MXPA04003852A

MXPA04003852A - Composiciones de vacuna estreptococica multivalente, y metodos para sus uso.

Info

Publication number: MXPA04003852A
Application number: MXPA04003852A
Authority: MX
Inventors: James B Dale
Original assignee: Univ Tennessee Res Foundation
Priority date: 2001-10-26
Filing date: 2002-10-28
Publication date: 2005-02-17
Also published as: EP1450752A2; CA2463008A1; US6939959B2; CA2464527A1; WO2003065973A8; US20050287642A1; JP2005523000A; AU2002365223A1; WO2003060143A2; WO2003060143A3; WO2003065973A3; EP1450752A4; AU2002365184A8; US20070148731A9; US20030143245A1; US20030143685A1; WO2003065973A2; US7528245B2; AU2002365184A1; US7270827B2

Abstract

Se proveen composiciones y metodos para fabricar y usar formulaciones terapeuticas de polopeptidos hibridos M de varios serotipos diferentes de estreptococos grupo A, y anticuerpos para los mismos; se proveen tambien acidos nucleicos que codifican para dichos polipeptidos hibridos; las formulaciones de polipeptidos hibridos pueden usarse, por ejemplo, en metodos para tratar o prevenir una infeccion microbiana, e inducir una respuesta inmune protectora que tiene anticuerpos opsonicos ampliamente protectores en ausencia de anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con tejidos.

Description

TR), OAPI patent (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, — w/f/z sequence listing parí of description published sepa- GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG). rately in electronic form and available upon requesí from the International Bureau Published: For two-leller codes and other abbreviations, refer lo the "Guid- — -without iníernalional search reporl and ¡o be rep blis ed ance Notes on Codes and Abbreviations" appearing al Ihe begin- upon receipl of that reporl niríg of each regular issue of the PCT Gazetie.

COMPOSICIONES DE VACUNA ESTREPTOCOCICA ULTIVALENTE, Y METODOS PARA SU USO REFERENCIA RECIPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de E.U.A. No. 06/348,434, presentada en octubre 26, 2001. Esta solicitud provisional se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.

ENUNCIADO DE INTERES PARA EL GOBIERNO Esta invención fue hecha con apoyo del gobierno bajo la concesión No. AI-10085, concedida por los Institutos Nacionales dé Salud (National Institutes of Health), y apoyo de los fondos del Department of Veteran Affairs, Merit Review. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere en general a la prevención de enfermedades infecciosas, y más específicamente, a composiciones que comprenden polipéptidos híbridos multivalentes que tienen proteína M y péptidos Spa inmunógenos capaces de inducir inmunidad protectora.

DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA La faringitis estreptocócica grupo A, es una de las infecciones bacterianas más comunes en niños en edad escolar. Además de la faringitis estreptocócica, puede haber secuelas no supurativas asociadas, tales como fiebre reumática aguda (ARF). Aunque la incidencia de ARF ha declinado en países desarrollados, la enfermedad continúa siendo agresiva en países en desarrollo (Community prevention and control of cardiovascular diseases. Report of a WHO expert committee. World Health Organizaron. 1986: 732). Otra forma de infección estreptocócica es invasiva, y aflige a miles de niños y adultos cada año, con frecuencia causando muerte o morbilidad importante (Stevens, J. Infecí. Dis. 2:S366, 1999). Esfuerzos por desarrollar una vacuna que prevenga las infecciones estreptocócicas grupo A, han estado en curso por más de ocho décadas (Dochez et al., J. Exp. Med. 30: 179, 1919; Lancefield, J. Exp. Med. 47:91 , 1928). Por consiguiente, existe la necesidad de identificar y desarrollar composiciones terapéuticamente efectivas contra infecciones estreptocócicas, en particular composiciones que puedan funcionar como una vacuna e inducir inmunidad protectora. Además, existe la necesidad de formulaciones de vacuna que puedan hacerse variar para brindar protección contra la infección por diferentes serotipos estreptocócicos, o para el tratamiento de la misma. La presente invención satisface dichas necesidades, y provee además otras ventajas relacionadas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee el descubrimiento de formulaciones terapéuticas de polipéptidos híbridos multivalentes, en particular un coctel de polipéptidos híbridos útiles para inducir una respuesta inmune protectora que tiene anticuerpos opsónicos ampliamente protectores en ausencia de anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con tejidos. Los polipéptidos híbridos de la invención comprenden por lo menos seis diferentes péptidos inmunógenos enlazados, en donde cada péptido comprende una porción amino-terminal de una proteína M estreptocócica de por lo menos 30 aminoácidos, y en donde el polipéptido tiene un péptido amino-terminal que es reiterado como un péptido carboxi-termínal, y el polipéptido es capaz de inducir una respuesta inmune contra más de un serotipo de estreptococos del grupo A. En un aspecto, la invención provee un polipéptido híbrido que comprende por lo menos seis diferentes péptidos inmunógenos enlazados, en donde cada péptido comprende una porción amino-terminal de una proteína M estreptocócica de por lo menos 30 aminoácidos, y en donde el polipéptido tiene un péptido amino-terminal que es reiterado como un péptido carboxi-terminal, y el polipéptido es capaz de inducir una respuesta inmune contra más de un antígeno de estreptococos del grupo A, que comprende por lo menos M5, M6, M14, M19, M24 y M29. En otras modalidades, el polipéptido induce una respuesta inmune contra más de un antígeno de estreptococos del grupo A, que comprende por lo menos 2, M11 , M22, M33, M43, M59 y M94, o por lo menos M75, M76, M77, M89, M92, ?10 y M114, o por lo menos Spa, M1.0, M1.2, M3, M12, M18 y M28, o contra 27 o más antígenos de estreptococos del grupo A. En más modalidades, el péptido inmunógeno amino-terminal del polipéptido híbrido es M24, M1 , 2 o M89. En otras modalidades, los polipéptidos son recombinantes, y los péptidos inmunógenos están enlazados en tándem, los polipéptidos teniendo una estructura de M24-M5-M6-M 19-M29-M 14-M24, M2-M43-M94-M22-M 1 -M59-M33-M2, M89- 101-M77-M114-M75-M76-M92-M89 o M1.0-M12-Spa-M28-M3-M1.2-M18-M1.0. En otras modalidades, los polipéptidos híbridos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6 u 8. En otras modalidades, los péptidos inmunógenos son enlazados por cuando menos dos aminoácidos codificados por una secuencia de ácido nucleico que es un sitio de reconocimiento de enzima, de restricción, en donde el sitio de reconocimiento incluye por lo menos uno de BamH\, C/al, EcoRI, ndlll, Kpn\, Nco\, Nhe\, Pml\, Pst\, Sal\ y Xho\. En otras modalidades, cualquiera de los polipéptidos híbridos mencionados anteriormente capaz de inducir por lo menos un anticuerpo opsónico que no es un anticuerpo que reacciona en forma cruzada con tejidos en un sujeto, en donde el sujeto es un humano o un animal. En más modalidades, cualquiera de los polipéptidos híbridos mencionados anteriormente que comprende además una marca carboxi-terminal, en donde la marca carboxi-terminal se selecciona del grupo que consiste de fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, hexahistidina, FLAG®, XPRESS® y GST. En otras modalidades, cualquiera de los polipéptidos híbridos mencionados anteriormente o proteínas de fusión que comprenden además por lo menos un aminoácido carboxi-terminal adicional, en donde el aminoácido carboxi-terminal adicional es un D-aminoácido o cisteína. En otro aspecto, la invención provee cualquiera de los polipéptidos híbridos mencionados anteriormente o proteínas de fusión, en donde los polipéptidos son sintéticos. En ciertas modalidades, los polipéptidos híbridos sintéticos tienen uno o más aminoácidos alterados para un D-aminoácido correspondiente, o son enlazados a un alcano tal como acrilamida o un análogo o derivado de la misma. En otra modalidad, los polipéptidos híbridos sintéticos tienen péptidos inmunógenos enlazados para formar un péptido ramificado con núcleo de lisina. En otro aspecto, la invención incluye una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para un polipéptido híbrido de SEQ ID NOS: 2, 4, 6 u 8. En una modalidad relacionada, se provee una construcción de expresión de ácido nucleico que comprende una secuencia de control de la expresión enlazada operablemente a un polinucleótido que codifica para un polipéptido híbrido de SEQ ID NOS: 2, 4, 6 u 8. En otras modalidades, la construcción de expresión comprende un vector de expresión de ácido nucleico seleccionado del grupo que comprende un plásmido, fagémido, vector de lanzadera, cósmido o virus. En una modalidad, el vector es el plásmido pT5 (SEQ ID NO: 17). En otra modalidad, se provee una célula hospedera que contiene cualquiera de las construcciones de ácido nucleico mencionadas anteriormente. En otras modalidades, la célula hospedera se selecciona de una bacteria, una célula de levadura, una célula de nematodo, una célula de insecto o una célula de mamífero. En una modalidad, la célula hospedera es ia bacteria Escherichia coli. En otro aspecto, la presente invención provee una pluralidad de anticuerpos que comprenden dos o más anticuerpos diferentes, en donde cada anticuerpo es específico para un péptido inmunógeno diferente de un polipéptido híbrido, el polipéptido comprendiendo por lo menos seis péptidos inmunógenos diferentes enlazados en tándem, cada péptido comprendiendo por lo menos 30 aminoácidos, y el péptido amino-terminal es reiterado como un péptido carboxi-terminal, en donde el polipéptido es capaz de inducir una respuesta inmune contra más de un antígeno de estreptococos del grupo A, que comprende por lo menos M5, M6, M14, M19, M24 y M29. En otras modalidades, la pluralidad de anticuerpos es específica para más de un antígeno de estreptococos del grupo A que comprende por lo menos M2, M1 1 , M22, M33, 43, M59 y M94, o por lo menos M75, 76, M77, M89, M92, M101 y M114, o por lo menos Spa, M1.0, M1.2, M3, M12, M18 y M28, o específica para 27 o más antígenos de estreptococos del grupo A. En otras modalidades, cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, en donde los polipéptidos híbridos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, u 8. En otras modalidades, cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente son opsónicos, y no reaccionan en forma cruzada con tejidos en un sujeto. En una modalidad, los anticuerpos son policlonales. En otro, aspecto, se provee un método para producir un polipéptido híbrido, el cual comprende cultivar una célula hospedera que contiene cualquiera de los vectores de expresión de ácido nucleico mencionados anteriormente, comprendiendo por lo menos una secuencia de control de la expresión enlazada operablemente a una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido híbrido de SEQ ID NOS: 2, 4, 6 u 8, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para la expresión del polipéptido. En un aspecto relacionado, la invención provee cualquiera de los polipéptidos híbridos mencionados anteriormente producidos mediante el método mencionado anteriormente. En un aspecto, se provee una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y cualquiera de los polipéptidos híbridos mencionados anteriormente. En otros aspectos, la invención es una composición de coctel que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una mezcla de por lo menos dos o tres de cualquiera de los polipéptidos híbridos mencionados anteriormente. En una modalidad, las composiciones del coctel incluyen por lo menos uno de los polipéptidos híbridos que tienen un péptido inmunógeno Spa. En otras modalidades, se provee cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, en donde los polipéptidos híbridos se mezclan en cantidades equimolares. En otras modalidades, cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente comprende además un adyuvante tal como alumbre o adyuvante de Freund. En otro aspecto, la invención provee un método para prevenir una infección microbiana, el cual comprende administrar a un sujeto cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, a una dosis suficiente para inducir anticuerpos específicos para uno o más polipéptidos híbridos, en donde los anticuerpos son opsónicos y no reaccionan en forma cruzada con tejidos. En ciertas modalidades, la infección microbiana que se está previniendo es una infección estreptocócica, y en una modalidad relacionada, es una infección estreptocócica grupo A. En algunas modalidades, cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente se administra a un sujeto mediante una vía seleccionada de la vía. enteral, parenteral, transdérmica, transmucosa o por inhalación. En otras modalidades, las composiciones se administran a un sujeto humano o animal, y las composiciones comprenden además un adyuvante tal como alumbre o adyuvante de Freund. En otro aspecto relacionado, se proveen anticuerpos aislados producidos mediante los métodos mencionados anteriormente, para prevenir una infección microbiana. En ciertas modalidades, los anticuerpos producidos mediante estos métodos comprenderán por lo menos un anticuerpo específico para un serotipo M no representado en un polipéptido híbrido, tal como M4. En otra modalidad, se provee un método para tratar o prevenir una infección microbiana, el cual comprende administrar a un sujeto una composición qué comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y cualquiera de la pluralidad de anticuerpos mencionados anteriormente. En una modalidad, el sujeto es un animal o humano.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra un diagrama esquemático de los cuatro polipéptidos híbridos usados como agente de vacunación. Se sintetizaron los oligonucleótidos iniciadores usados, para amplificar un fragmento del gen emm 5' (es decir, el péptido inmunógeno) mediante PCR para cada serotipo, para incluir los sitios de enzima de restricción únicos indicados, los cuales codifican para aminoácidos que enlazan los péptidos inmunógenos en tándem (indicados por las líneas entre los cuadros). Cada cuadro representa, un péptido inmunógeno de proteína M amino-terminal, en donde el número dentro de cada cuadro designa el serotipo, y el número abajo de cada cuadro indica el número de aminoácidos que comprenden cada péptido inmunógeno.

El serotipo M101 fue designado antiguamente como stNS5, el serotipo 1 4 fue designado antiguamente como SÍ2967, y el serotipo M94 fue designado antiguamente como M13W y M13. "6xHis" se refiere a la presencia de una hexahistidina, la cual es opcional. Las figuras 2A a 2C muestran la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del polipéptido híbrido A.3 hexavaiente. Se indican los sitios de enzima de restricción y el punto de inicio de cada péptido inmunógeno de serotipo M: Se optimizaron once codones de arginina para expresión en E. coli, mutando los codones de AGG/AGA a codones de CGT/CGC (las bases mutadas están subrayadas). Las figuras 3A a 3D muestran la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del polipéptido híbrido B.3a hexavaiente. Se indican los sitios de enzima de restricción y el punto de inicio de cada péptido inmunógeno de serotipo M. Se optimizaron nueve codones de arginina para expresión en E. coli, mutando los codones de AGG/AGA a codones de CGT/CGC (las bases mutadas están subrayadas). Las figuras 4A a 4C muestran la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del polipéptido híbrido C.2 hexavaiente. Se indican los sitios de enzima de restricción y el punto de inicio de cada péptido inmunógeno de serotipo M. Se optimizaron siete codones de arginina para expresión en E. coli, mutando los codones de AGG/AGA a codones de CGT (las bases mutadas están subrayadas). Las figuras 5A a 5C muestran la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del polipéptido híbrido D.3 hexavalente. Se indican los sitios de enzima de restricción y el punto de inicio de cada péptido ¡nmunógeno de serotipo M. Se optimizaron cinco codones de arginina para expresión en E. coli, mutando los codones de AGG/AGA a codones de CGT/CGC (las bases mutadas están subrayadas). La figura 6 muestra un resumen de los 28 serotipos. M de estreptococos del grupo A invasivos más comunes aislados en los Estados Unidos, entre agosto 12, 2000 y julio 16, 2001. Los datos eran parte de estudios actuales realizados por el Active Bacterial Core Surveillance Program of the Centers for Disease Control and Prevention. Estos 28 serotipos representaron 92.1 % de los 3,424 aislados invasivos referidos durante este período. La figura 7 muestra que la proteína M específica del tipo y los anticuerpos Spa, fueron inducidos por un agente de vacunación que comprendía un coctel de cuatro polipéptidos" híbridos diferentes (es decir, una vacuna bidecaheptavalente), cuando se examinó mediante ELISA. Cada barra representa suero de un conejo. La figura 8 muestra los resultados de pruebas de opsonización in vitro usando sueros inmunes, los cuales fueron inducidos en conejos con una composición que comprendía un coctel de cuatro polipéptidos híbridos diferentes (es decir, una vacuna bidecaheptavalente). Se consideró como respuesta positiva a por lo menos un incremento de 3 veces sobre la opsonización con suero preinmune (es decir, opsonización de 30% o más).

Los sueros preinmunes dieron como resultado menos de 10% de opsonización de cada serotipo estreptocócico. Cada barra representa suero de un conejo. La figura 9 muestra los resultados de pruebas de actividad bactericida usando sueros inmunes, los cuales fueron inducidos en conejos con un agente de vacunación que comprendía un coctel de cuatro polipéptidos híbridos diferentes (es decir, una vacuna bidecaheptavalente). Se consideró como respuesta positiva por lo menos una destrucción de 50%. Cada barra representa suero de un conejo. La figura 10 muestra que una respuesta inmune con actividad bactericida es inducida contra el serotipo 4 estreptocócico del grupo A, el cual es un serotipo no representado en el agente de vacunación bidecaheptavalente. Cada barra representa suero de un conejo. Los sueros inmunes eran de un conejo inmunizado a 0, 4 y 8 semanas (barra a rayas), y de un conejo inmunizado a 0, 4 y 16 semanas (barra clara). Los aislados estreptocócicos del serotipo 4 eran de 5 localidades geográficas diferentes, incluyendo Florida (FL); Illinois (IL); California; Connecticut (CT); y Dakota del Sur (SD). ¦ La figura 1 1 muestra los títulos de anticuerpo de la media geométrica antes (día 0) y después (día 134) de inmunización de sujetos humanos, determinados mediante ELISA. La gráfica es una escala de log10- El serotipo M101 fue designado antiguamente como stNS5, el serotipo SÍ2967 es ahora designado como M114, y el serotipo M13 es ahora designado como M94. La figura 12 muestra el incremento en número de veces del logaritmo natural en títulos de anticuerpo determinados mediante ELISA (barras), en comparación con el porcentaje de incremento en la destrucción de estreptococos del grupo A por células polimorfonucleares en 26 serotipos. El serotipo M101 fue designado antiguamente como stNS5, el serotipo M114 fue designado antiguamente como SÍ2967, y el serotipo M13 es ahora designado como 94- La figura 13 muestra el incremento en número de veces en los títulos de anticuerpo de la media geométrica en sujetos humanos inmunizados con un polipéptido hexavalente (Hexa 1.2), en comparación con los títulos de anticuerpo de la media geométrica en sujetos humanos inmunizados con un coctel bidecaheptavalente de cuatro polipéptidos multivalentes híbridos (Hexa A.3, Septa B.3a, Septa C.2 y Septa D3; véase la figura 1 ). Los títulos de anticuerpo de la media geométrica se calcularon con base en ELISAs contra los seis serotipos presentes en ambas vacunas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Como se indicó anteriormente, la presente invención está dirigida en general a polipéptidos híbridos de antígenos estreptocócicos, y composiciones de los mismos, los cuales son capaces de inducir anticuerpos protectores contra estreptococos. Además, las composiciones pueden incluir un polipéptido híbrido individual o una combinación de varios polipéptidos híbridos diferentes, los cuales pueden ser útiles para inducir una respuesta inmune contra estreptococos del grupo A. En un aspecto, pueden formularse uno o más polipéptidos híbridos como una composición para tratar o prevenir simultáneamente una infección por varios serotipos estreptocócicos del grupo A diferentes, así como para tratar o prevenir infección por serotipos no representados en los polipéptidos híbridos. La presente invención provee también ácidos nucleicos aislados que codifican para dichos polipéptidos híbridos, así como métodos para expresar y purificar dichos polipéptidos híbridos. Un polipéptido híbrido, como se describe en la presente, comprende varios péptidos inmunógenos enlazados diferentes, en donde cada péptidp comprende, por ejemplo, una porción amino-terminal de una proteína M estreptocócica, y pueden inducir anticuerpos opsónicos específicos para un serotipo estreptocócico del grupo A particular, sin inducir anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con tejidos del hospedero. La presente invención provee también anticuerpos específicos para cada serotipo de péptido inmunógeno, incluido en un polipéptido híbrido o en una combinación de polipéptidos híbridos, así como anticuerpos específicos para serotipos no incluidos en los polipéptidos híbridos (es decir, anticuerpos que confieren protección cruzada entre los serotipos). Por lo tanto, la invención se refiere en general al descubrimiento sorprendente de que son factibles vacunas basadas en polipéptidos híbridos multivalentes altamente complejas, para inducir simultáneamente anticuerpos ampliamente protectores contra varios serotipos estreptocócicos diferentes. Además, una composición que comprende un coctel de más de un polipéptido híbrido multivalente usado como una vacuna, induce inesperadamente una respuesta de anticuerpo mucho más vigorosa en humanos que una composición que comprende un polipéptido híbrido multivalente individual, en donde el incremento en la respuesta de anticuerpo da como resultado también un incremento en la función del anticuerpo (es decir, capacidad incrementada para opsonizar y/o destruir microorganismos), Como se usa en la presente, un "coctel" de polipéptidos híbridos se refiere a una composición que comprende por lo menos dos polipéptidos híbridos diferentes de esta invención. Por consiguiente, la invención se refiere también en general al descubrimiento sorprendente de que un coctel de polipéptidos híbridos multivalentes puede . funcionar sinergísticamente para inducir una respuesta de anticuerpo mayor de lo que es una respuesta inmune protectora. Por consiguiente, las composiciones y los métodos de la presente invención pueden usarse fácilmente para tratar o prevenir infecciones estreptocócicas. Descritos en más detalle a continuación, son polipéptidos híbridos y composiciones mixtas de los mismos (incluyendo mezclas o cocteles) adecuados para su uso dentro de la presente invención, así como ejemplos de métodos para obtener dichos polipéptidos híbridos y composiciones, y usos terapéuticos de los mismos.

Polipéptidos híbridos La presente invención está dirigida en general a polipéptidos híbridos ¡nmunógenos multivalentes de proteínas M y proteínas tipo M, incluyendo fusiones con otras proteínas. Los péptidos M y tipo M ¡nmunógenos pueden comprender cualquier porción de una proteína M que sea inmunógena, la cual puede conferir o no, carácter específico por el serotipo. Una pluralidad de diferentes polipéptidos híbridos ¡nmunógenos multivalentes pueden mezclarse o combinarse en una composición de coctel para su uso para inducir una respuesta inmune protectora. La presente invención provee además métodos para producir polipéptidos M híbridos ¡nmunógenos multivalentes sintéticos o recombinantes, incluyendo proteínas de fusión. Por ejemplo, pueden cultivarse células hospederas que contengan construcciones de expresión de ácido nucleico que codifican para el polipéptido híbrido, para producir polipéptidos híbridos recombinantes. Se contemplan también métodos para tratar o prevenir una infección microbiana, o para inducir una respuesta inmune usando un polipéptido híbrido o una combinación de polipéptidos híbridos (incluyendo proteínas de fusión). A manera de antecedentes y sin desear que sea limitado por la teoría, las especies estreptocócicas son bacterias Gram-positivas que se agrupan con base en diferencias inmunológicas en los polisacáridos de su pared celular y se designan, por ejemplo, como grupo A, B, C, F y G. Específicamente, los estreptococos del grupo A (GrAS) son microorganismos clínicamente importantes que colonizan la garganta y la piel. Los GrAS son responsables de una variedad de infecciones supurativas (por ejemplo, inflamación séptica de la garganta, fascitis necrosante) y secuelas no supurativas (por ejemplo, fiebre reumática aguda, artritis reactiva) (véase, en general, Cunningham, Clin. Microbiol. Rev. 13:470, 2000). Los GrAS tienen dos factores antifagocíticos principales expuestos en su superficie, cápsula y proteína M, que permiten que estos organismos colonicen y sobrevivan en un hospedero. La proteína M, la cual es codificada por el gen emm, se extiende desde la superficie celular como un dímero plegado en espiral alfa-helicoidal que aparece como una fibrilla sobre la superficie de los GrAS. Las proteínas M son un grupo diverso, que se ha separado serológicamente en serotipos de proteína M. Actualmente, se han identificado más. de 120 serotipos de proteína M, y dentro de algunos serotipos se han identificado varios subtipos. Por ejemplo, sin limitación, la proteína M tipo 1 tiene los subtipos relacionados 1.1-1.15, y el tipo 12 tiene los subtipos 12.1 -12.9. Además, como es sabido en la técnica, los serotipos no clasificados pueden tener una designación inicial (tal como SÍ2967), y reciben finalmente una clasificación "final" (tal como SÍ2967, siendo ahora clasificado como tipo M 114), o los serotipos clasificados anteriormente pueden reclasificarse con un número diferente (tal como M13W, el cual es ahora reclasificado como M94). En ciertas modalidades, pueden usarse porciones amino-terminales de cualquiera de uno o más de los serotipos 1-120+ de proteína M conocidos, o de serotipos desconocidos, para generar péptidos inmunógenos para su inclusión en polipéptidos híbridos inmunógenos multivalentes de la presente invención. Se entenderá que cualquier escala numérica incluida en la presente incluye cualquier entero dentro de la escala y, cuando sea aplicable (por ejemplo, en concentraciones), fracciones del mismo, tales como un décimo y un centésimo de un entero (a menos que se indique de otra manera). Además, la proteína M forma parte de una superfamilia de proteínas, la cual incluye sin limitación, proteínas de unión a inmunoglobulina (por ejemplo, FrcA), proteínas tipo M (por ejemplo, Mrp y Spa) y proteínas M. Por consiguiente, como se usa en la presente, el término "proteína M" se refiere a la superfamilia de proteínas, que incluye cualquier proteína M conocida o desconocida (con o sin un serotipo designado), así como proteínas tipo M, tales como Spa (véase, por ejemplo, Dale et al., J. Clin. Invest. 103: 1261 , 1999, y McLellan et a|., Infecí. Immun. 69:2943, 2001 ), Mrp (véase, por ejemplo, Boyle et al., J. Infecí. Dis. 177:991 , 1998), proteínas de unión a inmunoglobulina (véase, por ejemplo, Podbielski et al., Mol. Microbiol. 12:725, 1994; Whatmore y Kehoe, Mol. Microbiol. 1 :363, 1994), y similares. Como se describe en la presente y como se entiende en la técnica, el serotipo de una proteína M puede reclasificarse y producir un cambio a un tipo diferente, un nuevo tipo, o incluso un subtipo. Asimismo, como se usa en la presente, los términos "serotipo de proteína M" o "tipo M", se refieren a todas las proteínas M dentro de ese serotipo, incluyendo, todos los subtipos, proteínas relacionadas, y similares. Además, la referencia a un tipo M particular puede aplicarse recíprocamente de la manera siguiente, a manera de ilustración y no de limitación, proteína M de serotipo 1 , tipo 1 , M1 , y similares que, como se describió anteriormente, incluye también todos los subtipos. Como se describió anteriormente, los estreptococos del grupo A han desarrollado un sistema para evitar algunas de las defensas antimicrobianas de un hospedero humano. Las cepas de estreptococos que expresan la cápsula y proteína M pueden evadir la fagocitosis, por ejemplo, por leucocitos polimorfonucleares o neutrófilos, y multiplicarse en un hospedero que no haya sido expuesto a estreptococos (es decir, teniendo sangre no inmune). Sin embargo, un sujeto puede desarrollar resistencia a una infección estreptocócica, si el hospedero puede producir anticuerpos protectores dirigidos contra estreptococos. La protección ante los GrAS se correlaciona en general con la presencia de anticuerpos opsonizantes contra la proteína M específica del tipo (véase, por ejemplo, Lancefield, J. Immunol. 89:307, 1962), y se piensa que el desarrollo de anticuerpos secretorios o de mucosas desempeña una función importante para prevenir la colonización inicial por estreptococos. Sin embargo, la patogénesis de algunas de las secuelas no supurativas puede deberse a reacción cruzada de los tejidos del hospedero con anticuerpos estreptocócicos. Como se usa en la presente, "reactividad cruzada con los tejidos" significa que un antígeno del hospedero comparte por o menos un epítope con un antigeno extraño, tal como un antígeno estreptococia). Por ejemplo, los antígenos diferentes pueden compartir una secuencia de aminoácidos idéntica, pueden ser homólogos pero no idénticos, o pueden ser moléculas diferentes con un epítope compartido (por ejemplo, proteína y carbohidrato o proteína y molécula de ácido nucleico). De esta manera, uná vacuna efectiva contra infecciones estreptocócicas induciría de preferencia una respuesta inmune que incluye anticuerpos que no reaccionan en forma cruzada con los tejidos (es decir, no causan enfermedad autoinmune) y son protectores (es decir, opsónicos) contra muchos de los serotipos clínicamente importantes. La presente invención pertenece a polipéptidos híbridos o variantes de los mismos que tienen una pluralidad de péptidos inmunogenos de proteínas M o tipo M, o moléculas de ácido nucleico que codifican para dichos polipéptidos o variantes de los mismos. Como se usa en la presente, el término "péptido ¡nmunógeno" se refiere a cualquier péptido o polipéptido estreptocócico que tiene por lo menos un epítope capaz de inducir una respuesta inmune, los cuales son las unidades componentes de los polipéptidos híbridos. De preferencia, el epítope está dentro de una porción amino-terminal de una proteína M estreptocócica o proteína Spa, y más preferiblemente es un epítope opsónico que no induce anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con los tejidos. La presente invención provee también un procedimiento racional para el diseño de vacunas para la selección de los serotipos de proteína estreptocócica que se incluirán en la vacuna del polipéptido híbrido multivalente. Algunos criterios que pueden usarse incluyen, sin limitación, identificar los serotipos de proteína M que son causas frecuentes de faringitis no complicada, identificar los serotipos que se recuperan comúnmente de sitios normalmente estériles (es decir, cepas invasivas) (por ejemplo, pueden obtenerse datos útiles del Active Bacterial Core Surveillance of the Emerging Infections Program Network, sustentada por los Centers for Disease Control and Prevention; véase también Beall et al., J. Clin. Microbiol. 35:1231 , 1997; Schuchat et al., Emerg. Infecí. Dis. 7:92, 2001 ), e identificar serotipos que se consideran actualmente o históricamente como "reumatógenos" (Bisno A L. The concept of rheumatogenic and nonrheumatogenic group A streptococci. En Reed S E y J. B. Zabriskie, ed. Streptococcal Diseases and the Immune Response. New York: Academic Press, 1980: 789-803). También útil es el fragmento del péptido amino-terminal de Spa, un nuevo antígeno protector que es expresado por varios serotipos de estreptococos del grupo A (Dale et al., J. Clin. Invest. 103: 1261 , 1999), o puede usarse cualquier otro antígeno estreptocócico capaz de inducir anticuerpos protectores. Como se describe en la presente y como es sabido en la técnica, secuencias de aminoácidos de proteína M seleccionadas para su inclusión en un polipéptido híbrido, están disponibles en el sitio web del centro de tipificación de emm CDC (www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/emmtvpes.html). Además, para eliminar la posibilidad de inducir anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con los tejidos, pueden compararse las regiones amino-terminales de una proteína M madura y Spa, con proteínas humanas conocidas para detectar cualquier homología (por ejemplo, usando el programa BlastP). De preferencia, se excluyen porciones de proteína M amino-terminales que tengan cinco o más apareamientos contiguos de aminoácidos con una proteína humana. Además, las regiones seleccionadas de los péptidos M y Spa se analizan de preferencia mediante el método de Hopp y Woods (Mol. Immunol. 20:483, 1983), para asegurar la integridad de los picos hidrofílicos. Por ejemplo, el método de Hopp y Woods puede ser útil para predecir que un péptido inmunógeno particular de una porción amino-terminal de proteína M puede fusionarse mejor con un cierto subgrupo de otros péptidos inmunógenos, y no con otros. En modalidades preferidas, puede designarse que los polipéptidos híbridos, o variantes y combinaciones de los mismos, sean vacunas específicas para estreptococos asociados con, por ejemplo, faringitis, fiebre escarlata, fiebre reumática aguda, fascitis necrosante, celulitis, meningitis, neumonía, síndrome de choque tóxico, bacteremia, septicemia, artritis séptica, pioderma, infecciones de la piel, ¡mpétigo, erisipelas, infección de tejidos blandos, nefritis, reacciones pirógenas, y similares. Además, las vacunas pueden diseñarse para tratar o prevenir infecciones estreptocócicas en poblaciones particulares (por ejemplo, pacientes, niños y ancianos inmunocomprometidos), poblaciones geográficas particulares (por ejemplo, aborígenes australianos) y localidades geográficas particulares (por ejemplo, regiones templadas de países escandinavos). De preferencia, las porciones amino-terminales de las proteínas M diferentes que comprenden un péptido inmunógeno, pueden inducir anticuerpos opsónicos que no reaccionan en forma cruzada con los tejidos del hospedero. En otro aspecto preferido, el serotipo de proteína M se selecciona con base en su frecuencia en los estreptococos más comunes que se sabe están asociados comúnmente con una enfermedad particular (por ejemplo, serotipos asociados con faringitis o infecciones de la piel), o secuelas de la misma. En un aspecto más preferido, la presente invención puede usarse para diseñar y generar una variedad de polipéptidos híbridos inmunógenos multivalentes diferentes que pueden ser dirigidos a, o pueden mezclarse en, grupos particulares para dirigir cambios en estreptococos frecuentes. Por ejemplo, como es sabido en la técnica, el serotipo de estreptococos más frecuente asociado con una enfermedad hoy en día, tal como ARF, puede no ser tan frecuente o importante 5, 10 ó 15 años. En otro ejemplo, un serotipo estreptocócico particular puede ser frecuente en Europa, y llegar a ser importante repentinamente en Sudamérica. Por consiguiente, los péptidos inmunógenos que comprenden un polipéptido híbrido multivalente pueden ser modificados, o diferentes polipéptidos híbridos multivalentes pueden mezclarse y aparearse, para crear un coctel deseado, diseñado para su uso en una población o localidad particular para atacar los estreptococos clínicamente más relevantes, según sea necesario. En ciertas modalidades preferidas, un péptido inmunógeno comprende una porción amino-terminal de una proteína M o proteína Spa que tiene de 10 a 70 aminoácidos, o cualquier entero en esa escala; más preferiblemente, teniendo 20 a 65 aminoácidos, o cualquier entero en esa escala; y muy preferiblemente, de 30 a 60 aminoácidos, o cualquier entero en esa escala. En modalidades particularmente preferidas, un polipéptido híbrido comprende por lo menos seis o siete péptidos inmunógenos enlazados diferentes, en donde cada péptido comprende una porción amino-terminal de una proteína M estreptocócica de por lo menos 30 aminoácidos, y en donde el polipéptido tiene un péptido amino-terminal que es reiterado como un péptido carboxi-terminal, y el polipéptido es capaz de inducir una respuesta inmune contra más de un serotipo de estreptococos del grupo A. De preferencia, un polipéptido híbrido es capaz de inducir una respuesta inmune contra por lo menos los serotipos 5, 6, 14, 19, 24 y 29; o por lo menos contra los serotipos 2, 11 , 22, 33, 43, 59 y 94; o por lo menos contra los serotipos 75, 76, 77, 89, 92, 101 y 1 14; o por lo menos contra los serotipos 1.0, 1.2, 3, 12, 18 y 28. En otra modalidad "preferida, un polipéptido híbrido es capaz de inducir una respuesta inmune contra un serotipo M no representado en el polipéptido híbrido, tal como el serotipo 4. En ciertas modalidades, los polipéptidos híbridos tienen por lo menos 50% a 100% de identidad de aminoácidos, o cualquier entero en esa escala, con la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NOS: 2, 4, 6 y 8; de preferencia 60%-99% de identidad, o cualquier entero en esa escala, más preferiblemente 70%-97% de identidad, o cualquier entero en esa escala, y muy preferiblemente 80%-95% de identidad, o cualquier entero en esa escala. Como se usa en la presente, el "porcentaje de identidad" o "por ciento de identidad" es el valor en porcentaje que se obtiene comparando el total de la presente secuencia de polipéptidos, péptidos, o variante de los mismos, con una secuencia de prueba, usando un algoritmo ¡mplementado por cómputo, típicamente con parámetros de omisión. La comparación de las secuencias puede llevarse a cabo usando cualquier programa patrón, tal como BLAST, tBLAST, pBLAST o MegAlign. Otros programas incluyen los provistos en el departamento de cómputo y bioinformática de Lasergene, el cual es producido por DNASTAR® (Madison, Wisconsin). Referencias para algoritmos tales como ALIGN o BLAST pueden encontrarse, por ejemplo, en Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991 ; o Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 0915-10919, 1992. El programa BLAST está disponible en el sitio web del NCBl (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Otros métodos para comparar secuencias múltiples de nucleótidos o aminoácidos determinando alineación óptima, son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Peruski y Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins", en Methods in Gene Biotechnology, págs. 123-151 (CRC Press, Inc. 1997); y Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2a. edición, Academic Press, Inc., 1998). Como se usa en la presente, la "similitud" entre dos péptidos o polipéptidos, se determina en general comparando la secuencia de aminoácidos de un péptido o polipéptido, con la secuencia de aminoácidos y sustitutos de aminoácidos conservados de un segundo péptido o polipéptido. Pueden usarse fragmentos o porciones de los polipéptidos híbridos de la presente invención para producir el polipéptido híbrido de longitud completa correspondiente mediante síntesis de péptidos; por lo tanto, los fragmentos pueden usarse como intermediarios para producir los polipéptidos híbridos de longitud completa. En forma similar, pueden usarse fragmentos o porciones de los ácidos nucleicos de la presente invención, para sintetizar ácidos nucleicos de longitud completa de la presente invención. Los polipéptidos híbridos y ácidos nucleicos correspondientes de la presente invención se proveen de preferencia en una forma aislada, y en ciertas modalidades preferidas, se purifican hasta homogeneidad. Como se usa en la presente, el término "aislado" significa que el material es removido de su ambiente original o natural. Por ejemplo, un polipéptido o molécula de ácido nucleico de ocurrencia natural presente en una célula o animal vivo no está aislado, sino la misma molécula de ácido nucleico o polipéptido está aislado cuando se separa de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, o algunos de los mismos. Las moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, podrían ser parte de un vector, y/o dichos ácidos nucleicos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y estar aún aislados porque dicho vector o composición no forma parte de su ambiente natural. La presente invención pertenece también a polipéptidos híbridos y vanantes de los mismos producidos sintéticamente o en forma recombinante, y de preferencia en forma recombinante. Los péptidos ¡nmunógenos componentes de los polipéptidos híbridos pueden sintetizarse mediante métodos químicos patrón, incluyendo síntesis mediante algún procedimiento automatizado. En general, los péptidos ¡nmunógenos se sintetizan con base en la estrategia de protección con Fmoc de fase sólida patrón, con HATU como el agente de acoplamiento. El péptido inmunógeno es desdoblado de la resina de fase sólida con ácido trifluoroacético que contenga depuradores adecuados, los cuales desprotegen también los grupos funcionales de cadena lateral. El péptido inmunógeno crudo es purificado adicionalmente usando cromatografía preparativa de fase invertida. Pueden usarse otros métodos de purificación, tales como cromatografía de partición, filtración en gel, electroforesis en gel o cromatografía de intercambio iónico. Otras técnicas de síntesis conocidas en la materia pueden usarse para producir péptidos ¡nmunógenos similares, tales como la estrategia de protección con tBoc, el uso de reactivos de acoplamiento diferentes, y similares. Además, puede usarse cualquier aminoácido de ocurrencia natural, o derivado del mismo, incluyendo D- o L- aminoácidos, y combinaciones de los mismos. En modalidades particularmente preferidas, un polipéptido híbrido sintético de la invención tendrá un péptido inmunógeno M2, M.12, M24 o M89 en el extremo amino. Como se describe en la presente, los polipéptidos híbridos de la invención pueden ser recombinantes, en donde el polipéptido híbrido es expresado a partir de un polinucleótido que codifica para un polipéptido híbrido deseado que es enlazado operablemente a una secuencia de control de la expresión (por ejemplo, promotor), en una construcción de expresión de ácido nucleico. En modalidades particularmente preferidas, un polipéptido híbrido recombinante de la invención tendrá un péptido inmunógeno M2, M12, M24 o M89 en el extremo amino. Algunos polipéptidos híbridos recombinantes preferibles, comprenden péptidos inmunógenos enlazados en tándem que tienen la -estructura de M24-M5- 6-M19-M29-M14-M24, M2-M43-M94- 22-M11-M59-M33-M2, M89-M101-M77-M114-M75-M76- 92-M89 o M1.0-M12-Spa-M28-M3- 1.2-M18- 1.0, y cualquier combinación de los mismos. Más preferiblemente, un polipéptido híbrido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6 u 8, y variantes de los mismos. Como se describió anteriormente y como se describe en la presente, cualquier serotipo M puede incluirse en la presente invención, de preferencia los serotipos 1.0, 1.2, 2, 3, 5, 6, 1 1 , 12, 14, 18, 19, 22, 24, 28, 29, 33, 43, 59, 75, 76, 77, 89, 92, 94, 101 y 114 se incluyen en los polipéptidos híbridos. En ciertas modalidades preferidas como se describe en la presente, polipéptidos híbridos de la presente invención capaces de inducir por lo menos un anticuerpo opsónico que no es un anticuerpo que reacciona en forma cruzada con los tejidos en un sujeto, en donde el sujeto es un animal o un humano. En otra modalidad preferida, los polipéptidos híbridos son enlazados por cuando menos dos aminoácidos codificados por una secuencia de ácido nucleico que es un sitio de reconocimiento de enzima de restricción, en donde los sitios de restricción pueden ser cualquiera de uno o más de BamHI, C/al, EcoRI, Hiná\\\, Kpn\, Nco\, Nhe\, Pml\, Psü, Sa/I, Xho\, y similares. Enlazadores de aminoácidos adicionales pueden añadirse también sintéticamente como se describe en la presente. De preferencia, los aminoácidos adicionales no crean alguna identidad en secuencia dentro de un tramo de cinco aminoácidos de una proteína humana. Además, los polipéptidos híbridos de la presente invención pueden comprender por lo menos un aminoácido carboxi-terminal adicional, en donde el aminoácido adicional es un D- o un L- aminoácido. Puede añadirse cualquiera de los veinte aminoácidos de ocurrencia natural, o derivados de los mismos, tales como cisteína, histidina, leucina y ácido glutámico. Por ejemplo, la adición de cisteína puede ser útil para unir otros constituyentes, tales como un lípido, una proteína portadora, y similares. Como se describe en la presente, la invención provee también proteínas de fusión con el polipéptido híbrido que comprenden polipéptidos híbridos fusionados con una secuencia de polipéptidos funcional o no funcionar adicional que permite, por ejemplo, a manera de ilustración y no de limitación, la detección, el aislamiento y/o la purificación de las proteínas de fusión con el polipéptido híbrido. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica funcional adicional puede ser una secuencia de marca, que incluye proteínas de fusión que, en ciertas modalidades, pueden detectarse, aislarse y/o purificarse mediante métodos de afinidad por proteína-proteína (por ejemplo, receptor-ligando), afinidad por metales o afinidad por cargas. En algunas otras modalidades, las proteínas de fusión con el polipéptido híbrido pueden detectarse mediante desdoblamiento con proteasa específico de una proteína de fusión que tenga una secuencia que comprenda una secuencia de reconocimiento de proteasa, de modo que los polipéptidos híbridos puedan ser separables de la secuencia polipeptídica adicional. Además, los polipéptidos híbridos pueden obtenerse sintéticamente, incluyendo aminoácidos adicionales, una proteína portadora, o una secuencia de marca, la cual puede localizarse en el extremo amino-terminal o carboxi-terminal. En modalidades particularmente preferidas, por ejemplo, polipéptidos híbridos recombinantes se fusionan en el marco de lectura a una marca carboxi-terminal, cuya marca puede ser cualquiera de fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, hexahistidina (6xHis), marca de epítope FLAG® (DYKDDDDK, SEQ ID NO: 18) o GST, y similares. Más preferidas son las proteínas de fusión con polipéptidos híbridos que facilitan la detección por afinidad y el aislamiento de los polipéptidos híbridos, y pueden incluir, por ejemplo, poli-His o los epítopes de péptidos antigénicos definidos descritos en la patente de E.U.A. No. 5,01 1 ,912, y en Hopp et al. (1988 Bio/Technology 6:1204), o la marca de epítope XPRESS™ (DLYDDDDK, SEQ ID NO: 19; Invitrogen, Carlsbad, CA). La secuencia de afinidad puede ser una marca de hexahistidina, provista por un vector. Por ejemplo, un vector pBAD/His (Invitrogen) o un vector pQE-30 (Qiagen, Valencia, CA), puede proveer una marca de polihistidina para la purificación de la fusión de la proteína madura de un hospedero particular, tal como una bacteria. En forma alternativa, la secuencia de afinidad puede añadirse sintéticamente, o puede diseñarse en los iniciadores usados para generar en forma recombinante la secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, usando la reacción en cadena de polimerasa) que codifica para un péptido inmunógeno del polipéptido híbrido multivalente. De preferencia, un polipéptido híbrido multivalente es fusionado a una polihistidina, y es codificado por una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica para dicha proteína de fusión. Los péptidos ¡nmunógenos pueden enlazarse también químicamente para formar los polipéptidos híbridos deseados, incluyendo secuencias de aminoácidos adicionales, mediante una variedad de métodos como se proveen en la presente y se conocen en la técnica (véase, en general, Jackson et al., Vaccine 18: 355, 2000). Pueden enlazarse péptidos recombinantes o sintéticos para formar construcciones lineales (véase, por ejemplo, Leclerc, et al., Eur. J. Immunol. 17: 26, 1987, y Francis, et al., Nature 330:168, 1987) o ramificadas (véase, por ejemplo, Fitzmaurice, et al., Vaccine 14:553, 1996), o pueden enlazarse usando ligación química de epítopes (véase, por ejemplo, Tam y Spetzler, Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1 :123, 1995; Rose, J. Am. Chem. Soc. 1 16:30, 1994; y Dawson, et al., Science 266:776, 1994). Pueden enlazarse también péptidos mediante el sistema de péptidos antigénicos múltiples para formar polipéptidos híbridos ramificados (véase, por ejemplo, Tam, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5409, 1988; y patente de E.U.A. No. 5,229,490). El sistema de péptidos antigénicos múltiples hace uso de moléculas centrales multifuncionales, en donde cada grupo funcional en la molécula central forma por lo menos dos ramas, cuyas unidades principales son también multifuncionales. Por ejemplo, puede usarse lisina como el péptido central, ya que tiene un grupo funcional carboxilo y dos grupos funcionales amina (a. y e). Cada unidad multifuncional en una rama provee una base para crecimiento añadido, produciendo crecimiento exponencial del polímero dendrítico. Los péptidos pueden unirse entonces al núcleo dendrítico usando una molécula de enlace (por ejemplo, glicina). El sistema de péptidos antigénicos múltiples enlaza un gran número de péptidos sintéticos al grupo funcional de una molécula del núcleo dendrítico, proveyendo una alta concentración de péptidos sintéticos en un volumen molecular reducido. De preferencia, se usan dos o tres niveles de lisinas geométricamente ramificadas, en donde estos núcleos de lisina forman una estructura central tetramérica u octamérica, respectivamente. El sistema de péptidos antigénicos múltiples puede incluir también una porción de anclaje lipofílica unida a la molécula central, eliminando de esta manera la necesidad de un adyuvante formulado en una vacuna peptídica que requiere de otra manera una para inmunoestimulación (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,580,563). En una modalidad preferida, un polipéptido híbrido d la invención comprende péptidos inmunógenos enlazados para formar un polipéptido ramificado con núcleo de lisinas. Además, pueden enlazarse péptidos sintéticos similares o diferentes mediante polimerización controlada a través de derivatización del extremo amino de un péptido con el grupo acriloílo (CH2=CH-) usando cloruro de acriloílo (véase, por ejemplo, O'Brien-Simpson, et al., J. Am. Chem. Soc. 1 19:1183, 1997; Jackson, et al., Vaccine 15:1697, 1997). Los péptidos derivatízados se polimerízan entonces individualmente, o en mezcla con péptidos derivatízados en forma similar, mediante inicio de alargamiento de cadena por radicales libres. Como resultado, se ensamblan péptidos en polímeros en los cuales los determinantes peptídicos forman cadenas laterales pendientes de una estructura de base de alcano. Los polipéptidos híbridos y las proteínas de fusión que se describen en la presente, pueden construirse como se describió anteriormente. En una modalidad preferida, un polipéptido híbrido de la invención comprende péptidos inmunógenos enlazados por una estructura de base de alcano. En ciertas modalidades, la estructura de base de alcano es acrilamida, o un análogo o derivado de la misma.

Formulaciones terapéuticas y métodos de uso de las mismas La invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que contienen uno o más polipéptidos multivalentes híbridos, los cuales pueden usarse para inducir una respuesta inmune. La invención se refiere además a métodos para tratar y prevenir infecciones microbianas, administrando a un sujeto un polipéptido híbrido o una mezcla de polipéptidos híbridos a una dosis suficiente, para inducir anticuerpos específicos para uno o más polipéptidos híbridos, como se describe en la presente. Un polipéptido híbrido o un coctel de polipéptidos híbridos forma de preferencia parte de una composición farmacéutica, cuando se usa en los métodos de la presente invención. En ciertos aspectos, la invención provee . una composición que comprende un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, y cualquiera de los polipéptidos híbridos multivalentes de la presente invención, y cualquier combinación de los mismos. Una modalidad preferida es un vehículo farmacéuticamente aceptable y una mezcla de por lo menos dos o tres polipéptidos híbridos de la presente invención. En otra modalidad preferida, un polipéptido híbrido que comprende por lo menos siete péptidos inmunógenos diferentes enlazados en tándem, en donde cada péptido comprende una porción amino-terminal de una proteína M estreptocócica de por lo menos 50 aminoácidos, y en donde el polipéptido tiene un péptido amino-terminal que es reiterado como un péptido carboxi-terminal, y el polipéptido es capaz de inducir una respuesta inmune contra más de un serotipo de estreptococos del grupo A que comprende por lo menos los serotipos 1.0, 1.2, 3, 12, 18 y 28, se combina con por lo menos algún otro polipéptido híbrido de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad más preferida, una composición comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una mezcla de los polipéptidos híbridos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6 y 8, o variantes de los mismos, y en otra modalidad, estos cuatro polipéptidos o variantes de los mismos se mezclan en cantidades equimolares, y por lo menos uno de los polipéptidos híbridos tiene un péptido Spa. En otras modalidades, se proveen SEQ ID NOS: 2, 4, 6 y 8, o variantes de las mismas, con una marca de polihistidina, o comprenden además por lo menos un aminoácido adicional, tal como cisteína. Cada una de estas formulaciones puede comprender además un adyuvante, tal como alumbre o adyuvante de Freund, y un diluyente tal como agua o PBS. Además, las composiciones terapéuticas de la presente invención deben ser de preferencia estables por varios meses, y capaces de ser producidas y mantenidas bajo condiciones estériles. La composición farmacéutica incluirá por lo menos uno de un vehículo, portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, además de uno o más polipéptidos multivalentes híbridos o proteína de fusión de los mismos y, opcionalmente, otros componentes. Por ejemplo, vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para su uso con una composición de un polipéptido híbrido o proteína de fusión , del mismo, o coctel de dos o más polipéptidos híbridos o proteína de fusión de los mismos pueden incluir, por ejemplo, un agente espesante, un agente regulador de pH, un solvente, un humectante, un conservador, un agente quelante, un adyuvante, y similares, y combinaciones de los mismos. Ejemplos de adyuvantes son alumbre (hidróxido de aluminio, REHYDRAGEL®), fosfato de aluminio, adyuvante de proteosomas (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,726,292 y 5,985,284), virosomas, liposomas con y sin lípido A, Detox (Ribi/Corixa), F59, u otros adyuvantes tipo emulsiones de aceite y agua, tales como nanoemulsiones (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,716,637), y emulsiones del tamaño de submicras (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,961 ,970), y adyuvante completo e incompleto de Freund. Vehículos farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y como se describe en la presente y, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro, ed., décimoctava edición, 1990), y en CRC Handbook of Food, Drug, and Cosmetic Excipients, CRC Press LLC (S. C. Smolinski, ed., 1992). E! término "sal farmacéuticamente aceptable", se refiere a sales de los compuestos de la presente invención derivadas de la combinación de dichos compuestos y un ácido orgánico o inorgánico (sales ácidas de adición); o una base orgánica o inorgánica (sales básicas de adición). Los compuestos de la presente invención pueden usarse en cualquiera de las formas de base libre o sal, considerándose que ambas formas están dentro del alcance de la presente invención. Además, la composición farmacéutica puede incluir un diluyente tal como agua o solución salina, regulada en su pH con fosfato (PBS). De preferencia, el diluyente es PBS con una concentración de fosfato final que varía de alrededor de 0.1 mM a aproximadamente 1 M, más preferiblemente de alrededor de 0.5 mM a aproximadamente 500 mM, aún más preferiblemente de alrededor de 1 mM a aproximadamente 50 mM, y muy preferiblemente de alrededor de 2.5 mM a aproximadamente 10 mM; y la concentración final de sales varía de alrededor de 100 mM a aproximadamente 200 mM, y más preferiblemente de alrededor de 125 mM a aproximadamente 175 mM. De preferencia, la concentración final de PBS es fosfato alrededor de 5 mM, y sal (tal como NaCI) aproximadamente 150 mM. En ciertas modalidades, cualquiera de las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente que comprendan un coctel de polipéptidos híbridos multivalentes de la presente invención, es de preferencia estéril. Las composiciones pueden ser estériles preparándolas bajo un ambiente aséptico, y/o pueden ser esterilizadas terminalmente usando métodos disponibles en la técnica. Muchos agentes farmacéuticos se fabrican para ser estériles, y este criterio es definido por la USP XXII<1211>. La esterilización en esta modalidad puede lograrse mediante muchos medios aceptados en la industria, y enlistados en la USP XXI 211>, incluyendo esterilización con gas, radiación ionizante o filtración. La esterilización puede mantenerse mediante lo que se denomina como procesamiento aséptico, definido también en la USP XXII <1211>. Gases aceptables usados para la esterilización con gas, incluyen óxido de etileno. Los tipos de radiación aceptables usados para los métodos de radiación ionizante, incluyen radiación gamma, por ejemplo, de una fuente de cobalto 60 y un haz de electrones. Una dosis típica de radiación gamma es 2.5 MRad. Cuando sea adecuado, la filtración puede lograrse usando un filtro con un tamaño de poro adecuado, por ejemplo, 0.22 µ?t?, y un material adecuado, por ejemplo, Teflón®. El término "USP" se refiere a la Farmacopea de los Estados Unidos (véase, www.usp.org; Rockville, MD). La presente invención pertenece también a métodos para prevenir una infección microbiana, los cuales comprenden administrar a un sujeto una composición de la presente invención a una dosis suficiente para inducir anticuerpos específicos para uno o más polipéptidos híbridos, en donde los anticuerpos son de preferencia opsónicos, y no reaccionan en forma cruzada con los tejidos. En ciertas modalidades, una infección es una infección estreptocócica, tal como una infección estreptocócica grupo A. Un sujeto adecuado para tratamiento con una formulación del polipéptido híbrido puede identificarse mediante indicadores de riesgo bien establecidos para desarrollar una enfermedad, o distintivos bien establecidos de una enfermedad existente. Por ejemplo, indicadores de una infección incluyen fiebre, pus, cultivos positivos a microorganismos, inflamación, y similares. Las infecciones que pueden tratarse con un polipéptido híbrido de la presente invención incluyen, sin limitación, las causadas por microorganismos o debidas a los mismos, si la infección es primaria, secundaria, oportunista, o similares. Ejemplos de microorganismos incluyen bacterias Gram-positivas, tales como estreptococos. Las composiciones farmacéuticas que contienen uno más polipéptidos híbridos pueden estar en cualquier forma que permita que la composición sea administrada a un sujeto, tal como un humano o animal. Por ejemplo, pueden prepararse y administrarse composiciones del polipéptido híbrido multivalente de la presente invención como una solución líquida, o pueden prepararse como una forma sólida (por ejemplo, liofilizada), la cual puede administrarse en forma sólida, o puede resuspenderse en una solución en conjunto con la administración. La composición del polipéptido híbrido se formula de modo que permita que los ingredientes activos contenidos en la misma sean biodisponibles tras la administración de la composición a un sujeto o paciente, o biodisponibles mediante liberación lenta. Las composiciones que se administrarán a un sujeto o paciente toman la forma de una o más unidades de dosificación en donde, por ejemplo, una tableta puede ser una unidad de dosificación individual, y un contenedor de uno o más compuestos de la invención en forma de aerosol puede contener una pluralidad de unidades de dosificación. En ciertas modalidades preferidas, cualquiera de las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente que comprendan un polipéptido híbrido o coctel de polipéptidos híbridos de la invención, está en un contenedor, de preferencia en un contenedor estéril. En una modalidad, la composición terapéutica se administra oralmente, y un polipéptido híbrido o composición de coctel de la presente invención es absorbido por células, tales como células localizadas en el lumen del intestino. Otras vías de administración típicas incluyen, sin limitación, las vías enteral, parenteral, transdérmica/transmucosa, y por inhalación. El término enteral, como se usa en la presente, es una vía de administración en la cual el agente es absorbido a través del tracto gastrointestinal o mucosa oral,- incluyendo la mucosa oral, rectal y sublingual. El término parenteral, como se usa en la presente, describe vías de administración que evitan el tracto gastrointestinal, incluyendo inyección intraarterial, ¡ntradérmica, intramuscular, intranasal, infraocular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, submucosa e intravaginal, o técnicas de infusión. El término vía transdérmica/transmucosa, como se usa en la presente, es una vía de administración en donde el agente se administra a través de la piel o por medio de la misma, incluyendo administración tópica. El término inhalación abarca técnicas de administración en donde el agente se introduce en el árbol pulmonar, incluyendo administración intrapulmonar o transpulmonar. De preferencia, las composiciones de la presente invención se administran intramuscularmente. Dependiendo de la aplicación, la dosis del polipéptido híbrido en las composiciones variará, en general, de alrededor de 10 µg a aproximadamente 10 mg, de preferencia de alrededor de 100 µg a 1 mg, más preferiblemente de alrededor de 150 µ9 a 500 µ9, y muy preferiblemente de alrededor de 200 µg a aproximadamente 400 µg, en combinación con el excipiente, adyuvante, aglutinante y/o diluyente biológicamente aceptable, incluyendo cualquier entero con la escala de dosificación. Como se usa en la presente, el término "aproximadamente" o "que consiste esencialmente de" se refiere a ± 10% de cualquier estructura, valor o escala indicado. Pueden administrarse inmunizaciones de refuerzo en tiempos múltiples, a intervalos deseados que varían de alrededor de 2 semanas a aproximadamente 24 semanas, de preferencia a intervalos de 2, 4 y 8 semanas, y más preferiblemente a intervalos de 2, 4 y 16 semanas, y aún más preferiblemente a intervalos de 0, 4 y 24 semanas, para aumentar al máximo la respuesta inmune. La invención provee además una pluralidad de anticuerpos producidos mediante el método para prevenir una infección microbiana, el cual comprende administrar a un sujeto una composición de la presente invención a una dosis suficiente para inducir anticuerpos específicos para uno o más polipéptidos híbridos, en donde los anticuerpos son opsónicos y no reaccionan en forma cruzada con los tejidos. En una modalidad, los anticuerpos comprenden por lo menos un anticuerpo específico para un serotipo M no representado en un polipéptido híbrido, tal como la proteína M tipo 4. En otra modalidad, un método para tratar o prevenir una infección microbiana comprende administrar a un sujeto una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una pluralidad de anticuerpos de la presente invención.

Anticuerpos y pruebas de los mismos En otro aspecto, los polipéptidos híbridos y variantes de los mismos de la presente invención se usan para inducir anticuerpos específicos para por lo menos un epítope presente en los polipéptidos híbridos que se proveen en la presente. Por consiguiente, la presente invención provee también dichos anticuerpos. En modalidades preferidas, los anticuerpos se unen a epítopes protectores específicos presentes en una proteína M. Dentro del contexto de la presente invención, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, . anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos anti-idiotípicos, fragmentos de los mismos tales como los fragmentos F(ab')2 y Fab, y anticuerpos producidos en forma recombinante o sintética. Dichos anticuerpos incorporan las regiones variables que permiten que un anticuerpo monoclonal se una específicamente, lo cual significa que un anticuerpo es capaz de unirse selectivamente a un péptido producido a partir de una secuencia de emm o spa de esta invención. El término "específico para" se refiere a la capacidad de una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) para unirse selectivamente a un polipéptido o péptido codificado por una molécula de ácido nucleico de emm o spa, o un polipéptido híbrido sintetizado de esta invención. La asociación o "unión" de un anticuerpo a un antígeno específico implica en general interacciones electrostáticas, formación de puentes de hidrógeno, interacciones de Van der Waals, e interacciones hidrofobicas. Cualquiera de estas interacciones, o cualquier combinación de las mismas, puede desempeñar una función en la unión entre un anticuerpo y su antígeno. Dicho anticuerpo se asocia en general con un antígeno, tal como proteína M, con una constante de afinidad (Ka) de por lo menos 04, de preferencia de por lo menos 105, más preferiblemente de por lo menos 106, aún más preferiblemente de por lo menos 107, y muy preferiblemente de por lo menos 108. Las constantes de afinidad pueden ser determinadas por los expertos en la técnica usando técnicas bien conocidas (véase Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51 :660-672, 1949). La afinidad de un anticuerpo monoclonal o anticuerpo puede ser determinada fácilmente por los expertos en la técnica (véase Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51 :660-672, 1949). Además, el término "anticuerpo", como se usa en la presente, incluye anticuerpos de ocurrencia natural, así como anticuerpos de ocurrencia no natural incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos, bifuncionales y humanizados, así como fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Dichos anticuerpos de ocurrencia no natural pueden construirse usando síntesis de péptidos de fase sólida, pueden producirse en forma recombinante, o pueden obtenerse, por ejemplo, seleccionando colecciones combinatorias que consistan de cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)). Estos y otros métodos para sintetizar, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, injertados con CDR, de cadena sencilla y bifuncionales, son bien conocidos en la técnica (Winter y Harris, Immunol. Today 14:243, 1993; Ward et al., Nature 341 :544, 1989, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory, New York, 1992; Borrabeck, Antibody Engineering, 2a. ed., Oxford Univ. Press, 1995; Hilyard et al., Protein Engineering: A practica! approach, IRL Press, 1992). En una modalidad preferida, una pluralidad de anticuerpos comprende dos o más anticuerpos diferentes, en donde cada anticuerpo es específico para un péptido inmunógeno diferente de un polipéptido híbrido, el polipéptido comprende por lo menos seis péptidos inmunógenos diferentes enlazados en tándem, cada péptido comprende por lo menos 30 aminoácidos, y el péptido amino-terminal es reiterado como un péptido carboxi-terminal, en donde el polipéptido es capaz de inducir una respuesta inmune contra más de un serotipo de estreptococos del grupo A. De preferencia, un polipéptido híbrido es capaz de inducir una respuesta inmune contra por lo menos los serotipos 5, 6, 14, 19, 24 y 29; o por lo menos contra los serotipos 2, 11 , 22, 33, 43, 59 y 94; o por lo menos contra los serotipos 75, 76, 77, 89, 92, 101 y 1 14; o por lo menos contra los serotipos 1.0, 1.2, 3, 12, 18 y 28. En otra modalidad preferida, un polipéptido híbrido es capaz de inducir un respuesta inmune contra un serotipo M no representado en el polipéptido híbrido, tal como el serotipo 4. Más preferiblemente, los anticuerpos son inducidos por los polipéptidos híbridos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6 y 8, individualmente o en combinación, y más preferiblemente por lo menos un anticuerpo es opsónico y no reacciona en forma cruzada con los tejidos en un sujeto. Como se usa en la presente, el término "opsónico" significa cualquier epítope que mejore la fagocitosis de una célula o partícula que tiene al epítope. Como lo entienden comúnmente los expertos en la técnica, los "anticuerpos opsónicos" son anticuerpos que facilitan la actividad fagocítica de una partícula que tiene al antígeno, tal como una célula bacteriana. En otra modalidad preferida, los anticuerpos inducidos por los polipéptidos híbridos de la invención son policlonales. Los anticuerpos policlonales pueden ser generados fácilmente por los expertos en la técnica a partir de una variedad de animales de sangre caliente, tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, pavos, conejos, ratones o ratas. En resumen, el polipéptido híbrido deseado o mezclas de polipéptidos híbridos, o variantes de los mismos, se administran para inmunizar a un animal a través de inyección parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intraocular o subcutánea. La inmunogenicidad del polipéptido híbrido de interés puede incrementarse mediante el uso de un adyuvante, tal como alumbre y adyuvante completo o incompleto de Freund. Después de varias inmunizaciones de refuerzo durante un período de semanas, pequeñas muestras de suero se recogen y se ponen a prueba para reactividad al péptido M o péptido Spa deseado. Los sueros inmunes policlonaies particularmente preferidos dan una señal que es por lo menos tres veces mayor que la señal de fondo. Una vez que el título del animal ha alcanzado una meseta en términos de su reactividad al polipéptido híbrido, pueden obtenerse fácilmente mayores cantidades de suero inmunes policlonaies mediante sangrías semanales, o por exsanguinación del animal. Por ejemplo, los poüpéptidos híbridos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6 y 8 (véase la figura 1 ) fueron purificados, mezclados en concentraciones equimolares, y formulados con alumbre para contener 400 µg de proteínas totales y 750 9 de alumbre en cada dosis de 0.5 mi. Cada uno de tres conejos recibió tres inyecciones intramusculares del coctel de poüpéptidos híbridos a 0, 4 y 8 semanas, o 0, 4 y 16 semanas, y se recuperó el suero inmune a las 18 semanas. Los sueros cosechados se analizaron mediante ELISA, como se describe en la presente, usando los componentes del péptido dimérico recombinante purificado de cada uno de los poüpéptidos más grandes de la vacuna. Mediante el uso de la ELISA (con péptidos inmunógenos diméricos recombinantes purificados de la molécula híbrida), se encontró que los sueros inmunes de los conejos inmunizados a 0, 4 y 16 semanas contienen títulos altos de anticuerpos contra la vasta mayoría de los péptidos M y el péptido Spa contenidos en los poüpéptidos híbridos del coctel (figura 3). En ciertas modalidades preferidas, los anticuerpos policlonaies incluyen los que son específicos para estreptococos del grupo A de los serotipos 5, 6, 14, 19, 24 y 29, o de los serotipos 2, 11 , 22, 33, 43, 59 y 94, o de los serotipos 75, 76, 77, 89, 92, 101 y 114, o de los serotipos 1.0, 1.2, 3, 12, 18 y 28. Pueden generarse también fácilmente anticuerpos monoclonales usando técnicas bien conocidas (véase las patentes de E.U.A. Nos. RE 32,01 1 , 4,902,614, 4,543,439 y 4,411 ,993; véase también Monoclonaí Antibodies, Hybrídomas: A New Dimensión in Bioiogical Analyses, Plenum Press, Kennettí, McKearn y Bechtol (eds.), 1980, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). En resumen, en una modalidad, se inyecta a un sujeto animal tal como una rata o ratón con una proteína o péptido deseado. Si se desea, pueden usarse varias técnicas para aumentar la respuesta inmune resultante generada por la proteína, para desarrollar mayor reactividad de los anticuerpos. Por ejemplo, puede acoplarse la proteína o el péptido deseado a otra proteína portadora (tal como ovoalbúmina, hemoclanina de la lapa Fissurella (KLH), o subunidad de la toxina B lábil de E. coli), o mediante el uso de adyuvantes (tales como alumbre o adyuvante completo e incompleto de Freund), y similares. Una vez que se hayan obtenido anticuerpos adecuados, pueden aislarse o purificarse mediante muchas técnicas bien conocidas por los expertos en la materia (véase Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe, citado anteriormente). Técnicas adecuadas incluyen columnas de afinidad por péptidos o proteínas, CLAR o RP-CLAR, purificación sobre columnas de proteína A o proteína G, o cualquier combinación de estas técnicas. Dentro del contexto de la presente invención, el término "aislado", como se usa para definir anticuerpos, significa "sustancialmente libre de otros componentes sanguíneos". Varias pruebas están disponibles como se describe en la presente para examinar la actividad de los anticuerpos inducidos por los polipéptidos híbridos de la presente invención. Un ejemplo de prueba es una prueba de opsonofagocitosis, que detecta la fagocitosis facilitada por la presencia de anticuerpos opsónicos presentes en los antisueros de prueba. En resumen, la prueba mide la cantidad de fagocitosis de células bacterianas seleccionadas por neutrófilos, después de preincubar las células en presencia o ausencia de antisueros enfrentados, por ejemplo, contra inmunógenos del polipéptido híbrido. La preincubación con los sueros inmunes recubre las células con los anticuerpos reactivos a proteína M, algunos de los cuales serán anticuerpos opsónicos inducidos a partir de epítopes opsónicos presentes en los antígenos de proteína M. Las células recubiertas preincubadas se mezclan entonces con la sangre entera de un animal, típicamente un mamífero para el cual se busca protección opsónica (por ejemplo, un humano), para determinar el porcentaje de neutrófilos que se asocian con las células bacterianas, lo cual es una medida de la actividad fagocítica facilitada por los anticuerpos opsónicos. Los sueros inmunes que contienen anticuerpos opsónicos inducen un mayor porcentaje de neutrófilos asociados con las bacterias seleccionadas, que los sueros inmunes que carecen de anticuerpos opsónicos. En una variación de esta prueba, la actividad bactericida de sueros inmunes puede ponerse a prueba incubando los sueros inmunes con menos células bacterianas, mediante incubación en sangre durante un período más largo, y depositando entonces la mezcla sobre un medio de cultivo para evaluar las bacterias viables. La presencia de anticuerpos opsónicos en los sueros inmunes aumenta el número de bacterias destruidas por fagocitosis y, por lo tanto, disminuye el número de unidades formadoras de colonias (CFUs) detectadas sobre la placa de cultivo. Otro ejemplo de prueba analiza la actividad bactericida de los anticuerpos de prueba (véase el ejemplo 5).

Moléculas de ácido nucleico y células hospederas La invención abarca también moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia que codifica para un polipéptido híbrido, en donde cada péptido comprende una porción aminó-terminal de una proteína M estreptocócica (por ejemplo, SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16). La presente invención provee también construcciones de expresión de ácido nucleico, y células hospederas que contienen dichos ácidos nucleicos, los cuales codifican para polipéptidos híbridos y variantes de los mismos, cuyos polipéptidos híbridos son capaces de inducir una respuesta inmune contra más de un serotipo de estreptococos del grupo A. Este aspecto de la invención pertenece a secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican para una secuencia del polipéptido híbrido como se describe en la presente, así como secuencias derivadas fácilmente de moléculas de ácido nucleico aisladas tales como, por ejemplo, secuencias complementarias, secuencias inversas y complementos de secuencias inversas. Los términos "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refieren a cualquiera de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR), y fragmentos generados mediante cualquiera de ligación, escisión, acción de endonucieasa y acción de exonucieasa. Los ácidos nucleicos se pueden formar de monómeros que son nucleótidos de ocurrencia natural (tales como desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos), análogos de nucleótidos de ocurrencia natural (por ejemplo, formas a-enantioméricas de nucleótidos de ocurrencia natural), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener modificaciones en las porciones de azúcar y/o en las porciones de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcar incluyen, por ejemplo, reemplazo de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden ser funcionalizados como éteres o ésteres. Además, la porción entera de azúcar puede ser reemplazada con estructuras estéricamente y electrónicamente similares, tales como aza-azúcares y análogos carbocíclicos de azúcar. Ejemplos de modificaciones en una porción de base, incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden enlazarse mediante enlaces fosfodiéster o análogos de dichos enlaces. Análogos de enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, y similares. El término "ácido nucleico" incluye también los denominados "ácidos nucleicos peptídicos", que comprenden bases de ácido nucleico modificadas o de ocurrencia natural unidas a una estructura de base de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena sencilla o de doble cadena. Además, una "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula de polinucleótido en forma de un fragmento separado, o como un componente de una construcción de ácido nucleico más grande, que ha sido separada de su célula original (incluyendo el cromosoma que reside normalmente en la misma) por lo menos una vez en una forma sustancialmente pura. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica para un polipéptido Spa, péptido, o vanante de los mismos, que ha sido separada de una célula de Streptococcus o del ADN genómico de una célula de Streptococcus, es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico químicamente sintetizada. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender una amplia variedad de nucleótidos, incluyendo ADN, ADNc, ARN, análogos de nucleótidos, o alguna combinación de los mismos. En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia que codifica para un polipéptido híbrido de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16. En ciertos aspectos, la invención se refiere a vectores y construcciones de ácido nucleico que incluyen secuencias de ácido nucleico de la presente invención, y en particular a "construcciones de expresión de ácido nucleico" que incluyen cualquier polinucleótido que codifique para un polipéptido híbrido como se indicó anteriormente; a células hospederas que son diseñadas genéticamente con vectores y/o construcciones de la invención, y a la producción y uso en métodos para tratar o prevenir una infección microbiana o inducir una respuesta inmune. Los polipéptidos híbridos pueden expresarse en células de mamífero, levadura, bacterias u otras células, bajo el control de secuencias de control de la expresión adecuados. Pueden usarse también sistemas de traducción libres de células para producir dichas proteínas, usando moléculas de ARN derivadas de las construcciones de expresión de ácido nucleico de la presente invención. Vectores de expresión y clonación adecuados para su uso con hospederos procarióticos y eucarióticos se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, NY (1989), y pueden incluir plásmidos, cósmidos, vectores de lanzadera, virus virales y vectores que comprendan un origen de replicación cromosómico como se describe en la presente. En una modalidad preferida, una construcción de expresión de ácido nucleico comprende una secuencia de control de la expresión enlazada operablemente a un polinucleótido que codifica para un polipéptido híbrido de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16. En otra modalidad preferida, la construcción de expresión de ácido nucleico tiene un promotor ¡nducible, el cual puede ser el promotor lac, tac, trc; ara, trp, promotor del fago ?, promotor del fago T7 y promotor del fago T5, y más preferiblemente es una secuencia de control de la expresión de operador /ac/promotor del fago T5, como se describe en SEQ ID NO: 17. La expresión "secuencia de control de la expresión" se refiere a cualquier secuencia suficiente para permitir la expresión de una proteína de interés en una célula hospedera, incluyendo una o más secuencias de promotor, secuencias de intensificador, secuencias de operador (por ejemplo, lacO), y similares. En ciertas modalidades, el ácido nucleico que codifica para el polipéptido híbrido está en un plásmido, más preferiblemente en el plásmido pT5 (SEQ ID NO: 17), y la célula hospedera es una bacteria, más preferiblemente Escherichia coii. Debe entenderse que el ácido nucleico que codifica para el polipéptido híbrido puede ser una variante de la secuencia natural debida a, por ejemplo, la degeneración del código genético (incluyendo alelos). En resumen, dichas "variantes" pueden resultar de polimorfismos naturales, o pueden sintetizarse mediante metodología recombinante (por ejemplo, para obtener optimización de codones para expresión en un hospedero particular) o síntesis química, y pueden diferir de los polipéptidos de tipo silvestre por una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos, o similares. Las variantes que abarcan sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen, por ejemplo, sustituciones de un aminoácido alifático por otro, tales como lie, Val, Leu o Ala, o sustituciones de un residuo polar por otro, tales como entre Lys y Arg, Glu y Asp o Gln y Asn. Dichas sustituciones son bien conocidas en la técnica por proveer variantes que tienen propiedades físicas y actividades funcionales similares tales como, por ejemplo, la capacidad para inducir y reaccionar en forma cruzada con anticuerpos similares. Otras variantes incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido híbrido que tiene por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16. Modalidades preferidas, son aquellas que tienen más de 90% o 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16. Como lo apreciarán los expertos en la técnica, una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido híbrido o variante del mismo puede diferir de las secuencias nativas presentadas en la presente, debido a degeneración de codones, polimorfismo de nucleótidos, o sustitución, deleción o inserción de nucleótidos. De esta manera, en ciertos aspectos, la presente invención incluye todas las moléculas de ácido nucleico degeneradas que codifican para polipéptidos y péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16. En otro aspecto, se incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican para variantes del polipéptido híbrido que tienen sustituciones conservativas de aminoácidos, o deleciones o sustituciones tales que la variante del polipéptido híbrido retiene por lo menos un epítope capaz de inducir anticuerpos específicos para uno o más serotipos estreptocócicos. En ciertos aspectos, puede modificarse una secuencia de ácido nucleico que codifica para una variante del polipéptido híbrido, en donde codones específicos de la secuencia de ácido nucleico han sido cambiados por codones que son favorecidos por un hospedero particular, y pueden dar como resultado niveles mejorados de expresión (véase, por ejemplo, Haas et al., Curr. Biol. 6:315, 1996; Yang et al., Nucleic Acids Res. 24: 4592, 1996). Por ejemplo, ciertos codones de los péptidos inmunógenos obtenidos de proteínas M estreptocócicas fueron optimizados, sin cambiar la secuencia primaria de los péptidos, para expresión mejorada en Escherichia coli. A manera de ilustración y no de limitación, once de los trece codones de arginina (Arg) de AGG/AGA en el polipéptido híbrido hexavalente, como se describe en SEQ ID NO: 9, fueron cambiados por los codones de arginina de CGT/CGC como se describe en SEQ ID NO: 1. En forma similar, doce de veinte codones de arginina de AGG/AGA de SEQ ID NO: 15, fueron optimizados por codones de CGT/CGC como se describe en SEQ ID NO: 8; siete de trece codones de arginina de AGG/AGA de SEQ ID NO: 11 , fueron optimizados por codones de CGT/CGC como se describe en SEQ ID NO: 3; y cinco de nueve codones de arginina de AGG/AGA de SEQ ID NO: 13, fueron optimizados por codones de CGT/CGC como se describe en SEQ ID NO: 5. Como se sabe en la técnica, los codones pueden optimizarse para cualquier hospedero en el que el polipéptido híbrido se expresará incluyendo, sin limitación, bacterias, hongos, células de insecto, células vegetales y células de mamífero. Además, pueden cambiarse también codones que codifican para diferentes aminoácidos, en donde uno o más codones que codifican para diferentes aminoácidos pueden ser alterados simultáneamente, como vendría mejor para un hospedero particular (por ejemplo, pueden optimizarse todos los codones para arginina, glicina, leucina y serina, o cualquier combinación de los mismos). En forma alternativa, la optimización de codones puede producir uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos primaria, tal como deleción, adición o sustitución conservativa de aminoácidos, o combinaciones de las mismas. Aunque modalidades particulares de ácidos nucleicos aislados que codifican para polipéptidos híbridos se ilustran en SEQ ID NOS: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13 y 15, dentro del contexto de la presente invención, la referencia a uno o más ácidos nucleicos aislados incluye variantes de estas secuencias que son sustancialmente similares, porque codifican para polipéptidos híbridos nativos o no nativos con capacidad y estructura similar para inducir anticuerpos seroespecíficos para por lo menos una subunidad de péptido ¡nmunógeho contenida en los polipéptidos híbridos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16. Como se usa en la presente, se considera que l secuencia de nucleótidos es "sustancialmente similar", si: (a) la secuencia de nucleótidos se deriva de la región de codificación de un gen emm aislado de un estreptococo (incluyendo, por ejemplo, porciones de la secuencia o variaciones alélicas de las secuencias descritas anteriormente), y contiene un epítope dé proteína M con sustancialmente la misma capacidad para inducir anticuerpos opsónicos protectores contra estreptococos que no reaccionan en forma cruzada con los tejidos; (b) la secuencia de nucleótidos es capaz de hibridar con las secuencias de nucleótidos de la presente invención bajo severidad moderada o alta; (c) las secuencias de nucleótidos son degeneradas (es decir, secuencias que codifican para los mismos aminoácidos usando secuencias de codones diferentes) como resultado del código genético para las secuencias de nucleótidos definidas en (a) o (b); o (d) es un complemento de cualquiera de las secuencias descritas en (a), (b) o (c). Como se usa en la presente, se dice que dos secuencias de nucleótidos "hibridan" bajo condiciones de una severidad especificada, cuando se forman híbridos estables entre secuencias de ácido nucleico sustancialmente complementarias. La severidad de hibridación se refiere a una descripción del ambiente bajo el cual los híbridos se unen y lavan, e incluye típicamente resistencia iónica y temperatura. Otros factores que podrían afectar la hibridación incluyen el tamaño de la sonda y el tiempo que se deja transcurrir para que los híbridos se formen. Por ejemplo, la severidad "alta", "moderada" y "baja" abarca las siguientes condiciones, o condiciones equivalentes a las mismas: alta severidad es 0.1 x SSPE o SSC, SDS a 0.1 %, 65°C; severidad moderada es 0.2 x SSPE o SSC, SDS a 0.1%, 50°C; y severidad baja es .1.0 x SSPE o SSC, SDS a 0.1 %, 50°C. Como se usa en la presente, el término "condiciones de alta severidad" significa que una o más secuencias quedarán hibridadas, sólo si existe por lo menos 95%, y de preferencia por lo menos 97%, de identidad entre las secuencias. En modalidades preferidas, las secuencias de ácido nucleico que continúan estando hibridadas con una molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido híbrido, codifica para polipéptidos que retienen por lo menos un epítope de un polipéptido híbrido codificado por un ácido nucleico de cualquiera de SEQ ID NOS: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13 y 15. Se proveen también métodos para producir los polipéptidos híbridos de la presente invención, en donde puede usarse cualquiera de las moléculas de ácido nucleico y células hospederas descritas en la presente. En una modalidad preferida, un método para producir un polipéptido híbrido, comprende cultivar una célula hospedera que contiene un vector de expresión dé ácido nucleico que comprende por lo menos una secuencia de control de la expresión enlazada operablemente a una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido híbrido, tal como un polipéptido híbrido como se describe en cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ó 16, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para la expresión del polipéptido. En una modalidad particularmente preferida, se produce un polipéptido híbrido mediante este método, y más preferiblemente los polipéptidos híbridos producidos son de SEQ ID NOS: 10, 12, 14 ó 16, y muy preferiblemente los polipéptidos híbridos producidos son de SEQ ID NOS: 2, 4, 6 u 8. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación: EJEMPLOS EJEMPLO 1 Generación de proteínas estreptococias individuales y multivalentes recombinantes Una vez que las secuencias 5' específicas de cada gen emm y spa se habían seleccionado para su inclusión en la vacuna, se usaron para diseñar cuatro moléculas de ácido nucleico híbridas, cada una conteniendo secuencias de codificación de emm y/o spa enlazadas en tándem mediante sitios de reconocimiento únicos de enzima de restricción (figuras 1-5). Se construyeron las cuatro moléculas de ácido nucleico híbridas usando moléculas de ácido nucleico de emm y spa generadas mediante PCR que se amplificaron a partir de ADN genómico estreptocócico del serotipo correspondiente, usando los oligonucleótidos iniciadores delantero e inverso que contenían sitios de enzima de restricción en el extremo 5'. Los fragmentos generados mediante PCR fueron purificados, digeridos con las enzimas de restricción adecuadas, ligados usando métodos descritos anteriormente (Dale et al., J. Immunol. 151 :2188, 1993; Dale, Vaccine 17: 193, 1999), y entonces clonados secuencialmente en el vector de expresión de pT5. El plásmido pT5 (SEQ ID NO: 17) comprende un promotor de bacteriófago T5 enlazado operablemente a operadores lac, lo cual significa que la expresión a partir del promotor de T5 puede inducirse con isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG). El fragmento de emm 5' fue reiterado en el extremo 3' de cada molécula de ácido nucleico híbrida, con base en observaciones de que un péptido de proteína M amino-terminal reiterado en el extremo carboxi de un polipéptido híbrido, parece mejorar o proteger la inmunogenicidad de los péptidos de proteína M adyacentes (véase Dale, Vaccine 17:193, 1999; y documento WO 99/13084). Además, la molécula de ácido nucleico de emm ¦ clonada en el extremo 3' de la molécula híbrida, fue diseñada para incluir en el extremo 5' lo siguiente: (a) por lo menos seis codones de histidina, (b) un sitio de enzima de restricción Xho\, (c) dpcionalmente uno o más codones de aminoácidos (por ejemplo, cisteína), y (d) por lo menos un codón sin sentido (TAA o TAG). Varios de los codones de arginina de cada uno de los polipéptidos hexavalentes y heptavalentes fueron optimizados (véase las figuras 2-5), sin cambiar la secuencia de aminoácidos primaria, para expresión en E. coh lo cual causó un incremento de alrededor de 2 veces a aproximadamente 10 veces la producción de polipéptidos. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de los polipéptidos híbridos usados para obtener mezclas para inmunizar a conejos y/o humanos, se describen en SEQ ID NOS: 1-16. Se usó cada construcción de plásmido de expresión de pT5 para transformar la cepa JM 05 de E. coli (genotipo F\ traO Q /aclqA(/acZ)M15proA+B+/tf?/ rpsL (str) endA sbcB15 sbcC? /7sdR4(rk ) A(/ac- proAB). La identidad de secuencias de cada molécula de ADN híbrida transformada en la cepa JM105 de E. coli, se verificó secuenciando ambas cadenas. La expresión de cada proteína de fusión componente se detectó mediante análisis SDS-PAGE usando lisados de células enteras antes y después de inducción con IPTG a 1 mM. Además de los polipéptidos multivalentes híbridos generados para inmunizar a un sujeto particular, péptidos homodiméricos recombinantes que comprendían un péptido ¡nmunógeno de serotípo individual, fueron expresados y purificados para poner a prueba sueros inmunes inducidos por los polipéptidos estreptocócicos híbridos. Cada fragmento del gen emm o spa, incluido" en las moléculas de ácido nucleico híbridas descritas anteriormente, fue amplificado independientemente mediante PCR, purificado y clonado secuencialmente en el vector de expresión pT5, como un dímero en el marco de lectura con un sitio de enzima de restricción entre cada secuencia de codificación. Se verificó cada secuencia generada mediante PCR, secuenciando ambas cadenas de la molécula de ácido nucleico que codifica para el dímero. La expresión de cada péptido en la cepa transformada JM 05 de E. coli se detectó mediante análisis SDS-PAGE, como se describió anteriormente. Cada polipéptido híbrido codificado por las moléculas de ácido nucleico híbridas se analizó adicionalmente usando el programa BlastP (matriz BLOSUM62), para asegurar que no existieran homologías significativas con proteínas humanas en la base de datos del Banco de Genes. Se seleccionaron los sitios de enzima de restricción de enlace entre las moléculas de ácido nucleico que codifican para emm y/o spa, para evitar crear una secuencia que codificara para epítopes potenciales que reaccionan en forma cruzada con tejidos humanos. Específicamente, se buscaron los dos residuos de aminoácido codificados por cada sitio de enzima de restricción, junto con los seis residuos de Spa o de proteína M de flanqueo en cada lado de los sitios (14 residuos en total) usando el programa BlastP (matriz PAM30), para detectar homologías potenciales con proteínas humanas en la base de datos del Banco de Genes. No se usó sitio de enzima de restricción alguno que se apareara con más de cuatro aminoácidos contiguos de las secuencias de proteína de un humano.

EJEMPLO 2 Purificación de proteínas estreptococias individuales y multivalentes Se purificó por separado cada poíipéptido híbrido y péptido dimérico individual. La pasta de células de la cepa JM105 de E. coli que expresa el poíipéptido híbrido marcado con His, fue lisada en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) mediante microfluidización (Microfluidics, Inc., Newton, MA). Después de centrifugación, el lisado clarificado fue adsorbido en forma intermitente a resina de quelato de afinidad cargada con níquel (Toso Biosep, Montgomeryville, PA), lavado y eluido con un gradiente gradual de imidazol en PBS. Las fracciones que contenían al poíipéptido híbrido eluido fueron agrupadas, bombeadas a través de un cartucho de intercambio aniónico HITRAP® Q de 5 mi (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), y concentradas en una celda de agitación (Millipore, Bedford, A). El polipéptido híbrido concentrado se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño, usando una columna Superdex 200 (600 cm de longitud, Amersham Pharmacia Biotech), equilibrada con PBS. La pureza de las fracciones fue monitoreada usando SDS-PAGE, y las fracciones que contenían al polipéptido híbrido puro fueron agrupadas y almacenadas a -20°C hasta su uso. La pureza, identidad y concentración del polipéptido híbrido se evaluaron adicionalmente mediante CLAR de fase invertida, análisis de aminoácidos y espectrometría de masas-electroaspersión. Los péptidos diméricos individuales fueron purificados en forma similar, pero con diferencias notables. La cepa JM105 de E. coli que expresa al péptido dimérico marcado con 6xHis, fue lisada en PBS que contenía urea a 8 durante 3 horas con agitación. Después de centrifugación, el lisado clarificado fue adsorbido en forma intermitente a resina de quelato de afinidad cargada con níquel (Toso Biosep), y lavado y eluido con un gradiente gradual de imidazol en PBS. El péptido dimérico eluido fue cargado entonces sobre una columna C4 de fase invertida preparativa (Vydac, Hesperia, CA), lavado, y eluido con concentraciones crecientes de acetonitrilo en agua que contenía ácido trifluoroacético a 0.1 %. Las fracciones del péptido dimérico eluido fueron monitoreadas usando SDS-PAGE. Las fracciones que contenían al péptido dimérico purificado fueron agrupadas y dializadas contra PBS antes de almacenamiento a -20°C.

EJEMPLO 3 Formulación del coctel de polipéptidos híbridos, e inmunización de conejos Los cuatro polipéptidos multivalentes (Hexa A.1 [SEQ ID NO: 10], Septa B.2 [SEQ ID NO: 16], Septa C.2 [SEQ ID NO: 4] y Septa D.1 (SEQ ID NO: 14]) fueron mezclados en cantidades equimolares, y adsorbidos a alumbre (REHYDRAGEL®, baja viscosidad, Reheis, Inc., Berkeley Heights, NJ), hasta alcanzar una concentración final de proteínas de 800 µ???? y una concentración final de alumbre de 1.5 µ?/?t??. Este coctel de polipéptidos ' inmunógenos representa por lo menos 27 antígenos. Se inmunizaron conejos blancos de Nueva Zelanda con 400 µg (es decir, aproximadamente 100 µg de cada polipéptido multivalente) de la vacuna mediante la vía intramuscular, a 0, 4 y 8 semanas, o 0, .4 y 16 semanas (véase Dale, Vaccine 17:193, 1999). Se obtuvo suero antes de la primera inyección y dos semanas después de la inyección final.

EJEMPLO 4 ELISA usando suero de conejos inmunizados Se detectaron anticuerpos específicos del tipo mediante pruebas de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISAs), esencialmente mediante métodos descritos anteriormente ( cLellan et al., Infecí. Immun. 69: 2943, 2001 ). En resumen, se recubrieron placas de microtítulo con péptidos M diméricos recombinantes purificados (es decir, copiando las subunidades de la vacuna y usadas como antígenos de fase sólida). Las cavidades sin péptido, pero conteniendo los demás reactivos, sirvieron como controles negativos. Las ELlSAs se llevaron a cabo usando sueros de conejo preinmunes e inmunes. Los sueros fueron diluidos gradualmente en PBS (pH 7.4), con TWEEN® 20 a 0.05%, añadidos a las cavidades, e incubados a 37°C durante 2 horas. Las cavidades se lavaron con TWEEN® 20-solución salina a 0.15%. Se añadió una inmunoglobulina G (IgG) de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante a inmunoglobulinas de conejo (IgG, IgA e IgM) (ICN Biomedicals, Aurora, OH) diluidas 1 :2,000, y se incubó a 37°C durante 2 horas. Las cavidades se lavaron entonces, se añadió ácido 5-aminosalicílico, y la A45o se registró después de 15 minutos en un lector de microplaca MR 600 (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA). Los sueros inmunes de los conejos (obtenidos 2 semanas después de la inmunización final), contenían altos títulos de anticuerpos para la mayoría de los péptidos M contenidos en la vacuna (figura 7). Se determinaron los títulos de anticuerpo para cada uno de los 26 péptidos M y Spa, un nuevo antígeno protector de estreptococos del grupo A (Dale et al., J. Clin. Invest. 130:1261 , 1999). Todos los títulos preinmunes fueron menores de 200. De los 81 títulos de suero inmune determinados (27 antígenos x 3 conejos), 69 títulos (85%) aumentaron en cuatro veces o más sobre los niveles preinmunes (figura 7).

EJEMPLO 5 Pruebas de opsonización usando suero de conejos inmunizados Se detectaron anticuerpos opsónicos mediante pruebas de opsonización in vitro, esencialmente como se describió anteriormente (Beachey et al., J. Exp. Med. 145: 1469, 1977). La mezcla de prueba consistió de 0.05 mi de una suspensión patrón de estreptococos desarrollados hasta fase semilogarítmica, 0.05 mi de suero de prueba, y 0.2 mi de sangre humana no inmune heparinizada entera (10 U/ml). Para estas pruebas, el número de CFU estreptococias por leucocito fue de aproximadamente 10. Los tubos se hicieron girar, extremo sobre extremo, durante 45 minutos a 37°C. Se hicieron entonces frotis sobre portaobjetos de vidrio, y se tiñeron con tinción de Wright (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO). Se cuantificó la opsonización contando 50 neutrófilos consecutivos, y calculando el porcentaje con estreptococos asociados (porcentaje de opsonización). Los sueros preinmunes de los tres conejos dieron como resultado < 10% de opsonización de cada uno de los 26 serotipos puestos a prueba (datos no mostrados), indicando que la sangre del donador usada para estas pruebas no contenía anticuerpos contra el organismo de prueba, y que cada organismo era totalmente resistente a la opsonización en sangre no inmune. Mediante el uso de 30% de opsonización en presencia de suero inmune como un resultado umbral positivo (es decir, tres o más veces el nivel preinmune), 18 de los 26 serotipos (69%) fueron opsonizados por cuando menos uno de tres sueros de conejo inmunes (figura 8).

EJEMPLO 6 Pruebas bactericidas usando suero de conejos inmunizados Se llevaron a cabo pruebas bactericidas similares al ejemplo 5 (Lancefield, J. Exp. Meó. 106:525, 1957), salvo que se añadieron 0.05 mi de caldo de Todd-Hewitt que contenía menos bacterias, a 0.1 mi de suero de prueba y 0.35 mi de sangre, y la mezcla se hizo girar durante tres horas a 37°C. Entonces, se añadieron alícuotas de 0.1 mi de esta mezcla a agar sangre fundido de oveja, se prepararon cuatro placas, y se hizo ei conteo de organismos viables (CFU) después de incubación la noche anterior a 37°C. Para cada serotipo puesto a prueba, se usaron tres diferentes inóculos para asegurar que el crecimiento en la sangre que contenía suero preinmune fuera óptimo y cuantificable. Los resultados se expresan como porcentaje de destrucción, el cual se calculó usando la fórmula siguiente: [(CFU después de tres horas de crecimiento con suero preinmune) - (CFU después de tres horas de crecimiento con suero inmune)] ÷ [CFU después de tres horas de crecimiento con suero preinmune] x 100. Sólo las pruebas que resultaron en crecimiento de la cepa de prueba a por lo menos ocho generaciones en presencia de suero preinmune, se usaron para expresar el porcentaje de destrucción en presencia de suero inmune. En todos los experimentos, la mezcla de prueba que contenía suero preinrnune resultó en crecimiento de los organismos hasta ocho generaciones o más (datos no mostrados), indicando de nuevo que la sangre humana no contenía anticuerpos opsónicos contra las cepas de prueba, y que cada organismo era totalmente resistente a la destrucción bactericida en sangre no inmune. Mediante el uso de 50% de reducción en el crecimiento después de tres horas de rotación en suero inmune en comparación con suero preinrnune (porcentaje de destrucción), se observó la actividad bactericida contra 22 de los 26 serotipos puestos a prueba (figura 9). Cuando se combinaron los resultados de la opsonizacion y las pruebas bactericidas, 24 de los 26 serotipos (92%) puestos a prueba fueron opsonizados por los sueros inmunes en una o ambas pruebas.

EJEMPLO 7 Pruebas para detectar anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con los tejidos en conejos inmunizados Se pusieron a prueba sueros inmunes de conejo enfrentados contra una composición que comprendía un coctel de cuatro polipéptidos híbridos diferentes (es decir, una vacuna bidecaheptavalente), para la presencia de anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con tejidos mediante pruebas de inmunofluorescencia indirecta (Dale y Beachey, J. Exp. Med. 161 :113, 1985), usando secciones congeladas (4 µ??) de miocardio, riñon, ganglios básales, corteza cerebral y cartílago de humano. Las secciones se colocaron sobre portaobjetos recubiertos de gelatina, y fueron fijadas con paraformaldehído a 1 % durante 10 minutos. Los portaobjetos se lavaron con PBS, se Incubaron con sueros inmunes diluidos 1 :5 en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, y se lavaron completamente en PBS. Las secciones se Incubaron entonces con IgG anti-conejo de cabra conjugada con fluoresceína (Cappel, West Chester, PA) a una dilución de 1 :40 en PBS durante 30 minutos, a temperatura ambiente. Después de lavado, los portaobjetos se montaron en Gelvatol, y se examinaron en un microscopio de fluorescencia. Los antisueros de conejo que se sabe reaccionan en forma cruzada con miocardio, riñon y cerebro de humano, se usaron como controles positivos, y los sueros preinmunes de conejo como controles negativos. Aunque los polipéptidos híbridos indujeron anticuerpos opsónicos para la mayoría de los serotipos de los GrAS puestos a prueba, ninguna de los polipéptidos híbridos indujo anticuerpos humanos que reaccionaran en forma cruzada. Esto indica que los polipéptidos híbridos, solos o en" combinación, no contienen epítopes autoinmunes potencial mente nocivos.

EJEMPLO 8 Actividad bactericida del suero de conejos inmunizados contra otros serotipos Los estreptococos de tipo 4 son causas relativamente comunes de faringitis no complicada e infecciones invasivas. Los organismos de tipo 4 representan actualmente 3.8% de todas las infecciones invasivas, y 8.6% de todos los aislados de faringitis en el programa de vigilancia en curso de los Estados Unidos (comunicación personal, S. T. Shulman). Sin desear que sea limitado por la teoría, parece que la proteína M tipo 4 recombinante purificada no induce anticuerpos opsónicos, o las cepas estreptocócicas de tipo 4 son resistentes a la opsonización. Por esta razón, el fragmento del gen emm4 no se incluyó en la composición que comprendía los cuatros polipéptidos híbridos de Hexa A.1 [SEQ ID NO: 10], Septa B.2 [SEQ ID NO: 16], Septa C.2 [SEQ ID NO: 4] y Septa D.1 [SEQ ID NO: 14] (es decir, la vacuna bidecaheptavalente). Para determinar si alguno de los anticuerpos inducidos por la vacuna bidecaheptavalente podría ser dirigido contra epítopes opsónicos que reaccionan en forma cruzada sobre la superficie de estreptococos de tipo 4, se llevaron a cabo pruebas bactericidas usando siete aislados clínicos obtenidos del U.S. Streptococcal Pharyngitis Surveillance Program (figura 10). Lo que es interesante destacar, se detectó actividad bactericida contra cinco de las siete cepas de estreptococos de tipo 4. Las cepas aisladas de pacientes en Florida (FL9) e Illinois (IL23 e IL-2) fueron opsonizadas por los antisueros bidecaheptavalentes puestos a prueba. Uno de los dos antisueros opsonizó ambos aislados de California (CA8 y CA12), mientras que las cepas de Connecticut (CT5) y Dakota del Sur (SD32) no fueron opsonizadas por el antisuero (figura 10). Los resultados sugieren que la vacuna del coctel bidecaheptavalente puede inducir anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con epítopes protectores sobre la superficie de algunas cepas de estreptococos de tipo 4. Además, los datos indican que los estreptococos de tipo 4 pueden ser un grupo heterogéneo de organismos que expresan diferentes epítopes protectores, aún cuando todos expresan la proteína M4 específica del tipo.

EJEMPLO 9 Formulación del coctel de polipéptidos híbridos, e inmunización de humanos La vacuna global formulada consiste de las cuatro proteínas recombinantes (Hexa A.3 [SEQ ID NO: 2], Septa B.3a [SEQ ID NO: 8], Septa C.2 [SEQ ID NO: 4] y Septa D.3 [SEQ ID NO: 6]) adsorbidas sobre hidróxido de aluminio (concentración final de alumbre de aproximadamente 1 .5 µg/ml), y diluidas hasta una concentración objetivo de alrededor de 400 µ^?t?] o aproximadamente 800 g/ml (100 µg ml o 200 µfp?, respectivamente, de cada polipéptido híbrido) con solución salina regulada en su pH con fosfato. Este coctel de polipéptidos inmunógenos representa por lo menos 27 antígenos. En resumen, se miden los volúmenes calculados de los polipéptidos híbridos purificados en PBS, y se añaden a un matraz de medios de poliesíireno estériles. La mezcla se agita hasta homogeneidad, y se diluye entonces con un volumen igual de agua estéril para inyección. Este paso de dilución reduce la concentración de Na2HP04 y NaCI en la mezcla, hasta la concentración final deseada (fosfato a 5 mM, NaCI a 150 mM, pH 7.5). Los polipéptidos híbridos agrupados se hacen pasar entonces a través de una unidad de filtración y esterilización (MILLIPAK® 20, illipore, Bedford, A) usando una bomba peristáltica. Si algunos péptidos requieren algunas condiciones especiales para homogeneizarse o diluirse, entonces las soluciones se obtienen por separado, y se mezclan subsecuentemente con un ajuste a pH, según sea necesario. Se mide el volumen requerido de polipéptidos híbridos recombinantes, y se añade a un matraz de formulación. Se recibe REHYDRAGEL® (baja viscosidad, Reheis, Inc., Berkeley Heights, NJ) como una suspensión estéril de hidróxido de aluminio en agua para inyección, y se usa sin más preparación. Se mide el volumen requerido de REHYDRAGEL®, y se añade al matraz de formulación mientras se agita. Se mide el pH de la mezcla, y se ajusta a 7.5-7.7 usando NaOH a 1M. Por último, se añade regulador de pH de formulación para lograr el volumen final correcto, y la mezcla se agita durante otras 16 a 20 horas a temperatura ambiente. La vacuna global se divide en contenedores (estériles), se toman muestras para prueba, y la vacuna formulada se almacena a 2-8°C. Se seleccionaron humanos voluntarios, y se enrolaron 30 sujetos sanos de 18 a 50 años de edad. Cada sujeto fue inmunizado con 400 µ9 de la composición de vacuna del coctel mediante la vía intramuscular a 0, 30 y 120 días. Se obtuvo suero antes de la primera inyección, y en los días 14, 30, 44, 60, 120, 134 y 150.

EJEMPLO 10 ELISA usando suero de sujetos humanos inmunizados Se detectaron anticuerpos específicos del tipo mediante ELISA, en forma similar a los métodos descritos en el ejemplo 4 (véase también McLellan et al., Infecí Immun. 69:2943, 2001 ). En resumen, se recubrieron las cavidades de microtítulo con péptidos M diméricos recombinantes (es decir, copiando las subunidades de vacuna, y usados como antígenos de fase sólida). Las cavidades sin sueros humanos, pero conteniendo todos los otros reactivos, sirvieron como controles negativos. Las ELISAs se llevaron a cabo usando los sueros humanos colectados. Los sueros se diluyeron gradualmente en PBS (pH 7.4) con BSA a 0.1 % y TWEEN® 20 a 0.5%, se añadieron a las cavidades, y se incubaron a 37°C durante 2 horas. Las cavidades se lavaron con PBS-TWEEN® 20 a 0.05%. Se añadió una inmunoglobulina G (IgG) de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante a inmunoglobulinas humanas (IgG, IgA e IgM) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) diluidas 1 :2,000, y se incubó a 37°C durante 1 hora. Las cavidades se lavaron entonces, se añadió substrato de ELISA-TMB -Step™ Turbo (Pierce, Rockford, IL), y se añadió ácido sulfúrico a 1 N después de 30 minutos. Se registró la / 450/595 en un lector de microplaca VMAX® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Todos los sueros inmunes de los sujetos humanos (obtenidos en el día 134, el cual fue dos semanas después de la tercera inyección en el día 120), mostraron una elevación estadísticamente significativa en el título de anticuerpo para todos los antígenos M y el antígeno Spa, con un valor p < 0.001 (figura 1 1 ). Todos los sujetos tuvieron un título preinmune del nivel de línea de referencia para algunos antígenos (día 0), como se observa en la figura 11 (día 0, barras claras). El incremento de la media geométrica en el anticuerpo del suero para todos los antígenos en el coctel bidecaheptavalente fue de 12.6 veces, con un incremento mínimo de tres veces y un incremento máximo de más de 68 veces. En conjunto, 26 de los 27 antígenos representados en la vacuna evocaron por lo menos un incremento medio de cuatro veces en el título de anticuerpo.

EJEMPLO 11 Pruebas bactericidas usando suero de sujetos humanos inmunizados Se llevaron a cabo pruebas bactericidas esencialmente como se describe en el ejemplo 6 (véase también Lancefield, J. Exp. Med. 106:525, 1957). Sólo las pruebas que resultaron en crecimiento de la cepa de prueba en presencia de suero en el día 0, se usaron para expresar el porcentaje de destrucción en presencia de suero en el día 134. Todos los sujetos que mostraron un aumento en los títulos de anticuerpo sobre los títulos preinmunes del nivel de línea de referencia, mostraron también un incremento sobre la actividad bactericida de los niveles de línea de referencia (figura 12). Se determinó el incremento del título de anticuerpo dé la media geométrica como en el ejemplo 10, y fue convertido a logaritmo normal (Ln) para comparación con la actividad funcional (destrucción bactericida), de los mismos sueros inmunes. De esta manera, existe una correlación cuantitativa entre los títulos de anticuerpo incrementados y la capacidad de los anticuerpos para inducir destrucción bacteriana.

EJEMPLO 12 Pruebas para detectar anticuerpos que reaccionan en forma cruzada en tejidos, en suero de sujetos humanos inmunizados Se pusieron a prueba sueros obtenidos de sujetos humanos, quienes fueron inmunizados con una composición de vacuna 12-valente que : comprendía un coctel de cuatro polipéptidos híbridos diferentes (Hexa A.3 [SEQ ID NO: 2], Septa B.3a [SEQ ID NO: 8], Septa C.2 [SEQ ID NO: 4] y Septa D.3 [SEQ ID NO: 6]), para la presencia de anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con tejidos, esencialmente como se describe en el ejemplo 7. En forma similar a los resultados observados en conejos, ninguno de los polipéptidos híbridos indujo anticuerpos humanos de reacción cruzada. Esto indica que los polipéptidos híbridos, solos o en combinación, no contienen epítopes autoinmunes humanos potencialmente nocivos.

EJEMPLO 13 Comparación de la vacuna hexavalente contra la vacuna del coctel bidecaheptavalente usada para inmunizar a sujetos humanos Se llevó á cabo una prueba similar en humanos usando el polipéptido hexavalente individual Hexa 1.2, el cual tiene la estructura M24- M5-M6-M19-M1-M3-M25 (véase Dale, Vaccine 17:193, 1999; y documento WO 99/13084). Se seleccionaron humanos voluntarios, y cada uno de once sujetos humanos fue inmunizado tres veces con 100 µ9 de Hexa 1.2 en el mismo regulador de pH de formulación usado para la composición de vacuna bidecaheptavalente que comprendía un coctel de cuatro polipéptidos híbridos diferentes (Hexa A.3 [SEQ ID NO: 2], Septa B.3a (SEQ ID NO: 8], Septa C.2 [SEQ ID NO: 4] y Septa D.3 (SEQ ID NO: 6]). Los seis antígenos estreptocócicos del grupo A de Hexa 1.2 ( 24, M5, M6, M19, M1 y M3) están representados en dos de los cuatro polipéptidos multivalentes que comprenden la vacuna bidecaheptavalente. Se realizaron entonces ELlSAs en sueros de sujetos inmunizados, para identificar anticuerpos específicos del tipo para cada uno de los antígenos Hexa 1.2, esencialmente como se describe en el ejemplo 10. Se calcularon los títulos de la media geométrica usando los títulos de anticuerpo de los 11 sujetos que recibieron el polipéptido multivalente Hexa 1.2, y usando los títulos de anticuerpo de los 30 sujetos en el coctel bidecaheptavalente de cuatro polipéptidos multivalentes diferentes de la prueba clínica, respectivamente (figura 13). El incremento en número de veces en los títulos de anticuerpo, representa el aumento en número de veces en los títulos de la media geométrica después de la inmunización, en comparación con los títulos de la media geométrica antes de la inmunización. En forma sorprendente, los sujetos inmunizados con la composición bidecaheptavalente mostraron un incremento en número de veces mucho mayor en los títulos de anticuerpo en conjunto, que los sujetos que recibieron la composición hexavalente (figura 13). El coctel bidecaheptavalente mostró un incremento en número de veces mayor para todos los antígenos M, variando el incremento en número de veces de alrededor de 1.1 a aproximadamente 4. Como se indicó anteriormente, el incremento en el título de anticuerpo se correlaciona también con un incremento en la actividad bactericida. Por consiguiente, los cuatro péptidos multivalentes mostraron inesperadamente en conjunto un efecto sinergístico al evocar una respuesta inmune en comparación con un péptido hexalente individual. A partir de lo anterior se apreciará que, aunque se han descrito en la presente modalidades específicas de la invención para propósitos de ilustración, pueden hacerse varias modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, la invención no es limitada salvo por las reivindicaciones anexas.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> ID Biomedical Corporation of Washington University of Tennessee Research Corporation Reddish, ark A. Hu, Mary C. alls, Michael A. Dale, James B. <120> COMPOSICIONES DE VACUNA ESTREPTOCOCICA MULTIVALENTE, Y ETODOS PARA SU USO <130> 481112. 13PC ' <140> PCT <141> 28-10-2002 <160> 19 <170> Patentln, Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1005 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> CDS <222> (1) .. (1002) <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Acido nucleico que codifica para híbrido de proteína M y proteína tipo M de estreptococos del grupo A <400> 1 atg gtc gcg act cgc tct cag aca gat act ctg gaa aaa gta caá gaa 48 Met Val Ala Thr Arg Ser Gln Thhr Asp Thr Leu Glu Lys Val Gln Glu 1 5 10 15 cgt gct gac aag ttt gag ata gaa aac aat acg tta aaa ctt aag aat 96 Arg Ala Asp Lys Phe Glu lie Glu Asn Asn Thr Leu Lys Leu Lys Asn 20 25 30 agt gac tta agt ttt aat aat aaa gcg tta aaa gat cat aat gat gag 144 Ser Asp Leu Ser Phe Asn Asn Lys Ala Leu Lys Asp His Asn Asp Glu 35 40 45 tta act gaa gag ttg agt aat gct aaa gag aaa cta cgt cae gtg gee 192 Leu Thr Glu Glu Leu Ser Asn Ala Lys Glu Lys Leu Arg His Val Ala 50 55 60 gtg act cgc ggt aca ata aat gac ccg caá aga gca aaa gaa gct ctt 240 Val Thr Arg Gly Thr lie Asn Asp Pro Gln Arg Ala Lys Glu Ala Leu 65 ' 70 75 80 gac aag tat gag cta gaa aac cat gac tta aaa act aag gga tec cgt 288 Asp Lys Tyr Glu Leu Glu Asn His Asp Leu Lys Thr Lys Gly Ser Arg 85 90 95 gtg ttt cct cgc ggg acg gta gaa aac ccg gac aaa gca cga gaa ctt 336 Val Phe Pro Arg Gly Thr Val Glu, Asn Pro Asp Lys Ala Arg Glu Leu 100 105 110 ctt aac aag tat gac gta gag aac tct atg tta caá gct aat aat gac 384 Leu Asn Lys Tyr Asp Val Glu Asn Ser Met Leu Gln Ala Asn Asn Asp 115 120 125 aag tta cea tgg cgt gtg cgt tat act cgc cat acg cea gaa gat aag 432 Lys Leu Pro Trp Arg Val Arg Tyr Thr Arg His Thr Pro Glu Asp Lys 130 135 140 cta aaa aaa att att gac gat ctt gac gca aaa gaa cat gaa tta caá 480 Leu Lys Lys lie lie Asp Asp Leu Asp Ala Lys Glu His Glu Leu Gln 145 150 " 155 160 caá cag aat gag aag tta tct ctg-cag aaa gtg tat att act cgt ggt 528 Gln Gln Asn Glu Lys Leu Ser Leu Gln Lys Val Tyr lie Thr Arg Gly 165 ' 170 175 atg acá aaa gag gac gta gaa aaa att gct aac aac ctt gac ata gaa 576 Met Thr Lys Glu Asp Val Glu Lys lie Ala Asn Asn Leu Asp lie Glu 180 185 190 aac cat ggg tta aaa caá cag aat gaa cag tta tct act gat aaa caá 624 Asn His Gly Leu Lys Gln Gln Asn Glu Gln Leu Ser Thr Asp Lys Gln 195 200 205 · " ggt ctt gaa gaa cag aat ggt acc gat cgc gtt agt cgt tct atg .tea 672 Gly Leu Glu Glu Gln Asn Gly Thr Asp Arg Val Ser Arg Ser Met Ser 210 215 220 cgc gat gat cta tta aac agg gct cag gat ctt gaa gca aaa aac cae 720 Arg Asp Asp Leu Leu Asn Arg Ala Gln Asp Leu Glu Ala Lys Asn His 225 230 235 240 ggg tta gaa cae cag aat act aag tta tct act gaa aat aaa acg ctt 768 Gly Leu Glu His Gln Asn Thr Lys Leu Ser Thr Glu Asn Lys Thr Leu 245 250 255 caá gaa caá gca gaa gca cgc cag aaa gaa ate gat gtc gcg act cgc 816 Gln Glu Gln Ala Glu Ala Arg Gln Lys Glu lie Asp Val Ala Thr Arg 260 265 270 tct cag acá gat act ctg gaa aaa gta caá gaa cgt gct gac aag ttt 864 Ser Gln Thr Asp Thr Leu Glu Lys Val Gln Glu Arg Ala Asp Lys Phe 275 280 285 gag ata gaa aac aat acg tta aaa ctt aag aat agt gac tta agt ttt 912 Glu lie Glu Asn Asn Thr Leu Lys Leu Lys Asn Ser Asp Leu Ser Phe 290 295 300 aat aat aaa gcg tta aaa gat cat aat gat gag tta act gaa gag ttg 960 Asn Asn Lys Ala Leu Lys Asp His Asn Asp Glu Leu Thr Glu Glu Leu 305 310 315 320 agt aat gct aaa gag aaa cta cgt cae cae cae cae cae cac tga 1005 Ser Asn Ala Lys Glu Lys Leu Arg His His His His His His 325 330" <210> 2 <211> 334 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial:' Híbrido de proteína y proteína tipo de estreptococos del grupo A <400> 2 ' Met Val Ala Thr Arg Ser Gln Thr Asp Thr Leu Glu Lys Val Gln Glu 1 5 10 . 15 Arg Ala Asp Lys Phe Glu lie Glu Asn Asn Thr Leu Lys Leu Lys Asn 20 25 30 Ser Asp Leu Ser Phe Asn Asn Lys Ala Leu Lys Asp His Asn Asp Glu 35 - 40 45 .Leu Thr Glu Glu Leu Ser Asn Ala Lys Glu Lys Leu Arg His Val Ala 50 ' 55 60 Val Thr Arg Gly Thr lie Asn Asp Pro Gln Arg Ala Lys Glu Ala Leu 65 70 75 80 Asp Lys Tyr Glu Leu Glu Asn His Asp Leu Lys Thr Lys Gly Ser Arg 85 90 95 Val Phe Pro Arg Gly Thr' Val Glu Asn Pro Asp Lys Ala Arg Glu Leu 100 .105 110 Leu Asn Lys Tyr Asp Val Glu Asn Ser Met Leu Gln Ala Asn Asn Asp • 115 120 125 Lys Leu Pro Trp Arg Val Arg Tyr Thr Arg His .Thr Pro Glu Asp Lys 130 135 140 Leu Lys Lys lie lie Asp Asp Leu Asp Ala Lys Glu His Glu Leu Gln 145 150 155 160 Gln Gln Asn Glu Lys Leu Ser Leu Gln Lys Val Tyr lie Thr Arg Gly 165 170 175 Met Thr Lys Glu Asp Val Glu Lys lie Ala Asn Asn Leu Asp lie Glu 180 185 190 Asn His Gly Leu Lys Gln Gln Asn Glu Gln Leu Ser Thr Asp Lys Gln 195 200 205 Gly Leu Glu Glu Gln Asn Gly Thr Asp Arg Val Ser Arg Ser Met Ser 210 215 220 Arg Asp Asp Leu Leu Asn Arg Ala Gln Asp Leu Glu Ala Lys Asn His 225 230 235 240 Gly Leu Glu His Gln Asn Thr Lys Leu Ser Thr Glu Asn Lys Thr Leu 245 250 255 Gln Glu Gln Ala Glu Ala Arg Gln Lys Glu lie Asp Val Ala Thr Arg 260 2S5 270 Ser Gln Thr Asp Thr Leu Glu Lys Val Gln Glu Arg Ala Asp Lys Phe 275 280 285 Glu lie Glu Asn Asn Thr Leu Lys Leu Lys Asn Ser Asp Leu Ser Phe 290 295 300 Asn Asn Lys Ala Leu . Lys Asp His Asn Asp Glu Leu Thr Glu Glu Leu 305 310 315 320 Ser Asn Ala Lys Glu Lys Leu Arg His His His His His His 325 330 <210> 3 <211> 1107 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> CDS <222> (1) ... (1104) <220> ' · <223> Descripción de la secuencia artificial: Híbrido de proteína M y proteína tipo M de estreptococos del grupo A <400> 3 atg agt aag aac cct gtc cct gtc aaa aaa gaa gca aaa tta agt gaa 48 Met Ser Lys Asn Pro Val Pro Val Lys Lys Glu Ala Lys Leu Ser Glu 1 5 10 " 15 gca gaa tta cat gac aaa att aaa aac ctt gaa gag gaa aaa gca gaa 96 Ala Glu Leu His Asp Lys lie Lys Asn Leu Glu Glu Glu Lys Ala Glu 20 25 30 tta ttc gag aaa ctc gac gaa gaa cae cct gac gtt gtc gct gct aga 144 Leu Phe Glu Lys Leu Asp Glu Glu His Pro Asp Val Val Ala Ala Arg 35 · 40 45 gaa age gta cta aat aat gtc cgt gta ceg ggt acá ctt tgg cta cgt 192 Glu Ser Val Leu Asn Asn Val Arg Val Pro Gly Thr Leu Trp Leu Arg 50. 55 60 caá aaa gaa gaa aat gac aaa ctt aaa ttg gaa aag aaa ggg ctt gag 240 Gln Lys Glu Glu Asn Asp Lys Leu Lys Leu Glu Lys Lys Gly Leu Glu 65 70 75 80 act gag tta cag gaa aag gaa caá gct age gaa gaa gca tea aat aat 288 Thr Glu Leu Gln Glu Lys Glu Gln Ala Ser Glu Glu Ala Ser Asn Asn 85 90 95 999 caa ctc acá tta cag cat aaa aat aat gca ttg act agt gag aat 336 Gly Gln Leu Thr Leu Gln His Lys Asn Asn Ala Leu Thr Ser Glu Asn 100 105 110 gag tct ctt cgt cgt gaa aaa gat cgt tat ttg tat gaa aaa gaa gaa 384 Glu Ser Leu Arg Arg Glu Lys Asp Arg Tyr Leu Tyr Glu Lys Glu Glu 115 120 125 tta gaa gga tcc gag tea tea aat aat gcg gag tea tea aac att tct 432 Leu Glu Gly Ser Glu Ser Ser Asn Asn Ala Glu Ser Ser Asn lie Ser . 130 135 140 caa gaa age aaa cta ata aat acá ttg act gat gaa aat gag aaa ctc 480 Gln Glu Ser Lys Leu lie Asn' Thr Leu Thr Asp Glu Asn Glu Lys Leu 145 150 ' 155 160 aga gaa gag ctc caa cag tat tat gca. tta agt gat gct aaa gaa gaa 528 Arg Glu Glu Leu Gln Gln Tyr Tyr Ala Leu Ser Asp Ala Lys Glu Glu 165 170 175 gaa ect cgt tat aaa gca ctg cag act gaa gt aag gct gcg ggg caa 576 Glu Pro Arg Tyr Lys Ala Leu Gln Thr Glu Val Lys Ala Ala Gly Gln 180 185 190 age gct ect aaa ggt acá aac gtg age gca gac cta tat aat teg cta 624 Ser Ala Pro Lys Gly' Thr Asn Val Ser Ala Asp Leu Tyr Asn Ser Leu 195 200 205 tgg gat gaa aat aaa act ctt aga gaa aaa caa gaa gag tat ata acá 672 Trp Asp Glu Asn Lys Thr Leu Arg Glu Lys Gln. Glu Glu Tyr lie Thr 210 215 220 aaa att caa aat- gaa gag acá aaa aat aaa ggt acc gaa caa gca aaa 720 Lys lie Gln Asn Glu Glu Thr Lys Asn Lys Gly Th Glu Gln Ala Lys 225 230 235 - 240 aat aat aat ggg gaa ctc acá tta cag caa aaa tac gat gca ttg act 768 Asn Asn Asn Gly Glu Leu Thr Leu Gln Gln Lys Tyr Asp Ala Leu Thr 245 250 255 aat gag aat aag tct ctt cgt cgt gag cgt gat aac tat tta aat tat 816 Asn Glu Asn Lys Ser Leu Arg Arg Glu Arg Asp Asn Tyr Leu Asn Tyr 260 265 270 tta tat gaa aaa cea tgg gaa gag cat gaa aaa gta acá caa gee aga 864 Leu Tyr Glu Lys Pro Trp Glu Glu His Glu Lys Val Thr Gln Ala Arg 275 280 285 gaa gcg gtt ate aga gag atg caa cag agg ggg acá aat ttt gga ect 912 Glu Ala Val lie Arg Glu Met Gln Gln Arg Gly Thr Asn Phe Gly Pro 290 295 300 ctg tta gca agt acá atg cga gat aat cae aat tta aaa gaa acg ctt 960 Leu Leu Ala Ser Thr Met Arg Asp Asn His Asn Leu Lys Glu Thr Leu 305 310 315 320 gac aaa act cac gtg agt aag aac cct gtc cct gtc aaa aaa gaa gca 1008 Asp.Lys T r His Val Ser Lys Asn Pro Val Pro val Lys Lys Glu Ala 325 330 335 aaa tta agt gaa gca gaa tta cat gac aaa att aaa aac ctt gaa gag 1056 Lys Leu Ser Glu Ala Glu Leu His Asp Lys lie Lys Asn Leu Glu Glu 340 345 350 gaa aaa gca gaa tta ttc gag aaa ctc gag cac cac cac cac cac cac 1104 Glu Lys Ala Glu Leu Phe Glu Lys Leu Glu His His His His His His 355 360 365 tga · 1107 <210> 4-<211> 368 <212> P T <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Híbrido de proteína M y proteína tipo M de estreptococos del grupo A - <400> 4 Met Ser Lys Asn Pro Val Pro Val Lys Lys Glu Ala Lys Leu Ser Glu 1 5 10 15 Ala Glu Leu His Ásp Lys lie Lys Asn Leu Glu Glu Glu Lys Ala Glu 20 25 30 Leu Phe Glu Lys Leu Ásp Glu Glu His Pro Asp Val Val Ala Ala Arg 35 40 45 Glu Ser Val Leu Asn Asn Val Arg Val Pro Gly Thr Leu Trp Leu Arg 50 55 60 Gln Lys Glu Glu Asn Asp Lys Leu Lys Leu Glu Lys Lys Gly.Leu Glu 65 70 75 80 Thr Glu Leu Gln Glu Lys Glu Gln Ala Ser Glu Glu Ala Ser Asn Asn ' 85 90 95 Gly Gln Leu Thr Leu Gln His Lys Asn Asn Ala Leu Thr Ser Glu Asn 100 105 110 Glu Ser Leu Arg Arg Glu Lys Asp Arg Tyr Leu Tyr Glu Lys Glu Glu 115 120 125 Leu Glu Gly Ser Glu Ser Ser Asn Asn Ala Glu Ser Ser Asn lie Ser 130 135 140 Gln Glu Ser Lys Leu lie Asn Thr Leu Thr Asp Glu Asn Glu Lys Leu 145 150 155 160 Arg Glu Glu Leu Gln Gln Tyr Tyr Ala Leu Ser Asp Ala Lys Glu Glu 165' 170 175 Glu Pro Arg Tyr Lys Ala Leu Gln Thr Glu Val Lys Ala Ala Gly Gln 180 185 190 Ser Ala Pro Lys Gly Thr Asn Val Ser Ala Asp Leu Tyr Asn Ser Leu 195 200 205 Trp Asp Glu Asn Lys Thr Leu Arg Glu Lys Gln Glu Glu Tyr lie Thr 210 215 220 Lys lie ' Gln Asn Glu Glu Thr Lys Asn Lys Gly Thr Glu Gln Ala Lys 225 230 235 240 Asn Asn Asn Gly Glu Leu Thr Leu Gln Gln Lys Tyr Asp Ala Leu Thr 245 ' 250 255 Asn Glu Asn Lys Ser Leu Arg Arg Glu Arg Asp Asn Tyr Leu Asn Tyr 260 265 270 Leu Tyr Glu Lys Pro Trp Glu Glu His Glu Lys Val Thr Gln Ala Arg ' 275 280 . 285 Glu Ala Val lie Arg Glu Met Gln Gln Arg Gly Thr Asn Phe Gly Pro 290 295 300 Leu Leu Ala Ser Thr Met Arg Asp Asn His Asn Leu Lys Glu Thr Leu 305 310 315 ' 320 Asp Lys Thr His Val Ser Lys Asn Pro Val Pro Val Lys Lys Glu Ala 325 330 335 Lys Leu Ser Glu Ala Glu Leu His Asp Lys lie Lys Asn Leu Glu Glu 340 345 350 Glú Lys Ala Glu Leu Phe Glu Lys Leu Glu His His His His His His • 355 360 365 <210> 5 <211> 1209 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> CDS <222> (1) .. (1206) <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Acido nucleico que codifica para híbrido de proteína M y proteína tipo de estreptococos del grupo A <400> 5 atg agt gac aat att aat cgt tct gtc tct gtc aaa gat aat gaa aaa 48 Met Ser Asp Asn lie Asn Arg Ser Val Ser Val Lys Asp Asn Glu Lys 1 5 10 15 gaa tta cat aac aaa att gca gac ctt gaa gag gaa agg ggt gaa cat Glu Leu His Asn Lys lie Ala Asp Leu Glu Glu Glu Arg Gly Glu His 20 25 30 cta gac aaa ata gat gaa cta aaa gaa gaa cta aaa gca aag gaa aaa Leu Asp Lys lie Asp Glu Leu Lys Glu Glu Leu Lys Ala Lys Glu Lys 35 . 0 45 agt tea gga tec gct gat cae ect age tat acc gct gct aaa gat gaa Ser Ser Gly Ser Ala Asp His Pro Ser Tyr Thr Ala Ala Lys Asp Glu 50 55 60 gta cta agt aag ttc tet gta ceg ggt cat gtt- tgg gca cat gaa aga Val Leu Ser Lys Phe Ser Val Pro Gly His Val Trp Ala His Glu Arg 65 70 75 80 gaa aaa aat gac aaa ctt age teg gaa aat gaa ggg ctt aag gct ggt Glu Lys Asn Asp Lys Leu Ser Ser Glu Asn Glu Gly Leu Lys Ala Gly .85 90 95 tta cag gaa aag gaa caá gct age gaa ggg gtt tet gta ggt tea gat Leu Gln Glu Lys Glu Gln Ala Ser Glu Gly Val Ser Val Gly Ser Asp 100 105 110 gca tea cta cat aac cgc att acá gac ctt gaa gag gaa aga gaa aaa Ala Ser Leu His Asn Arg lie Thr Asp Leu Glu Glu Glu Arg Glu Lys 115 ' 120 125 tta tta aat aaa tta gat aaa gtt gaa gaa gag cat aaa aaa gat cat Leu Leu Asn Lys Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu His Lys Lys Asp His 130 135 · 140 · gaa caá ggt acc aac' agt aag aac ect gee ect gee ect gee tet gct Glu Gln Gly Thr Asn Ser Lys Asn Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ala 145 ,150 155 160 gtc ect gtc aaa aaa gaa gca acá aaa tta agt gaa gca gaa tta tat 528 Val Pro Val Lys Lys Glu Ala Thr Lys Leu Ser Glu Ala Glu Leu Tyr 165 170 175 aac aaa att caá gaa ctt gaa gag- gga aaa gca gaa tta ttc gga tec 576 Asn Lys lie Gln Glu Leu Glu Glu Gly Lys Ala Glu Leu Phe Gly Ser 180 185 190 gaa gaa gaa cgt act ttt act gag tta cca tat gaa gca cga tac aaa 624 Glu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Leu Pro Tyr Glu Ala Arg Tyr Lys 195 200 205 gca tgg aaa agt gaa aat gat gag ctt cgg gaa aat tat cgt cgt acc 672 Ala Trp Lys Ser Glu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Arg Thr 210 215 220 tta gat aag ttt aat act gag caá ggt aag act acg cgc tta gaa gaa 720 Leu Asp Lys Phe Asn Thr Glu Gln Gly Lys Thr Thr Arg Leu Glu Glu 225 230 235 240 caá aat aag ctt gcg gac gcg aac tcg aaa age gtt tet aat agt aac 758 Gln Asn Lys Leu Ala Asp Ala Asn Ser Lys Ser Val Ser Asn Ser Asn 245 250 255 gtg age ata aat cta tat aat gag cta cag gct gaa cat gat aag cta 816 Val Ser lie Asn Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Ala Glu His Asp Lys Leu 260 265 270 cag act aaa cat gag gag cta ttg gct gaa cat gat gct ctt aaa gaa 864 Gln Thr Lys His Glu Glu Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Leu Lys Glu 275 280 285 aaa caá gat aáa aat caá gaa ttc gat gac cgg age gtt tet act aat 912 Lys Gln Asp Lys Asn Gln Glu Phe Asp Asp Arg Ser Val Ser Thr Asn 290 ' 295 300 agt ' ggt age gtg age acá cea tat aat aac cta ttg aat gaa tat gat 960 Ser Gly Ser Val Ser Thr- Pro Tyr Asn Asn Leu Leu Asn Glu Tyr Asp 305 310 · 315 320 gac cta ttg gct aaa cat ggt gag cta ttg agt gaa tat gat gct ctt' 1008 Asp Leu Leu Ala Lys His Gly Glu Leu Leu Ser Glu Tyr Asp Ala Leu 325. 330 335 aaa gaa aaa caá gat aaa aat caá gaa gct age agt gac aat att aat 1056 Lys Glu Lys Gln Asp Lys Asn Gln Glu Ala Ser Ser Asp Asn lie Asn .340 345 350 cgt tet gtc tet gtc aaa gat aat gaa aaa gaa tta cat aac aaa att 1104 Arg Ser Val Ser Val Lys Asp Asn Glu Lys Glu Leu His Asn Lys lie 355 360 365 gca gac ctt gaa gag gaa agg ggt gaa cat cta gac aaa ata gat gaa 1152 Ala Asp Leu Glu Glu Glu Arg Gly Glu His Leu Asp Lys lie Asp Glu 370 375 380 cta aaa gaa gaa cta aaa gca aag gaa aaa agt tea cae cae cae cae 1200 Leu Lys Glu Glu Leu Lys Ala Lys Glu Lys Ser Ser His His His His 385 390 395 400 cae cae tga 1209 His His <210>.6 <211> 402 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Híbrido de proteína M y proteína tipo M de estreptococos del grupo A <400> 6 Met Ser Asp Asn lie Asn Arg Ser Val Ser Val Lys Asp Asn Glu Lys 1 5 10 15 Glu Leu His Asn Lys lie Ala Asp Leu Glu Glu Glu Arg Gly Glu His 20 25 30 Leu Asp Lys lie Asp Glu Leu Lys Glu Glu Leu Lys Ala Lys Glu Lys 40 45 Ser Ser Gly Ser Ala Asp His Pro Ser Tyr Thr Ala Ala Lys Asp Glu 50 55 60 Val Leu Ser Lys Phe Ser Val Pro Gly His Val Trp Ala His Glu Arg 65 70 75 80 Glu Lys Asn Asp Lys Leu Ser Ser Glu Asn Glu Gly Leu Lys Ala Gly 85 SO 95 Leu Gln Glu Lys Glu Gln Ala Ser Glu Gly Val Ser Val Gly Ser Asp 100 105 '110 Ala Ser Leu His Asn Arg lie. Thr Asp Leu Glu Glu Glu Arg .Glu Lys 115 120 125 Leu Leu Asn Lys Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu His Lys Lys Asp His 130 135 140 Glu Gln Gly Thr Asn Ser Lys Asn Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ala 145 150 155 160 Val Pro Val Lys Lys Glu Ala Thr Lys Leu Ser Glu Ala Glu Leu Tyr 165 170 175 Asn Lys lie Gln Glu Leu Glu Glu Gly Lys Ala Glu Leu Phe Gly Ser 180 185 190 Glu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Leu Pro Tyr Glu Ala Arg Tyr Lys 195 200 205 Ala Trp Lys Ser Glu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Arg Thr 210 215 220 Leu Asp Lys Phe Asn Thr Glu Gln Gly Lys Thr Thr Arg Leu Glu Glu 225 230 235 240 Gln Asn Lys Leu Ala Asp Ala Asn Ser Lys Ser Val Ser Asn Ser Asn 245 250 255 Val Ser lie Asn Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Ala Glu His Asp Lys Leu . 260 265 270 Gln Thr Lys His Glu Glu Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Leu Lys Glu 275 280 285 Lys Gln Asp Lys Asn Gln Glu Phe Asp Asp Arg Ser Val Ser Thr Asn 290 295 300 Ser Gly Ser Val Ser Thr Pro Tyr Asn Asn Leu Leu Asn Glu Tyr Asp 305 310 315 320 Asp Leu Leu Ala Lys His Gly Glu Leu Leu Ser Glu Tyr Asp Ala Leu 325 330 335 Lys Glu Lys Gln Asp Lys Asn Gln Glu Ala Ser ,Ser Asp Asn lie Asn 340 345 350 Arg Ser Val Ser Val Lys Asp Asn Glu Lys Glu Leu His Asn Lys lie 355 360 365. Ala Asp Leu Glu Glu Glu Arg Gly Glu His Leu Asp Lys lie Asp Glu 370 375 380 Leu Lys Glu Glu Leu Lys Ala Lys Glu Lys Ser Ser His His His His 385 390 395 400 His His <210> 7 <211> 1287 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> CDS <222> (1) .. (1284) <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Híbrido de proteína M y proteína tipo de estreptococos del grupo A · <400> 7 atg aac ggt gat ggt aat cct ágg gaa gtt ata gaa gat ctt gca gca 48 Met Asn Gly Asp Gly Asn Pro Arg Glu Val lie Glu Asp Leu Ala Ala 1 5 10 ' 15 aac aat ccc gca ata ca aat ata cgt tta cgt cae gaa aac aag gac 96 Asn Asn Pro Ala lie Gl Asn lie Airg Leu Arg His Glu Asn Lys Asp 20 25 30 tta aaa gcg aga tta gag aat gca atg gaa gtt gca gga aga gat ttt 144 Leu Lys Ala Arg Leu Glu Asn Ala Met Glu Val Ala Gly Arg Asp Phe 35 .40 45 aag aga gct etc gac gat cat agt gat tta gtc gca gaa aaa caá cgt 192 Lys Arg Ala Leu Asp Asp His Ser Asp Leu Val Ala Glu Lys Gln Arg 50 55 60 tta gaa gat tta gga caá aaa ttt gaa aga ctg aaa cag cgt tea gaa 240 Leu Glu Asp Leu Gly Gln Lys Phe Glu Arg Leu Lys Gln Arg Ser Glu 65 70 75 80 etc tac ctt cag caá tac tat gat aat aaa tea aat gga tat aaa ggt 288 Leu Tyr Leu Gln Gln Tyr Tyr Asp Asn Lys Ser Asn Gly Tyr Lys Gly gac tgg tat gta caa cag tta" gga tcc gat tca gta agt gga tta gag 336 Asp Trp Tyr Val Gln Gln Leu Gly Ser Asp Ser Val Ser Gly Leu Glu 100 105 110 gtg gca gac ccc tct gat agt aag aaa ctt att gaa tta ggt ttg gct 384 Val Ala Asp Pro Ser Asp Ser Lys Lys Leu lie Glu Leu Gly Leu Ala 115 120 125 aaa tac ctt aat gat aaa tta ccc ttt aaa act aaa gaa gat tca gag 432 Lys Tyr Leu Asn Asp Lys Leu Pro Phe Lys Thr Lys Glu Asp Ser Glu 130 ¦ 135 140 att tta tca gag tta cgt gat gta tta aaa aat ctg cag gag tct cea 480 lie Leu Ser Glu Leu Arg Asp Val Leu Lys Asn Leu Gln Glu Ser Pro 145 150 155 160 aaa agt act gag act tct gct aat gga gct gat aaa tta gct gat gca 528 Lys Ser Thr Glu Thr Ser Ala Asn Gly Ala Asp Lys Leu Ala Asp Ala 165 170 175 tac aac acá ttg ctt act gaa cat gag aaa etc aga gat gag tat tat 576 Tyr Asn Thr Leu Leu Thr Glu His Glu Lys Leu Arg Asp Glu Tyr Tyr 180 185 - 190 acá tta att gat gct aaa gaa gaa gaa ect cgc. tat aaa gca ttg ggt 624 Thr Leu lie Asp Ala Lys Glu Glu Glu Pro Arg Tyr Lys Ala Leu Gly 195 200 205 acc ttg tta gat cag gtt acá caa tta tat act aaa cat aat agt aat 672 Thr Leu Leu Asp Gln Val Thr Gln Leu Tyr Thr Lys His Asn Ser Asn 210 215 220 tac caa caa tat aat gca caa gct ggc aga ctt gac ctg aga caa aag 720 Tyr Gln Gln Tyr Asn Ala Gln Ala Gly Arg Leu Asp Leu Arg Gln Lys 225 230 235 240 gct gaa tat cta aaa ggc ctt aat gat tgg .gct gag cgc ctg tta caa 768 Ala Glu Tyr Leu Lys Gly Leu Asn Asp Trp Ala Glu Arg Leu Leu Gln 245 250 255 gag tta aat ggt acc aac aat gat ggt cgt tct cgt gac gtt acg gaa 816 Glu Leu Asn Gly Thr Asn Asn Asp Gly Arg Ser Arg Asp Val Thr Glu 260 265 270 gag att gca gca aac aat aec acá gta caa aat ata cgt tta cgt aac 864 Glu lie Ala Ala Asn Asn Thr Thr Val Gln Asn lie Arg Leu Arg Asn 275 280 285 gaa aac aag aac tta aaa gcg aaa aac gag gac tta gaa gcg aga tta 912 Glu Asn Lys Asn Leu Lys Ala Lys Asn Glu Asp Leu Glu Ala Arg Leu 290 295 300 gag aat gca atg aat gtt gca gga cgc gat ttt aag cgt gct gaa ttc 960 Glu Asn Ala Met Asn Val Ala Gly Arg Asp Phe Lys Arg Ala Glu Phe 305 310 315 320 gca cct ctt act cgt gct acá gca gac aat aaa gac gaa tta ata aaa 1008 Ala Pro Leu Thr Arg Ala Thr Ala Asp Asn Lys Asp Glu Leu lie Lys 325 330 335 aga gct aac ggt tat gag ata cag. aac cat cag tta acá gtt gag aat 1056 Arg Ala Asn Gly Tyr Glu lie Gln Asn His Gln Leu Thr Val Glu Asn 340 345 350 aaa aaa tta aaa act gat aag gaa cag tta acá aaa gag aat gat gat 1104 Lys Lys Leu Lys Thr Asp Lys Glu Gln Leu Thr Lys Glu Asn Asp Asp 355 360 365 tta aaa cae gtg aac ggt gat ggt aat cct cgt gaa gtt ata gaa gat 1152 Leu Lys His Val Asn Gly Asp Gly Asn Pro Arg Glu Val lie Glu Asp 370 375 380 ctt gca gca aac aat ecc gca ata caá aat ata cgt tta cgt cae gaa 1200 Leu Ala Ala Asn Asn Pro Ala lie Gln Asn lie Arg Leu Arg His Glu 385 390 395 400 aac aag gac tta aaa gcg aga tta gag aat gca atg gaa gtt gca gga 1248 · Asn Lys Asp Leu Lys Ala Arg Leu Glu Asn Ala Met Glu Val Ala Gly 405 410 415 cgt gat ttt aag cgt gct cae cae cae cae cae cae taa 1287 Arg Asp Phe Lys Arg Ala His His His His His His 420 425 <210> 8 -<211=» 428 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> 223> Descripción de la secuencia artificial: Híbrido de proteína y proteína tipo M de estreptococos del grupo A <400> 8 Met Asn Gly Asp Gly Asn Pro Arg Glu Val lie Glu Asp Leu Ala Ala 1 5 10 15 Asn Asn Pro Ala lie Gln Asn lie Arg Leu Arg His Glu Asn Lys Asp 20 25 .30 Leu Lys Ala Arg Leu Glu Asn Ala Met Glu Val Ala Gly Arg Asp Phe 35 40 45 Lys Arg Ala Leu Asp Asp His Ser Asp Leu Val Ala Glu Lys Gln Arg .50 55 60 Leu Glu Asp Leu Gly Gln Lys Phe Glu Arg Leu Lys Gln Arg Ser Glu 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Gln Tyr Tyr Asp Asn Lys Ser Asn Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 Asp Trp Tyr Val Gln Gln Leu Gly Ser Asp Ser Val Ser Gly Leu Glu 100 ¦ 105 110 Val Ala Asp Pro Ser Asp Ser Lys Lys Leu lie Glu Leu Gly Leu Ala 115 120 125 Lys Tyr Leu Asn Asp Lys Leu Pro Phe Lys Thr Lys Glu Asp Ser Glu 130 ' 135 140 lie Leu Ser Glu Leu Arg Asp Val Leu Lys Asn Leu Gln Glu Ser Pro 145 150 155 160 Lys Ser Thr Glu Thr Ser Ala Asn Gly Ala Asp Lys Leu Ala Asp Ala 165 170 175 Tyr Asn Thr Leu Leu Thr Glu His Glu Lys Leu Arg Asp Glu Tyr Tyr 180 185 190 Thr Leu lie Asp Ala Lys Glu Glu Glu Pro Arg Tyr Lys Ala Leu Gly 195 200 205 Thr Leu Leu Asp Gln Val Thr Gln Leu Tyr Thr Lys His Asn Ser Asn 210 215 220 Tyr Gln Gln Tyr Asn Ala Gln Ala Gly Arg Leu Asp Leu Arg Gln Lys 225 230 235 240 Ala Glu Tyr Leu Lys Gly Leu Asn Asp Trp Ala Glu Arg Leu Leu Gln 245 250 255 Glu Leu Asn Gly Thr Asn Asn Asp Gly Arg Ser Arg Asp Val Thr Glu 260 265 270 Glu lie Ala Ala Asn Asn Thr Thr Val Gln Asn lie Arg Leu Arg Asn 275 280 285 Glu Asn Lys Asn Leu Lys Ala Lys Asn Glu Asp Leu Glu Ala Arg Leu 290 295 300 Glu Asn Ala Met Asn Val Ala Gly Arg Asp Phe Lys Arg Ala Glu Phe 305 310 _ 315 320 Ala Pro Leu Thr Arg Ala Thr Ala Asp Asn Lys Asp Glu Leu lie Lys 325 330 335 Arg Ala Asn Gly Tyr Glu lie Gln Asn His Gln Leu Thr Val Glu Asn 340 345 350 Lys Lys Leu Lys Thr Asp Lys Glu Gln Leu Thr Lys Glu Asn Asp Asp 355 360 365 Leu Lys His Val Asn Gly Asp Gly Asn Pro Arg Glu Val lie Glu Asp 370 375 380 Leu Ala Ala Asn Asn Pro Ala lie Gln Asn lie Arg Leu Arg His Glu 385 390 395 400 Asn Lys Asp Leu Lys Ala Arg Leu Glu Asn Ala Met Glu Val Ala Gly 405 410 415 Arg Asp Phe Lys Arg Ala His His His His His His 420 425 <210> 9 <211> 1008 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> CDS <222> (1) .. (1005) <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Acido nucleico que codifica para híbrido de proteína M y proteina tipo M de estreptococos del grupo A <400> 9 atg gtc gcg act agg tct cag acá gat act ctg gaa aaa gta caá gaa 48 Met Val Ala Thr Arg Ser Gln Thr Asp Thr Leu Glu Lys Val Gln Glu 1 5 10 15 cgt gct' gac aag ttt gag ata gaa aac aat acg.tta aaa ctt aag aat 96 Arg Ala Asp Lys Phe Glu lie Glu Asn Asn Thr Leu Lys Leu Lys Asn 20 25 30 agt gac tta agt ttt aat aat aaa gcg tta aaa gat cat aat gat gag 144 Ser Asp Leu Ser Phe Asn Asn Lys Ala Leu Lys Asp His Asn Asp Glu 35· 40 45 tta act gaa gag ttg agt aat gct aaa gag aaa cta cgt cae gtg gee 192 Leu Thr Glu Glu Leu Ser Asn Ala Lys Glu Lys Leu Arg His Val Ala 50 55 so ;gtg act agg ggt acá ata aat gac ceg caá aga gca aaa gaa gct ctt 240 Val Thr Arg Gly Thr lie Asn Asp Pro Gln Arg Ala Lys Glu Ala Leu 65 70 75 80 gac aag tat gag cta gaa aac cat gac tta aaa act aag gga tec aga 288 Asp Lys Tyr Glu Leu Glu Asn His Asp Leu Lys Thr Lys Gly Ser Arg 85 90 95 gtg ttt ect agg ggg acg gta gaa aac ceg gac aaa gca cga gaa ctt 336 Val Phe Pro Arg Gly Thr Val Glu Asn Pro Asp Lys Ala Arg Glu Leu 100 105 110 ctt aac aag tat gac gta gag aac tct atg tta caá gct aat aat gac 384 Leu Asn Lys Tyr Asp Val Glu Asn Ser Met Leu Gln Ala Asn Asn Asp 115 120. 125 ¦ aag tta cea tgg aga gtg cgt tat act agg cat acg cea gaa gat aag 432 Lys Leu Pro Trp Arg Val Arg Tyr Thr Arg His Thr Pro Glu Asp Lys 130 135 140 cta aaa aaa att att gac gat ctt gac gca aaa gaa cat gaa tta caa 480 Leu Lys Lys lie lie Asp Asp Leu Asp Ala Lys Glu His Glu Leu Gln 145 150 155 160 caa cag aat gag aag tta tct ctg cag aaa gtg tat att act agg ggt 528 Gln Gln Asn Glu Lys Leu Ser Leu Gln Lys Val Tyr lie. Thr Arg Gly 165 170 175 atg acá aaa gag gac gta gaa aaa att gct aac aac ctt gac ata gaa 576 Met Thr Lys Glu Asp Val Glu Lys lie Ala Asn Asn Leu Asp lie Glu 180 185 190 aac cat ggg tta aaa caa cag aat gaa cag tta tct act gat aaa caa 624 Asn His Gly Leu Lys Gln Gln Asn Glu Gln Leu Ser Thr Asp Lys Gln 195 200 205 ggt ctt gaa gaa cag aat ggt acc gat aga gtt agt agg tct atg tea 672 Gly Leu Glu Glu Gln Asn Gly Thr Asp Arg Val Ser Arg Ser Met Ser 210 215 220 aga gat gat cta tta aac agg gct cag gat ctt gaa gca aaa aac cae 720 Arg Asp Asp Leu Leu Asn Arg Ala Gln Asp Leu Glu Ala Lys Asn His '225 230 235 240 ggg tta gaa cae cag aat act aag. tta tct act gaa aat aaa acg ctt 768 Gly Leu Glu His Gln Asn Thr Lys Leu Ser Thr Glu Asn Lys Thr Leu 245 250 255 caa gaa caa gca gaa gca cgc cag aaa gaa ate gat gtc gcg act agg 816 Gln Glu Gln Ala Glu Ala Arg Gln Lys Glu lie Asp Val Ala Thr Arg '260 265 .270 tct cag "acá gat act ctg gaa aaa gta caa gaa' cgt gct gac aag ttt 864 Ser Gln Thr Asp Thr Leu Glu Lys Val Gln Glu Arg Ala Asp Lys Phe 275 280 285 gag ata gaa aac aat acg tta aaa ctt aag aat agt gac tta agt ttt 912 Glu lie Glu Asn Asn Thr Leu Lys Leu Lys Asn Ser Asp Leu Ser Phe 290 295 300 aat aat aaa gcg tta aaa gat cat aat gat gag tta act gaa gag ttg 960 Asn Asn Lys Ala Leu Lys Asp His Asn Asp Glu Leu Thr Glu Glu Leu 305 310 315 320 agt aat gct aaa gag aaa cta cgt cae cae cae cae cae cae tgc tga 1008 Ser Asn Ala Lys Glu Lys Leu Arg His His His His His His Cys 325 330 335 <210> 10 <211> 335 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Híbrido de proteína M y proteína tipo M de estreptococos del grupo A <400>' 10 Met Val Ala Thr Arg Ser Gln Thr Asp Thr Leu Glu Lys Val Gln Glu 1 5. · 10 15 Arg Ala Asp Lys Phe Glu lie Glu Asn Asn Thr Leu Lys Leu Lys Asn 20 25 30 Ser Asp Leu Ser Phe Asn Asn Lys Ala Leu Lys Asp His Asn Asp Glu 35 40 45 Leu Thr Glu Glu Leu Ser Asn Ala Lys Glu Lys Leu Arg His Val Ala 50 55 60 Val Thr Arg Gly Thr lie Asn. Asp Pro Gln Arg Ala Lys Glu Ala Leu 65 70 75 80 Asp Lys Tyr Glu Leu Glu Asn His Asp Leu Lys Thr Lys Gly Ser Arg 85 90 95 Val Phe Pro Arg Gly Thr Val Glu Asn Pro Asp Lys Ala Arg Glu Leu 100 105 ' 110 Leu Asn Lys Tyr Asp Val Glu Asn Ser Met Leu Gln Ala Asn Asn Asp 115 120 125 Lys Leu Pro Trp Arg Vaí.Arg Tyr Thr Arg His Thr Pro Glu Asp Lys 130 135 140 Leu -Lys Lys lie lie Asp Asp Leu Asp Ala Lys Glu His Glu Leu Gln 145 150 155 160 Gln Gln Asn Glu Lys Leu Ser Leu Gln Lys Val Tyr lie Thr Arg Gly 165 170 175 Met Thr Lys Glu Asp Val Glu Lys lie Ala Asn Asn Leu Asp lie Glu ' 180 - 185 190 Asn His Gly Leu Lys Gln Gln Asn Glu Gln Leu Ser Thr Asp Lys Gln 195 .200 205 Gly Leu Glu Glu Gln Asn Gly Thr Asp Arg Val Ser Arg Ser Met Ser 210 215 220 Arg Asp Asp Leu Leu Asn Arg Ala Gln Asp Leu Glu Ala Lys Asn His 225 230 235 240 Gly Leu Glu His Gln Asn Thr Lys Leu Ser Thr Glu Asn Lys Thr Leu 245 250 255 Gln Glu Gln Ala Glu Ala Arg Gln Lys Glu lie Asp Val Ala Thr Arg 260 265 270 Ser Gln Thr Asp Thr Leu Glu Lys Val Gln Glu Arg Ala Asp Lys Phe 275 280 285 Glu lie Glu Asn Asn Thr Leu Lys Leu Lys Asn Ser Asp Leu Ser Phe 290 295 300 Asn Asn Lys Ala Leu Lys Asp His Asn Asp Glu Leu Thr Glu Glu Leu 305 310 315 320 Ser Asn Ala Lys Glu Lys Leu Arg His His His His His His Cys 325 330 335 <210> 11 <211> 1194 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> CDS <222 (1) .. (1191) <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Híbrido de proteína- M y proteína tipo de estreptococos del grupo A <400> 11 atg agt aag aac cct gtc cct gtc . aaa aaa gaa gca aaa tta agt gaa 48 Met Ser Lys Asn Pro Val Pro Val Lys Lys Glu Ala Lys Leu Ser Glu 1 5 10 15 gca gaa tta cat gac aaa att aaa aac ctt gaa gag gaa aaa gca gaa 96 Ala Glu Leu His Asp Lys lie Lys Asn Leu Glu Glu Glu Lys Ala Glu 20 ' - 25 30 tta ttc gag .aaa tta gat aaa gtt gaa gaa gag cat aaa aaa gtt gaa 144 Leu Phe Glu Lys Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu His Lys Lys Val Glu .. .. 35 40 45 gaa gag cat gtc gac gaa gaa cae cct gac gtt gtc gct gct aga gaa 192 Glu Glu His Val Asp Glu Glu His Pro Asp Val Val Ala Ala Arg Glu 50 55 60 age gta cta aat aat gtc cgt gta ceg ggt acá ctt tgg cta cgt caá 240 Ser Val Leu Asn Asn Val Arg Val Pro Gly Thr Leu Trp Leu Arg Gln 65 70 75 80 aaa gaa gaa aat gac aaa ctt aaa ttg- gaa aag aaa ggg ctt gag act 288 Lys Glu Glu Asn Asp Lys Leu Lys Leu Glu Lys Lys Gly Leu Glu Thr 85 90 95 gag tta cag gaa aag gaa caá gct age gaa gaa gca tea aat aat ggg 336 Glu Leu Gln Glu Lys Glu Gln Ala Ser Glu Glu Ala Ser Asn Asn Gly 100 105 110 caá etc acá tta cag cat aaa aat aat gca ttg act agt gag aat gag 384 Gln Leu Thr Leu Gln His Lys Asn Asn Ala Leu Thr Ser Glu Asn Glu 115 120 125 tct ctt aga aga gaa aaa gat aga tat ttg tat gaa aaa gaa gaa tta 432 Ser Leu Arg Arg Glu Lys Asp Arg Tyr Leu Tyr Glu Lys Glu Glu Leu 130 135 140 gaa gga tcc gag tea. tea aat aat gcg gag .tea tea aac att tct caá 480 Glu Gly Ser Glu Ser Ser Asn Asn Ala Glu Ser Ser Asn lie Ser Gln 145 150 155 160 gaa age aaa cta ata aat acá ttg act gat gaa aat gag aaa etc aga 528 Glu Ser Lys Leu lie Asn Thr Leu Thr Asp Glu Asn Glu Lys Leu Arg 165 170 . 175 gaa gag etc caá cag tat tat gca tta agt gat gct aaa gaa gaa gaa 576 Glu Glu Leu Gln Gln Tyr Tyr Ala Leu Ser Asp Ala Lys Glu Glu Glu 180 " 185 190 ect agg tat aaa gca ctg" cag act gaa gtt aag gct gcg ggg caá age 624 Pro Arg Tyr Lys Ala Leu Gln Thr Glu Val Lys Ala Ala Gly Gln Ser 195 200 205 gct ect aaa ggt acá aac gtg age gca gac cta tat aat teg cta tgg 672 ¦ Ala Pro Lys Gly Thr' Asn Val Ser Ala Asp Leu Tyr Asn Ser Leu Trp 210 215 220 gat gaa aat aaa act ctt aga gaa aaa caá gaa gag tat ata acá aaa 720 Asp Glu Asn Lys Thr Leu Arg Glu Lys Gln Glu Glu Tyr lie Thr Lys 225 230 235 240 att caá aat gaa gag acá aaa aat aaa ggt acc gaa caá gca aaa aat 768 lie Gln Asn Glu Glu Thr Lys Asn Lys Gly Thr Glu Gln Ala Lys Asn 245 250 255 aat aat ggg gaa .etc acá tta cag caá aaa tac gat gca ttg act aat 816 Asn Asn Gly Glu Leu Thr Leu Gln Gln Lys Tyr Asp Ala Leu Thr Asn 260 . 265 ' 270 gag aat aag tct ctt aga aga gag aga gat aac tat tta aat tat tta 864 Glu Asn Lys Ser Leu Arg Arg Glu Arg Asp Asn Tyr Leu Asn Tyr Leu 275 280 285 tat gaa aaa cea tgg gaa gag cat gaa aaa gta acá caá gee aga gaa 912 Tyr Glu Lys Pro Trp Glu Glu His Glu Lys Val Thr Gln Ala Arg Glu 290 295 300 gcg gtt ate aga gag atg caá cag agg ggg acá aat ttt gga ect ctg 960 Ala Val lie Arg Glu Met Gln Gln Arg Gly Thr- Asn Phe Gly Pro Leu 305 310 315 320 tta gca agt ac atg cga gat aat cac aat tta aaa gaa acg ctt gac 1008 Leu Ala Ser Thr Met Arg Asp Asn His Asn Leu Lys Glu Thr Leu Asp 325 330 335 aaa act cac gtg agt aag aac cct gtc cct gtc aaa aaa gaa gca aaa 1056 Lys Thr His Val Ser Lys Asn Pro Val Pro Val Lys Lys Glu Ala Lys 340 345 350 tta agt gaa gca gaa tta cat gac aaa att aaa aac ctt gaa gag gaa 1104 Leu Ser Glu Ala Glu Leu His Asp Lys lie Lys Asn Leu Glu Glu Glu 355 360 365 aaa gca gaa tta ttc gag aaa tta gat aaa gtt gaa gaa gag cat aaa 1152 Lys Ala Glu Leu Phe Glu Lys Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu His Lys 370 ' 375 380 aaa gtt gaa gaa gag cat cac cac cac cac cac cac tgc taa 1194 Lys Val Glu Glu Glu His His His His His His His Cys 385 390 395 <210> 12 <211> 397 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Híbrido de proteína M y proteína tipo M de estreptococos del grupo A <400> 12 Met Ser Lys Asn Pro Val Pro Val Lys Lys Glu Ala Lys Leu Ser Glu 1 5 10 15 Ala Glu Leu His Asp Lys lie Lys .Asn Leu Glü Glu Glu Lys Ala Glu 20 25 30 Leu Phe Glu Lys Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu His Lys · Lys Val Glu 35 "40 45 Glu Glu His Val Asp Glu Glu His Pro Asp Val Val Ala Ala Arg Glu 50 55 60 Ser Val Leu Asn Asn Val Arg Val Pro Gly Thr Leu Trp Leu Arg Gln 65 70 75 80 Lys Glu Glu Asn Asp Lys Leu Lys Leu Glu Lys Lys Gly Leu Glu Thr 85 90 95 Glu Leu Gln Glu Lys Glu Gln Ala Ser Glu Glu Ala Ser Asn Asn Gly 100 105 110 Gln Leu Thr Leu Gln His Lys Asn Asn Ala Leu Thr Ser Glu Asn Glu 115 120 125 Ser Leu Arg Arg Glu Lys Asp Arg Tyr Leu Tyr Glu Lys Glu Glu Leu 130 135 140 Glu Ser Lys Leu lie Asn Thr Leu Thr Asp Glu Asn Glu Lys Leu Arg 165 170 175 Glu Glu. Leu Gln Gln Tyr Tyr Ala Leu Ser Asp Ala Lys Glu Glu Glu 180 185 190 Pro Arg Tyr Lys Ala Leu Gln Thr Glu Val Lys Ala Ala Gly Gln Ser 195 200 205 Ala Pro Lys Gly Thr Asn Val Ser Ala Asp Leu Tyr Asn Ser Leu Trp 210 215 220 Asp Glu Asn Lys Thr Leu Arg Glu Lys Gln Glu Glu Tyr lie Thr Lys 225 230 235 240 lie Gln Asn Glu Glu Thr Lys Asn Lys Gly Thr Glu Gln Ala Lys Asn 245 250 255 Asn Asn Gly Glu Leu Thr Leu Gln Gln Lys Tyr As Ala Leu Thr Asn 260 ' 265 270 Glu Asn Lys Ser Leu Arg Arg Glu Arg Asp Asn Tyr Leu Asn Tyr Leu 275 280 285 Tyr Glu Lys Pro Trp Glu Glu His Glu Lys Val Thr Gln Ala Arg Glu 290' 295 300 Ala Val lie Arg Glu Met Gln Gln Arg Gly Thr Asn Phe Gly Pro. Leu 305 310 315 320 Leu Ala Ser Thr Met Arg Asp Asn His Asn Leu Lys Glu Thr Leu Asp 325 330 .335 Lys Thr His Val Ser Lys Asn Pro Val Pro Val Lys Lys Glu Ala Lys 340 345 350 Leu Ser Glu Ala Glu Leu His Asp Lys lie Lys Asn Leu Glu Glu Glu 355 360 365 Lys Ala Glu Leu Phe Glu Lys Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu His Lys 370 375 380 Lys Val Glu Glu Glu His His His His His His His Cys 385 390 395 <210> 13 <211> 1212 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> CDS <222> (1) .. (1209) <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Acido nucleico que codifica para híbrido de proteína M y proteína tipo M de estreptococos del grupo A <400> 13 atg agt gac aat att aat aga tct gtc tct gtc aaa gat aat gaa aaa 48 Met Ser Asp Asn lie Asn Arg Ser Val Ser Val Lys Asp Asn Glu Lys 1 5 10 15 gaa tta cat aac aaa att gca gac ctt gaa gag gaa agg ggt gaa cat 96 Glu Leu His Asn Lys lie Ala Asp Leu Glu Glu Glu Arg Gly Glu His 20 25 30 cta gac aaa ata gat gaa cta aaa gaa gaa cta aaa gca aag gaa aaa 144 Leu Asp Lys lie Asp Glu Leu Lys Glu Glu Leu Lys Ala Lys Glu Lys 35 40 45 agt tea' gga tec gct gat cae ect age tat acc gct gct aaa gat gaa 192 Ser Ser Gly Ser Ala Asp His Pro Ser Tyr Thr Ala Ala Lys Asp Glu 50 55 60 10 gta cta agt aag ttc tct gta ceg ggt cat gtt tgg gca cat gaa aga 240 Val Leu Ser Lys Phe Ser Val Pro Gly His Val Trp Ala His Glu Arg 65 70 75 80 gaa aaa aat gac aaa ctt age teg gaa aat gaa ggg ctt aag gct ggt 288 Glu Lys Asn Asp Lys Leu Ser Ser Glu Asn Glu Gly Leu Lys Ala Gly 85 90 95 tta cag gaa aag gaa caá gct age gaa ggg gtt tct gta ggt tea gat 336 ¦Leu Gln Glu Lys Glu Gln Ala Ser Glu Gly Val Ser Val Gly Ser Asp 100 105 110 ,| g gca tea cta cat aac cgc att ac gac ctt gaa gag gaa aga gaa aaa 384 Ala Ser Leu His Asn Arg lie Thr Asp Leu Glu Glu Glu Arg Glu Lys 115 120 125 tta tta aat aaa tta gat aaa gtt gaa gaa gag cat aaa aaa gat cat 432 Leu Leu Asn Lys Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu His Lys Lys Asp His 130 135 140 gaa caá ggt acc aac agt aag aac ect gee ect gee ect gee tct gct 480 Glu Gln Gly Thr Asn Ser Lys Asn Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ala 145 150 155 ¦ 160 gtc ect gtc aaa aaa gaa gca acá aaa tta agt gaa gca gaa tta tat Val Pro Val Lys Lys Glu Ala Thr Lys Leu Ser Glu Ala Glu Leu Tyr 165 170 175 aac aaa att caá gaa ctt gaa gag gga aaa gca gaa tta ttc gga tec Asn Lys lie Gln Glu Leu Glu Glu Gly Lys Ala Glu Leu Phe Gly Ser 180 185 190 gaa gaa gaa cgt act ttt act gag tta cea tat gaa gca cga tac aaa 624 Glu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Leu Pro Tyr Glu Ala Arg Tyr Lys 195 200 205 gca tgg aaa agt gaa aat gat gag ctt cgg gaa aat tat aga agg acc Ala Trp Lys Ser Glu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Arg Thr 210 215 220 tta gat aag ttt aat act gag caá ggt aag act acg aga tta gaa gaa Leu Asp Lys Phe Asn Thr Glu Gln Gly Lys Thr Thr Arg Leu Glu Glu 225 230 235 240 caá aat aag ctt gcg gac gcg aac tcg aaa age gtt tet aat agt aac Gln Asn Lys Leu Ala Asp Ala Asn Ser Lys Ser Val Ser Asn Ser Asn 245 250 255 gtg age ata aat cta tat aat gag cta cag gct gaa cat gat aag cta Val Ser lie Asn Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Ala Glu His Asp Lys Leu 260 265 270 cag act aaa cat gag gag cta ttg gct gaa cat gat gct ctt aaa gaa Gln Thr Lys His Glu Glu Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Leu Lys Glu 275 280 285 aaa caá gat aaa aat caá gaa ttc gat gac cgg age gtt tet act aat Lys Gln Asp Lys 'Asn Gln Glu Phe Asp Asp Arg Ser Val Ser Thr Asn 290 295 300 a9t 39t age gtg age acá cea tat aat aac cta ttg aat gaa tat gat Ser Gly Ser Val Ser Thr Pro Tyr Asn Asn Leu Leu Asn Glu Tyr Asp 305 310 315 320 gac cta ttg gct aaa cat ggt gag cta ttg agt gaa tat gat gct ctt Asp Leu Leu Ala Lys His Gly Glu Leu Leu Ser Glu Tyr Asp Ala Leu 325 330 335 aaa gaa aaa caá gat aaa aat caá gaa gct age agt gac aat att aat Lys Glu Lys Gln Asp Lys Asn Gln Glu Ala Ser Ser Asp Asn lie Asn 340 345 350 aga tet gtc tet gtc aaa gat aat gaa aaa gaa tta cat aac aaa att 1104 Arg Ser Val Ser Val Lys Asp Asn Glu Lys Glu Leu His Asn Lys lie 355 360 365 gca gac ctt gaa gag gaa agg ggt gaa cat cta gac aaa ata gat gaa 1152 Ala Asp Leu Glu Glu Glu' Arg Gly Glu His Leu Asp Lys lie Asp Glu 370 375 380 cta aaa gaa gaa cta aaa gca aag gaa aaa agt tea cae cae cae cae 1200 Leu Lys Glu Glu Leu Lys Ala Lys Glu Lys Ser Ser His His His His 385 390 395 400 cae cae tgc tga 1212 His His Cys <210> 14 <211> 403 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Híbrido de proteina M y proteína tipo' M de estreptococos del grupo A <400> 14 Met Ser Asp Asn lie Asn Arg Ser Val Ser Val Lys Asp Asn Glu Lys 1 5 10 15 Glu Leu His Asn Lys lie Ala Asp Leu Glu Glu Glu Arg Gly Glu His 20 30 Leu Asp Lys lie Asp Glu Leu Lys Glu Glu Leu Lys Ala Lys Glu Lys 35 40 45 Ser Ser Gly Ser Ala Asp His Pro Ser Tyr Thr Ala Ala Lys Asp Glu 50 55 ' 60 Val Leu Ser Lys Phe Ser Val Pro Gly His Val Trp Ala His Glu Arg 65 70 75 80 Glu Lys Asn Asp, Lys Leu Ser Ser Glu Asn Glu Gly Leu Lys Ala Gly 85 90 95 Leu Gln Glu Lys Glu Gln Ala Ser Glu Gly Val Ser Val Gly Ser Asp 100 105 110 Ala, Ser Leu His Asn Arg lie Thr Asp Leu Glu Glu Glu Arg Glu Lys 115 120 125 Leu Leu Asn Lys Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu His Lys Lys Asp His .130 135 140 Glu Gln Gly Thr Asn Ser Lys Asn Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ala 145 150 · 155 160 Val Pro Val Lys Lys Glu Ala Thr Lys Leu Ser Glu Ala Glu Leu Tyr 165 170 175 Asn Lys lié Gln Glu Leu Glu Glu Gly Lys Ala Glu Leu Phe Gly Ser 180 185 190 Glu Glu Glu Arg Thr Phe Thr Glu Leu Pro Tyr Glu Ala Arg Tyr Lys 195 200 205 Ala Trp Lys Ser Glu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Arg Thr 210 215 220 Leu Asp Lys Phe Asn Thr Glu Gln Gly Lys Thr Thr Arg Leu Glu Glu 225 230 235 240 Gln Asn Lys Leu Ala Asp Ala Asn Ser Lys Ser Val Ser Asn Ser Asn 245 250 255 Val Ser lie Asn Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Ala Glu His Asp Lys Leu 260 265 270 Gln Thr Lys His Glu Glu Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Leu Lys Glu 275 · 280 285 Lys Gln Asp Lys Asn Gln Glu Phe Asp Asp Arg Ser Val Ser Thr Asn 290 295 300 Ser Gly Ser Val Ser Thr Pro Tyr Asn Asn Leu Leu Asn Glu Tyr Asp 305 310 315 ¦ 320 Asp Leu Leu Ala Lys His Gly.Glu Leu Leu Ser Glu Tyr Asp Ala Leu .325 330 335 Lys Glu Lys Gln Asp Lys Asn Gln Glu Ala Ser Ser Asp Asn lie Asn 340 345 350 Arg Ser Val Ser Val Lys Asp Asn Glu Lys Glu Leu His Asn Lys lie 355 360 365 Ala Asp Leu Glu Glu Glu Arg Gly Glu His Leu Asp Lys lie Asp Glu 370 375 380 Leu .Lys Glu Glu Leu Lys Ala Lys Glu Lys Ser Ser His His His His 385 390 395 / 400 His His Cys <210> 15 <211> 1290 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> CDS <222> (1) .. (1287) <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Híbrido de proteína M y proteína tipo M de estreptococos del grupo A <400> 15 atg aac ggt gat ggt aat cct agg gaa gtt ata gaa gat ctt gca gca 48 Met Asn Gly Asp Gly Asn Pro Arg Glu Val lie Glu Asp Leu Ala Ala 1 5 10 15 aac aat ccc gca ata caá aat ata cgt tta cgt cae gaa aac aag gac 96 Asn Asn Pro Ala lie Gln Asn lie Arg Leu Arg His Glu Asn Lys Asp 20 25 ¦ 30 tta aaa gcg aga tta gag aat gca atg gaa gtt gca gga aga gat ttt 144 Leu Lys Ala Arg Leu Glu Asn Ala Met Glu Val Ala Gly Arg Asp Phe 35 40 45 aag aga gct etc gac gat cat agt gat tta gtc gca gaa aaa caá cgt 192 Lys Arg Ala Leu Asp Asp His Ser Asp Leu Val Ala Glu Lys Gln Arg 50 55 60 tta gaa gat tta gga caa aaa ttt gaa aga ctg aaa cag cgt tca gaa Leu Glu Asp Leu Gly Gln Lys Phe Glu Arg Leu Lys Gln Arg Ser Glu 65 70 75 80 ctc tac ctt cag caa tac tat gat aat aaa tca aat gga tat aaa ggt Leu Tyr Leu Gln Gln Tyr Tyr Asp Asn Lys Ser Asn Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 gac tgg tat gta caa cag tta gga tcc gat tca gta agt gga tta gag Asp Trp Tyr Val Gln Gln Leu Gly Ser Asp Ser Val Ser Gly Leu Glu 100 105 110 gtg gca gac ccc tct gat agt aag aaa ctt att gaa tta ggt ttg gct Val Ala Asp Pro Ser Asp Ser Lys Lys Leu lie Glü Leu Gly Leu Ala 115 120 125 aaa tac ctt aat gat aaa tta ccc ttt aaa act aaa gaa gat tca gag Lys Tyr Leu Asn Asp Lys Leu Pro Phe Lys Thr Lys Glu Asp Ser Glu 130 135 140 att tta tea gag tta cgt gat gta tta aaa aat ctg cag gag tct cea' lie Leu Ser Glu Leu Arg Asp Val Leu Lys Asn Leu Gln Glu Ser Pro 145 150 155 . 160 aaa agt act gag- act tct gct aat gga gct gat aaa tta gct gat gca Lys Ser Thr Glu Thr Ser Ala Asn Gly Ala Asp Lys Leu Ala Asp Ala 165 170 175 tac aac acá ttg ctt act gaa cat gag aaa ctc aga gat gag tat tat Tyr Asn Thr Leu Leu Thr Glu His Glu Lys Leu Arg Asp Glu Tyr Tyr 180- 185' 190 acá tta att gat gct aaa gaa gaa gaa ect agg tat aaa gca ttg ggt Thr Leu lie Asp Ala Lys Glu Glu Gl-u Pro Arg Tyr Lys Ala Leu Gly 195 200 205 acc ttg tta gat cag gtt acá caa tta tat act aaa cat aat agt aat 672 Thr Leu Leu Asp Gln Val Thr Gln Leu Tyr Thr Lys His Asn Ser Asn 210 215 220 tac caa caa tat aat gca caa gct ggc aga ctt gac ctg aga caa aag 720 Tyr Gln Gln Tyr Asn Ala Gln Ala Gly Arg Leu Asp- Leu Arg Gln Lys 225 230 235 240 gct gaa tat cta aaa ggc ctt aat gat tgg gct gag agg ctg tta caa 768 Ala Glu Tyr Leu Lys Gly Leu Asn Asp Trp Ala Glu Arg Leu Leu Gln 245 250 255 gag tta aat ggt acc aac aat gat ggt agg tct agg gac gtt acg gaa 816 Glu Leu Asn Gly Thr Asn Asn Asp Gly Arg Ser Arg Asp Val Thr Glu 260 265 270 gag att gca gca aac aat acc acá gta caa aat ata cgt tta cgt aac 864 Glu lie Ala Ala Asn Asn Thr Thr Val Gln Asn lie Arg Leu Arg Asn 275 280 285 gaa aac aag aac tta aaa gcg aaa aac gag gac tta gaa gcg aga tta 912 Glu Asn Lys Asn Leu Lys Ala Lys Asn Glu Asp Leu Glu Ala Arg Leu 290 295 300 gag aat gca atg aat gtt gca gga aga gat ttt aag aga gct gaa ttc 960 Glu Asn Ala Met Asn Val Ala Gly Arg Asp Phe Lys Arg Ala Glu Phe 305 310 315 320 gca cct ctt act cgt gct acá gca gac aat aaa gac gaa tta ata aaa 1008 Ala Pro Leu Thr Arg Ala Thr Ala Asp Asn Lys Asp Glu' Leu lie Lys 325 330 335 aga gct aac ggt tat gag ata cag aac cat cag tta acá gtt gag aat 1056 Arg Ala Asn Gly Tyr Glu lie Gln Asn His Gln Leu Thr Val Glu Asn 340 345 350 aaa aaa tta aaa act gat aag gaa cag tta acá aaa gag aat gat gat 1104 Lys Lys Leu Lys Thr Asp Lys Glu Gln Leu Thr Lys Glu Asn Asp Asp 355 360 3S5 tta aaa cae gtg aac ggt gat ggt aat cct agg gaa gtt ata gaa gat 1152 Leu Lys His Val Asn Gly Asp Gly Asn Pro Arg Glu Val lie Glu Asp 370 3.75 380 ctt gca gca aac aat ecc gca ata caá aat ata cgt tta cgt cae gaa 1200 Leu Ala Ala Asn Asn Pro Ala lie Gln Asn lie Arg Leu Arg His Glu 385 390 395 400. aac aag gac tta aaa gcg aga tta gag aat gca atg gaa gtt gca gga 1248 Asn Lys Asp Leu Lys Ala Arg Leu Glu Asn Ala Met Glu Val Ala Gly 405 410 415 aga gat ttt aag aga gct cae cae cae cae cae cae tgc taa 1290 Arg Asp Phe Lys Arg Ala His His His His His His Cys 420- 425 <210> 16 -<211> -429 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Híbrido de proteína M y proteína tipo M de estreptococos del grupo A <400> 15 Met Asn Gly Asp Gly Asn Pro Arg Glu Val lie Glu Asp Leu Ala Ala 1 5 10 15 Asn Asn Pro Ala lie Gln Asn lie Arg Leu Arg His Glu Asn Lys Asp 20 25 30 Leu Lys Ala Arg Leu Glu Asn Ala Met Glu Val Ala Gly Arg Asp Phe 35 40 45 Lys Arg Ala Leu Asp Asp His Ser Asp Leu Val Ala Glu Lys Gln Arg 50 55 60 Leu Glu Asp Leu Gly Gln Lys Phe Glu Arg Leu Lys Gln Arg Ser Glu 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Gln Tyr Tyr Asp Asn Lys Ser Asn Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 Asp Trp Tyr Val Gln Gln Leu Gly Ser Asp Ser Val Ser Gly Leu Glu 100 105 110 Val Ala Asp Pro Ser Asp Ser Lys Lys Leu lie Glu Leu Gly Leu Ala 115 120 125 Lys Tyr Leu Asn Asp Lys Leu Pro Phe Lys Thr Lys Glu Asp Ser Glu 130 135 140 lie Leu Ser Glu Leu Arg Asp Val Leu Lys ' Asn Leu Gln Glu Ser Pro 145 150 155 160 Lys Ser Thr Glu Thr Ser Ala Asn Gly Ala Asp Lys Leu Ala Asp Ala 165 170 175 Tyr Asn Thr Leu Leu Thr Glu His Glu Lys Leu Arg Asp Glu Tyr Tyr ""180 185 190 Thr Leu lie Asp Ala Lys Glu Glu Glu Pro Arg Tyr Lys Ala Leu Gly 195 200 205 ¦ Thr Leu Leu Asp Gln Val Thr Gln Leu Tyr Thr Lys His Asn Ser Asn 210 215 220 Tyr, Gln Gln Tyr Asn Ala Gln Ala Gly Arg Leu Asp Leu Arg Gln Lys 225 ' 230 235 240 Ala Glu Tyr Leu Lys Gly Leu Asn Asp Trp Ala Glu Arg Leu Leu Gln 245 250 255 Glu Leu Asn Gly Thr Asn Asn Asp Gly Arg Ser Arg Asp Val Thr Glu 260 265 270 Glu lie Ala Ala Asn Asn Thr Thr Val Gln Asn lie Arg Leu Arg Asn 275 280 285 Glu Asn Lys Asn Leu Lys Ala Lys Asn Glu Asp Leu Glu Ala Arg Leu 290 295 300 Glu Asn Ala Met Asn Val Ala Gly Arg Asp Phe Lys Arg Ala Glu Phe 305 310 315 320 Ala Pro Leu Thr Arg Ala Thr Ala Asp Asn Lys Asp Glu Leu lie Lys 325 330 335 Arg Ala Asn Gly Tyr Glu lie Gln Asn His Gln Leu Thr Val Glu Asn 340 345 350 Lys Lys Leu Lys Thr Asp Lys Glu Gln Leu Thr Lys Glu Asn Asp Asp 355 360 365 Leu Lys His Val Asn Gly Asp Gly Asn Pro Arg Glu Val lie Glu Asp 370 375 380 Leu Ala Ala Asn Asn Pro Ala lie Gln Asn lie Arg Leu Arg His Glu 385 390 395 400 Asn Lys Asp Leu Lys Ala Arg Leu Glu Asn Ala Met Glu Val Ala Gly 405 410 415 Arg Asp Phe Lys Arg Ala His His His His His His Cys 420 425 <210> 17 <211> 5347 <212> ADM <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Vector <400> 17 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240 acgtagtggg ccatcgccc't gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacáctc aaccctatct cggtctattc 360 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540 tccgctcatg. aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600 tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660 actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta* tcggtctgcg attccgactc 720 gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780 aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840 agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900 cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960 aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020 tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080 tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140 taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200 ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260 tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320 tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380 cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440 cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500 gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560 gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620 agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680 aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740 agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860 accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920 aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980 ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040 cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100 gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160 tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220 agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400 ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460 gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520 gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580 gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640 aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700 5 ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760 acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820 ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880 tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940 tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000 cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060 gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120 ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180 catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa- 3240 ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300. gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360 gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420 -|Q ¦ ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 34S0 atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600 tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660 ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720 aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780 atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840 cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900 gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960 tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020 agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080 gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140 ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200 15 catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260 tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320 tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380 gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440 ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500 tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560 catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620 cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680 tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740 ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800 ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860 cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920 0 gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcta atcataaaaa 4980 atttatttgc tttgtgagcg gataacaatt ataatagatt caattgtgag cggataacaa 5040 ttataataga ttcaattcta aatttacaag aatttcacac agaattcatt aaagaggaga 5100 aattacatat ggctagcatg actggtggac agcaaatggg tcgcggatcc gaattcgagc 5160 tccgtcgaca agcttgcggc cgcactcgag caccaccacc accaccactg agatccggct 5220 gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca 5280 taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata 5340 tccggat · 5347 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Secuencia de la marca carboxi terminal <400> 18 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Secuencia de la marca carboxi terminal <400> 19 Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims

109 NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1. - Un polipéptido híbrido que comprende por lo menos seis péptidos inmunógenos enlazados diferentes, en donde cada péptido comprende una porción amino-terminal de una proteína estreptocócica de por lo menos 30 aminoácidos, y en donde el polipéptido tiene un péptido amino-terminal que es reiterado como un péptido carboxi-terminal, y el polipéptido es capaz de inducir una respuesta inmune contra más de un antígeno de estreptococos del grupo A que comprende por lo menos M5, M6, M14, M19, M24 y M29. 2. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el péptido inmunógeno amino-terminal del polipéptido es M24. 3. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el polipéptido es recombinante, y los péptidos inmunógenos están enlazados en tándem, el polipéptido teniendo una estructura de M24-M5-M6-M19-M29-M14-M24. 4. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. 5. - Un polipéptido híbrido que comprende por lo menos siete 110 péptidos inmunógenos enlazados diferentes, en donde cada péptido comprende una porción amino-terminal de una proteína M estreptocócica de por lo menos 35 aminoácidos, y en donde el polipéptido tiene un péptido amino-terminal que es reiterado como un péptido carboxi-terminal, y el polipéptido es capaz de inducir una respuesta inmune contra más de un antígeno de estreptococos del grupo A que comprende por lo menos M2, M 1 , M22, M33, M43, M59 y M94. 6. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el péptido inmunógeno amino-terminal del polipéptido es M2. 7. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el polipéptido es recombinante, y los péptidos inmunógenos están enlazados en tándem, el polipéptido teniendo una estructura de M2-M43-M94-M22-M11-M59-M33-M2. 8.- El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. 9.- Un polipéptido híbrido que comprende por lo menos siete péptidos inmunógenos enlazados diferentes, en donde cada péptido comprende una porción amino-terminal de una proteína M estreptocócica de por lo menos 40 aminoácidos, y en donde el polipéptido tiene un péptido amino-terminal que es reiterado como un péptido carboxi-terminal, y el polipéptido es capaz de inducir una respuesta inmune contra más de un 111 antígeno de estreptococos del grupo A que comprende por lo menos M75, M76, M77, M89, M92, M101 y M114. 10. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el péptido ¡nmunógeno amino-terminal del polipéptido es M89. 11. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el polipéptido es recombinante, y los péptidos inmunógenos están enlazados en tándem, el polipéptido teniendo una estructura de M89-M101-M77-M114-M75- 76-M92-M89. 12.- El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. 13. - Un polipéptido híbrido que comprende por lo menos siete péptidos inmunógenos diferentes enlazados en tándem, en donde cada péptido comprende una porción amino-terminal de una proteína M estreptocócica de por lo menos 50 aminoácidos, y en donde el polipéptido tiene un péptido amino-terminal que es reiterado como un péptido carboxi-terminal, y el polipéptido es capaz de inducir una respuesta inmune contra más de un antígeno de estreptococos del grupo A que comprende por lo menos Spa, M1.0, M1.2, M3, M12, M18 y M28. 14. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el péptido ¡nmunógeno amino-terminal del polipéptido es M1.0. 112 15. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el polipéptido es recombinante, y los péptidos inmunógenos están enlazados en tándem, el polipéptido teniendo una estructura de M1.0-M12-Spa- 28-M3-M1.2- 18~ 1.0. 16. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. 17. - El polipéptido híbrido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3, 7, 11 y 15, caracterizado además porque los péptidos inmunógenos son enlazados por cuando menos dos aminoácidos codificados por una secuencia de ácido nucleico que es un sitio de reconocimiento de enzima de restricción. 18. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la secuencia de ácido nucleico es un sitio de reconocimiento de enzima de restricción, el sitio de reconocimiento siendo por lo menos uno de Bam \, C/al, EcoRI, H/ndIII, Kpn\, ?/col, Nhe\, Pml\, Psíl, Sa/l Xho\. 19. - El polipéptido híbrido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado además porque el polipéptido es capaz de inducir por lo menos un anticuerpo opsónico que no es un anticuerpo que reacciona en forma cruzada con los tejidos en un sujeto. 20. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el sujeto es un humano o un animal. 113 21. - El polipéptido híbrido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado además porque comprende una marca carboxi-terminal. 22. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la marca carboxi-terminal se selecciona del grupo que consiste de fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, hexahistidina, marca de epítope DYKDDDDK (SEQ ID NO: 18), marca de epítope DLYDDDDK (SEQ ID NO: 19), y GST. 23. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la marca carboxi-terminal es hexahistidina. 24. - El polipéptido híbrido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado además porque comprende por lo menos un aminoácido carboxi-terminal adicional. 25. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el aminoácido carboxi-terminal adicional es un D-aminoácido. 26. - El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el aminoácido carboxi-terminal adicional es cisteína. 27.- El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque comprende por lo menos un aminoácido carboxi-terminal adicional. 28.- El polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 114 27, caracterizado además porque el aminoácido carboxi-terminal adicional es cisteína. 29.- Un polipéptido híbrido que comprende la secuencia de aminoácidos. de SEQ ID NOS: 2, 4, 6 u 8. 30.- Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para un polipéptido híbrido de SEQ ID NOS: 2, 4, 6 u 8. 31. - Una construcción de expresión de ácido nucleico que comprende una secuencia de control de la expresión enlazada operablemente a un polinucleótido que codifica para un polipéptido híbrido de SEQ ID NOS: 2, 4, 6 u 8. 32. - La construcción de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque la secuencia de control de la expresión es un promotor inducibie. 33.- La construcción de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque el promotor inducibie se selecciona del grupo que consiste de un promotor lac, tac, trc, ara o trp, o un promotor del fago ?, promotor del fago T7 y promotor del fago T5. 34. - La construcción de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque el promotor inducibie es un promotor del fago T5. 35. - La construcción de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque la construcción comprende un vector de 115 expresión de ácido nucleico seleccionado del grupo que comprende un plásmido, fagémido, vector de lanzadera, cósmido y virus. 36. - La construcción de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque la construcción comprende un vector de expresión de ácido nucleico, en donde el vector es un plásmido. 37. - La construcción de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque el plásmido es pT5 (SEQ ID NO: 17). 38. - Una célula hospedera que contiene una construcción de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 37. 39.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada además porque la célula hospedera se selecciona del grupo que consiste de una bacteria, una célula de levadura, una célula de nematodo, una célula de insecto y una célula de mamífero. 40. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque la célula hospedera es una bacteria, en donde la bacteria es Escherichia coli. 41. - Un método para producir un polipéptido híbrido que comprende cultivar una célula hospedera que contiene un vector de expresión de ácido nucleico que comprende por lo menos una secuencia de control de la expresión enlazada operablemente a una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido híbrido de SEQ ID NOS: 2, 4, 6 u 8, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para la expresión del polipéptido. 42. - El método de conformidad con la reivindicación 41 , 116 caracterizado además porque la secuencia de control de la expresión es un promotor inducible. 43. - El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque el promotor inducible se selecciona del grupo que consiste de un promotor lac, tac, trc, ara o trp, o un promotor del fago ?, promotor del fago T7 y promotor del fago T5. 44. - El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque el promotor inducible es un promotor del fago T5. 45.- El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque el vector de expresión de ácido nucleico es pT5 (SEQ ID NO: 17). 46.- Un polipéptido híbrido que se produce de conformidad con el método de la reivindicación 45. 47.- Una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un polipéptido híbrido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, 29 y 46. 48. - Una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una mezcla de por lo menos dos de los polipéptidos híbridos de conformidad con las reivindicaciones 1 , 5, 9 y 13. 49. - La composición de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada además porque los polipéptidos comprenden péptidos inmunogenos enlazados en tándem, en donde dichos polipéptidos (por lo 1 17 menos dos) comprenden una estructura de M24-M5-M6-M19-M29-M14-M24, M2-M43-M94-M22-M1 1-M59-M33-M2, M89-M101-M77-M1 14-M75-M76-M92-M89, o M1.0-M12-Spa-M28-M3-M1.2-M18- 1.0. 50. - Una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una mezcla del polipéptido híbrido de conformidad con la reivindicación 13, con por lo menos uno de los polipéptidos híbridos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 5 ó 9. 51 . - La composición de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada además porque los polipéptidos comprenden péptidos inmunógenos enlazados en tándem, en donde el polipéptido de conformidad con la reivindicación 13 comprende una estructura de 1.0- 12-Spa-M28-M3-M1.2-M18-M1.0, y dicho otro polipéptido (por lo menos uno) comprende una estructura de 24-M5-M6-M19-M29-M14-M24, 2-M43-M94-M22-M1 -M59-M33- 2, o M89-M101-M77- 114- 75-M76- 92-M89. 52.- Una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una mezcla de por lo menos tres de los polipéptidos híbridos de conformidad con las reivindicaciones , 5, 9 y 13. 53.- La composición de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada además porque los polipéptidos comprenden péptidos inmunógenos enlazados en tándem, en donde dichos polipéptidos (por lo menos tres) comprenden una estructura de M24-M5-M6- 19- 29-M14-M24, 2-M43- 94-M22-M 11 - 59-M33-M2, M89- 101 -M77-M 1 14-M75-M76-M92- 89, o M .0-M12-Spa-M28-M3-M1.2- 18-M1.0. 1 18 54. - Una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una mezcla de polipéptidos híbridos de conformidad con las reivindicaciones 4, 8, 12 y 16. 55. - La composición de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque los polipéptidos están en cantidades equimolares. 56. - La composición de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque por lo menos uno de los polipéptidos híbridos incluye un péptido inmunógeno Spa. 57.- La composición de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque comprende un adyuvante. 58.- La composición de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada además porque el adyuvante es alumbre o adyuvante de Freund. 59.- La composición de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada además porque comprende un adyuvante, en donde dicho adyuvante es alumbre. 60. - El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 47, a una dosis suficiente para inducir anticuerpos específicos para uno o más polipéptidos híbridos, en donde los anticuerpos son opsónicos y no reaccionan en forma cruzada con los tejidos, para elaborar un medicamento para prevenir una infección microbiana. 61. - El uso para prevenir una infección como se reclama en la 119 reivindicación 60, en donde la infección microbiana es una infección estreptocócica. 62. - El uso para prevenir una infección como se reclama en la reivindicación 60, en donde la infección estreptocócica es una infección estreptocócica grupo A. 63. - El uso para prevenir una infección como se reclama en la reivindicación 60, en donde el medicamento es administrable mediante una vía seleccionada del grupo que consiste de enteral, parenteral, transdérmica, transmucosa, y por inhalación. 64.- El uso para prevenir una infección como se reclama en la reivindicación 60, en donde el medicamento comprende además un adyuvante. 65.- El uso para prevenir una infección como se reclama en la reivindicación 64, en donde el adyuvante es alumbre o adyuvante de Freund. 66.- El uso para prevenir una infección como se reclama en la reivindicación 60, en donde el sujeto es humano o un animal. 67 - Una pluralidad de anticuerpos producidos de conformidad con la reivindicación 60. 68. - La pluralidad de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada además porque los anticuerpos comprenden por lo menos un anticuerpo específico para un antígeno de proteína M no representado en un polipéptido híbrido. 69. - La pluralidad de anticuerpos de conformidad con la 1.20 reivindicación 68, caracterizada además porque el antígeno de proteína no representado en un polipéptido híbrido es M4. 70.- El uso de una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una pluralidad de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 67, para la elaboración de un medicamento para tratar o prevenir una infección microbiana.