MXPA03010575A - Uso de inhibidores de il-08 para el tratamiento o prevencion de sepsis. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al uso de un inhibidor de IL-18, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o prevencion de sepsis y otras enfermedades caracteristicas del sindrome de respuesta inflamatoria sictemica, SIRS, seleccionadas de sepsis severa y choque septico, y tambien para disfuncion cardiaca relacionada con sepsis.

Description

WO 02/092008 A2 ?????????????????? GB, GR, IE, IT, LU, MC. Nt-, PT, SE, TRJ, ???? patent For two-leller codes and othsr abbrevialions, refer lo ihe "Guid- (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, ance Notes on Codes and Abbrevialions" appearing al the begin- NE, SN, TD, TG). ning of each regular issue of the PCT Gazelte. Publis ed: — wilhoul ¡nlernaUonal search report and lo be rspublished upon receipt of thal report USO DE INHIBIDORES DE IL-18 PARA EL TRATAMIENTO O PREVENCION DE SEPSIS CAMPO DE LA INVENCION La siguiente solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/291 ,463, presentada el 16 de mayo de 2001 , cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. La presente invención se refiere al uso de inhibidores de IL-18 para el tratamiento y/o prevención de sepsis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION En 1989, se detectó un factor Inducido en el suero de ratones infectados con Mycobacterium bovis y desafiados con LPS. Este factor fue capaz de inducir interferón-? (IFN-?) en cultivos de células de bazo de ratones normales en presencia de interleucina-2 (IL-2) (Nakamura et al 1989). Este factor funcionó no como un inductor directo de IFN-?, sino más bien como un co-estimulante junto con IL-2, anti-CD3 o mitógenos. Un intento por identificar mejor esta actividad a partir de suero de ratones tratados después con endotoxinas, reveló una proteína aparentemente homogénea de 50-55 kDa, que estaba asociada con la actividad anterior (Nakamura et al. 1993). Puesto que otras citocinas pueden actuar como co-estimulantes para la producción de IFN-?, la imposibilidad de los anticuerpos neutralizantes para IL-1 , IL-4, IL-5, IL-6 o FNT para bloquear la actividad en suero, sugirió que éste era un factor distinto. Los mismos autores documentaron que el co-estimulante inducido por endotoxinas para la producción de IFN-? estaba presente en extractos de hígados de ratones pre-condicionados con P. acnés (Okamura et al. 1995). De acuerdo a este modelo experimental, la población de macrófagos hepáticos (células de Kupffer) se expande, y por lo tanto una baja dosis de lipopolisacárido bacteriano (LPS) se vuelve letal. Un tratamiento similar no es letal para ratones no pre-condicionados. El factor, denominado factor inductor de IFN-? (IGIF), y designado después como ¡nterleucina- 8 (IL-18), se purificó hasta homogeneidad a partir de estos hígados de ratón tratados con P. acnés, y se obtuvo una secuencia de aminoácidos parcial. Se usaron oligonucleótidos degenerados derivados de las secuencias de aminoácidos de IL- 8 purificada para clonar un ADNc de IL-18 de murino (Okamura et al. 1995). La secuencia de ADNc de humano para IL-18, fue reportada en 1996 (Ushio et al. 1996). La interleucina IL-18 (Tsutsui et al. 1996, Nakamura et al. 1993, Okamura et al. 1995, Ushio et al. 1996), comparte características estructurales con la familia de proteínas de IL-1 (Bazan et al. 1996), las cuales tienen una estructura de lámina ß plegada a diferencia de la mayoría de las otras citocinas, las cuales exhiben una estructura de haz de cuatro hélices. En forma similar a IL-1 ß, IL-18 se sintetiza como un precursor biológicamente inactivo (prolL-18), y carece de un péptido de señal (Ushio et al. 1996). Los precursores de IL-1 ß e IL-18 son desdoblados por la caspasa-1 (enzima de conversión de IL-? ß, o ICE), que desdobla los precursores después de un residuo de ácido aspártico en la posición P1 . Las citocinas maduras resultantes se liberan de la célula (Ghayur et al. 1997 y Gu et al. 1997), a pesar de la falta del péptido de señal. Se sabe que IL- 8 actúa como un co-estimulante para la producción de citocinas (IFN-?, IL-2 y factor estimulante de colonias de macrófagos-granulocitos) por células T auxiliares tipo 1 (Th1 ) (Kohno et al. 1997), y también un co-estimulante para la citotoxicidad mediada por el ligando FAS por clones de células asesinas naturales de murino (Tsutsui et al. 1996). La interleucina-12 (IL-12) es una citocina inmunorreguladora producida por monocitos/macrófagos y otras células que presentan antígenos. Es fundamental para la orquestación de inmunorrespuestas innatas y adquiridas mediadas por células (Trinchieri 1998). Consiste de un heterodímero formado de los productos enlazados covalentemente de dos genes separados: una cadena pesada (p40) y una cadena ligera (p35). La producción de IL-12 se estimula en respuesta a ciertas bacterias, productos bacterianos, parásitos intracelulares y virus. Se han atribuido las siguientes funciones a la IL-12: 1 ) es un inductor potente de IFN-? a partir de células T y células asesinas naturales (NK), 2) es co-mitogénica para dichas células, 3) es crítica para el desarrollo de respuestas de Th1 en la mayoría de los sistemas (llevando de esta manera secundariamente, a incrementos en la producción de IFN-? y FNT, activación de macrófagos, etc.), 4) intensifica la citotoxicidad de linfocitos T citotóxicos y células NK, y 5) se requiere para respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado. Se mostró que la producción de IL-12 en leucocitos esplénicos de murino aislados tratados con la cepa 1 de Staphylococcus aureus Cowan, es suprimida por el IFN-oc o IFN-ß (Karp et al. 2000). Recientemente, se ha reportado que la IL-12 interviene en la patogénesis de enfermedades inflamatorias autoinmunes específicas de órganos, tales como esclerosis múltiple (MS) (Karp et al. 2000) y enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (Blumberg y Strober 2001 , y Fiocchi 1999), y se está considerando de esta manera como un fármaco potencial objetivo para el tratamiento de estas condiciones. IL-18 e IL-12 exhiben un sinergismo notable en la inducción de IFN-? en células T (Okamura et al. 1998). Investigaciones en el mecanismo de este sinergismo, han revelado que la IL-12 sobrerregula la expresión de ambas cadenas del receptor de IL-18 en células que producen IFN-? (Kim et al. 2001 ). Aunque IL-12 e IL-18 activan inmunidad innata y adquirida, su producción excesiva por macrófagos activados puede inducir trastornos de órganos múltiples que incluyen mal funcionamiento del sistema inmune (Seki et ai. 2000). Las proteínas de unión a citocina (receptores de citocina solubles), son usualmente los dominios de unión al ligando extracelulares de sus receptores de citocina de superficie celular respectivos. Se producen mediante empalme alternativo o mediante desdoblamiento proteolítico del receptor de superficie celular. Estos receptores solubles se han descrito en el pasado: por ejemplo, los receptores solubles para IL-6 e IFN-y (Novick et al. 1989), FNT (Engelmann et al. 1989 y Engelmann et al. 1990), IL-1 e IL-4 (Maliszewski et al. 1990) e IFN-a/ß (Novick et al. 1994, Novick et al. 1992). Una proteína de unión a citocina, denominada osteoprotegerina (OPG, conocida también como factor inhibidor de osteoclastos -OCIF), un miembro de la familia de FNTR/Fas, parece ser el primer ejemplo de un receptor soluble que existe sólo como una proteína secretada (Anderson et al. 1997, Simonet et al. 1997, Yasuda et al. 1998). Se purificó por afinidad una proteína de unión a interleucina-18 (IL-18BP), sobre una columna de IL-18, a partir de orina (Novick et al. 1999). IL-18BP suprime la inducción de IFN-? por IL-18, y la activación de NF-kB por IL-18 in vitro. Además, IL-18BP inhibe la inducción de IFN-? en ratones inyectados con LPS. El gen de IL-18BP se localizó hacia el cromosoma humano 11 , y no pudo encontrarse un exón que codificara para un dominio de transmembrana en la secuencia genómica de 8.3 kb que comprende el gen de IL-18BP. Cuatro isoformas de IL-18BP generadas mediante empalme de ARN mensajero alternativo, se han encontrado hasta ahora en humanos. Se designaron como IL-18BP a, b, c y d, todas compartiendo el mismo extremo N y difiriendo en el extremo C (Novick et al. 1999). Estas isoformas varían en su capacidad para unirse a IL-18 (Kim et al. 2000). De las cuatro, se sabe que las isoformas a y c de la IL-18BP de humano (hlL-18BP) tienen una capacidad neutralizante por IL-18. La ¡soforma de IL-18BP más abundante, la isoforma variante empalmada a, exhibe una alta afinidad por IL-18, con una rápida activación y una lenta desactivación, y una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 0.4 nM (Kim et al. 2000). La IL-18BP se expresa constitutivamente en el bazo, y pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas. Los residuos que intervienen en la interacción de IL-18 con IL-18BP se han descrito mediante el uso de elaboración de modelos en computadora (Kim et al. 2000), y se basan en la interacción entre la proteína similar I L-1 ß con el tipo 1 de IL-1 R (Vigers et al. 1997). De acuerdo al modelo de unión de IL-18 a la IL-18BP, se ha propuesto que el residuo Glu en la posición 42, y el residuo Lys en la posición 89 de IL-18, se unen a Lys-130 y Glu-114 en IL- 8BP, respectivamente (Kim et al. 2000). La IL-18BP está presente constitutivamente en muchas células (Puren et al. 1999), y circula en humanos sanos (Urushihara et al. 2000), representando un fenómeno único en la biología de las citocinas. Debido a la alta afinidad de IL-18BP por IL-18 (Kd = 0.4 nM), así como la alta concentración de IL-18BP presente en la circulación (exceso molar de 20 veces sobre IL-18), se ha especulado que la mayoría de las moléculas de IL-18, si no todas, en la circulación, se unen a IL-18BP. De esta manera, la IL-18BP circulante que compite con los receptores de superficie celular por IL-18, puede actuar como un antiinflamatorio natural y una molécula inmunosupresora. Como se mencionó, la IL-18 induce a IFN-? que, a su vez, se reportó recientemente induce la generación de ARN mensajero de IL-18BPa in vltro (Muhl et al. 2000). Por lo tanto, la IL-18BPa podría servir como una señal de "inactivación", terminando la respuesta inflamatoria. La IL-18BP es significativamente homologa con una familia de proteínas codificadas por varios Poxvirus (Novick et al. 1999, Xíang y oss 999). La inhibición de IL-18 por esta IL-18BP viral putativa, puede atenuar la respuesta antiviral inflamatoria de Th . El término síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) describe el síndrome clínico familiar de sepsis, independiente de su causa. El SIRS puede resultar de trauma, pancreatitis, reacciones a fármacos, enfermedad autoinmune y otros trastornos: cuando surge en respuesta a infección, se dice que está presente sepsis (Nathens y Marshall 1996). El choque séptico es la causa más común de muerte en las unidades de cuidados intensivos médicos y quirúrgicos (Astiz y Rackow 1998).

Los términos sepsis, sepsis severa y choque séptico, se usan para identificar el continuum de la respuesta clínica a la infección. Los pacientes con sepsis presentan evidencias de infección y manifestaciones clínicas de inflamación.

Los pacientes con sepsis severa desarrollan hipoperfusión con dísfunción de órganos. El choque séptico se manifiesta por hipoperfusión e hipotensión persistente. La mortalidad varía de 16% en pacientes con sepsis, a 40 a 60% en pacientes con choque séptico. La infección bacteriana es la causa más común de choque séptico. Los sitios de infección más frecuentes son los pulmones, abdomen y tracto urinario. Terapias antiinflamatorias generales tales como el uso de corticosteroides, no pudieron mostrar mejoras en la supervivencia ante sepsis y choque séptico. Tres anticuerpos monoclonales específicos de endotoxina se han puesto a prueba en pruebas clínicas, y no han podido mejorar los índices de supervivencia. La terapia con antagonistas del factor de necrosis tumoral, interleucina-1 , bradiquinina, ibuprofeno y factor activador de plaquetas, no mostró mejora en la supervivencia ante choque séptico (Astiz y Rackow 1998). La sepsis es causada, entre otros, por bacterias Gram-positivas, por ejemplo, Staphylococcus epidermidis. Se piensa que los ácidos lipotéiquicos y los peptidoglicanos, que son los componentes principales de la pared celular de las especies de Staphylococcus, son los inductores de la liberación de citocinas en esta condición (Grupta et a!. 996 y Cleveland et al. 1996). Sin embargo, se considera también a otros componentes Gram-positivos como estimuladores de la síntesis de citocinas (Henderson et al. 1996). Se piensa que la producción de IL- , FNT-a e IFN-? es el factor principal en la patogénesis del choque séptico (Dinarello 1996 y Okusawa et al. 1988). Además, se mostró que la quimiocina IL-8 es inducida por neutrófilos en respuesta a S. epidermidis (Hachicha et al. 1998). Factores importantes en la regulación de la inducción de IL-1 , FNT-a e IFN-? por S. epidermidis, son IL-18, IL-12, IL-1 p y FNT-a. Puede considerarse a la IL-1 B y al FNT-a como co-estímulo para la producción de IFN-? por linfocitos T en forma similar a IL-18. Estas dos citocinas tienen una actividad co-estimuladora sobre la producción de IFN-? en el contexto de la IL-12 o la estimulación bacteriana (Skeen et al. 1995 y Tripp et al. 1993).

Recientemente, Nakamura et al. (2000) reportaron que la administración concomitante de IL-18 e IL-12 a ratones, da como resultado alta toxicidad similar a la encontrada en choque séptico inducido por endotoxinas. Se ha mostrado que los niveles de IL-18 están elevados en los sueros de pacientes con sepsis (Endo et al. 2000), pero este incremento se correlacionó con los niveles de creatinina, sugiriendo que los niveles elevados de IL-18 pueden resultar de falla renal. En otro estudio (Grobmyer et al. 2000), los niveles de IL-18 en 9 sujetos con sepsis durante las primeras 96 horas después de su admisión en el hospital, fueron altos y no se correlacionaron con los niveles de creatinina. Es evidente a partir de lo anterior, que la IL-18 es una Interleucina pleiotrópica que tiene funciones inflamatorias intensificadoras y atenuantes. Por otra parte, mejora la producción de citocinas proinflamatorias tales como el FNT-cc, promoviendo de esta manera la Inflamación. Por otro lado, induce la producción de óxido nítrico (NO), un inhibidor de caspasa-1 , bloqueando de esta manera la maduración de IL-? ß, y atenuando posiblemente la Inflamación. Esta doble función de la IL-18, cuestiona seriamente la eficacia de los inhibidores de IL-18 en el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Además, debido a la intervención de una gran variedad de diferentes citocinas y quimiocinas en la regulación de la inflamación, no siempre puede esperarse lograr un efecto benéfico al bloquear sólo una de las vías en dicha red de interacción complicada.

Netea et al. (2000) reportaron que la administración de anticuerpo policlonal anti-IL-18 protegió a ratones contra los efectos deletéreos de LPS derivado de las especies E. coli o S. typhimurium puestas a prueba, apoyando el concepto de que la IL-18 tiene una función patogénica importante en endotoxemia letal. Sin embargo, la incertidumbre respecto a la eficiencia de una formulación de tratamiento potencial basada en la administración de inhibidores de IL-18, se manifiesta porque ratones con expresión bloqueada de IL-18 no son menos susceptibles a sepsis, en comparación con animales de tipo silvestre (Sakao et al. 1999), y porque reportes recientes sugieren que la actividad proinflamatoria de la IL-18 es esencial para las defensas del hospedero ante varias infecciones (Nakanishi et al. 2001 y Foss et al. 2001 ). De esta manera, existe la necesidad de proveer medios para tratar y/o prevenir la sepsis, a pesar de las consideraciones mencionadas anteriormente respecto al uso de inhibidores de IL-18.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se refiere al uso de un inhibidor de IL-18, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de sepsis y otras enfermedades características del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) seleccionadas de sepsis severa y choque séptico, y también para disfunción cardiaca relacionada con sepsis.

Más específicamente, la invención se refiere al uso de un inhibidor de !L-18, seleccionado de inhibidores de caspasa-1 · (ICE), anticuerpos contra IL-18, anticuerpos contra cualquiera de las subunidades del receptor de IL-18, inhibidores de la vía de señalización de IL-18, antagonistas de IL-18 que compiten con IL-18 y bloquean al receptor de IL-18, inhibidores de la producción de IL-18, y proteínas de unión a IL-18, isoformas, muteínas, proteínas fusionadas, derivados funcionales, fracciones activas o derivados circularmente permutados de los mismos, que tienen por lo menos esencialmente la misma actividad que una proteína de unión a IL-18. La proteína de unión a IL-18 de conformidad con la invención, es una isoforma, una muteína, proteína fusionada (por ejemplo, fusionada con Ig), derivado funcional (por ejemplo, conjugado con PEG), fracción activa o derivado permutado circularmente de los mismos. Los anticuerpos usados de conformidad con la invención pueden ser anticuerpos específicos anti-IL-18 seleccionados de anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos. Además, la invención se refiere al uso de un inhibidor, en la fabricación de un medicamento que comprende además un inhibidor de IL-12, de preferencia un anticuerpo neutralizante de IL-12, un interferón, de preferencia interferón- o -ß, un inhibidor del factor de necrosis tumoral, de preferencia FNTRI o FNTRII solubles, y/o un inhibidor de IL-1 , de preferencia antagonista del receptor de IL-1 , para administración simultánea, secuencial o separada.

En un aspecto, la invención provee el uso de un vector de expresión que comprende la secuencia de codificación de un inhibidor de IL-18 seleccionado de inhibidores de caspasa-1 (ICE), anticuerpos contra IL-18, anticuerpos contra cualquiera de las subunidades del receptor de IL-18, inhibidores de la vía de señalización de IL-18, antagonistas de IL-18 que compiten con IL-18 y bloquean al receptor de IL-18, inhibidores de la producción de IL-18 y proteínas de unión a IL-18, isoformas, muteínas, proteínas fusionadas o derivados circularmente permutados de los mismos que tienen por lo menos esencialmente la misma actividad que una proteína de unión a IL-18, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de sepsis, por ejemplo, mediante terapia génica. En otro aspecto, la invención provee el uso de un vector para inducir y/o mejorar la producción endógena de un inhibidor de IL-18 en una célula, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de sepsis. Además, la invención provee el uso de una célula que ha sido modificada genéticamente para producir un inhibidor de IL-18, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de sepsis. En otra modalidad, la invención se refiere a un método para el tratamiento y/o prevención de sepsis y otras enfermedades características del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), incluyendo disfunción cardiaca relacionada con sepsis, el cual comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un inhibidor de IL-18 seleccionado de inhibidores de caspasa-1 (ICE), anticuerpos contra IL-18, anticuerpos contra cualquiera de las subunidades del receptor de IL-18, inhibidores de la vía de señalización de IL-18, antagonistas de IL-18 que compiten con IL-18 y bloquean al receptor de IL-18, inhibidores de la producción de IL-18, y proteínas de unión a IL-18, isoformas, muteínas, proteínas fusionadas, derivados funcionales, fracciones activas o derivados circularmente permutados de los mismos, que tienen esencialmente la misma actividad que una proteína de unión a IL-18. El método puede comprender co-administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de citocinas seleccionado de inhibidor de IL-12, de preferencia anticuerpos neutralizantes, inhibidores del factor de necrosis tumoral, de preferencia la porción soluble de FNTRI o FNTRII, inhibidores de IL-1 , de preferencia los antagonistas del receptor de IL-1 e inhibidores de IL-8, y/o un interferón, de preferencia interferón-a o -ß. Además, la invención provee un método para el tratamiento y/o prevención de sepsis y otras enfermedades características del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), el cual comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un vector que codifica para la secuencia de un inhibidor de IL-18 seleccionado de inhibidores de caspasa-1 (ICE), anticuerpos contra IL-18, anticuerpos contra cualquiera de las subunidades del receptor de IL-18, inhibidores de la vía de señalización de IL-18, antagonistas de IL-18 que compiten con IL-18 y bloquean al receptor de IL-18, inhibidores de la producción de IL-18 y proteínas de unión a IL- 8, isoformas, muteínas, proteínas fusionadas o derivados circularmente permutados de los mismos. En otra modalidad, la invención se refiere a un método para el tratamiento y/o prevención de sepsis y otras enfermedades características del SIRS, el cual comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo, una cantidad farmacéuticamente efectiva de un vector para inducir y/o mejorar la producción endógena de un inhibidor de IL-18 en una célula. Además, la invención provee un método para el tratamiento y/o prevención de sepsis y otras enfermedades características del SIRS, el cual comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo, una célula que se ha modificado genéticamente para producir un inhibidor de IL-18.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la distribución de IL-18BPa en suero en individuos sanos. Sueros de hombres y mujeres sanos, de 20 a 60 años de edad, puestos a prueba para la presencia de IL-18BPa mediante una ELISA específica (n = 107). La figura 2A muestra los niveles promedio de IL-18 e IL-18BPa en pacientes con sepsis y sujetos sanos. Se determinaron IL-18 e IL-18BPa en suero en los individuos sanos (véase la figura 1 ) y en 198 muestras de 42 pacientes con sepsis inmediatamente tras su admisión en el hospital y durante la hospitalización.

La figura 2B muestra la distribución de los niveles individuales de IL-18 e IL-18BPa de los sujetos sanos y pacientes descritos en la figura 2A. Los niveles medios de IL-18 y IL- 8BPa en suero en sujetos sanos, se indican mediante una línea vertical y horizontal punteada, respectivamente. La figura 3 muestra una comparación entre la IL-18 total y libre en pacientes individuales con sepsis tras su admisión en el hospital. El nivel de IL-18 libre (círculos oscuros) en suero, se calculó con base en la concentración de IL-18 total (círculos claros) e IL-18BPa, tomando en cuenta una estequiometría de 1 :1 de IL-18 con IL-18BPa en un complejo, y una Kd calculada de 400 pM. Cada línea vertical enlaza la IL-18 total y libre en una muestra de suero individual. La figura 4 muestra el efecto de IL-18BP sobre la producción de IFN-? inducida por S. epidermidis en sangre entera. Se estimuló sangre entera con S. epidermidis solo o S. epidermidis e IL-18BP recombinante a las concentraciones indicadas. Después de 48 horas de incubación, el cultivo de sangre fue lisado y se midió el IFN-?. Los resultados se expresan como porcentaje de la inducción de IFN-? por S. epidermidis. P<0.01 contra S. epidermidis solo. Los datos representan la media ± error estándar de la media (SEM) de seis experimentos. SE representa la extensión de la media de una muestra. SEM da una ¡dea de la precisión de la media. SEM = SD/(raíz cuadrada del tamaño de la muestra). Los datos se analizaron con una prueba pareada de Student.

La figura 5 muestra el efecto inhibidor ejercido por la doble actividad de la IL-18BPa y anticuerpos monoclonales anti-IL-12, sobre la producción de IFN-? por sangre entera tratada con S. epidermidis. Se estimuló sangre entera con S. epidermidis en presencia o en ausencia de IL-18BPa (125 ng/ml), Mab de IL-12 (2.5 ng/ml), y ambos. Después de 48 horas de incubación, el cultivo de sangre fue lisado, y se midió el IFN-?. Los datos se expresan como por ciento de la inducción de IFN-?. P<0.01 contra S. epidermidis solo. Los datos representan la media + error estándar de la media (SEM) de seis experimentos. SEM representa la extensión de la media de una muestra. SEM da una idea de la precisión de la media. SEM = SD (raíz cuadrada del tamaño de la muestra). Los datos se analizaron con prueba pareada de Student. La figura 6 muestra la cuantificación de la IL-18BPa reflejada en una curva estándar de ELISA. Se diluyó gradualmente IL-18BPa humana recombinante, y se sometió a una ELISA como se describe en el ejemplo 3. Los datos muestran la absorbancia media = SE (error estándar) de 10 experimentos. La figura 7 muestra ei efecto inhibidor de la IL-18 sobre la cuantificación de IL-18BPa mediante una ELISA. Se muestra el por ciento de inhibición de la señal. La figura 8 muestra la reactividad cruzada inmunológica de isoformas de IL-18BP humana. Se llevó a cabo la ELISA de IL-18BP con todas las isoformas (a-d) de IL-18BP. Se diluyeron gradualmente materiales de abastecimiento (3.2 de las isoformas de IL-18BP, y se pusieron a prueba en una ELISA de IL-18BPa. La figura 9 muestra el contenido de IL-18 en tejido del miocardio después de la administración de LPS. Se inyectó a ratones con LPS de E. coli (0.5 mg/kg, intraperitonealmente). Se homogenizaron los corazones en los tiempos indicados en el eje x. Se llevó a cabo una ELISA para determinar el contenido de IL-18 en el miocardio (n = 4-5 por grupo). La figura 10 muestra el efecto de anticuerpo anti-IL-18 sobre disfunción del miocardio inducida por LPS. Se inyectó a ratones con vehículo (solución salina inyectada intraperitonealmente, n = 8) o LPS de E. coli (0.5 mg/kg inyectados intraperitonealmente, n = 8), y se determinó la presión ventricular izquierda desarrollada (LVDP) a 6 horas mediante perfusión del corazón aislado. En experimentos separados, se trató previamente a ratones con suero normal de conejo (NRS, n = 5) o anticuerpo anti-IL-18 (anti-IL-18, n = 8) 30 minutos antes de LPS.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la administración de inhibidores de IL-18 para prevenir o tratar sepsis, y se basa en los hallazgos descritos en los ejemplos. Se encontró de conformidad con la presente invención, que los niveles de IL-18 circulante (libre) efectiva están significativamente elevados en el suero de pacientes con sepsis, en comparación con individuos sanos, y que la inhibición de la IL-18 causa una disminución en la inducción de IFN-? por la bacteria Gram-positiva Staphylococcus epidermidis. Además, el tratamiento preventivo de la sepsis puede abordarse mediante la administración de un inhibidor de IL-18, en combinación con otros inhibidores de citocina potencialmente capaces de incrementar su efecto. La sepsis de conformidad con la presente invención comprende SIRS, sepsis severa, choque séptico, choque endotóxico, etc., y puede ser causada por bacterias Gram-positivas o Gram-negativas. El término "inhibición de IL-18" dentro del contexto de esta invención, se refiere a cualquier molécula que module la producción y/o acción de IL-18 de tal forma que la producción y/o acción de IL-18 sea atenuada, reducida, o parcialmente, sustancialmente o completamente suprimida o bloqueada. Un inhibidor de producción puede ser cualquier molécula que afecte negativamente la síntesis, procesamiento o maduración de IL-18, por ejemplo, inhibidor de ICE. Los inhibidores considerados de conformidad con la invención pueden ser, por ejemplo, supresores de la expresión génica de la interleucina IL-18, moléculas de ARN mensajero antisentido que reduzcan o prevengan la transcripción del ARN mensajero de IL-18, o ribozimas que lleven a la degradación del ARN mensajero, proteínas que deterioren el plegamiento correcto, o que prevengan parcialmente o sustancialmente la secreción de IL-18, proteasas que degraden a IL-18, y similares.

Los inhibidores de la acción de IL-18 pueden ser antagonistas de IL-18, por ejemplo, IL-18BP. Los antagonistas pueden unirse a, o secuestrar la molécula IL-18 misma, con afinidad y carácter específico suficientes para neutralizar parcialmente o sustancialmente la IL-18 o los sitios activos de la IL-18 que determinan la unión de IL-18 a sus ligandos (por ejemplo, a sus receptores). Un antagonista puede inhibir también la vía de señalización de IL-18, que es activada dentro de las células después de la unión al receptor/IL-18. Los inhibidores de la acción de IL-18 pueden ser también receptores de IL-18 solubles, o moléculas que imiten a los receptores, o agentes que bloqueen a los receptores de IL-18 o moléculas que imiten a los receptores, o agentes que bloqueen a los receptores de IL-18, anticuerpos de IL-18 tales como anticuerpos monoclonales, o cualquier otro agente o molécula que prevenga la unión de IL-18 a sus objetivos, disminuyendo o previniendo de esta manera el desencadenamiento de reacciones intracelulares o extraceiulares mediadas por IL-18. El término "proteínas de unión a IL-18", se usa en la presente como sinónimo de "IL18-BP". Comprende proteínas de unión a IL-18 como se define en el documento WO 99/09063 o en Novick et al., 1999, incluyendo variantes de empalme y/o isoformas de proteínas de unión a IL-18, como se define en Kim et al., 2000. En particular, las isoformas humanas a y c de IL-18BP son útiles de conformidad con la presente invención. Las proteínas útiles de conformidad con la presente invención pueden ser glucosiladas o no glucosiladas, pueden derivarse de fuentes naturales tales como la orina, o pueden producirse de preferencia en forma recombinante. La expresión recombinante puede llevarse a cabo en sistemas de expresión procarióticos tales como E. coli, o en sistemas de expresión eucarióticos, y de preferencia en sistemas de expresión de mamífero. Como se usa en la presente, el término "muteínas" se refiere a análogos de una IL-18BP, o análogos de una IL-18BP viral, en donde uno o más de los residuos de aminoácido de una IL-18BP natural o IL-18BP viral, son reemplazados por residuos de aminoácido diferentes, o son eliminados, o uno o más residuos de aminoácido se añaden a la secuencia natural de una IL-18BP o una IL-18BP viral, sin cambiar considerablemente la actividad de los productos resultantes, en comparación con la IL-18BP de tipo silvestre o IL-18BP viral. Estas muteínas se preparan mediante síntesis conocida, y/o mediante técnicas de mutagénesis dirigida a sitio, o cualquier otra técnica conocida adecuada para lo mismo. Cualquiera de dichas muteínas tiene de preferencia una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicativa de la de una IL-18BP, o suficientemente duplicativa de una IL- 8BP viral, tal como para tener actividad sustancialmente similar a la de la IL-18BP. Una actividad de la IL-18BP, es su capacidad para unirse a IL- 8. En tanto la muteína tenga actividad de unión sustancial con IL-18, puede usarse en la purificación de IL-18, tal como mediante medios de cromatografía de afinidad, y de esta manera puede considerarse que tiene actividad sustancialmente similar a la de la IL-18BP.

De esta manera, puede determinarse si alguna muteína determinada tiene sustancialmente la misma actividad que IL-18BP mediante experimentación de rutina que comprende someter a dicha muteína, por ejemplo, a una prueba simple de competencia en sándwich, para determinar si se une o no a una IL-18 marcada adecuadamente, tal como una ELISA o radioinmunoensayo. Las muteínas de polipéptidos de IL-18BP, o muteínas de IL- 8BPs virales que pueden usarse de conformidad con la presente invención, o ácido nucleico que codifica para las mismas, incluyen una serie finita de secuencias sustancialmente correspondientes como péptidos o polinucleótidos de sustitución que pueden ser obtenidos habitualmente por los expertos en la técnica, sin experimentación indebida, con base en las enseñanzas y guía presentadas en la presente. Cambios preferidos para las muteínas de conformidad con la presente invención, son las que se conocen como sustituciones "conservativas". Sustituciones conservativas de aminoácidos de polipéptidos o proteínas de IL-18BP o IL-18BPs virales, pueden incluir aminoácidos sinónimos dentro de un grupo que tenga propiedades fisicoquímicas sustancialmente similares que la sustitución entre los miembros del grupo preservará la función biológica de la molécula (Grantham, 1974). Es claro que pueden hacerse también inserciones y deleciones de aminoácidos en las secuencias definidas anteriormente, sin alterar su función, en particular si las inserciones o deleciones incluyen sólo unos cuantos aminoácidos, por ejemplo, menos de 30, y de preferencia menos de 10, y no remueven o desplazan aminoácidos que son críticos para una conformación funcional, por ejemplo, residuos de cisteína. Las proteínas y muteínas producidas mediante dichas deleciones y/o inserciones, están dentro del alcance de la presente invención. De preferencia, los grupos de aminoácidos sinónimos son los que se definen en el cuadro I. Más preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los que se definen en el cuadro II; y muy preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los que se definen en el cuadro III.

CUADRO I Grupos preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu He, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Val Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly lie Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie Phe Trp, Met, Tyr, lie, Val, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, lie, Val, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gln, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Met Phe, lie, Val, Leu, Met Trp Trp CUADRO II Grupos más preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, lie, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Val Val, Met, lie Gly Gly lie He, Met, Phe, Val, Leu Phe Met, Tyr, lie, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gln, Arg Gln Glu, Gln, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gln Met Met Phe, lie, Val, Leu Trp Trp CUADRO III Grupos muy preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser Arg Arg Leu Leu, lie, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Val Val Gly Gly lie lie, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser CUADRO ill (Continuación) His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, lie, Leu Trp Met Ejemplos de producción de sustituciones de aminoácido en proteínas que pueden usarse para obtener muteínas de polipéptidos o proteínas de IL-18BP, o muteínas de IL-18BPs virales, para su uso en la presente invención, incluyen cualquier paso de método conocido, tal como se presenta en las patentes de E.U.A. Nos. RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585 y 4,737,462 a Mark et al.; 5,116,943 a Koths et al., 4,965,195 a Ñamen et al., 4,879,11 1 a Chong et al; y 5,017,691 a Lee et al; y proteínas sustituidas con lisina presentadas en la patente de E.U.A. No. 4,904,584 (Shaw et al). El término "proteína fusionada" se refiere a un polipéptido que comprende una IL-18BP, o una IL-18BP viral, o una muteína o fragmento de las mismas, fusionado con otra proteína que, por ejemplo, tenga un tiempo de residencia extendido en fluidos corporales. Una IL-18BP o una IL-18BP viral puede fusionarse de esta manera con otra proteína, polipéptido o similares, por ejemplo, una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. El término "derivados funcionales", como se usa en la presente, abarca derivados de IL-18BP o una IL-18BP viral, y sus muteínas y proteínas fusionadas, que pueden preparase a partir de grupos funcionales que ocurren como cadenas laterales en los residuos o los grupos N- o C- terminales, mediante medios conocidos en la técnica, y se incluyen en la invención en tanto continúen siendo farmacéuticamente aceptables, es decir, no destruyan la actividad de la proteína que es sustancialmente similar a la actividad de IL-18BP, o IL-18BPs virales, y no confieran propiedades tóxicas en las composiciones que los contengan. Estos derivados pueden incluir, por ejemplo, cadenas laterales de polietilenglicol (conjugadas con PEG), que pueden enmascarar sitios antigénicos y extender el tiempo de residencia de una IL-18BP o una IL-18BP viral en fluidos corporales. Otros derivados incluyen ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo mediante reacción con amoníaco o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo de grupos amino libres de los residuos de aminoácido formados con porciones acilo (por ejemplo, grupos alcanoilo o aroilo carbocíclico) o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, de residuos serilo o treonilo) formados con porciones acilo. Como "fracciones activas" de una IL-18BP, o una IL- 8BP viral, muteínas y proteínas fusionadas, la presente invención abarca cualquier fragmento o precursores de la cadena polipeptídica de la molécula de proteína sola o junto con moléculas o residuos asociados enlazados a la misma, por ejemplo, residuos de azúcar o fosfato, o agregados de la molécula de proteína o los residuos de azúcar por sí mismos, siempre que dicha fracción tenga actividad sustancialmente similar a la de la IL- 8BP.

Derivados funcionales de IL-18BP pueden conjugarse con polímeros para mejorar propiedades de la proteína, tales como estabilidad, vida media, biodisponibilidad, tolerancia por el cuerpo humano, o inmunogenicidad. Para lograr esta meta, la IL-18BP puede enlazarse, por ejemplo, a polietilenglicol (PEG). La conjugación con PEG puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos, descritos en el documento WO 92/13095, por ejemplo. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la presente invención, la IL-18BP se conjuga con PEG. En otra modalidad preferida de la invención, el inhibidor de IL-18 es una proteína fusionada que comprende una proteína de unión a IL-18 completa, o parte de la misma, que se fusiona a una inmunoglobulina completa, o parte de la misma. El experto en la técnica entenderá que la proteína de fusión resultante retiene la actividad biológica de la IL-18BP, en particular la unión a la IL-18. La fusión puede ser directa, o mediante un péptido enlazador corto, que puede ser tan corto como 1 a 3 residuos de aminoácido de longitud o más largo, por ejemplo, 13 residuos de aminoácido de longitud. Dicho enlazador puede ser un tripéptido de la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una secuencia de enlazador de 13 aminoácidos que comprenda Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-GÍy-GIn-Phe-Met introducidos entre la secuencia de la IL-18BP y la secuencia de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante tiene propiedades mejoradas, tales como tiempo de residencia extendido en fluidos corporales (vida media), actividad específica incrementada, nivel de expresión incrementado, o se facilita la purificación de la proteína de fusión. La IL-18BP puede fusionarse a la región constante de una molécula de Ig. De preferencia, se fusiona con regiones de la cadena pesada, tales como los dominios CH2 y CH3 de la lgG1 humana, por ejemplo. La generación de proteínas de fusión específicas que comprenden IL-18BP y una porción de una inmunoglobulina, se describe en el ejemplo 11 del documento WP99/09063, por ejemplo. Otras ¡soformas de moléculas de Ig son también adecuadas para la generación de proteínas de fusión de conformidad con la presente invención, tales como las isoformas lgG2 o lgG4, u otras clases de Ig, tales como IgM o IgA, por ejemplo. Las proteínas de fusión pueden ser monoméricas o multíméricas, heteromultiméricas u homomultiméricas. El inhibidor de IL-18 puede ser un antagonista, por ejemplo, una molécula que se une al receptor de IL-18, pero no es capaz de desencadenar la vía de señalización activada tras la unión de la citocina a dicho receptor (por ejemplo, IL1 -Ra, como se describe en Dinarello 1996). Todos los grupos de antagonistas son útiles, ya sea solos o juntos, en combinación con un inhibidor de IL-18, en la terapia de sepsis. El inhibidor de IL-18 puede ser un anticuerpo específico anti-IL-18. los anticuerpos anti-IL-18 pueden ser policlonales o monoclonales, quiméricos, humanizados, o incluso totalmente humanos. Los anticuerpos recombinantes y fragmentos de los mismos se caracterizan por alta afinidad de unión con IL-18 ¡n vivo, y baja toxicidad. Los anticuerpos que pueden usarse en la invención, se caracterizan por su capacidad para tratar pacientes durante un período suficiente para tener regresión buena a excelente o alivio de la condición patogénica, o cualquier síntoma o grupo de síntomas relacionados con una condición patogénica, y una baja toxicidad. Se ha mostrado que la IL-18 se incrementa en el curso de la disfunción cardiaca causada por la sepsis. La co-administración de LSP junto con un inhibidor de IL-18, tal como anticuerpo policlonal anti-IL-18 neutralizante, brinda protección ante la disfunción del miocardio inducida por LPS. Los niveles de anticuerpos neutralizantes se incrementan rápidamente en animales tales como conejos, cabras o ratones mediante inmunización con IL-18. Los ratones inmunizados son particularmente útiles para proveer fuentes de células B para la obtención de hibridomas, los cuales a su vez se cultivan para producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales anti-IL-18. Los anticuerpos quiméricos son moléculas de inmunoglobulina caracterizadas por dos o más segmentos o porciones derivadas de especies animales diferentes. En general, la región variable del anticuerpo quimérico se deriva de un anticuerpo de mamífero no humano, tal como anticuerpo monoclonal de murino, y la región constante de inmunoglobulina se deriva de una molécula de inmunoglobulina humana. De preferencia, ambas regiones y la combinación tienen baja inmunogenicidad, según se determina habitualmente (Elliott et al., 1994). Los anticuerpos humanizados son moléculas de inmunoglobulina creadas mediante técnicas de ingeniería genética en las cuales las regiones constantes de murino se reemplazan con contrapartes de humano, mientras retienen las regiones de unión a antígeno de murino. El anticuerpo quimérico de ratón-humano resultante, tiene de preferencia ¡nmunogenicidad reducida y farmacocinética mejorada en humanos (Knight et al., 1993). De esta manera, en otra modalidad preferida, el anticuerpo de IL-18 es un anticuerpo de IL- 8 humanizado. Ejemplos preferidos de anticuerpos anti-IL-18 humanizados, se describen en la solicitud de patente europea EP 0 974,600, por ejemplo. En otra modalidad preferida, el anticuerpo de IL-18 es totalmente humano. La tecnología para producir anticuerpos humanos se describe en detalle, por ejemplo, en los documentos WO00/76310, WO99/53049, US 6,162,963 o AU5336100. Los anticuerpos totalmente humanos son de preferencia anticuerpos recombinantes, producidos en animales transgénicos, por ejemplo, xeno-ratones, que comprenden loci de IgG humana funcionales completos, o partes de los mismos. Los inhibidores polipeptídicos pueden producirse en sistemas recombinantes procarióticos o eucarióticos, o pueden codificarse en vectores diseñados para elección de genes. Otros inhibidores de citocina pueden usarse junto con inhibidores de IL-18 en el tratamiento de sepsis. Un inhibidor de IL-18 puede usarse en combinación con un inhibidor de IL-12.

El término "inhibición de IL-12", dentro del contexto de esta invención, se refiere a cualquier molécula que module la producción y/o acción de IL-12, de tal forma que la producción y/o acción de IL-12 sea atenuada, reducida, o parcialmente, sustancialmente o completamente suprimida o bloqueada. Un inhibidor de la producción de IL-12 puede ser cualquier molécula que afecte negativamente su síntesis, por ejemplo, interferón a/ß (Karp et al. 2000), o moléculas que afecten negativamente el procesamiento o la maduración de la IL-12. Los inhibidores contemplados de conformidad con la invención pueden ser, por ejemplo, supresores de la expresión génica de la interleucina IL-12, moléculas de ARN mensajero antisentido que reduzcan o prevengan la transcripción del ARN mensajero de IL-12, o ribozimas que lleven a la degradación del ARN mensajero de IL-12, proteínas que deterioren el plegamiento correcto o que prevengan parcialmente o sustancialmente la secreción de IL-12, proteasas que degraden a IL-12, y similares. Los antagonistas de IL-12 ejercen su actividad de varias formas. Los antagonistas puede unirse a la molécula de IL-12 misma, o secuestrar la misma, con afinidad y carácter específico suficientes para neutralizar parcialmente o sustancialmente el epítope o los epítopes de IL-12 que determinan la unión al receptor de IL-12 (denominados en lo sucesivo como "antagonistas secuestrantes"). Un antagonista secuestrante puede ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra IL-12, una forma truncada del receptor de IL-12 que comprenda los dominios extracelulares del receptor o porciones funcionales del mismo, etc. Un antagonista puede inhibir también la vía de señalización de IL- 2 que se activa dentro de las células tras la unión al receptor/IL-12 (denominados en lo sucesivo como "antagonistas de señalización"). Todos los grupos de antagonistas son útiles, ya sea solos o en conjunto, en combinación con un inhibidor de IL-18, en la terapia de sepsis. Los antagonistas de IL-12 se identifican y evalúan fácilmente mediante selección de rutina de candidatos para su efecto sobre la actividad de la IL-12 nativa en líneas de células susceptibles ¡n vitro, por ejemplo, esplenocitos de ratón en los cuales el éster de forbol y la IL-12 causan proliferación. La prueba contiene la formulación de IL-12 a diluciones variables de antagonista candidato, por ejemplo, de 0.1 a 100 veces la cantidad molar de IL-12 usada en la prueba, y controles sin IL-12, antagonista únicamente, o éster de forbol e IL-12 (Tucci et al., 1992). Los antagonistas secuestrantes son los antagonistas de IL-12 preferidos que se usarán de conformidad con la presente invención. Entre los antagonistas secuestrantes, se prefieren los anticuerpos que neutralicen la actividad de la IL-12. De conformidad con la invención, se prefiere el uso simultáneo, secuencial o separado del inhibidor de IL-18 con el antagonista de IL-12. Anti-1L-12 es el antagonista de IL-12 preferido que se usará en combinación con un inhibidor de IL-18, así como derivados de anticuerpo, fragmentos, regiones y porciones biológicamente activas del anticuerpo. El inhibidor de IL-18 puede usarse simultáneamente, secuencialmente o separadamente con el inhibidor de IL-12.

Además, puede usarse un inhibidor de IL-18 en combinación con inhibidores de otras citocinas, que se sabe desempeñan una función importante en el choque séptico, por ejemplo, IL-1 , FNT, IL-8, etc. (véase Dinarello 1996 y Okusawa et al. 1998). Un ejemplo de un inhibidor de IL- es ei antagonista del receptor de IL-1 , y para el FNT, la porción soluble de los receptores FNTRI y FNTR2. El término "inhibición de citocinas" dentro del contexto de esta invención, se refiere a cualquier molécula que module la producción y/o acción referidas de las citocinas (por ejemplo, inhibidores de ICE en el caso de IL-1 ), de tal forma que su producción y/o acción sea atenuada, reducida, o parcialmente, sustancialmente o completamente suprimida o bloqueada. Un inhibidor de producción puede ser cualquier molécula que afecte negativamente la síntesis, procesamiento o maduración de dicha citocina. Los inhibidores contemplados de conformidad con la invención pueden ser, por ejemplo, supresores de la expresión génica de la citocina, moléculas de ARN mensajero antisentido que reduzcan o prevengan la transcripción del ARN mensajero de la citocina, o ribozimas que lleven a la degradación del ARN mensajero, proteínas que deterioren el plegamiento correcto o prevengan parcialmente o sustancialmente la secreción de dicha citocina, proteasas que degraden la citocina, y similares. Los antagonistas de citocina ejercen su actividad de varias formas. Los antagonistas pueden unirse a la molécula de citocina misma, o secuestrar la misma, con afinidad y carácter específico suficientes para neutralizar parcialmente o sustanciaimente el epítope o los epítopes de la citocina responsables de la unión al receptor de citocina (denominados en lo sucesivo como "antagonistas secuestrantes"). Un antagonista secuestrante puede ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra la citocina, una forma truncada del receptor de citocina (por ejemplo, receptor soluble FNTRI y FNTRII en el caso del FNT), que comprenda los dominios extracelulares del receptor o porciones funcionales del mismo, etc. En forma alternativa, los antagonistas de citocinas pueden inhibir la vía de señalización de la citocina activada por el receptor de superficie celular después de la unión a la citocina (denominados en lo sucesivo como "antagonistas de señalización"). Un antagonista puede ser también una molécula que se una al receptor, pero no sea capaz de desencadenar la vía de señalización activada tras la unión de la citocina a dicho receptor (por ejemplo, IL1-Ra, como se describe en Dinarello 1996). Todos los grupos de antagonistas son útiles, ya sea solos o en conjunto, en combinación con un inhibidor de IL- 8, en la terapia de sepsis. El inhibidor de IL-18 puede usarse simultáneamente, secuencialmente o separadamente con los inhibidores de citocina descritos anteriormente. La invención se refiere además al uso de un vector de expresión que comprenda la secuencia de codificación de un inhibidor de IL-18, en la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de sepsis. Se usa de esta manera una alternativa terapéutica génica para tratar y/o prevenir la enfermedad. En forma ventajosa, la expresión del inhibidor de IL-18 será entonces in situ, bloqueando de esta manera eficientemente a la IL- 8 directamente en los tejidos o células afectados por la enfermedad. El uso de un vector para inducir y/o mejorar la producción endógena de un inhibidor de IL-18 en una célula normalmente silenciosa para la expresión de un inhibidor de IL-18, o que expresa cantidades del inhibidor que no son suficientes, se contempla también de conformidad con la invención. El vector puede comprender secuencias reguladoras funcionales en las células que se desea expresen el inhibidor de IL-18. Dichas secuencias reguladoras pueden ser, por ejemplo, promotores o intensificadores. La secuencia reguladora puede introducirse entonces en el locus adecuado del genoma mediante recombinación homologa, enlazando operablemente de esta manera la secuencia reguladora con el gen, cuya expresión se requiere sea inducida o mejorada. La tecnología es referida usualmente como "activación endógena de genes" (EGA) y se describe, por ejemplo, en el documento WO 91/09955. La invención comprende también la administración de células genéticamente modificadas capaces de producir un inhibidor de IL-18, para el tratamiento o prevención sepsis. Los expertos en la técnica entenderán que también es posible suprimir la expresión de IL-18 usando la misma técnica, es decir, introduciendo un elemento de reguiación negativa, por ejemplo, un elemento silencioso, en el locus del gen de IL-18, llevando de esta manera a la subregulación o prevención de la expresión de la IL-18. El experto en la técnica entenderá que dicha subregulación o silenciamiento de la expresión de la 1L-18 tiene el mismo efecto que el uso de un inhibidor de IL-18 para prevenir y/o tratar la enfermedad. Se entiende que la definición de "farmacéuticamente aceptable" abarca cualquier vehículo que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo, y que no sea tóxico para el hospedero al cual se administra. Por ejemplo, para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), las proteínas activas pueden formularse en una forma de dosificación unitaria para inyección en vehículos tales como solución salina, solución de dextrosa, albúmina de suero y solución de Ringer. Los ingredientes activos de la composición farmacéutica de conformidad con la invención, pueden administrarse a un individuo de varias formas. Las vías de administración incluyen las vías intradérmica, transdérmica (por ejemplo, en formulaciones de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, epidural, tópica e intranasal. Puede usarse cualquier otra vía de administración terapéuticamente efectiva, por ejemplo, absorción a través de tejidos epiteliales o endoteliales, o mediante terapia génica, en donde una molécula de ADN que codifica para el agente activo se administra al paciente (por ejemplo, mediante un vector), haciendo que el agente activo sea expresado y secretado in vivo. Además, las proteínas de conformidad con la invención pueden administrarse junto con otros componentes de agentes biológicamente activos, tales como agentes tensioactivos, excipientes, vehículos, diluyentes y vehículos farmacéuticamente aceptables. Para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), las proteínas activas pueden formularse como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua, solución salina, solución de dextrosa) y aditivos que mantengan isotonicidad (por ejemplo, manitol) o estabilidad química (por ejemplo, conservadores y reguladores de pH). La formulación se esteriliza mediante técnicas que se usan comúnmente. La biodisponibilidad de las proteínas activas de conformidad con la invención puede mejorarse también usando procedimientos de conjugación que aumentan la vida media de la molécula en el cuerpo humano, por ejemplo, enlazando la molécula a polietilenglicol, como se describe en la solicitud de patente del PCT WO 92/13095. Las cantidades terapéuticamente efectivas de las proteínas activas serán una función de muchas variables, incluyendo el tipo de antagonista, la afinidad del antagonista por IL-18, cualquier actividad citotóxica residual exhibida por los antagonistas, la vía de administración y la condición clínica del paciente (incluyendo la conveniencia de mantener un nivel no tóxico de actividad de IL-18 endógena). Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es tal que cuando se administra, el inhibidor de IL-18 da como resultado la inhibición de la actividad biológica de IL-18. La dosificación administrada a un individuo, como dosis individuales o dosis múltiples variará, dependiendo de una variedad de factores que incluyen las propiedades farmacoclnéticas del inhibidor de IL-18, la vía de administración, la condición y las características del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud, estatura), extensión de los síntomas, tratamientos concurrentes, frecuencia de tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y la manipulación de las escalas de dosificación establecidas, están bien dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, así como métodos in vitro e in vivo para determinar la Inhibición de IL- 8 en un individuo. De conformidad con la Invención, el inhibidor de IL-18 puede administrarse profilácticamente o terapéuticamente a un individuo que necesita antes de, simultáneamente o secuenciaimente con, otros regímenes o agentes terapéuticos (por ejemplo, regímenes de fármaco múltiples), en una cantidad terapéuticamente efectiva, en particular con un inhibidor de IL-12 y/o inhibidor de IL- , interferón y antagonista de FNT. Los agentes activos que se administran simultáneamente con otros agentes terapéuticos, pueden administrarse en la misma composición o en composiciones diferentes. La invención se refiere además a un método para la preparación de una composición farmacéutica, el cual comprende mezclar una cantidad efectiva de un inhibidor de IL-18 y/o un inhibidor de IL-12 y/o un inhibidor de IL-1 , interferón y/o un antagonista de FNT, con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Habiendo descrito ahora la invención, se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos que se proveen a manera de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Niveles de IL-18BPa e IL-18 en suero, en individuos sanos y pacientes con sepsis La medición de citocinas circulantes específicas y sus inhibidores naturales en salud y enfermedad, provee información acerca de la intervención en la progresión y severidad de una enfermedad. Como se mencionó en la sección de antecedentes de la invención, uno de los mediadores clave de la sepsis es el IFN-?. Puesto que la IL-18 es un coinductor de iFN-?, el nivel de IL-18 y su inhibidor natural, variante de empalme IL-18BPa, se monitoreó en pacientes con sepsis, y se comparó con los niveles encontrados en sujetos sanos mediante el uso de ELISAs específicas (ejemplo 3).

Niveles de 1L-16 e IL-18BPa en sujetos sanos El nivel medio de IL-18 en 107 donadores sanos fue de 64±17 pg/ml, medido mediante la prueba de ECL (Pomerantz et al. 2001 ). Se puso a prueba la prueba de ECL para interferencia mediante proteínas relacionadas. Se encontró que no fue afectada por la presencia de f L-1 p madura o prolLi p, mientras que pro-IL- 8 fue reactiva en forma cruzada. Por consiguiente, tanto como 20% de la IL-18 madura detectada en muestras de suero humano en el presente estudio, puede ser pro-IL-18. La prueba de IL-18 mediante ECL, no fue afectada por IL-18BPa a una concentración < 160 ng/ml. Se pusieron a prueba los niveles de IL-18BPa en el suero de los 107 individuos sanos mediante ELISA (ejemplo 3). Los niveles de IL-18BPa variaron de 0.5 ng/ml a tan altos como 7 ng/ml, con un promedio de 2. 5±0. 5 ng/ml (figura 1 ). Puesto que IL-18 e IL-18BPa están presentes concomitantemente en el suero, parte de la IL-18 puede estar presente en un complejo con IL-18BPa. Se calculó el nivel de IL-18 libre con base en el nivel promedio de IL-18 total (2.15 ng/ml). Se determinó la IL-18 libre de acuerdo a la ley de acción de masas. El cálculo se basó en los siguientes parámetros: la concentración de IL-18 total se determinó mediante la prueba de ECL: la concentración de IL-18BPa total determinada mediante ELISA; una estequiometría de 1 :1 en este complejo de IL-18BPa e IL-18 y una constante de disociación (Kd) de 0.4 nM (Novick et al. 1999 y Kim et al. 2000). En un sistema de equilibrio L+R- -LR, en donde L representa IL- 8 y R representa IL-18BP, las siguientes ecuaciones son aplicables: Kd = [LR]/[L!¡bre][R librej Llibre = Ltotal"LR Rlibre = Rtotal-LR Sustituyendo: Ltotai = 64±17 pg/ml (nivel medio), Rtotai = 2.15±0. 5 ng/ml (promedio) y Kd = 0.4 nM, se encontró que en sujetos sanos aproximadamente 51.2 pg/ml de IL-18 (alrededor de 80% del total), está en su forma libre.

Niveles de IL-18 e IL- 8BPa en pacientes con sepsis Se pusieron a prueba los niveles de IL-18 e IL-18BPa en 192 muestras de suero de 42 pacientes sépticos, inmediatamente después de la admisión y durante la hospitalización. Los niveles de IL-18 e IL-18BPa fueron significativamente más elevados en pacientes con sepsis, en comparación con los sujetos sanos (figura 2A), y se observó una distribución amplia de los valores (figura 2). Además, estos niveles fueron incluso mayores en estos pacientes en el día de la admisión, mostrando un incremento de 22 veces el nivel de IL-18 en comparación con individuos sanos (1.5+0.4 ng/ml contra 0.064±0.17 ng/ml), y un incremento de 13 veces el nivel de IL-18BPa (28.6±4.5 contra 2.15±0.15 ng/ml, figura 2A). No pudo observarse correlación estadísticamente significativa alguna entre los niveles de creatinina y las concentraciones de IL-18 o IL-18BPa en estos sueros (evaluadas medíante la puntuación de APACHE II, Knaus et al. 1993), sugiriendo que los niveles elevados de IL-18 e IL-18BPa en estos pacientes, no se debieron a falla renal. Puesto que los niveles de IL-18 e IL-18BPa en suero en pacientes con sepsis variaron considerablemente (figura 2B), se calcularon los niveles de IL-18 libre en suero en muestras individuales. Los cálculos se hicieron como se describió anteriormente, usando las mismas tres ecuaciones y sustitución de los valores de Kd, Ltotai y Rtotai encontrados experimentalmente. Los cálculos muestran que la IL-18BPa redujo el nivel de IL-18 libre en la mayoría de los pacientes. Notablemente, este efecto fue particularmente marcado cuando la IL-18 total fue muy alta. Por ejemplo, en dos pacientes, la IL-18 en suero alcanzó 0.5 nM (10 ng/ml), un incremento de 50 veces sobre individuos sanos. Sin embargo, al considerar la unión a la IL-18BPa circulante (27 ng/ml y 41.2 ng/ml), el nivel de IL-18 libre en estos dos pacientes disminuyó en 78% y 84%, respectivamente (figura 3). Por lo tanto, la mayor parte de la IL-18 en suero es bloqueada por la IL-18BPa circulante. Sin embargo, de acuerdo a estos cálculos, la IL-18 libre restante es aún mayor que la encontrada en individuos sanos. Por lo tanto, se espera que la administración de IL-18BPa exógena a pacientes sépticos, disminuya aún más el nivel de IL-18 circulante libre, causando alivio de la enfermedad resultante.

EJEMPLO 2 Efecto de IL-18BPa sobre la producción de IFIM-? inducida por S. epidermidis en células presentes en muestras de sangre entera de sujetos sanos Como se mencionó en la sección de antecedentes de la invención, se sabe que la bacteria Gram-positiva Staphylococcus epidermidis causa sepsis. La inducción de citocinas, por ejemplo, IL-1 , IFN-? y FNT-a, es un mediador clave para esta patología. Puesto que la IL-18 es un co-inductor de IFN-?, se puso a prueba el efecto de su inhibición sobre la inducción de IFN-? por Staphylococcus epidermidis. La IL-18BPa usada como el inhibidor de IL-18, era una versión recombinante marcada con histidina producida en células CHO. Se mezclaron 0.5 mi de sangre en tubos de polipropileno de 5 mi de 12x75 mm de fondo redondo (Falcon, Becton Dickinson Labware, FrankIin Lakes, NL), con 0.5 mi de medio de crecimiento del RPMI (Cellgro Mediatech, Hendon, VA complementado con L-glutamina a 10 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 de estreptomicina y FBS a 10% [Gibco BRL, Grand Island, NYJ) que contenía S. epidermidis (de ATCC) con o sin IL-18BP. Las muestras se incubaron a 37°C (C02 a 5%) durante 48 horas, seguido de tratamiento con Tritón X-100 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), a una concentración final de 0.5%, para lisar las células presentes en la muestra de sangre entera. Los tubos que contenían a las muestras se invirtieron varias veces, hasta que la muestra de sangre mostrara una apariencia clara. La concentración de lFN-? en las muestras lisadas de sangre, que representa citocina intracelular y secretada, se midió mediante electroquimioluminiscencia (ECL), como es descrito por Pomerantz et al. (2001 ). Para este estudio, se usó sangre entera de voluntarios sanos no fumadores. La sangre se obtuvo mediante venopunción, y se mantuvo en tubos heparinizados. Se propagó a S. epidermidis en caldo de infusión de cerebro-corazón durante 24 horas, se lavó en solución salina libre de pirógenos, y se hirvió como es descrito por Aiura et al. (1993). La concentración de bacterias destruidas por el calor, se ajustó a 10 células bacterianas por glóbulo blanco (WBC). Los resultados de la figura 4 muestran que la IL- 8BPa es capaz de inhibir la inducción de IFN-? por S. epidermidis. Puesto que se sabe que el IFN-? es co-estimulado por la IL-18 y la IL-12, se puso a prueba el efecto de la combinación de IL-18BPa y anticuerpos específicos anti-IL-12 (Mab 1 1 .5.14 de IL-12 anti-humana, Preprotech, Rocky Hill, NJ), sobre la inducción de IFN-? dirigida por S. epidermidis. Esta inducción se puso a prueba en presencia de 125 ng/ml de IL-18BPa (IL-18BPa marcada con histidina, producida en células COS, y purificada sobre una columna de Talón, como es descrito por Novick et al. 1999), y 2.5 ng/ml de anticuerpo específico de IL-12 anti-humana. Los resultados mostrados en la figura 5, sugieren que anticuerpos específicos de anti-IL-12 potencian el efecto inhibidor de IL-18BPa sobre la inducción de IFN- ? por S. epidermídis.

EJEMPLO 3 Desarrollo de una ELISA específica de IL-18BP La ELISA comprendió dos anticuerpos anti-IL-18BPa: ab 582.10 de murino, un subclon de Mab 582 descrito en el ejemplo 4 como el anticuerpo de captura, y anticuerpo policlonal de conejo para detección (ejemplo 4). Se recubrieron placas de microtítulo de 96 cavidades para ELISA (Maxisorb; Nunc A/S, Roskilde, Dinamarca) con Mab No. 582.10 anti-IL-18BPa (un subclon de MAb 582, 4 en PBS) durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron con PBS que contenía Tween 20 a 0.05% (solución de lavado), y se bloquearon (2 horas, 37°C) con solución de abastecimiento de BSA (KPL, Geithersburg, MD) diluida 1 : 10 en agua. La solución de abastecimiento de BSA se diluyó 1 :15 en agua (diluyente) para la dilución de todas las muestras puestas a prueba y el anticuerpo de detección. Las muestras de suero se diluyeron por lo menos 1 :5 en el diluyente, y se añadieron alícuotas de 100 µ? a las cavidades. Se diluyó rlL-18BPa altamente pura (preparada en células CHO y purificada mediante inmunoafinidad usando Mab N 430 purificado con proteína G específica de IL-18BP mostrada en el cuadro I del ejemplo 4), mediante 7 diluciones dobles graduales (4 a 0.062 ng/ml), y se añadieron a cada placa de ELISA para la generación de una curva normal. Las placas se incubaron durante 2 horas a 37°C, y se lavaron 3 veces con la solución de lavado. Se añadió suero anti-IL-18BPa de conejo (1 :5000 en diluyente, 100 µ?/cavidad), y las placas se incubaron después durante 2 horas a 37°C. Las placas se lavaron tres veces, se añadió un conjugado de peroxidasa de rábano picante anti-conejo-de cabra (HRP, Jackson ImmunoResearch Labs, 1 :10,000 en PBS, 100 pl/cavidad), y las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C. Las placas se lavaron tres veces, y se desarrollaron mediante la adición de substrato de OPD peroxidasa (tabletas de diclorhidrato de o-fenilendiamina, Sigma) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante HCI a 3N (100 µ?), y se determinó la absorbancia a 492 nm mediante un lector de ELISA. La OD se gráfico como la función de la concentración de IL-18BPa, y se observó la linealidad en una escala de 0.12-2.00 ng/ml de IL-18BPa (figura 6). La curva patrón de IL-18BPa en ausencia de suero o en presencia de hasta 20% de suero humano, continuó siendo igual. Puesto que la IL-18BPa se une a IL-18 con una afinidad muy alta, fue necesario determinar si la ELISA distingue entre la IL-18BPa libre y unida. Se encontró que la IL-18 interfiere con la ELISA de IL-18; sin embargo, la interferencia es insignificante en muestra de suero. En 90% de los pacientes con sepsis, los niveles de IL-18 en suero fueron menores de 4 ng/ml (véase más adelante). Dichas muestras de suero tienen la IL-18BPa elevada, requiriendo una dilución de 5 a 20 veces antes de medir la IL-18BPa. A dichas diluciones, la interferencia de IL-18 con ia ELISA de lL-18BPa, es menor de 10% (figura 7). Otras citocinas relacionadas, incluyendo prolL- 8, usadas a un exceso molar de 10 veces sobre IL-18BPa, así como un exceso molar de 200 veces de IL- 1 madura, no interfieren con la prueba. La ¡soforma más abundante de IL-18BP humana, es IL-18BPa, mientras que las isoformas b, c y d son variantes de empalme menores (Novick et al. 1999 y Kim et ai. 2000). La IL-18BPa exhibe la afinidad más alta por la IL-18 (Kim et al. 2000). La afinidad de la IL-18BPc por la IL-18 es 10 veces menor, mientras que las isoformas b y d no se unen a la IL-18 o neutralizan la misma. Fue por lo tanto importante determinar la reactividad cruzada de la IL-18BPa en la ELISA con las otras isoformas de 1L-18BP. Como se muestra en la figura 8, la IL-18BPc humana generó una señal 10 veces menor sobre una base en peso, en comparación con la hulL- 8BPa, mientras que las isoformas humanas b y d generaron una señal insignificante en la ELISA.

EJEMPLO 4 Generación de anticuerpos específicos anti-lL-18BP Se inyectó a un conejo con rlL-18BPa-His6 para la generación de anticuerpos policlonales. Para la producción de anticuerpos monoclonales, se inyectó 5 veces a ratones Balb/C hembras con 10 de IL-18BPa recombinante marcada con histidina (rlL-18BPa-His6). Al ratón que exhibía el título más alto, determinado mediante un radioinmunoensayo invertido (IRIA, ejemplo 5) o RIA de fase sólida (sRIA, ejemplo 5), se le dio un refuerzo final intraperitonealmente 4 y 3 días antes de la fusión. Se prepararon linfocitos de bazo, y se llevó a cabo fusión con células de mieloma NSO/I. Los hibridomas que se encontró producen anticuerpos para IL-18BPa, fueron subclonados mediante dilución limitativa. Los clones generados se pusieron a prueba mediante IRIA (ejemplo 5). Hibridomas representativos se muestran en el cuadro 1.

CUADRO 1 Hibridomas representativos que producen ant¡ IL-18BPa IRIA-, sRIA2 MAb No (cpm) (cpm) 148 23912 7941 297 1652 6483 369 316 12762 430 6887 3254 433 1009 15300 460 3 99 4326 485 400 13010 582 15000 17897 601 1046 1928 i Placas recubiertas con anticuerpos anti-ratón de cabra, e hibridomas detectados con 1251 IL 18BPa. 2Placas recubiertas con IL 18BP urinaria, e hibridomas detectados con 1251 anticuerpos anti-ratón de cabra.

Se desecharon hibridomas que secretan anticuerpos dirigidos contra la marca de histidina. Los anticuerpos se caracterizaron aún más mediante sRIA para la capacidad para reconocer la IL-18BP de ocurrencia natural (purificada de la orina). Las características de unión de varios hibridomas positivos, se muestran en el cuadro 1. Los hibridomas Nos. 148, 430, 460 y 582 fueron positivos con IL-18BP recombinante y urinaria. Se obtuvieron anticuerpos adecuados para Western blotting, inmunoprecipitación, purificación por inmunoafinidad y para el desarrollo de una ELISA específica. Se inyectaron clones positivos que producen anticuerpos específicos anti-IL-18BP en ratones Balb/C cebados previamente con pristano, para la producción de ascitis. Los isotipos de los anticuerpos se definieron con el uso de una ELISA de IgG anti-ratón (Amersham-Pharmacia Biotech). Se usó Mab-582, que era altamente reactivo con la IL-18BP recombinante y nativa (cuadro 1 ), para el ensamble de la ELISA específica de IL-18BP (ejemplo 3). Se pusieron a prueba anticuerpos mediante sRIA en presencia de IL- 8 (ejemplo 5) para su capacidad para reconocer un complejo de IL-18BPa con IL-18. La mayoría de los anticuerpos fueron incapaces de reconocer a 1L-18BP cuando se combinaron con IL- 8. Por lo tanto, estos anticuerpos parecen ser dirigidos contra el dominio de unión al ligando de IL-18BPa.

EJEMPLO 5 Radioinmunoensayos para la detección de clones de células que producen anticuerpos anti-lL-18BP Radioinmunoensavo invertido (IRIA) Se recubrieron placas de microtítulo de PVC (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) durante la noche a 4°C con anticuerpos F(ab)2 anti-ratón de cabra purificados por afinidad (10 100 µ?/cavidad; Jackson ImmunoResearch Labs). Las placas se lavaron entonces dos veces con PBS que contenía Tween 20 a 0.05% (solución de lavado), y se bloquearon con BSA (0.5% en la solución de lavado) durante 2 horas a 37°C. Se añadieron sobrenadantes de cultivo de hibridomas (100 µ?/cavidad), y las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces, se añadió 125l-rlL-18BPa-His6 (105 cpm en 100 µ?) a cada cavidad, y las placas se incubaron durante 5 horas a 22°C. Las placas se lavaron entonces tres veces, y las cavidades individuales se contaron en un contador gamma. Se consideró que eran positivos sobrenadantes que generaban hibridomas, que exhibían radiactividad de unión a niveles cinco veces mayores que el control negativo.

RIA de fase sólida fsRIA) Se usó rlL-18BPa (5 µ?/?t??) como el antígeno de captura, y se usaron anticuerpos anti-ratón de cabra marcados con 25l (100 µ?, 105 cpm) para detección. El bloqueo y los lavados se llevaron a cabo como se describió anteriormente. Se seleccionaron además clones positivos mediante sRIA para su capacidad para reconocer a la IL-18BP aislada de orina humana concentrada (Novick et al. 1999). Las placas de microtítulo se recubrieron con ligando-IL-18BP urinaria purificada por afinidad (1 µ?/???), se bloquearon y se lavaron como se indicó anteriormente. Se añadieron sobrenadantes de hibridoma (100 µ?), y la detección se llevó a cabo con anticuerpos anti-ratón de cabra marcados con 125l (105 cpm en 100 µ?). sRIA para anticuerpos específicos del sitio de unión al ligando de IL-18BP Se recubrieron placas de microtítulo con IL-18BP urinaria (0.5 se bloquearon y se lavaron como en un sRIA. Se añadió IL-18 humana recombinante (50 µ?) a una concentración final de 1 .5 (15 minutos a temperatura ambiente), seguido de la adición de sobrenadantes de hibridoma (50 µ?). La detección se llevó a cabo con anticuerpos anti-ratón de cabra marcados con 25l ( 05 cpm en 100 µ?, 2 horas a temperatura ambiente).

EJEMPLO 6 Contenido de IL-18 del miocardio después de LPS Se ha implicado al FNT e IL-? ß en la disfunción cardiaca durante sepsis. Puesto que la IL-18 es una citocina proinflamatoria que se sabe media la producción del FNTa e i L- 1 ß , se puso a prueba la concentración de IL-18 en disfunción cardiaca inducida por LPS. Se trataron ratones con vehículo (solución salina) o LPS. Se cosecharon corazones a 2, 4 y 6 horas después de la administración de LPS, y se homogeneizaron para determinar el contenido de IL-18 del miocardio mediante ELISA (equipo adquirido de R&D Systems (Minneapoiis MN)). Los resultados en la figura 9 muestran un incremento de dos veces el contenido de IL-18 del miocardio a 4 horas después de la administración de LPS, que indica que la IL-18 interviene en disfunción cardiaca durante la sepsis.

EJEMPLO 7 Efecto de la neutralización de IL-18 sobre la disfunción del miocardio inducida por LPS En el ejemplo anterior, se ha encontrado un incremento en el contenido de IL-18 en disfunción cardiaca inducida por LPS. Por lo tanto, se evaluó el efecto de la neutralización de IL- 8 sobre la disfunción del miocardio inducida por LPS.

Se determinó la función del miocardio mediante una técnica isovolumétrica y no recirculante de Langendorff, según se describió anteriormente (Meng et al. 1998). Se perfundieron corazones aislados con solución normotérmica de Krebs-Henseleit que contenía 11.0 mmoles/l de glucosa, 1.2 mmoles/l de CaCI2, 4.7 mmoles/l de KCI, 25 mmoles/l de NaHC03, 119 mmoles/l de NaCI, 1.17 mmoles/l de MgS04 y 1.18 mmoles/l de KH2P04. Se insertó un globo de látex en el ventrículo izquierdo a través de la aurícula izquierda, y se infló con agua hasta alcanzar una presión diastólica y ventricular izquierda (LVEDP) de 10 mm de Hg. Se unieron alambres de avance a la aurícula izquierda, y se reguló la frecuencia cardiaca a 300 latidos por minuto. Se cuantificó el flujo por coronario colectando el efluente de las arterias pulmonares. La temperatura del miocardio se mantuvo a 37°C. Se registraron continuamente la presión ventricular izquierda desarrollada (LVDP) y sus primeras derivadas (+dP/dt, -dP/dt) y LVEDP, usando un digitalizador-amplificador de presión computarizado (Maclab 8, AD Instrument, Cupertino, CA). Después de un período de equilibrio de 20 minutos, se determinaron LVDP y +/-dP/dt a niveles de LVEDP variados (10, 15 y 20 mm de Hg). Después de la administración de LPS, la presión ventricular izquierda desarrollada (LVDP) se redujo en 38%, en comparación con controles de solución salina (36.3+/-1.9 mm de Hg contra 59.1 +/- mm de Hg, PO.001 (figura 10). El pretratamiento de los ratones 30 minutos antes de la administración de LPS con suero normal de conejo (NRS), tuvo influencia mínima sobre la disfunción del miocardio inducida por LPS; sin embargo, el pretratamiento con anticuerpo neutralizante de IL-18, revocó la disfunción (figura 10). El flujo coronario no fue diferente entre los grupos (datos no mostrados). Los resultados indican que la neutralización de la IL-18, brinda protección contra la disfunción del miocardio inducida por LPS.

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Las referencias citadas en la presente y a lo largo de la especificación, se incorporan en su totalidad en la presente como referencia.

Claims (1)

1. 64 NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 .- El uso de un inhibidor de IL-18 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de sepsis y otras enfermedades características del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), seleccionadas de sepsis severa y choque séptico. 2 - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , para el tratamiento y/o prevención de disfunción cardiaca relacionada con sepsis. 3.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde el inhibidor de IL-18 se selecciona de inhibidores de caspasa-1 (ICE), anticuerpos contra IL-18, anticuerpos contra cualquiera de las subunidades del receptor de IL-18, inhibidores de la vía de señalización de IL-18, antagonistas de IL-18 que compiten con IL-18 y bloquean al receptor de IL-18, inhibidores de la producción de IL-18 y proteínas de unión a IL-18, isoformas, muteínas, proteínas fusionadas, derivados funcionales, fracciones activas o derivados circularmente permutados de los mismos, que tienen por lo menos esencialmente la misma actividad que una proteína de unión a IL-18. 4.- El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde el inhibidor de IL-18 es una proteína de unión a IL-18, o una isoforma, una muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o derivado permutado circularmente de los mismos. 65 5. - El uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde la proteína de unión a IL-18 se conjuga con PEG. 6. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde la proteína fusionada comprende una fusión con Ig. 7.- El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde el inhibidor de IL-18 es un anticuerpo específico anti-IL-18 seleccionado de anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos. 8. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medicamento comprende además un inhibidor de IL-12 para administración simultánea, secuencial o separada. 9. - El uso como se reclama en la reivindicación 8, en donde el inhibidor de IL-12 es un anticuerpo neutralizante. 10. - El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el medicamento comprende además un interferón, para administración simultánea, secuencial o separada. 1 1 . - El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde ei interferón es interferón-ß. 12. - El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde el interferón es interferón-a. 13.- El uso como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el medicamento comprende además un inhibidor de una citocina seleccionada de factor de necrosis tumoral (FNT), IL-1 e IL-18, para administración simultánea, secuencial o separada. 66 14 - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde el inhibidor de FNT es la porción soluble de FNTRI o FNTRII. 15.- El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde el inhibidor de IL-1 es un antagonista del receptor de IL-1. 16.- El uso de un vector de expresión que comprende la secuencia de codificación de un inhibidor de IL-18 seleccionado de inhibidores de caspasa-1 (ICE), anticuerpos contra IL-18, anticuerpos contra cualquiera de las subunidades del receptor de IL-18, inhibidores de la vía de señalización de IL-18, antagonistas de IL-18 que compiten con IL- 8 y bloquean al receptor de IL-18, inhibidores de la producción de IL-18 y proteínas de unión a IL-18, isoformas, muteínas, proteínas fusionadas o derivados circularmente permutados de los mismos, que tienen por lo menos esencialmente la misma actividad que una proteína de unión a IL-18, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de sepsis. 17.- El uso como se reclama en la reivindicación 16, para terapia génica. 18.- El uso de un vector para inducir y/o mejorar la producción endógena de un inhibidor de IL-18 en una célula, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de sepsis. 19.- El use de una célula que ha sido modificada genéticamente para producir un inhibidor de IL-18, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de sepsis.