FORMULACIONES DE PROTEÍNA DE ALTA CONCENTRACIÓN Y MÉTODO DE FABRICACIÓN
El tratamiento terapéutico con algunas proteínas, y particularmente inmunoglobulinas, requiere la administración de una dosis grande. Debido a su habilidad única para reconocer y unir a objetivos específicos, inmunoglobulinas en particular mantener gran promesa para tratamientos terapéuticos en las luchas contra enfermedades tales como cáncer y artritis. Algunas desventajas al tratamiento con inmunoglobulinas, sin embargo, incluyen baja potencia en una base de masa debido a un peso molecular típicamente grande, una solubilidad relativamente baja en agua y requerimientos para almacenamiento a largo plazo efectivo. Por ejemplo, anticuerpos IgG monoclonales típicos tienen peso moleculares de aproximadamente 1 50kDa, tienen un límite de solubilidad acuosa de menos de 50mg/ml_ y deben liofilizarse para almacenamiento a largo plazo. También, debido a la potencia baja observada en una base de masa , los anticuerpos terapéuticos comercialmente disponibles tienen regímenes de dosificación que requieren usualmente administración d entre 100 mg y 1000 mg por dosis. Baja solubilidad en agua significa que varios mililitros de solución de anticuerpo deben administrarse por administración de una dosis única. Aún suponiendo solubilidad tan alta como 50 mg/mL para el anticuerpo, una dosis de 1 00 mg requeriría la administración de 2 ml_ de solución, mientras que una dosis de 1000 mg requeriría la administración de 20 mL de solución. Estos volúmenes son d masiado grandes para aplicaciones de administración tales como inyecciones subcutáneas (SC), intramusculares (IM), intratumorales (IT) e intraarticulares (IA), que se limitan generalmente a un volumen de 1 mL. Por lo tanto, ha sido necesario administrar estos agentes terapéuticos como infusiones IV. Tales infusiones IV son consumidoras de tiempo e inconvenientes para pacientes y equipo médico. Una limitación adicional impuesta por la solubilidad relativamente baja de proteínas de anticuerpo se relaciona con su producción. Después de una fermentación a gran escala con frecuencia es deseable mantener material en una etapa intermedia para combinar varios grupos para crear un lote grande de producto. El volumen del mat rial intermedio debe ser suficientemente pequeño para almacenarse convenientemente en el equipo de fabricación. La diafiltración de soluciones diluidas puede conducir a la precipitación y bioincrustación de membrana. La liofilización a gran escala requiere inversiones significativas en espacio, equipo capital y costos de operación. Se han hecho intentos para preparar soluciones de anticuerpo altamente concentradas por control cuidadoso de pH, resistencia iónica y tipo de regulador, pero muchos anticuerpos y otras proteínas no pu d n disolverse en altas concentraciones aún bajo las mejores condición s. También, aún cuando es posible disolver el anticuerpo a una alta concentración, aún es difícil mantener la estabilidad de proteína adecuada en tales soluciones de alta concentración durante almacenamiento a largo plazo. En particular, el riesgo de formación de agregados no nativos altamente indeseables increm nta a medida que la concentración de la proteína en la solución aumenta. Además, la alta viscosidad mostrada por algunas soluciones de anticuerpo de alta concentración con frecuencia complica, y en algunos casos impedir, procesamiento práctico de los materiales durante las operaciones de fabricación. Por razones de estabilidad del producto, los anticuerpos terapéuticos se suministran actualmente a prácticas clínicas en forma liofilizada. Los frascos liofilizados se almacenan bajo condiciones refrigeradas y deben reconstituirse antes de utilizarse. El procedimiento de reconstitución consume tiempo debido a que la torta liofilizada no se r constituye rápidamente. También, la reconstitución puede resultar en la degradación de la proteína terapéutica a través de la espumacion y desnaturalización. El proceso de reconstitución puede, por lo tanto, conducir a la variabilidad en tanto la dosis de administración como la actividad/inmunogenicidad relativa del agente terapéutico. Existe una necesidad significativa para formulaciones de proteína de alta concentración mejoradas, y existe especialmente una necesidad para formulaciones de anticuerpo adecuadas para la administración por aplicaciones tales como inyección SC, I , IT e IA. También existe una necesidad significativa para técnicas mejoradas para procesamiento y almacenamiento de productos intermedios durante la fabricación de anticuerpo y otros productos de proteína. Existe una necesidad adicional para técnicas de almacenamiento a largo plazo de anticuerpos y otras proteínas que reducen o eliminan los problemas con reconstitución de productos liofilizados.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Con la presente invención, se ha encontrado que las formulaciones de proteína concentradas estables pueden prepararse sin requerir liofilización. La formulación de proteína concentrada es una mezcla de la proteína en la forma precipitada y un medio líquido, típicamente un medio acuoso. Se ha encontrado que la proteína precipitada en la mezcla concentrada es altamente estable, permitiendo ventajosamente el almacenamiento por un tiempo extendido sin el gasto y complejidad incluidos con liofilización . También, la mezcla concentrada es fácilmente diluible para reconstituir la proteína precipitada en una formulación más diluida , como se puede desear para procesamiento adicional o para administración. Durante la fabricación de la mezcla concentrada y/o durante la dilución subsecuente para preparar una formulación más diluida, aditivos, tales como estabilizadores de proteína y agentes tensoactivos, pueden agregarse para impartir las características deseadas a la composición farmacéutica . La presente invención es particularmente útil con proteínas macromoleculares, y especialmente anticuerpos, que con frecuencia son difíciles de formular en formulaciones inyectables y suficientemente concentradas para administración por vías tales como inyección IM, SC, IT o IA. Con la presente invención, las suspensiones concentradas aún inyectables de proteínas, y específicamente anticuerpos, pueden prepararse, que son adecuadas para administración por vías tales como inyección IM, SC, IT, e IA. En un aspecto, la presente invención proporciona un m ' todo para preparar composiciones farmacéuticas incluyendo una proteína. La composición farmacéutica podría ser una composición final diseñada para la administración, o puede ser una composición intermedia que se diseña para almacenamiento extendido esperando procesamiento o dilución adicional para preparar una composición final para administración. En una solicitud particularmente ventajosa, el método incluyen precipitación de una proteína de interés de una solución en la cual la proteína se disuelve al contactar la solución con un agente de precipitación adecuado; seguido por el retiro de suficiente líquido de la mezcla resultante para preparar una mezcla concentrada que comprende al menos 8 por ciento de la proteína precipitada, y preferentemente al menos 1 0 por ciento en peso de la proteína precipitada. También, para almacenamiento mejorado y reconstitución de la proteína precipitada, la mezcla concentrada debe incluir preferentemente al menos 20 por ciento en peso de agua, y más preferentemente al menos 30 por ciento en peso de agua. Esto es un contraste para tortas liofilizadas que típicamente incluyen significativamente menos de 10 por ciento en peso de agua y pueden ser muy difíciles de reconstituir para administración. En una modalidad particularmente preferida de este aspecto de la invención, el agente de precipitación es un copolímero biocompatible, y preferentemente un polímero de gelación térmica inversa. El polímero biocompatible no solamente causa la precipitación de la proteína, sino que también la presencia del polímero biocompatible en la mezcla concentrada proporciona protección adicional para estabilizar la proteína durante el almacenamiento por un tiempo extendido.
En una aplicación del método, la mezcla concentrada se diseña para almacenamiento extendido de la proteína de interés en una forma estable. En esta situación , la mezcla concentrada comprenderá típicamente al menos 40 por ciento en peso de la proteína precipitada, y preferentemente una concentración aún más alta de la proteína. En una mejora , un estabilizador de proteína, tal como sucrosa, trehalosa o manitol se agrega durante el método para mejorar además la estabilidad de la proteína precipitada en la mezcla concentrada para almacenamiento extendido. También, los polioles y/o agent s t nsoactivos, tales como un manitol o un polisorbato, pueden incluirse ventajosamente en la mezcla concentrada para mejorar la inyectabilidad de una composición farmacéutica final. En un aspecto, la invención proporciona un método para preparar una composición farmacéutica, típicamente en una formulación final designada para administración. El método incluye diluir una mezcla concentrada de la proteína precipitada para preparar una mezcla más diluida de la proteína precipitada. Típicamente, la dilución se realizará en una manera para prevenir que cualquier porción substancial de la prot ína se disuelva en el medio líquido de la mezcla diluida. Al mantener la cantidad de proteína disuelta en una cantidad pequeña o insignificante, el potencial para la formación de agregados no nativos indeseables se reduce significativamente, lo que es benéfico para estabilidad a largo plazo de la formulación. En otro aspecto, la invención proporciona un método para almacenar una proteína por un tiempo extendido, típicamente por al menos un mes y con frecuencia por 3 meses o más. La proteína se almacena en una mezcla concentrada de la proteína en forma precipitada. Para mejorar además la estabilidad durante el almacenamiento, la mezcla concentrada puede congelarse. En otra modalidad, la mezcla concentrada puede convertirse en una forma de gel cuando la mezcla concentrada incluye una concentración suficiente de un polímero de gelación térmica inversa biocompatible. En otro aspecto, fa invención proporciona un método para empacar una proteína. El método incluye empacar una cantidad de una mezcla concentrada de una proteína precipitada en un recipiente sellado. En una modalidad preferida, la cantidad contenida incluye una dosis única de la proteína para administración y más preferentemente la cantidad contenida tiene un volumen de no más de 1 mL. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una mezcla concentrada de una proteína precipitada. En una modalidad preferida, la composición incluye una alta concentración de la proteína, y también una cantidad significativa de agua para facilitar la fácil reconstitución de la proteína precipitada en una formulación más diluida. En una modalidad, la composición se diseña como una composición final para administración, y preferentemente es inyectable para administración de la composición por una técnica tal como inyección IM, SC, IT o IA. En una modalidad, la composición farmacéutica se empaca de manera que la composición farmacéutica incluye una dosis única de la proteína precipitada contenida en un recipiente sellado, tal como un frasco o bot lia. En el caso de administración por vías tales como inyección IM, SC, IT o IA, la cantidad contenida de la composición farmacéutica es preferentemente no más de 1 ml_. En otra modalidad, la composición farmacéutica se contiene dentro de un dispositivo de inyección , tal como una jeringa. En otro aspecto, la invención proporciona un método para administrar la composición farmacéutica mediante inyección a un paciente, y preferentemente por una vía tal como inyección IM, SC, IT o IA. El paciente puede ser un paciente animal o humano. Tanto la breve descripción anterior como la siguiente descripción detallada incluyendo los ejemplo, son ejemplificativas y no pretenden proporcionar explicación de la invención según se enmienda. Otros aspectos y nuevas características serán fácilmente aparentes para aquellos expertos en la materia a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un diagrama de bloques del proceso generalizado que muestra una modalidad del método de la presente invención para preparar una mezcla concentrada que contiene una alta concentración de proteína precipitada. La figura 2 es un diagrama de bloques del proceso generalizado que muestra una modalidad del método de la pres nte invención en el cual una mezcla concentrada de proteína precipitada se convierte en una forma de gel para estabilidad durante almacenamiento. La figura 3 es un diagrama de bloques d I proc so generalizado que muestra una modalidad del método de la presente invención en el cual una mezcla concentrada de proteína precipitada se congela para estabilidad durante uso. La figura 4 es un diagrama de bloques del proceso generalizado que muestra una modalidad del método de la présente invención en el cual una mezcla concentrada de proteína precipitada se diluye al último para preparar una mezcla más diluida de la proteína precipitada. La figura 5 es un diagrama de bloques del proceso generalizado que muestra una modalidad del método de la presente invención en el cual una mezcla concentrada de proteína precipitada s empaca.
DESCRIPCIÓN DETALLADA En un aspecto, la invención proporciona un método para preparar una composición farmacéutica en la forma de una formulación concentrada de una proteína. Refiriéndose a la figura 1 , diagrama d bloques del proceso generalizado de una modalidad del método se muestra . Como se muestra en la figura 1 , una primer etapa es preparación de la solución 1 02, durante la cual una solución de una proteína se hace con la proteína disueita en un medio líquido. Después de la preparación de la solución 102, la proteína se precipita durante la precipitación de la proteína 1 04, durante la cual la solución de la proteína se contacta con un agente de precipitación, causando que la proteína se precipite fuera de la solución. La precipitación de la prot ína 104 resulta en una m zcla qu incluye la proteína precipitada y medio líquido. Después de la precipitación de la proteína 104, el líquido se separada de la mezcla en una etapa de separación de líquido 108 para producir un líquido separado 1 1 0 y una mezcla concentrada 1 12. La mezcla concentrada 1 12 incluye una alta concentración de la proteína precipitada. Por proteína precipitada, se entiende la proteína en una forma particulada como precipitada de la solución durante la precipitación de la proteína 104. La proteína precipitada es completamente reversible y contiene moléculas de proteína en las cuales la estructura secundaria de la proteína nativa no se ha perturbado substancialmente. Esto debe contrastarse con agregados irreversibles indeseables que caen fuera de la solución y contiene moléculas de proteína con estructura secundaria substancialmente no nativa. La preparación de la solución 1 02 puede realizarse en cualquier manera para disolver la proteína en un medio líquido adecuado. El medio líquido típicamente será un líquido acuoso de salinidad, pH y resistencia iónica adecuados para disolver la proteína en la emisión a la concentración deseada. La concentración de la proteína en la solución variará dependiendo de la proteína particular que se procesa. Sin embargo, no es necesario que la proteína se concentre altamente en la solución. Preferentemente, se prefiere generalmente que la concentración de la proteína en la solución sea relativamente baja, para facilidad de preparación y manejo de la solución durante procesamiento. Tal s soluciones de protetna de concentración relativamente baja se preparan frecu nt ment durante las op raciones d fabricación. En la mayoría de las situación s, la concentración de la proteína en la solución no es más grande que 50 mg/mL, más típicamente no más grande que 25 mg/mL, y aún más típicamente no más grande que 10 mg/mL. Las concentración s muy bajas se prefieren particularmente para proteínas extremadam nte grandes, tales como anticuerpos. La proteína utilizada con el método de la presente invención puede ser cualquier proteína para la cual se desea una formulación altamente concentrada. Las proteínas típicamente tienen pesos moleculares de 15 kD o más altos. Se prefieren para uso con las presentes invenciones las proteínas de peso molecular más alto, aqu Has que tiene un peso molecular de al menos 1 00 kD, para las cuales con frecuencia es difícil o no posible preparar a altas concentraciones en solución. Estas proteínas de peso molecular más alto se refieren en la presente como proteínas macromoleculares. Las proteínas de p so molecular inferior, sin embargo, también pueden procesarse ventajosamente con la presente invención . Las proteínas de peso molecular aún inferior que pueden disolverse en altas concentraciones en medios acuosos se benefician de encontrarse en el estado precipitado más estable con la presente invención. Esta estabilidad de formulación mejorada es particularmente útil para almacenamiento extendido de proteínas, tal cómo puede ocurrir entre ciertas operaciones de procesamiento durante la fabricación. Algunos ejemplos específicos de proteínas para utilizarse con la presente invención se listan en la Pat nte de EE. UU. No. 6,267 ,958, los contenidos totales de la cual se incorporan n la pr s nte para r f rencia como se stabl ce en la pres nte n totalidad . Algunas proteínas preferidas para utilizars con la presente invención incluyen factores de crecimiento, receptores solubles, citoquinas, factores de hemofilia y anticuerpos. Los anticuerpos, que típicamente tienen un peso molecular de aproximadamente 150k Daltones o más, se prefieren particularmente como proteínas para utilizarse con la presente invención. Cualquier anticuerpo puede utilizarse con la presente invención. La Patente de EE. UU. No. 6,267,958 trata algunos anticuerpos específicos para utilizarse con la presente invención. Por ejemplo, el anticuerpo podría ser o incluir un anticuerpo monoclonal, una composición que tiene especificidad poliepitópica, un anticuerpo bioespecífico, un diacuerpo, una molécula d cadena única, y un fragmento de anticuerpo. En una modalidad preferida, la proteína debe ser típicamente esencialmente pura, en que debe encontrarse substancialmente en la ausencia de proteínas contaminantes. Preferentemente, la proteína es al menos 90 por ciento en peso pura, más preferentemente al menos 95 por ciento en peso pura y aún más preferentemente al menos 99 por ciento n p so pura antes de la preparación de la solución 102. Además, la proteína típicamente no se purifica durante las etapas de preparación de la solución 1 02, la precipitación de la proteína 104 o la separación de líquido 108. Se prefiere que el método substancialmente efectúe solamente una concentración de la proteína n la forma precipitada y no purifique la proteína. En una modalidad preferida, la pureza de la proteína en la precipitación es esencialmente la misma qu n la solución d la proteína de la cual la prot ína s pr cipitada durant la pr cipitación de la proteína 104. El agente de precipitación contactado con la solución de la proteína durante la precipitación de la proteína 104 puede ser cualquier material en una forma capaz de causar la precipitación de al menos una porción de la proteína, y preferentemente la mayoría o substancialmente toda la proteína. Típicamente al menos 80 por ciento en peso, preferentemente al menos 90 por ciento en peso, aún más preferentemente al menos 95 por ciento en peso, todavía más preferentemente al menos 98 por ciento en peso, y más preferentemente al menos 99 por ciento en peso d la proteína se precipita durante la precipitación de la proteína 104. D manera correspondiente, preferentemente poca proteína permanece disuelta en el medio líquido después de la precipitación 104. Típicamente, no más del 20 por ciento en peso, preferentemente no más del 1 0 por ciento en peso, aún más preferentemente no más del 5 por ciento en peso, aún más preferentemente no más del 2 por ciento en peso y más preferentemente no más del 1 por ciento en peso de la proteína permanece disuelta en el medio líquido después de la precipitación 1 04. La pr cipitación de mucho de la proteína como sea posible es importante para mejorar la estabilidad en la mezcla concentrada 1 1 2 que facilita el almacenamiento a largo plazo. Para desempeño mejorado, el agente de precipitación deb ser biocompatible, debido a que al menos una porción del agente de precipitación permanecerá en la mezcla concentrada 1 12, y se contempla que en la mayoría, si no en todas, las situaciones al menos una porción d I ag nt d precipitación p rman cerá con la proteína precipitada durante la administración de la proteína precipitada a un paciente. Por biocompatible, se entiende que una substancia no tiene efectos dañinos o tóxicos en función biológica en un huésped . Preferido para el uso como el agente de precipitación es un polímero biocompatible o muestra de polímeros biocompatibles que, cuando se contactan con la solución de proteína durante la precipitación de la proteína 1 04, resulta en la precipitación deseada de la proteína de la solución. El polímero biocompatible puede ser cualquier polímero biocompatible capaz de contactarse con la solución de proteína para fectuar la precipitación deseada de la proteína. El polímero biocompatible típicamente se disolverá en una solución, típicamente una solución acuosa, preparada de manera separada de la solución de la proteína. La solución del polímero y la solución de la proteína se mezclan entonces durante la precipitación de la proteína 104, ya sea al agregar la solución de polímero a la solución de la proteína o al agregar la solución de la proteína a la solución del polímero, con la última prefiriéndose. Un polímero biocompatible preferido para utilizarse con la presente invención como el agente de precipitación es un polímero d g lación térmica inversa. En una modalidad, el polímero biocompatible se selecciona y las soluciones de la proteína y polímero se formulan d manera que el polímero biocompatible en la mezcla resultante, y tambi ' n en la mezcla concentrada 1 12, está presente en una concentración de manera que al menos la porción líquida de la mezcla respectiva muestra conducta de viscosidad térmica inversa a través de al menos un rango de temperatura, pref rentement un rango de temperatura por debajo de 4Q°C, más pref rentemente un rango de temperatura por d bajo d 37°C y aún más preferentemente un rango de temperatura dentro de un rango de desde 10°C a 37°C. Típicamente, el líquido muestra conducta de viscosidad térmica inversa arriba de algún rango de temperatura dentro de un rango de 1 °C a 20°C. Debido a la conducta de viscosidad térmica inversa del líquido en la mezcla concentrada 1 12, la mezcla concentrada 1 1 2 puede administrarse a un huésped a una temperatura más fría en donde la composición tiene una viscosidad inferior. Cuando ei líquido de la mezcla concentrada 1 1 2 tiene una propiedad de gelación térmica inversa, entonces el líquido de la mezcla concentrada 1 12 se encontrará en la forma de un medio fluible al menos a una primer temperatura y en la forma de un gel al menos en una segunda temperatura que es más alta que la primer temperatura. Preferentemente, tanto la primer como la segunda temperatura son por debajo de 40°C, y más preferentemente la segunda temperatura no es más alta que 37°C. Una situación preferida es cuando la primer temperatura se encuentra en un rango de 1 °C a 20°C y la segunda temperatura se encuentra en un rango de 25°C a 37°C. En una modalidad, el líquido e la mezcla después d la precipitación de la proteína y el líquido en la mezcla concentrada 1 1 2 contiene cada uno una concentración del polímero de gelación térmica inversa en un nivel de manera que el líquido tiene una propiedad de g lación térmica inversa, preferentemente con una temperatura de transición de líquido-gel térmica inversa de manera que cuando la mezcla concentrada 1 12 se administra a un huésped, el polímero biocompatibl se convi rt de un estado líquido a gel in vivo. En otra modalidad, la concentración del polímero de gelación térmica inversa no es suficientemente grande para permitir la fprmación de la forma de gel del polímero durante el almacenamiento, administración o después 0e administración . Esta última situación con frecuencia se prefiere para administración por inyección IM, SC, IT o IA. Como se utiliza en la presente, los términos "propiedad de viscosidad térmica inversa" y "conducta de viscosidad térmica inversa" se refieren cada uno a una propiedad de un componente o componentes, y en particular una combinación de polímero biocompatible/agua, para experimentar un incremento de viscosidad con temperatura creciente a través de al menos un rango de temperatura. "Propiedad de gelación térmica inversas" se refiere a una propiedad de un componente o componentes, y en particular una combinación de polímero/agua biocompatible, para cambiar de una forma líquida a una forma de gel a medida que la temperatura se eleva de abajo a arriba de una temperatura de transición de líquido-gel térmica inversa. "Temperatura de transición de líquido-gel térmica inversa" se refiere a una temperatura en la cual, o un rango de temperatura a través del cual, un componente o component s, y en particular una combinación de polímero/agua biocompatible, cambia de forma física de una forma líquida a una forma de gel a medida que la temperatura del material se incrementa. "Polímero de gelación térmica inversa" se refiere a un polímero capaz de interactuar con un vehículo líquido, y particularmente agua, de manera que fá combinación d polímero/vehículo líquido muestra una propiedad de gelación térmica inv rsa al menos en algunas proporciones del polím ro y el v hículo líquido. Ejemplos no limitantes de algunos polímeros de gelación t ' rmica inversa biocompatibles incluyen ciertos poliéteres (preferentemente copolímeros de bloque de polioxialquileno con copolímeros de bloque de polioxialquileno más preferidos incluyendo copolímeros de bloque de polioxietileno-polioxipropileno referidos en la presente como copolímeros de bloque POE-POP, tales como Pluronic™ F68, Pluronic™ F127, Pluronic™ L121 , Pluronic™ L101 , y Tetronic™ T1 501 ); ciertos polímeros celulósicos, tal como celulosa de etilhidroxietilo; y ciertos copolímeros de bloque poli(éter-éster) (tales como aquellos d scritos en la Patente de EE.UU. No. 5,702,717, los contenidos completos de la cual se incorpora para referencia en la presente como se establece en la presente en su totalidad). Pluronic™ y Tetronic™ son marcas comerciales de BASF Corporation. Además, más de uno de estos y/u otros polímeros biocompatibles pueden incluirse en la solución de polímero. También, otros polímeros y/u otros aditivos también pueden incluirse en la solución de polímero y/o la solución de proteína al grado que la inclusión no sea inconsistente con el conducto del método de la presente invención o los requerimientos de desempeño de la mezcla concentrada 1 12. Además, estos polímeros pueden mezclarse con otros polímeros u otros aditivos, tales como azúcares, para variar la temperatura de transición, típicamente en soluciones acuosas, en las cuales ocurre la gelación térmica inversa. Los copolímeros de bloque de polioxialquoileno s prefieren particularmente como polímeros biocompatibles para utilizars como el agente de precipitación. Un copolíméro d bloqu es un polímero que incluye al menos un bloque (es decir, segmento de polímero) de un primer polioxialquileno y al menos un bloque de un segundo polioxialquileno, aunque otros bloques pueden estar presentes también. Los copolímeros de bloque POE-POP son una clase de copolímeros de bloque de polioxialquileno preferidos para utilizarse como el pol ímero de g lación térmica inversa biocompatible en el polímero biocompatible formulado. Los copolímeros de bloque POE-POP incluyen al menos un bloque de un polioxietileno y al menos un bloque de polioxipropileno, aunque otros bloques también pueden presentarse. El bloque de polioxietileno puede generalmente representarse por la fórmula (C2H 0)b en donde b es un número entero. El bloque de polioxipropileno puede representarse generalmente por la fórmula (C3H60)a en donde a es un número entero. El bloque de polioxipropileno podría ser por ejemplo (CH2CH2CH20)a, o podría ser CH3 I (CHCH20)a Varios copolímeros de bloque POE-POP se conocen por mostrar propiedades de gelación térmica inversa, y estos polímeros son particularmente preferidos para impartir viscosidad térmica inversa y/o propiedades de gelación térmica inversa a la mezcla concentrada 1 12. Ejemplos de copolímeros de bloque POE-POP incluyen Pluronic™ F68, Pluronic™ F127, Pluronic™ L121 , Pluronic™ L1 01 , y Tetronic™ T1501 . Tetronic™ T1501 es un ejemplo de un copolímero de bloque POE-POP qu ti ne al m nos un segm nto d polímero además de los segmentos de polioxietil no y polioxipropileno. Tetronic™ T1501 se reporta por BASF Corporation por ser un copolímero de bloque que incluye segmentos de polímero, o bloques de óxido de etileno, óxido de propileno y diamina de etileno. Como se apreciará, cualquier número de polímeros biocompatibles puede ahora o después existir, que son capaces de actuar como el agente de precipitación, y tales polímeros se proponen específicamente para encontrarse dentro del alcance de la presente invención cuando se incorporan en el polímero biocompatible formulado. Algunos copolímeros de bloque POE-POP tienen la fórmula:
HO(C2H40)b(C3HeO)a(C2H40)bH I que en la modalidad preferida, tiene la propiedad de ser líquida a temperaturas ambiente o inferior y existir como un gel semi-sólido a temperaturas corporales del mamífero en donde a y b son números enteros en el rango de 15 a 80 y 50 a 150, respectivamente. Un copolímero de bloque POE-POP para utilizarse con la presente invención tien la siguiente fórmula: HO(CH2CH20)b(CH2(CH3)CHO)a(CH2CH20)bH II en donde a y b son números enteros tales que la base hidrofóbica representada por (CH2(CH3)CHO)a tiene un peso molecular de aproximadamente 4,000, como se determina por número hidroxilo, la cadena de polioxietileno constituyendo aproximadamente 70 por ciento del número total de unidad s monom ' ricas en la molécula y en dond el copolímero ti ne un peso molecular promedio de aproximadamente 12,600. Pluronic™ F-127, también conocido como Poloxamer 407 , es tal material. Adémás, Pluronic™ F-68 estructuralmente similar también puede utilizarse. Una ventaja del uso de un polímero biocompatible relativo al uso de agentes de precipitación no poliméricos es que el polímero biocompatible ayuda a proteger y estabilizar la proteína en la mezcla concentrada 1 1 2. Esto es especialmente el caso cuando se utiliza un polímero de gelación térmica inversa, tal como los polímeros de polioxialquileno preferidos. En este aspecto, cuando el polímero de gelación térmica inversa está presente en una concentración que imparte una propiedad de gelación térmica inversa, la formación de un gel a medida que se eleva la temperatura protege además la proteína d la degradación. Algunos agentes de precipitación no poliméricos, que no se prefieren para utilizarse con la presente invención incluyen ciertas sales de zinc, sulfato de amonio, acetato de sodio y etanol. Estos agentes de precipitación no se prefieren, debido a que no son tan benignos para administración como el polímero biocompatible. Durante la precipitación de proteína 1 04, el agente de precipitación puede contactarse con la solución de la proteína en cualquier manera que efectúa la precipitación deseada de la proteína. Típicamente, el agente de precipitación se disolverá en una segunda solución qu s agrega a la solución de la proteína , o a la cual se agrega la solución de la proteína, típicamente con agitación o alguna otra forma de mezclado activo. El agente de precipitación puede utilizarse en cualquier cantidad suficiente para efectuar la precipitación deseada durante la precipitación de la proteína 1 04. Por ejemplo, el agente de precipitación de polímero biocompatible típicamente se prepara en una solución de polímero separada que comprende el polímero biocompatible en una concentración de típicaménte al menos 5 por ciento en peso y típicamente no más del 40 por ciento en peso. Preferentemente, el polímero biocompatible se disuelve completamente en la solución de polímero antes de la precipitación de la proteína 104. Después de mezclar la solución de polímero y la solución de la proteína durante la precipitación d la proteína, la concentración del polímero en la mezcla resultante es típicamente al menos 5 por ciento en peso y típicamente no más del 30 por ciento en peso. Algo del polímero biocompatible en la mezcla resultante de la precipitación de la proteína permanecerá en la solución en la fase líquida, y algo del polímero biocompatible se encontrará en la fase sólida junto con la proteína precipitada. La fase sólida resultante de la precipitación de la proteína típicamente comprenderá solamente un poco por ciento de la mezcla total, con un contenido de sólido que cae en un rango de desde 1 por ciento en peso a 10 por ciento en peso de la mezcla resultante en la mayoría de las situaciones. En una mejora del método de la invención, uno o más aditivos pueden agregarse durante el procesamiento además de la proteína y el agente de precipitación. Un aditivo particularmente útil es un estabilizador d prot ína qu ayuda a estabilizar además la proteína en la m zcla concentrada 1 1 2. El estabilizador de proteína es cualquier molécula que vita o reduce significativamente la inestabilidad, ya sea química o física, de la proteína cuando se incorpora en la composición concentrada 1 12. Ejemplos de algunos estabilizadores de proteína útiles con la presente invención incluyen substancias que se han utilizado tradicionalmente para estabilizar las proteínas liofilizadas. Un número de estos Hoprotectores así llamados se describen en la Patente de EE.UU. No. 6,267,958. Preferidas para utilizarse como un estabilizador de proteína con la presente invención son los azúcares. Particularmente preferidos son los azucares, sucrosa y trehalosa. Otro estabilizador de proteína preferido es manitol. Cuando se utiliza, el estabilizador de proteína puede introducirse como parte de la solución de la proteína, como parte de la solución de polímero o separada de las soluciones de proteína y polím ro. Preferentemente, el estabilizador de proteína se agrega antes a la separación de líquido 1 08, y más preferentemente el estabilizador de proteína se codisuelve en al menos una de la solución de la proteína y la solución de polímero. La adición del estabilizador de proteína ayuda a mejorar la estabilidad de la proteína en la mezcla concentrada 1 12. La naturaleza estable de la mezcla concentrada 1 12 es particularmente ventajosas d bido a que se logra sin la complejidad y gasto de liofilización. Otro aditivo que puede agregarse ventajosamente durant la fabricación o después de la fabricación es un aditivo para mejorar las propiedades de flujo d la m zcla concentrada 1 12, tal como para mejorar la inyectabilidad. Los agentes tensoactivos y polioles son ejemplos de aditivos que mejorar el flujo. La adición de un agente tensoactivo y/o un poliol es especialmente útil para mejorar la inyectabilidad de la mezcla concentrada 1 12, especialmente cuando la mezcla concentrada 1 12 extremadamente se concentra altamente en la proteína. Los agentes tensoactivos biocompatibles no iónicos y polioles se prefieren. Los ejemplos no limitantes de algunos polioles y/o agentes tensoactivos pueden encontrarse en la Patente de EE.UU. No. 6,267,958. Preferidos para utilizarse como un agente tensoactivo con la presente invención son los polisorbatos. Algunos polioles preferidos incluyen manitol y glicerol. Un agente tensoactivo de polisorbato preferido se distribuye bajo la marca Tween™ por Uniquemá (ICI Group). Otros agentes tensoactivos preferidos incluyen ésteres de sorbitan, tales como aquellos distribuidos bajo la marca Span™ por Uniquema (ICI Group). La inyectabilidad mejorada que puede algunas veces lograrse con el uso de un agente tensoactivo y/o un poiiol es particularmente notable y ventajosa, especialmente cuando se d sea administrar formulaciones extremadamente concentradas de la proteína por inyección IM, SC, IT o IA. Durante la separación de líquido 108, al menos una porción, y típicamente una mayoría, del líquido se remueve del precipitado de la proteína. La separación puede realizarse utilizando cualquier técnica de s paración de líquido-sólido. Las técnicas de separación posibles incluyen establecimiento del precipitado de proteína seguido por la decantación de líquido sobrenadante, centrifugación, filtración, ciclonación, etc. El establ cimiento d I pr cipitado d prot ína s guido por la d cantanción del líquido sobrenadant se prefiere debido a que relativamente fácil de mantener un ambiente antiséptico durante tal operación. El líquido separado 1 10 típicamente se descarta. La mezcla concentrada 1 12 comprenderá ventajosamente una formulación concentrada de la proteína pr cipitada y el líquido restante. Durante la separación de líquido 108, suficiente líquido se remueve para proporcionar la concentración deseada de la proteína precipitada en la mezcla concentrada 1 12. La concentración deseada de la proteína concentrada variará dependiendo de la proteína particular que se procesa y la situación particular. Una ventaja significativa de la presente invención es que la mezcla concentrada 1 12 puede producirse con una amplia variedad de concentraciones de proteína precipitada, permitiendo mayor flexibilidad para preparar la mezcla concentrada 1 12 en una concentración deseada específica de la proteína precipitada para cualquier aplicación particular. Sin embargo, la concentración de la proteína precipitada en la mezcla concentrada 1 12 típicamente será en un rango de desde 8 por ciento en peso a 80 por ciento en peso, y más típicamente en un rango de desde 10 por ciento en p so a 70 por ciento en peso de la mezcla concentrada 1 12. En el extremo inferior de los rangos de concentración de proteína precipitada ej mplificativa, la concentración de la proteína precipitada debe ser suficiente grande para utilizarse para la administración por técnicas tal s como la inyección IM, SC, IT e IA. En el extremo más alto del rango de concentración ejemplifícativo, es importante retener al menos suficiente agua de manera que la mezcla concentrada 1 12 podría diluirse por último fácilm nt con agua adicional para reconstituir la proteína pr cipitada a una concentración inferior para administración. La mezcla concentrada 1 12 preferentemente incluirá agua en un rango que tiene un límite inferior de típicamente 10 por ciento en peso, más típicamente 20 por ciento en peso y aún más típicamente 30 por ciento en peso de la mezcla concentrada 1 12 y un límite superior de típicamente 92 por ciento en peso y más típicamente 90 por ciento en peso. Si demasiada agua se remueve durante la separación de líquido 108, la reconstitución podría sufrir d algunos problemas con frecuencia experimentados con reconstitución de proteínas liofilizadas. Al mantener al menos una concentración significativa de agua en la mezcla concentrada 1 12, la mezcla concentrada 1 12 se diluye fácilmente para reconstituir la proteína precipitada en una mezcla más diluida adecuada para administración o para procesamiento adicional, según se desee. Además de agua y la proteína precipitada, la mezcla concentrada 112 también incluirá al menos algo del agente de pr cipitación, y puede incluir otros aditivos también, tales como un agente tensoactivo, poliol y/o estabilizador de proteína. La concentración del agente de precipitación en la mezcla concentrada 1 12 variará dependiendo del agente de precipitación específico que se utiliza y las condiciones de precipitación. Cuando se utiliza un agente de precipitación de polímero biocompatible, la mezcla concentrada 1 12 incluye típicamente al menos 5 por ciento en peso del polímero biocompatible y típicamente no más d 50 por ciento en peso del polímero biocompatible, con concentraciones de polímero biocompatible de desde 10 a 30 por ciento en peso siendo más común. Cuando se utiliza, el agente tensoactivo se agregará durante la fabricación en una cantidad que es típicam nte al m nos 0.001 por ciento en peso relativo a la proteína y que es típicamente no más grande que 1 por ciento en peso relativo a la proteína, y entonces generalmente estará presente en la mezcla concentrada 1 12 a aproximadamente aquellas mismas concentraciones relativas a la proteína precipitada. Cuando se utiliza, el estabilizador de proteína se agregará durante la fabricación en una cantidad que es típicamente al menos 10 por ciento en peso relativa a la proteína y que es típicamente no más grande que 1000 por ciento en eso relativo la proteína, y generalmente estará presente en la mezcla concentrada 1 12 a aproximadamente aquellas mismas concentraciones r lativas a la proteína precipitada. Si la mezcla concentrada 1 12 está por utilizarse como una formulación farmacéutica final para administración, entonces la concentración de la proteína precipitada debe preferentemente ser suficientemente alta para permitir que una dosis completa de la proteína se administre por inyección en un volumen de 1 ml_, permitiendo la administración por técnicas tales como inyección IM, SC, IT e IA. En sta situación, y especialmente para anticuerpos, la mezcla concentrada 1 12 t ndrá una concentración de la proteína precipitada que se encuentra en un rango que tiene un límite inferior de típicamente 8 por ciento en p so, más típicamente 10 por ciento en peso, y con frecuencia 20 por ciento en peso de la mezcla concentrada 1 12 y que tiene un límite superior de típicamente 50 por ciento en peso, más típicamente 40 por ciento en p so, aún más típicamente 35 por ciento en peso y con frecuencia 30 por ci nto n peso de la mezcla concentrada 1 12. Correspondientemente, la mezcla concentrada 1 12 cont ndrá agua en una cantidad n un rango que tien un límite inferior de típicamente 50 por ciento en peso, más típicamente 60 por ciento en peso, aún más típicamente 65 por ciento en peso, y con frecuencia 70 por ciento en peso de la mezcla concentrada 1 12 y que tiene un límite superior de típicamente 92 por ciento en peso y más típicamente 90 por ciento en peso de la mezcla concentrada 1 12. Un rango particularmente preferido para la concentración de la proteína precipitada para administración por inyección I , SC, IT e IA es de 10 por ciento en peso a 30 por ciento en peso, que permite mayor flexibilidad para administración de un número de anticuerpos. Un número de anticuerpos requerirá una concentración en un rango de 20 por ciento en peso a 30 por ciento en peso de la mezcla concentrada 1 12. Es importante en el caso de administración, sin embargo, que la mezcla concentrada sea suficientemente inyectable para administrarse por inyección IM, SC, IT o IA, una situación que con frecuencia se logra con la presente invención. Una ventaja particular de la presente invención es el uso de la mezcla concentrada 1 12 como un producto intermedio que se almacena fácilmente por tiempo extendidos entre las etapas de procesamiento en las operaciones de fabricación de proteína. En esta situación, generalment se desea que, durante la separación de líquido 104, la mayoría del líquido se remueve de manera que la mezcla concentrada 112 será muy altamente concentrada en la proteína precipitada, para reducir grandemente el volumen que debe manejarse y almacenarse mientras se esp ra procesamiento adicional. En esta situación, y especialmente para anticuerpos, la mezcla concentrada 1 12 tendrá una concentración de la prot ína precipitada que se encuentra en un rango que ti ne un límite inf rior de típicamente 20 por ciento en peso, más típicamente 30 por ciento en peso, aún más típicamente 40 por ciento en peso y más típicamente 50 por ciento en peso de la mezcla concentrada 1 1 2 y que tiene un límite superior de típicamente 90 por ciento en peso, más típicamente 80 por ciento en peso y aún más típicamente 70 por ciento en peso de la mezcla concentrada 1 12. Correspondientemente, la mezcla concentrada 1 12 contendrá agua en una cantidad en un rango que tiene un límite inferior de típicamente 10 por ciento en peso, más típicamente 20 por ciento en peso y aún más típicamente 30 por ciento en peso de la mezcla concentrada 1 12 y que tiene un límite superior de típicamente 80 por ciento en peso, más típicamente 70 por ciento en peso, aún más típicamente 60 por ciento en peso y más típicamente 50 por ciento en peso. Un rango particularmente preferido para la concentración de la proteína precipitada para una aplicación de almacenamiento intermedio es de 50 por ciento en peso a 70 por ciento en peso de la mezcla concentrada 1 12. Como se apreciará a partir de la discusión anterior, en la mayoría de las situaciones una mayoría del líquido se separará de la proteína precipitada durante la separación de líquido 1 08 para preparar la mezcla concentrada 1 12. Aún en la situación cuando la mezcla concentrada 1 12 se propone como una formulación final para administración, típicamente al menos 50 por ciento en peso del líquido se remueve durante la separación del líquido 1 08. Más típicamente al menos 75 por ciento en peso y aún más típicamente al menos 90 por ciento n peso d I líquido s remu v durant la separación d I líquido 108. En algunas situaciones, al menos 95 por ciento en peso o aún 98 por ciento en peso o más del líquido se remueve durante la separación del líquido 1 08. Cuando una consideración extrema del precipitado de proteína se desea, la centrifugación es una técnica de separación de líquido-sólido preferida. También como se apreciará a partir de la descripción anterior, la mezcla concentrada 1 12 contiene una concentración mucho más elevada de la proteína precipitada que la concentración de la proteína en la solución de proteína preparada durante la preparación de la solución 102. Típicamente, la proporción de la concentración (en una base de peso) de la proteína concentrada en la mezcla concentrada 1 12 a la concentración de la proteína disuelta en la solución de la proteína original es al menos 2, más típicamente al menos 5 y aún más típicamente al menos 10. En algunos casos, la proporción puede ser al menos 20 o aún 40 o más alta. Para la mayoría de las aplicaciones cuando la mezcla concentrada 1 12 s propone como una formulación final para administración, la proporción es típicamente al menos 5 y más típicamente en un rango de desde 5 a 40. Cuando la mezcla concentrada 1 12 se diseña para almacenamiento intermedio antes de procesamiento adicional, la proporción es típicam nt al menos 25 y más típicamente al menos 50, aunque en algunas situaciones la proporción puede ser al menos 75 o aún 100 o más. Un aspecto significativo de la presente invención es que la mezcla concentradá 1 12 es estable y puede almacenarse típicamente por un tiempo apreciable sin degradación de proteína substancial. Esto es esp cialment I caso cuando un polímero biocompatibl s utiliza como el agente de precipitación, y aún más cuando el polímero biocompatible es un polímero de gelación térmica inversa. Un aspecto de esta estabilidad es que la mezcla concentrada 1 12 contiene muy poca proteína en solución en el líquido remanente, debido a que la mayoría o substancialmente toda la proteína se precipita usualmente fuera de la solución durante la precipitación de la proteína 104. Esto es importante y benéfico, debido a que la proteína precipitada es menos susceptible a degradación y desnaturalización que la proteína restante en solución. Las proteínas disueltas en medios acuosos son altamente susceptibles de formar agregados no nativos indeseables. Debido a que al menos una cantidad significativa del medio líquido se retiene en la mezcla concentrada 1 12, es importante precipitar tanto de la proteína como sea posible durante la precipitación de proteína 104, de manera que tan poca proteína como s a posible permanece en solución y susceptible a formación de agregado no nativa. Típicamente no más del 5 por ciento en peso, preferentement no más del 2 por ciento en peso, más preferentemente no más del 1 por ciento en peso, aún más preferentemente no más del 0.5 por ciento y más preferentemente no más del 0.2 por ciento en peso de la proteína total en la mezcla concentrada 1 12 se disuelve en el medio líquido retenido en la mezcla concentrada 1 12. Correspondientemente, típicamente al menos 95 por ciento en peso, preferentemente al menos 2 por ciento en peso, más preferentemente al menos 99 por ciento en peso, aún más preferentemente al menos 99.5 por ciento en peso y más preferentemente al menos 99.8 por ciento en peso de proteína total en la mezcla concentrada 1 1 2 es la proteína pr cipitada. La estabilidad durante el almacenamiento se aumenta además por la presencia de polímero biocompatible que se retiene en la mezcla concentrada 1 12. La presencia del polímero biocompatible parece proporcionar alguna protección a la prot ína precipitada y su presencia también previene que la proteína precipitada s redisuelva en el medio líquido restante. Además, la adición de un estabilizador de proteína durante la fabricación ayuda además a la estabilidad de la mezcla concentrada 1 12. Un aspecto importante de la invención es que la mezcla concentrada puede almacenarse por un tiempo extendido sin requerir liofilización problemática y costosa. El almacenamiento de la mezcla concentrada 1 1 2 típicamente incluye refrigeración estándar. En una modalidad, sin embargo, la mezcla concentrada 1 12 incluye un polímero de gelación térmica-inversa biocompatible en una cantidad suficiente de manera que el polímero existe en una forma de gel a alguna temperatura más elevada que la temperatura a la cual la precipitación de la proteína 104 se conduce, con la temperatura de transición de líquido-gel térmica siendo típicamente no más alta que 37°C, como se trata arriba. R firiéndose ahora a la figura 2, un diagrama de bloques del proceso generalizado se muestra para el método de la invención en el cual la mezcla concentrada 1 12 se somete a gelación 1 16. Durante la gelación 1 16, la temperatura de la mezcla concentrada 1 12 se eleva de una temperatura por debajo de una temperatura por arriba de una temperatura de transición de líquido-gel térmica inversa, de manera que el polímero s convierte de una forma líquida una forma de gel. La forma de gel r sultante 1 18 d la mezcla conc ntrada 1 12 pu de almacenare ntonc s.
D spu ' s del almac namiento, la temperatura de la forma de gel 1 18 de la mezcla concentrada 1 12 podría entonces disminuirse por debajo de la temperatura de transición de líquido-gel térmica inversa de nuevo a la forma líquida para procesamiento adicional o para administración. El almacenamiento de la mezcla concentrada 1 12 en la forma de gel reduce los costos de refrigeración y facilita el fácil manejo y envío de la mezcla concentrada 1 1 2. En otra modalidad la mezcla concentrada 1 12 puede congelarse ventajosamente para almacenamiento a largo plazo. Esto s particularmente útil para almacenamiento a largo plazo que ocurre en un punto intermedio durante la fabricación, tal como cuando un grupo de proteínas está por mantenerse por un tiempo extendido entre las etapas d procesamiento. La congelación es ventajosa debido a que la mezcla concentrada 1 12 contiene un volumen substancialmente reducido de agua que necesita congelarse, relativa al congelamiento de una solución diluida o una suspensión más diluida. Refiriéndose ahora a la figura 3, un diagrama de bloques del proceso generalizado se muestra para una modalidad del método de la invención en el cual la mezcla concentrada 1 12 se somete a congelamiento 120. Durante el congelamiento 120, la temperatura de la mezcla concentrada 1 12 se disminuye por debajo del punto de congelación del medio líquido presente en la mezcla concentrada 1 12. Típicamente, la temperatura de la mezcla concentrada 1 12 se disminuye a una temperatura en un rango de desde -20°C a -80°C. la forma congelada resultante 1 22 de la mezcla concentrada 1 1 2 pu de almac narse ntonc s por un tiempo ext ndido. Después del almacenamiento, el medio líquido en la mezcla concentrada 1 12 puede entonces fundirse para convertir la mezcla concentrada de nuevo a una forma más fluida para procesamiento adicional o para administración. Es importante que con la presente invención, el congelamiento de la mezcla concentrada 1 12 no necesita incluir liofilización, lo que agregaría significativamente gasto de procesamiento y haría a la proteína precipitada más dura de reconstituir en una formulación más diluida después del almacenamiento. Una ventaja significativa con la presente invención es la flexibilidad proporcionada en relación con ta variación de la concentración de la proteína precipitada en la mezcla concentrada 1 12, la habilidad para agregar aditivos durante la fabricación de la mezcla concentrada 1 12, y la variedad de opciones disponibles de almacenamiento y manejo. Otra v ntaja es que la mezcla concentrada 1 2 puede procesarse además para impartir características adicionales al producto farmacéutica final, según se desee. Por ejemplo, los estabilizadores de proteína y agentes tensoactivos, no se agregan durante la preparación de la solución 102 o una precipitación de la proteína 104, podrían agregarse después de la separación del líquido 1 08 para cambiar las características de la mezcla concentrada 1 12. Una modalidad particularmente preferida para procesamiento adicional de la mezcla concentrada es agregar m dio líquido adicional para preparar una formulación de proteína más diluida. Esto puede ser ventajoso, por ejemplo, para preparar un producto más diluido con características mejoradas para administración después d almacenamiento xtendido d la m zcla conc ntrada 1 12.
Refiriéndose ahora a la figura 4, un diagrama de bloques del proceso generalizado se muestra para una modalidad del método d la presente invención en el cual la mezcla concentrada 1 1 2 se somete a dilución 1 28 para preparar una mezcla diluida 1 30. Durante la dilución 128, el medio líquido de dilución se agrega a la mezcla concentrada 1 1 2 de manera que la concentración de la proteína precipitada en la mezcla diluida 1 30 se reduce. El medio líquido de dilución es típicamente un líquido acuoso que es compatible con líquido acuoso ya presente en la mezcla concentrada 1 12. Aunque en algunas circunstancias la adición del medio líquido de dilución resultará en la disolución de alguna de la proteína precipitada, la disolución será suficientemente pequeña que la concentración de proteína disuelta en la mezcla diluida 1 30 no será más del 20 por ciento, y más frecuentemente no será más del 10 por ciento n peso, de la proteína total en la mezcla diluida 130, cuando la concentración de proteína disuelta en la mezcla diluida 1 30 ha alcanzado el equilibrio después de la dilución 1 28. Correspondientemente, típicamente al menos 80 por ciento en peso, y más frecuentement al menos 90 por ciento en peso, de proteína total en la mezcla diluida 130 permanece en la proteína precipitada. En la mayoría de los casos, será deseable que el medio líquido d dilución sea de tal carácter que disuelve cualquier cantidad substancial de la proteína precipitada en la mezcla concentrada 1 12 como un resultado d la dilución 1 28. Por lo tanto, más típicamente no más del 5 por ci nto en peso, preferentemente no más del 2 por ciento en peso, más preferent mente no más del 1 por ciento en peso, aún más pr ferentemente no más del 0.5 por ciento en peso y más preferentem nte no más del 0.2 por ciento en peso de proteína total en la mezcla concentrada 1 12 se disuelve en el medio líquido de la mezcla diluida 130, cuando la concentración de proteína disuelta en la mezcla diluida 1 30 ha alcanzado equilibrio después de la dilución 128. De manera correspondiente, más típicamente al menos 95 por ciento en p so, pr ferentemente al menos 98 por ciento en peso, más preferentemente al menos 99 por ciento en peso, aún más preferentemente al menos 99.5 por ci nto en peso y más preferentemente al menos 99.8 por ciento en peso de la proteína total en la mezcla diluida 130 permanece en la proteína pr cipitada. Para inhibir la solución de proteína como un resultado de la dilución 128, el medio líquido de dilución puede tener ventajosamente disuelto en el mismo algo del agente de precipitación, o algún otro agente, que tiene el efecto de inhibir, o aún completamente prevenir, la redisolución de proteína precipitada. Cuando se utiliza, la concentración del agente de precipitación en el medio líquido de dilución, sin embargo, con frecuencia puede ser más pequeña que la concentración del agente de precipitación en el medio líquido de la mezcla conícentrada 1 12, reduciendo así la concentración del agente de precipitación en la mezcla diluida 130 r lativa a la mezcla concentrada 1 12. Puede ser benéfico reducir la viscosidad de la formulación de inyectabilidad mejorada. En ei caso de un agente de precipitación de polímero biocompatible, la reducción de viscosidad puede deberse tantp a la presencia de una proporción más grand d líquido en la mezcla diluida 130 como a una conc ntración reducida del polímero biocompatible. En una modalidad, el medio líquido de dilución está esencialmente libre del polímero biocompatible, para proporcionar una dilución significativa de la concentración del polímero biocompatible en la mezcla diluida 130. Sin embargo, en esta situación, la redisolución de la proteína precipitada probablemente depende del medio de dilución específico utilizado. Para prevenir cualquier redisolución substancial de la proteína precipitada, suficiente polímero biocompatible, o algún otro agente químico efectivo para prevenir la redisolución, d be estar presente en la mezcla diluida 130. Aún cuando el medio líquido de dilución está esencialmente libre del polímero biocompatible, la mezcla diluida 1 30 aún incluirá al menos una cantidad pequeña del polímero biocompatible, y típicamente al menos 0.1 por ciento en peso del polímero biocompatible. Una ventaja significativa de la mezcla concentrada 1 12 es que puede hacerse de manera que la proteína precipitada fácilmente s reconstituye para preparar la mezcla diluida 1 30. Para fácil reconstitución , la mezcla concentrada 1 1 2 preferentemente incluye al menos 20 por ciento n peso de agua y más preferentemente al menos 30 por ciento en peso de agua. El uso de un agente de precipitación de polímero biocompatibl se prefiere particularmente para preparar la mezcla concentrada de manera que se reconstituye fácilmente para preparar la mezcla diluida (o cuando s desea redisolver la proteína precipitada). La concentración de agua en la mezcla diluida 130 típicamente será al menos 1 0 por ciento en peso en puntos más alta que la concentración de agua en la mezcla concentrada 1 12 (por ejemplo, increm ntado d 30 por c¡ nto en peso d agua en la mezcla concentrada 1 12 a al menos 40 por ciento en peso de agua en la m zcla diluida 130). Correspondientemente, la concentración de la proteína precipitada en la mezcla diluida 1 30 típicamente será al menos 1 0 por cinto en peso de puntos más pequeña que en la mezcla concentrada 1 12 (por ejemplo, reduciendo de 60 por ciento en peso de proteína precipitada en la mezcla de concentración a no más de 50 por ciento en peso de proteína precipitada en la mezcla diluida 1 30). Con frecuencia, la cantidad de medio líquido de dilución agregado a la mezcla concentrada 1 12 durante la dilución 128 será al menos tan grande como, o aún varias veces más grande como, el medio líquido en la mezcla concentrada 1 12. Esto podría ser el caso, por ejemplo, cuando la mezcla concentrada 1 12 se concentra muy altamente en la proteína precipitada (por ejemplo, de talvez 40 por ciento en peso a 70 por ciento en peso de proteína precipitada en la m zcla concentrada 1 12) para almacenamiento interino, con la dilución 128 proponiéndose para diluir la formulación a una concentración inferior de proteína precipitada (por ejemplo, a un rango de tal vez 1 0 por ciento en peso a 30 por ciento en peso de proteína precipitada en la mezcla diluida 130) que tiene inyectabilidad mejorada u otras propiedades deseables n una composición farmacéutica final, tal como para administración por inyección IM, SC, IT o IA. La habilidad de preparar la mezcla concentrada 1 12 para almacenamiento extendido de la proteína en una forma estable es particularmente ventajosa para almacenamiento que con frecuencia se requiere entre las etapas en las operaciones de fabricación en donde las composiciones d prot ína se hacen. Por jemplo, muchas proteínas terapéuticas se preparan en grandes cantidades a través d procesos de fermentación. Las proteínas producto se purifican entonces. Los procesos de purificación típicamente se operan a concentración baja en proteína. Durante tales procesos, algunas veces es deseable mantener los materiales en proceso en varias etapas de purificación. Con la presente invención, la proteina puede concentrarse en la forma de la mezcla concentrada 1 12 para almacenamiento y después someterse a la dilución 1 28 para reconstituir la proteína en la mezcla diluida 1 30 que tiene una concentración más baja de la proteína precipitada. Además, preferentemente meramente diluyéndose, la proteína precipitada podría redisolverse si se desea, para procesamiento adicional, pero esto no sería típicamente el caso. Para redisolver la proteína precipitada, suficiente medio acuoso que está substancialmente libre del agente de precipitación u otros agentes similares se agregaría para acomodar solubilidad completa de la proteína precipitada. En algunas situaciones, la redisolución completa de la proteína precipitada podría acompañarse por múltiples adiciones y separaciones de líquido acuoso para reducir el agente de precipitación residual a un nivel muy bajo, si se desea. En otro aspecto de la presente invención, la mezcla de proteína precipitada de la invención (por ejemplo, la mezcla concentrada 1 12 o la mezcla diluida 1 30) podría empacarse, tal como en la forma de frascos o botellas que contienen una dosis única de la proteína precipitada para administración. Refiriéndose ahora a la figura 5, un diagrama de bloques del proceso generalizado se muestra para una modalidad del m ' todo d la pres nte inv nción n la cual la mezcla concentrada 1 12 se mpaca durante una etapa de empacado 134 para preparar un producto farmacéutico empacado 136. Durante el empacado 1 34, las cantidad s medidas de la mezcla concentrada 1 12 se colocan dentro de recipientes y los recipientes se sellan para prevenir la contaminación durante el transporte y almacenamiento. En una modalidad preferida, la cantidad de la mezcla concentrada 1 12 sellada en cada recipiente es una dosis única para administración de la proteína precipitada. En una modalidad aún más pr ferida, el volumen de la mezcla concentrada 1 12 que contiene la dosis única no es más grande que 1 ml_, y también preferentemente es suficientemente inyectable para permitir la administración por una técnica tal pomo inyección IM, SC, IT o IA. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que incluye una mezcla de una proteína precipitada y un medio líquido. La composición farmacéutica se conc ntra en la proteína precipitada, pero también incluye una cantidad significativa de medio líquido, típicamente un líquido acuoso, como se trata arriba. La composición farmacéutica también incluirá típicamente al menos algo del agente de precipitación y puede incluir otros aditivos, tales como, por ejemplo, un estabilizador de proteína y/o agente tensoactivo. Toda la discusión anterior que concierne a los tipos y cantidades relativas de los diversos constituyentes se aplican por igual aquí, y especialment en relación a las propiedades de la mezcla concentrada 1 12 y la mezcla diluida tratada con referencia a las figuras 1 -5. La composición farmacéutica podría ser, por ejemplo, la mezcla concentrada 1 12 o la m zcla diluida 130 tratada con r sp cto a las figuras 1 -5, o podría s r algún otro producto incluyendo cualquiera de los constituyent s en cualquier cantidad relativa y que tiene cualquiera de los atributos como se trata arriba. Las cantidades relativas de constituyentes en la composición farmacéutica dependerá de la situación específica, por ejemplo, en la proteína específica incluida en la composición y si la composición se diseña almacenamiento interino o es una formulación final para administración, como se trata arriba. Como se trata arriba, es benéfico para la composición farmacéutica incluir al menos una cantidad significativa del medio líquido para facilitar la fácil reconstitución de la proteína precipitada para preparar una formulación más diluida, si se desea. Por lo tanto, se prefiere que la proteína precipitada en la composición farmacéutica se mantenga después de la precipitación en una formulación que comprende típicamente al menos 10 por ciento en peso, preferentemente al menos 20 por ciento en peso y más preferentemente al menos 30 por ciento en peso de agua; aunque concentraciones de agua mucho más altas con frecuencia están presentes, como se trata arriba con respecto a las figuras 1 -5. Consistente con la discusión anterior en relación a las figuras 1 -5, la composición farmacéutica comprenderá normalmente al menos 8 por ciento en peso, preferentemente al menos 10 por ciento en peso y con frecuencia una concentración aún más alta de la proteína precipitada, y al menos 0.1 por ciento en peso, preferentemente al menos 5 por ciento en peso y con frecuencia una concentración aún más alta del polímero biocompatibl . Los estabilizadores de proteína, cuando se utilizan, ordinariamente estarán pr s ntes en una concentración de d sd 10 por ci nto en peso a 1000 por ciento en p so relativo a la proteína precipitada. Los agentes tensoactivos, cuando se utilizan, ordinariamente estarán presentes en una concentración de desde 0.001 por ciento en peso a 1 por ciento en peso relativo a la proteína precipitada. Cuando una cantidad de un aditivo se especifica en la presente como siendo en un por ciento en peso relativo a la proteína precipitada, significa que la cantidad del aditivo se determina como un peso que es aquel porcentaje relativo del peso de la proteína precipitada. En una modalidad, la composición farmacéutica está en un recipiente sellado, como se trata arriba, y preferentemente la cantidad de la composición farmacéutica contenida en el recipiente sellado tiene un volumen total no más grande de 1 mL. La cantidad de la composición farmacéutica contenida en el recipiente sellado también incluye preferentemente una dosis única de la proteína precipitada para administración. En una modalidad, la composición farmacéutica se encuentra en una forma suficientemente inyectable para administrarse por inyección. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica se administra por inyección IM, SC, IT o IA, y más preferentemente a través de una aguja hipodérmica de no más de calibre 18. Cuando se administra por inyección, la composición farmacéutica se contendrá en un dispositivo de inyección, tal como, por ejemplo, una jeringa, y preferentemente una jeringa que tiene una aguja hipodérmica de no más de calibre 1 8. En otro aspecto la presente invención proporciona un método para utilizar la composición farmacéutica para administrar una proteína precipitada a un paciente. La administración es preferentemente por inyección, como se trata arriba. Preferentemente una dosis única inyectada de la proteína precipitada se contiene en un volumen de la composición farmacéutica que no es más grande que 1 mL. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica incluye un agente tensoactivo que mejora la inyectabilidad de la composición farmacéutica. En otro aspecto la presente invención proporciona un método para utilizar la composición farmacéutica para almacenamiento extendido de una proteína precipitada. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica incluirá al menos un estabilizador de proteína para aplicaciones de almacenamiento extendido. Ei molos Objetos adicionales, ventajas y nuevas características de la invención sérán aparentes para aquellos expertos en la materia en la exanimación de los siguientes ejemplos, que se proponen para describir además y ayudar en el entendimiento de la invención y no limita el alcance de la invención en ninguna manera. Ejemplo 1 Una solución homogénea de 1 0mg/ml_, 20 mL s inmunoglobulina bovina (B-lgG) (CalBiochem, cat#345876) se prepara una salina normal y enfría a 2-8°C por disolución de B-lgG seca en 150 mM NaCI, 0.1 % NaN3. La solución de reserva de 30% (p:vol) de Pluronic™ F127 (BASF) en agua desionizada se prepara al disolver el polímero n agua refrigerada a 2-8|c con mezclado periódico hasta que se forma una solución homog ' n a. Un volumen de 20 mL d la solución de reserva d Plurónic™ se coloca en un recipiente de vidrio equipado con una barra agitadora magnética y mantenida a 2-8°C mientras se agita. A esta solución de Pluronic™ se agrega lentamente la solución de B-lgG. La mezcla resultante inmediatamente forma un precipitado. La mezcla se agita a 2-8°C por 30 minutos. La suspensión resultante se centrífuga a 1300rpm por 15 minutos. Aproximadamente 39 mL de sobrenadante s decantan y analizan para contenido de proteína. La pastilla resultante (mezcla concentrada) es un material denso pero flexible. Ejemplo 2 Las soluciones de B-lgG y Pluronic™ F127 se preparan como s describe en el Ejemplo 1 . 500 µ? de la solución de B-lgG se agrega a 500 µ? de la solución F127. La mezcla resultante se agita por una inversión de extremo sobre extremo a 2-8°C por 30 minutos. El precipitado se separa por centrifugación y decantación del fluido sobrenadante. La pastilla restante (mezcla concentrada) se redisueive entonces por la adición de 1 mL de salina normal. La mezcla de salina/pastilla se incuba a 2-8°C por aproximadamente 16 horas después del cual resulta tiempo de vórtice breve en una solución clara, sin color. Ejemplo 3 Las soluciones de inmunoglobulina de bovino y Pluronic™
F127 se preparan como se describe arriba en el Ejemplo 1 , con la excepción de que 10% (p:vol) de mantiol se incluyen en la solución de B-IgG. Las soluciones se mezclan entonces por la adición de la solución de B-lgG a la solución de Pluronic™. La mezcla resultante se agita por inversión de extr mo sobre xtremo a 2-8°C por 30 minutos. El precipitado s separa por c ntrifugación y el precipitado separado (m zcia concentrada) se encuentra que es fluido y viscoso. El precipitado separado (mezcla concentrada) es suficientemente inyectable para colocarse en una jeringa de 1 ce y distribuirse fácilmente a través de una aguja hipodérmica de calibre 22. Ejemplo 4 Ejemplo 3 se repite excepto agregando 0.005% Tween™ n lugar de preferentemente 10% de manitol. La pastilla resultante (mezcla concentrada) también es suave y puede empujarse a través de una aguja hipodérmica de calibre 27. Ejemplo 5 Ejemplo 3 se repite excepto que preferentemente 10% de Trehalosa, 10% de Dextrosa, 10% de Fructosa o 1 % de PEG 600 (glicol de polietileno) se agrega en lugar de manitol. Las pastillas resultant s (mezclas concentradas) son duras y no podrían empujarse a través de una aguja hipodérmica de calibre 18. Ejemplo 6 Una solución de 15 mg/mL de anti-ovalbumina de conejo policlonal se prepara por reconstitución de una torta liofilizada con 5 mL d salina normal (Cappe; Cat#55304). La solución resultante se enfría a 2-8°C. Un 30% (p:vol) de solución de Pluronic™ F127 se prepara como se describe en el ejemplo 1 . 250 µ?. de la solución de anticuerpo se agrega entonces a 250 µ? de la solución de polímero. El precipitado se separa por centrifugación y decantación del fluido sobrenadante. La pastilla resultante (mezcla concentrada) se vuelve a disolver n salina normal como se describe en el Ejemplo 2. Análisis del grado de oligomerización no específica y afinidad reactiva del anticuerpo redisuelto se realiza por cromatografía de exclusión de tamaño y ELISA respectivamente. Ningún cambio se detecta en ningún análisis del inicial contra el material de proteína redisuelto. Ejemplo 7 Ejemplo 6 se repite con la excepción que la pastilla resultante (mezcla concentrada) se mantiene por dos meses a 2-8°C sin cambio m dible en ya sea oligomerización no específica y/o afinidad reactiva, indicando que la proteína en la mezcla concentrada es estable por un tiempo extendido. Ejemplo 8 Ejemplo 7 se repite, excepto que a la solución de anti-ovalbumina de conejo se agregan 0.005% TweenT , y la mezcla concentrada resultante se mantiene por 2 meses a 2-8°C sin cambio medible en ya sea oligomerización no específica y/o afinidad reactiva, indicando que la proteína en la mezcla concentrada es estable por un ti mpo extendido. Ejemplo 9 Ejemplo 7 se repite, excepto que a la solución anti-ovalbumina de conejo se agrega 10% (p:vol) de manitol, y la mezcla concentrada r sultante se mantiene por 2 meses a 2-8°C sin cambio medible en ya s a oligomerización no específica y/o afinidad reactiva, indicando que la proteína en la mezcla concentrada es estable por un tiempo extendido. Ei molo 10 Ejemplo 6 se repite, excepto que a la solución de anti-ovalbumina de conejo se agrega 0.005% TweenTM, y la mezcla concentrada resultante se somete a un ciclo de congelado/descongelado con la mezcla concentrada mantenida en un estado congelado por 2 semanas a una temperatura de ya sea -20C o -80°C. Ningún cambio m dible en ya sea la oligomerización no específica y/o afinidad reactiva se detecta, indicando que la proteína en la mezcla concentrada es estable a través de los ciclos de congelado/descongelado. Ejemplo 1 1 Ejemplo 6 se repite, excepto que la mezcla concentrada resultante se cubre con 250 µ?. de una solución acuosa que contiene 30%, 22.5% o 15% (p:vol) de Pluronic™ F127. La temperatura de cada muestra se eleva a 40°C y se mantiene por 3 semanas. Cada muestra exhibe algún incremento en oligomerización, pero no hay diferencia en la afinidad r activa de la proteína, indicando que algo de degradación de proteína ha ocurrido. Ei mplo 12 Ejemplo 6 se repite, excepto que ya sea 10 mM o 10mM de cloruro de zinc se agrega a la solución de anti-ovalbumina de conejo. La proteína precipitada en la mezcla concentrada no se redisuelve fácilmente en salina normal. La discusión anterior de la invención se ha presentado para propósitos de ilustración y descripción. Lo anterior no se propone limitar la invención a solamente la forma o formas específicamente descritas en la misma. Aunque la descripción de la invención ha incluido la descripción d una o más modalidad s y ciertas variaciones y modificaciones, otras variaciones y modificaciones se encuentran dentro del alcance de la invención, por ejemplo, como puede encontrarse dentro de la experiencia y conocimiento de aquellos en la materia después del entendimiento de la presente descripción. Se proponen obtener derechos que incluyen modalidades alternativas al grado permitido, incluyendo estructuras, funciones, rangos o pasos alternos, intercambiables y/o equivalent s a aquellos reivindicados, ya sea que se describan o no tales estructuras, funciones, rangos o pasos alternos, intercambiables y/o equivalent s descritos en la presente, y sin proponer dedicar públicamente cualqui r materia sujeto patentable. Además, cualquier característica descrita con r specto a cualquier modalidad descrita puede combinarse en cualquier combinación con una o más características de cualquier otra modalidad o modalidades. Por ejemplo, los pasos de procesamiento adicional s pueden incluirse en cualquier punto durante o después del procesamiento descrito en cualquier modalidad del proceso de las figuras 1 -5, siempre que etapas adicionales no sean incompatibles con el procesami nto d scrito. Además, los pasos del proceso descritos en cualquiera de las figuras 1 -5 pueden combinarse con cualquier otro paso de procesamiento como se describe en las figuras 1 -5.