CN116327901A - 一种预防棘球蚴病的疫苗组合物、及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含免疫量的SUMO‑EG95蛋白片段的融合蛋白或包含免疫量的ELP40‑SUMO‑EG95蛋白片段的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。本发明的疫苗组合物具有良好的免疫效果，可保护牛、羊免受棘球蚴虫的感染。其制备方法能在产业上大规模的生产和应用。

Description

一种预防棘球蚴病的疫苗组合物、及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于预防棘球蚴病的疫苗组合物、及其制备方法和应用，属于生物制药领域。

背景技术

包虫病(Hydatidosis，Hydatid Disease)又称棘球蚴病(Echinococcosis)或囊性包虫病(Cystic Echinococcosis，CE)，是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg)或多房棘球绦虫(E.multilocularis)的蚴虫感染牛、羊和寄生在人体肝、肺等脏器所引起的一种人兽共患寄生虫病，是中国卫健委规划防治的五大寄生虫病之一。

由于使用药物和包囊摘除的方法治疗包虫病的效果并不理想，因此对于该病来说目前主要以预防为主，基因工程疫苗以其高效性及特异性的特点成为预防该病最理想的方法。研究表明，EG95蛋白是一种能够用于预防棘球绦虫感染的保护性抗原。Lightowlers等将EG95蛋白与GST融合表达制备的基因工程亚单位疫苗，能对包虫病能起到很好的免疫保护作用，但因重组蛋白表达量偏低且不可溶，制约了该疫苗的大规模生产及应用。

因此，急需一种能大规模生产及应用且免疫效果良好的产品来预防和控制棘球蚴病。

发明内容

本发明提供了大肠杆菌可溶性表达EG95抗原蛋白的制备方法。

本发明提供了大肠杆菌高效表达EG95抗原蛋白的制备方法。

本发明提供了EG95抗原蛋白，其为EG95全长蛋白片段，具有良好的免疫原性。

本发明提供了含有EG95抗原蛋白的疫苗组合物。

本发明提供了保护牛免受棘球蚴虫的感染的疫苗组合物。

本发明提供了保护羊免受棘球蚴虫的感染的疫苗组合物。

本发明还提供了疫苗组合物在制备牛、羊免受棘球蚴虫的感染的药物中的应用。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

定义

术语“棘球蚴病”又称为包虫病。包虫病是由棘球属绦虫的细粒棘球绦虫等数种棘球绦虫的幼虫寄生于人、牛、羊等多种哺乳动物的脏器内而引起的一种危害极大的人畜共患寄生虫病，主要见于草地放牧的牛、羊等。本病的临床表现视包虫囊部位、大小和有无并发症而不同。

术语“EG95蛋白”是指位于细粒棘球绦虫六鈎蚴、可育囊生发层、原头蚴以及成虫体被上，可能在六鈎蚴钻穿小肠绒毛上皮层的过程中起重要作用。

术语“抗原(Antigen)”是指能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。

本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有棘球蚴虫蛋白抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强牛、羊等针对棘球蚴虫的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“SUMO”是指类泛素蛋白修饰分子，用于蛋白翻译后修饰方式。

所述“ELP40”是指类弹性蛋白多肽，人工合成的基因工程化多肽聚合物。

术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除棘球蚴虫蛋白抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括矿物油、铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206或Gel佐剂中的一种或几种。

术语“冻干保护剂”是指是除赋形剂外，给予药物有效成分在冷冻干燥过程及冻干后储存阶段保护药物药效的成分。

术语“剂型”是指药物制剂的形态。也指根据药物性质，以及治病和处方的要求制成的药剂(成品药)。合适的剂型是为了发挥药物的最佳疗效，减少毒副作用，以及便于使用、贮存和运输。

术语“注射剂(injection)”是指药物制成的供注入体内的无菌溶液(包括乳浊液和混悬液)以及供临用前配成溶液或混悬液的无菌粉末或浓溶液，可以是注射水针剂(溶媒为水)、注射油针剂(溶媒为油)；尚有用其它溶媒的注射剂，如乙醇(氢化可的松注射液的溶媒就是乙醇)、甘油、丙二醇(PEG)等。

术语“注射用粉末”是指在无菌环境下将药液冷冻，将原料药“掺”在某些辅料或溶在某些溶媒中，经过一定的加工处理制成不同形式的制剂。术语“预防”在涉及棘球蚴虫感染时是指抑制棘球蚴虫的复制、抑制棘球蚴虫的传播或防止棘球蚴虫在其宿主体内定居，以及减轻棘球蚴虫感染的疾病或病症的症状。

发明详述

本发明将编码EG95蛋白的核苷酸序列按照大肠杆菌密码子偏好性优化并合成，构建分泌表达EG95抗原蛋白的重组菌株。利用表达的EG95抗原蛋白制备疫苗，免疫牛和羊后均能够诱导较高水平的特异性抗体产生，可同时保护牛和羊免受棘球蚴虫的感染。

本发明提供了一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白或包含免疫量的ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白，以及药学上可接受的载体；所述SUMO-EG95蛋白片段为SEQ.ID No.3或其简并序列所编码，所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段为SEQ.ID No.4或其简并序列所编码。

本发明还提供了根据所述制备方法制备的EG95抗原蛋白；所述EG95抗原蛋白如SEQ ID NO.1所示序列编码。

作为较佳的实施方式，所述的疫苗组合物中，所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为≥25μg/mL。更佳地，所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为25～100μg/mL。更佳地，所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为25～50μg/mL。更佳地，所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为50～100μg/mL。

作为较佳的实施方式，所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为50μg/mL。

根据较佳的实施方式，所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量选自25μg/mL、26μg/mL、27μg/mL、28μg/mL、29μg/mL、30μg/mL、31μg/mL、32μg/mL、33μg/mL、34μg/mL、35μg/mL、36μg/mL、37μg/mL、38μg/mL、39μg/mL、40μg/mL、41μg/mL、42μg/mL、43μg/mL、44μg/mL、45μg/mL、46μg/mL、47μg/mL、48μg/mL、49μg/mL、50μg/mL、51μg/mL、52μg/mL、53μg/mL、54μg/mL、55μg/mL、56μg/mL、57μg/mL、58μg/mL、59μg/mL、60μg/mL、61μg/mL、62μg/mL、63μg/mL、64μg/mL、65μg/mL、66μg/mL、67μg/mL、68μg/mL、69μg/mL、70μg/mL、71μg/mL、72μg/mL、73μg/mL、74μg/mL、75μg/mL、76μg/mL、77μg/mL、78μg/mL、79μg/mL、80μg/mL、81μg/mL、82μg/mL、83μg/mL、84μg/mL、85μg/mL、86μg/mL、87μg/mL、88μg/mL、89μg/mL、90μg/mL、91μg/mL、92μg/mL、93μg/mL、94μg/mL、95μg/mL、96μg/mL、97μg/mL、98μg/mL、99μg/mL、100μg/mL。

作为较佳的实施方式，所述的疫苗组合物中，所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为≥25μg/mL。更佳地，所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为25～100μg/mL。更佳地，所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为25～50μg/mL。更佳地，所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为50～100μg/mL。

作为较佳的实施方式，所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为50μg/mL。

根据较佳的实施方式，所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量选自25μg/mL、26μg/mL、27μg/mL、28μg/mL、29μg/mL、30μg/mL、31μg/mL、32μg/mL、33μg/mL、34μg/mL、35μg/mL、36μg/mL、37μg/mL、38μg/mL、39μg/mL、40μg/mL、41μg/mL、42μg/mL、43μg/mL、44μg/mL、45μg/mL、46μg/mL、47μg/mL、48μg/mL、49μg/mL、50μg/mL、51μg/mL、52μg/mL、53μg/mL、54μg/mL、55μg/mL、56μg/mL、57μg/mL、58μg/mL、59μg/mL、60μg/mL、61μg/mL、62μg/mL、63μg/mL、64μg/mL、65μg/mL、66μg/mL、67μg/mL、68μg/mL、69μg/mL、70μg/mL、71μg/mL、72μg/mL、73μg/mL、74μg/mL、75μg/mL、76μg/mL、77μg/mL、78μg/mL、79μg/mL、80μg/mL、81μg/mL、82μg/mL、83μg/mL、84μg/mL、85μg/mL、86μg/mL、87μg/mL、88μg/mL、89μg/mL、90μg/mL、91μg/mL、92μg/mL、93μg/mL、94μg/mL、95μg/mL、96μg/mL、97μg/mL、98μg/mL、99μg/mL、100μg/mL。

作为较佳的实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述药学上可接受的载体包括佐剂或冻干保护剂；所述佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；优选地，所述佐剂为水包油包水乳剂；更优选地，所述佐剂为ISA 206；所述佐剂含量为5％-60％V/V，优选为30％-60％V/V，更优选为50％V/V；所述冻干保护剂选自糖、多元醇、聚合物、表面活性剂、盐、胺、或氨基酸。

作为较佳的实施方式，所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物的剂型为溶液型注射剂、混悬型注射剂、注射用粉末、缓释微球制剂、控释微球制剂、或缓控释植入剂。

作为较佳的实施方式，所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物的剂型为溶液型注射剂、混悬型注射剂、或注射用粉末。

作为较佳的实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。

为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

本发明还提供了所述的疫苗组合物在制备预防棘球蚴虫感染的药物中的应用。

作为较佳的实施方式，所述应用为在制备预防牛、羊棘球蚴虫感染的药物中的应用。

根据较佳的实施方式，所述疫苗组合物的给药方式选自皮下注射给药、口服给药、口腔给药、舌下给药、鼻腔给药、肺部给药、结肠给药、直肠给药、透皮给药。根据更佳的实施方式，所述疫苗组合物的给药方式为皮下注射给药。

本发明还提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)构建包含有SUMO-EG95蛋白片段的基因序列的表达载体；步骤(2)将所述步骤(1)的所述表达载体转化到大肠杆菌中，扩增所述转化了所述表达载体的大肠杆菌；步骤(3)诱导所述步骤(2)的转化的大肠杆菌，表达所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白；步骤(4)纯化所述步骤(3)所述表达的SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白；以及步骤(5)将所述步骤(4)纯化的SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白与所述药学上可接受的载体混合，乳化，得到所述疫苗组合物。

作为较佳的实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(1)中的所述表达载体为pSUMO质粒，所述pSUMO质粒核苷酸序列如SEQ.ID No.2所示；所述步骤(2)中所述大肠杆菌为BL21(DE3)；所述步骤(3)中诱导表达所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白的诱导剂为IPTG。

本发明还提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)构建包含有ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的基因序列的表达载体；步骤(2)将所述步骤(1)的所述表达载体转化到大肠杆菌中，扩增所述转化了所述表达载体的大肠杆菌；步骤(3)诱导所述步骤(2)的转化的大肠杆菌，表达所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白；步骤(4)纯化所述步骤(3)所述表达的ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白；以及步骤(5)将所述步骤(4)纯化的ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白与所述药学上可接受的载体混合，乳化，得到所述疫苗组合物。

作为较佳的实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(1)中的表达载体为pELP40质粒；所述步骤(2)中大肠杆菌为BL21(DE3)；所述步骤(3)中诱导表达所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白的诱导剂为IPTG。

本发明还提供了一种EG95抗原蛋白的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤(1)重组EG95蛋白片段的基因到克隆载体，获得重组EG95蛋白片段基因的克隆载体；步骤(2)扩增回收克隆载体的EG95蛋白片段基因，与pSUMO质粒进行连接；步骤(3)制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得所述DH5α大肠杆菌感受态细胞；步骤(4)将所述步骤(2)的所述重组EG95蛋白片段的基因的pSUMO质粒连接产物，转化到所述步骤(3)的所述DH5α大肠杆菌感受态细胞，筛选重组EG95蛋白片段的基因DH5α大肠杆菌转化子；步骤(5)进一步转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，以获得高表达量、分泌表达的EG95蛋白片段基因的大肠杆菌表达菌株；以及步骤(6)诱导表达所述步骤(5)的所述高表达量的、分泌表达的EG95蛋白片段基因的大肠杆菌表达菌株，获得所述EG95抗原蛋白；其中，所述EG95蛋白片段的基因序列如SEQID NO.1所示。

单独EG95在E.coli中不表达，本发明按照大肠杆菌密码子偏好性设计合成优化后的EG95基因序列，融合SUMO标签，可直接实现可溶性表达，克服了EG95抗原蛋白难以可溶性表达的问题。利用表达的EG95抗原蛋白制备的亚单位疫苗，在生物安全性上对动物的生长发育无不良反应，免疫原性较好，可同时应用于保护牛、羊免受棘球蚴虫的感染。

本发明还提供一种含有所述EG95蛋白基因序列的表达载体。

本发明还提供重组了所述带SUMO标签的EG95蛋白基因的大肠杆菌转化子。

下面通过具体实施方式来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

为更充分的体现本发明的优势与应用范畴，下面结合具体实例来进一步阐述本发明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

实施例1BL21(DE3)/pSUMO-EG95表达菌的构建

由苏州金唯智生物科技有限公司合成相应编码序列表SEQ ID NO.2所示表达载体的核苷酸序列，命名为pSUMO质粒。

将GeneBank中EG95的核苷酸序列(Genebank accession number:AF199354)进行密码子优化，优化后的序列(SEQ ID NO.1)由苏州金唯智生物科技有限公司进行合成，并克隆至pUC57载体上，得到pUC57-EG95质粒载体。以pUC57-EG95为模板，以EG95-F(TATAGGATCCATGGCTTTCCAGCTGT)、EG95-R(GCCGAAGCTTTTAGGTCAGAACAAC)为上、下游引物进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小(约500bp)，并用DNA胶回收试剂盒进行纯化，纯化后DNA片段经BamHI和HindIII双酶切后，与相同双酶切处理的pSUMO质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆。使用质粒提取试剂盒提取转化子质粒并进行双酶切鉴定，酶切鉴定正确的质粒进行测序分析，将验证正确的质粒命名为pSUMO-EG95，其中编码SUMO-EG95融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。将pSUMO-EG95转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，构建BL21(DE3)/pSUMO-EG95表达菌，保存于-80℃备用。

实施例2BL21(DE3)/pSUMO-EG95表达菌蛋白表达特性研究

2.1SUMO-EG95蛋白的表达

将BL21(DE3)/pSUMO-EG95表达菌划线于LB平板(含50μg/mL卡那霉素)上，37℃培养14小时。挑取单个菌落，接种于5mL LB液体培养基中(含50μg/mL卡那霉素)，37℃摇床(220r/min)培养10小时，按照1％接种量转接于含200mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)的500mL三角瓶中，摇床(37℃，220r/min)培养4小时，降温至28℃，加入终浓度为0.2mmol/L的异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)，继续培养8小时。取培养物于4℃，8000r/min离心10min，收集菌体，重悬于20mL PBS中，冰水浴中超声破碎30分钟，破碎条件为：工作5秒，间歇15秒，超声功率为400W。破碎液于4℃，10000r/min离心10min后取上清进行后续检测与纯化。

2.2SUMO-EG95的纯化

取2.1项中的菌体裂解液上清于1.5mL离心管中，加入终浓度为1％(v/v)的曲拉通X-114(Triton X-114)，涡旋振荡，样品在冰上放置10min，涡旋振荡冷却的样品后，离心管立即放入37℃水浴中温浴5min，使溶液变浑浊，然后将样品于37℃，10000r/min离心5min。离心后，目的蛋白将留在上层，而含有内毒素的洗涤剂将会以油滴的性状残留在离心管底部，循环操作3次。小心吸出上层水相，缓慢加入等体积饱和硫酸铵溶液，4℃搅拌1小时，离心收集沉淀，沉淀用等体积PBS重悬，加入10mmol/L咪唑，0.45μm过滤后采用蛋白层析纯化系统进行蛋白亲和层析纯化。层析介质为Ni Sepharose 6Fast Flow，收集洗脱产物，并透析至PBS中，无菌过滤后即为纯化后蛋白，并检测蛋白纯度、浓度和内毒素残留，可用于后续免疫评价。

2.3SUMO-EG95的鉴定

经SDS-PAGE检测，结果上清中可检测到大小为35KDa左右的目的条带，表明目的蛋白得到表达，蛋白表达水平为0.4g/L，蛋白纯度为70％以上，实现了产业上大规模表达EG95抗原蛋白。

实施例3BL21(DE3)/pELP40-SUMO-EG95表达菌的构建

以pSUMO为模板，以SUMO-BamHI-F(GCTAGGATCCATGTCGGACTCAG)、SUMO-EG95-R(CAGGCACAGCTGGAAAGCCATACCACCAATCT)为上、下游引物进行PCR扩增，获得SUMOF DNA片段；以pUC57-EG95为模板，以SUMO-EG95-F(ACAGAGAACAGATTGGTGGTATGGCTTTCC)、EG95-R(GCCGAAGCTTTTAGGTCAGAACAAC)为上、下游引物进行PCR扩增，获得EG95R DNA片段。再以SUMOF和EG95R DNA片段为模板，以SUMO-BamHI-F、EG95-R为上、下游引物进行重叠PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小(约770bp)，并用DNA胶回收试剂盒进行纯化，纯化后DNA片段经BamHI和HindIII双酶切后，与相同双酶切处理的pELP40质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆。使用质粒提取试剂盒提取转化子质粒并进行双酶切鉴定，酶切鉴定正确的质粒进行测序分析，将验证正确的质粒命名为pELP40-SUMO-EG95，其中编码ELP40-SUMO-EG95融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。将pELP40-SUMO-EG95转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，构建BL21(DE3)/pELP40-SUMO-EG95表达菌，保存于-80℃备用。

实施例4BL21(DE3)/pELP40-SUMO-EG95表达菌蛋白表达特性研究

4.1ELP40-SUMO-EG95蛋白的表达

将BL21(DE3)/p ELP40-SUMO-EG95表达菌划线于LB平板(含50μg/mL卡那霉素)上，37℃培养14小时。挑取单个菌落，接种于5mL LB液体培养基中(含50μg/mL卡那霉素)，37℃摇床(220r/min)培养10小时，按照1％接种量转接于含200mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)的500mL三角瓶中，摇床(37℃，220r/min)培养4小时，降温至28℃，加入终浓度为0.2mmol/L的异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)，继续培养8小时。取培养物于4℃，8000r/min离心10min，收集菌体，重悬于20mL PBS中，冰水浴中超声破碎30分钟，破碎条件为：工作5秒，间歇15秒，超声功率为400W。破碎液于4℃，10000r/min离心10min后取上清进行后续检测与纯化。

4.2ELP40-SUMO-EG95的纯化

取4.1项中的菌体裂解液上清，缓慢加入NaCl至终浓度为3mol/L，4℃搅拌30min，离心收集沉淀，沉淀用等体积PBS重悬，无菌过滤后即为纯化后蛋白，并检测蛋白纯度、浓度和内毒素残留，蛋白用于后续免疫评价。

4.3ELP40-SUMO-EG95的鉴定

SDS-PAGE结果显示上清中ELP40-SUMO-EG95分子量为50KDa左右，表明目的蛋白得到表达，蛋白表达水平为0.6g/L，蛋白纯度为90％以上，实现了产业上大规模表达EG95抗原蛋白。

实施例5EG95基因工程亚单位疫苗的制备

将实施例2制备得到的SUMO-EG95蛋白、实施例4制备得到的ELP40-SUMO-EG95蛋白分别加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800r/min乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为含EG95蛋白抗原的亚单位疫苗组合物。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本发明中，选用佐剂为双相佐剂(水包油包水乳剂)，例如可以是佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。制备的疫苗中各组分的具体配比见表1。

表1EG95蛋白亚单位疫苗组合物成分配比

实施例6EG95基因工程亚单位疫苗对羊的免疫原性试验

筛选羊棘球蚴(包虫)病抗原抗体阴性绵羊70只，随机分为7组，每组10只。第1组免疫疫苗1，第2组免疫疫苗2，第3组免疫疫苗3，第4组免疫疫苗4，第5组免疫疫苗5，第6组免疫疫苗6，第7组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部皮下注射1mL/只，对照组免疫等量的PBS+佐剂。首免后4周用相同免疫方式和免疫剂量进行第二次免疫。首免后4周、二免2周采血检测抗体。结果见表2、表3、表4、表5。

表2EG95基因工程亚单位疫苗对羊的抗体检测结果1

备注：S/P＝待检样品OD450/阳性对照(高免血清)OD450均值；S/P≥0.2，判定为阳性；S/P＜0.2，判定为阴性。

表3EG95基因工程亚单位疫苗对羊的抗体检测结果2

备注：S/P＝待检样品OD450/阳性对照(高免血清)OD450均值；S/P≥0.2，判定为阳性；S/P＜0.2，判定为阴性。

表4EG95基因工程亚单位疫苗对羊的抗体检测结果3

备注：S/P＝待检样品OD450/阳性对照(高免血清)OD450均值；S/P≥0.2，判定为阳性；S/P＜0.2，判定为阴性。

表5EG95基因工程亚单位疫苗对羊的抗体检测结果4

备注：S/P＝待检样品OD450/阳性对照(高免血清)OD450均值；S/P≥0.2，判定为阳性；S/P＜0.2，判定为阴性。

结果显示，EG95基因工程亚单位疫苗对羊具有良好的免疫原性，抗体检测均为阳性。表明本发明的EG95基因工程亚单位疫苗采用截短的EG95蛋白抗原，免疫效果良好，可保护羊免受棘球蚴虫的感染。

实施例7EG95基因工程亚单位疫苗对牛的免疫原性试验

筛选牛棘球蚴(包虫)病抗原抗体阴性牛35头，随机分为7组，每组5只。第8组免疫疫苗1，第9组免疫疫苗2，第10组免疫疫苗3，第11组免疫疫苗4，第12组免疫疫苗5，第13组免疫疫苗6，第14组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部皮下注射2mL/头，对照组免疫等量的PBS+佐剂。首免后4周用相同免疫方式和免疫剂量进行第二次免疫。首免后4周、二免2周采血检测抗体。结果见表6、表7、表8、表9。

表6EG95基因工程亚单位疫苗对牛的抗体检测结果1

备注：S/P＝待检样品OD450/阳性对照(高免血清)OD450均值；S/P≥0.2，判定为阳性；S/P＜0.2，判定为阴性。

表7EG95基因工程亚单位疫苗对牛的抗体检测结果2

备注：S/P＝待检样品OD450/阳性对照(高免血清)OD450均值；S/P≥0.2，判定为阳性；S/P＜0.2，判定为阴性。

表8EG95基因工程亚单位疫苗对牛的抗体检测结果3

备注：S/P＝待检样品OD450/阳性对照(高免血清)OD450均值；S/P≥0.2，判定为阳性；S/P＜0.2，判定为阴性。

表9EG95基因工程亚单位疫苗对牛的抗体检测结果4

备注：S/P＝待检样品OD450/阳性对照(高免血清)OD450均值；S/P≥0.2，判定为阳性；S/P＜0.2，判定为阴性。

结果显示，EG95基因工程亚单位疫苗对牛具有良好的免疫原性，抗体检测均为阳性。表明本发明的EG95基因工程亚单位疫苗采用截短的EG95蛋白抗原，免疫效果良好，可保护牛免受棘球蚴虫的感染。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 一种预防棘球蚴病的疫苗组合物、及其制备方法和应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 471

<212> DNA

<213> 棘球绦虫

<400> 1

atggctttcc agctgtgcct gatcctgttc gctacctctg ttctggctca ggaatacaaa 60

ggtatgggtg ttgaaacccg taccaccgaa accccgctgc gtaaacactt caacctgacc 120

ccggttggtt ctcagggtat ccgtctgtct tgggaagttc agcacctgtc tgacctgaaa 180

ggtaccgaca tctctctgaa agctgttaac ccgtctgacc cgctggttta caaacgtcag 240

accgctaaat tctctgacgg tcagctgacc atcggtgaac tgaaaccgtc taccctgtac 300

aaaatgaccg ttgaagctgt taaagctaaa aaaaccatcc tgggtttcac cgttgacatc 360

gaaaccccgc gtgctggtaa aaaagaatct accgttatga cctctggttc tgctctgacc 420

tctgctatcg ctggtttcgt tttctcttgc atcgttgttg ttctgaccta a 471

<210> 2

<211> 5630

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 2

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100

agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atgatgtcgg actcagaagt caatcaagaa 5160

gctaagccag aggtcaagcc agaagtcaag cctgagactc acatcaattt aaaggtgtcc 5220

gatggatctt cagagatctt cttcaagatc aaaaagacca ctcctttaag aaggctgatg 5280

gaagcgttcg ctaaaagaca gggtaaggaa atggactcct taagattctt gtacgacggt 5340

attagaattc aagctgatca gacccctgaa gatttggaca tggaggataa cgatattatt 5400

gaggctcaca gagaacagat tggtggtgga tccgaattcg agctccgtcg acaagcttgc 5460

ggccgcactc gagcaccacc accaccacca ctgagatccg gctgctaaca aagcccgaaa 5520

ggaagctgag ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc 5580

taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat 5630

<210> 3

<211> 771

<212> DNA

<213> 棘球绦虫

<400> 3

atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcgt 60

gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120

aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180

gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaattcaag ctgatcagac ccctgaagat 240

ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggtggatcc 300

atggctttcc agctgtgcct gatcctgttc gctacctctg ttctggctca ggaatacaaa 360

ggtatgggtg ttgaaacccg taccaccgaa accccgctgc gtaaacactt caacctgacc 420

ccggttggtt ctcagggtat ccgtctgtct tgggaagttc agcacctgtc tgacctgaaa 480

ggtaccgaca tctctctgaa agctgttaac ccgtctgacc cgctggttta caaacgtcag 540

accgctaaat tctctgacgg tcagctgacc atcggtgaac tgaaaccgtc taccctgtac 600

aaaatgaccg ttgaagctgt taaagctaaa aaaaccatcc tgggtttcac cgttgacatc 660

gaaaccccgc gtgctggtaa aaaagaatct accgttatga cctctggttc tgctctgacc 720

tctgctatcg ctggtttcgt tttctcttgc atcgttgttg ttctgaccta a 771

<210> 4

<211> 1371

<212> DNA

<213> 棘球绦虫

<400> 4

gtgggtgttc cgggcgtggg tgttccgggt ggcggtgtgc cgggcgcagg tgttcctggt 60

gtaggtgtgc cgggtgttgg tgtgccgggt gttggtgtac caggtggcgg tgttccgggt 120

gcaggcgttc cgggtggcgg tgtgccgggc gtgggtgttc cgggcgtggg tgttccgggt 180

ggcggtgtgc cgggcgcagg tgttcctggt gtaggtgtgc cgggtgttgg tgtgccgggt 240

gttggtgtac caggtggcgg tgttccgggt gcaggcgttc cgggtggcgg tgtgccgggc 300

gtgggtgttc cgggcgtggg tgttccgggt ggcggtgtgc cgggcgcagg tgttcctggt 360

gtaggtgtgc cgggtgttgg tgtgccgggt gttggtgtac caggtggcgg tgttccgggt 420

gcaggcgttc cgggtggcgg tgtgccgggc gtgggtgttc cgggcgtggg tgttccgggt 480

ggcggtgtgc cgggcgcagg tgttcctggt gtaggtgtgc cgggtgttgg tgtgccgggt 540

gttggtgtac caggtggcgg tgttccgggt gcaggcgttc cgggtggcgg tgtgccgggc 600

ggatccatgt cggactcaga agtcaatcaa gaagctaagc cagaggtcaa gccagaagtc 660

aagcctgaga ctcacatcaa tttaaaggtg tccgatggat cttcagagat cttcttcaag 720

atcaaaaaga ccactccttt aagaaggctg atggaagcgt tcgctaaaag acagggtaag 780

gaaatggact ccttaagatt cttgtacgac ggtattagaa ttcaagctga tcagacccct 840

gaagatttgg acatggagga taacgatatt attgaggctc acagagaaca gattggtggt 900

atggctttcc agctgtgcct gatcctgttc gctacctctg ttctggctca ggaatacaaa 960

ggtatgggtg ttgaaacccg taccaccgaa accccgctgc gtaaacactt caacctgacc 1020

ccggttggtt ctcagggtat ccgtctgtct tgggaagttc agcacctgtc tgacctgaaa 1080

ggtaccgaca tctctctgaa agctgttaac ccgtctgacc cgctggttta caaacgtcag 1140

accgctaaat tctctgacgg tcagctgacc atcggtgaac tgaaaccgtc taccctgtac 1200

aaaatgaccg ttgaagctgt taaagctaaa aaaaccatcc tgggtttcac cgttgacatc 1260

gaaaccccgc gtgctggtaa aaaagaatct accgttatga cctctggttc tgctctgacc 1320

tctgctatcg ctggtttcgt tttctcttgc atcgttgttg ttctgaccta a 1371

Claims (9)

1.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白或包含免疫量的ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白，以及药学上可接受的载体；

所述SUMO-EG95蛋白片段为SEQ.ID No.3或其简并序列所编码，所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段为SEQ.ID No.4或其简并序列所编码。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为≥25μg/mL；优选地，所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为25～100μg/mL；更优选地，所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为25～50μg/mL；更优选地，所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为50～100μg/mL；

所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为≥25μg/mL；优选地，所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为25～100μg/mL；更优选地，所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为25～50μg/mL；更优选地，所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白含量为50～100μg/mL。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括佐剂或冻干保护剂；所述佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；优选地，所述佐剂为水包油包水乳剂；更优选地，所述佐剂为ISA 206；

所述佐剂含量为5％-60％V/V，优选为30％-60％V/V，更优选为50％V/V；

所述冻干保护剂选自糖、多元醇、聚合物、表面活性剂、盐、胺、或氨基酸。

4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物的剂型为溶液型注射剂、混悬型注射剂、或注射用粉末。

5.权利要求1～4任一项所述的疫苗组合物在制备预防棘球蚴虫感染的药物中的应用；优选地，所述应用为在制备预防牛、羊棘球蚴虫感染的药物中的应用。

6.一种制备权利要求1所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：

步骤(1)构建包含有SUMO-EG95蛋白片段的基因序列的表达载体；

步骤(2)将所述步骤(1)的所述表达载体转化到大肠杆菌中，扩增所述转化了所述表达载体的大肠杆菌；

步骤(3)诱导所述步骤(2)的转化的大肠杆菌，表达所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白；

步骤(4)纯化所述步骤(3)所述表达的SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白；以及

步骤(5)将所述步骤(4)纯化的SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白与所述药学上可接受的载体混合，乳化，得到所述疫苗组合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述步骤(1)中的所述表达载体为pSUMO质粒，所述pSUMO质粒核苷酸序列如SEQ.ID No.2所示；所述步骤(2)中所述大肠杆菌为BL21(DE3)；所述步骤(3)中诱导表达所述SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白的诱导剂为IPTG。

8.一种制备权利要求1所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：

步骤(1)构建包含有ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的基因序列的表达载体；

步骤(2)将所述步骤(1)的所述表达载体转化到大肠杆菌中，扩增所述转化了所述表达载体的大肠杆菌；

步骤(3)诱导所述步骤(2)的转化的大肠杆菌，表达所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白；

步骤(4)纯化所述步骤(3)所述表达的ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白；以及

步骤(5)将所述步骤(4)纯化的ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白与所述药学上可接受的载体混合，乳化，得到所述疫苗组合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述步骤(1)中的表达载体为pELP40质粒；所述步骤(2)中大肠杆菌为BL21(DE3)；所述步骤(3)中诱导表达所述ELP40-SUMO-EG95蛋白片段的融合蛋白的诱导剂为IPTG。