MXPA03006118A - Proceso de fermentacion controlada metabolica para la produccion de carbamoil tobramicina. - Google Patents
Proceso de fermentacion controlada metabolica para la produccion de carbamoil tobramicina.Info
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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-
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Abstract
Se ha desarrollado un proceso de fermentacion controlada metabolica para la produccion de 6' -O-carbamoil tobramicina mediante la aplicacion de diferentes cepas de Streptomyces tenebrarius en cultivos sumergidos a una temperatura de ntro de 37OC-41OC en un medio que contiene fuentes de carbono y nitrogeno asimilables, sales minerales y controlando las fuentes de carbono y nitrogeno asimilables mediante la carga en una gama optima. Como resultado de esta invencion se pudo lograr una produccion con alto rendimiento de carbamoil tobramicina con alta pureza.
Description
PROCESO DE FERMENTACIÓN CONTROLADA METABÓLICA PARA LA PRODUCCIÓN DE CARBA OIL TOBRAMICINA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con el desarrollo de un proceso de fermentación controlada metabólica para la producción de 6' -O-carbamoil tobramicina.
Más específicamente, la invención revela el cultivo de las cepas Streptomyces tenebrarius para producir 6' -O-tobramicina controlando el proceso de fermentación a través de la regulación de los niveles de glucosa, ácido glutámico y nitrógeno d e amoníaco .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Tobramicina tiene el nombre químico 0 -3-amino-3-desoxi-ot-D-glucopiranosil- (1-6) -O- [2 , 6-diamino-2 , 3 , 6-tridesoxi-a-D-ribo-hexo-piranosil- (1-4) ] -2 -desoxi-D-estreptamina [también denominada "4- [2 , 6-diamino-2-3 , 6-tridesoxi-a-D-glicopiranosil] -6- [3 -amino-3-desoxi-a-D-glicopiranosil] -2-desoxiestreptamina", factor 6 de nebramicina; NF S; Gemebcina; Tobracina; Tobradistina; Tobralex; Tobramaxina; Tobrex. Tobramicina tiene la fórmula química de:
Tobramicina es un antibióti co que tiene un amplio espectro de actividad contra bacterias tanto Gramo positivas como Gramo negativas . Las bacterias sensibles incluyen Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Psudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Proteus mirabelis, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganíi , Haemophilus, influenzae, Haemophilus aegyptius, Moraxlea lacumata, y Acinetobacter calcoaceticus . Se sabe que tobramicina tiene un buen perfil antibacteriano en infecci ones de los ojos y los oídos.
Tobramicina se produce actualmente mediante el cultivo de Streptomyces tenebrarius . La tecnología de lote de carga se usa frecuentemente en la producción de carbamoil tobramicina. En la fermentación de lotes, el metabolismo d el carbono y el nitrógeno no se controla directamente. Debido al agotamiento de los nutrientes, que ocurre durante el período de cultivo, el rendimiento de la carbamoil tobramicina se reduce sustancialmente . La fermentación de carbamoil tobramicina también es notablemente sensible al suministro de oxigeno. Además, la pérdida de volumen resultante de la evaporación durante el cultivo también afecta al rendimiento y la compensación del volumen durante el cultivo introduce un riesgo de contaminación.
Es desea ble desarrollar una tecnología mediante la cual la corrección fina de los perfiles de carga en el transcurso de la fermentación se pueda regular mediante un tecnología de control fino para mejorar la producción de fermentación para carbamoil tobramicina con rendimiento y pureza sustancialmente más altos.
OBJETOS DE LA INVENCIÓN
En consecuencia un objeto de la presente invención es proporcionar un proceso económico y altamente eficiente para producir carbamoil tobramicina. El proceso revelado consiste en el cultivo de los microorganismos productores de 6r -O-carbamoil tobramicina y se relaciona con el control metabólico del proceso de fermentación de 6' -O-carbamoil tobramicina por tales microorganismos de manera de producir una pureza sustancialmente elevada.
Otro objeto de la presente invención es regular selectivamente el nivel constante de nutrición durante el cultivo de los microorganismos que producen 6' -O-carbamoil tobramicina.
Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar el control metabólico del proceso de fermentación de 6' -O-carbamoil tobramicina manteniendo independientemente los niveles de glucosa, ácido glutámico y nitrógeno de amoniaco.
EXTRACTO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un proceso de fermentación de alto rendimiento para la producción de 6' -O-carbamoil tobramicina en cultivos sumergidos a una temperatura en la gama de 37 °C a 41°C en un medio que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y una sal mineral .
El proceso preferentemente incluye los pasos de cultivar una cepa del microorganismo productor de 6' -O-tobramicina en un caldo de fermentación estable para la producción de 6' -O-carbamoil tobramicina, por lo cual el metabolismo del carbono y el nitrógeno de la cepa durante el metabolismo se controlan a un nivel de glucosa del 0,001% al 0,5%, a un nivel del ácido glutámico del 0,005% al 0,1% y el nivel de nitrógeno de amoniaco del 0,03% al 0,2% cargando continuamente la glucosa, el glutamato de sodio y la solución de amonio. En el método de acuerdo con la invención, la regulación de los nutrientes preferentemente se realiza independientemente uno de otro.
De acuerdo con una realización, el fosfato inorgánico se carga durante la fermentación en una cantidad del 0,001% al 0,002% por día.
La presente invención proporciona un proceso para producir 6' -O-carbamoil tobramicina desde Streptomyces tenebrarius mientras se controla metabólicamente la producción de 6' -O-carbamoil tobramicina, que comprende los pasos de: a) preparar un caldo de fermentación que contiene el microorganismo productor de 6' -0-carbamoil tobramicina; b) regular un nivel constante de la fuente de carbono asimilable y la fuente de nitrógeno asimilable; y c) recuperar la 6r -O-carbamoil tobramicina.
La presente invención proporciona que el medio de fermentación tiene una gama de temperatura de 37 °C a 41°C.
La presente invención provee que el medio de fermentación es un cultivo sumergido.
La presente invención provee que el caldo de fermentación contiene fuentes de carbono asimilable, nitrógeno a similable, sales minerales usando diferentes cepas de Streptomyces tenebrarius .
La presente invención provee que las fuentes de carbono y nitrógeno asimilables se controlan a un nivel de glucosa del 0,001% al 0,5%. La presente invención además provee que las fuentes de carbono y nitrógeno asimilables se controlan a un nivel del ácido glutámico del 0,005% al 0,1%. La presente invención provee además que las fuentes de carbono y nitrógeno asimilables se controlan a un nivel del nitrógeno de amoniaco del 0,03% al 0,2%.
La presente invención provee que las fuentes de carbono y nitrógeno asimilables se controlan cargando continuamente una solución de glucosa, glutamato de sodio y amoniaco (NH +) independientemente una de otra.
La presente invención además prov ee ajustar el pH de la glucosa con ácido fosfórico. Preferentemente la gama de pH de la solución de glucosa es de 4 a 5. La invención además provee un fosfato inorgánico que se puede cargar en el medio de fermentación con glucosa en una cantidad del 0,001% al 0,002% por dia.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Como se usan aquí, el término "ppm" se refiere a partes por millón; "rpm" se refiere a revoluciones por minuto, y "vvm" se refiere a volumen por volumen por minuto.
Como se usa aquí, el término " N¾-N" se refiere a nitrógeno de amoniaco .
A menos que se especifique lo contrario, el término se refiere a porcentaje en peso contra peso. Por ejemplo, un 0,001% de glucosa significa 0,001 gramo de glucosa contra 100 gramos del caldo de fermentación. Como se usa aquí, el término "6' -O-carbamoil-tobramicina" se refiere a una forma carbamoilizada de tobramicina. Durante la síntesis de tobramicina, ésta se biosintetiza en una forma carbamoilizada que es la 6' -O-carbamoil-tobramicina. Se la denomina también carbamoil tobramicina.
Como se usa aquí, el término "tecnología de lotes de carga" se refiere a una fermentación en donde uno o más componentes nutrientes se agregan al lote durante el proceso de fermentación. Cuando se agrega uno o más incrementos de nutriente durante la fermentación (del 1% al 2%), ésta se denomina fermentación "bang -bang" . Cuando se agrega un gran número de porciones pequeñas de nutriente durante la fermentación (del 0,02% la 0,05%) o carga continua (ininterrumpida) verdadera, se den omina fermentación de carga continua. Como se usa aqui, el término "carga continua" se refiere a la carga de pequeñas porciones (del 0,02% al 0,05%) o carga verdaderamente continua de nutrientes y oxigeno.
Como se usa aqui, el término "asimilable" se refi ere a un microorganismo dado que tiene un sistema de enzimas para la absorción de nutrientes y el consumo o uso o descomposición de tales nutrientes para usar en la biosintesis de constituyentes complejos del microorganismo.
Como se usa aqui, el término " una sal mineral" se refiere a una sal de un elemento y vestigio de elemento biológicamente importante que incluyen calcio, magnesio, hierro, zinc, fosfato, manganeso, sodio, potasio y cobalto.
Como se usa aqui, el término ^fermentador principal" se refiere a un recipiente usado en el proceso de fermentación usado para el cultivo de Streptojmyces y para la producción de 6r -O-carbamoil tobramicina .
Por consiguiente, la invención provee un proceso para producir 6' -O-carbamoil tobramicina controlando individualmente el proceso de fermentación; preferentemente, regulando continuamente los niveles de glucosa, ácido glutámico y nitrógeno de amoniaco; más preferentemente cada uno en forma independiente del otro.
De acuerdo con la presente invención, tobramicina se biosintetiza en una forma carbamoilizada, es decir, la 6' -O-carbamoil-tobramicina. El tipo, índice, y relación del metabolismo de carbono y nitrógeno es importante en la formación de 6r -O-carbamoil tobramicina. En la fermentación de lote, este metabolismo no se controla directamente. La presente invención provee optimizar los niveles de glucosa y ácido glutámico en el caldo de fermentación, y optimizar la relación del metabolismo de carbono o nitrógeno para la formación de carbamoil tobramicina. Basado en esta información, la presente invención además provee una nueva tecnología de fermentación para la producción de 6" -O-carbamoil tobramicina (es decir, la tecnología de lotes controlada) . Si bien generalmente se conocen y usan tecnologías de lotes de carga para tros productos de la fermentación, la presente invención proporciona una tecnología de lotes de carga controlada para 6' -O-carbamoil tobramicina controlando el metabolismo de carbono y nitrógeno asimilables que es único para 6' -O-carbamoil tobramicina.
En el proceso de fermentación de esta invención, se pueden usar diferentes fuentes de carbono y nitrógeno asimilables. Una realización preferida de la presente invención consiste en usar glucosa o ácido glutámico (o su sal) como una fuente de carbono asimilable. Otra realización preferida de la presente invención consiste en usar nitrógeno de amoniaco como fuente de nitrógeno asimilable .
De acuerdo con la presente invención, la fuente de nitrógeno asimilable se selecciona del grupo de compuestos orgáni eos e inorgánicos metabolizables . Tales compuestos incluyen urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio y similares, y mezclas de ellos. Preferentemente, el nitrógeno de amoniaco es sulfato de amonio [(NH4)2S04] .
De ac uerdo con la presente invención, regular los niveles de glucosa, ácido glutámico y "nitrógeno de amoniaco" es importante en la biosintesis de carbamoil tobramicina. La presente invención provee un proceso de fermentación para 6' -O-carbamoil tobramicina en donde "al menos uno de los niveles de glucosa, ácido glutámico o nitrógeno de amoníaco" se controla o regula a un nivel constante, lo cual deriva en un mejor rendimiento y pureza de 6' -O-carbamoil tobramicina.
Un microorganismo productor de 6' -O-carbamoil tobramicina preferido para llevar a cabo el proceso de fermentación de la invención es Streptomyces tenejbrarius . Preferentemente Streptomyces tenebrarius es la cepa de Streptomyces tenebrarius depositada como NCAIM B (P) 000169. Preferentemente Streptomyces tenebrarius es la cepa de Streptomyces tenebrarius depositada como NCAIM B (P) 000204.
En una realización de la invención, el nivel de glucosa se regula del 0,001% al 0,5%. Preferentemente, el nivel de glucosa se regula del 0,001% al 0,4%. Más preferente mente, el nivel de glucosa se regula del 0,001% la 0,05%.
En otra realización de la invención, el nivel del ácido glutámico se regula del 0,005% al 0,1%. Más preferentemente, el nivel del ácido glutámico se regula del 0,001% al 0,1%.
I En otra realización preferida de la invención, el ácido glutámico en la forma de sal (e . glutamato de sodio) se regula del 0,005% al 0,1%. Más preferentemente, el nivel del glutamato se regula del 0,001% al 0,1%.
En otra realización de la invención, el nivel del nitrógeno de amoniaco se regula del 0,03% al 0,2%. Más preferentemente, el nivel del nitrógeno de amoniaco se regula del 0,02% al 0,2%.
Preferentemente, la fermentación metabólica controlada de 6' -0-carbamoil tobramicina se realiza cargando continuamente la solución de glucosa, glutamato de sodio y nitrógeno de amoníaco independientemente uno de otro .
Tobramicina es un antibiótico de tipo de aminoglicósido . Durante su biosíntesis de 6' -O-carbamoil tobramicina, hay dos formas de catabolismo de la glucosa: el ciclo de Embden-Mayerhoff-Parnass y el desvío de Monofosfato de Hexosa en donde los productos catabólicos pueden suprimir la biosíntesis de 6' -O-carbamoil tobramicina. La fermentación controlada metabólica se regula manteniendo el nivel de la glucosa en el cald o de fermentación. Preferentemente, la glucosa se mantiene a un bajo nivel (ej . del 0,001% al 0,5%) para asegurar la ausencia de supresión de catabolitos de glucosa (o intermedios de catabolitos de glucosa) .
En forma similar, la fermentación controlada metabólica se regula manteniendo el nivel de ácido glutámico en el caldo de fermentación. Preferentemente, el ácido glutámico (o su sal) se mantiene a un nivel bajo (ej . del 0,005% al 0,1%) para asegurar la ausencia de supresión de catabolitos de glucosa.
En forma similar, la fermentación controlada metabólica se regula manteniendo el nivel de nitrógeno de amoniaco en el caldo de fermentación. Preferentemente, el nitrógeno de amoníaco se mantiene a un bajo nivel (ej . del 0,03% al 0,2%) . Regular el nivel de nitrógeno de amoniaco a un bajo nivel asegura el amplio suministro de sustratos para el proceso de transaminación sin los problemas asociados con los productos catabólicos .
La presente invención provee la fermentación controlada metabólica manteniendo el nivel de al menos uno de glucosa, ácido glutámico y nitrógeno de amoníaco.
En otra realización de la invención, el fosfato inorgánico se carga en el medio de fermentación con la condición de que la cantidad total de él sea suficiente para permitir que el proceso de fermentación avance eficazmente. Preferentemente, la cantidad del fosfato inorgánico está en la gama de cantidad del 0,001% al 0,002% por día.
La presente invención provee la fermentación controlada metabólica de 5' -O-carbamoil tobramicina en d onde el rendimiento mejorado de 6' -O-carbamoil tobramicina es generalmente superior al 30%.
La invención además se describe en los siguientes ejemplos que de ninguna manera intentan limitar el alcance de la invención.
EJEMPLOS Ejemplo 1
Medio de Cultivo, Medio de Gramo/litro Fermentación Principal , gramo/litro Dextrosa 50 Monohidratada Alimento de semilla 20 35 de soj a Caseína ácida 2,5 6, 75 Pancreatina 0, 05 0, 17 Cloruro de amonio 3 5 Nitrato de amonio 1 Sulfato de magnesio 5 Nitrato de cobalto 0, 01 0, 01 Carbonato de calcio 3 5 Aceite de soja 15 16 Aceite de palma 15 16 Sulfato de zinc 1
Cultivo de fftreptomyces tenebrarius en un Medio de Cultivo
Se preparó un medio de cultivo (sin glucosa) en un recipiente de 60 litros. El medio d e cultivo se esterilizó a 121°C durante 60 minutos .
Por separado se preparó una solución de glucosa. El pH de la solución de glucosa se ajustó con ácido clorhídrico a un valor ede 4,0 a 5,0. La esterilización de la solución de glucosa se hizo a 121 °C dura nte 30 minutos. La solución de glucosa esterilizada se agregó en el medio de cultivo esterilizado.
La cepa de Streptomyces tenebrarius (NCAIM B (P) 000169) se inoculó en una cantidad de 500 mi del medio de cultivo estéril (con glucosa). Se dejó desarrollar un cultivo de células vegetales de la cepa Streptomyces tenebrarius a una fase logarítmica. El cultivo se llevó a cabo a los parámetros de temperatura: 37 °C, presión de la cabeza: 0,4 bar, velocidad de mezcla: 2,6 m/segundo y relación de aireación: 0,4 ppm.
Cultivo de Streptomyces tenebrarius en un Medio de Fermentación
Se preparó un medio de fermentación principal (sin glucosa) en un recipiente de 300 litros. El medio de fermentación principal se esterilizó a 121°C durante 60 minutos.
Por separado se p reparó una solución de glucosa. La solución de glucosa se ajustó a un pH de 4,0 a 5,0 usando ácido clorhídrico. La solución de glucosa se esterilizó a 121°C durante 30 minutos. La solución de glucosa esterilizada se agregó en el medio de fermentación principal después de la esterilización.
El transporte de la etapa de cultivo al fermentador fue después de 24 horas de cultivo. La relación de transporte de la etapa de cultivo a la fermentación principal fue del 100%. Los parámetros de cultivo para el ferment ador principal fueron los siguientes . Temperatura dentro de 0-70 horas: 37°C y dentro de las 70 horas -hasta el final del proceso de fermentación: 39°C; índice de aireación: 0,1 ppm; velocidad de agitación: 250 rpm; presión interna : 0,2 bar .
Se preparó una solución de glutamato de sodio en una cantidad de 8 gramos/litro del medio. Se preparó también una solución de sulfato de magnesio en 10 gramos/litro del medio. Ambas soluciones de glutamato de sodio y sulfato de magnesio se esterilizaron a 121°C durante 60 minutos. Ambas soluciones luego se agregaron en un volumen de 20 litros al cultivo de fermentación principal a esta edad de 24 horas. El cultivo se hizo durante 144 horas.
El contenido inicial de glucosa del medio se agotó a la 80a hora de la fermentac ión. El contenido inicial de glutamato del medio se consumió completamente a la 60a hora de la fermentación. El contenido inicial de 120 mg/100 mi de ?? 3-N (medido por la titulación de "Formol") del medio se redujo a menos de 60 mg/100 mi a la 50a hora de la fermentación y se consumió completamente al final de la fermentación.
El rendimiento logrado medido por HPLC fue 1.856 µg/gramo de apramicina, 678 g/gramo de carbamoil kanamicina y 1.968 µg/gramo de 6' -O-carbamoil tobramicina.
Ej emplo 2
Medio de Cultivo, Medio de Gramo/litro Fermentación Principal , gramo/litro
Dextrosa 30 50 Monohidratada Alimento de semilla 20 50 de soja Sulfato de magnesio 5 Sulfato de amonio 3 5 Carbonato de calcio 3 5 Aceite de soja 30 32 Sulfato de zinc 1 Fosfato de 0, 45 dihidrógeno de potasio
Cultivo de Streptomyces tenebrarius en Medio de Cultivo
Se preparó un medio de cultivo en un recipiente de 60 litros, medio de cultivo se esterilizó a 121°C durante 60 minutos.
Se preparó por separado una solución de glucosa. La solución de glucosa se ajustó usando ácido clorhídrico de 4,0 a 5,0. El medio de glucosa se esterilizó a 121°C durante 30 minutos. El medio de glucosa esterilizado se agregó al medio de cultivo después de la esterilización.
La cepa de Streptomyces tenebrarius (NCAIM B (P) 000169) se inoculó en una cantidad de 500 mi del medio de cultivo esterilizado. Se dejó desarrollar una cepa de Streptomyces tenebrarius de cultivo de células vegetales a una fase logarítmica. Los parámetros del cultivo fueron similares a los descritos en el Ejemplo 1.
Cultivo de Streptomyces tenebrarius en Medio de Fermentación Principal
Se preparó un medio de fermentación principal en un recipiente de 300 litros. El medio de fermentación principal se esterilizó a 121°C durante 60 minutos.
Se preparó por separado una solución de glucosa. La solución de glucosa se ajustó con ácido clorhídrico de 4,0 a 5,0. La solución de glucosa se esterilizó a 121°C durante 30 minutos. La solución de glucosa esterilizada se agregó al medio d e fermentación principal después de la esterilización.
La condición del transporte de la etapa de cultivo al fermentador principal fue similar a la descrita en el Ejemplo 1. El tiempo de cultivo fue de 20 horas. Los parámetros de cultivo con la carga hecha a la 24a hora fueron similares a los descritos en el Ej emplo 1.
El agotamiento (es decir el consumo) del contenido de glucosa, glutamato y nitrógeno de amoniaco del medio fueron similares a los descritos en el Ejemplo 1.
El rendimiento logrado medido p or HPLC fue 2.150 µg/gramo de 6' -O-carbamoil tobramicina.
Ejemplo 3
Se preparó un medio de cultivo en forma similar a la descrita en el Ejemplo 2. La inoculación se hizo por el cultivo vegetal de 500 mi de la cepa de Streptomyces tenebrarius (NCAIM B(P)
000204) . Los parámetros del cultivo fueron similares a los descritos en el Ejemplo 1.
ün medio de fermentación principal se preparó en forma similar a la descrita en el Ejemplo 2. La condición del transporte de la etapa de cultivo fue similar a la descrit a en el Ejemplo 1 y el tiempo de cultivo utilizado fue de 18 horas. Los parámetros del cultivo con la carga hecha a la 24a hora fueron similares a los descritos en el Ej emplo 1.
El agotamiento del contenido de glucosa, glutamato, y nitrógeno de amoniaco d el medio fue también similar al descrito en el Ejemplo 1.
El rendimiento logrado medido por HPLC fue 2.210 µg gramo de 6' -O-carbamoil tobramicina.
Ejemplo 4
Se preparó un medio de cultivo en forma similar al descrito en el Ejemplo 2. La inoculación se hizo por 500 mi de cultivo vegetal de la cepa de Streptomyces tenebrarius (NCAIM B(P) 000169). Los parámetros del cultivo fueron similares a los descritos en el Ejemplo 2.
Un medio de fermentación principal se preparó en forma similar a la descrita en el Ejemplo 2, pero el pH de la solución de glucosa se ajustó con ácido fosfórico. La condición del transporte de la etapa de cultivo fue similar a la descrita en el Ejemplo 1, pero el tiempo de cultivo fue de 18 horas. Los parámetros del cultivo con la carga hecha a la 24a hora fueron similares a los descritos en el Ej emplo 1.
Además, se preparó una solución de glutamato de sodio al 50% y se esterilizó a 121°C durante 60 minutos, y luego la solución de glucosa al 50% se preparó y después del ajuste del pH de 4,0 a 5,0 por el ácido fosfórico se esterilizó a 121°C durante 30 minutos. El contenido del fosfato de la solución de glucosa fue en la gama del 0,05% al 0,2%. La carga de estas soluciones se llevó a cabo a la 24a hora de la fermentación hasta el final controlando en la fase de producción el contenido de glucosa y glutamato en al gama del 0,001% al 0,05% y del 0,0011% al 0,1%, respectivamente. Además de las concentraciones precedentes, la solución de amoniaco también se cargó para controlar el contenido de nitrógeno de amoniaco en al gama de 30 a 200 mg7100 mi (es decir, del 0,03% al 0,2%).
El rendimiento logrado medido por HPLC fue de 3.150 µ9^^??? de 6' -O-carbamoil tobramicina.
Ej emplo 5
Se preparó un medio de cultivo en forma similar a la descrita en el Ejemplo 2. La inoculación se hizo por 500 mi de cultivo vegetal de la cepa de Strepto yces tenebrarius (NCAIM B(P)
000204) . Los parámetros de cultivo fueron similares a los descritos en el Ejemplo 2.
La condición del transporte de la etapa de cultivo fue similar a la descrita en el Ejemplo 1 y el tiempo de cultivo fue de 16 horas .
Se preparó un medio de fermentación principal en forma similar a la descrita en el Ejemplo 4. En forma similar al Ejemplo 4, se preparó una solución de glutamato de sodio al 50% y se esterilizó a 121°C durante 60 minutos. Se preparó una solución de glucosa al 50% y después del ajuste del pH de 4,0 a 5,0 por ácido fosfórico y luego se esterilizó a 121°C durante 30 minutos. Las condiciones de la fermentación con la carga contro lada metabólica fueron similares a las descritas en el Ejemplo 4. La carga de estas soluciones se llevó a cabo desde la 24a hora de la fermentación hasta el final controlando en la fase de producción el contenido de glucosa y glutamato en la gama del 0,001% al 0,5% y del 0,001% al 0,1%, respectivamente. Además de la concentración precedente, la solución de amoniaco se cargó para controlar el contenido de nitrógeno de amoniaco del cultivo de fermentación en la gama de 20 a 200 mg/100 mi (es decir, del 0,02% al 0,2%).
El rendimiento logrado medido por HPLC fue de 4.030 µg/gramo de 6' -O-carbamoil tobramicina.
La aplicación de la tecnología de lote de carga provee una actividad más alta de 6' -O-carbamoil tobramicina en el caldo de fermentación .
Como resultado de la carga no solamente se compensó la pérdida de volumen debido a la evaporación, sino que también se puede conseguir un aumento en el volumen sometido al tratamiento final del lote, lo cual deriva en una utilización más eficiente del volumen del fermen tador y una mayor cantidad del ingrediente activo cosechado también. Debido a la posibilidad de la corrección fina de los perfiles de carga en el transcurso de la fermentación se puede obtener una tecnología controlada de alto nivel, sofisticada. La presen te invención proporciona un proceso de fermentación mediante el cual se asegura una corrección de los perfiles de carga porque se regulan los niveles de glucosa, glutamato y nitrógeno de amoníaco.
La fermentación de carbamoil tobramicina es muy sensible a 1 suministro de oxígeno. Este parámetro se puede controlar más fácilmente en el caso de la tecnología de lote de carga ajusfando la presión interna y el índice de aireación al valor óptimamente demandado. Por ejemplo, usando un índice de aireación superior a 0,1 vvm o una presión contrapresión superior a 0,2 bar, el título de 6' -O-carbamoil tobramicina comienza a disminuir y el nivel de Kanamicina B (contaminante) aumenta (ej . la relación de 6r -0-carbamoil tobramicina/Kanamicina B es peor) . Aún a un índice de aireación de 0,2-0,4 vvm, el título puede disminuir un 20% -25% y el nivel de Kanamicina B se puede duplicar. De acuerdo con la presente invención, la formación de impurezas se puede controlar fácilmente usando la tecnología de lote de carga usando la técnica de fermentación controlada metabólica. Por consiguiente, además de ajustar la presión interna y el índice de aireación de la fermentación, se logra un mejor valor óptimo demandado de 6' -O-carbamoil tobramicina cargando continuamente fuentes de carbono asimilable y fosfato inorgánico.
Por consiguiente, las ventajas se pueden efectuar más fácilmente usando la carga continua en relación con la carga similar al lote (Ver Patente BG 50996) .
Mediante la aplicación de un proceso de lotes de carga la composición de un medio de cultivo inicial más simple se puede preparar y proporciona una posibilidad para mejorarla eliminando los componentes de origen animal (e . caseína hidrolizada, etc.) y evitando el riesgo de la contaminación con Encefalopatía Espongiforme Bovina (BSE) .
La presente invención no está limitada en su alcance por las realizaciones específicas descritas aguí. De hecho, diferentes modificaciones de la invención además de agüellas descritas aguí se harán evidentes para los expertos en el arte a partir de la descripción precedente y las figuras gue la acompañan. Tales modificaciones están dentro del alcance de las reivindicaciones. Aguí se citan diferentes publicaciones, cuyas invenciones se incorporan como referencia en su totalidad.
Claims (31)
1. ün proceso para producir 6' -O-carbamoil tobramicina desde un microorganismo productor de 6' -O-carbamoil tobramicina, que comprende los pasos de : a) preparar un caldo de fermentación que contiene el microorganismo productor de 6' -O-carbamoil tobramicina; b) regular un nivel de contenido de fuente de carbono asimilable y fuente de nitrógeno asimilable; c) recuperar la 6' -O-carbamoil tobramicina.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo productor de 6' -O-carbamoil tobramicina es Streptomyces tenebrarius.
3. El proceso de la reivindicación 1, en donde la fuente de carbono asimilable es glucosa.
4. El proceso de la reivindicación 3, en donde la glucosa se regula a un nivel constante en la gama del 0,001% al 0,5%.
5. El proceso de la reivindicación 3, en donde la glucosa se regula a un nivel de contenido en la gama del 0,001% al 0,4%. 2
6. El proceso de la reivindicación 3, en donde la glucosa se regula a un nivel constante en la gama del 0,001% al 0,05%.
7. El proceso de la reivindicación 1, en donde la fuente de carbono asimilable es ácido glutámico.
8. El proceso de la reivindicación 1, en donde la fuente de carbono asimilable es glutamato de sodio.
9. El proceso de la reivindicación 7 u 8, en donde la fuente de carbono asimilable se regula al nivel constante en la gama del 0,005% al 0,1%.
10. El proceso de la reivindicación 7 u 8, en donde la fuente de carbono asimilable se regula a un nivel constante en la gama del 0,001% al 0,1%.
11. El proceso d e la reivindicación 1, en donde la fuente de nitrógeno asimilable es nitrógeno de amoniaco.
12. El proceso de la reivindicación 11, en donde el nitrógeno de amoniaco se selecciona de urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, nitrato d e amonio y la mezcla de ellos . 3
13. El proceso de la reivindicación 11, en donde el nitrógeno de amoniaco es sulfato de amonio.
14. El proceso de la reivindicación 11, en donde el nitrógeno de amoniaco se regula a un nivel constante en la gama del 0,03% al 0,2%.
15. El proceso de la reivindicación 11, en donde el nitrógeno de amoniaco se regula a un nivel constante en la gama del 0,02% al 0,2%.
16. El proceso de la reivindicación 1, en donde un nivel de contenido de la fuente de carbono asimilable y la fuente de nitrógeno asimilable en el caldo de fermentación se regula cargando continuamente glucosa, glutamato de sodio y sulfato de amonio .
17. El proceso de la reivindicación 16, en donde la carga continua de glucosa, glutamato de sodio y sulfato de am onio ocurren independientemente uno de otro.
18. El proceso de la reivindicación 1, gue además comprende una carga continua de una sal mineral . 4
19. El proceso de la reivindicación 18, en donde la sal mineral se selecciona del grupo formado por calcio, ma gnesio, hierro, zinc, fosfato, manganeso, sodio, potasio y cobalto.
20. El proceso de acuerdo con las reivindicaciones 4, 5, 6, en donde la solución de glucosa se ajusta a un pH entre 4,0 y 5,0.
21. El proceso de la reivindicación 20, en donde el pH de 1 a solución de glucosa se ajusta usando un fosfato inorgánico.
22. El proceso de la reivindicación 21, en donde el fosfato inorgánico es ácido fosfórico.
23. El proceso de la reivindicación 22, en donde el fosfato inorgánico se carga durante la fermentad ón en la cantidad del 0,001% al 0,002% por dia.
24. El proceso de la reivindicación 2, en donde la cepa de Streptomyces tenebrarius es MCAIM B(P) 000169.
25. El proceso de la reivindicación 2, en donde la cepa de Streptomyces tenebrarius es NCAIM B(P) 000204.
26. El proceso de la reivindicación 1, en donde la fermentación es un cultivo sumergido .
27. El proceso de la reivindicación 1, en donde la fermentación se mantiene a una gama de temperatura de 37 °C a 41 °C.
28. 6r -O-carbamoil tobramicina producida de acuerdo con la reivindicación 1.
29. Una formulación útil en el tratamiento de enfermedades infecciosas en humanos que comprende 6' -O-carbamoil tobramicina producida de acuerdo con el proceso de la reivindicación 1.
30. Una formulación útil en el tra tamiento de una infección de los ojos y los oídos en humanos que comprende 6' -O-carbmoil tobramicina producida de acuerdo con el proceso de la reivindicación 1.
31. La formulación de acuerdo con la reivindicación 20 o 30, en donde 6' -O-carbamoil tobramici na producida de acuerdo con el proceso de la reivindicación 1 elimina bacterias seleccionadas del grupo formado por Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Psudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter aerojenes Proteus mirabelis, 6 Klebsiella pneumoniae, Morganella morganil , Haemophilus influenzae, Haemophilus aegyptius, Moraxlea lacumata, y Acinetobacter calcoaceticus.
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