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CN1330750C - 磷酸甘油酸族氨基酸及氨基酸衍生物的发酵制造方法 - Google Patents

磷酸甘油酸族氨基酸及氨基酸衍生物的发酵制造方法 Download PDF

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CN1330750C
CN1330750C CNB031786677A CN03178667A CN1330750C CN 1330750 C CN1330750 C CN 1330750C CN B031786677 A CNB031786677 A CN B031786677A CN 03178667 A CN03178667 A CN 03178667A CN 1330750 C CN1330750 C CN 1330750C
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Abstract

本发明涉及一种微生物菌株，该菌株适用于磷酸甘油酸族氨基酸或其衍生物的发酵制造且可由一起始菌株制得，该起始菌株的特征为具有增强的yfiK基因产物或yfiK同源物基因产物的活性。

Description

磷酸甘油酸族氨基酸及氨基酸衍生物的发酵制造方法
技术领域
本发明的内容是一种藉发酵作用以制造如：O-乙酰基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-丝氨酸、L-半胱氨酸、LL-胱氨酸及L-半胱氨酸衍生物等磷酸甘油酸(phosphoglycerate)族氨基酸及氨基酸衍生物的方法。
背景技术
目前二十种天然蛋白质氨基酸通常是经由微生物发酵作用制得。此处所利用的事实是：微生物具有此类天然氨基酸合成所需的适当生物合成途径。
但，此类生物合成途径是在野生型菌株内加以严格地调节，以确保细胞所制造的此类氨基酸仅供其本身需要。所以有效制造方法的重要先决条件是：可获得适当的微生物，与野生型微生物不同的是，其制造所需的氨基酸的功能被大幅提高。
此类超量生产氨基酸的微生物可借助于传统突变/选择方法及/或现代特定重组体技术(“代谢工程(metabolic engineering)”)制得。后者首先涉及到那些由其修饰作用、激活作用及失活作用可导致超量生产的基因或等位基因鉴定工作。借助于分子生物学技术，随后将此类基因/等位基因引进一微生物菌株内或使之失活以达到最佳超量生产。但，通常，唯有将许多不同措施组合起来方可达到真正有效的生产。
此类氨基酸的磷酸甘油酸族是基于此类氨基酸是藉生物合成作用由3-磷酸甘油酸衍生出来的事实而加以界定的。初始时，经由中间产物3-磷酸羟基丙酮酸酯及3-磷酸-L-丝氨酸，该天然代谢途径抵达L-丝氨酸。L-丝氨酸可进一步转化为甘氨酸或经由O-乙酰基-L-丝氨酸转化为L-半胱氨酸。
现有技术中已知的、可用于超量生产氨基酸的、用作发酵制造磷酸甘油酸族氨基酸(尤其是L-丝氨酸及L-半胱氨酸)的若干基因/等位基因为：
-SerA等位基因，如欧洲专利EP 0620853 B1或EP 0931833 A2中所述。此类serA等位基因编码3-磷酸甘油酸脱氢酶，L-丝氨酸对此类3-磷酸甘油酸脱氢酶反馈抑制作用是减低的。如此基本上消除了细胞的丝氨酸水平对3-羟基丙酮酸的形成的影响。
-cysE等位基因，如
-WO97/15673(并此以供参考)或
-中森等人所著，1998，应用环境微生物64：1607-1611(并此以供参考)或
-高木等人，1999，欧洲生物化学学会联合会通讯，452：323-327中所述，此类cysE等位基因已被引进一微生物菌株内。
此类cysE等位基因编码丝氨酸O-乙酰基转移酶，L-半胱氨酸对此类丝氨酸O-乙酰基转移酶的反馈抑制作用是减低的。如此基本上消除了细胞的半胱氨酸水平对O-乙酰基-L-丝氨酸或L-半胱氨酸的形成的影响。
-外向通量基因(efflux genes)，如欧洲专利EP 0885962A1中所述，所述的orf基因可能编码-外向通量系统，该外向通量系统适于输出抗生素及其他毒性物质并造成L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-乙酰基-丝氨酸及/或四氢噻唑衍生物的超量生产。
-cysB基因，如德国专利DE 19949579 C1中所述，该cysB基因编码硫代谢的核心基因调节物，因此对半胱氨酸生物合成的提供硫化物方面扮演决定性的角色。
自现有技术同样可知上述方法还可制得半胱氨酸衍生物。因此，在发酵过程中，LL-胱氨酸可作为氧化作用产物由L-半胱氨酸形成或2-甲基四氢噻唑-2，4-二羧酸可作为缩合作用产物由L-半胱氨酸及丙酮酸形成。由于L-半胱氨酸是细胞的核心硫供体，亦可利用所述方法作为起始点以制造许多含硫代谢物[亦即L-蛋氨酸(甲硫氨酸)、(+)-生物素、硫胺素等]，依照本发明，此类含硫代谢物即为L-半胱氨酸衍生物。
利用一适当程序，亦可制得N-乙酰基-L-丝氨酸(欧洲专利EP-A1-0885962)及O-乙酰基-L-丝氨酸(德国专利DE-A-10107002)等氨基酸作为主要发酵产物的事实亦曾经述及。依照DE-A-10219851，L-丝氨酸可比较容易地自含N-乙酰基-L-丝氨酸的发酵液中进一步得到回收。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组体微生物菌株，该菌株可使磷酸甘油酸族的氨基酸或氨基酸衍生物超量生产。另一目的是提供一种借助于该重组体微生物菌株以制造磷酸甘油酸族氨基酸或氨基酸衍生物的发酵方法。
本发明一方面提供了一种遗传学修饰的微生物菌株，该菌株适用于发酵制造O-乙酰基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-丝氨酸、L-半胱氨酸或LL-胱氨酸，该菌株包含编码丝氨酸O-乙酰基转移酶的cysE等位基因，其中L-半胱氨酸对所述丝氨酸O-乙酰基转移酶的反馈抑制作用是减低的，且该菌株可由一起始菌株制得，所述微生物菌株的特征为具有增强的yfiK-基因产物或yfiK同源物基因产物的表达。
本发明另一方面提供了一种质粒，该质粒包含一具有一启动子的yfiK基因和用于半胱氨酸代谢去调节作用的遗传元件，该遗传元件编码丝氨酸O-乙酰基转移酶，其中L-半胱氨酸对所述丝氨酸O-乙酰基转移酶的反馈抑制作用是减低的。
本发明另一方面提供了一种用以制备本发明的微生物菌株的方法，其包含将如上述的质粒引入起始菌株内。
本发明另一方面提供了一种用以制备O-乙酰基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-丝氨酸、L-半胱氨酸或LL-胱氨酸的方法，其包含在发酵作用中使用本发明的微生物菌株以及将制得的氨基酸自发酵混合物内移除。
附图说明
图1所示为pG13的质粒构建示意图。
具体实施方式
借助于一种适于发酵制造磷酸甘油酸族氨基酸及其衍生物且可由一起始菌株制得的微生物菌株(在该菌株中可将yfiK-基因产物的活性或yfiK同源物基因产物的活性提升至较该起始菌株更高)可达成前一个目的。
依照本发明，当细胞内的总活性提高时(由于该细胞内的基因产物数量增加)，yfiK-基因产物的活性亦提高，因此每个细胞yfiK同源物的活性亦提高，即使该基因产物的比活性保持不变。
作为大肠杆菌基因组序列的一部分(布勒特纳等人，1997，科学277：1453-1462)，yfiK基因经识别为开放阅读框并编码具有195个氨基酸的蛋白质。截至目前为止，仍不可能对yfiK基因赋予一生理功能。对于具有序列同源性的蛋白质所作的资料库搜寻(GCG威斯康辛软件包的FASTA演算法，基因电脑小组，麦迪逊，威斯康辛)迄无适当结论，这是由于所显示者仅是与功能同样不详的蛋白质的相似性。yfiK基因产物可能具有活性的唯一线索可在艾勒欣等人所著(生物科学趋势，1999，24：133-135)中发现。该文献的诸位作者提出一种应可描绘出氨基酸外向通量蛋白质所属蛋白质家族特性的结构基序。因该微弱的共有基序亦出现在yfiK蛋白质中，后者可成为氨基酸的外向通量系统。但本领域技术人员绝不可能由此获得有关该yfiK蛋白质的具体氨基酸底物的结论。发现yfiK基因产物对磷酸甘油酸族氨基酸的制造具有极大贡献是一件值得惊奇的事，尤其因为大肠杆菌内磷酸甘油酸族氨基酸的外向通量蛋白质(例如：YdeD基因产物)的特性已经加以描述(达斯勒等人，分子微生物，2000，36：1101-1112)而第二个系统的存在是完全出乎预料的。令人感兴趣的是，yfiK-基因产物与YdeD-基因产物之间在结构上并无相似之处。
SEQ ID No.1及SEQ ID No.2的序列已将yfiK基因及yfiK基因产物(yfiK蛋白质)的特性分别加以描述。在本发明的范围内，在利用BESTF1T演算法(GCG威斯康辛软件包，基因电脑小组(GLG)，麦迪逊，威斯康辛)的分析中，凡序列相同性超过30％的基因即认为是yfiK同源物。尤其序列相同性超过70％者更是属于同源基因。
同样地，序列相同性超过30％[BESTFIT演算法GCG威斯康辛软件包，基因电脑小组(GLG)，麦迪逊，威斯康辛]的蛋白质则认为是yfiK同源蛋白质。尤其序列相同性超过70％者更是属于同源蛋白质。
因此，yfiK同源物亦指yfiK基因的等位基因变体，尤其功能变体，此类变体是藉核苷酸的缺失、插入或取代自SEQ ID No.1号所图示的序列衍生出来，但各个基因产物的酶活性则仍保持不变。
利用分子生物学的标准技术，可制得yfiK-基因产物活性较起始菌株高的本发明微生物。
适当的起始菌株，原则上是凡具有磷酸甘油酸族氨基酸生物合成途径的任何微生物，可用重组方法及可由发酵作用培养。此类微生物可以是真菌、酵母或细菌。其中以真细菌中系统发育群(phylogeneticgroup)的细菌为佳，但以肠杆菌科的微生物较佳，尤以大肠杆菌种更佳。
举例言之，通过增加yfiK基因的表达，可增加本发明微生物内yfiK基因产物的活性。借助于适当启动子，可增加微生物内yfiK基因的拷贝数及/或增加yfiK基因的表达。经增加的表达意谓优选的yfiK的表达至少等于起始菌株的两倍高。
利用本领域技术人员熟知的方法可增加微生物内yfiK基因的拷贝数。举例言之，可将yfiK基因植入每个细胞具有多重拷贝的质粒载体中(例如：用于大肠杆菌的pUC19、pBR322、pACYC184)并用此方法将其引进至该微生物内。或者，亦可将yfiK基因的此类多重拷贝整合在微生物的染色体内。可用的整合方法是：利用温和噬菌体、整合性质粒或经由同源重组的整合作用等已知系统(例如：汉弥顿等人，1989，细菌学报，171：4617-4612)。
其中以在-启动子控制之下将-yfiK基因克隆入质粒载体内以增加拷贝数目的方式为佳。尤以将-yfiK基因克隆入-pACYC衍生物[例如：pACYC184-LH(依据布达佩斯条约，保藏于德意志微生物保藏中心，不伦瑞克，德国，1995年8月18日，编号DSM 10172)]内而增加大肠杆菌内拷贝数更佳。
基因的天然启动子及操纵子区可用作表达质粒编码的yfiK基因的控制区。
但，yfiK基因的表达，尤其亦可借助于其他启动子予以增加。适当的启动子系统，例如：gapA基因的组成性GAPDH启动子或大肠杆菌内可诱导的lac、tac、trc、lambda、ara或tet启动子乃本领域技术人员所熟知(麦克瑞德斯，1996，微生物评论60：512-538)。此类结构可依照已知方式用在质粒上或染色体上。
通过含有翻译起始子信号，例如：最佳化序列内核糖体结合部位或基因起始密码子的特别构建，或通过以较常出现的密码子、依照“密码子用途”替换稀有密码子亦可进一步增加表达。
具有前述修饰作用的微生物菌株是本发明的优选的实施方式。
举例言之，利用涵盖全部yfiK基因的特定引物，借助于聚合酶链反应，通过特异性扩增及随后与载体DNA片段的连接作用，可将一yfiK基因克隆入质粒载体内。
优选地，用以克隆yfiK基因的适合载体是已含有增加表达所用的启动子(例如：大肠杆菌gapA基因的组成性GAPDH启动子)的质粒。
因此本发明的另一内容是包含具有启动子的yfiK基因的质粒。
特别优选的是已含有一基因/等位基因的载体，利用此类载体可造成磷酸甘油酸酸族氨基酸[例如：cysEX基因(WO97/15673)]的超量生产。此类载体可直接自任何微生物菌株制备具有高度氨基酸超量生产的本发明微生物菌株，这是由于该质粒亦减低微生物内半胱氨酸代谢作用的反馈抑制作用。
因此本发明的另一内容为一种质粒，该质粒包含一用作半胱氨酸代谢去调节作用(deregulation)的遗传元件及一具有一启动子的yfiK基因。
将含有yfiK的质粒送入微生物中是使用一种普通转化方法(电穿孔作用)，随后借助于例如对抗生素的抵抗力对携带质粒的克隆加以选择。
所以本发明的另一内容是若干制各本发明微生物菌株的方法，其中是将本发明的一种质粒引进一起始菌株内。
借助于本发明的一种微生物菌株以制造磷酸甘油酸族氨基酸的工作是依照已知的方法在一发酵罐内实施。
所以本发明的另一内容是一种用以制造磷酸甘油酸族氨基酸的方法，该方法包含在发酵作用中使用本发明的一种微生物菌株及将所制氨基酸自发酵混合物中移除。
该微生物菌株在发酵罐内是以连续培养、分批培养，或优选地补料一分批培养方式生长。尤为优选的是在发酵过程中计量加入一碳源。
适当的碳源以糖类、糖醇类或有机酸类为佳。在本发明的方法中，尤为优选的是使用葡萄糖、乳糖或甘油作为碳源。
计量加入碳源的方式以能确保发酵过程中碳源的含量保持在0.1至50克/升范围内为佳。尤为优选的是保持在0.5至10克/升范围内。
本发明的方法所用的优选的氮源是氨、铵盐或蛋白质水解产物。若用氨调整pH值，在发酵过程中氮源是在规律时段中连续计量加入。
其他可添加的培养基添加剂是：元素磷、氟、钠、镁、氮、钾、钙、铁的盐类及微量(亦即微摩尔浓度)元素钼、硼、钴、锰、锌及镍的盐类。
于培养基中另外亦可添加有机酸(例如：乙酸、柠檬酸)、氨基酸(例如：异亮氨酸)及维生素类(例如：B1、B6)。
举例言之，可使用的复合营养源是：酵母提取液、玉米浆、大豆粉或大麦提取液。
嗜温微生物的温育温度优选为15至45℃，尤为优选的是30至37℃。
发酵作用以在有氧生长情况下实施为佳。将氧送入发酵罐内是借助于压缩空气或借助于纯氧。
在发酵过程中，发酵培养基的pH以5.0至8.5为佳，尤以pH7.0更佳。若需依照本发明制造O-乙酰基-L-丝氨酸时，以pH为5.5至6.5最佳。
制造L-半胱氨酸及L-半胱氨酸衍生物时，在发酵过程中需要将硫源加入。此处以使用硫酸盐或硫代硫酸盐为佳。
生长阶段过后，依照所述方法发酵的微生物以分批或补料-分批方式，高效率地将磷酸甘油酸族氨基酸分泌至培养基内，历时10至150小时。
现通过下列实施例将本发明作进一步说明。
实施例1：yfiK基因的克隆
借助于聚合酶链反应将来自大肠杆菌菌株w3110的yfiK基因扩增。所用特定引物是寡聚核苷酸yfiK-fw：(SEQ ID No.3)5’-GGA ATTCAT TAA TGA TCC ATA ACC CCA AAC CTA TC-3’及yfiK-rev：(SEQ ID No.4)5’-GCC TTA ATT AAG TAG CAA GTT ACT AAGCGG AAG-3’。
用限制酶Asnl及PacI将所得DNA片段加以消化，借助于琼脂糖凝胶电泳将其加以纯化并分离出来(奇亚奎克凝胶萃取器、奇亚根，希尔顿，D)。克隆的实施是借助于与一NdeI/Pacl-切成的载体pACYC184-cysEX-GAPDH连接，其过程在欧洲专利EP0885962A1中曾经详细述及。该载体含有一编码一丝氨酸乙酰基转移酶的cycEX基因及其3’的gapA基因的组成性GADPH启动子，L-半胱氨酸对所述的丝氨酸乙酰基转移酶的反馈抑制作用是减低的。该程序以适当方法将yfiK基因置于GAPDH启动子的下游，由此转录可自该处引发。所得载体定名为pG13且以示意图方式图示于图1内。随后通过转化大肠杆菌菌株w3110及利用四环素选择适当转化株而对构建体加以验证。该细菌株大肠杆菌w3110/pG13是保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心，D-38142不伦瑞克)，编号DSM 15059，依据布达佩斯条约，且是用作下列诸实施例中用以制造磷酸甘油酸酸氨基酸的生产菌株(producer strain)。用以说明yfiK基因增加表达效果所选的比较性菌株是w3110/pACYC 184-cysEX，该菌株同样在欧洲专利EP0885962A1中亦曾详细述及，但与pG13相较，该菌株不含GAPDH启动子-yfiK序列。
实施例2：生产菌株的预培养物
使用20毫升LB培养基(10克/升胰蛋白胨、5克/升酵母提取物、10克/升食盐)，其中另外含有15毫克/升四环素，与菌株w3110/pG13或w3110/pACYC184-cycEX接种，并于一转速150转/分钟的摇床内，在30℃温度下加以保温。七小时之后，将全部混合物移入100毫升SM1培养基内(12克/升K2HPO4；3克/升KH2PO4；5克/升(NH4)2SO4；0.3克/升MgSO4×7H2O；0.015克/升CaCl2×2H2O；0.002克/升FeSO4×7H2O；1克/升Na3柠檬酸×2H2O；0.1克/升NaCl；1毫升/升微量元素溶液，包括0.15克/升Na2MoO4×2H2O；2.5克/升Na3BO3；0.7克/升CoCl2×6H2O；0.25克/升CuSO4×5H2O；1.6克/升MnCl2×4H2O；0.3克/升ZnSO4×7H2O，另外补充以5克/升葡萄糖，0.5毫克/升维生素B1及15毫克/升四环素。于温度30℃及转速150转/分钟的情况下继续实施保温17小时。
实施例3：O-乙酰基-L-丝氨酸的发酵制造
所用发酵罐是一勃朗生物科技公司(麦尔松根，D)制造的BiostatbW仪器，该仪器最大培养物容量为2升。将实施例2的中所述的预培养物(在600纳米处的光密度约为3)接种于含有900毫升SM1培养基的发酵罐中，所述的培养基补充以15克/升葡萄糖、0.1克/升胰蛋白胨、0.05克/升酵母萃取物、0.5毫克/升维生素B1及15毫克/升四环素发酵罐。在发酵过程中，将温度调节至32℃，并通过计量25％氨使pH维持在6.0恒常不变。以1.5体积/体积/分钟的速率将消毒的压缩空气通入培养物内并以200转/分钟的转速加以搅拌。待氧饱和度降至50％之后，为保持50％氧饱和度[通过在900转/分钟情况下校准至100％饱和度的氧分压(PO2)探针测定]，经由一控制装置将转速增加至1200转/分钟。当发酵罐内葡萄糖含量已自初始的15克/升降至约5至10克/升时，立即将一56％浓度的葡萄糖溶液计量加入，以6至12毫升/小时的流速实施补料，并将发酵罐内的葡萄糖浓度保持在0.5至10克/升。葡萄糖是利用YSI(黄泉，俄亥俄，美国)公司制造的葡萄糖分析器测定。发酵时间为28小时，之后将样品取出并通过离心作用将细胞移除。以流速0.5毫升/分钟，于一LUNA5微米C18(2)柱(芬诺门奈克斯公司，阿夏芬堡，德国)上，通过反相HPLC将所得培养物上清液加以分析。所用洗脱液是经稀释的磷酸(0.1毫升浓磷酸/升)。表1所示是所得培养物上清液内主要代谢产物含量。所述的产物为O-乙酰基-L-丝氨酸及N-乙酰基-L-丝氨酸，该N-乙酰基-L-丝氨酸是在中性或碱性情况下由O-乙酰基-L-丝氨酸的同分异构作用而增量制得。
表1
菌株      氨基酸含量(克/升)O-乙酰基-L-丝氨酸N-乙酰基-L-丝氨酸
W3110/pACYC184-cysEXW3110/pG13(cysEX-yfiK)      1.8      1.5
     7.4      3.0
实施例4：N-乙酰基-L-丝氨酸的发酵制造
N-乙酰基-L-丝氨酸的制造方法与实施例2及3所述者完全相同，但发酵时的pH是调节至7.0。如此容易使O-乙酰基-L-丝氨酸同分异构化为N-乙酰基-L-丝氨酸且所得主要产物是N-乙酰基-L-丝氨酸。发酵时间为48小时。
表2
菌株     氨基酸含量(克/升)N-乙酰基-L-丝氨酸
    W3110/pACYC184-cysEXW3110/pG13(cysEX-yfiK)     5.8
    9.2
实施例5：L-半胱氨酸及L-半胱氨酸衍生物
L-半胱氨酸的制造方法与实施例2及3所述者完全相同，但发酵时的pH是调节至7.0且补料硫代硫酸盐。后者是于两小时之后，以30％浓度的硫代硫酸钠、流速为3毫升/小时补料。发酵时间为48小时。L-半胱氨酸的制造是利用盖唐德分析法(盖唐德，(1967)，生物化学学报，104，627-633)以比色方式加以监控。此处必须考虑到该分析法不能将L-半胱氨酸与欧洲专利EP 0885962 A1中所述L-半胱氨酸及丙酮酸的缩合产物(2-甲基四氢噻唑-2，4-二羧酸)加以区别。在该分析法中，用二硫苏糖醇(DTT)稀溶液，在pH为8.0的情况下，经由还原作用同样地可将通过氧化作用由L-半胱氨酸制得的LL-胱氨酸检定为L-半胱氨酸。
表3
菌株     氨基酸含量(克/升)L-半胱氨酸+衍生物
    W3110/pACYC184-cysEXW3110/pG13(cysEX-yfiK)     4.6
    7.5
序列表
<110>电化学工业有限公司(国际)
<120>磷酸甘油酸酯族氨基酸及氨基酸衍生物的发酵制造方法
<130>yfiK
<140>
<141>
<160>4
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>750
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(110)..(694)
<400>1
gatccataac cccaaaccta tcgaaaatat cgaatctaga atataaaaac attcattttt  60
ttaaatgttc cgtgtcgggt actgtctacc aaaacagagg agataacaa gtg aca ccg  118
                                                      Val Thr Pro
                                                        1
acc ctt tta agt gct ttt tgg act tac acc ctg att acc gct atg acg    166
Thr Leu Leu Ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Met Thr
      5                  10                  15
cca gga ccg aac aat att ctc gcc ctt agc tct gct acg tcg cat gga    214
Pro Gly Pro Asn Asn Ile Leu Ala Leu Ser Ser Ala Thr Ser His Gly
 20                  25              30                      35
ttt cgt caa agt acc cgc gtg ctg gca ggg atg agt ctg gga ttt ttg     262
Phe Arg GLn Ser Thr Arg Val Leu Ala Gly Met Ser Leu Gly Phe Leu
                40                   45                  50
att gtg atg tta ctg tgt gcg ggc att tca ttt tca ctg gca gtg att     310
Ile Val Met Leu Leu Cys Ala Gly Ile Ser Phe Ser Leu Ala Val Ile
             55                  60                  65
gac ccg gca gcg gta cac ctt ttg agt tgg gcg ggg gcg gca tat att     358
Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala Ala Tyr Ile
         70                  75                  80
gtc tgg ctg gcg tgg aaa atc gcc acc agc cca aca aag gaa gac gga     406
Val Trp Leu Ala Trp Lys Ile Ala Thr Ser Pro Thr Lys Glu Asp Gly
     85                  90                  95
ctt cag gca aaa cca atc agc ttt tgg gcc agc ttt gct ttg cag ttt     454
Leu Gln Ala Lys Pro Ile Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala Leu Gln Phe
100                 105                 110                 115
gtg aac gtc aaa atc att  ttg tac ggt  gtt acg gca ctg tcg acg ttt   502
Val Asn Val Lys Ile Ile Leu Tyr Gly Val Thr Ala Leu Ser Thr Phe
                120                 125                 130
gtt ctg ccg caa aca cag gcg tta agc tgg gta gtt ggc gtc agc gtt     550
Val Leu Pro Gln Thr Gln Ala Leu Ser Trp Val Val Gly Val Ser Val
            135                 140                 145
ttg ctg gcg atg att ggg acg ttt ggc aat gtg tgc tgg gcg ctg gcg    598
Leu Leu Ala Met Ile Gly Thr Phe Gly Ash Val Cys Trp Ala Leu Ala
        150                 155                 160
ggg cat ctg ttt cag cga ttg ttt cgc cag tat ggt cgc cag tta aat    646
Gly His Leu Phe Gln Arg Leu Phe Arg Gln Tyr Gly Arg Gln Leu Ash
    165                 170                 175
atc gtg ctt gcc ctg ttg ctg gtc tat tgc gcg gta cgc att ttc tat    694
Ile Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Tyr Cys Ala Val Arg Ile Phe Tyr
180                     185             190                 195
taacgaaaaa aagcggaaga ggtcgccctc ttccgcttag taacttgcta cttaag      750
<210>2
<211>195
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>2
Val Thr Pro Thr Leu Leu Ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu Ile Thr
  1               5                  10                  15
Ala Met Thr Pro Gly Pro Ash Asn Ile Leu Ala Leu Ser Ser Ala Thr
             20                  25                  30
Ser His Gly Phe Arg Gln Ser Thr Arg Val Leu Ala Gly Met Ser Leu
         35                  40                  45
Gly Phe Leu Ile Val Met Leu Leu Cys Ala Gly Ile Ser Phe Ser Leu
     50                  55                  60
Ala Val Ile Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala
 65                  70              75                      80
Ala Tyr Ile Val Trp Leu Ala Trp Lys Ile Ala Thr Ser Pro Thr Lys
                 85                  90                  95
Glu Asp Gly Leu Gln Ala Lys Pro Ile Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala
            100                 105                 110
Leu Gln Phe Val Asn Val Lys Ile Ile Leu Tyr Gly Val Thr Ala Leu
        115                 120                 125
Ser Thr Phe Val Leu Pro Gln Thr Gln Ala Leu Ser Trp Val Val Gly
    130                 135                 140
Val Ser Val Leu Leu Ala Met Ile Gly Thr Phe Gly Asn Val Cys Trp
145                 150                 155                 160
Ala Leu Ala Gly His Leu Phe Gln Arg Leu Phe Arg Gln Tyr Gly Arg
                165                 170                 175
Gln Leu Asn Ile Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Tyr Cys Ala Val Arg
            180                 185                 190
Ile Phe Tyr
        195
<210>3
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<223>PCR引物
<400>3
 ggaattcatt aatgatccat aaccccaaac ctatc    35
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>4
gccttaatta agtagcaagt tactaagcgg aag       33

Claims (16)

1、一种遗传学修饰的微生物菌株，该菌株适用于发酵制造O-乙酰基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-丝氨酸、L-半胱氨酸或LL-胱氨酸，该菌株包含编码丝氨酸O-乙酰基转移酶的cysE等位基因，其中L-半胱氨酸对所述丝氨酸O-乙酰基转移酶的反馈抑制作用是减低的，且该菌株可由一起始菌株制得，所述微生物菌株的特征为具有增强的yfiK-基因产物或yfiK同源物基因产物的表达。
2、如权利要求1的微生物菌株，该菌株是真菌、酵母或细菌。
3、如权利要求1或2的微生物菌株，其中yfiK基因的拷贝数被增加或其中该yfiK基因的表达通过利用适当的启动子或翻译信号增加。
4、如权利要求3的微生物菌株，其中该启动子选自由gapA基因的组成性GAPDH启动子、可诱导的lac、tac、trc、lambda、ara及tet启动子组成的一组。
5、如权利要求1或2的微生物菌株，该微生物菌株是大肠杆菌菌株，所述的大肠杆菌菌株中yfiK基因产物的增强的表达是基于pACYC衍生物中yfiK基因拷贝数的增加。
6、如权利要求3的微生物菌株，该微生物菌株是大肠杆菌菌株，所述的大肠杆菌菌株中yfiK基因产物的增强的表达是基于pACYC衍生物中yfiK基因拷贝数的增加。
7、如权利要求4的微生物菌株，该微生物菌株是大肠杆菌菌株，所述的大肠杆菌菌株中yfiK基因产物的增强的表达是基于pACYC衍生物中yfiK基因拷贝数的增加。
8、一种质粒，该质粒包含一具有一启动子的yfiK基因和用于半胱氨酸代谢去调节作用的遗传元件，该遗传元件编码丝氨酸O-乙酰基转移酶，其中L-半胱氨酸对所述丝氨酸O-乙酰基转移酶的反馈抑制作用是减低的。
9、一种用以制备如权利要求1-7中任一项的微生物菌株的方法，其包含将如权利要求8的质粒引入起始菌株内。
10、一种用以制备O-乙酰基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-丝氨酸、L-半胱氨酸或LL-胱氨酸的方法，其包含在发酵作用中使用如权利要求1-7中任一项的微生物菌株以及将制得的氨基酸自发酵混合物内移除。
11、如权利要求10的方法，其中该微生物菌株作为连续培养物或作为分批培养物或作为补料-分批培养物在一发酵罐内生长。
12、如权利要求10或11的方法，其中在发酵过程中连续计量加入一碳源。
13、如权利要求11的方法，其中所用的碳源是糖类、糖醇类或有机酸类。
14、如权利要求11的方法，其中所用的碳源是以适当的方式计量加入，以确保在发酵过程中发酵罐内的碳源含量维持在0.1至50克/升范围内。
15、如权利要求10或11的方法，其中所用氮源是氨、铵盐或蛋白质的水解物。
16、如权利要求10或11的方法，其中所述的发酵作用是在需氧生长情况下进行的。
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