MXPA02010145A - Cepa de streptomyces con actividad insecticida y el metodo de uso como un insecticida. - Google Patents

Abstract

Se divulga una nueva cepa de Streptomyces galbus que produce metabolitos y que exhibe actividad pesticida. En adicion, se divulga un sobrenadante de la cepa nueva con actividad pesticida. Se proporciona un metabolito estable en alcali, de bajo peso molecular, soluble en etilacetato producido por la nueva cepa Streptomyces glabus con actividad pesticida contra insectos lepidopteros. Tambien se incluyen metodos para fermentar la nueva cepa de Streptomyces galbus e incrementar la bioactividad de la actividad pesticida. Tambien se incluyen metodos para proteger o tratar plantas de las orugas, que comprende la etapa de aplicar a un planta una cantidad efectiva de la nueva cepa Streptomyces galbus, los metabolitos producidos por la cepa o una combinacion de los mismos.

Description

CEPA DE STKEPTOMYCES CON ACTIVIDAD INSECTICIDA Y EL MÉTODO DE USO COMO DN INSECTICIDA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuentra en el campo de 5 biopesticidas. Más particularmente, esta invención se refiere a una cepa novedosa de Streptomyces con una actividad insecticida y métodos de uso de la misma. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los productos naturales son sustancias producidas por microbios, plantas y otros organismos. Los productos naturales microbianos ofrecen una fuente abundante de diversidad química. Existe una larga historia de utilización de estos productos naturales para propósitos farmacéuticos. A pesar del énfasis en productos naturales para la terapéutica humana, hay solamente unos cuantos insecticidas de producto natural para uso en la agricultura.'- Los insecticidas de producto natural microbiano más exitosos, son las toxinas de Bacillus thutingiensis, avermectina y las espinosinas. Las bacterias de Bacíllus thuringiensis (Bt) producen cristales de proteina citoplásmica (d-endotoxinas) durante la O esporulación, que son los factores más importantes en la patogénesis del insecto (ver, Ellar, D.J. (1997) "The structure and function of Bacillus th?ringiensis d-endotoxins and prospects for biopesticide improvement, " En: Microbial Insecticídes : Novelty or Necessity? The British Crop Protection Council Symposium Proceedings No. 68, Coventry, UK) . Las 8-endotoxinas se han utilizado tanto en preparaciones de roció asi como en biopesticidas 'sistemióos' a través de la introducción de los genes de endotoxina en plantas transgénicas. El crecimiento del mercado para las preparaciones de roció de Bt se estima que es de alrededor de 10% para 1997 hasta el 2000, lo cual dará por resultado un mercado de $100-$130 millones de dólares para el 2000 (ver, Lisansky, S. (1997) "Microbial biopesticides" En: Microbial Insecticides: Novelty or Necessity? The British Crop Protection Council Symposium Proceedings No. 68, Coventry, UK) . Los cultivos transgénicos de Bt principales son maiz y algodón. El mercado de maiz de Bt transgénico en los Estados Unidos ha crecido de solamente 1.4% de la superficie de acres plantada en 1996 a 19.1% in 1998. El crecimiento en algodón de Bt no ha sido tan drástico, incrementándose de 14.6% de la superficie de acres plantada en 1996 a 16.8% en 1998. El mercado completo actualmente es dirigido contra las plagas lepidópteras . En 1999, el mercado para pesticidas utilizados contra orugas en los Estados Unidos, excedió los 400 millones de dólares norteamericanos. Las avermectinas son producidas mediante Streptomyces avermitilis durante la fermentación. La abamectina, una de las lactonas macrociclicas que ocurren naturalmente, muestra actividad contra ácaros, psilido de peral y polilla con dorso con rombos. La emamectina, un análogo se isintético de abamectina, muestra actividad contra larvas lepidópteras. En invertebrados, las avermectinas inducen la abertura de un canal de ion cloruro presináptico (no activado con GABA) , conduciendo al efluente de iones cloruro, la despolarización de la terminal nerviosa y por consiguiente la liberación de neurotransmisor. Ver, Turner, M.J. y Schaeffer, J.M. (1989) "Afecte of action of Ivermectin" En : Ivermectin and Abamectin, W. C. Campbell (Ed. ) Springer-Verlag, New York. El uso de avermectinas en el control de insectos tiene un valor estimado en el mercado mundial de $80-$120 millones de dólares en 1998. La espinosinas son una nueva clase de macrólidos tetraciclicos derivados de la fermentación, producidos mediante el actinomicete Saccharopolyspora spinosa. Las espinosinas A y D, los componentes principales del insecticida spinosad, Tracer®, muestran actividad contra las plagas lepidópteras y mosquitos. Ver, Sparks, T. C. y colaboradores (1999) "Fermentation-derived insecticide control agents: the spinosyns" En: Biopesticides Use and Delivery, Hall, F.R. y colaboradores, eds. Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 115-170. Su modo de acción es único, con un sitio primario de ataque en el receptor de acetilcolina de nicotina y un ataque secundario, posiblemente sobre, o en los receptores de GABA. Ver, Salgado, V.L. (1997) "The modes of action of spinosad and other insect control products" Down to Earth 52:35-43. Los Streptomyces son una fuente reconocida de productos naturales insecticidas. Además de las avermectinas y las espinosinas, la oxidasa de colesterol (Purcell, J.P. Y colaboradores, (1993) Biochem. Biophys . Res . Commun . 196:1406-1413), alosamidina (Sakuda, S. (1986) Tetrahedron Lett, 27:2475-2478), valinomicina (Heisey, R. (1998) J. Agrie. Food Chem. 36:1283-1286), derivados de pirrolizina (Jizba, J. y colaboradores, (1992) Folia Microbiologica 37:461-462), respirantina (Urushibata, I. Y colaboradores, (1993) J. Antibíotícs 46:701-703), prasinones (Box, S. J. y colaboradores, (1973) Appl . Microbiol . 26:699-704), piercidina (Takahashi, N. y colaboradores, (1968) Agr. Biol . Chem. 32:1115-1122) griseulina (Nair, M. G. y colaboradores, (1993) J. Antibiotics 46:1762-1763), martinomicina (Cárter, G. T. y colaboradores, (1994) J. Antibiotics 47:1549-1553), faeriefungina (Nair, M. G. y colaboradores. (1989) J. Nat . Prod. 52:797-809), indanomicina (Zhang, D. y colaboradores. (1997) J. Antibiotics 50:617-620), ciclofostina (Kurokawa, T. y colaboradores. (1993) J. Antibiotics 46:1315-1318), manumicina (Zeeck, A. y colaboradores, (1987) J. Antíbíotics 40:1530-1540), ictio icina (Zizka, Z. y colaboradores. (1991) Cytobios 65:31-38), virginiamicina (Prikrylova, V. y colaboradores. (1992) Folia Microbiol .. 37:386-388) suidatestrina (Knuessel, I. y colaboradores. (1998) Comp. Biochem. Phys . B. 120B:639-646), gualamicina (Tsuchiya, K. J. (1995) J. Antibiotics 48:626-629), y otros productos naturales insecticidas se han reportado de las cepas de Streptomyces. Streptomyces galbus es reconocido por su producción de los macrólidos antibotritis potentes, galbonólido A y galbonólido B (Paul A: K. y Banerjee, A. K. (1983) Folia Microbiol . 28:386-396; Sigmund, J. M. y Hirsch, C. F. (1998) J. Antibiotics 51:829-836; Achenbach, H. Patente DE No. 86-3632168; y Zaehner, H., Patente DE No. 3632168). Nakayama y colaboradores. (1987) Agrie. Biol . Chem. 51:853-860, reportaron el descubrimiento de la rustmicina, un inhibidor potente de la roya del tallo de trigo, Puccinia gramnis. Después, el galbonólido A se mostró que es la misma molécula como la rustmicina. Achenbach y colaboradores. (1998) Annals N. Y. Acad. Sci . 544:128-140, reportaron el galbonólido A que es mucho más activo que el galbonólido B contra un número de levaduras endomicetosas y un gran número de Deuteromycetes tales como Candida albicans and Botrytis cinérea . Nada de evidencia para la actividad ionofórica, desestabilización de la membrana, interferencia con la biosintesis de DNA o RNA o la inhibición de la biosintesis de quitina podrian ser atribuidos a estos macrólidos. Recientemente, Mándala y colaboradores, (1998) J. Biol . Chem. 24:14942-14949) y Harris y colaboradores. (1998) J. Antíbiotics 51:837-844; y Harris, G. y colaboradores, Patente No. GB 2324300) demostraron que la rustmicina inhibe la sintetasa de inositol fosfoceramida, la primera enzima especifica fungal en la biosintesis de esfingolipidos. Los solicitantes ahora documentan las propiedades insecticidas potentes de una cepa novedosa de S. galbus, con actividad contra un número de Lepidópteros relevantes en la agricultura. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un compuesto novedoso, Streptomyces galbus, No. de Acceso NRRL 30232, y mutantes del mismo, que retienen la misma actividad, para uso como un insecticida contra Lepidópteros. La invención comprende el uso de sobrenadantes y metabolitos de la cepa, para uso como un insecticida. La invención también incluye métodos para tratar plantas o frutas para controlar las infestaciones de Lepidópteros utilizando la cepa reivindicada, ya sea sola, o en combinación con otros pesticidas quimicos o biológicos. Además se proporcionan métodos para fermentar la cepa reivindicada para incrementar su bioactividad como un insecticida. MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Depósito de Microorganismos Una cepa de Streptomyces galbus se ha depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest en la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) , Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA. El número de Acceso es NRRL 30232. La cepa se ha depositado bajo condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante la calidad de pendiente de esta solicitud. El depósito es disponible como es requerido por las leyes de patentes extranjeras en paises en donde son presentadas contrapartes o duplicados de la solicitud expuesta, o su progenie. Sin embargo, se debe entender que su disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la invención expuesta en derogación de los derechos de patente otorgados por la acción gubernamental. Definiciones Como se utiliza en la presente, ciertos términos pueden tener los siguientes significados definidos . La forma singular "un" "una" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas. El término "que comprende" se propone para dar a entender que las composiciones y métodos incluyen los elementos mencionados, pero no excluyen otros. "Que consiste esencialmente de" cuando se utiliza para definir composiciones y métodos, significará que excluye otros elementos de cualquier significado esencial a la combinación. Asi, una composición que consiste esencialmente de los elementos como se definen en la presente, no excluirá contaminantes menores del método de aislamiento y purificación y los portadores agriculturalmente aceptables. "Que consiste de" significará que excluye más de los elementos menores de otros ingredientes y de los pasos del método sustancial para aplicar las composiciones de esta invención. Las modalidades definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta invención. Como se utiliza en la presente, "control biológico" se define como el control de un patógeno o insecto mediante el uso de un segundo organismo. Los mecanismos conocidos de control biológico incluyen las bacterias entéricas que controlan el pudrimiento de la raiz al competir con los hongos por espacios en las superficies de las raices, o la aplicación de Bacillus thuringiensis para controlar las plagas de insectos. Las toxinas bacterianas, tales como antibióticos, se han utilizado para controlar patógenos e insectos. La toxina se puede aislar y aplicar directamente a la planta o las especies bacterianas se pueden administrar para producir la toxina in situ. El término "hongo" u "hongos" incluye una amplia variedad de organismos que llevan esporas nucleadas, que están exentos de clorofila. Ejemplos de hongos incluyen levaduras, mohos, mildeus, royas y setas. El término "bacteria" incluye cualquier organismo procariótico que no tiene un núcleo distinto. "Fungicida" o "antifungal" significa la capacidad de una sustancia para incrementar la mortalidad o inhibir la proporción de crecimiento de los hongos. "Antibiótico" incluye cualquier sustancia que es capaz de matar o inhibir el crecimiento de otro organismo viviente, incluyendo, pero no limitado a, otros microorganismos. Los antibióticos se pueden producir mediante un microorganismo o mediante un proceso sintético o un proceso semisintético. El término "mutante" se refiere a una variante de la cepa de origen, asi como a los métodos para obtener un mutante o variante en el cual la actividad pesticida es más grande que la expresada por la cepa de origen. La "cepa de origen" es definida en la presente como la cepa de Streptomyces original antes de la mutagénesis. Para obtener tales mutantes, la cepa de origen debe ser tratada con una sustancia química tal como N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina, etilmetanosulfona, o mediante irradiación utilizando rayos gamma, rayos x, o irradiación UV, o por otros medios bien conocidos para aquellos expertos en la técnica.

Una "variante" es una cepa que tiene todas las características de identificación del No. de Acceso NRRL 30232 y puede ser identificada por tener un genoma que se hibridiza bajo las condiciones de alta severidad al genoma de No. de Acceso NRRL B-30232. "Hibridización" se refiere a una reacción en la cual uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que es estabilizado via el enlace de hidrógeno entre las bases de los residuos de nucleótidos. El enlace de hidrógeno puede ocurrir mediante el emparejamiento de base de Watson-Crick, el enlace de Hoogstein o en cualquier otra manera especifica de la secuencia. El complejo puede comprender dos hebras que forman una estructura doble, tres o más hebras que forman un complejo de multihebra, una hebra autohibridizante individual, o cualquier combinación de estas. Las reacciones de hibridización se pueden realizar bajo condiciones de diferentes "severidad". En general, una reacción de hibridización de baja severidad es llevada a cabo aproximadamente a 40°C en 10 X SSC o una solución de intensidad iónica/temperatura equivalentes. Una hibridización de severidad moderada es típicamente realizada en aproximadamente 50°C en 6 X SSC, y una reacción de hibridización de alta severidad generalmente es realizada aproximadamente a 60°C en 1 X SSC. Una variante del No. de Acceso NRRL 30232 también puede ser definida como una cepa que tiene una secuencia genómica que es más grande que 85%, más de preferencia más grande que 90% o mucho más de preferencia más grande que 95% de identidad de secuencia al genoma de No. de Acceso NRRL B-30232. Un polinucleótido o región de polinucleótido (o un polipéptido o región de polipéptido) tiene un cierto porcentaje (por ejemplo 80%, 85%, 90% o 95%) de "identidad de secuencia" a otra secuencia, lo que significa que, cuando se alinea, ese porcentaje de bases (o aminoácidos) son las mismas al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el por ciento de homología o identidad de secuencia se puede determinar utilizando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo aquellos descritos en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel y colaboradores. Eds. 1987) Supplement 30, sección 7.7.18, Tabla 7.7.1. De preferencia, se utilizan parámetros ' de error para la alineación. Un programa de alineación preferido es BLAST, utilizando parámetros de error. En particular, los programas preferidos son BLASTN y BLASTP, utilizando los siguientes parámetros de error: Código genético = estándar; filtro = ninguno; hebra = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificado por = HIGH SCORE; Bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR. Los detalles de estos programas se pueden encontrar en la siguiente dirección de Internet: http://www.nebí.nlm.nh.gov/cgi-bin/BLAST. El término "cultivar" se refiere a la propagación de organismos sobre, o en medios de varias clases. "Cultivo de caldo completo" se refiere a un cultivo liquido que contiene tanto células como el medio. "Sobrenadante" se refiere al caldo liquido que permanece cuando las células cultivadas en el caldo son retiradas por centrifugación, filtración, sedimentación u otros medios bien conocidos en la técnica. Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para efectuar los resultados beneficiosos o deseados. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. En términos de tratamiento y protección, una "cantidad efectiva" es aquella cantidad suficiente para reducir, retardar, o eliminar una capacidad del insecto para alimentarse, crecer y reproducirse en la etapa de desarrollo preadulta o adulta. Como se utiliza en la presente, el término "insecto" incluye todos los organismos en la clase de Insectos . Como se utiliza en la presente, el término "Lepidópteros" se refiere a la orden de insectos caracterizada por una etapa de larva que toma la forma de una oruga o gusano y una etapa adulta que toma la forma de una polilla o una mariposa.

Un insecto "preadulto" se refiere a cualquier forma de un organismo antes de la etapa adulta, incluyendo, por ejemplo, huevecillos, larvas y crisálidas. "Insecticida" se refiere a la capacidad de una sustancia para incrementar la mortalidad o inhibir la proporción de crecimiento de los insectos. "Pesticida" se refiere a la capacidad de una sustancia para incrementar la mortalidad o inhibir la proporción de crecimiento de los insectos, nemátodos y ácaros. "Control positivo" significa un compuesto conocido que tiene actividad pesticida. Los "controles positivos" incluyen, pero no están limitados a, pesticidas químicos comercialmente disponibles . El término "control negativo" significa un compuesto conocido que no tiene actividad pesticida. Ejemplos de controles negativos son el agua, medios nulos o bajas concentraciones de solvente tal como acetona, etanol o acetato de etilo. Los medios nulos están compuestos de caldo de fermentación esterilizado en la ausencia de un microorganismo de fermentación. El término "solvente" incluye cualquier liquido que contiene otra sustancia en solución. "Extraible de solvente" se refiere a cualquier compuesto que se disuelve en un solvente y que luego puede ser aislado del solvente. Ejemplos de solventes incluyen, pero no están limitados a, solventes orgánicos similares a acetato de etilo (EtOAc) , acetona, etanol (EtOH) , acetonitrilos, metanol (MeOH), butanol (BuOH) o dimetiisulfóxido (DMSO) . El término "metabolito" se refiere a cualquier compuesto, sustancia o subproducto de la fermentación de un microorganismo que tiene actividad biológica. Una "composición" se propone para dar a entender una combinación de agente activo y otro compuesto, portador o composición, inerte (por ejemplo, un agente detectable o marcador o portador liquido) o activo, tal como un adyuvante. Esta invención proporciona un cultivo biológicamente puro de una cepa que tiene todas las características de identificación del Streptomyces galbus, No. de Acceso NRRL 30232, y sus variantes y mutantes, como se describen anteriormente, que tienen actividad insecticida. En una modalidad, la invención es la cepa designada No. de Acceso NRRL 30232. Esta invención proporciona un proceso para aislar un metabolito de los cultivos de cepas biológicamente puros, descritos en la presente, asi como los metabolitos aislados por medio de eso. El metabolito es caracterizado por ser extraible en solvente y tener un peso molecular de menos de ,000 Daltons. Además se proporciona un proceso para purificar sobrenadantes biológicamente activos de los cultivos biológicamente puros, identificados en la presente, y los sobrenadantes aislados mediante el mismo. Los sobrenadantes aislados tiene actividad insecticida similar a aquella de un Streptomyces galbus, No. de Acceso NRRL 30232, o mutantes o variantes del mismo. También se proporcionan mediante esta invención, composiciones que comprenden por lo menos uno de los cultivos biológicamente puros, sobrenadantes o el metabolito aislado descrito anteriormente y un portador. En otro aspecto, la composición además contiene por lo menos un pesticida químico o biológico. Las composiciones son formuladas como cualquiera o más de un polvo humectable, un granulo, una suspensión acuosa y concentrado emulsificable y una formulación microencapsulada . Con el fin de alcanzar buena dispersión y adhesión de las composiciones dentro de la presente invención, puede ser ventajoso formular el cultivo de caldo completo, sobrenadante, fracción y/o metabolito/antibiótico con componentes que ayudan a la dispersión y a la adhesión. Por consiguiente, las formulaciones adecuadas serán conocidas para aquellos expertos en la técnica (polvos humectables, granulos y similares, o pueden ser microencapsuladas en un medio adecuado y similar, líquidos tales como fluibles acuosos y suspensiones acuosas y concentrados emulsificables) . Otras formulaciones adecuadas serán conocidas para aquellos expertos en la técnica. Cualquiera de las cepas, metabolitos, fracciones, sobrenadantes y composiciones que contienen estos ingredientes activos, mencionados anteriormente, se pueden utilizar para proporcionar un método para tratar o proteger plantas, raices o frutas de infecciones de insectos. Los insectos incluyen, pero no están limitados a, un insecto seleccionado del grupo que consiste de Lepidópteros, Coleópteros y Dípteros. En un aspecto, el insecto es Lepidóptero, por ejemplo, Spodoptera exigua, Anticarsia ge matalis, Plutella spp, Helicoverpa zea, Heliothis virescens y Trichoplusia ni . También se proporciona mediante esta invención, un método para producir un sobrenadante activo como un insecticida al cultivar las cepas de esta invención y al aislar el sobrenadante. El sobrenadante producido mediante este método también es reivindicado o reclamado en la presente. El metabolito es aislado mediante la extracción en fase sólida, fase inversa, utilizando un gradiente escalonado de metanol y agua. El metabolito puede ser identificado por su peso molecular (menos de 10,000 Daltons).

Todas las patentes y publicaciones citadas en la presente son incorporados por referencia. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención. Estos ejemplos no van a ser considerados como limitativos. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proponen para ilustrar, pero no para limitar la invención.

Ejemplo 1 Caracterización de la cepa de Streptomyces galbus, No. de Acceso NRRL 30232. El No. de Acceso NRRL 30232 se identificó basándose en la secuenciación de 16S rRNA. El protocolo utilizado para generar la secuencia de datos del gen 16S rRNA (Acculab Customer Handbook v. 1.0) es descrito como sigue. El gen 16S rRNA es amplificado en PCR a partir del DNA genómico aislado de colonias bacterianas. Los cebadores o iniciadores utilizados para la amplificación corresponden a las posiciones de E. coli 005 y 531. Los productos de amplificación son purificados del exceso de cebadores y los dNTPs utilizando membranas de corte de peso molecular Microcon 100 (Amicon) y verificadas para la calidad y cantidad al correr una porción de los productos sobre un gel de agarosa. La secuenciación del ciclo de los productos de amplificación de 16S rRNA es llevada a cabo utilizando la AmpliTaq FS DNA polimerasa y los terminadores de tinte dRhodamine. Los terminadores marcados con tinte en exceso son retirados de las reacciones de secuenciación utilizando una columna de giro Sephadex G-50. Los productos son colectados por centrifugación, secados bajo vacio y congelados a -20°C hasta que estuvieron listos para la carga. Las muestras son resuspendidas en una solución de formamida/azul de dextrano/EDTA y desnaturalizadas antes de la carga. Las muestras son sometidas a electroforesis en un Secuenciador de DNA ABI Prism 377. Los datos son analizados utilizando PE/edición de DNA de Applied Biosystem y el software (elementos de programación) de montaje. Una vez obtenidas, las secuencias son comparadas contra la base de datos PE/Applied Biosystem' s MicroSeqMR utilizando el software de análisis de secuencia MicroSeq*4*. Las secuencias también son comparadas con el GenBank and Ribosomal Datábase Project (RDP) . El resultado de la secuenciación de 16S rRNA identificó el NRRL No. 30232 como Streptomyces galbus con un registro de %ID de 99% (GenBank) y un rango de similaridad de 0.98 (RDP). Estos registros indican una igualación en el nivel de especie. Ejemplo 2 Actividad del Streptomyces galbus, No. de Acceso NRRL 30232 contra patógenos de plantas. La cepa de Streptomyces galbus novedosa se cultivó para probar contra patógenos de plantas de la siguiente manera. El microbio aislado se fermentó inicialmente en tres medios de cultivo de actinomycete distintos. El medio 38 estuvo compuesto de 2 g/L de pasta de tomate, 2 g/L de harina de avena y 1.0 g/L de sales de mar. El medio 31. estuvo compuesto de 45 g/L de harina de avena, 2 g/L de extracto de levadura, 6 g/L de KH2P0 y 4.8 g/L de Na2HP04, pH 7. El medio 6 estuvo compuesto de 20 g/L de almidón soluble, 10 g/L de dextrosa, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de N-Z amineA, y 1 g/L de CaC03. El microbio se recolectó del agar de tomate-harina de avena (2 g/L de pasta de tomate, 2 g/L de harina de avena y 20 g/L de agar) y se introdujo a tubos cónicos de 50 ml que contienen 12 ml del medio de fermentación estéril, tapados con un tapón de espuma. Los tubos inoculados se incubaron a 27±3°C, en un agitador orbital durante seis dias. Los tubos del producto de fermentación a pequeña escala se giraron a 4,200 rpm (fuerzas de 3,500 g) durante 15 minutos utilizando un rotor de cubo oscilatorio (JS4.2) en una centrifuga refrigerada Beckman JB-6. Los sobrenadantes se colectaron asépticamente y se transfirieron a placas de 96 cavidades profundas, estériles, o a tubos de cinco ml en rejillas dispuestas a la automatización. Cada sobrenadante se transfirió asépticamente, por triplicado, en placas microtitulo de 96 cavidades, estériles. Controles químicos se adicionaron como verificadores positivos junto con los medios nulos y los controles de agua. Las capas de agar fundido luego se sobrepusieron en un modo escalonado. Las alícuotas de 25 microlitros (µl) de sobrenadante se sobrepusieron con 75 µl de agar al 2.5% fundido, seguido por alícuotas de 100 µl de Agar de Dextrosa de Papa de 0.75% (Caldo de Dextrosa de Papa 23 g/L, agar 7.5 g/L) . Finalmente, 25 µl de una suspensión de esporas patogénicas se sobrepusieron en la parte de arriba del PDA y las placas se incubaron a 2 ±2°C durante cuatro dias. El crecimiento del patógeno se clasificó utilizando un Índice graduado, en el cual cinco indicó crecimiento igual al control de agua, y una clasificación de uno indicó la ausencia completa de crecimiento. Los valores del índice de dos (2) hasta (4) representan niveles intermedios de esporulación y crecimiento, mientras que cero (0) indica una prueba con falla o innecesaria. Los siguientes pares de patógeno/sustancia química se probaron: Alternaría brassisicola (ABRA Benomyl), Botrytis cinérea (BOTC/Benomyl) , Monilinua fruticola (MONF/Benomyl) , Phytophthora capsici (PCAP/Metalaxyl) , Pseudomonas syringae (PSTO/Gentamycin) y Colletotrich?m coccoides (COLC/Chlorothaloni) . La Tabla 1 muestra los resultados de tres pruebas replicadas distintas. Las pruebas comprendieron tres datos de fermentación separados y son documentados en lo siguiente. Los controles químicos registraron las clasificaciones del índice de uno (1) en todas las pruebas replicadas independientes y los medios nulos tuvieron clasificaciones de cinco (5) .

Tabla 1. Actividad fungicida del No. de Acceso NRRL 30232 Aunque hubo alguna ligera inhibición de los patógenos probados en algunas de las cavidades, particularmente PCAP Rep 1, los resultados no se confirmaron concluyentemente en Rep 2. En conjunto, los datos muestran que el sobrenadante de caldo completo de un cultivo de seis días de edad de la cepa novedosa No. de Acceso NRRL 30232 no estuvo generalmente activo contra las esporas patogénicas de la planta en un ensayo de tipo difusión de agar.

Ejemplo 3 Actividad del Streptomyces galb?s, No. de Acceso NRRL 30232 contra insectos. Para estimar la actividad insecticida, seis réplicas de cada extracto microbiano se sobrepusieron en la parte superior de una dieta artificial basada en germen de trigo/caseína en placas de 96 cavidades (29 g/L de agar, 13.8 g/L de Celufil, 38.5 g/L de sucrosa, 32.2 g/L de caseína, 27.5 g/L de germen de trigo, 9.2 g/L de mezcla de sal de Wesson, 9.0 g/L de premezcla de vitamina, 33 mg/L de estreptomicina, 33 mg/L de clorhidrato de clorotetraciclina, 1.2 ml/L de ácido propriónico, 0.12 ml/L de ácido fosfórico, 10 ml/L de etanol de graduación 100, 1 g/L de metil parabeno, 0.3 g/L de benzoato de sodio, 1.0 g/L de ácido sórbico). Temporalmente, los huevecillos de gusano desvastador de remolacha sincronizados se sanitizaron y se suspendieron en una solución de agar diluida. Se utilizaron placas de filtración de 96 cavidades Millipore® invertidas, como un patrón para inocular rectángulos de papel filtro Whatman® #2 con cinco a diez huevecillos de siete dias de edad en 25 µl. El papel filtro se dejó secar, se invirtió y se emparejó a los orificios de la cavidad de la placa de dieta/extracto. Los papeles filtro se cubrieron con una tapa de placa ventilada y se ahusaron en el lugar adecuado. Las placas se incubaron en una cámara de crecimiento Percival a 28±2°C, bajo un fotoperiodo de 16:8, a humedad relativa de 30-40%. Los huevecillos se incubaron y los neonatos se dejaron caer a la dieta tratada con extracto. Después de cuatro días, las placas se retiraron del Percival, la cinta de celofán se retiró y las placas se dejaron caer sobre una tabla de mesa para retirar los gusanos del papel filtro. La tapa/filtros se reemplazaron con una pieza perforada de Mylar transparente y se sellaron en el lugar adecuado con un hierro caliente. La prueba se regresó al Percival durante un día adicional. El crecimiento de larvas se clasificó visualmente utilizando un Índice similar a la selección de patología de la planta, donde una clasificación de uno indicó 100% de mortalidad y una clasificación de cuatro indicó crecimiento igual a los controles no tratados. Una clasificación de dos indica menos de 100% pero más grande que 50% de mortalidad o crecimiento severamente impedido. Una clasificación de tres indica menos de 50%, pero mayor que 25% de mortalidad o impedimento de crecimiento. Una placa de control química se corrió para cada dato experimental replicado. Ocho diluciones en serie de Javelin® (cepa kurstaki de Bacillus thuringiensis) de 1000 a 7 PPM produjeron datos de respuesta a la dosis. Los escarabajos de pepino moteados del oeste (CRW: Diabxotica undecimpunctata) se probaron en un análisis similar utilizando bifentrina como un control químico. Afidos de duraznos verdes (GPA: Myzus persicae) o áfidos de guisante (PA: Acyrthosiphon pisum) se probaron en análisis de placa de 96 cavidades. Los sobrenadantes se absorbieron sobre discos de papel filtro en el fondo de las placas de 96 cavidades. Los áfidos se colocaron en las cavidades y placas de filtro de 96 cavidades Millipore® adaptadas con membranas para película, se utilizaron para cubrir la placa de base. Las cavidades de la placa de filtro se cargaron con 40 µl de sobrenadante y 40 µl de dieta liquida artificial (300 g/L de sucrosa, 10 g/L de hidrosilado de caseína, 1 g/L de mezcla de sal de Wesson, 1 g/L de premezcla de vitamina, 33 mg/L de estreptomicina, 33 mg/L de clorhidrato de clorotetraciclina, 1 g/L de metil parabeno, 0.3 g/L de benzoato de sodio, 1.0 g/L de ácido sórbico, pH 6.8). Las placas de control químicas se trataron con diluciones en serie de imidocloprid en las cuales el papel filtro tratado en la placa de base detectó la actividad de contacto y las cavidades tratadas con membrana detectaron la actividad ingerida. La mortalidad de áfidos se leyó después de 24 a 48 horas. El número de áfidos vivos que se alimentan en las membranas de control de agua/dieta y que caminan o descansan en las cavidades con papel filtro tratado con agua se tabularon. Los limites superior e inferior y su desviación estándar se calcularon permitiendo los cálculos del rango de índice. Acaros rojos de dos manchas (SM: Tetranynchus orticae) se evaluaron utilizando placas de 96 cavidades con papeles filtro. Los sobrenadantes (40 µl) se pipetearon sobre las papeles filtro seguido por alícuotas de 20 µl de dieta liquida artificial y las placas se secaron parcialmente bajo aire inducido. La mortalidad se evaluó después de 24-48 horas. Se utilizaron diluciones en serie de avermectina como controles químicos. Ascárides (CE: Caenorhabditis elegans) , nemátodos entomopatogénicos (HB: Heterorhabditis bacteriophora) y nematodos del nudo de raíz (MJ: Meloidogyne javonica) se evaluaron como suspensiones liquidas de J2s en placas de 96 cavidades. Avermectina® se utilizó como un control químico. Los datos en la Tabla 2 muestran la especificidad del No. de Acceso NRRL 30232 contra el gusano desvastador de remolacha. El No. de Acceso ATCC 49460 es el aislado del tipo silvestre en la American Type Culture Collection de Saccharopolyspora spinosa - un organismo que produce espinosínas. Ver, Sparks y colaboradores, (1999) "Fermentation-derived insecticide control agents: the spinosyns" En: Biopesticides, Use and Delivery, Hall F.R. y colaboradores, eds., Humana Press, Totowa, New Yersey, pp. 155-170. Como es mostrado en la Tabla 2, en lo siguiente, ambos No. de Acceso ATCC 49460 y No. de Acceso 30232 fueron activos contra el gusano desvastador de remolacha en el medio 31.

Tabla 2 Actividad Isecticida del NRRL 30232 y ATCC 49460 Ejemplo 4 Características quimi.cas de los Metabolitos Insecticidas Producidos mediante el No. de Acceso NRRL 30232. Para " determinar la estabilidad del principio activo, alícuotas de un mililitro de caldo completo se ajustaron al pH de 1 con ácido clorhídrico 2N (HCl) . Después de una hora el pH se reajustó a 7 con hidróxido de sodio 2N (NaOH) . De manera similar, alícuotas de 1 ml del caldo completo se ajustaron a un pH 10 con NaOH 2N. Después de 1 hora, el pH se reajustó a 7 con HCl 2N. La actividad se perdió durante el tratamiento con ácido, pero permaneció bajo condiciones básicas. Para determinar la capacidad de extracción del principio activo, alícuotas de 20 ml del caldo completo se dividieron con acetato de etilo, 3 veces con 20 ml cada uno (extracto total 60 ml) y subsecuentemente con n-butanol (BuOH) saturado con agua, 3 veces con 20 ml cada uno (extracto total 60 ml) . Todas las fracciones, incluyendo la fase acuosa restante se secaron y luego se resuspendieron. Los extractos de EtOAc secados se suspendieron en acetona: agua, las fracciones de BuOH se suspendieron en EtOH: agua y la fase acuosa restante se resuspendió en agua para llevarla nuevamente al equivalente de caldo lx. Las fracciones combinadas consistieron de volúmenes iguales de cada fase. La fracción de EtOAc se encontró que contiene la mayoría del metabolito activo, con una porción pequeña que se lleva en la fracción de BuOH, cuando se ensayó a lx. A concentraciones más diluidas (l/4x) la actividad solamente se observó en la fracción de EtOAc. Un equivalente de caldo completo de 10 ml de la fracción de EtOAc en 200µl de acetona se purificó adicionalmente mediante la extracción en fase sólida de fase inversa (RP) (Bakerbond spe, octadecilo) utilizando un gradiente escalonado de MeOH al 25%: agua, MeOH al 50%: agua, MeOH al 75%: agua y MeOH al 100%. El metabolito activo se eluyó con MeOH al 100%. Los datos en la Tabla 3, en lo siguiente, muestran los resultados de cuatro extracciones-particiones, dos cromatografías de fase inversa y dos pruebas de pH. Tabla 3 Bioactividad del No. de Acceso NRRL 30232; extractos, particiones, cromatografía de RP y pH alterado.

Distinto a los fungicidas típicamente asociados con Streptomyces galbus, la actividad insecticida del No. de Acceso NRRL 30232 fue estable bajo condiciones alcalinas (pH 9-10) e inestable en ácido (pH 1-2) .

Ejemplo 5 Actividad de la Planta del No. de Acceso NRRL 30232 Contra Plagas de Insectos La prueba de la planta completa confirmó la actividad del No. de Acceso NRRL 30232 contra el gusano desvastador de remolacha. Primero, hojas reales de frijoles verdes enanos Henderson jóvenes se sumergieron durante 3-5 segundos en caldo completo y se dejaron secar con aire. Las hojas se colocaron en una placa petri de 50 mm con papel filtro húmedo y 10 primeras larvas de gusano desvastador de remolacha neonatas en estrella. La mortalidad se clasificó después de 48 horas. Los resultados se muestran en la Tabla 4, siguiente. Tabla 4 Actividad Larvicida del No. de Acceso NRRL 30232 en pruebas de inmersión de hoja contra el gusano desvastador de remolacha En pruebas similares, el No. de Acceso NRRL 30232 demostró igual o mejor actividad larvicida contra Heliothis virescens, Helicoverpa zea y Anticarsia gemmatalis.

Los caldos completos del No. de Acceso NRRL 30232 se giraron a 9,000 x g y el sobrenadante se roció sobre plantas de frijoles Henderson Bush de una semana de edad utilizando un aerógrafo. Las hojas nuevas se dejaron secar y las hojas reales más pequeñas se cosecharon. Cada hoja (tres réplicas por tratamiento) se colocaron en una placa petri de 50 ml con un papel filtro humedecido y aproximadamente 10 larvas neonatas. Las placas se leyeron después de 24 horas en una incubadora (28±2°C, 16:8 fotoperíodo) . Las plantas de frijol grandes de dos semanas de edad con hojas reales completamente expandidas se rociaron para estimar el potencial de fitotoxicidad. Los resultados son mostrados en la Tabla 5 a continuación. Tabla 5 Eficacia del sobrenadante y los extractos de EtOAC contra gusanos desvastadores de remolacha en hojas de frijol *Este es el mismo extracto de EtOAc utilizado en el análisis documentado en la Tabla 3. No se observó fítotoxicidad con algunas de las muestras. Las pruebas de las hojas sustentan los datos de selección primaria mostrando que el caldo completo y el sobrenadante son estables y potentes. En este análisis la fracción de acetato de etilo perdió algo de actividad cuando se roció sobre las hojas. La prueba en planta completa adicional a una escala de invernadero confirmó la protección completa de la col China, Brassica rapa, contra el gusano desvastador de remolacha. Un rociador de carril de laboratorio (Devries Manufacturing, Holland, Mich.) se calibró para suministrar un volumen de rocío de 90 galones/acre vía una boquilla de ventilador TEE-JET 8015. Las plantas de col maduras se trataron con agua desionizada (control negativo) , caldo completo No. de Acceso NRRL 30232 o Javelin® WG a 1.1 lb/acre (estándar tóxico) . Antes de la aplicación, el caldo completo de No. de Acceso NRRL 30232 se homogeneizó mecánicamente durante 20 segundos con un Ultra Turrax (Tek ar, Cincinnati, Ohio) . Cada tratamiento se replicó tres veces. Los residuos del rocío se verificaron para uniformidad y se dejaron secar antes de que las plantas se colocaran dentro del encerramiento de plexiglás y malla dentro de un medio ambiente de invernadero. Cada planta luego se inoculó con aproximadamente 50 larvas neonatas y aproximadamente 50 huevecillos. Las plantas se mojaron como fue necesario y sin que se deslavaran el residuo de rocío o los insectos del follaje. Las observaciones cualitativas en el Dia 7 indicaron daño por alimentación del insecto significante dentro del tratamiento de control, daño menor con el tratamiento estándar tóxico (Javelin®), y poco o nada de daño dentro del tratamiento con el No. de Acceso NRRL 30232. Los resultados indicaron que el tratamiento con el No. de Acceso NRRL 30232 dio por resultado plantas de calidad superior en el mercado.

Ejemplo 6 Aumento Progresivo de la. Fermentación y Estabilidad de la Actividad Contra Plagas de Orugas. Los puntos del aumento progresivo de la fermentación son un componente significante en la ruta critica de evaluación de un biopesticida potencial (Hofstein y Freidlender (1994) "Development of production, formulation, and delivery systems for biofungicides" En: Brighton Crop Protection Conference: Pests and Disease, BCPC publications, Major Print Ltd, Nottingham UK, pp. 1273-1280) . El incremento del volumen de la fermentación de 12 ml en un tubo de 50 ml (TI) a 50 ml en un matraz de agitación de 250ml (SI) es el primer paso en el proceso de aumento progresivo. La concentración de los sobrenadantes de este paso vía speed-vac no tuvo un impacto negativo en la actividad biológica del No. de Acceso NRRL 30232 produciendo una respuesta de dosis positiva cuando se probó en 2x, Ix y 0.5x. La prueba de estabilidad del No. de Acceso NRRL 30232 de la fermentación SI mostró que la actividad contra el gusano desvastador de remolacha es estable por dos a tres semanas, cuando se mantuvo bajo refrigeración a 4°C o se mantuvo congelado a -80°C. Los resultados son mostrados en las Tablas 6. y 7 a continuación.

Tabla 6 Bioactividad del caldo de una semana de edad (Wl) cultivado en un matraz de agitación de 250 mi (SI) y en tubos de 50 ml (TI) Tabla 7 Bioactividad del caldo de dos semanas de edad (W2) 30232 cultivado en un matraz de agitación de 250 ml (SI) La Tabla 8, en lo siguiente, muestra los resultados cuando la especificidad de la actividad biológica del matraz de 250 ml se limitó al gusano desvastador de remolacha como en la fermentación inicial en tubos de 50 ml.

Tabla 8 Bioactividad del caldo de No. de Acceso NRRL 30232 refrigerado y congelado de tres semanas de edad (W3) cultivado en un matraz de agitación de 250 ml (SI) El segundo paso en el proceso de aumento progresivo es una repetición del volumen de 50 ml en un matraz de 250 ml (S2) . La fermentación concurrente en un tubo de 50 ml verificó la actividad de la cepa. Los resultados son mostrados en la Tabla 9, a continuación. Tabla 9 Respuesta del caldo de una semana de edad (Wl) cultivado en un matraz de agitación de 250 ml (S2) y en tubos de 50 ml (T2) A medida que se incrementó el volumen, la bioactividad del medio 38 declinó comparado con el medio 31. Sigmund J. M. y Hirsch, C. F. (1998) J. Antibiotics 51:829- 836, demostraron que la adición de pasta de tomate es un componente crítico en la producción fungicida. En contraste a lo que se observa con la rustmicina (producida por S. galbus) , el aumento progresivo de los solicitantes mostró que a medida que se incrementó el volumen, el medio de harina de avena complejo (31) incrementó la actividad insecticida del No. de Acceso NRRL 30232 sobre el medio 38 basado en pasta de tomate. Dos incrementos adicionales en el volumen confirmaron la eficacia del medio 31. El S3 utilizó 200 ml del medio 31 en un matraz de 1 L con deflector y el S4 utilizó volúmenes de 500 ml en matraces de Fernbach de 2.8 L sin deflector. Los resultados son mostrados en la Tabla 10, enseguida. Tabla 10 Bioactividades de caldos de dos semanas de edad (W2) cultivados en matraces de agitación de 1,000 ml (S3) y en matraces de Fernbach de 2,800 ml (S4) El incremento del tamaño de la fermentación a través de los tres pasos a 500 ml del medio 31 en un matraz de Fernbach de 2,800 ml no tuvo un impacto negativo sobre la actividad insecticida del No. de Acceso NRRL 30232. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y entendimiento, será evidente para aquellos expertos en la técnica que ciertos cambios y modificaciones serán practicados. Por lo tanto, la descripción y los ejemplos no deben ser considerados como limitativos del alcance de la invención, el cual es delineado por las reivindicaciones anexas.

Claims (35)

1. REIVINDICACIONES 1. Un cultivo biológicamente puro de una cepa que tiene todas las características de identificación del Streptomyces galbus, No. de Acceso NRRL 30232, y sus variantes y mutantes, caracterizado porque tiene actividad insecticida .
2. 2. Un cultivo biológicamente puro de un Streptomyces galbus, caracterizado porque es designado No. de Acceso NRRL 30232.
3. 3. Una composición, caracterizada porque comprende el cultivo biológicamente puro de la reivindicación 1 o 2 y un portador.
4. 4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende por lo menos un pesticida químico o biológico.
5. 5. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque además comprende por lo menos un pesticida químico o biológico.
6. 6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición es formulada del grupo que consiste de un polvo humectable, un granulo, una suspensión acuosa y un concentrado emulsificable y una formulación microencapsulada.
7. 7. Un metabolito aislado del cultivo biológicamente puro de una cepa que tiene todas las características de identificación de un Streptomyces galbus, No. de Acceso NRRL 30232, y mutantes del mismo, caracterizado porque tiene actividad insecticida.
8. 8. Un sobrenadante separado del cultivo biológicamente puro de una cepa que tiene todas las características de identificación de un Streptomyces galbus, No. de Acceso NRRL 30232, o mutantes del mismo, caracterizado porque tiene actividad insecticida.
9. 9. Una composición, caracterizada porque comprende el metabolito de la reivindicación 7 y un portador.
10. 10. Una composición, caracterizada porque comprende el sobrenadante de la reivindicación 8 y un portador.
11. 11. El metabolito de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende por lo menos un pesticida químico o biológico.
12. 12. El sobrenadante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque además comprende por lo menos un pesticida químico o biológico.
13. 13. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la composición es formulada del grupo que consiste de un polvo humectable, un granulo, una suspensión acuosa, un concentrado emulsificable y una formulación microencapsulada.
14. 14. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la composición es formulada del grupo que consiste de un polvo humectable, un granulo, una suspensión acuosa, un concentrado emulsificable y una formulación microencapsulada.
15. 15. Un método para prevenir o tratar una planta, raíz o fruta de una infestación de insectos, caracterizado porque comprende aplicar una cantidad efectiva del cultivo biológicamente puro de la reivindicación 1 o 2 a la planta, raíz o fruta.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el insecto es seleccionado del grupo que consiste de Lepidópteros, Coleópteros y Dípteros.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el insecto es Lepidóptero.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la infestación de Lepidópteros es ocasionada por al menos un insecto seleccionado del grupo que consiste de Spodoptera exigua, Anticarsía ge matalis, Plutella spp. , Helicoverpa zea, Heliothis virescens y Tríchoplusia ni .
19. 19. Un método para prevenir o tratar una planta, raíz o fruta de una infestación insecticida, caracterizado porque comprende aplicar una cantidad efectiva de la composición de la reivindicación 4 o 5 a la planta, raíz o fruta .
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el insecto es seleccionado del grupo que consiste de Lepidópteros, Coleópteros y Dípteros.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el insecto es Lepidóptero.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la infestación de Lepidópteros es ocasionada por al menos un insecto seleccionado del grupo que consiste de Spodoptera exigua, Anticarsia gemmatalis, Plutella spp. , Helicoverpa zea, Heliothis virescens y Trichoplusia ni .
23. 23. Un método para prevenir o tratar una planta, raíz o fruta de una infestación, caracterizado porque comprende aplicar una cantidad efectiva del metabolito de la reivindicación 7 u 11.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el insecto es seleccionado del grupo que consiste de Lepidópteros, Coleópteros y Dípteros.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el insecto es Lepidóptero.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la infestación de Lepidópteros es ocasionada por al menos un insecto seleccionado del grupo que consiste de Spodoptera exigua, Anticarsia gemmatalis, Plutella spp. , Helicoverpa zea, Heliothis vírescens y Trichoplusia ni .
27. 27. Un método para prevenir o tratar una planta, raíz o fruta de una infestación, caracterizado porque comprende aplicar una cantidad efectiva del sobrenadante de la reivindicación 8 o 12 a la planta, raíz o fruta.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el insecto es seleccionado del grupo que consiste de Lepidópteros, Coleópteros y Dípteros.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el insecto es Lepidóptero.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la infestación de Lepidópteros es ocasionada por al menos un insecto seleccionado del grupo que consiste de Spodoptera exigua, Anticarsia gemmatalis, Plutella spp. , Helicoverpa zea, Heliothis virescens y Trichoplusia ni .
31. 31. Un método para mejorar la bioactividad del cultivo biológicamente puro de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende fermentar el cultivo durante una a tres semanas antes de la aplicación a una planta, raíz o fruta.
32. 32. Un método para producir un sobrenadante activo como un insecticida, caracterizado porque comprende cultivar la cepa de la reivindicación 1, y aislar el sobrenadante producido por la cepa, para de esta manera producir el sobrenadante.
33. 33. El sobrenadante producido mediante el método de la reivindicación 32. 3 . Un método para aislar un metabolito activo como un insecticida, caracterizado porque comprende separar el metabolito del sobrenadante de la reivindicación 33 mediante la extracción en fase sólida y en fase inversa utilizando un gradiente gradual de metanol y agua, para aislar de esta manera el metabolito. 35. El metabolito producido mediante el método de la reivindicación
34. 34.