CN102911227B - 一种淀粉酶产色链霉菌、其发酵产物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastochromognes）、其发酵产物5`-epi-SPA-6952A及其应用。本发明的淀粉酶产色链霉菌的保藏号为CGMCCNo.2281，其发酵产物具有良好的杀虫活性，且发酵产物中具有杀虫活性的活性成分为化合物5`-epi-SPA-6952A。本发明的淀粉酶产色链霉菌的发酵液、活性成分5`-epi-SPA-6952A都具有良好的杀虫活性，且生产成本低、对环境友好，因而具有良好的应用前景。另外，化合物5`-epi-SPA-6952A是一种新的化合物，因此具有广泛的开发应用前景。

Description

一种淀粉酶产色链霉菌、其发酵产物及应用

本申请是申请号200810200613.4、申请日2008年09月27日、发明创造名称“一种淀粉酶产色链霉菌、其发酵产物及应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体地说，是关于一种淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastochromogenes）SSPRC-11339，其发酵产物及应用。

背景技术

化学农药防治虫害对于农业生产的发展起了十分重要的作用。但由于长期依赖化学农药，忽视自然调控，使虫害防治趋于复杂和困难。并且很多药剂都存在一个用药量大，毒性较高，对环境有影响等问题，不符合当前社会的要求，急需有新产品来替代。

为了有效防治虫害，生物农药(包括农用抗生素）的研究与开发在全球引起了广泛的重视。另外，随着我国加入WTO步伐的加快，再要仿制新的国外农药已几乎不可能，开发拥有自主知识产权的农药产品，已成为迫在眉睫的任务。

随着生物技术的兴起，利用微生物和生物源产生的活性物质作为开发新农药的研究受到世界各国极大的重视。这是由于生物农药通常易被自然界分解而不会污染环境，而且还可以利用与微生物生长繁殖所需的几乎相同的设备条件和再生资源来生产不同的产品，能耗低、投资省。

发明内容

为了寻找比以往更有效的杀虫剂，本申请的发明人从多种土壤中分离微生物并制取其代谢产物，然后对获得的代谢产物的杀虫活性进行了研究，结果找到了一株菌株SSPRC-11339，其代谢产物对于粘虫等多种农田植物害虫具有良好的防治效果。经过对SSPRC-11339的理化性质等进行分析，确定该菌株为淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastochromogenes）。经过进一步提取代谢产物中的活性成分，并确定活性成分的结构，发现该活性成分是一种新的化合物。

因此，本发明的首要目的就在于，提供一种淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastochromogenes）SSPRC-11339，其代谢产物具有良好的杀虫活性。

本发明的第二个目的在于，提供所述淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastochromogenes）SSPRC-11339用于制备农用杀虫剂的应用。

本发明的第三个目的在于，提供一种由所述淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastochromogenes）SSPRC-11339发酵获得的新的化合物5`-epi-SPA-6952A。

本发明的第四个目的在于，提供一种农用杀虫剂。

本发明的第五个目的在于，提供所述农用杀虫剂的应用。

本发明的所述具有杀虫活性的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastochromogenes）SSPRC-11339，其16srDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步的，所述淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastochromogenes）SSPRC-11339的保藏号为CGMCC No.2281。

本发明的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastochromogenes）SSPRC-11339的代谢产物对于粘虫等多种农田植物害虫具有良好的防治效果，因而可以用于生产农用杀虫剂。

本发明的由所述淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastochromogenes）SSPRC-11339发酵获得的新的化合物5`-epi-SPA-6952A，是化合物SPA-6952A(Nobuo Hosotani et al.J.Antibiot.58(6):409-411,2005）的手性异构体，其结构式如下：

本发明的农用杀虫剂，以化合物5`-epi-SPA-6952A为活性成分，还可以添加一种或多种常用的助剂。

根据本发明，在制备所述以活性成分5`-epi-SPA-6952A为有效成份的农用杀虫剂时，可同样使用本技术领域中已知农药所通用的固相、液相及乳化分散剂等各种载体，并可配制成乳油、颗粒剂、水剂、粒剂、可湿性粉剂、微胶囊剂、胶悬剂、气雾剂等任意剂型。同时，在各种制剂中一般可适当添加一些助剂，如分散剂、乳化剂、润湿剂、渗透剂、展着剂、粘着剂、消泡剂、发泡剂、增粘剂、稳定剂等，但不能加入碱性辅助剂。用于制剂中的载体，可以是诸如Jeeklite，滑石，膨润土，粘土，高岭土，硅藻土，白碳黑，蛭石，熟石灰，硅砂，硫酸铵或尿素等的固体载体，诸如异丙醇，二甲苯，环己烷或甲基萘等的液体载体。这里所述的表面活性剂和分散剂可以是苯甲酸纳、醇磺酸酯，烷基芳基磺酸酯，木质素磺酸盐，聚氧乙烯乙二醇醚，聚氧乙烯烷基芳基醚或聚氧乙烯山梨醇单烷基酯。助剂可以是羧甲基纤维素，聚乙二醇或阿拉伯树胶。

各种制剂中有效成份的配比，可根据不同的使用目的而适当增减。一般来说，水剂、粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂的有效成份范围通常在1－30%，乳剂、胶悬剂的有效成份范围在0.2－10%，微胶囊剂在10－30%。

在实际使用中，所述农用杀虫剂在使用前可以稀释至合适的浓度，或直接使用。

此外，本发明的农用杀虫剂也可以与其它杀虫剂结合使用。

根据本发明，所述以化合物5`-epi-SPA-6952A为活性成分可以用于防治粘虫。

本发明的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastochromogenes）SSPRC-11339，由于其代谢产物具有良好的杀虫活性，且发酵的成本低，对环境友好，因而具有良好的应用前景。此外，本发明的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastochromogenes）SSPRC-11339，其代谢产物中的活性成分5`-epi-SPA-6952A是一种新的化合物，因而具有广泛的开发应用前景。

附图说明

图1为本发明的菌株SSPRC-11339基于其16srDNA序列构建的系统进化树状图，显示了菌株SSPRC-11339在系统发生中的位置。

图2为本发明的化合物5`-epi-SPA-6952A的紫外吸收图谱。

图3为本发明的化合物5`-epi-SPA-6952A的核磁共振氢谱。

图4为本发明的化合物5`-epi-SPA-6952A的多键碳氢关系(HMBC）图谱。

图5为本发明的化合物5`-epi-SPA-6952A的H-H关系(COSY）图谱。

图6为本发明的化合物5`-epi-SPA-6952A的碳谱。

保藏事项

本发明的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastochromogenes）SSPRC-11339已于2007年12月5日提交位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC）保藏，保藏号：CGMCC No.2281。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明的淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastochromogenes）SSPRC-11339及其代谢产物的杀虫活性作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

经常规方法测定，本发明的菌株SSPRC-11339的培养特性、形态特征、生理生化特征及化学分类、以及根据16srDNA进化树分析的结果如下：

1.1、培养特性

培养基	气生菌丝	基内菌丝	可溶性色素
				高氏一号合成培养基	砖灰成絮状	偏浅红	无
葡萄糖天门冬素琼脂	砖灰成絮状	白	无
				蔗糖硝酸盐琼脂	砖灰	白	无
无机盐淀粉琼脂	乌贼灰	无色	无
				燕麦粉琼脂	灰绒毛状	白	无
马铃薯浸汁琼脂	黄灰	白	无
				酵母麦芽汁浸汁琼脂	深乌贼灰	浅芒果棕	笋棕
桑塔斯琼脂	灰	白	褐黑

1.2、形态特征

培养基：    高氏

基内菌丝体：横隔 无     断裂   无      分生孢子无

气生菌丝体：分支        生长           分枝

孢子丝：    长度        松螺旋2～3环圈 顶端

孢子：      形状 长株型 表面 有凹陷

1.3、生理生化特征及化学分类

菌株SSPRC-11339的生理生化特性结果为：明胶不液化，脱脂牛奶中脱脂牛奶中轻微凝固及胨化，淀粉水解完全，H2S产生阳性，能利用的碳源为D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇、L-肌醇、L-鼠李糖、棉子糖、L-鼠李糖、蔗糖、D-果糖；不能利用纤维素、L-阿拉伯糖生理生化特性与链霉菌属接近。

1.4、16srDNA进化树分析

菌株SSPRC-11339的16srDNA核苷酸序列全长为1477bp，具体序列如SEQ ID No:1所示。

图1为基于16srDNA序列的系统发育树状图，显示了菌株SSPRC-11339在系统发生中的位置。各结点的数值(百分数）是1000次重复抽样检验的Bootsrap值。

菌株SSPRC-11339在大多数培养基上生长良好，在高氏培养基上，菌落整齐，基内菌丝体无横隔，不断裂，气生菌丝体分支，生长丰盛，呈松螺旋2～3环圈，孢子长柱形，表面有凹陷，属于链霉菌属。从系统发育树状图来看，与淀粉产色链霉菌聚为一支。经查阅伯杰氏手册，其生理生化性质与淀粉产色链霉菌接近。

根据以上形态观察以及生理生化特征，结合16srDNA进化树分析，确定菌种SSPRC-11339应属于链霉菌属Streptomyces diastochromogenes(淀粉产色链霉菌）。

实施例1、菌株11339的发酵

种子培养基：葡萄糖2%、淀粉5%、花生饼粉2%、黄豆饼粉1%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.4%、氯化钠0.2%、硫酸镁0.5%、硝酸胺0.2%、磷酸氢二钾0.05%，pH 7.2。

发酵培养基：同种子培养基。

按以上配方配制种子培养基，然后将生长于高氏斜面的菌种11399接种于配制的培养基中，在28℃下培养36～40小时，获得种子液。

取上述获得的种子液，以5～20%的比例接种于上述培养基组成的发酵培养液中，28℃通气搅拌培养90～96小时，获得发酵液。

实施例2、活性成分的提取

取实施例1获得的发酵培养液10公斤，过滤，得上清液8公斤，用盐酸酸化到PH4~5后用膜过滤处理，得10公斤料液，然后用1公斤大孔吸附树脂1300型进行吸附，以3公斤酒精水(酒精：水=1：1）(体积比）进行洗脱，洗脱液减压浓缩，得到45克褐色固体物Ⅰ，然后用400ml甲醇水(甲醇：水=90：10）(体积比）溶解，冰箱内放置过夜，得10克白色固体Ⅱ。

实施例3、活性成分的结构确定

3.1、紫外吸收图谱的测定

取实施例2获得的化合物Ⅱ0.5mg溶于50ml甲醇中，取3ml加入比色槽中，以甲醇作空白对照，在紫外全波长扫描仪(UV-2501PC，日本岛津公司）上进行测定，测定波长从400nm到200nm，得到该化合物的紫外吸收图谱(图2）。

由图2的紫外吸收图谱可见，该化合物Ⅱ在末端处有吸收。

3.2、核磁共振氢谱测定

取实施例2获得的化合物Ⅱ10mg，溶于0.5ml氘代氯仿中，以四甲基硅烷TMS为测量化学位移的基准物质，在VARIAN 500MHz核磁共振仪(VARIAN COMPANY）上进行扫描，得到该化合物核磁共振氢谱(图3）。

由图3的结果可见，该化合物的分子量为894。

3.3、核磁共振碳氢相关谱(HMQC以及COSY）测定

取实施例2获得的化合物Ⅱ10mg，溶于0.5mlDMSO中，以四甲基硅烷TMS为测量化学位移的基准物质，在VARIAN 500MHz核磁共振仪(VARIAN COMPANY）上进行扫描，得到多键碳氢关系(HMBC）(图4）和H-H关系(COSY）(图5），根据HMBC和COSY图谱，获得相应的图谱数据(表1）。

表1、¹H and¹³C NMR Data(in CD₃OD).

由表1的结果可见，符合该化合物碳-氢以及碳-碳的空间结构关系。

3.4、碳谱测定

取实施例2获得的化合物Ⅱ10mg，溶于0.5ml DMSO中，以四甲基硅烷TMS为测量化学位移的基准物质，在VARIAN 500MHz核磁共振仪(VARIAN COMPANY）上进行扫描，得到化合物Ⅱ的碳谱(图6）。

由图6的结果可见，该化合物共有49个碳。

根据以上各图谱的分析结果，可得出本发明的淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastochromogenes）SSPRC-11339的代谢产物中的活性成分(化合物Ⅱ）具有以下结构式：

该化合物与现有报道的化合物SPA-6952A(Nobuo Hosotani et al.J.Antibiot.58(6):409-411,2005）结构基本相同，不同之处在于5`位上甲基的异构化，是化合物SPA-6952A的手性异构体，命名为5`-epi-SPA-6952A，是一种新的化合物，分子式为：C₄₉H₈₃NO₁₃；分子量为894。

实施例4、化合物5`-epi-SPA-6952A制成农用杀虫剂

4.1、化合物5`-epi-SPA-6952A制成可湿性粉剂

取实施例3获得的化合物5`-epi-SPA-6952A(化合物Ⅱ）40份(重量比，下同）与2份木质素磺酸钠、4份拉开粉、2份浸润剂LS以及52份硅藻土混合均匀，粉碎，即获得100份含量为40％的可湿性粉剂。

4.2、化合物5`-epi-SPA-6952A制成乳油

取实施例3获得的化合物5`-epi-SPA-6952A(化合物Ⅱ）28份与10份乙二醇、20份二甲基甲酰胺、10份二甲苯及32份乙醇混合均匀，即获得100份含量为28％的乳油。

实施例5、化合物5`-epi-SPA-6952A的杀虫活性测定

分别取实施例1所获得的发酵液上清液、实施例2获得的化合物5`-epi-SPA-6952A(化合物Ⅱ）、实施例4制备的可湿性粉剂和乳油，稀释至表2所示的各预定浓度，同时以清水作为对照，以粘虫为对象，使用粘虫浸叶饲喂法进行测试，每个处理设置3个重复，具体如下：

剪取2×5cm的玉米叶段，将叶片在药液中浸渍10s，取出后阴干。先处理空白对照，然后按试验设计剂量从低到高的顺序重复上述操作，每处理3次重复。挑选整齐一致的二龄粘虫接种于防有玉米叶片的培养皿中，上面用两层纱布覆盖保湿。将处理后的试虫分别置于正常条件下饲养；每24h观察试虫反应情况，48h时查询试验结果。用Abbott公式(具体用Abbott公式计算校正死虫率p，其计算公式为：p=(p'-c)/(1-c)，p'为未校正死虫率，c为对照组死虫率。按国家标准GB 13917.1～13917.8-92，c不应大于20%。）计算各处理的死亡率，结果如表2所示。

表2、化合物5`-epi-SPA-6952A的杀虫活性测定

注：生测48h后进行死亡率的统计计算，活虫与死虫的鉴别以触动虫体能否正常爬行为准，非正常的即爬行不自然、半死、全死的个体均算为死亡个体。

由表2的结果可见，本发明的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastochromogenes）SSPRC-11339的发酵液以及提取的活性成分5`-epi-SPA-6952A都具有良好的杀虫活性，且生产成本低，对环境友好，因而具有良好的应用前景；加之化合物5`-epi-SPA-6952A是一种新的化合物，在现有技术中未见有报道，因此具有良好的开发应用前景。

Claims (7)

1.一种由淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastochromogenes)CGMCC No.2281发酵获得的化合物，其特征在于，所述化合物具有以下结构式：

其中，5’位上甲基的光学构型为S型。

2.如权利要求1所述的化合物的应用，其特征在于，用于制备农用杀虫剂。

3.一种农用杀虫剂，其特征在于，该农用杀虫剂以权利要求1所述的化合物为活性成分。

4.如权利要求3所述的农用杀虫剂，其特征在于，还包括一种或多种助剂。

5.如权利要求4所述的农用杀虫剂，其特征在于，所述助剂选自：分散剂、乳化剂、润湿剂、渗透剂、展着剂、粘着剂、消泡剂、发泡剂、增粘剂、稳定剂。

6.如权利要求3－5中任一项所述的农用杀虫剂，其特征在于，所述农用杀虫剂的剂型选自：乳油、水剂、粒剂、可湿性粉剂、微胶囊剂、胶悬剂、气雾剂。

7.如权利要求3－6中任一项所述的农用杀虫剂的应用，其特征在于，用于防治粘虫。