienen fósforo incluyen pero no están limitadas a las patentes de los E.U.A. Nos. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; ,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 y 5,625,050, cada una de las cuales aquí se incorpora por referencia. Estructuras principales de oligonucleótido modificado preferidas que no incluyen un átomo de fósforo tienen estructuras principales que se forman por enlaces internucleosido alquil o ciclo alquilo de cadena corta, enlaces internucleosido alquil o ciclo alquilo y de heteroátomos mixtos o uno o más enlaces internucleosido heterocíclicos o heteroaromáticos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte de la porción azúcar de un nucleosido) ; estructuras principales xiloxano; estructuras principales sulfuro, sulfóxido y sulfota; estructuras principales formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales metilen, acetilo y tioformacetilo; estructuras principales de iguacetilo; estructuras principales que contienen alqueno; estructuras principales sulfonato; estructuras principales mutilen dimino y metil hidracilo; estructuras principales sulfonato y sulfonamida ; estructuras principales amida; y otras que tienen partes componentes N, O, S y CH.sub.2 mixtas. Patentes de los E.U.A. representatives que ilustran la preparación de estos oligonucleosidos incluyen pero no están limitadas a patentes de los Nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; ,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 y 5,677,439, de las cuales aquí se incorpora por referencia . En otros oligonucleótidos antisentido preferidos tanto el enlace azúcar como internucleosido, es decir la estructura principal de la unidad nucleótido se reemplazan con grupos novedosos. Las unidades base se mantienen para hibridizacion con un compuesto objetivo de ácido nucleico apropiado. Un compuesto oligomérico tal, un oligonucleótido mimético que se ha mostrado tiene excelentes propiedades de hibridizacion, se refiere como un ácido nucleico péptido (PNA = peptide nucleic acid) . En compuestos PNA, la estructura principal azúcar de un oligonucleótido se reemplaza con una estructura principal que contiene amida, en particular una estructura principia amino etilglicina. Las núcleo bases se retienen y se ligan directamente o indirectamente con átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la estructura principal. Patentes de los E.U.A. representativas que ilustran la preparación de compuestos PNA incluyen pero no están limitadas a patentes de los E.U.A. Nos. 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262, cada una de las cuales aquí se incorpora por referencia. Adicionales enseñanzas de compuestos PNA pueden encontrarse en Nielsen y colaboradores, Science, 1991, 254, 1497-1500. Oligonucleótidos antisentido preferidos incorporan estructuras principales fosforotionato y/o estructuras principales de heteroátomo en particular CH2 NH 0 CH2 , CH2 N(CH3) O CH2 [conocido como estructura principal metileno (metilimino) o MMI] , CH2 O N(CH3) CH2, CH2 N(CH3) N(CH3) CH2 y 0 N(CH3) CH2 CH2 [en donde la estructura principal fosfodiester nativa se representa como O P O CH2 ] descrito en la Patente de los E.U.A. No. 5,489,677, anteriormente referida y las estructuras principales amida de la Patente de los E.U.A. No. 5,602,240, anteriormente referida. También se prefieren oligonucleótidos antisentido que tienen estructuras de cadena principal morfolino de la Patente de los E.U.A. No. 5,034,506 anteriormente referida. Oligonucleótidos modificados también pueden contener una o más porciones azúcar substituidas. Oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-alquil, S-alquilo, o N alquilo; O-alquenil, S-alkeinilo, o N alquenyl ; O alquinilo, S alquinilo o N alquinilo; o 0 alquilo O, en donde alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo Cl a CIO substituido o sin sustituir o alquenilo y alquinilo C2 a CIO. Se prefieren particularmente O [ (CH2) nO] mCH3 , 0(CH2)nOCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nO H2, y O (CH2 ) nO [ (CH2 ) nCH3 ) ] 2 , en donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos antisentido preferidos comprenden uno d elos siguientes en la posición 2 ' ·. alquilo inferior Cl a CIO, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alkarilo, aralquilo, O alcarilo o O aralquilo, SH, SCH , OCN, Cl , Br, CN, CF3, OCF3 , SOCH3 , S02 CH3 , ON02 , N02 , N3 , NH2 , heterocicloalquilo, heterocicloalkarilo, aminoalquiloamino , poliyalquiloamino, sililo substituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo reportero, un intercalador , un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido o un grupo para mejorar las propiedades fármaco dinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2' metoxietoxi (también conocido como 2' O CH2CH2OCH3, o 21 -O- (2-metoxietil) o 2'-MOE) (Martin y colaboradores, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486 504) es decir un grupo alkoxi alkoxi . Una modificación preferida adicional incluye 2' dimetilaminooxietoxi , es decir, un grupo O (CH2) 20N (CH3) 2 también conocido como 2' DMAOE, como se describe en los ejemplos siguientes, y 2' dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2 ' 0 dimetilaminoethoxietil o 2 ' DMAEOE) , es decir, 21 -0-CH2-0-CH2-N(CH2) . Una modificación adicional referida incluye ácidos nucleicos enclavados (LNAs = Locked Nucleic Acids)en donde el grupo 2' hidroxilo se enlaza al átomo de carbono 3' o 4' del anillo azúcar, de esta manera formando una porción de azúcar bicíclica. El enlace de preferencia es un grupo metileno (CH2)n que puentea el átomo de oxífeno 2' y el átomo de carbono 4' en donde m es 1 o 2. LNAs y su preparación se describen en WO 98/39352 y WO 99/14226. Otras modificaciones preferidas incluyen 2 ' methoxy (2' 0 CH3), 2' aminopropoxy (2 ' OCH2CH2CH2 NH2), 2' allyl (21 CH2 CH=CH2) , 2' O allyl (2' 0 CH2 CH=CH2) y 2' fluoro (2' F) . La modificación 2' puede ser en la posición arabino (arriba) o posición ribo (abajo) . Una modificación 2' arabino preferida es 2'F. Modificaciones similares también pueden realizarse en otras posiciones en el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal o en los oligonucleótidos 2' 5' enlazados y la posición 5' de nucleótidos 5' terminal. Oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como porciones ciclobutilo en lugar del azúcar tentofuranocilo . Patentes de los E.U.A. representativas que ilustran la preparación de estas estructuras de azúcar modificadas incluyen pero no están limitadas a las Patentes de los E.U.A. Nos.: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; y 5,700,920, cada una de las cuales se incorpora aquí completamente por referencia. Oligonucleótidos también pueden incluir nucleobase (a menudo referida en la técnica simplemente como "base") modificaciones o sustituciones. Como se emplea aquí, núcleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases purina, adenina (A) y guanina (G) , y las bases de pirimidina timina (T) , citosina (C) y uracilo (U) . Núcleobases modificadas incluyen otras núcleobases sintéticas y naturales tales como 5 metilcitosina (5 me C) , 5 hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2 aminoadenina, 6 metil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2 propil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2 tiouracilo, 2 tiotimina y 2 tiocitosina, 5 halouracilo y citosina, 5 propinilo (-C=C-CH3 o -CH2-C=CH) uracil y citosina y otros derivados alquinilo de bases pirimidina, 6 azo uracil, citosina y timina, 5 uracil (pseudouracil) , 4 tiouracil, 8 halo, 8 amino, 8 tiol, 8 tioalquilo, 8 hidroxil y otras guaninas y adeninas 8 sustituidas, 5 halo, particularmente 5 bromo, 5 trifluorometil y otras citosinas y uracilos 5 sustituidos, 7 metilguanina y 7 metiladenina , 2 F adenina, 2 amino adenina, 8 azaguanina y 8 azaadenina, 7 deazaguanina y 7 deazaadenina y 3 deazaguanina y 3 deazaadenine . Adicionales nucleobases modificadas incluyen pirrimidinas tricíclicas tales como penoxazine citidina (1H pirimido[5,4 b] [1 , 4] benzoxazin 2 (3H) ona) , penotiazina citidine (1H pirimido[5,4 b] [1 , ] benzotiazin 2 (3H) one) , sujetadores G tales como fenoxazina histidina sustituida (por ejemplo 9 (2 aminoethoxy) H pirimido[5,4 b] [1 , 4 ] benzoxazin 2 (3H) ona), carbazole citidina (2H pirimido [4 , 5 b] indol 2 ona), piridoindole citidina (H pirido [3 ' , 2 ' : 4 , 5] pirrólo [2 , 3 djpirimidin 2 ona). Nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en donde la base Purina o piridina se reemplaza con otros heterociclos , por ejemplo 7 deaza adenina, 7 deazaguanosina , 2 aminopiridina y 2 piridona. Adicionales nucleobases incluyen aquellas descritas en la Patente de los E.U.A. No. 3,687,808, aquellas descritas en The Concise Enciclopedia Of Polymer Science y Engineering (Enciclopedia Concisa de Ciencia e Ingeniería de Polímeros), páginas 858 859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, y aquellas descritas por Englisch y colaboradores, Angewandte Chemie, edición internacional, 1991, 30, 613. Ciertos de estas núcleobases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de enlace de los compuestos oligoméricos de la invención. Estas incluyen pirimidinas 5 sustituidas, 6 azapirimidinas y purinas N 2, N 6 y 0 6 sustituidas, incluyendo 2 aminopropyladenina, 5 propinilouracil y 5 propinilocitosina . Sustituciones 5 metilcitosina se han mostrado que incrementan la estabilidad de dúplex de ácido nucleico en 0.6 1.2. °C. (Sanghvi y colaboradores, Antisense Research y Applications (Investigación y aplicaciones antisentido), CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp. 276 278) y son sustituciones base preferidas, aún más particularmente cuando se combinan con modificiaciones 2 ' 0 metoxietil azúcar. Patentes de los E.U.A. representativas que ilustran la preparación de núcleobases modificadas incluyen pero no están limitadas a: Patente de los E.U.A. No. 3,687,808, así como las Patentes de los E.U.A. Nos.: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; ,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,681,941 y 5,750,692, cada una de las cuales aquí se incorpora por referencia. Otra modificación de los oligonucleotidos antisentido que enlazan químicamente con el oligonucleótido una o más porciones o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o absorción celular de oligonucleótido. Los compuestos de la invención pueden incluir grupos conjugados enlazados covalentemente con grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios y secundarios. Grupos conjugados de la invención incluyen intercaladotes , moléculas reporteras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles , poliéteres, grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas de oligómeros y grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Grupos conjugados típicos incluyen colesteroles , lípidos, lípidos catiónicos, fosfolípidos , fosfolípidos catiónicos, biotina, fenazina, folato, fenantridina , antraquinona , acridina, fluoresceinas , rodaminas, cumarinas, y colorantes. Grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas , en el contexto de esta invention incluyen grupos que mejoran la absorción de oligómero, mejoran la resistencia a degradación del oligómero, y refuerzan la hibridización específica de secuencia con ARN. En el contexto de esta invention, incluyen grupos que mejoran absorción de oligómero distribución, metabolismo o excresión. Porciones conjugadas incluyen pero no están limitadas a porciones lípido tales como porción colesterol (Letsinger y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553 6556) , ácido cólico (Manoharan y colaboradores, Bioorg. Med. Chem. Let . , 1994, 4, 1053 1060), u tioéter, por ejemplo, hexil S tritiltiol (Manoharan y colaboradores, nn. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306 309; Manoharan y colaboradores, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765 2770) , un tiocolesterol (Oberhauser y colaboradores, Nucí. Acids Res., 1992, 20, 533 538), una cadena alifática, por ejemplo, residucos dodecandiol o undecilo (Saison Behmoaras y colaboradores, EMBO J. , 1991, 10, 1111 1118; Kabanov y colaboradores, FEBS Lett., 1990, 259, 327 330; Svinarchuk y colaboradores, Biochimie, 1993, 75, 49 54), un fosfolípido, por ejemplo, di hexadecilo rae glicerol o trietil amonio 1,2 di O hexadecel rae glicerol 3 H fosfonato (Manoharan y colaboradores, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651 3654; Shea y colaboradores, Nucí. Acids Res., 1990, 18, 3777 3783) , una poliamina o una cadena polietilen glicol (Manoharan y colaboradores, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969 973), o ácido agamantán acético (Manoharan y colaboradores, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651 3654), una porción palmitilo (Mishra y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229 237), o una porción octadecilamina o hexilamino carbonil oxicolesterol . Oligonucleótidos de la invention también pueden conjugarse con sustancias de droga active, por ejmplo aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofen, suprofen, fenbufen, ketoprofen, (S) (+) pranoprofen, carprofen, dansylsarcosina, ácido 2,3,5 tryiodobenzoico, ácido flufenámico, ácido folínico, a benzotiadiazida, clorotiazida, a diazepina, indometicina, a barbiturate, a cefalosporin, una droga sulfa, un antidiabético un antibacteriano o un antibiótico. Conjugados de drogas oligonucleótido y su preparación se describen en la solicitud de Patente de los E.U.A. No. Serie 09/334,130 (presentada Jun. 15, 1999) y las patentes de los E.U.A.
NOS. : 4, 828, 979; 4, 948,882; 5,218, 105; 5, 525,465; ,541,313; 5, 545, 730; 5,552,538; 5, 578, 717, 5, 580, 731; , 580, 731; 5,591,584; 5, 109, 124; 5, 118, 802 ; 5, 138, 045; ,414, 077; 5,486, 603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608, 046; 4, 587, 044; 4, 605, 735; 4,667, 025; 4, 762, 779; 4, 789, 737; 4, 824, 941; 4,835,263; 4, 876, 335; 4 , 904, 582 ; 4, 958, 013; , 082, 830; 5,112,963; 5, 214, 136; 5, 082, 830 ; 5, 112 , 963 ; ,214, 136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5, 262 , 536; ,272,250; 5,292,873; 5, 317, 098; 5,371,241, 5,391,723; ,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5, 512, 667; 5, 514 , 785; ,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 y 5,688,941, cada una de las cuales aquí se incorpora por referencia. No es necesario que todas las posiciones en un compuesto determinado se modifiquen de manera uniforme, y de hecho más de una de las modificaciones anteriormente mencionadas puede incorporarse en un solo compuesto o incluso en un solo nucleosido dentro de un olonucleótido . La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Compuestos antisentido "quiméricos" o "quimeras" en el contexto de esta invención son compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una constituida de al menos una unidad monómero, es decir un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido . Estos oligonucleótidos típicamente contienen cuando menos una región en donde el oligonucleótido se modifica para conferir sobre en el oligonucleótido ni incrementar la resistencia a degradación de nucleasa, incrementada absorción celular y/o incrementada habilidad de enlace para el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como un sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos ARN:ADN. A manera de ejemplo, Naza H es una endonucleasa celular que escinde la hebra ARN de un dúplex ARN :AND . Activación de RNaza H por lo tanto resulta en escisión del objetivo ARN, de esta manera mejorando enormemente la eficiencia de inhibición del poligonucleótido de expresión genética. Consecuentemente, resultados comparables a menudo pueden obtenerse con oligonucleótidos más cortos cuando se utilizan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con fosforotioato de oxioligonucleótidos que hibridizan a la misma región objetivo. Opuestos antisentido quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótido modificados, oligonucleosis y/o oligonucleótidos miméticos como se describen anteriormente.
Oligonucleótidos antisentido quiméricos preferidos se incorporan cuando menos un azúcar 2 ' -O- (CH2 ) 2 -0-CH3 modificada (de preferencia en el extremo 3' para conferir resistencia a nucleasa y una región con al menos 4 azúcares 21 -H contiguos para conferir actividad RNase H. Estos compuestos también se han referido en la técnica como híbridos o secuencias internas limitadas (gapmers) . Secuencias internas limitadas preferidas tienen una región de azúcares 2 ' modificadas (de preferencia 2 ' -O- (CH2) 2-0-CH3) en el extremo 3' y en el extremo 5' separado por al menos una región que tiene cuando menos 4 azúcares 2 ' -H contiguos y de preferencia incorporan enlaces de estructura principal fosforotioato . Patentes de los E.U.A. representativas que ilustran la preparación de estas estructuras híbridas, incluyen, pero no están limitadas a las patentes de los E.U.A. Nos. 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; y 5,700,922, cada una de las cuales aquí se incorpora por referencia totalmente. Los compuestos antisentido utilizados de acuerdo con esta invención pueden elaborarse en forma conveniente y rutinaria a través de la técnica bien conocida de síntesis de fase sólida. Equipo para esta síntesis se vende por varios distribuidores incluyendo por ejemplo Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Cualquier otro medio para esta síntesis conocido en la especialidad puede emplearse en forma adicional o alterna. Es bien conocido el utilizar técnicas seimilares para preparar oligonucleótidos tales como los fosforotioatos y derivados alquilados. Los compuestos de la invención también pueden emplearse y encapsularse , conjugarse o de otra forma asociarse con otras moléculas, estructuras de moléculas o mezclas de compuestos tal como por ejemplo liposomas, moléculas de receptor, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para ayudar en absorción, distribución y/o uptake por absorción. Patentes de los E.U.A. representativos que ilustran la preparación de dichas formulaciones que ayudan a upl, distribución y/o absorción que incluyen pero no están limitados a las patentes de los E.U.A. Nos. , 108, 921; 5, 354, 844; 5,416,016; 5,459, 127; 5, 521, 291; , 543 , 158 ; 5, 547, 932; 5,583, 020; 5, 591, 721 ; 4, 426, 330; 4, 534, 899; 5,013,556; 5, 108, 921; 5,213,804; 5, 227, 170; ,264,221; 5,356, 633; 5,395,619; 5, 416, 016 ; 5,417, 978; ,462, 854; 5, 469, 854 ; 5, 512,295; 5, 527, 528 ; 5, 534, 259; ,543,152; 5, 556, 948; 5,580,575; y 5, 595, 756, cada una de las cuales aquí se incorpora por referencia. Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que se enlazan covalentemente con porciones orgánicas tales como aquellos descritos en WO 90/10048, y otras porciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia de ácido nucleico objetivo, tal como poli- (L-lisina) . Aún más, agentes de intercalado tales como elipticina, y agentes alquilantes o complejos metálicos pueden conectarse a oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar especificidades de enlace del oligonucleótido antisentido o sentido para la secuencia de nucleótidos objetivo. Oligonucleótidos antisentido o sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo por cualquier método de transferencia de gen incluyendo por ejemplo transfección de ADN mediada por CaP04 , electroporación, o al utilizar vectores de transferencia de gen tales como virus Epstein-Barr . En un procedimiento preferido, un oligonucleótido antisentido o sentido se inserta en un vector retroviral conveniente. Una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo se contacta con el vector regroviral recombinante ya sea en vivo o ex vivo. Vectores retrovirales convenientes incluyen pero no están limitados a aquellos derivados del retrovirus murino -MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) , o los vectores de doble copia designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13641) . Oligonucleótidos sentido o antisentido también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos objetivo por formación de un conjugado con una molécula de enlace de ligando, como se describe en WO 91/04753. Moléculas de enlace de ligando convenientes se incluyen pero no están limitados a, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas, otros ligandos que enlazan con receptores de superficie celular. De preferencia, conjugación de la molécula de enlace de ligando no interfiere substancialmente con la capacidad de la molécula de enlace de ligando para ligar a su molécula o receptor correspondiente por lo que a la entrada de oligonucleótidos sentido o antisentido por su versión conjugada en la célula. En forma alterna, un oligonucleótido sentido o antisentido puede introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo por formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en WO 90/10448. El complejo oligonucleótido-lípido sentido o antisentido de preferencia se disocia en la célula por una lipasa endógena. Moléculas de ARN o ADN antisentido o sentido en general son de al menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, en forma alterna cuando menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, : 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 , 85, 90, 95, 100, 105, 110 , 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 , 155, 160, 165, 170 , 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 , 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410 , 420, 430, 440, 450 , 460 , 470 , 480, 490, 500 , 510 , 520, 530 , 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 , 610 , 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680 , 690 , 700, 710, 720, 730, 740 , 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890 , 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, o 1000 nucleótidos de longitud, en donde en este contexto al término "aproximadamente" significa la longitud de secuencia de nucleótidos referida más o menos 10 por ciento de la longitud referida. Las sondas también pueden emplearse en técnicas PCR para generar un conjunto de secuencias para identificación de secuencias de codificación TAT cercanamente relacionadas. Secuencias de nucleótidos que codifican un TAT también pueden emplearse para construir sondas de hibridización para generar un mapa del gen que codifica ese TAT y para el análisis genético de individuos con desórdenes genéticos. Las secuencias de nucleótido que aquí se proporcionan pueden ser mapeadas a un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma utilizando técnicas conocidas, tales como hibridización in situ, análisis de enlace contra marcadores cromosomales conocidos y monitoreo de hibridización con bibliotecas. Cuando las secuencias de codificación para TAT codifican una proteína que liga a otra proteína (ejemplo cuando TAT en un receptor) , el TAT puede emplearse en ensayos para identificar las otras proteínas o moléculas involucradas en la interacción de enlace. Por estos métodos, pueden identificarse inhibidores de la interacción de enlace ligando/receptor. Proteínas involucradas en estas interacciones de enlace también pueden emplearse para monitorear un péptido o inhibidores de molécula pequeña o agonistas de la interacción de enlace. También, el receptor TAT puede emplearse para aislar uno o varios ligandos correlativos. Ensayos de monitoreo pueden diseñarse para encontrar compuestos principales que imitan la actividad biológica de un TAT activo o un receptor para TAT. Estos ensayos de monitoreo incluirán ensayos suceptibles a monitoreo de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente convenientes para identificar candidatos de drogas de moléculas pequeñas. Moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de enlace proteína-proteína, ensayos de monitoreo bioquímico, inmuno ensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizadas en la especialidad. Ácidos nucleicos que codifican TAT o sus formas modificadas también pueden emplearse para generar ya sea animales transgénicos o animales "knl" que a su vez son útiles en el desarrollo y monitoreo de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgen, este transgen se introdujo en el animal o un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo embriónica. Un transgen es un ADN que se integra en el genoma de una célula de la cual se desarrolla un animal transgenico. En una modaliadad, ADN que codifica TAT puede emplearse para clonar ADN genómico que codifica TAT de acuerdo con técnicas establecidas y las secuencias genómicas empleadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica TAT. Métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han vuelto convencionales en la especialidad y se describen por ejemplo en las patentes de los E.U.A. Nos. 4,736,866 y 4,870,009. Típicamente, células particulares serán objetivo para incorporación de un transgen TAT con mej oradores específicos de tejido. Animales transgénicos que incluyen una copia del transgen que codifica TAT, han introducido en la línea germinal del animal en una etapa embriónica, pueden emplearse para examinar el efecto de expresión incrementada de ADN que codifica TAT. Estos animales pueden ser utilizados como animales de prueba para reactivos aunque para conferir protección de por ejemplo condiciones patológicas asociadas con su sobre-expresión. De acuerdo con esta faceta de la invención, se trata a un animal con el reactivo y una incidencia reducida de la condición patológica, en comparación con animales no tratados que contienen el transgen, indicará una intervención terapéutica potencial para la condición patológica. En forma alterna, homólogos no humanos de TAT pueden emplearse para construir un animal TAT "knl" que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica TAT como resultado de recombinación homologa entre el gen endógeno que codifica TAT y ADN genómico alterado que codifica TAT introducido en una célula madre embriónica del animal. Por ejemplo, cADN que codifica TAT pudo utilizarse para clonar ADN genómico que codifica TAT de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica TAT puede eliminarse o reemplazarse con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que puede utilizarse para supervisar la integración. Típicamente, varios kilobases de ADN flanqueante no alterado (tanto en los extremos 5' y 3') se incluyen en el reactor [ver por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores recombinantes homólogos. El vector se introduce en una línea de célula madre embriónica (por ejemplo por electroporación (y células en donde ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno se eligen [ver por ejemplo, Li y colaboradores, Cell, 69:915 (1992)] . Las células selectas luego se inyectan en un blastocisto de un animal (por ejemplo un ratón o rata) para formar quimeras de agregación [ver por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (Teratocarcinomas y Células Madre Embriónicas : Un Enfoque Práctico, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) , pp . 113-152] . Un embrión quimérico luego puede implantarse en un animal substituto hembra pseudopreñada conveniente y el embrión se lleva a término para crear un animal "nulo" . Progenie que aloja el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales puede identificarse por técnicas standard y emplearse para desarrollar animales en donde todas las células del animal contienen el ADN recombinado homólogamente. Animales nulos pueden caracterizarse por ejemplo por su habilidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido TAT. Ácido nucleico que codifica los polipéptidos TAT también pueden emplearse en terapia de genes. En la aplicación de terapia de genes, se introducen genes en células a fin de lograr síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo para reemplazo de un gen defectuoso. "Terapia de genes" incluye tanto terapia de genes convencional en donde se logra un efecto duradero por un solo tratamiento y la administración de agentes terapéuticos de genes que involucra la administración de una vez o repetida de un ADN o mAR terapéuticamente efectivo. ARNs y ADNs antisentido pueden emplearse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Ya se ha mostrado que oligonucleótidos antisentido cortos pueden importarse en células en donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares provocadas por su absorción restringida por la membrana celular. (Los oligonucleótidos pueden modificarse para mejorar su upl, por ejemplo al substituir sus grupos fosfodiester cargados negativamente por grupos no cargados . Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si se transfiere el ácido nucléico en células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del hospedero pretendido. Técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucléico en células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, micro inyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Las técnicas de transferencia de genes in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (típicamente retrovirales) y transfección mediada por liposoma-proteína de revestimiento viral (Dzau y colaboradores, Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). En algunas situaciones es conveniente el proporcionar la fuente de ácido nucleico por un agente que hace blanco a las células objetivo tal como un anticuerpo específico o una proteína de membrana de superficie celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor en la célula objetivo, etc. Cuando se emplean liposomas, proteínas que se ligan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis, pueden emplearse para hacer blanco y/o facilitar la captación, por ejemplo proteínas capsido o sus fragmentos trópicos para un tipo de célula particualar, anticuerpos para proteínas que se someten a impermeabilización en ciclado, proteínas que hacen blanco en ubicación intracelular y mejoran la vida media intracelular . La técnica de endocitosis mediada por receptor se describe por ejemplo por Wu y colaboradores, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); y Wagner y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 87, 3410-3414 (1990) . Para revisión de protocolos de terapia de genes y marcado de genes ver Anderson y colaboradores, Science 256, 808-813 (1992) .
Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos TAT o sus fragmentos aquí descritos son útiles para identificación de cromosomas. En este aspecto, existe una continua necesidad para identificar los marcadores de cromosoma, ya que están actualmente disponibles relativamente pocos reactivos de marcado de cromosomas, con base en datos de secuencia actual. Cada molécula de ácido nucleico TAT de la presente invención puede utilizarse como un marcador de cromosoma. Los polipéptidos TAT y moléculas de ácido nucleico de la presente invención también pueden emplearse para diagnóstico para tipado de tejido, en donde los polipéptidos TAT de la presente invención pueden expresarse en forma diferencial en un tejido en comparación con otro, de preferencia en un tejido enfermo en comparación con un tejido normal del mismo tipo de tejido. Moléculas de ácido nucleico TAT encontrarán uso para generar sondas para PCR, análisis Northern, análisis Southern y análisis Western. Esta invención abarca métodos para monitoreo de compuestos para identificar aquellos que emitan el polipéptido TAT (agonistas) o evitan el efecto del polipéptido TAT (antagonistas) . Ensayos de monitoreo para candidatos de droga antagonista se diseñan para identificar compuestos que ligan o complejan con los polipéptidos TAT codificados por los genes aquí identificados o de otra forma interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas similares, incluyendo por ejemplo inhibir la expresión del polipéptido TAT de las células. Estos ensayos de monitoreo incluirán ensayos susceptibles a monitoreo de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolas particularmente convenientes para identificar candidatos de drogas de moléculas pequeñas. Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de enlace de proteína-proteína, ensayos de monitoreo bioquímico, inmunoensayos , y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la especialidad. Todos los ensayos para antagonistas son comunes ya que requieren contactar el candidatos de droga con un polipéptido TAT codificado por un ácido nucleico que se identifica aquí bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que interactúen estos dos componentes . En ensayos de enlace, la interacción es enlazar y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido TAT codificado por el gen aquí identificado o el candidato de droga se moviliza en una fase sólida, por ejemplo en una placa de microtitulación, por conexiones covalentes o no covalentes. Conexión no covalente en general se logra al revestir la superficie sólida con una solución del polipéptido TAT y secar. En forma alterna, el anticuerpo inmovilizado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido TAT a inmovilizarse, puede utilizarse para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza al agregar el componente no inmovilizado, que puede ser etiquetado por una etiqueta detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo la superficie revestida que contiene el componente anclado. Cuando se completa la reacción, se retiran los componentes no reaccionados, por ejemplo por lavado y se detectan complejos anclados en la superficie sólida. Cuando el componente luego inmovilizado originalmente transporta una etiqueta detectable, la detección de etiqueta inmovilizada de la superficie indica que ocurrió complejado. Cuando el componente no inmovilizado origialmente no transporta la etiqueta, puede detectarse el complejado, por ejemplo al utilizar un anticuerpo etiquetado específicamente que enlaza el complejo inmovilizado. Si el compuesto candidato interactúa pero no liga con un polipéptido TAT particular codificado por un gen aquí identificado, su interacción con ese polipéptido puede ensayarse por métodos bien conocidos para detectar interacciones proteína-proteína. Estos ensayos incluyen enfoques tradicionales, tales como por ejemplo enlazado cruzado, co- inmunoprecipitación y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas . Además, interacciones proteína-proteína pueden monitorearse al utilizar un sistema genético basado en levadura descrito por Fields y colaboradores (Fields and Song, Nature (London) , 340:245-246 (1989); Chien y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 88:9578-9582 (1991)) como se describe por Chevray and Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991) . Muchos activadores de transcripción tales como GAL4 de levadura, consisten de dos dominios modulares discretos físicamente, uno que actúa como el dominio de enlace de ADN, el otro que funciona como el dominio de activación de transcripción. El sistema de extrusión de levadura descrito en las publicaciones anteriores (generalmente referido como el "sistema de dos híbridos") aprovecha esta propiedad y emplea dos proteínas híbridas una de las cuales, la proteína objetivo se fusiona al dominio de enlace ADN de GAL4 , y otro, en donde proteínas de activación candidato se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen reportero GALl-lacZ bajo el control de un promotor activado GAL4 depende de reconstitución de actividad GAL4 mediante ineracción proteína-proteína. Colonias que contienen polipéptidos de interacción se detectan con un substrato cromogénico para beta-galactosidasa . Un equipo completo (MATCHMAKERTM) para identificar interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas que utilizan la técnica de dos híbridos que están comercialmente disponibles de Clontech. Este sistema también puede desprenderse para mapear dominios de proteína involucrados en interacciones de proteínas específicas así como para señalar o dirigir a residuos amino ácido que son cruciales para estas interacciones. Compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polipéptido TAT aquí identificado y otros componentes infra- o extra-celulares pueden probarse como sigue: usualmente una vez que la reacción se prepara que contiene el producto de gel y el componente infra- o extra-celular bajo condiciones y para un tiempo que permite la interacción y enlace de dos productos. Para probar la habilidad de un compuesto candidato para inhibir el enlace, la reacción se corre en la ausencia y en la presencia del compuesto de prueba. Además, puede agregarse un placebo a una tercer mezcla de reacción, para servir como un control positivo. El enlace (formación de complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra-o extra-celular presente en la mezcla se supervisa como se describió previamente. La formación de un complejo en la o las reacciones de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba, implica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su socio de reacción. Para ensayar antagonistas, el polipeptido TAT puede agregarse a una célula junto con el compuesto a monitorearse para actividad particular y la habilidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en la presencia del polipeptido TAT indica que el compuesto es un antagonista para el polipéptido TAT. En forma alterna, pueden detectarse antagonistas en combinar el polipéptido TAT y un antagonista potencial con receptores de polipéptido TAT ligados con membrana o receptores recombinantes bajo condiciones apropiadas a un ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido TAT puede ser etiquetado, tal como por reactividad, de manea tal que el número de moléculas polipéptido TAT ligadas al receptor puede utilizarse para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que codifica el receptor puede identificarse sobre numerosos métodos conocidos por aquellos con destreza en la especialidad, por ejemplo selección de ligando y clasificación FACS . Coligan y colaboradores, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991) . De preferencia, clonación de expresión se emplea en donde ARN poliadenilado se prepara a partir de una célula que responde al polipeptido TAT y una biblioteca de cADN creada de este ARN se divide en depósitos y utiliza para transfectar células COS u otras células que no responden al polipéptido TAT. Células transíectadas que se desarrollan en porta-objetos de vidrio se exponen a polipéptido TAT etiquetado. El polipéptido TAT puede ser etiquetado por una variedad de medios incluyendo yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa específica de sitio. Después de fijación e incubación, los porta objetos se identifican y son depósitos se preparan y re-transfectan utilizando un proceso de sub-recolección y re-monitoreo interactivo, dando por resultado eventualmente un solo clón que codifica el receptor putativo . Como enfoque alterno para la identificación de receptor, polipéptido TAT etiquetado puede enlazarse por fotoafinidad con preparaciones de extracto o membrana celular que expresa la molécula receptora. Material entrelazado se resuelve por PAGE y expone a película de rayos-X. El complejo etiquetado que contiene el receptor puede ser cortado, resuelto en fragmentos péptido y sometido a micro- secuenciado de proteínas. La secuencia amino ácidos obtenida de micro- secuenciado se utilizará para diseñar un conjunto de sondas poligonucleótido degeneradas para monitorear una biblioteca cADN para identificar el gen que codifica el receptor putativo. En otro ensayo para antagonistas, células de mamífero o una preparación de membrana que expresa el receptor se incubarán con polipéptido TAT etiquetado en la presencia del compuesto candidato. La capacidad del compuesto para mejorar o bloquear esta interacción luego puede medirse. Ejemplos más específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que liga a las funciones de inmunoglobulina con polipéptido TAT y en particular anticuerpos incluyendo sin limitación anticuerpos poli- y mono-clonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos anti-idiotípicos, y versiones quiméricas o humanizadas de estos anticuerpos o fragmentos así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. En forma alterna, un antagonista potencial puede ser una proteína cercanamente relacionada, por ejemplo una forma montada del polipéptido TAT que reconoce el receptor pero no imparte efecto, de esta manera inhibiendo en forma competitiva la acción del polipéptido TAT.
Otro antagnsita polipéptido TAT potencial es una construcción ARN o ADN antisentido que se prepara utilizando tecnología antisentido, en donde por ejemplo una molécula ARN o ADN antisentido actúa para bloquear directamente la traduccion de mARN al hibridizar a mARN objetivo y evitar traducción de proteína. Tecnología antisentido puede utilizarse para controlar la expresión de gen a través de formación de triple hélice o ADN o ARN antisentido, ambos de estos métodos se basan en enlazar un polinucléotido ADN o ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia de polinucléotido que codifica a los polipéptidos TAT maduros aquí, se utiliza para designar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares base de longitud. Un oligonucleótido de ADN se diseña para ser complementario a una región del gen involucrado en transcripción (triple hélice - ver Lee y colaboradores, Nucí. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney y colaboradores, Science, 241: 456 (1988); Dervan y colaboradores, Science, 251:1360 (1991) ) , de esta manera evitando transcripción y la traducción del polipéptido TAT. El oligonucleótido ARN antisentido hibridiza al mARN in vivo y bloquea la traducción de la molécula mARN en el polipéptido TAT (antisentido Okano, Neurochem. , 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (Oligodeoxinucleótidos como Inhibidores Antisentido de Expresión de Gen) (CRC Press: Boca Ratón, FL, 1988) . Los oligonucleótidos anteriormente descritos también pueden ser suministrados a células de manera tal que el ARN o ADN antisentido pueda ser expresado in vivo para inhibir la producción del polipéptido TAT. Cuando se utiliza ADN antisentido, oligodeoxiribonucleótidos derivados del sitio de inicio de traducción, por ejemplo entre aproximadamente -10 y +10 posiciones de la secuencia de nucleotidos de gen objetivo, se prefieren. Antagonistas potenciales incluyen pequeñas moléculas que ligan al sitio activo, el sitio ligando de receptor, o factor de crecimiento u otro sitio de enlace relevante del polipéptido TAT, de esta manera bloqueando la actividad biológica normal del polipéptido TAT. Ejemplos de pequeñas moléculas se incluyen pero no están limitados a pequeños péptidos o moléculas tipo péptido, de preferencia péptidos solubles, y compuestos orgánicos o inorgánicos no-peptidilo sintético. Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica de ARN. Las ribozimas actúan por hibridización específica de secuencia con el ARN objetivo complementario seguido por escisión endonucleolítica . Sitios de escisión de ribozima específicos dentro de un objetivo ARN potencial pueden ser identificados por técnicas conocidas. Para mayor detalles ver por ejemplo ver, Rossi, Current Biology (Biología Actual), 4:469-471 (1994), y publicación PCT No. WO 97/33551 (publicado en septiembre 18, de 1997) . Moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice empleadas para inhibir transcripción deberán ser de una sola hebra y compuestas por deoxinucleótidos . La composición base de estos oligonucleótidos se diseña de manera tal que promueve formación de triple hélice mediante reglas de par base Hoogsteen, que en general requieren tramos dimensionables de purinas o pirimidinas en una hebra de un dúplex. Para mayores detalles ver por ejemplo publicación del PCT No. WO 97/33551, arriba. Estas pequeñas moléculas pueden ser identificadas por cualquiera una o más de ensayos de monitoreo discutidos previamente y/o por cualquier otra técnica de monitoreo bien conocido por aquellos con destreza en la especialidad. Ácido nucleico que codifica polipéptido TAT aislado puede utilizarse aquí para producir en forma recombinante polipéptidos TAT utilizando técnicas bien conocidas en la especialidad y como se describe aquí. A su vez, los polipéptidos TAT producidos pueden emplearse para generar anticuerpos anti-TAT utilizando técnicas bien conocidas en la especialidad y como se describe aquí . Anticuerpos que ligan específicamente un polipéptido de TAT aquí identificado así como otras moléculas identificadas por los ensayos de monitoreo descritas previamente, pueden administrarse para el tratamiento de diversos desórdenes, incluyendo cáncer, en la forma de composiciones farmacéuticas. Si el polipéptido TAT es intracelular y se utilizan anticuerpos enteros como inhibidores, se prefieren anticuerpos de internalización. Sin embargo, también pueden emplearse lipofecciones o liposomas para suministrar anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, en células. Cuando los fragmentos de anticuerpo se utilizan, el fragmento inhibidor más pequeño que liga específicamente al dominio de enlace de la proteína objetivo se prefiere. Por ejemplo, con base en las secuencias de región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas de péptido que retienen la capacidad por ligar la secuencia de proteína objetivo. Estos p ptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse por tecnología de ADN recombinante . Ver por ejemplo, Marasco y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 90: 7889-7893 (1993) .
La presente formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, de preferencia aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente entre sí. En forma alterna o además, la composición puede comprender un agente que mejora su función tal como por ejemplo un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor de crecimiento. Estas moléculas convenientemente están presentes en combinación en cantidades que son efectivas para los propósitos pretendidos. Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos de ilustración solamente y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención en forma alguna . Todas las referencias de patente y literatura citadas en la presente especificación aquí se incorporan por referencia completamente. EJEMPLOS Reactivos comercialmente disponibles referidos en los ejemplos se emplearon de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos que se indique de otra forma. La fuente de esas células identificada en los siguientes ejemplos y a través de la especificación por números de acceso ATCC es la conexión de cultivo tipo americana American Type Culture Collection, Manassas, VA. EJEMPLO 1: Perfilado de Expresión de Tejido Utilizando GeneExpress® Una base de datos de propiedad que contiene información de expresión de gen (GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg , MD) se analizó en un intento por identificar polipéptidos (y sus ácidos nucleicos de codificación) cuya expresión se regula a la alta significativamente en tejido o tejidos de tumor particulares de interés en comparación con otros tumores y/o tejidos normales. Específicamente, análisis de la base de datos GeneExpress® se realiza utilizando cualquiera del soporte lógico disponible a través de Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD, para utilizar con la base de datos GeneExpress® o con soporte lógico de propiedad descrito y desarrollado en Genentech, Inc., para utilizar con la base de datos GeneExpress®. La calificación de aciertos positivos en el análisis se basa en varios criterios incluyendo por ejemplo especificidad de tejido, especificidad de tumor y nivel de expresión en tejidos proliferativos normales y/o esenciales normales. A continuación se da una lista de moléculas cuyo perfil de expresión de tejido como se determina de un análisis de la base de datos GeneExpress® evidencia alta expresión de tejido y significante regula a la alta de expresión en un tumor o tumores específicos en comparación con otros tumores y/o tejidos normales y expresión relativamente baja opcionalmente en tejidos de proliferación normal y/o esencial normal. Como tal, las moléculas enlistadas a continuación son excelentes blancos polipéptidos para el diagnóstico y terapia de cáncer en mamíferos.
Molécula Regulación a la En comparación con Alta de Expresión en : DNA227943 tumor de mama tej ido normal de mama (TAT242) DNA227943 tumor de cerebro tej ido normal de (TAT242) cerebro DNA227019 tumor de mama tej ido normal de mama (TAT244) DNA227109 tumor de pulmón tej ido normal de pulmón (TAT244) DNA227019 tumor de ovario tejido normal de ovario (TAT244) DNA227465 tumor de mama tej ido normal de mama (TAT241) Molécula Regulación a la En comparación con : Alta de Expresión en : DNA227465 tumor de pulmón tej ido normal de pulmón (TAT241) DNA82306 tumor de riñon tejido normal de riñon (TAT243) DNA82306 tumor linfoide tejido normal linfoide (TAT243) DNA82306 tumor de colon tejido normal de colon (TAT243) DNA42551 tumor de mama tejido normal de mama (TAT246) DNA42551 tumor de pulmón tejido normal de pulmón (TAT246) DNA42551 tumor de ovario tejido normal de ovario (TAT246) DNA68885 tumor uterino tej ido normal uterino (TAT135) DNA68885 tumor de pulmón tej ido normal de pulmón (TAT135) DNA68885 tumor de ovario tej ido normal de ovario (TAT135) DNA68885 tumor pancreático tejido normal Molécula Regulación a la En comparación con : Alta de Expresión en : (TAT135) pancreático DNA68885 tumor de mama tej ido normal de mama (TAT135) DNA68885 tumor cervical tejido normal cervical (TAT135) DNA68885 tumor endometrial tejido normal (TAT135) endometrial DNA68885 tumor de estómago tejido normal de (TAT135) estómago DNA59619 tumor de mama tej ido normal de mama (TAT249) DNA59619 tumor esofágico tejido normal esofágico (TAT249) DNA59619 tumor de ovario tejido normal de ovario (TAT249) DNA59619 tumor de estómago tejido normal de (TAT249) estómago DNA290812 tumor de colon tejido normal de colon (TAT283) DNA290812 tumor de mama tejido normal de mama (TAT283) Molécula Regulación a la En comparación con : Alta de Expresión en : DNA292996 tumor de pulmón te ido normal de pulmón (TAT286) DNA254932 tumor de mama tejido normal de mama (TAT288) DNA254932 tumor de colon tejido normal de colon (TAT288) DNA254932 tumor de ovario tej ido normal de ovario (TAT288) DNA288313 tumor de colon te ido normal de colon (TAT289) DNA288313 tumor de ovario tejido normal de ovario (TAT289) DNA227583 tumor de colon tejido normal de colon (TAT279) DNA227583 tumor de útero tejido normal de útero (TAT279) DNA227708 tumor de mama tejido normal de mama (TAT281) DNA227708 tumor de próstata te ido normal de (TAT281) próstata DNA226859 tumor de colon tej ido normal de colon Molécula Regulación a la En comparación con : Alta de Expresión en : (TAT282) DNA194838 tumor de mama te ido normal de mama (TAT280) DNA194838 tumor de colon tejido normal de colon (TAT280) DNA194838 tumor de recto tej ido normal de recto (TAT280) DNA194838 tumor endometrial tejido normal (TAT280) endometrial DNA194838 tumor de riñon te ido normal de riñon (TAT280) DNA194838 tumor de ovario tej ido normal de ovario (TAT280) DNA290924 tumor de mama tej ido normal de mama (TAT290) DNA290924 tumor de colon tej ido normal de colon (TAT290) DNA290924 tumor de recto tej ido normal de recto (TAT290) DNA290924 tumor endometrial tejido normal (TAT290) endometrial Molécula Regulación a la En comparación con : Alta de Expresión en : DNA290924 tumor de riñon tej ido normal de riñon (TAT290) DNA290924 tumor de ovario tejido normal de ovario (TAT290) DNA299882 tumor de mama tej ido normal de mama (TAT373) DNA299882 tumor de colon te ido normal de colon (TAT373) DNA299882 tumor de recto tej ido normal de re (TAT373) DNA299882 tumor uterino tejido normal uterino (TAT373) DNA299882 tumor de ovario te ido normal de ovario (TAT373) DNA299882 tumor de páncreas tej ido normal de (TAT373) páncreas DNA299882 tumor de vej iga tejido normal de vejiga (TAT373) DNA299882 tumor de pulmón tej ido normal de pulmón (TAT373) DNA299882 tumor de riñon tej ido normal de riñon Molécula Regulación a la En comparación con Alta de Expresión en: (TAT373) DNA254340 tumor de mama tejido normal de mama (TAT287) DNA254340 tumor de colon tejido normal de colon (TAT287) DNA254340 tumor de recto tejido normal de recto (TAT287) DNA254340 tumor uterino tejido normal uterino (TAT287) DNA254340 tumor de ovario tejido normal de ovario (TAT287) DNA254340 tumor de páncreas tejido normal de (TAT287) páncreas DNA254340 tumor de vej iga tejido normal de vejiga (TAT287) DNA254340 tumor de pulmón tej ido normal de pulmón (TAT287) DNA254340 tumor de riñon tej ido normal de riñon (TAT287) DNA274297 tumor de glioma tejido normal de glioma (TAT257) Molécula Regulación a la En comparación con : Alta de Expresión en : DNA274297 tumor de mama tej ido normal de mama (TAT257) DNA274297 tumor de tiroides tejido normal de (TAT257) tiroides DNA274297 tumor de estómago tejido normal de (TAT257) estómago DNA274297 tumor de riñon tej ido normal de riñon (TAT257) DNA274297 tumor tej ido normal de (TAT257) neuroendócrino neuroendócrino DNA274297 linfoma de Hodkins te idos normales (TAT257) asociados DNA2 4297 linfoma maligno tej idos normales (TAT257) asociados DNA47369 tumor de glioma tej ido normal de (TAT258) cerebro DNA47369 tumor de hueso tejido normal de hueso (TAT258) benigno DNA226027 tumor de glioma tejido normal de (TAT259) cerebro DNA226027 tumor de huesos de tej ido normal de hueso Molécula Regulación a la En comparación con : Alta de Expresión en : (TAT259) células gigantes DNA226027 tumor de hueso tejido normal de hueso (TAT259) benigno DNA226027 tumor de hueso tejidos normales (TAT259) metastásico asociados DNA226027 tumor de fibroma tej ido normal de (TAT259) fibroma DNA226713 tumor de glioma tejido normal de (TAT260) cerebro DNA226713 tumor de hueso tejido normal de hueso (TAT260) benigno DNA226713 tumor de huesos de ido normal de huesos (TAT260) células gigantes DNA226713 linfoma de Hodgkins tej idos normales (TAT260) asociados DNA226713 linfoma metastásico tej idos normales (TAT260) asociados DNA86517 tumor de glioma tej ido normal de (TAT261) cerebro DNA88126 tumor de glioma tej ido normal de (TAT262) cerebro Molécula Regulación a la En comparación con : Alta de Expresión en : DNA103464 tumor de glioma tejido normal de (TAT263) cerebro DNA194776 tumor de glioma tej ido normal de (TAT264) cerebro DNA194776 tumor de Wilm tejidos normales (TAT264) asociados DNA194776 tumor de ríñones tejido normal de riñon (TAT264) metastásico DNA194776 tumores de te idos tejidos blandos (TAT264) blandos normales DNA288204 tumor de glioma tejido normal de (TAT265) cerebro DNA288204 tumores de tejidos tejidos blandos (TAT265) blandos normales DNA288204 tumor de leucocitos tej ido normal de (TAT265) de granulomatosis leucocitos de Wegner DNA257354 tumor de glioma tej ido normal de (TAT266) cerebro DNA257354 tumor de ovarios tej ido normal de (TAT266) metastásico ovarios Molécula Regulación a la En comparación con Alta de Expresión en : DNA98566 tumor de glioma tejido normal de (TAT267) cerebro DNA227212 tumor de glioma tejido normal de (TAT268) cerebro DNA227212 tumor de mama tej ido normal de mama (TAT268) DNA227212 tumor de útero tejido normal de útero (TAT268) DNA227461 tumor de glioma tejido normal de (TAT269) cerebro DNA150762 tumor de glioma tejido normal de (TAT270) cerebro DNA150762 tumor de riñon tejido normal de riñon (TAT270) DNA150762 tumor de cabeza y tejido normal de cab (TAT270) cuello y cuello DNA150762 tumores de tejidos te idos blandos (TAT270) blandos normales DNA150762 tumor de mama tejido normal de mama (TAT270) DNA150762 leucemia mieloide tejido mieloide normal Molécula Regulación a la En comparación con : Alta de Expresión en: (TAT270) crónica DNA150762 linfoma de Hodgkins tejidos normales (TAT270) asociados DNA150762 linfoma maligno tej idos normales (TAT270) asociados DNA86382 tumor de glioma tejido norma de (TAT271) cerebro DNA86382 leucocitos tejido norma de (TAT271) granulomatosis leucositos Wegner DNA256608 tumor de glioma tej ido normal de (TAT272) cerebro DNA256608 tumor de riñon tej ido normal de riñon (TAT272) DNA256608 tumor tej ido normal (TAT272) neuroendocrino neuroendocrino DNA19902 tumor de glioma tej ido normal de (TAT273) cerebro DNA19902 tumor colorectal tej ido normal (TAT273) colorectal DNA182764 tumor de glioma tej ido normal de Molécula Regulación a la En comparación con : Alta de Expresión en: (TAT274) cerebral DNA182764 tumor de ovario tejido normal de ovario (TAT274) DNA225727 tumor de glioma tejido normal de (TAT275) cerebro DNA119500 tumor de glioma tej ido normal de (TAT276) cerebro DNA19362 tumor de glioma tej ido normal de (TAT277) cerebro DNA19362 tumor de piel tejido normal de piel (TAT277) DNA19362 tumor de hueso te ido normal de hueso (TAT277) DNA19362 tumor de riñon tej ido normal de riñon (TAT277) DNA19362 tumores de tejidos tejidos normales (TAT277) blandos blandos EJEMPLO 2: Análisis de Micro-hilera para Detectar Regulación a la Alta de Polipéptidos TAT en Tumores Cancerosos Micro-conjuntos de ácido nucleico a menudo que contienen miles de secuencias de genes, son útiles para identificar genes expresados diferencialmente en tejidos enfermos en comparación con sus contrapartes normales. Utilizando micro-conjuntos de ácido nucléico, muestras de prueba y control de mAR de muestras de tejido de prueba de control se someten a transcripción inversa y etiquetan para generar sondas cADN. Las sondas cADN luego se hibridizan a una colección de ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte sólido. La colección se configura de manera tal que la secuencia y posición de cada miembro del conjunto se conoce. Por ejemplo, una selección de genes que se conocen y expresan en ciertos estados de enfermedad pueden disponerse en un soporte sólido. La hibridización de una sonda etiquetada con un miembro del conjunto particular indica que la muestra de la cual se deriva la sonda expresa ese gen. Si la señal de hibridización de una sonda de una muestra de prueba (tejido enfermo) es mayor que la señal de hibridización de una sonda de una muestra de control (tejido normal), se identifican el o los genes sobre-expresados en el tejido enfermo. La implicación de este resultado es que una proteína sobre-expresada en un tejido enfermo no solo es útil como un marcador de diagnóstico para la presencia de la condición enferma sino también como un objetivo terapéutico para el tratamiento de la condición enferma. La metodología de hibridización de ácidos nucleicos y tecnología de micro-conjunto es bien conocida en la especialidad. En un ejemplo, la preparación específica de ácidos nucléicos para hibridización y sondas, porta objetos y condiciones de hibridización todos se detallan en la solicitud de patente del PCT No. de serie PCT/USOl/10482 , presentada en marzo 30 del 2001 y que aquí se incorpora por referencia . En el presente ejemplo, tumores cancerosos derivados de diversos tejidos humanos se estudiaron para expresión de gen regulada a la alta respecto a tumores cancerosos de diferentes tipos de tejidos y/o tejidos humanos no cancerosos en un intento por identificar aquellos polipéptidos que se sobre -expresan en tumores cancerosos particulares. En ciertos experimentos, tej idos de tumor humano canceroso y tej ido de tumor humano no canceroso del mismo tipo de tejido (a menudo de el o la misma paciente) se obtienen y analizan para expresión de polipéptido TAT . Adicionalmente, tejido de tumor humano canceroso de cualquiera de una variedad de tumores humanos diferentes se obtuvo y comparó con una muestra de control epitelial "universal" que se preparó al recolectar tejidos humanos no cancerosos de origen epitelial, incluyendo de hígado, riñon y pulmón. mARN aislado de los tejidos recolectados representa una mezcla de productos de gen expresados de estos diferentes tejidos. Experimentos de hibridi zación de micro-hileras utilizan las muestras de control recolectadas generaron un trazo lineal en un análisis de dos colores. La pendiente de la línea generada en un análisis de dos colores luego se utilizó para normalizar las proporciones de (prueba: detección de control) dentro de cada experimento. Las proporciones normalizadas de diversos experimentos luego se compararon y utilizaron para identificar enjambrado o agrupameinto de expresión de gen. De esta manera, la muestra de "control universal" recolectada no solo permite determinaciones de expresión de gen relativas y efectivas en una simple comparación de dos muestras, también permite comparación de múltiples muestras a través de varios experimentos. En los presentes experimentos, sondas de ácido nucleico derivadas de las secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptido TAT aquí descritas se utilizaron en la creación de la micro-hilera y ARN de diversos tejidos de tumor se utilizaron para su hibridización . A continuación se ilustran los resultados de esos experimentos, mostrando que diversos polipéptidos TAT de la presente invención se sobre-expresan significativamente en diversos tejidos de tumor humano en comparación con sus tejidos contra partes normales. Aún más, todas las moléculas mostradas a continuación se sobre-expresan significativamente en sus tejidos de tumor específicos en comparación con el control epitelial "universal". Como se describió anteriormente, estos datos demuestran que los polipéptidos TAT de la presente invención son útiles no solo como marcadores de diagnóstico para la presencia de uno o más tumores cancerosos sino también sirven como blancos terapéuticos para el tratamiento de esos tumores.
Molécula regulación a la en comparación con: alta de expresión en : DNA68885 (TAT135) tumor de mama tej ido normal de mama DNA68885 (TAT135) tumor de recto tej ido normal de recto DNA68885 (TAT135) tumor de pulmón tej ido normal de pulmón DNA68885 (TAT135) tumor de ovario tej ido normal de ovario DNA274297 (TAT257) tumor de glioma tej ido normal de Molécula regulación a la en comparación con: alta de expresión en : cerebro DNA47369 (TAT258) tumor de glioma tej ido no mal cerebro DNA226027 (TAT259) tumor de glioma tej ido normal cerebro DNA226713 (TAT260) tumor de glioma tej ido normal cerebro DNA86517 (TAT261) tumor de glioma tej ido normal cerebro DNA88126 (TAT262) tumor de glioma tej ido normal cerebro DNA103464 (TAT263) tumor de glioma tej ido normal cerebro DNA194776 (TAT264) tumor de glioma tej ido normal cerebro DNA288204 (TAT265) tumor de glioma tej ido normal cerebro DNA257354 (TAT266) tumor de glioma tej ido normal cerebro DNA98566 (TAT267) tumor de glioma tej ido normal cerebro DNA227212 (TAT268) tumor de glioma tej ido normal Molécula regulación a la en comparación con: alta de expresión en : cerebro DNA227461 (TAT269) tumor de glioma tejido normal de cerebro DNA150762 (TAT270) tumor de glioma tejido normal de cerebro DNA86382 (TAT271) tumor de glioma tejido normal de cerebro DNA256608 (TAT272) tumor de glioma tejido normal de cerebro DNA19902 (TAT273 ) tumor de glioma tejido normal de cerebro DNA19902 (TAT273 ) tumor colorectal tejido normal colorectal DNA182764 (TAT274) tumor de glioma tejido normal de cerebro DNA119500 (TAT276) tumor de glioma tejido normal de cerebro DNA19362 (TAT277) tumor de glioma tejido normal de cerebro DNA226446 (TAT278) tumor de glioma tejido normal de cerebro EJEMPLO 3: Análisis Cuantitativo de Expresión de mARN TAT En este ensayo, un ensayo de 5' nucleasa (por ejemplo, TaqMan®) y PCR cuantitativo en tiempo real (por ejemplo, ABI Prizm 7700 Sequence Detection System® (Perkin Elmer, Applied Biosystems División, Foster City, CA) ) , se utilizaron para encontrar genes que se sobre-expresan significativamente en tumor o tumores cancerosos en comparación con otros tumores cancerosos o tejido no canceroso normal . La reacción de ensayo de 5 ' nucleasa es una técnica basada en PCR fluorescente que utiliza la actividad 51 exonucleasa de enzima Taq ADN polimerasa para supervisar expresión de gen en tiempo real. Dos cebadores poligonucleótido (cuyas secuencias se basan en el gen o secuencia EST de interés) se utilizan para generar un amplicon típico de una reacción PCR. Un tercer oligonucleótido , o sonda, se diseña para detectar secuencia de nucleótidos ubicada entre los dos cebadores PCR. La sonda no es extensible por enzima Taq ADN polimerasa, y se etiqueta con un colorante fluorescente reportero y un colorante fluorescente neutralizador . Cualquier emisión inducida por láser de un colorante reportero se neutraliza por el clorante de neutralización cuando los dos colorantes se ubican cerca en conjunto como están en la sonda. Durante la reacción de amplificación PCR, la enzima Taq ADN polimerasa escinde la sonda y una forma dependiente de plantilla. Los fragmentos de sonda resultantes se desasocian en solución y la señal del colorante reportero liberado está libre del efecto neutralizador del segundo fluoroforo. Una molécula de colorante reportero se libera por cada nueva molécula y es sintetizada y la detección de colorante reportero no neutralizado proporciona la base para interpretación cuantitativa de los datos. El procedimiento 51 nucleasa se corre en un dispositivo PCR cuantitativo en tiempo real tal como el ABI Prism 7700TM Sequence Detection. El sistema consiste de un termociclador, láser, cámara de dispositivo acoplado de carga (CCD) y computadora. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pozos en un termociclador. Durante amplificación, señal fluorescente inducida por láser se recolecta en tiempo real a través de cables de fibras ópticas para todos los 96 pozos y detecta en el CCD. El sistema incluye soporte lógico para operar el instrumento y para analizar los datos. El material de partida para el monitoreo fue mAR aislado de una variedad de tejidos cancerosos diferentes. El mARN se cuantifica precisamente por ejemplo fluorométricamente . Como un control negativo, ARN se aisló de diversos tejidos normales del mismo tipo de tejido que los tejidos cancerosos que se prueban. Datos de ensayo 51 nucleasa se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Esto se define como el ciclo en el cual la señal reportera se acumula sobre el nivel de fondo de fluorescencia. Los valores deltaCt se utilizan como medidas cuantitativas del número relativo de copias de partida de una secuencia objetivo particular en una muestra de ácido nucleico cuando se comparan resultados de mAR de cáncer con resultados de mARN humano normal . Como una unidad Ct corresponde a 1 ciclo de PCR o aproximadamente un incremento relativo de 2 veces respecto a lo normal, 2 unidades corresponden a un incremento relativo 4 veces, 3 unidades corresponden a un incremento relativo de 8 veces y así en adelante, se pueden medir cuantitativamente el incremento de dobles relativo en expresión de mARN entre dos o más tejidos diferentes. Utilizando esta técnica, las moléculas enlistadas a continuación se han identificado que se sobre-expresan significativamente en uno o varios tumores particulares y en comparación con sus tejidos contraparte no cancerosos (tanto de donadores de tejido iguales y diferentes) y de esta manera representan objetivos polipéptidos excelentes para el diagnóstico y terapia de cáncer en mamíferos.
Molécula Regulación a la En comparación con : Alta de Expresión en : DNA227943 tumor de mama tejido normal de mama (TAT242) apareado DNA175959 tumor de ovario tejido normal de ovario (TAT251) apareado DNA59612 tumor de ovario tej ido normal de ovario (TAT253) apareado DNA227465 tumor de mama tej ido normal de mama (TAT241) apareado DNA82306 tumor de riñon tej ido normal de riñon (TAT243) apareado DNA42551 tumor de ovario tejido normal de ovario (TAT246) apareado DNA68885 tumor de ovario tejido normal de ovario (TAT135) apareado DNA59619 tumor de mama tej ido normal de mama (TAT249) apareado DNA288313 tumor de ovario tej ido normal de ovario (TAT289) apareado DNA194838 tumor de riñon te ido normal de riñon (TAT280) apareado Molécula Regulación a la En comparación con : Alta de Expresión en : DNA194838 tumor de colon tejido normal de colon (TAT280) apareado DNA290924 tumor de riñon tejido normal de riñon (TAT290) apareado DNA290924 tumor de colon tejido normal de colon (TAT290) apareado DNA254340 tumor de mama tejido normal de mama (TAT287) apareado DNA299882 tumor de mama tej ido normal de mama (TAT373) apareado DNA274297 tumor de glioma tejido normal de (TAT257) cerebro apareado DNA226027 tumor de glioma tej ido normal de (TAT259) cerebro DNA194776 tumor de glioma tej ido no mal de (TAT264) cerebro DNA288204 tumor de glioma tej ido normal de (TAT264) cerebro DNA257354 tumor de glioma tej ido normal de (TAT266) cerebro DNA98566 tumor de glioma tej ido normal de Molécula Regulación a la En comparación con Alta de Expresión en : (TAT267) cerebro DNA227212 tumor de glioma tej ido normal de (TAT268) cerebro DNA150762 tumor de glioma tej ido normal de (TAT270) cerebro DNA86382 tumor de glioma tej ido normal de (TAT271) cerebro DNA182764 tumor de glioma tej ido normal de (TAT274) cerebro DNA19362 tumor de glioma tej ido normal de (TAT277) cerebro EJEMPLO 4: Hibridización In Situ Hibridización in situ es una técnica poderosa y versátil para la detección y ubicación de secuencias de ácido nucleico dentro de preparaciones de tejido o células. Puede ser útil por ejemplo para identificar sitios de expresión de gen, analizar la distribución de tejido de transcripción, identificar y localizar infección viral, seguir cambios en síntesis de mAR en en específico y ayudar en mapeo de cromosomas.
Hibridización in situ se realiza siguiendo una versión optimizada del protocolo por Lu y Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994), utilizando ribo-sondas etiquetadas 33P generadas por PCR. Brevemente, tejidos humanos incrustados en parafina fijos con formal ina se seccionaron, desparafinaron, desprotéinaron en protínasa K (20 g/ml) por 15 minutos a 37 grados C, y además se procesan para hibridización in situ por Lu and Gillett, arriba. Una ribo-sonda antisentido etiquetada [33 -P] UTP se genera a partir de un producto PCR e hibridiza a 55 grados C durante la noche. Los cubre objetos se sumergieron en emulsión de pista nuclear Kodak NTB2 y expusieron por 4 semanas. Síntesis de 33P-Ribosonda 6.0 µ? (125 mCi) de 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol) se secaron en speed vac . A cada tubo que contiene 33P-UTP seco, se agregaron los siguientes ingredientes : 2.0 µ? amortiguador de transcripción 5x 1.0 µ? DTT (100 mM) 2.0 µ? mezcla NTP (2.5 mM : 10 µ; cada uno de GTP 10 mM, CTP & ATP + 10 µ? H20) 1.0 µ? UTP (50 µ?) 1.0 µ? Rnasin 1.0 /il plantilla ADN (^g) 1.0 µ? ?20 1.0 µ? polimerasa ARN (para productos PCR T3 = AS, T7 = S, usualmente) Los tubos se incubaron a 37 grados C pro una hora . Se agrega 1.0 µ? de RQ1 DNase seguido por incubación a 37 grados C por 15 minutos. 90 µ? TE (10 mM Tris pH 7.6/lmM EDTA pH 8.0) se agregan y al mezcla se pipetea en papel DE81. La solución restante se carga en una unidad de ultra-filtración Microcon-50 , y centrifugó utilizando el programa 10 (6 minutos) . La unidad de filtración se invierte en un segundo tubo y centrifuga utilizando el programa 2 (3 minutos) . Después de la centrifugación de recuperación final, 100 µ? de TE se agregaron. 1 µ? del producto final se pipetea en papel DE81 y cuentan en 6 mi de Biofluor II. La sonda se corre en un gel TBE/urea. 1-3 µ? de la sonda o 5 µ? de RNA Mrk III se agregaron a 3 µ? de amortiguador de carga. Después de calentar en un bloque térmico durante 95 grados C por tres minutos, la sonda se colocó inmediatamente en hielo. Los pozos de gel se lavaron por arrastre, la muestra se cargó y corrió a 180-250 volts por 45 minutos. El gel se envolvió en envoltura de sarán y expuso a película XAR con una pantalla de identificación en congelador a -70 grados C una hora durante la noche.
Hibridización-33P A. Pretratamiento de secciones congeladas Los porta objetos se retiraron del congelador, colocaron en charolas de aluminio y se descongelaron a temperatura ambiente por 5 minutos. Las charolas se colocaron en una incubadora a 55 grados C por 5 minutos para reducir condensación. Los porta objetos se fijaron por 10 minutos en paraformaldehído al 4 por ciento en hielo en la campana de humos, y lavaron en SSC 0.5 x por 5 minutos, a temperatura ambiente (25 mi 20 x SSC + 975 mi SQ H20) . Después de desproteinar en 0.5 g/ml proteinasa K por 10 minutos a 37 grados C (12.5 µ? de 10 mg/ml material en 250 mi de amortiguador R ase-libre de RNAse precalentado), las secciones se lavaron en SSC 0.5 x 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en 70%, 95%, 100% de etanol, 2 minutos cada uno. B . Pretratamiento de secciones incrustadas en parafina Los porta objetos se desparafinaron, colocaron en SQ H20, y enjuagaron 2 veces en SSC 2x a temperatura ambiente por 5 minutos cada vez. Las secciones se desproteinaron en 20 µg/ml de proteinasa K (500 µ? de 10 mg/ml en 250 mi de amortiguador RNasa-libre RNasa; 37 grados C, 15 minutos) - embrión humano o proteinasa K 8 x (100 µ? en 250 mi amortiguador Rnasa, 37 grados C, 30 minutos) - tejidos en formalina. Subsecuente enjuague en SSC 0.5 x y deshidratación se realizaron como se describió anteriormente. C . Prehibridizacion Los porta objetos en una caja de plástico revestida con papel filtro saturado amortiguador Box (4 x SSC, 50% formamida) . D . Hibridización 1.0 x 106 cpm de sonda y 1.0 µ? tRNA (50 mg/ml de material) por corta objetos se calentaron a 95 grados C por 3 minutos. Los porta objetos se enfriaron en hielo, y se agregó por porta objeto 48 µ? de amortiguador de hibridización. Después de someter a torbellino, 50 µ? de mezcla 33P se agregaron a 50 µ? de prehibridizacion en porta objeto. Los porta objetos se incubaron durante la noche a 55 grados C. E . Lavados Se efectuó lavado con 2 x 10 minutos con 2xSSC, EDTA a temperatura ambiente (400 mi 20 x SSC + 16 mi 0.25 EDTA, Vf=4L) , seguido por tratamiento R aseA a 37 grados C por 30 minutos (500 µ? de 10 mg/ml en 250 mi de amortiguador Rnasa = 20 g/ml)l Los porta objetos se lavaron 2 x 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones de lavados severas fueron como sigue: 2 horas a 55 C, 0.1 x SSC, EDTA (20 mi 20 x SSC + 16 mi EDTA, Vf=4L) . F . Oligonucleótidos Análisis in situ se realizó en una variedad de secuencias de ADN aquí descritas. Los oligonucleótidos empleados para estos análisis se obtuvieron para ser complementarios con los ácidos nucléicos (o sus complementos) como se ilustra en las Figuras acompañantes . G . Resultados Análisis in situ se realizó en una variedad de secuencias de ADN aquí descritas. Los resultados de estos análisis son como sigue. (1) DNA42551 (TAT246) Con respecto a tejidos normales, se observa expresión muy débil en las células epiteliales de glándulas bronquiales submucosales, mama, vesícula biliar y próstata; ésta última es inconsistente. Ningún otro tejido normal probado fue sometido a expresión. En un análisis, se observa fuerte expresión en 12 de 15 carcinomas de ovarios. En adenocarcinomas uterinos, se observa expresión positiva en 4 de 8 muestras . En otro análisis, ** In another analysis, weak to modérate expression is observed in 3 of 16 non-small cell lung carcinomas. Positive expression is also observed in 2 of 14 colorectal adenocarcinomas , 5 of 8 gastric adenocarcinomas , 3 of 4 esophageal carcinomas (2 adeno and 1 squamous cell carcinoma) and 1 of 3 pancreatic ductal adenocarcinomas. (2) DNA68885 (TAT135) En otro análisis, expresión débil a moderada se observa en 3 de 16 carcinomas de pulmón de células no pequeñas. Expresión positiva también se observa en 2 de 4 adenocarcinomas colorectales, 5 de 8 adenocarcinomas gástricos, 3 de 4 carcinomas esofágicos (2 adeno- y 1 carcinoma de célula escamosa) y 1 de 3 adenocarcinomas ductales pancreáticos. (2) DNA68885 (TAT135) Expresión de intensidad moderada se ve en mucosa gastrointestinal. En colon e intestino delgado, la expresión aparece a través del epitelio del forro. En el estómago la expresión aparece concentrada en el epitelio foveolar, células jefe y parietales son negativas. Una señal débil a moderada se detecta en dos núcleos de riñon, localiza células de la macula densa. También se observa expresión en 11 de 15 carcinomas de ovario (superficie epitelial y adenocarcinoma) y un caso de tumor de Brenner. La expresión también se ve en 6 de 8 adenocarcinomas uterinos, incluyendo un tumor mueleriano mixto maligno (MMMT = Malignant Mixed Muellerian Tumor) . La expresión también se observa en mucosa bronquial normal , en donde el nivel de expresión está en el rango desde muy débil a moderada. Se observa fuerte expresión en 10 de 16 carcinomas de pulmón que no son de células pequeñas. También se ve la expresión en los siguientes neoplasmas malignos: 19 de 19 adenocarcinomas colorectales , 8 de 9 adenocarcinomas gástricos, 2 de 2 adenocarcinomas pancreáticos, 2 de 4 carcinomas esofágicos y 11 de 11 adenocarcinmas metastásicos . (3) DNA59619 (TAT249) Ninguno de los tejidos normales analizados muestra una señal positiva. Con respecto a las muestras de carcinoma, 22 de 86 casos de cáncer de mama ductal invasiva son positivos para expresión. (4) DNA288313 (TAT289) Una señal de intensidad moderada se ve en 2 de 3 carcinomas de ovario, mientras que no se observa señal positiva en tejido de ovario normal. (5) DNA194838 (TAT280) Tres de 4 carcinomas de células renales muestran una señal positiva; en donde los tres casos positivos son carcinomas de células clásicos. No hay señal positiva observada en nada del tejido de riñon de línea normal analizado (corteza o médula) . (6) DNA290924 (TAT290) Tres de 4 carcinomas de células renales muestran una señal positiva; en donde los tres casos positivos son carcinomas de células claras clásicos. No hay señal positiva observada en nada del tejido de riñon benigno normal analizado (corteza o médula) . EJEMPLO 5 : Verificación y análisis de Expresión del polipéptido TAT diferencial por GEPIS. Polipéptidos TAT que pueden haber sido identificados como un antígeno de tumor se describen en uno o más de los ejemplos anteriores, se analizaron y verificaron como sigue. Una base de datos de AND de etiqueta de secuencia expresada (EST = expressed sequence Tag) además de un (LIFESEQ® , Incyte Pharmaceuticals , Palo Alto, CA) fue buscada y se identificaron secuencias EST interesantes por GEPIS. Perfilado de expresión de gen en silico (GEPIs) es una herramienta de via informática desarrollada en Genentech, Inc., que caracteriza genes de interés para nuevos objetivos terapéuticos de cáncer. GEPIS aprovecha grandes cantidades de información de biblioteca y secuencia EST para determinar perfiles de expresión de genes. GEPIS es capaz de determinar el perfil de expresión de un gen con base en su correlación proporcional con el número de sus ocurrencias en bases de datos EST, y trabaja al integrar la base de datos relacional EST LIFESEQ® e información de propiedades Genentech en una forma significante estadísticamente y severa. En este ejemplo, GEPIS se utiliza para identificar y validar en forma cruzada novedosos antígenos de tumor, aunque puede configurarse GEPIS para desempeñar ya sea análisis muy específicos o tareas de monitoreo amplio. Para el monitoreo inicial, se utiliza GEPIS para identificar secuencias EST de la base de datos LIFESEQ® que correlaciona a expresión en el tejido o tejidos particulares de interés (a menudo un tejido de tumor de interés) . Las secuencias EST identificadas en este monitoreo inicial (o secuencias de concenso obtenidas de alinear múltiples secuencias EST relacionadas y superpuestas que se obtienen del monitoreo inicial ) luego se sometieron a un monitoreo pretendido para identificar la presencia de al menos un dominio transmembrana en la proteína codificada. Finalmente, se emplea GEPIS para generar un perfil de expresión de tejido completo para las diversas secuencias de interés. Utilizando este tipo de bioinformática de monitoreo, diversos polipéptidos TAT (y sus moléculas de ácido nucleico de codificación) se identificaron como sobre expresado significativamente en u ntipo particular de cáncer o ciertos cánceres en comparación con otros cánceres y/o tejidos no cancerosos normales. La calificación de aciertos GEPIS se basa en varios criterios incluyendo por ejemplo especificidad de tejido, especificidad de tumor y nivel de expresión en tejidos de proliferación normal y/o esencia normal. Lo siguiente es una lista de moléculas cuyo perfil especial de tejido como se determina por GEPIS evidencia alta expresión de tejido y significante regulación a alta de expresión en un tumor o tumores específicos en comparación con otros tumores y/o tejidos normales y expresión relativamente baja opcionalmente en tejidos proliferativos normales y/o esenciales normales. Como tal, las moléculas enlistadas a continuación son excelentes blancos u objetivos de polipéptidos para el diagnóstico y terapia de cáncer en mamíferos .
Molécula regulación a la en comparac alta de expresión con : en: DNA172363 tumor de vej iga tejido normal de (TAT240) vej iga Molécula regulación a en comparación alta de expre con: en : DNA172363 tumor de cerebro tejido normal de (TAT240) cerebro DNA172363 tumor de mama tejido normal de (TAT240) mama DNA227943 tumor de cerebro tejido normal de (TAT242) cerebro DNA227943 tumor de mama tej ido normal de (TAT242) mama DNA227943 tumor de próstata tej ido normal de (TAT242) próstata DNA227943 tumor de riñon tej ido normal de (TAT242) riñon DNA227943 tumor de útero tejido normal de (TAT2 2) útero DNA227019 tumor de pulmón tejido normal de (TAT244) pulmón DNA227019 tumor de mama tej ido normal de (TAT244) mama DNA227019 tumor de próstata tej ido normal de (TAT244) próstata DNA227019 tumor de útero tej ido normal de (TAT244) útero Molécula regulación a la en comparación alta de expresión con : en : DNA96942 (TAT245) tumor de cerebro tejido normal de cerebro DNA96942 (TAT245) tumor de pulmón tejido normal de pulmón DNA96942 (TAT245) tumor de útero tejido normal de útero DNA96942 (TAT245) tumor de colon tejido normal de colon DNA96942 (TAT245) tumor de mama tejido normal de mama DNA59619 (TAT249) tumor de cerebro tejido normal de cerebro DNA59619 (TAT249) tumor de mama tejido normal de mama (Notargen ubicado en el mismo amplicon que el gen Her-2 que también está sobre expresado en tumores de mama) DNA59619 (TAT249) tumor de próstata tejido normal de próstata DNA227205 tumor de colon tejido normal de (TAT250) colon DNA227205 tumor de mama tejido normal de (TAT250) mama Molécula regulación a la en comparación alta de expresión con : en: DNA227205 tumor de útero tejido normal de (TAT250) útero DNA227205 Tumor de próstata tejido normal de (TAT250) próstata DNA227205 tumor de pulmón tejido normal de (TAT250) pulmón DNA175959 tumor de próstata tejido normal de (TAT251) próstata DNA175959 tumor de útero tej ido normal de (TAT251) útero DNA175959 tumor de trompa tej ido normal de (TAT251) de Falopio trompa de Falopio DNA175959 tumor de colon tej ido normal de colon DNA175959 tumor de ovario tej ido normal de (TAT251) ovario DNA48227 (TAT252) tumor de colon tejido normal de colon DNA48227 (TAT252) tumor de mama tej ido normal de mama DNA48227 (TAT252) tumor de pulmón te ido normal de pulmón Molécula regulación a la en comparación alta de expresión con : en: DNA59612 (TAT253) tumor de pros te ido normal de próstata DNA59612 (TAT253) tumor de pulmón tejido normal de pulmón DNA59612 (TAT253] tumor de trompa tejido normal de de Falopio trompa de Falopio DNA59612 (TAT253; tumor de útero tejido normal de útero DNA59612 (TAT253) tumor de mama tejido normal de mama DNA226917 tumor de ovario tejido normal de (TAT254) ovario DNA226917 tumor de próstata tejido normal de (TAT254) próstata DNA226917 tumor de colon tej ido normal de (TAT254) colon DNA125219 tumor de mama tejido normal de (TAT255) mama DNA125219 tumor de colon tej ido normal de (TAT255) colon DNA125219 tumor de pulmón tej ido normal de (TAT255) pulmón Molécula regulación a la en comparación alta de expresión con : en : DNA151291 tumor de mama tejido normal (TAT256) mama DNA151291 tumor de colon tej ido normal de (TAT256) colon DNA151291 tumor de pulmón tej ido normal de (TAT256) pulmón DNA151291 tumor de ovario tej ido normal de (TAT256) ovario DNA227465 tumor de pulmón tej ido normal de pulmón DNA227465 tumor de útero tejido normal de (TAT241) útero DNA82306 (TAT243; tumor de riñon tej ido normal de riñon DNA82306 (TAT243) tumor de estómago tejido normal de estómago DNA82306 (TAT243) tumor de mama tejido normal de mama DNA42551 (TAT246) tumor mieloide tej ido normal de mieloide DNA42551 (TAT246) tumor de próstata tejido normal de próstata Molécula regulación a la en comparación alta de expresión con : en : DNA42551 (TAT246) tumor de pulmón tejido normal de pulmón DNA42551 (TAT246) tumor de colon tejido normal de colon DNA42551 (TAT246) tumor de estómago tej ido normal de estómago DNA68885 (TAT135) tumor de ovario te ido normal de ovario DNA68885 (TAT135) tumor pancreático tej ido normal pancreático DNA68885 (TAT135) tumor de riñon tej ido normal de riñon DNA68885 (TAT135) tumor de próstata tejido normal de próstata DNA68885 (TAT135) tumor uterino tejido normal uterino DNA59619 (TAT249) tumor de mama tej ido normal de mama DMA59619 (TAT249) Tumor ovárico tej ido normal ovárico DNA59619 (TAT249) tumor pancreático tej ido normal pancreático Molécula regulación a la en comparación alta de expresión con : en : DNA290812 tumor de colon tej ido normal de (TAT283) colon DNA290812 tumor de mama tej ido normal de (TAT283) mama DNA292996 tumor de pulmón te ido normal de (TAT286) pulmón DNA254932 tumor de mama tej ido normal de (TAT288) mama DNA254932 tumor de colon te ido normal de (TAT288) colon DNA254932 tumor ovárico tej ido normal (TAT288) ovárico DNA288313 tumor de colon tej ido normal de (TAT289) colon DNA288313 tumor ovárico tej ido normal (TAT289) ovárico DNA227583 tumor de colon tej ido normal de (TAT279) colon DNA227583 tumor uterino tej ido normal (TAT279) uterino DNA227708 tumor de mama tej ido normal de (TAT281) mama Molécula regulación a la en comparación alta de expresión con : en : DNA227708 tumor de próstata te ido normal de (TAT281) próstata DNA226859 tumor de colon tejido normal de (TAT282) colon DNA194838 tumor de riñon tej ido normal de (TAT280) riñon DNA194838 tumor de estómago tej ido normal de (TAT280) estómago DNA194838 tumor esofágico tejido normal (TAT280) esofágico DNA290924 tumor de riñon tejido normal de (TAT290) riñon DNA290924 tumor de estómago tej ido normal de (TAT290) estómago DNA290924 tumor esofágico tejido normal (TAT290) esofágico DNA299882 tumor uterino tejido normal (TAT373) uterino DNA299882 tumor ovárico tej ido normal (TAT373) ovárico DNA299882 tumor de páncreas te ido normal de (TAT373) páncreas Molécula regulación a la en comparación alta de expresión con : en : DNA299882 tumor de vej iga te ido normal de (TAT373) vej iga DNA299882 tumor de pulmón tej ido normal de (TAT373) pulmón DNA299882 tumor de riñon tej ido normal de (TAT373) riñon DNA254340 tumor uterino tej ido normal (TAT287) uterino DNA254340 tumor ovarico tejido normal (TAT287) ovárico DNA254340 tumor de páncreas tej ido normal de (TAT287) páncreas DNA254340 tumor de vej iga tej ido normal de (TAT287) vej iga DNA254340 tumor de pulmón tejido normal de (TAT287) pulmón DNA254340 tumor de riñon tej ido normal de (TAT287) riñon DNA274297 tumor de gliorna tejido normal de (TAT257) cerebro DNA47369 (TAT258) tumor de glioma tej ido normal de cerebro Molécula regulación a la en comparación alta de expresión con : en: DNA226027 tumor de glioma tej ido normal de (TAT259) cerebro DNA226713 tumor de glioma tej ido normal de (TAT260) cerebro DNA86517 (TAT261) tumor de glioma tej ido normal de cerebro DNA88126 (TAT262) tumor de glioma tej ido normal de cerebro DNA103464 tumor de glioma tej ido normal de (TAT263) cerebro DNA194776 tumor de glioma tej ido normal de (TAT264) cerebro DNA288204 tumor de glioma tej ido normal de (TAT265) cerebro DNA257354 tumor de glioma tej ido normal de (TAT266) cerebro DNA98566 (TAT267) tumor de glioma tej ido normal de cerebro DNA227212 tumor de glioma tej ido normal de (TAT268) cerebro DNA227461 tumor de glioma tej ido normal de (TAT269) cerebro Molécula regulación a en comparación alta de expre con : en : DNA150762 tumor de glioma tej ido normal de (TAT270) cerebro DNA86382 (TAT271) tumor de glioma tejido normal de cerebro DNA256608 (TAT272) tumor de glioma tej ido normal de cerebro DNA19902 (TAT273) tumor de glioma tej ido normal de cerebro DNA182764 tumor de glioma tej ido normal de (TAT274) cerebro DNA119500 tumor de glioma tej ido normal de (TAT276) cerebro DNA19362 (TAT277] tumor de glioma tejido normal de cerebro DNA226446 tumor de glioma tej ido normal de (TAT278) cerebro EJEMPLO 6 : Uso de TAT como una sonda de hibridizacion. El siguiente método describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica TAT como una sonda de hibridización para, es decir, diagnóstico de la presencia de un tumor en un mamífero. ADN que comprende la secuencia de codificación de TAT de longitud íntegra o maduro como se describe aqui también puede emplearse como una sonda para monitoreo de ADNs homólogos (tales como aquellos que codifican variantes de origen natural de TAT) en bibliotecas cADN de te ido humano o videotecas genómicas de tejido humano. Hibridización y lavado de filtros que contienen cualesquiera de bibliotecas de ADNs se realiza bajo los siguientes condiciones de alta severidad. La hibridización de sonda derivada TAT radioetiquetada a los filtros se realiza en una solución de formamida al 50%, SSC 5x, SDS 0.1%, pirofosfato de sodio 0.1%, fosfato de sodio a 50 mM, pH 6.8, solución de Denhardt ' s 2x y sulfato de dextrano al 10% a 42 grados C por 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de SSC 0. lx y SDS 0.1% a 42 grados C. ADNs que tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica TAT secuencia nativa de longitud íntegra luego puede identificarse utilizando técnicas estándar conocidas en la especialidad. EJEMPLO 7: Expresión de TAT E.coli Este ejemplo ilustra preparación de una forma no glicosilada de TAT por expresión recombinante en E.coli . La secuencia de ADN que codifica TAT se amplifica inicialmente utilizándose valores PCR selectos. Los cebadores deberán contener sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión selecto. Una variedad de vectores de expresión puede emplearse. Un ejemplo de un vector conveniente es pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolívar y colaboradores, Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina . El vector se digiere con enzima de restricción y desfosforila . Las secuencias amplificadas PCR luego se ligan en el vector. El vector de preferencia incluirá secuencias que codifican un gen de resistencia antibiótico, un promotor TRP, un líder poly-his (incluyendo los primeros 6 codones ST2 , secuencia poly-his y sitio de escición enterocinasa) , la región de codificación TAT, terminador de transcripción lamda y un gen argU. La mezcla de ligación luego se utiliza para transformar una sepa de E.coli selecta utilizando los métodos descritos por Sambrook y colaboradores, arriba. Transformantes se identifican por su habilidad para desarrollar en placas LB y colonias resistentes a antibióticos luego se eligen. ADN plásmido puede aislarse y confirmarse por análisis de restricción y secuenciado de ADN. Clones selectos pueden desarrollarse durante la noche en medio de cultivo líquido tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo durante la noche subsecuentemente puede utilizarse para inocular un cultivo de mayor escala. Las células luego se desarrollan a una densidad óptica deseada, durante lo cual se activa el promotor de expresión. Después de cultivar las células por varias horas más, las células pueden cosecharse por centrifugación. El nodulo celular obtenido por la centrifugación puede solidizarse utilizando diversos agentes conocidos en la técnica y la proteína TAT solubilizada luego puede ser purificada utilizando una columna de quelación de metal bajo condiciones que permiten cerrado o apretado enlace de la proteína. TAT puede expresarse en E.coli, en una forma etiquetada poly-his utilizando el siguiente procedimiento. El TAT que codifica AND se amplifica inicialmente utilizando cebadores PCR selectos. Los cebadores contendrán sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión selecto y otras secuencias útiles que proporcionan inicio de traducción eficiente y confiable, rápida purificación en una columna de quelación de metal y remoción proteolítica con enterocinasa . Las secuencias etiquetadas con poly-his aplicadas por PCR luego se ligan en un vector de expresión que se utiliza para transformar un hospedero E.coli con base en la sepa 52 (W3110 fuhA(tonA)) Ion galE rpoHts (htpRts) clpP(lacIq). Transformantes primero se desarrollan en LB hasta que se alcanza un O.D.600 de 35. Luego los cultivos se diluyen 50 a 100 veces en medio CRAP (preparada al mezclar 3.57 g (NH4)2S04, 0.71 g citrato de sodio -2H20, 1.07 g KC1, 5.36 g de extracto de levadura Difco, 5.36 g de Sheffield hycase SF en 500 mL de agua, así como POS 110 mM, pH 7.3, 0.55% (p/v) de glucosa y MgS04 7mM) y desarrollan por aproximadamente 20 a 30 horas a 30 grados C con agitación. Se retiran las muestras para verificar expresión por análisis SDS PAGE y el volumen de cultivo a granelse centrifuga para nodulizar la célula. Nodulos celulares se congelan hasta purificación y replegado. Pasta de E. coli de fermentaciones de 0.5 a 1 L (nodulos de 6 10 g) se resuspende en 10 volúmenes (p/v) en guanidina 7 M, Tris 20 mM, amortiguador pH 8. Sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio se agregan para producir concentraciones finales de 0.1 M y 0.2 M, respectivamente y la solución se agita durante la noche a 4 grados C. Esta etapa resulta en una proteína desnatural zada con todos los residuos cisteína bloqueados por sulfitolización . La solución se centrifuga a 40, 000 rpm en una ultracentrífuga Beckman por 30 minutos. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de amortiguador de columna con querato de metal (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7.4) y filtra a través de filtros de 0.22 mieras a clarificar. El extracto clarificado se carga en una columna de quelato de metal Ni NTA Qiagen de mi equilibrada en el amortiguador de columna del querato de metal. La columna se lava con amortiguador adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol) , pH 7.4. La proteína se eluye con amortiguador que contiene imidazol 250 mM. Fracciones que contienen la proteína deseada se recolectan y almacenan a 4 grados C. Concentración de proteínas se estima por su absorbancia a 280 mM utilizando el coeficiente de extinción calculado con base en su secuencia de amino ácidos. Las proteínas son replegadas al diluir la muestra lentamente en amortiguador de replegado resientemente preparado que consiste de: Tris 20 mM, pH 8.6, NaCl 0.3 M, urea 2.5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Volúmenes de replegado se eligen de manera tal que la concentración de proteína final está entre 50 a 100 microgramos/ml . La solución de replegado se agita suavemente a 4 grados C por 12 a 36 horas. La reacción de replegado se neutraliza por la adición de TFA a una concentración final de 0.4% (pH de aproximadamente 3) . Antes de adicional purificación de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0.22 mieras y se agrega acetonitrilo a concentración final de 2-10%. La proteína replegada se cromatografía en una columna de fase inversa Poros Rl/H utilizando un amortiguador móvil de TGA 0.1% con elusión, con un gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%. Alicotas de fracciones con absorvancia a 280 se analizan en geles de SDS poliacrilamida y fracciones que contienen proteína replegada homogénea se recolectan. En general, las especies adecuadamente replegadas de la mayoría de las proteínas se eluyen a las concentraciones más bajas de acetonitrilo ya que esas especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos contra interacción con la resina de fase invertida. Especies agregadas usualmente se eluyen a superiores concentraciones de acetonitrilo. Además de resolver formas mal plegadas de proteínas de las formas deseadas, la etapa de fase invertida también elimina endotoxina de las muestras. Fracciones que contienen el polipéptido TAT plegado se reconectan y el acetonitrilo se retira utilizando una ligera corriente de nitrógeno dirigida a la solución. Se formulan proteínas en Hepes 20 mM, pH 6.8 con cloruro de sodio 0.14 M y 4% de manitol por diálisis o por filtración en gel utilizando resinas G25 Superfineby (Pharmacia) equilibradas en el amortiguador de formulación y filtradas estériles. Ciertos de los polipéptidos TAT descritos aquí se han expresado exitosamente y purificado utilizando estas técnicas. EJEMPLO 8: Expresión de TAT en células de mamífero Este ejemplo ilustra preparación de una forma potencialmente glicosilada de TAT por expresión recombinante en células de mamífero. El vector, pRK5 (ver EP 307,247, publicada en marzo 15, 1989) , se emplea como el vector de expresión. Opcionalmente, el ADN TAT se liga en pRK5 con enzimas de restricción selectas para permitir inserción del ADN TAT utilizando métodos de ligación tal como se describe por Sambrook y colaboradores, arriba. El vector resultante se denomina pRK5 -TAT . En una modalidad, las células hospederas selectas pueden ser células 293. Células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se desarrollan a confluencia en placas de cultivo de tejido en medio tal como DMEM suplementado con suero bovino fetal y opcionalmente componentes nutrientes y/o antibióticos. Aproximadamente 10 /¿g de ADN pRK5 - AT se mezcla con aproximadamente 1 g de ADN que codifica el gen VA ARN [Thimmappaya y colaboradores, Cell, 31:543 (1982)] y disuelven en 500 µ? de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0.1 mM, CaCl2 de 0.227 M. A esta mezcla se agrega por gotas, 500 µ? de HEPES 50 mM (pH 7.35), NaCl 280 mM, NaP04 1.5 mM, y se deja que se forme un precipitado por 10 minutos a 25 grados C. El precipitado se suspende y agrega a las células 293 y deja que sedimente por aproximadamente 4 horas a 37 grados C. El medio de cultivo se separa por aspiración y 2 mL de glicerol en PVS al 20% se agregan por 30 segundos. Las células 293 luego se lavan con medio libre de suero, se agrega medio fresco y las células se incuban por aproximadamente 5 días . Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones , el medio de cultivo se retira y reemplaza con medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que cotniene 200 µa/ml de 35S-cisteina y 200 µ??/??? de 35S-metionina . Después de incubación por 12 horas, el medio acondicionado se recolecta, concentra en un filtro de centrifugado y carga en un gel SDS al 15%. El gen procesado puede secarse y exponerse a película por un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia del polipéptido TAT. Los cultivos que contienen las células tranfectadas pueden someterse a mayor incubación (en medio libre de suero) y se prueba el medio en bioensayos selectos. En una técnica alterna, TAT puede introducirse en células 293 en forma transitoria utiliznado el método sulfato de dextrano descrito por Somparyrac y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Se desarrollan células 293 a densidad máxima en un matraz de centrifugado y se agregan 700 g de ADN pRK5-TAT. Las células primero se concentran del matraz de centrifugado por centrifugación y lavan con PVS el precipitado de ADN-dextrano se incuba en el nodulo celular por 4 horas. Las células se tratan con glicerol al 20% por 90 segundos, lavan con medio de cultivo de tejido y reintroducen en el matraz de centrifugado que contiene medio de cultivo de tejido, 5 g/ml de insulina bovina y 0.1 g/ml de transferina bovina. Después de aproximadamente 4 días, el medio acondicionado se centrifuga y filtra para retirar células y desechos. La muestra que contiene TAT expresado luego puede concentrarse y purificarse por cualquier método selecto, tal como diálisis y/o cromatografía de columna. En otra modalidad, TAT puede expresarse en células CHO. pRK5-TAT puede transíectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos tales como CaP04 y DEAE-dextrano . Como se describió anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio reemplazarse con medio de cultivo (solo) o medio que contiene una radioetiqueta tal como 35s-metionina . Después de determinar la presencia del polipéptido TAT, el medio de cultivo puede ser reemplazado con medio libre de suero. De preferencia, los cultivos se incuban por aproximadamente 6 días y luego se cosecha el medio acondicionado. El medio que contiene TAT expresado luego puede concentrarse y purificarse por cualquier método selecto . TAT etiquetado con epítope también puede expresarse en células CHO hospederas. TAT puede ser subclonado del vector pRK5. El inserto de subclon puede someterse a PCR para fusionar en cuadro con una etiqueta de epítope selecta de manera tal como una etiqueta poly-his en un vector de expresión baculoviros . El inserto TAT etiquetado poly-his luego puede ser subclonado en un vector impulsado SV40, que contiene un marcador de selección tal como DHFR para selección de clones estables. Finalmente, las células CHO pueden trasfectarse (como se describió anteriormente) con el vector impulsado SV40. El etiquetado puede realizarse como se describió anteriormente para verificar expresión. El medio de cultivo que contiene el TAT etiquetado poly-his expresado luego puede concentrarse y purificarse por cualquier método selecto tal como cromatografía de afinidad Ni2+-quelato . TAT también puede expresarse en células CHO y/o COS por un procedimiento de expresión transitoria o en células CHO por otro procedimiento de expresión estable. Expresión estable en células CHO se realizan utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan como una construcción IgG (inmunoadhesina) en donde las secuencias de codificación para las formas solubles (por ejemplo dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una secuencia de región constante IgG que contiene visagras, dominios CH2 y CH2 y/o es una forma etiquetada poly-his. Después de amplificación PCR, los ADNs minúscula respectivos se subclonan en un vector de expresión CHO utilizando técnicas estándar como se describe en Ausubel y colaboradores, Current Protocols of Molecular Biology (Protocoloes actuales de biología molecular), Unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Vectores de expresión CHO se construyen para tener sitios de restricción compatibles 51 3 ' del ADN de interés para permitir el transporte conveniente de cADNs . La expresión utilizada por vector en células CHO es como se describe por Lucas y colaboradores, Nucí. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996), y utiliza el mej orador/promotor temprano SV40 para dirigir la expresión del cADN de interés y dihidrofolato reductasa (DHFR) . La expresión de DHFR permite selección por mantenimiento estable del plásmido después de transfeccion. Doce microgramos del ADN plásmido deseado se introducen en aproximadamnete 10 millones de células de CHO utilizando reactivos de tranfección comercialmente disponibles Superfect® (Quiagen) , Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim) . Las células se desarrollan como se describe por Lucas y colaboradores, arriba. Aproximadamente 3 x 107 se congelan en una ampolleta para adicional crecimiento y producción como se describe a continuación. Las ampolletas que contienen el ADN plásmido se descongelan al colocarlas en baño de agua y mezclan por torbellino. Los contenidos se pasan con pipeta en un tubo de centrifuga que contiene 10 mLs de medios y centrifugan a 1000 rpm por cinco minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en 10 mL de medio selectivo (0.2 µt? de PS20 filtrado con 5% de 0.2 µp? suero bovino fetal diafiltrado) . Las células luego se toman aliquotas en un centrifugador de 100 mL que contiene 90 mL de medios selectivos. Después de 1 a 2 días, las células se transfieren a un centrifugado de 150 mL de medio de crecimiento selectivo e incubaron a 37 grados C. Después de otros 2 a 3 días, centrifugadoras de 250 mL, 500 mL y 2000 mL se siembran con 3 x 105 células/mL. El medio celular se intercambia con medio fresco por centrif gación y resuspensión en medio de producción. Aunque puede emplearse cualquier medio CHO conveniente, un medio de producción descrito en la patente de los E.U.A. No. 5,122,469, otorgada en junio 16, 1992 puede emplearse. Un centrifugador de producción de 3L se siembra a 1.2 x 106 células/mL. En el día 0, el pH de número de células se determina. El día 1, el centrifugador se muestrea y se inicia el burbujeo con aire filtrado. El día 2, se muestrea el centrifugador, la temperatura se pasa a 33 grados C y 30 mL de 500 g/L de glucosa 0.6 mL de antiespuma al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsión) se toma. A través de la producción, el pH se ajusta según sea necesario para mantenerlo alrededor de 7.2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad cayera por debajo de 70%, se cosecha el cultivo celular por centrifugación y pasa a través de un filtro de 0.22µt?. El filtrado ya se almacena a 4 grados C o carga inmediatamente en columnas para purificación. Para las construcciones etiquetadas poly-his, las proteína se purifican utilizando una columna (Qiagen) . Antes de purificación, se agrega imidazol al medio acondicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombea en una columna de Ni-NTA de 6 mL equilibrada en Hepes, pH 7.4, amortiguador que contiene NaCl 0.3 M e imidazol 5 mM a un gasto de flujo de 4-5 ml/min. a 4 grados C. Después de cargar, la columna se lava con amortiguador de compensación adicional y la proteína se eluye con amortiguador de equilibrio que contiene imidazol 0.25 M. La proteína altamente purificada se desalifica consecuentemente en un amortiguador de almacenamiento que contiene Hepes 10 mM, NaCl 0.14 M y manitol 4%, pH 6.8, con una columna G25 Superfine (Pharmacia) en 25 mi y almacena a -80 grados C. Construcciones de inmunoadhesina (que contienen Fe) se purifican del medio acondicionado como sigue. El medio acondicionado se bombea sobre una columna de 5 mi de proteína A (Pharmacia) que se ha equilibrado en amortiguador fosfato de Na 20 mM, pH 6.8. Después de cargar, la columna se lava extensamente con amortiguador de equilibrio antes de elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3.5. La proteína eluida se neutraliza inmediatamente al recolectar fracciones de 1 mi en tubos que contienen 275 µ?? de amortiguador Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada subsecuentemente es desalificada en amortiguador de almacenamiento como se describió anteriormente para las proteínas etiquetadas con poli-His. Se estima la homogeneidad por geles SDS poliacrilamida y por secuenciado de amino ácido N-terminal por degradación Edman. Ciertos de los polipéptidos TAT descritos aquí han sido expresados exitosamente y purificados utilizando estas técnicas. EJEMPLO 9 : Expresión de TAT en levadura El siguiente método describe expresión recombinante de TAT en levadura. Primero, se construyen vectores de expresión de levadura para producción intracelular o secresión de TAT del promotor ADH2/GAPDH . TAT que codifica ADN y promotor se insertan en sitios de enzima restricción convenientes en el plásmido selecto para dirigir expresión intracelular de TAT. Para secresión, TAT que codifica ADN puede clonarse en plásmido selecto junto con ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido de señal TAT nativo y otro péptido de señal de mamífero, o por ejemplo, un factor alfa de levadura o secuencia líder/señal secretoria invertasa y secuencias enlazadoras (si se necesita) para expresión de TAT. Células de levadura, tales como la cepa de levadura AB110, luego pueden transformarse con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivados en medio de fermentación. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse por precipitación con ácido trifluoroacético al 10% y separación por SDS-PAGE, seguido por tinción de los geles con azul Coomassie. TAT recombinante puede aislarse subsecuentemente y purificarse al retirar las células de levadura del medio de fermentación por centrifugación y luego concentración del medio utilizando cartuchos de filtro selecto. El concentrado que contiene TAT además puede purificarse utilizando resinas de cromatografía en columnas selectas. Ciertos de los polipéptidos TAT descritos aquí se han expresado y purificado exitosamente utilizando estas técnicas . EJEMPLO 10: Expresión de TAT en células de insecto infectadas con baculovirus. El siguiente método describe una expresión recombinante de TAT en células de insecto infectadas con baculovirus . La codificación de secuencia para TAT se fusiona corriente arriba de una etiqueta de epitope que contenida dentro de un vector de expresión baculovirus. Estas etiquetas eptiope incluyen etiquetas poli-HIS y etiquetas de inmunoglobulina (como regiones Fe de IgG) . Una variedad de plásmidos puede emplearse, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tales como pVL1393 (Novagen) . Brevemente, la secuencia que codifica TAT o la porción deseada de la secuencia de codificación de TAT tal como la secuencia que codifica un dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular, se amplifica por PCR conservadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar ciclos de enzimas de restricción blanqueantes (selectos) . El producto luego se digiere con aquellas enzimas de restricción selectas y subclona en el vector de expresión. Baculovirus recombinante se genera por cotransfección del plásmido anterior y virus ADN (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipopeptina (comercialmente disponible de GIBCO-BRL) . Después de 4 a 5 días de incubación a 28 °C, los virus liberados se cosechan y emplean para mayores amplificaciones. Se realizan infección viral y expresión de proteína como se describe por O'Reilley y colaboradores, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994) . TAT etiquetado con poli-his expresado puede luego purificarse, por ejemplo por cromatografía de actividad Ni2+-quelato como sigue. Se preparan extractos de células Sf9 infectadas con virus recombinante como se describe por Rupert y colaboradores, Nature, 362:175-179 (1993) . Brevemente, se lavan células Sf9, resuspende el amortiguador de sonificación (25 mL de Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10% glicerol; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl) , y sonican dos veces por 20 segundos en hielo. Los sonicados se liberan por centrifugación y el sobrenadante se diluye 50 veces en amortiguador de carga (fosfato 50 mM, NaCl 100 mM, glicerol al 10%, pH 7.8) y filtran a través de un filtro de 0.45 µ?t?. Una columna de NÍ2+ -NTA (comercialmente disponible de Qiagen) se prepara con un volumen de lecho de 5 mL, lavan con 25 mL de agua y equilibran con 25 mL de amortiguador de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0.5 mL por minuto. La columna se lava a línea base a A 280 con amortiguador de carga en cuyo punto se inicia la recolección de fracciones. A continuación, la columna se lava con un amortiguador de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6.0), que eluye proteína no específicamente ligada. Después de alcanzar de nuevo línea base A280, la columna se revela con un gradiente 0 a 500 mM de inmidazol en el amortiguador de grabado secundario. Fracciones de 1 mL se recolectan y analizan por SDS-PAGE y tinzión con plata o transferencia Western con fosfatasa alkalina a conjugado NÍ2+-NTA-(Qiagen) . Fracciones que contienen el TAT etiquetado HislO unido se recolectan y dializan contra amortiguador de carga. En forma alterna, purificación del TAT etiqueta con IgG (o etiquetado Fe) pueden realizarse utilizando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo cromatografía en columna de proteína A o proteína G. Ciertos de los polipéptidos TAT descritos aquí se han expresado y purificado exitosamente utilizando estas técnicas . EJEMPLO 11: Preparación de anticuerpos que ligan TAT Este ejemplo ilustra preparación de anticuerpos monoclonales que pueden ligar específicamente TAT. Técnicas para producir los anticuerpos monoclonales se conocen en la especialidad y se describen por ejemplo Goding, arriba. Inmunógenos que pueden emplearse incluyen TAT purificada, proteínas de fusión que contienen TAT y células que expresan TAT recombinante en la superficie celular. Selección del inmunogeno puede realizarse por la persona con destreza sin indebida experimentación . Ratones tales como Balb/c, se inmunizan con el inmunogeno TAT emulsificado en adjuvante de Freund's e injecta subcutáneamente o intraperitonalmente en una cantidad de 1 a 100 microgramos. En forma alterna, el inmunógeno se emulsifica en adjuvante MPL-TD (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) e injecta en las plantas de las patas traseras del animal. En los ratones inmunizados luego se refuerzan 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsificado en el activante selecto. Posteriormente, por varias semanas, los ratones también pueden ser reforzados con iyecciones de inmunonización adicionales. Gotas de suero pueden obtenerse periódicamente de los ratones por sangrado retro orbital para prueba en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti- TAT. Después de que se ha detectado un título de anticuerpo conveniente, los animales "positivos" para anticuerpos pueden inyectarse con una inyección intravenosa final de TAT. 3 a 4 días después, los ratones se sacrifican y las células de bazo se recolectan. Las células de bazo luego se fusionan (utilizando polietilen glicol al 35%) a una línea de células de mieloma murina selecta tal como P3X63AgU.l, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células hibridoma que luego pueden revestirse en placas de cultivo de tejido de 96 pozos que contienen medio HAT (hipoxantina , aminopterina, y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo . Las células de hibridoma serán monitoreadas en una ELISA para reactividad contra TAT. Determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra TAT están dentro de la destreza de la especialidad. Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c sinigeneicos para producir ascitos que contienen los anticuerpo monoclonales anti-TAT. En forma alterna, las células de hibridoma pueden desarrollarse en matrazes de cultivo tejido o botellas giratorias. Purificación de los anticuerpos monoclonales producidas en los ascitos pueden lograrse utilizando precipitación de sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión de gel . En forma alterna, cromatografía de afinidad basada en enlace de anticuerpo a proteína A o proteína G puede emplearse. **Anticuerpos dirigidos contra ciertos de los polipéptidos TAT aquí descritos se han producido exitosamente utilizando esta técnica (s). Más específicamente, anticuerpos policlonales funcionales capaces de reconocer y ligar a proteína TAT (como se mide por análisis de clasificación standard ELISA, FACS y/o análisis de immunohistoquímica) se han generado exitosamente contra las siguientes proteínas TAT como aquí se describe: TAT243 (DNA82306), TAT135 (DNA68885) and TAT246 (DNA42551) . Además de la preparación exitosa de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los polipéptidos TAT como aquí se describe, muchos de esos anticuerpos monoclonales se han conjugado exitosamente a una toxina celular para utilizar en dirigir la toxina celular a una célula (o tejido) que expresa un polipéptido TAT de interés (tanto in vitro como in vivo) . Por ejemplo, anticuerpos monoclonales derivados de toxina (e. g.,DMl) se han generado exitosamente a los siguientes polipéptidos TAT como se describe aquí: TAT135 (DNA68885) . EJEMPLO 12: Purificación de los Polipéptidos TAT utilizando anticuerpos específicos. Polipéptidos TAT nativos o recombinantes pueden purificarse por una variedad de técnicas estándar en la especialidad de purificación de proteínas. Por ejemplo, polipéptido por-TAT, polipéptido TAT maduro o polipéptido pre-TAT se purifican por cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido TAT de interés. En general, una columna de inmunoafinidad se construye al acoplar covalentemente el anticuepro polipéptido anti-TAT a una resina cromatográfica activada .
Inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de suero inmune ya sea por precipitación con sulfato de amonio o por purificación en proteína A inmobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.) . Igualmente, se preparan anticuerpos monoclonales de fluido ascitos de ratón por precipitación con sulfato de amonio o cromatografía en proteína A inmovilizada. Inmunoglobulina parcialmente purificada se conecta covalentemente a una resina cromatográfica tal como SEPHAROSEMR activado con CNDR (Pharmacia LKB Biotechnology) . El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esta columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación de polipéptido TAT al preparar una fracción de células que contienen polipéptido TAT en una forma soluble. Esta preparación se derivan solubilizar toda la célula o una fracción subcelular que se obtiene mediante centrifugación diferencial por adición de detergente o por otros métodos bien conocidos en la especialidad. En forma alterna, polipéptido TAT soluble que contiene una secuencia de señal puede secretarse en cantidad útil en el medio en donde se desarrollan las células. Una preparación que contiene polipéptido TAT soluble se pasa sobre la columna de inmunoafinidad y la columna se lava bajo condiciones que permiten la absorbancia preferencial del polipeptido TAT (por ejemplo amortiguadores de alta concentración iónica en la presencia de detergente) . Luego, la columna se eluye bajo condiciones que rompen el enlace de anticuerpo/polipéptido TAT (por ejemplo un amortiguador de bajo pH tal como aproximadamente pH 2-3, o una alta concentración de un caotropo tal como urea o ion tiocianato) y el polipéptido TAT se recolecta. EJEMPLO 13 : El ensayo de exterminio de células de tumor in vitro Células de mamífero que expresan el polipéptido TAT de interés pueden obtenerse utilizando técnicas de clonación y vector de expresión estándar. En forma alterna, muchas líneas de células de tumor que expresan polipéptidos TAT de interés están disponibles públicamente, por e emplo a través de ATCC y pueden identificarse rutinariamente utilizando análisis ELISA o FACS estándar. Anticuerpos monoclonales de polipéptido anti-TAT (y sus derivados conjugados de toxina) luego pueden emplearse en ensayos para determinar la capacidad de anticuerpo para exterminar células que expresan polipéptido TAT in vitro. Por ejemplo, células que expresan el polipéptido TAT de interés se obtienen como se describió anteriormente y revisten en platos de 96 pozos. En un análisis, el conjugado de anticuerpo/toxina (o anticuerpo desnudo) se incluye a través de la incubación celular por un periodo de cuatro días. En un segundo análisis independiente, las células se incuban por una hora cuando el conjugado anticuerpo/toxina (o anticuerpo desnudo) y luego lavan e incuban en la ausencia de conjugado anticuerpo/toxina por un periodo de cuatro días. Luego se mide viabilidad celular utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay de Promega (Cat# G7571) . Células no tratadas sirven como control negativo. EJMPLO 14 : Ensayo de exterminio de células de tumor in vivo Para probar la eficacia de anticuerpos monoclonales de polipéptido anti-TAT conjugados y no conjugados, se inyecta anticuerpo anti-TAT intraperitonealmente en ratones desnudos 24 horas antes de recibir células promotoras de tumor subcutáneamente en el flanco. Inyecciones de anticuerpo continúan dos veces por semana por el resto del estudio. Volumen del tumor luego se mide dos veces por semana. La especificación escrita anterior se considera suficiente para permitir a una persona con destreza en la especialidad el practicar la invención. La presente invención no habrá de limitarse en alcance por la construcción depositada, ya que la modalidad depositada se pretende como una sola ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualesquiera construcciones que sean funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de esta invención. El depósito de el presente material no constituye una admisión de que la descripción escrita aquí contenida sea inadecuada para permitir la práctica de cualesquiera aspectos de la invención, incluyendo su mejor modo, ni habrá de considerarse como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. Sin duda, diversas modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí serán aparentes a aquellos con destreza en la especialidad de la descripción anterior y caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado que liga a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de amino ácido a: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS : 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41,58-73, 79-83,85, 88,89, 92,93 O 95 (SEQ ID NOS: 23-41,58-73, 79-83,85, 88,89, 92,93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41,58-73, 79-83,85, 88, 89, 92,93 o 95 (SEQID NOS: 23-41,58-73, 79-83,85, 88,89, 92,93 o 95), con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41,58-73, 79-83,85, 88, 89, 92,93 O 95 (SEQID NOS: 23-41,58-73, 79-83,85, 88,89, 92,93 o 95), que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22,42-57, 74-78, 84,86, 87,90, 91 O 94 (SEQ ID NOS: 1-22,42-57, 74-78,84, 86,87, 90,91 o 94); (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90,91 o 94 (SEQ ID NOS : 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94) .
  2. 2. Un anticuerpo aislado que liga a un polipéptido que tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su secuencia de péptido de señal asociado; (c) una secuencia de amino ácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23- 41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS: 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95) con su secuencia de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de amino ácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95 (SEQ ID NOS : 23-41, 58-73, 79-83, 85, 88, 89, 92, 93 o 95), que carece de su secuencia de péptido de señal asociado; (e) una secuencia de amino ácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22,42-57, 74-78,84, 86,87, 90,91 o 94 (SEQID NOS : 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94); (f) una secuencia de amino ácidos codificada por la región de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrado en cualquiera de las Figuras 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90 91 o 94 (SEQ ID NOS: 1-22, 42-57, 74-78, 84, 86, 87, 90, 91 o 94) .
  3. 3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal .
  4. 4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo .
  5. 5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico o humanizado.
  6. 6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque está conjugado a un agente inhibidor de crecimiento.
  7. 7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque está conjugado a un agente citotóxico.
  8. 8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el agente citotóxico se elije de un grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas .
  9. 9. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina.
  10. 10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la toxina se elije del grupo que consiste de maitansinoide y calicheamicina .
  11. 11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la toxina es un maitansinoide .
  12. 12. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se produce en bacterias .
  13. 13. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se produce en células CHO.
  14. 14. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque induce la muerte de una célula a la cual se liga.
  15. 15. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se etiqueta en forma detectable .
  16. 16. Un ácido nucléico aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de la reivindicación 1.
  17. 17. Vector de expresión qüé comprende el ácido nucleico de la reivindicación 16 enlazado operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula hospedera transformada con el vector.
  18. 18. Una célula hospedera que comprende el vector de expresión de la reivindicación 17.
  19. 19. La célula hospedera de la reivindicación 18 que es una célula CHO, una célula de E. coli o una célula de levadura.
  20. 20. Proceso para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula hospedera de la reivindicación 18 bajo condiciones adecuadas para expresión del anticuerpo y recuperar el anticuerpo del cultivo celular.
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