MXPA02009953A

MXPA02009953A - Derivados de acido nucleico de poliamida, agentes y metodos para su produccion.

Info

Publication number: MXPA02009953A
Application number: MXPA02009953A
Authority: MX
Inventors: Gerhard Breipohl
Original assignee: Aventis Pharma Gmbh
Priority date: 2000-04-18
Filing date: 2001-04-07
Publication date: 2003-02-12
Also published as: WO2001079216A3; US7897346B2; CA2406169C; DE50111371D1; WO2001079216A2; NO20024959L; KR20030036166A; ZA200208344B; DK1276760T3; US20020187473A1; AR032153A1; US6905820B2; JP2004501211A; NO333193B1; JP4908714B2; ES2275677T3; US20080070258A1; KR100842723B1; US20100022016A1; US20050009073A1

Abstract

La invencion se refiere a derivados de PNA que llevan uno o varios grupos fosforilo en la terminal C o bien en las terminales C y N de la estructura de PNA, dichos grupos fosforilo llevan opcionalmente uno o varios grupos marcadores o bien grupos para reticulacion o bien grupos que promueven la absorcion intracelular o bien grupos que mejoran la afinidad de enlace del derivado de PNA con acidos nucleicos. La invencion se refiere tambien a un metodo para la produccion de los derivados de PNA antes mencionados y al uso de los mismos como farmaco o agentes de diagnostico.

Description

DERIVADOS DE ÁCIDO NUCLEICO DE POLIAMIDA, AGENTES Y MÉTODOS PARA SU PRODUCCIÓN La presente invención se refiere a cerivados de ácido nucleico de poiiamida (PNA) foeforilados carboxi terminalmente y carboxi/amino terminal-aente que tienen propiedades mejoradas, a su uso y a agentes y procesos para su preparación. Los ácidos nucleicos de poliamida, que se conocen también como ácidos nucleicos peptídicos (PNA) se unen a secuencias blanco complementarias (ADN o ARN) con una afinidad mayor que los oligonucleótidos naturales y, además, tiene una ventaja, en comparación con el ADN natural, que son muy estables en suero. Los PNA fueron originalmente descritos como análogos de ácido nucleico no naturales en les cuales toda la estructura de azúcar-fosfato está reemplazada con unidades de N- (2-aptinoetil) glicina (M. Eghol y eclaboradores (1991) Science 254, 1497-1500; WO 92/20702; M. Egholm y colaboradores Nature (1993) 365, 566-568; P. Nielsen, (1994) Bioconjugate Chem. 5, 3-7; E. Uhlmann y colaboradores (1998) Angewandte Chemie Int. Ed. Engl. 37, 2796-2823) . Las bases empleadas son las nucleobases que ocurren naturalmente y son habituales en la química de los nucleótidos o bien núcleo bases que no ocurren naturalmente, o bien sus formas de profármaco, es decir precursores que son convertidos en la base libre por biotransformación en el cuerpo. Además, se ha descrito PNAs en ios cuales no todas ias posiciones en la estructura llevan residuos de bases .Greiner y colaboradores (1999) Helv. Chim Acta 82, 2151), y en los cuales la aminoetilglicina está reemplazada por unidades más complejas (Uhlmann y colaboradores (1998) Angewandte Chem. Int. Ed. 37, 2796; Falkiewicz (1999) Biochim. Pol., 46, 509-529). El hecho que la estructura de PNA no tenga ninguna carga neta es una característica de esta clase de sustancias y tiene consecuencias de largo alcance. El hecho que PNA se una a ARN y ADN complementario aún en concentración salina baja (por ejemplo, Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications [Ácidos Nucleicos Peptídicos: Protocolos y Aplicación]; Peter E. Nielsen y Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999, 3) , con las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick cumpliéndose, se asigna al carácter neutral del PNA y a la disminución de repulsa de carga asociada con esta situación. Por esta razón, se puede utilizar PNA, en principio, en varias aplicaciones en las cuales oligonucleótidos naturales o derivados de oligonucleótidos se emplearían de otra forma. Sin embargo, además de esto, debido a las propiedades de enlace únicas, un gran número de aplicaciones que son posibles con oligonucleótidos naturales se permiten también (véase, por ejemplo: Péptide Nucleico Acids: Protocols and Applications [Ácidos Nucleicos Peptídicos: Protocolos y Aplicaciones]; Peter E. Nielsen y Michael Egholm (Edit.) Horizon ?cientific Press, 1999). Por ejemplo, una invasión de cadena del ADN de cadena doble ha sido observada cuando se utiliza PNA. Ejemplos típicos de aplicaciones para PNA incluyen su uso para inhibir la expresión génica mediante enlace, en ferina específica para secuencia, ccr- ADN o ARN celular. Los "Agentes de Antisentido" sen derivades de ácido nucleic-; de una sola cadena, cortos, que se unen, a travée de apareamiento de base de Watson-riek a un ARNm complementario cuya traducción en la proteir-a correspondiente debe ser inhibida (Uhlmann y Peyman ',199 ; Che~ J Rev. 90, 543; Larsen y colaboradores (1999) Biochem. 3iophys. Acta 1489, 159). Los "Agentes Anti-gen" se unen, a través del apareamiento de bases de Hoogsteen, en la hendidura mayor de la doble hélice de AD? con formación de una triple hélice, io que resulta en la inhibición de la transcripción de los genes de manera específica para secuencia (Praseuth y .colaboradores (1999) Biochem. Biophys. Acta 1489, 181). La expresión de gen puede ser también inhibida específicamente por lo que se ccr.oce oligómero señuelo, que imitan las regiones para unión de factores de transcripción. Mediante el tratamiento con agentes señuelo, factores de transcripción particulares pueden ser capturados de manera específica para secuencia y se puede evitar de esta forma la activación de la transcripción (Mischiati y colaboradores (1999) j. Eiol.

Chem. 274, 33114) . Otro grupo de derivados de oligonucleótidos que actúan de manera intracelular, es decir, los quimeraplastos, se utilizan para reducción específica de genes 'Cole-Strauss y colaboradores (1996) Science 273, 1336-1369) . Los PNAs pueden por consiguiente, utilizarse como agentes farmacéuticos y/o de diagnóstico o bien para la producción de agentes farmacéuticos y/o de diagnóstico. Por ejemplo, después de haber sido marcado con biotina, fluoresceína o bien otros marcadores, el PNA puede utilizarse, para propósitos de diagnóstico y en biología molecular, como una sonda de hibridación específica, } . A la fecha se han descrito cuatro métodos en la literatura para la introducción de los grupos marcadores (Oerum y colaboradores (1999), en Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications [Ácidos Nucleicos Peptidicos: Protocolos y Aplicaciones , páginas 81-86; Lohse y colaboradores (1997) Bioconjugate Chem. 8, 503) . El primer método se basa en el marcado del PNA libre (desprotegido) después que ha sido sintetizado en solución. En este método, la terminal amino del P?A reacciona con un ácido carboxílico activado o un isotiocianato. Sin embargo, residuos de lisina adicionales son frecuentemente introducidos en el P?A y estos residuos reaccionan después con isotiocianato de fluoresceína (FITC) . En el segundo método, el P?A desprotegido es modificado en su terminal amino con derivados de ácido carboxílico activado o isotiocianatos mientras se encuentra todavía en fase sólida . Este método es adecuado solamente para marcar grupos que son estables en las condiciones vigentes durante la desprotección del PNA y durante su disociación del soporte . Los reactivos que se utilizan de preferencia en ambos casos son isotiocianatos (P . Wittung y colaboradores, ( 1995) FEBS Lett . 375, 27) así como ácidos carboxílicos activados tales como esteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) (Oerum y colaboradores, 1999) . ".J.a desventaj a de la reac i -.r. que utiliza los derivados de NHS es que se logra frecuentemente solamente con rendimientos bajos . Por esta razón, el ácido 8-amino-3, 6-dioxaoctanoico es frecuentemente condensado, co o enlazador o espaciador, entre el PNA y el grupo marcador (Oerum y colaboradores 1999) . Ambos enlaces se efectúan a través de enlaces amida o enlaces tiourea, que, como tales, sin embargo, presentan una mayor probabilidad de llevar a la insolubilidad. Alternativamente, los ácidos carboxílico reaccionan con activadores habituales en la química de los péptidos, tales como BUT, TBTU o HATU.

En el tercer método, monómeros configurados con fluoresceína se utilizan durante la síntesis de PNA en la fase sólida, con el marcado con fluorescencia efectuándose a través de un enlace amida (Lohse y colaboradores (1997) Bioconjugate Chem. 8, 503), lo que provoca otra vez la formación de conjugados relativamente difíciles de disolver. Un cuarto método utiliza conjugados peptídicos de PNA en donde la porción péptido forma un sustrato para una proteína quinasa (Koch y colaboradores (1995) Tetrahedron Lett. 36, 6933) . En esta forma, por consiguiente, no es la porción PNA que es modificada; al contrario, el residuo de serina en el segmento peptídico es fosforilado enzí icamente. Cuando se utiliza este método, por consiguiente, es solamente posible introducir fosfato radioactivo y no, por ej empio, fluoresceína o biotina, en el segmento peptídico del conjugado de PNA-péptido . Porción de péptido Se sabe que PNA tiende agregarse en solución acuosa, es decir en condiciones fisiológicas también. Por consiguiente el PNA es poco soluble en amortiguador acuoso y por consiguiente no está disponible para hibridación cen secuencias complementarias. Además, el PNA tiene una alta afinidad por varios materiales tales como Sephadex® (de Fhamacia) . Bond Elut© (de Varían) o bien varios materiales para crematografía HPLC que se utilizan en ia purificación de oiigóir.eros, io que significa que PNA puede ser aislado frecuentemente solamente con rendimientos bajos. Per consiguiente es necesario conjugar PNA con lisina u otros aminoácidos cargados positivamente (a través de la terminal C) (Egholm y colaboradores (1992) J. Ahem. Soc. 114, 1895; . Secuencias de PNA ricas en guanina tienen una tendencia muy particular a agregarse, y por estas razones el consejo es no utilizar tales P?A (véase "Lineamientos para diseño de secuencias de oligómeros de P?A" en Peptide ?ucleic Acids: Protocols and Applications [Ácidos Nucleicos Peptídicos: Protocolos y Aplicaciones] (1999) páginas 253-255) . Por ejemplo, oligómeros de PNA etiquetados con fluoresceína relativamente largos son especialmente difíciles de disolver, con la recomendación de adición de un solvente orgánico y calentamiento a una temperatura de 50°C. Es particularmente purificar los derivados de PNA iipofílicos poco solubles. Varios picos que se deben a agregados de PNA son frecuentemente detectados en HPLC. La eécnica de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAA , que es frecuentemente empleada para purificar y separar ácidos nucleicos, no puede ser utilizada para estos derivades de PNA. En los métodos de derivación de PNA que se describen arriba, el grupo marcador es siempre introducido mediante la formación de un enlace amida o un enlace tioamida, ccr- los derivados de PNA formados que son relativamente difíciles de disolver. Derivados de PNA poce solubles se formar-, en particular, cuando residuos lipofílicos, tales como fluoresceína, son introducidos. La inserción de marcadores en los dos extremos de PNA es técnicamente todavía más difícil y provoca generalmente una solubilidad todavía menor. Además, no se ha descrito ningún método eficiente para derivar simultáneamente PNA en las terminales amino y carboxi, en particular a través de síntesis de fase sólida. Además, puesto que las reacciones de etiquetado se efectúan frecuentemente con rendimientos bajos, un objeto a lograr consiste en proporcionar derivados novedosos de PNA que podrían ser preparados con altos rendimientos, que podrían presentar propiedades provechosas, como por ejemplo solubilidad mejorada, comportamiento de enlace mejorado y mejor absorción celular y que, además, hacen posible utilizar métodos eficientes para purificar los oligómeros de PNA. Según la presente invención, este objeto se logra proporcionando derivados de PNA que llevan uno o varios radicales fosforilo en la terminal C o bien en las terminales C y N de la estructura de PNA cen inclusión también de radicales tiofosforilo e iminofosforilo además de radicales oxofosforilo, y con por lo menoe uno de los radicales fosforilos llevando uno o varios grupos desprotomatables, de preferencia grupos hidroxiio o grupos mercapto. Los radicales fosforilo están unidos a la estructura de PNA a través de un enlace de oxígeno-fósforo, enlace de azufre-fósforo o e lace de nitrógeno-fósforo, ya sea directai-ente o bien a través de un espaciador, siendo posible que ei_espaciador sea, por ejemplo, una alcanoilamida, una poli (alcoxi) carboxamida o un aminoácido. Ejemplos de radicales fosforilo son fosfato, fosfonato, tiofosfato, fosfoamidato y radicales fosforilo sustituidos, con los radicales fosforilo sustituidos llevando, en caso apropiado, uno o varios grupos marcadores, o bien grupos para articulación, o bien grupos que promueven la absorción intracelular, o bien grupos que incrementan la afinidad de enlace del derivado de PNA para los ácidos nucleicos . En cuanto a este aspecto, grupos marcadores (etiquetas« se entienden como grupos que permiten que la actividad química o biológica de los derivados PNA sea evaluada cuantitativa o cualitativamente, por ejemplo, biotina o fluoresceína. La reticulación se entiende como la formación de enlaces intramoleculares o intermoleculares entre funcionalidades espacialmente adyacentes. Un ejemplo de grupo para reticulación es el grupo psoraleno. La invención se refiere de preferencia a derivados de PNA de la fórmula I Terminal Ñ Terminal C I 'I Fórmula I en donde q es 0 o bien 1, D' es hidroxilo, mercapto, amino, alquilamino o acilamino, de preferencia acetilamino, 15 V es, independientemente entre ellos, oxígeno, azufre, NRi, V es, independientemente entre ellos, oxígeno, azufre, NR:, un grupo U- (CR3R4)U'-C(0) -NH o un grupo U- (CH:CH20) U»-CH2-C (0) - NH, U es, independientemente entre ellos, oxígeno, azufre o NH, 0 u' es, independientemente entre ellos, de 1 a 10, de preferencia de 1 a 4, especialmente 1, y W son, independientemente entre ellos, oxígeno, azufre o NR:, Y y Y' son, independientemente entre ellos, hidroxilo, 25 mercapto, oxianión, tioato o NR:R2, X y X' son, independientemente entre ellos, un grupo U- ( alcandiilo C_-C22-)-U o bien un grupo U- (CH;CH_-0) u , o bien un grupo marcador o un grupo para reticulación, o bien un grupo que promueve ía absorción intraceiular, o bien un grupo que incrementa la afinidad de enlace del derivado de PNA por ácidos nucleicos, por ejemplo, una fluoresceína bifuncional, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofer.ilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina, Dabcyl, Edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G o bien radical digoxigenina, Z y Z' son, independientemente entre ellos, hidroxilo, mercapto, oxianión, tioato o bien NRjR-, alquilo C:-C22, arilalquilo Ci-Ca, alquilo C?-C22-U, arilalquilo C?-C--U, hidroxi-UCi-Cls, aminoalquilo-U o bien mercaptoalquilo-U, 0 bien un grupo de la fórmula R7 (CHCH?-0)r, en donde R- es hidroxilo, amino o bien alcoxi Ci-C—, y m es de 1 a 100, de preferencia de 2 a 10, o bien son un grupo marcador, o bien un grupo para reticulación, o bien un grupo que promueve la absorción intracelular, o bien un grupo que incrementa la afinidad de enlace del derivado de PNA por ácidos nucleicos, por ejemplo, una fluoresceína monofuncional o bifuncional, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina, Dabcyl, Edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G o bien radical digoxigenina, Ri y R_ son, independientemente entre ellos, un radical que consiste de hidrógeno o alquilo C:~C=, de preferencia hidrógeno, R3 y R son, independientemente entre ellos, un radical que consiste de hidrógeno o alquilo d-Cs, o bien el radical de una cadena lateral de aminoácidos, de preferencia hidrógeno, siendo posible que radicales adyacentes R3 y R en V formen también un anillo cicloalquilo C.-C;, n es de 0 a 10, de preferencia c . a 3, m es de 0 a 10, de preferencia de 0 a 3, a condición que por lo menos un radical Y, Y' o Z, Z' sea hidroxilo, mercapto, oxianión o tioato. El grupo {POLI} se describe a través de la fórmula II.

{BLOQUE} {BLOQUE}—G- Fórmula II en donde {BLOQUE} es, independientemente entre ellos, un grupo seleccionado a partir de la fórmula IIIA, Fórmula I I LA o bien a partir de la fórmula IIIB (Greiner y colaboradores (1999) Helv. Chim. Acta 82, 2151), Fórmula IIIB o bien a partir de las fórmulas IV A a IV G (Uhlmann y colaboradores (1998) Angewandte Chem. Int. Ed. 37, 2796; Falkiewicz (1999; Biochim. Pol., 46, 509-529), Fórmula IV A Fórmula IV B Fórmula IV C Fórmula IV D Fórmula IV E Fórmula IV F Fórmula IV G en donde cada {BLOQUE} de construcción puede ser diferente, y en donde se aplica además que Z" es de 0 a 100, de preferencia de 1 a 20, especialmente de i'. 4 a 15, G se selecciona dentro de los grupos (CR5R6)U'/ C (0)NH- (CR:R;) z - o C(0)NH- (CH2CH20)U'-CH2CH2, en donde u' tiene el significado indicado arriba y t' es de 2 a 10, de preferencia 6, A es, independientemente entre ellos, un grupo (CR:R;)S. en 15 donde s de 1 a 3, de preferencia 1, B es, independientemente entre ellos, ya sea un radical aromático que puede poseer también un carácter heteroaromático, o bien hidrógeno, o bien hidroxilo o bien alquilo Ci-Cie, 20 O bien una nucleobase que ocurre naturalmente, y es habitual en la química de los nucleótidos, o bien que no ocurre naturalmente, o bien su forma de profármaco, a condición que por lo menos un radical B sea una nucleobase, D es, independientemente entre ellos, un grupo (CR3R4).;< en 25 donde t es de 2 a 10, de preferencia de 2 a 4, especialmente 2, E es, independientemente entre ellos, un grupo :CR;R ).-,en donde los radicales Rz y R,- adyacentes pueden formar también un anillo cicloalquilo - a Ca o bien un compuesto espiro, R y R son, independientemente entre ellos, un radical que consiste de hidrógeno o alquilo C?-Cd, o bien el radical de una cadena lateral de aminoácidos, de preferencia hidrógeno, y en donde u' , R:, R, R3 y R4 tienen los mismos significados que los descritos arriba, asi como sales fisiológicamente toleradas de los derivados de PNA de la fórmula I. Sales fisiológicamente toleradas se describen, inter alia, en Regmingtons Pharmaceutical Science (1985) Mack Publishing Company, Easton, PA, Estados Unidos de América, página 1418. [Se da preferencia a sales de amonio, sales de trialquilamonio, sales de metales alcalinos (como por ejemplo sales de sodio y sales de potasio) y sales de metales alcalinos térreos (tales como sales de magnesio y sales de calcio) . Se da preferencia particular a sales de sodio. Un efecto positivo sorprendente que fue encontrado fue que la introducción de un radical fosforilo, por ejemplo, como fosfato o bien en forma de una derivación lipofílica (por ejemplo, como fosfodiéster de hexadecilo) incrementa la afinidad del PNA por AR? o AD? complementario. Este efecto fue inesperado puesto que el fuerte enlace de P?A con ARN o ADN complementario fue atribuido al carácter neutral del PNA y a la repulsión de carga reducida asociada con esta situación (por ejemplo, Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications [Ácidos Nucleicos Peptídicos: Protocolos y Aplicaciones]; Peter E. Nielsen y Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999, 3) . La biotina fue introducida de manera particularmente eficiente a través de un radical fosforilo. Cuando se utilizó como sondas de hibridación, el PNA biotinilado de la fórmula I (X, X', Z y/o Z ' = radical biotina; presentó mejores propiedades de enlace y menos efectos de fondo no específicos, estudios que las sondas de ADN biotiniladas correspondientes . En contraste con el PNA sin carga, los derivados de PNA de la fórmula I según la presente invención pueden también migrar en un campo eléctrico, haciendo posible de esta forma su micro localización y concentración en derivados de ácido nucleico complementarios inmovilizados. En el caso de oligonucleótidos polianiónicos este método que utiliza el campo eléctrico ya ha sido descrito para determinar rápidamente faltas de correspondencia entre bases (Sosnowski y colaboradores (1997) Proc. Nati. Acad. Si. U.S.A. 94, 1119) . Los substituyentes hidroxi o mercapto de los radicales fosforilo de los derivados de ADN de conformidad con la presente invención pueden ser desprcroñados en un rango de pH de 4.5 a 14, de preferencia de 6.5 a 12, de manera particularmente preferida de 6.5 a 9. La propiedad de capacidad de ionización de les radicales fosforilo puede ser explotada de manera provechosa para purificar los compuestos de la fórmula I. Por un lado, los compuestos de la fórmula I pueden ser purificados por electroferesis, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilanida. Por otra parte, es también posible purificarlos utilizando ir.tercambiadores de aniones. En este caso, los productos deseados son de preferencia eluidos mediante la utilización de un gradiente de sal, por ejemplo, un gradiente de cloruro de sodio, o un gradiente de pH. Los derivados del PNA de la fórmula I según la invención pueden ser purificados de manera particularmente simple y eficiente utilizando intercambiadores de aniones. Se encontró que los subproductos sin carga _ no son retardados en el intercambiador de anión mientras . que los productos con carga se adhieren a la columna. Después de lavar con agua, fue posible aislar el producto deseado en forma pura empleando una solución de cloruro de sodio o ácido acético. Los intercambiadores de aniones empleados son de preferencia intercambiadores de aniones fuertes o bien fases de modo mixto, por ejemplo ©Oasis MAX (Waters Gir-bH, Eschborn) . Se encontró además que los compuestos de la fórmula I según la presente invención en general sor- más fácilmente solubles en medio acuoso que los oligómeros de PNA correspondientes que no poseen el radical fosforilo. Esto es muy aparente en for-r.a de una solubilidad bastante mejorada en medio acuoso, en el caso de derivados lipofílicos, como por ejemplo los derivados de fluoresceína o los derivados de hexadecilo. La invención se refiere, en particular, a derivados de PNA en donde A y E son CH_. La invención se refiere además, particularmente, a derivados de PNA en los cuales sustituyentes D son (CHJ . Se da también preferencia a derivados de PNA de la fórmula I en donde W y W' son oxo, además a "derivados en los cuales Y y Y' son hidroxilo u oxianión, y a derivados en los cuales V y V son oxi. Ejemplos de bases naturales son adenina, citocina, 5- etilcitosina, guanina, timina y uracilo. Ejemplos de bases no naturales son purina, 2, 6-diaminopurina, N4N4-etanocitosina, N6N6-etano-2, 6-diaminopurina, 5-alquiniluracilo C3-C5) , 5-alquinilcitosina (C3-C6) , 5-(l-propargila ino) uracilo, 5- ( 1-propargilamino) citocina, fenoxazina, 9-aminoetoxifenoxazina, 5-fluorouracilo o bien pseudoisocitosina, 5- (hidroximetil) uracilo, 5-aminouracilo, pseudouracilo, dihidrouracilo, 5-alquiluracilo (C?-C6) , 5-alquilcitosina (Ci-Ce) , 5-alquenileitosina (C2-C6) , 5-fluorocitosina, 5-clorouracilo, 5-clorocitosina, 5-bromouracilo, 5-bromocitosina, 7-deazaadenina, 7-deazaguanina, 8-azapurina, y purinas -deaza-7-sustituidas.

En el caso de derivados de PNA que llevan solamente un radical fosforilo en la terminal C (y para los cuales q es 0) , la terminal N puede estar enlazada a una secuencia de péptidos. Secuencias de péptidos adecuadas son de preferencia las secuencias que optimizan la distribución en los órganos o la localización celular del PNA, como por ejemplo transportano, factor de crecimiento de tipo insulina, señales de localización nuclear o bien otras secuencias portadoras (Larsen y colaboradores (1999) Biochim. Biophys. Acta 159-166) . En péptido puede también utilizarse como una etiqueta de afinidad, como por ejemplo una cadena (His)6. La presente invención permite que los radicales X, X', Z y Z' sean variados ampliamente (Ejemplos se proporcionan en las Figuras la, lb, 2a, 2b, 3a y 3b) y por consiguiente hacer posible introducir diferentes características funcionales especificas en el PNA. Una modalidad preferida de Z o Z' es un radical alquilo Ci a C22. Se prefieren también radicales alcoxi Ci a C22, en particular radicales alcoxi Cíe. Otros radicales preferidos son radicales hidroxí (alcoxi C?-C?8) , en particular HO(CH2)3-?20. Se prefieren también radicales aminoalcoxi, en particular radicales 6-aminohexoxi y 5-aminopentoxi . Se da también preferencia a radicales de la fórmula R7 (CHCH2-0)m, en donde R7 es hidroxilo, amino o alcoxi C?-C22, de preferencia sin embargo hidroxilo y m es de 0 a 100, de preferencia de 2 a 10. Se da preferencia particular a HO (CH;CH--0) ;, HO (CH_CH_-0) 6 Y H_N- (CHiCH—O) . Otros ejemplos preferidos de Z o Z' incluyen radicales ercaptoalcoxi, en particular 6-mercaptohexiloxi . En otra modalidad preferida, Z e Z' comprende un grupo fluorescente, como por ejemplo flucresceína, rodamina, TAMRA o un colorante de cianina. Grupos fluorescentes preferidos pueden encontrarse en las Figuras la a 3b. Se da preferencia muy particular a Z siendo biotina. Otros grupos preferidos para Z incluyen Dabcyl, psoraleno, acridina, DNP y colesterol (Figuras lb y 2b), radicales BODIPY, ROX o bien R6G (Su-Chun Hung y colaboradores (1998) Analytical Biochemistry 255, 32- 38) y digoxigenina (Tarrason y colaboradores, Methods in Enzymology (1999) [Métodos en Enzimología (1999)] Vol. 313, 257-268) . Además de esto, Z o Z' pude ser un grupo que consiste de un radical monofuncional o bifuncional de fluoresceina, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina, Dabcyl, Edans, lexitropsina o psoraleno. Grupos de extremo monofuncionales se presentan en una lista a titulo de ejemplo en las Figuras la, lb, 2a y 3a, mientras que grupos de puente bifuncionales se presentan en lista en las Figuras 2b y 3b. En otra modalidad preferida n y/o m, independientemente entre ellos, son 0, es decir, la porción PNA lleva en cada caso solamente un radical fosforilo en la terminal N y/o en la terminal C. Una modalidad preferida de X o X' es U- (alcandiilo C2-C22,-U. En particular 0- (alcandiilc C2-C2Z) -0, de manera especialmente preferida 0-(CH2)^--0. Otra modalidad preferida de X o X' es un grupo de la fórmula U- (CH;CH;-0) > , en donde u' es de 1 a 10, de preferencia de 1 a 6, y en donde U es de preferencia oxi. En una modalidad preferida adicional, X c X' comprende un grupo fluorescente, per ejemplo fluoresceína, rodamina, TAMRA, o un colorante de cianina, por ejemplo Cy3© (de Amersham Pharmacia Biotech) . Grupos bifuncionales preferidos pueden encontrarse en lae Figuras 2a y 3a. Se da preferencia muy particular también al caso en el cual X o X' es biotina. Otros grupos preferidos son radicales Dabcyl, psoraleno, acridina, DNP, colesterol, BODIPY, lexitropsina, digoxigenina, ROX y R6G. Los radicales diferentes para X, X', Z y Z' en la fórmula I pueden cumplir • funciones diferentes. Los radicales de fluoresceína tienen aplicaciones de largo alcance en el secuenciamiento de ADN y amplificación de señal o bien como marcadores para determinar la absorción celular de PNA. Los radicales de colorante de cianina (Cy3® y Cy5@) proporcionan una señal de fluorescencia sustancialmente más intensa y de mayor duración que la fluoresceína misma. El radical de psoraleno es empleado para reticulación con ácidos nucleicos complementarios. El radical acridina es ur- mtercalador efectivo y puede por consiguiente incrementar la afinidad de enlace del PNA. Los derivados e biotina, aeridir- y psoralenc pueden también utilizarse para experimentes de antisentido. Además, derivados de hexadeciloxi y cclesteroi peden utilizarse para incrementar la capacidad del PNA para atravesar membranas. Compuestos marcados ccr- DNP de la fórmula I pueden ser detectados empleando anticuerpos anti-DNP. Radicales aminoalcoxi peden ser utilizados para acoplamiento con otros grupos, por ejemplo lexitropsina (véase Ejemplo 17; PNA-16) . De manera sir- Jar, grupos mercaptoalcoxi pueden ser utilizados también para derivación adicional . La invención se refiere además al uso de les derivados de PNA de la fórmula I como agentes farmacéuticos, estos agentes farmacéuticos pueden ser utilizados para prevenir y/o tratar enfermedades acompañadas o expresión o sobre-expresión de genes particulares. La invención se refiere adepás al uso de derivados de PNA como agentes de diagnóstico. Estos agentes de diagnóstico pueden ser utilizadas para diagnosticar las enfermedades mencionadas arriba en una etapa tepprana. Cuando se emplean como agentes farmacéuticos o agentes de diagnóstico, los derivados de PNA de la fórmula I pueden ser utilizados como agentes de antisentido, agenees anti-gen, agentes señuelo, y agentes quimeraplasto, según su secuencia.

Los derivadoe de PNA de conformidad con la presente invención se emplean, en particular, para producir agentes farmacéuticos para el tratamiento de enfermedades er- las cuales genes definidos son la causa o participan como resultado de su sobre-expresión. Estos agentes farmacéuticos pueden ser utilizados, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades provocadas por virus, por ejemplo por virus de CMV, VIH, HSV-1, HSV-2, influenza, VSV, hepatitis B o papiloma con la secuencia viral correspondiente siendo el blanco. Derivados de PNA de antisentido de conformidad cen la presente invención que son activos contra estos blancos tienen por ejemplo las siguientes secuencias de bases. a) contra CMV, por ejemplo SEQ ID NO. 1 5' -GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3' b) contra VIH, por ejemplo SEQ ID NO. 2 5'-ACACCCAATTCTGAAAATGG-3' SEQ ID NO. 3 5'-AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3' c) contra HSV-1, por ejemplo SEQ ID NO. 4 5' -GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3' Tales agentes farmacéuticos son también adecuados, por ejemplo para tratar cáncer. En cuando a este aspecto, es posible de preferencia utilizar secuencias enfocadas contra blancos responsables de la carcinogénesis o del crecimiento de un cáncer, en particular mediante la inhibición de la telo-rerasa (E. Matthes y colaboradores. (1999) Nucleic Acids Res. 27, 1152) . Blancos adicionales de esta naturaleza son: 1) Oncoproteínas nucleares, ccr.e por ejemplo c-myc, N-myc, c-myfc, c-fos, c-fos/jun, PCNA, p!20. 2) Dncoproteínas citoplás icas/asociadas con membrana, co o por ejemplo EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl, c-ete, 3) Receptores de células, por ejemplo receptores de EGF, Her-2, c-erbA, receptor de VEGF (KDR-1), receptores de retipoide, subunidad reguladora de proteína quinasa, c-fms, Tie-2, c-raf-1 quinasa, PKC-alfa, y proteína quinasa A (Rl alfa) . 4) Citocinas, factores de crecimiento y matriz extracelular, por ejemplo CSF-1, IL-6, IL-la, IL-lb, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, mieloblastina y fibronectina.

Derivados de PNA de antisentido que son activos contra tales blancos tienen, por ejemplo, las siguientes secuencias de bases: a) contra c-Ha-ras, por ejemplo SEQ ID NO. 5 5' -CAGCTGCAACCCAGC-3'-SEQ ID NO. 6 5'-TATTCCGTCAT-3' SEQ ID NO. 7 5'-TTCCGTCATCGCTCCTCAGGGG-3' b) bFGF, por ejemplo SEQ ID NO. 8 5'-GGCTGCCATGGTCCC-3' c) c-myc, por ejemplo SEQ ID NO. 9 5'-GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC-3' SEQ ID NO. 10 5'-AACGTTGAGGGGCAT-3' d) c-myb, por ejemplo SEQ ID NO. 11 5'-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3' . e) c-fos, por ejemplo SEQ ID NO. 12 5' -CGAGAACATCATCGTGG-3' SEQ ID NO. 13 5' -GGAGAACATCATGGTCGAAAG-3' SEQ ID NO. 14 5' -CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3' SEQ ID NO. 15 5' -GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3' f) pl20, por ejemplo SEQ ID NO. 16 5' -CACCCGCCTTGCCTCCCAC-3' g) receptor de EGF, por ejemplo SEQ ID NO. 17 5' -GGGACTCCGGCGCAGCGC-3' SEQ ID NO. 18 5' -GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-3' h) supresor de tumor p53, por ejemplo SEQ ID NO. 19 5' -GGGAAGGAGGAGGATGAGG-3' SEQ ID NO. 20 5' -GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG-3' i) bcl-2, por ejemplo SEQ ID NO. 21 5' -TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3' k) VEGT, por ejemplo SEQ ID NO. 22 5' -GCGCTGATAGACATCCATG-3' SEQ ID NO. 23 5' -GGAGGCCCGACC-3' SEQ ID NO. 24 5' -GGTTTCGGAGGC-3' SEQ ID NO. 25 5' -TGGTGGAGGTAG-3' S SEEQQ IIDD NNOO.. 2266 5' -GCATGGTGGAGG-3' SEQ ID NO. 27 5' -TTGGCATGGTGG-3' SEQ ID NO. 28 5' -GCCTGGGACCAC-3' SEQ ID NO. 29 5' -CAGCCTGGGACC-3' SEQ ID NO. 30 5' - GCAGCCTGGGA-3' SEQ ID NO. 31 5' -GTGCAGCCTGGG-3' SEQ ID NO. 32 5' -GGTGCAGCCTGG-3' SEQ ID NO. 33 5' -ATGGGTGCAGCC-3' SEQ ID NO. 34 5' -GGCTTGAAGATG-3' SEQ ID NO. 35 5' -GCAGCCCCCGCA-3' SEQ ID NO. 36 5' -GCAGCAGCCCCC-3' 1) c-raf quinasa, por ejemplo SEQ ID NO. 37 5' -TCCCGCCTGTGACATGCATT-3' m) PKC-alfa, por ejemplo SEQ ID NO. 38 5' -GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3' n) proteína quinasa A, por ejemplo SEQ ID NO. 39 5' -GCGTGCCTCCTCACTGGC-3' Agentes farmacéuticos que comprenden derivados de PNA de la fórmula I son también adecuados, por ejemplo para el tratamiento de enfermedades efectuadas por integrinas o receptores de adhesión célula-célula, por ejemplo por VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM o ELAM. Derivados de PNA de antisentido que son activos contra tales blancos tienen, por ejemplo, las siguientes secuencias de bases : a) VLA-4, por ejemplo SEQ ID NO. 40 5' -GCAGTAAGCATCCATATC-3' b) ICAM-1, por ejemplo SEQ ID NO. 41 5' -GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3' SEQ ID NO. 42 5' -CCCCCACCACTTCCCCTCIC-3' SEQ ID NO. 43 5' -CTCCCCCACCACTTCCCCTC-3' SEQ ID NO. 44 5' -GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3' c) ELAM-1, por ejemplo SEQ ID NO. 45 5' -ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-3' SEQ ID NO. 46 5' -CAATCAATGACTTCAAGAGTTC-3' d) Integrina alfa(V), por ejemplo SEQ ID NO. 47 5' -GCGGCGGAAAAGCCATCG-3' Agentes farmacéuticos que comprenden derivados de la PNA de la fórmula I son también adecuados, por ejemplo, para prevenir la restenosis. En cuanto a este aspecto, es posible utilizar secuencias de PNA enfocadas contra blancos responsables de la proliferación o migración. Ejemplos de tales blancos son: 1) Proteínas y ciclinas de transactivación nuclear, por ejemplo c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, ciclinas y cdc2 quinasa. 2) Mitógenos o factores de crecimiento, por ejemplo PEGF, bFGF, VEGF, EGF, HB-EGF y TGF-ß. 3) Receptores de células, por ejemplo receptor de bFGF, receptor de EGF, y receptor de PDGF. Derivados de PNA de antisentido que son activos contra tales blancos tienen, por ejemplo, las siguientes secuencias de bases : a) c-myb, por ejemplo SEQ ID NO. 48 5' -GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3' b) c-myc, por ejemplo SEQ ID NO. 49 5' -CACGTTGAGGGGCAT-3' c) cdc2 quinasa, por ejemplo SEQ ID NO. 50 5' -GTCTTCCATAGTTACTCA-3' d) PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes de ratas), por ejemplo SEQ ID NO. 51 5' -GATCAGGCGTGCCTCAAA-3' Derivados de PNA pueden también utilizarse para el tratamiento del vitíligo y otras enfermedades de despigmentación o trastornos de despigmentación (por ejemplo de la piel, de cabello y de los ojos), como por ejemplo albinismo y psoriasis, o para el tratamiento del asma, con expresión del receptor de adenosina Al, receptor de adenosina A3 o receptor de bradiquinina, o bien de IL-13 inhibida a través del uso de agentes de antisentido adecuados. Un ejemplo de una secuencia de bases de este tipo es: SEQ ID NO. 52 5' -GATGGAGGGCGGCATGGCGGG-3' Agentes farmacéuticos que comprenden un derivado de PNA de la fórmula I pueden emplearse, por ejemplo, en forma de preparaciones farmacéuticas que pueden ser administradas oralmente, por ejemplo, en forma de tabletas, tabletas revestidas, cápsulas de gelatina dura o blanda, soluciones, emulsiones o suspensiones. Pueden también ser administrados rectalmente, por ejemplo, en forma de supositorios, o bien parenteralrr.ente, por ejemplo en forma ce soluciones para inyección. Cen el objeto de producir preparaciones farmacéuticas, estos compuestos pueden ser procesados en excipientes orgánicos e inorgánicos terapéuticamente inertes. Ejemplos de tales excipientes para tabletas, tabletas revestidas y cápsulas de gelatina dura s n lactosa, almidón de maíz c bien derivados de los mismos, sebo y ácido esteárico o sales de los mismos. Excipientes adecuados para la preparación de soluciones son agua, polioles, sucrosa, azúcar invertida y glucosa. Excipientes adecuados para soluciones para inyección son agua, alcoholes, polioles, gliceroles y aceites vegetales. Excipientes adecuados para supositorios son aceites vegetales y aceites hidrogenados, ceras, grasas y polioles semi-líquidos . Las preparaciones farmacéuticas pueden también comprender conservadores, solventes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsificantes, endulzantes, colorantes, saborizantes, sales para modificar la presión osmótica, amortiguadores, agentes de revestimiento, oxidantes y, en case apropiado, otros compuestos terapéuticos activos. Formas de administración preferidas son aplicaciones tópicas, aplicaciones locales, por ejemplo empleando un catéter o bien inhalación, inyeccicr-es o infusiones y administración oral. Para inyección, los derivados de PNA de la fórmula I son formulados en una solución líquida, de preferencia en un amortiguador fisiológicamente aceptable, por ejemplo, solución de Hank o bien solución de Ringer. Sin embargo, los oligonucleótidos pueden también ser formulados en forma sólida y disueltos o suspendidos antes de uso. Las dosis preferidas para administración sistémica son de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal y por día. La invención se refiere además a preparaciones farmacéuticas que comprenden derivados de PNA de la fórmula I y/o sus sales fisiológicamente toleradas además de excipientes y/o aditivos farmacéuticamente aceptables. Los derivados de PNA y de la fórmula I y/o sus sales fisiológicamente toleradas pueden administrarse a animales, de preferencia mamíferos, y especialmente seres humanos, cono agentes farmacéuticos, solos, en mezcla entre ello, o bien en forma de preparaciones farmacéuticas que permiten uso tópico, percutáneo, parenteral o enteral y que comprenden, como constituyente activo, una dosis efectiva de por lo menos un derivado de PNA junto con excipientes y activos habituales farmacéuticamente aceptables . Las preparaciones comprenden de aproximadamente 0.1 a 90% en peso del compuesto terapéuticamente activo. Una aplicación tópica, per ejemplo, en forma de ungüentos, lociones o tinturas, emulsiones o suspensiones, se prefieren para el tratamiento de enfermedades cutáneas. Las preparaciones farmacéuticas son producidas de manera conocida per se (por ejemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA) , con excipientes inorgánicos y/u orgánicos farmacéuticamente inertes empleándose. Es posible, por ejemplo, utilizar lactosa, almidón de maíz y/o derivados de los mismos, cebo, ácido esteárico y/o sus sales, etc. para la producción de pildoras, tabletas, tabletas revestidas, y cápsulas de gelatina dura. Ejemplos de excipientes para cápsulas de gelatina blanda y/o supositorios son grasas, ceras, polioles, semisólidos y líquidos, aceites naturales y/o hidrogenados, etc. Excipientes adecuados para la producción de soluciones y/o jarabes son, por ejemplo, agua, sucrosa, azúcar invertida, glucosa, polioles, etc. Excipientes adecuados para producción de soluciones para inyección son agua, alcoholes, glicerol, polioles, aceites vegetales, etc. Excipientes adecuados para micro cápsulas, implantes y/o varillas son copoliméros que consisten de ácido glicólico y ácido láctico. Formulaciones de liposoma conocidas por parte del experto en la materia (N.

Weiner, Drug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523; "Liposome Dermatics, Springer Verlag 1992), por ejemplo liposomas HVJ (Hayashi, Gene Therapy 3 (1996) 878) son también adecuadas. Una aplicación dérmica puede también efectuarse, por ejemplo, utilizando métodos ionoforéticos y/o utilizando electropcración . Además de los compuestos activos y excipientes, una preparación farmacéutica puede contener aditivos tales como rellenadcres, extendedores, desintegrantes, aglomerantes, agentes de deslizamiento, agentes humectantes, estabilizadores, emulsificantes, conservadores, endulzantes, colorantes, saborizantes o agentes aromatizantes, espesadores, diluyentes y sustancias amortiguadoras, y además, solventes y/o agentes de solubilización y/o agentes para lograr un efecto de liberación prolongada, y también sales para alterar la presión osmótica, agentes de revestimiento y/o antioxidantes. Pueden comprender dos o más derivados diferentes de PNA de la fórmula I y/o sus sales fisiológicamente toleradas y también, además, por lo menos un derivado de PNA de la fórmula I, una o varias sustancias terapéuticamente . activas diferentes. La dosis puede variar dentro de límites amplios y debe ser ajustada a las circunstancias individuales en cada caso individual. La invención de refiere además al uso de derivados de PNA de la fórmula I como agentes de diagnóstico, en particular como auxiliares en el diagnóstico de ADN y en biología molecular (véase, por ejemplo: Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications [Ácidos Nucleicos Peptídicos: Protocolos y Aplicaciones]; Peter E. Nielsen y Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999) . En diagnóstico de ADN sondas génicas, conocidas también como sondas de ADN o sondas de hibridación, desempeñan una función importante en la detección específica para secuencias de genes particular. En general, una son génica consiste de una secuencia de reconocimiento y uno o varios grupos marcadores adecuados (etiquetas) . La especificidad con la cual una secuencia blanco en una muestra analítica es identificada a través de hibridación con una sonda génica complementaria es determinada por la secuencia de reconocimiento y su estructura química. Esta técnica puede aplicarse también a PNA. En comparación con oligonucleótidos que tienen una estructura natural, el PNA tiene la ventaja que tiene una mayor afinidad por la secuencia blanco y una mayor capacidad de discriminar entre bases. El uso de compuesto de la fórmula I por consiguiente se refiere también a la hibridación in situ e hibridación in situ con fluorescencia (FISH) La hibridación en situ puede emplearse también, por ejemplo, para detectar microorganismos y virus (Just y colaboradores 1998) J: Vir. Method. 73, 163-174) : Otra aplicación de los compuestos de la presente invención se refiere a la detección y cuantificación de ácidos nucleicos. Para este propósito, se prefiere utilizar también tecnología de conjuntos (Strother y colaboradores J. Am. Chem. Soc. (2000) 122, 1205-1209; Niemeyer y colaboradores, Angew. Hem. (1999) 111, 3039-3043; Pirrung (1997) Chem. Rev. 97, 473-488), que ofrece un alto rendimiento de muestras y un alto grado de sensibilidad. En este caso las sondas de PNA están fijadas en un soporte adecuado o chip de PNA. Para legrar esto, el PNA puede ser sintetizado de conformidad con lo descrito en los ejemplos y subsecuentemente fijado en el soporte o chip de PNA. Alternativamente, el PNA puede ser preparado directamente en el soporte. Otra aplicación es ei uso de los compuestos de la fórmula I como biosensores para detectar ácidos nucleicos (Wang y colaboradores (1996) J. Am. Chem. Soc. 118, 7667). El uso de PNA de la fórmula I que posee una etiqueta de afinidad, por ejemplo, histidilc-PNA, es otra aplicación para purificar los ácidos nucleicos (Oerum y colaboradores (1999), en Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications [Ácidos Nucleicos Peptídicos: Protocolos y Aplicaciones]). Los dos radicales fosforilo en la terminal amino y en la terminal carboxi pueden cumplir funciones diferentes. Por ejemplo, la terminal amino puede estar sustituida lipofílicamente con el objeto de incrementar la absorción celular, con un residuo de fluoresceína localizado en la terminal carboxi para el propósito de detectar la absorción mejorada de células (véase PNA-6 en el Ejemplo 7) . Los compuestos doblemente derivados de la fórmula I son también adecuados para su uso como lo que se conoce como "fanales moleculares" (Li y colaboradcres (2000= Angew. Chemie 112, 1091-1094), que emiten solamente una señal de fluorescencia en asociación con unión cen un ácido nucleico complementario. En estos fanales, un extremo de PNA, por ejemplo, la terminal amino, está equipada con una etiqueta de fluorescencia mientras que el otro extremo, por ejemplo, la terminal carboxi, tiene un apagador. El caso opuesto en donde la terminal N lleva un apagador y la terminal C lleva una etiqueta de fluorescencia es también posible. Esto resulta en la supresión de la señal de fluorescencia en la medida en que el derivado de PNA doblemente marcado nc se une a un ácido nucleico complementario. Es solamente en asociación con enlace que el residuo de fluorescencia (per ejemplo, Edans) y el apagador (por ejemplo, Dabcyl) están espacialmente separados entre ellos, lo que resulta en la emisión de señal de fluorescencia (Sokol y colaboradores (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. 95, 11538) . La estructura de PNA es sintetizada empleando los métodos descritos en la literatura, por ejemplo, utilizando la estrategia 'de grupo de protección terc-butiloxicarbonilo (BOC) , 0-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o bien monometoxitritilo (M t) Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications [Ácidos Nucleicos Peptídicos: Protocolos y Aplicaciones]; Peter E. Nielsen y Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999) . Se da preferencia a la utilización del grupo de protección Mmt para la protección temporal de la función amino de la aminoetilglicina y grupos de protección lábiles para bases lábiles en las nucleobases heterocíclicas (D. Will y colaboradores (1995) Tetrahedron 51, 12069; Breipohl y colaboradores (1937) Tetrahedron 53, 14671-14686) . Ejemplos de bloques de construcción monoméricos son compuestos de las fórmulas V a V D, con A, B, D, E, u' y V teniendo los significados mencionados arriba. PG es un grupo de protección de amino como por ejemplo, benzcílo, anisoil-, isobutircil-, aceil- o terc-butilbe zcí le >3reiphl y colaboradores (1997) Tetrahedron 53, 14671-14686). TR es un grupo de protección lábil para ácidos, por ejemplo, dimetoxitritilo (Dmt) para V = O y S) o bien Mmt (para V = Fórmula V Fórmula V A Fórmula V B Fórmula V C Fórmula V D Después ae ia construcción de la estructura de PNA, la función de amino libre de la terminal N puede reaccionar directamente con un reactivo de fosforilación apropiado, por ejemplo, para proporcionar el fosforamidato correspondiente (V = NRi en la fórmula I) . Los radicales fosforilo pueden ser introducidos empleando los reactivos habitualmente empleados en la química de los nucleótidos. Existe un gran número de reactivos de fosforilación disponibles que pueden ser utilizados para preparar los compuestos de la fórmula I. Una selección de los reactivos se muestra en las Figuras 4a a 4d, pero la invención no se limita sin embargo, a estos derivados especiales. Soportes apropiadamente modificados, en particular, soportes de CPG para síntesis de fase sólida, se emplean para la modificación de la terminal carboxi. Ejemplos de tales soportes se presentan en la lista en la Figura 6.

Los reactivos de fosforilación empleados pueden ser los reactivos habituales en la química de los nucleótidos (Glen Research Corporation, Sterling, VA 20164, de los Estados Unidos de América; Figuras 4a a 4d) y que reaccionan, por ejemplo, de conformidad con el método de fosforamidita, el método de H-fosfonato o el método de fosfotriéster (E. Sonveaux (1986) Bioorganic Chemistry 14, 274; S. L. Beaucage y R. P. Iyer (1993) Tetrahedron 49, 1925; E. Uhl ann y A. Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 543) . La amplia gama de modificaciones posibles e= determinada por el gran numere de reactivos de fosforilación conocidos y soportes apropiadamente derivados, en particular de soportes de vidrio de poros controlados (CPG) . ©TentaGil (de Rapp Polymers GmbH, Tübingen) y aminometilpoliestireno se utilizan también de preferencia como soportes sólidos. Mientras que, en principio, todos los reactivos conocidos en la química de los nucleótidos son adecuados para ' introducir la función fosforilo, los que son particularmente adecuados son los siguientes reactivos de las ' fórmulas VI A-, VI B, VI C y VI D Fórmula VI A Fórmula VI B Fórmula VI C Fórmula VI D donde K es halógeno, de preferencia Cl, triazolilo, imidazoiilo o dialquilamino, W puede tener el significado mencionado arriba o el significado de ff', y Z puede tener el significado mencionado arriba o bien el significado de X, X' o Z', con grupos reactivos apropiadamente protegidos. Por ejemplo, los grupos hidroxiles de la fluoresceína-fosfora-midita 3 (Figura 4a) son prctegidos por esterificación con ácido piválico. Los compuestos de la fórmula VI deben solamente considerarse como ejemplos de tales reactivos, los cuales reaccionan, en caso apropiado, en presencia de otros reactivos auxiliares tales como bases, ácidos o reactivos de condensación. Se da preferencia particular a los reactivos de la fórmula VI A, que reaccionan de conformidad con el método de fosforamidita (Beaucage y lyer, 1993) . Estos reactivos reaccionan como el compuesto de fósforo (III) y son subsecuentemente oxidados. Por ejemplo, si la oxidación se efectúa empleando yodo/agua /piridina o bien hidroperóxido de terc-butilo, los derivados de fosforilo (W = 0) se obtienen. Por otra parte, si la oxidación se efectúa empleando azufre elemental o bien reactivo de Beaucage, se obtiene el compuesto tiofosforilo correspondiente (W = S) . Entre los reactivos (Figuras 4a a 4d) , se encuentran también "reactivos bifuncionales" que debido a la posesión de una segunda función, la cual es inicialmente protegida, puede reaccionar varias veces. Las fosforamiditas 4, 6 y 8 a 13 son ejemplos de tales reactivos bifuncionales. En cuanto a ese aspecto, puede ser un asunto de la conjugación múltiple de ur. reactivo o bien de reacción sucesiva con reactivos diferentes. Así, por ejemplo, se puede provocar que la fluoresceína-fosfora idita 3 reaccione solamente una vez. En comparación, la fluoresceína-fosforamidita 4 posee una función hidroxilo protegida con grupo Dmt que puede reaccionar otra vez con un reactivo de fosforilación después de la eliminación del grupo Dmt. De esta forma, es posible introducir un mismo grupo o bien grupos diferentes varias veces. PNA-6 es un ejemplo de una conjugación múltiple en la terminal carboxi y una modificación adicional en la terminal amino. La fluoresceína y el enlazador amino fueron sintetizados por vez primera sucesivamente en la terminal carboxi. Después de la síntesis de la porción de PNA, un bloque.de construcción de hidroexietilglicina-t fue acoplado en el último ciclo, con el bloque de construcción reaccionando con reactivo de fosforilación de C16 7. PNA-1 y PNA-2 son compuestos de la fórmula I que son solamente modificados con un radical fosforilo en la terminal carboxi (q = 0) . Esta clase de sustancia es también novedosa y parte de la materia de la presente invención. Las Figuras 5a y 5b muestran algunos ejemplos de tipos de compuestos para modificación de terminal N de los compuestos de la fórmula I.

El tipo de compuesto A se obtiene mediante la reacción del grupo hidroxilo terminal del PNA con el reactivo de fosforilación 1. El tipo de compuesto B se obtiene mediante la reacción del grupo amino terminal del PNA con la biotina-fosforamidita 5. El tipo de compuesto C se obtiene mediante la reacción sucesiva del PNA que tiene un grupo hidroxilo terminal con el espaciador-18 fosforamiditita 9, amino modificador-5 fosforamidita 12 y lexitropsina. El tipo de compuesto D se obtiene mediante la reacción sucesiva del PNA que tiene un grupo hidroxilo terminal con el espaciador-9 fosforamidita 8 y la cianina-3 fosforamidita 10. El tipo de compuesto E se obtiene mediante la reacción sucesiva del PNA que tiene un grupo hidroxilo terminal con la fluoresceína bifuncional-fosforamidita 4, el espaciador-9 fosforamidita 8, y el reactivo de fosforilación C16 7. Los pasos que deben efectuarse adicionalmente tales como oxidación y eliminación de grupo de protección se describen en los ejemplos. Un ejemplo de la modificación de la terminal carboxi de PNA que se obtiene empleando una fosforamidita de la fórmula V D se muestra en la Figura 7. En este caso, el material inicial es un soporte de bishidroxietilsulfona I (Figura 6) , que, después de la eliminación del grupo Dmt con ácido tricloroacético al 3%, reacciona con la fosforamidita de la fórmula V D empleando tetrazol como catalizador. Después de oxidación con agua yodada, el grupo Mmt de terminal amino es eliminado con ácido tricloroacético al 3 y la porción de PNA es después sintetizada empleando métodos conocidos a partir de la literatura, por ejemplo, empleande el método de Mmt que se explica más adelante. Un método alternativo para la modificación de la terminal carboxi emplea soportes CPG modificados de conformidad con el radical a introducir, y contienen por consiguiente el radical de fluoresceína, por ejemplo, (Figura 8) . Este método se explicará empleando el ejemplo de un derivado de PNA modificado en terminal amino con un radical fosfato de hexadecilo y modificado en terminal carboxi con un fosfato de fluoresceína. El soporte de fluoresceína 3 (Figura 6) es primero detritilado con ácido tricloroacético y después condensado con el modificador de amino C6 fosforamidita 13 (Figura 4d) empleando tetrazol. Después de oxidación con agua yodada y eliminación del grupo Mmt, la porción de PNA puede ser sintetizada empleando métodos habituales. En el último ciclo, un bloque de construcción de PNA basado en hidroxietilo-glicina (fórmula V A, u' = 2, V = oxígeno) es acoplado, con este bloque de construcción reaccionando como se muestra en la Figura 9 después de la eliminación del grupo de protección Dmt empleando el agente de fosforilación C16 7. El derivado de PNA doblemente modificado es obtenido después de la eliminación de todos los grupos de protección y disociación del soporte de CPG.

Ejemplos: La preparación de los siguientes compuestos se describe a título de ejemplo: PNA-1 : PNA-2: PNA-3: PNA-4: PNA-5: PNA-6: PNA-7: en donde las secuencias de las 13 bases son descritas en cada caso por SEQ ID NO. 53, y z" en cada caso es 10: SEQ ID NO. 53 5' -TATTCCGTCAT-3' (de PNA-1 a PNA-7) Ejemplo 1: Síntesis de la cadena de PNA Los siguientes reactivos fueron utilizados para preparar la porción de PNA: 1. Reactivo de fosforamidita (0.1 M en acetonitrilo (ACN) 2. Monómero de Mmt-PNA y/o monómeros de de Dmt-oeg-PNA (0.2 M en DMF:ACN (1:1; v:v)) 3. ACN anhidro (< 30 ppm de agua) 4. Ácido tricloroacético (3%) en diclorometano :DCM) 5. Anhídrido acético, 2, 6-lutidina en THF (1:1:9; v:v:v) ; (Tapa A) 6. N-Metilimidazol (16%) en THF; (Tapa B) 7. Solución de yodo (0.05 M) en THF, agua, piridina (7:2:1; v:v:v) 8. Solución de lavado (THF, agua, piridina (7:2:1; v:v)) 9. Tetrazol (0.3 M) en ACN 10. BUT; 0.2 M en DMF:ACN (1:1; v:v) ll.DIPEA; 0.2 M en DMF:ACN (1:1; v:v) . 12. DMF (> 99.5%) 13. Soporte de fase sólida; aminopropilo-CPG (550 Á) cargado con hemisuccinato de Mmt-aminohex-1-ilo (para PNA-hexilamidas) . 14. Los monómeros oeg protegidos con Mmt/acilo o 2mt/acilo fueron preparados de conformidad con lo ya descrito 15. (Breipohl y colaboradores (1997) Tetrahedron 53, 14671- 14686) . La carga de aminopropilo-CPG con el hemisuccinato de Mmt-aminohex-1-ilo ya ha sido descrita también (Will y colaboradores (1995) Tetrahedron 51, 12069-12082) . Los soportes de CPG derivados están disponibles en el comercie (Glen Research Corporation, Sterling, VA 20164, Estados Unidos de América) . Las síntesis de PNA fueron efectuadas en general en una escala de 2 a 5 µ moles. El siguiente ciclo fue utilizado para la síntesis de PNA: 1. Paso de lavado con ACN 2. Desprotección del grupo Mmt o del grupo Dmt por tratamiento con TCA al 3% en DCM; 110 segundos. 3. Paso de lavado con DMF/ACN (1:1) 4. Neutralización con DIPEA en DMF/ACN (1:1) 5. Acoplamiento en el bloque de construcción monomérico mediante reactivación (15 minutos) con monómero BUT/DIPEA/PNA (proporción 1:1:1; volumen total 450 µl) carga de fase sólida y acoplamiento (45 minutos) 6. Paso de lavado con ACN 7. Tapar con anhídrido acético/N-metilimidazol 8. Paso de lavado con ACN 9. Nuevo ciclo Ejemplo 2: Síntesis de acetil-tat tec gtc at-aminohexil-p (PNA-1) El grupo de protección Dmt es eliminado primero del soporte de bishidroxietilsulfonilo 1 (lumol Figura 6) mediante tratamiento con ácido tricloroacético al 3%. La función de hidroxilo libre reacciona después con el modificador de amino C6 fosforamidita 13 (Figura 4d) empleando tetrazol como catalizador. La reacción emplea un exceso del reactivo de fosforilación 13 (aproximadamente 25 veces), como una solución 0.3 M en acetonitrilo/tetrahidrofurano (1 : 1; v:v), y el tetrazol (aproximadamente 50 veces; 0.5 M en acetonitrilo) . Después de la condensación, la oxidación es efectuada empleando una solución de yodo (0.05 M en tetrahidrofurano/agua, piridina (7:2:1; v:v:v)). Después de esto, la porción de PNA es preparada mediante síntesis en fase sólida de conformidad con lo descrito en el Ejemplo 1. En el último ciclo, la función amino libre es acetilada por tratamiento con el reactivo usado para tapar. Esto impide que el PNA sea degradado en su terminal amino durante desprotección con amoniaco concentrado. Finalmente, el PNA es disociado del soporte, y los grupos de protección son removidos al mismo tiempo, durante tratamiento con amoniaco concentrado a una temperatura de 50°C durante la noche. Obtienen 103 OD (26 0) del producto crudo deseado, y este producto crudo es purificado por electroforesis en gel de poliacrilamida de preparación (PAA) . La banda de producto deseado es eluida con amortiguador de bicarbonato de trietilammonio 0.2 M y desalada a través de una columna Bond-Elute C 18 (1 g) . Se obtienen 23.3 OD. El producto fue analizado por espectrometría de masa de iones negativos que confirmó la masa calculada (calculada 3166.2; encontrada 3166.8) . Ejemplo 3: Síntesis de acetil-tat tec gtc at (eo) -p (PNA-2) La preparación se efectúa en la síntesis de 1 µmol, de manera análoga a lo descrito en el Ejemplo 2. Después de la eliminación del grupo de protección Dmt del soporte 1 (Figura 6) , la función hidroxilo libre reacciona con la fosforamidita de la fórmula V D empleando tetrazol como catalizador. La reacción emplea un exceso de fosforamidita (aproximadamente 20 veces), como solución 0.1 M en acetonitrilo/tetrahidrofurano (1:1; v:v) y el tetrazol (aproximadamente 50 veces; 0.5 M en acetonitrilo). Después de la condensación, se efectúa una oxidación empleando una solución de yodo (0.05 M en tetrahidrofurano/agua, piridina (7:2:1; v:v:v)). Se obtienen 50 OD de producto crudo después de disociación con amoniaco. Se purifican 45 OD de este producto crudo por electroforesis a través de un gel de PAA al 15%. Se obtienen 13.2 OD del producto que tiene un peso molecular de 3052.9 (calculado 3052.9). Ejemplo 4: Síntesis de aminohexil-p-t (oeg) at tec gtc at-aminoheil-p (PNA-3) La preparación se efectúa en una síntesis de 1 µmol, de manera análoga a lo descrito en el ejemplo 2. Sin embargo, después de la síntesis de la terminal carboxi y de la porción de PNA, se acopla un bloque de construcción basado en hidroxietilglicina que tiene tiamina como la nucleobase (oegT) en el último ciclo. Después de la eliminación del grupo Dmt, la función de hidroxilo libre es acoplada al modificador amino C6 fosforamidita 13 (Figura 4d) empleando tetrazol como catalizador y subsecuentemente oxidada con agua yodada. El oligómero es disociado del soporte, y todos los grupos de protección lábiles para bases son removidos al mismo tiempo, mediante tratamiento con amoniaco concentrado a una temperatura de 50°C. El grupo de protección Mmt se terminal es después removido por tratamiento con ácido acético al 80%. Se obtienen 130 OD del producto crudo, con el producto de este grupo siendo purificado por electroforesis en gel. Se obtienen 22.5 OD de producto con un peso molecular de 3.1308, (calculado 3.305). Ejemplo 5: Síntesis de biotin-p- (oeg) at tec gtc at-aminohexil-p (PNA- ) La preparación se efectúa en una síntesis de 0.5 µmol, de manera análoga a lo descrito en el ejemplo 2. Sin embargo, después de la terminal carboxi y la porción de PNA, se acopla un bloque de construcción basado en hidroxietilglicina que tiene tiamina como la nucleobase (oegT) en el último ciclo.

Después de la eliminación del grupo Dmt, la función hidroxilo libre as acoplada la biotina fosforamidita 5 (Figura 4b) empleando tetrazol como catalizador y subsecuentemente oxidad con agua iodada y destritilada con ácido tricloroacético. El oligómero es disociado del soporte, y todos los grupos protectores son removidos al mismo tiempo, mediante tratamiento con amoniaco concentrado a una temperatura a 50° C. Se obtienen 37 OD del producto crudo, con este producto crudo siendo purificado por electroforesis en gel. Se obtienen 22.5 OD. Ejemplo 6: Síntesis de p-t (oeg) at tec gtc at-aminohexil-p-fluoresceína (PNA-5) L síntesis se efectúa de manera análoga al ejemplo 2 a partir del soporte de fluoresceína 3 (Figura 6a y 8) . El grupo de protección Dmt es eliminado a partir del soporte de fluoresceína 3 mediante tratamiento con ácido tricloroacético al 3%. La función hidroxilo libre reacciona después con el modificador amino C6 fosforamidita 13 (4d) empleando tetrazol como catalizador. Después de condensación, se efectúa oxidación empleando una solución yodo (0.05 M en tetrahidrofurano/agua, piridina (7:2:1; v:v:v)): Después de esto, la porción PNA es preparada por síntesis en fase sólida de conformidad con lo descrito en el ejemplo 1. Un bloque de construcción basado en hidroxietilglicina que tiene tiamina como nucleobase ((t)oeg) es acoplado en el último ciclo.

Después de la eliminación del grupo Dmt, la función hidroxilo libre es acoplada al reactivo de fosforilación 1 (Figura a) empleando tetrazol como catalizador y subsecuentemente cxidad con agua iodada. Finalmente, el PNA es disociado dei soporte, y los grupos de protección son removidos al mismo tiempo, mediante tratamiento con amoniaco concentrado a una temperatura de 50° C durante la noche. Se obtienen 61 (OD) (206) del producto crudo, con este producto crudo purificado por electroforesis en gel de poliacrilamida de preparación (PPA) . En la banda de producto deseado es eluido con amortiguador de bicarbonato de trietilamonio 0.2M y desalada a través de una columna Bond-Elut C18 (lg) . Se obtienen 5.6 OD. El producto fue analizado por espectroscopia de masa de iones negativos, que mostró la masa calculada (calculada 3709.5; encontrado 3706.3). Ejemplo 7: Síntesis de C16-p-t(oeg) at tec gtc at-aminohexil-p-fluoresceína (PNA-6) La síntesis se efectúa de manera análoga al ejemplo 6 empezando a partir de 1 µmol de soporte de fluoresceína 3 (Figura 6a y 8) . Un bloque de construcción basado en idroxietilglicina que tiene tiamina como nucleobase ((t)oeg) fue acoplado en el último ciclo. Sin embargo, después de la eliminación del grupo Dmt, la función hidroxilo libre es acoplada al reactivo de fosforilación C16 7 (Figura 4c) empleando tetrazol como catalizador y subsecuentemente oxidad con agua iodada. Finalmente, el PNA es eliminado del soporte, y los grupos de protección son removidos al mismo tiempo, mediante tratamiento con amcniaco concentrado a una temperatura de 50° C durante la noche. Se obtiene 61 OD (260) del producto crudo deseado, con el producto crudo siendo purificado por electroforesis en gel de poliacrilamida de preparación (PAA) . La banda de producto deseado es eluida con amortiguador de bicarbonato de trietilamonio 0.2M y desalada a través de un columna Bond-Elut C 18 (1 g) . Se obtienen 4.6 OD. El producto fue analizado por espectometría de masa de iones negativos, que mostró la masa calculada (calculada 3934, encontrada 3931) . Ejemplo 8: Determinación de las temperaturas de fusión Las temperaturas de fusión fueron determinadas empleando un espectrofotómetro de conjunto de diodos HP 8452A, un elemento HP 89090A Peltier y una programática para controlar la temperatura HP rev. B5.1 (de Hewlett Packard) .. La medición se efectuó en incrementos de 0.5°C/minuto en KCL 140 mM, dihidrogenfosfato de sodio 10 M, EDTA 0.1 mM (pH 7.4) como amortiguador. La concentración de oligómero es de 0.5 a 1 OD260 por ml . Sorprendentemente, los derivados de PNA-5 y PNA-6 doblemente modificados con fosforilo que tienen dos o tres cargas negativas presentaron un grado tan bueno o mejor de enlace con relación a ARN y AD? complementario que el P?A sin carga sustancia de referencia) . Derivado de ?NA ( DNA) T JRNA) Referencia Ac-HN-tat tec gtc at-hex J . 9 ° C 56. 6 ° C PNA- 5 p-t (oeg) at tec gtc at- 1 . 8 ° C 56. 9 ° C Aminohexil-p-fluoresceína PNA- 6 C16-p-t (oeg'1 at tte gtc 4 . 1 ° C 56.9° C At-aminohexil-p- fluoresceína Ejemplo 9: Determinación de absorción celular después de marcado con fluorescencia Se permiten el crecimiento de células CC? a confluencia en MEM de Dulbecco complementado con FCS al 10%, en cajas de Petri de 5 cm. Las células son lavadas dos veces con DMEM sin suero. Se rasca un área de aproximadamente lcirr en la parte media de la caja de Petri empleando una aguja estéril. La solución de PNA (10 µM) bajo investigación se aplica en esta área. La caja es incubada a una temperatura de 37° c bajo una atmósfera de C02. Después de 2, 4 y 16 horas, las células son examinadas por microscopía de fluorescencia. Para este propósito, las células son lavadas cuatro veces con DMEM sin suero, cubiertas con una laminilla y evaluadas bajo el microscopio de fluorescencia o por contraste de fase. Se examinaron PNA-5 y PNA-6 por microscopía de fluorescencia. En cuanto a este aspecto, se encontró que el derivado de PNA-hexadecilo (PNA-6) fue absorbido con mayor eficiencia en las células que el PNA sin radical hexadecilo. Ejemplo 10: Inhibición de proliferación de células con PNA-6 La secuencia de PNA es enfocada hacia el inicio de traducción del ARNm de Ha-ras. Células REH células de pre-leucemia B humana, DMS ACC 22) o bien células de tumor A549 fueron cultivadas, a una temperatura de 37° C y bajo CO; al 5%, en OptiMEM (Gibco BRL) que contiene suero fetal la 10% (FCS, GIBCO-BRL) . La densidad de las células para el ensayo fue de aproximadamente 1 x lOVml. El PNA-6 (10 µM) fue incubado con unas células en placas de 24 pozos. Después de incubación a una temperatura de 37° c y bajo una atmósfera de CO al 5% durante 96 horas, se determinó la densidad de las células. Los valores medios para densidad de las células fueron determinados a partir de 3 pozos individuales en una concentración dada de PNA. Se encentró que PNA-13 inhibe la proliferación de las células de REH. Después de más de 4 días de incubación, la . inhibición provocada por PNA-6 es mayor que la inhibición provocada por un oligonucleótido de fosforotioato correspondiente. Ejemplo 11: Síntesis de aminohexii-p-espaciador ld-p-t(oeg) at tec gtc at-aminohexil-p (PNA-7) La preparación es efectuada en una síntesis de 1 µmol, de manera análoga a lo descrito en el ejemplo 2. Sin embargo, después de la síntesis de la terminal carboxi y de la porción de PNA, se acopla un bloque de construcción basado en hidroxietilglicina que tiene timina como nucleobase (oegT) en el último ciclo. Después de eliminar el grupo Dmt, la función hidroxilo libre es acoplada al espaciador 18 de fosforamidita (Figura 4c) y, después de destritilación otra vez, al modificador amino de fosforamidita C6 13 (Figura 4o) empleando tetrazol como catalizador y oxidada subsecuentemente con agua iodada. El oligómero es disociado del soporte, y todos grupos de protección lábiles para bases son removidos al mismo tiempo, mediante tratamiento con amoniaco concentrado a una temperatura de 50° C. El grupo de protección Mmt terminal es después removido por tratamiento con ácido acético al 80%. Se obtienen 57 OD del producto crudo, con el producto crudo purificado por electroforesis en gel. Se obtienen 7.4 OD de producto, que presenta el peso molecular esperado de 3647.5 (calculado 3648.5) en el espectro de masa. Lista de abreviaturas: ACN Acetonitrilo BOC terc-butiloxicarbonilo C,c Pseudo-iso-citosina COS CV1 origen SV 40 CPG Vidrio con poros controlados DCM Diclorometano DIPEA Diisopropiletilamina DMEM MEM de Dulbecco DMF Dimetilformamida Dmt Dimetoxitritilo DNA Ácido desoxiribonucleico DNP Dinitroarilo FITC Isotiocianato de fluoresceína Fmoc Fluorenilmetoxicarbonilo HATU hexafluorofosfato de O (-7-azabenzotriazol-l- il) 1,1,3, 3-tetrametiluronio HBTU hexafluorofosfato de O (benzotriazol-1-il) 1, 1, 3, 3- tetrametiluronio Hex -?H-(CH2)6-OH MEM Medio esencial mínimo de Eagle modificado Mmt Monometoxitritilo OD Densidad óptica oeg ?- (2-hidroxietil) glicina PAA Poliacrilamida PG Grupo de protección PNA Ácido nucleico de poliamida PNA Ácido ribonucleico TBTU tetrafluoroborato de O(benzotriazol-l-il) 1, 1, 3, 3- tetrametiluronio TCA Ácido tricloroacético THF Tetrahidrofurano TR Grupo de protección lábil para ácido Las figuras la, 2b y 3b muestran ejemplos de radicales Z y Z' terminales . Las figuras 2a y 3a muestran ej emplos de radicales X y X ' de puente . Las figuras 4a, 4b, 4c y 4d muestran ejemplos de reactivos de fosforilación. Las figuras 5a y 5b muestran ejemplos de derivación simple (A, B) y múltiple (C a E) de PNA en la terminal N. La figura 6 muestra ejemplos de reactives unidos a soporte para la síntesis de fase sólida. Las figuras 7, 8 y 9 muestran ejemplos de síntesis de PNA modificado en terminal C y ?.

LISTA DE SECUENCIAS <110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> DERIVADOS DE ÁCIDO NUCLEICO DE POLIAMIDA, AGENTES Y MÉTODOS PARA SU PRODUCCIÓN <130> AVE D-2000/A023 <140> <141> <150> 10019135.5 <151> 200-04-18 <160> 53 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (21) <400> 1 gcgtttgctc ttcttcttgc g 21 <210> 2 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (20) <400> 2 acacccaatt ctgaaaatgg 20 <210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (20) <400> 3 aggtccctgt tcgggcgcca 20 <210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (20) <400> 4 gcggggctcc atgggggtcg 20 <210> 5 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (15) <400> 5 cagctgcaac ecage 15 <210> 6 <211> 11 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (11) <400> 6 tattccgtca t 11 <210> 7 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (22) <400> 7 ttccgtcatc gctcctcagg gg 22 <210> 8 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleccidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (15) <400> 8 ggctgccatg gtece 15 <210> 9 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (21) <400> 9 ggctgctgga gcggggcaca c 21 <210> 10 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (15) <400> 10 aacgttgagg ggcat 15 <210> 11 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (18) <400> 11 gtgccggggt cttcgggc 18 <210> 12 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (17) <400> 12 egagaacate atcgtgg 17 <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1)..(21) <400> 13 ggagaacatc atggtcgaaa g 21 <210> 14 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. 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(12) <400> 24 ggtttcggag ge 12 <210> 25 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (12) <400> 25 tggtggaggt ag 12 <210> 26 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial; oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (12) <400> 26 gctggtgga gg 12 <210> 27 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (12) <400> 27 ttggcatggt gg 12 <210> 28 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (12) <400> 28 gcctgggacc ac 12 <210> 29 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (12) <400> 29 cagcctggga cc 12 <210> 30 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (12) <400> 30 tgcagcctgg ga 12 <210> 31 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (12) <400> 31 gtgcagcctg gg 12 <210> 32 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (12) <400> 32 ggtgcagcct gg 12 <210> 33 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> 7! <223> Descripción de la secuencia artificial : oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (12) <400> 33 atgggtgcag cc 12 <210> 34 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (12) <400> 34 ggcttgaaga tg 12 <210> 35 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (12) <400> 35 gcagcccccg ca 12 <210> 36 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (12) <400> 36 gcagcagccc cc 12 <210> 37 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (20) <400> 37 tcccgcctgt gacatgeatt 20 <210> 38 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (20) <400> 38 gttctcgctg gtgagtttca 20 <210> 39 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (18) <400> 39 gcgtgcctcc tcactggc <210> 40 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (18) <400> 40 gcagtaagca tecatate <210> 41 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (20) <400> 41 gcccaagctg gcatccgtca 20 <210> 42 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (20) <400> 42 cccccaccac ttcccctctc 20 <210> 43 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (20) <400> 43 ctcccccacc acttcccctc 20 <210> 44 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (19) <400> 44 gctgggagcc atagcgagg 19 <210> 45 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (21) <400> 45 actgctgcct cttgtctcag g 21 <210> 46 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la eecuencia artificial oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (22) <400> 46 caatcaatga cttcaagagt tc 22 <210> 47 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (18) <400> 47 gcggcggaaa agecateg <210> 48 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial; oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (18) <400> 48 gtgtcggggt ctccgggc 18 <210> 49 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (15) <400> 49 cacgttgagg ggcat 15 <210> 50 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (18) <400> 50 gtettecata gttaetca <210> 51 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial, <220> <223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (18) <400> 51 gatcaggcgt geetcaaa 18 <210> 52 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (21) <400> 52 gatggagggc ggcatggcgg g 21 <210> 53 <211> 11 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace mise <222> (1) .. (1) <400> 53 tattccgtca t 11

Claims

REIVINDICAdOJSS Un derivado de PNA que lleva uno c varios radicales fosforilo en la terminal C o en las terminales C y N de la estructura de PNA, en dcnde radicales tiofosforilo y radicales iminofosforilo estén incluidos además de radicales oxofosforilo y en dcnde por lo menos une de los radicales fosforilo lleva uno o varios grupos desprotonables, de preferencia grupos hidroxilc o grupos mercapto, y los radicales fosforilo están unidos a la estructura de PNA a través de un enlace oxigeno-fósforo, un enlace azufre-fósforo o un enlace nitrógeno-fósforo, ya sea directamente o bien a través de un espaciador. Un derivado de PNA de conformidad con la reivindicación, en donde el espaciador puede ser, por ejemplo, una alcanoilamida, una poli(alcoxi) carboxamida o un aminoácido, y en donde por lo menos uno de los radicales fosforilo lleva uno o varios grupos hidroxilo o mercapto, que es/son desprotonables en un rango de pH de 4.5 a 14, de preferencia de 6.5 a 12, de manera especialmente preferida de 6.5 a 9, y en donde, además, el radical fosforilo es por ejemplo un fosfato, un fosfonato, un tiofosfato, un fosfoamidato o un radical fosforilo sustituido, y en donde radicales fosforilo sustituidos llevan en caso apropiado, uno o varios grupos marcadores, o bien grupos para reticulación o bien grupos que promueven la absorción intracelular, o bien grupos que incrementan la afinidad de enlace del derivado de PNA por acide nucleicos. Un derivado de PNA de la fórmula I Terminal N Te r-* inal C Fórmula I en donde q es 0 o bien 1, D' es hidroxilo, mercapto, amino, alquilamino o acilamino, V es, independientemente entre ellos, oxígeno, azufre, NRX, V es, independientemente entre ellos, oxígeno, azufre, NRi, un grupo U- (CR3Rí) ^-C (O) -NH o un grupo U- (CH;CH:0) .„.-CH2-C (O) -NH, U es, independientemente entre ellos, oxígeno, azufre o NH, u' es, independientemente entre ellos, de 1 a 10, de preferencia de 1 a 4, especialmente 1 , W y W' son, independientemente entre ellos, oxígeno, azufre o NRi, Y y Y' son, independientemente entre ellos, hidrcxilo, mercapto, oxianión, tioato o NR?R, X y X' son, independientemente entre ellos, un grupc U- ( alcandiilo C_-C__-}-U o bien un grupo U- (CH^CH^-O) -, o bien un grupo marcador o un grupo para reticulación, o bien un grupo que promueve la absorción intracelular, o bien un grupo que incrementa la afinidad de enlace del derivado de PNA por ácidos nucleicos, por ejemplo, una fluoresceína bifuncional, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina, Dabcyl, Edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G o bien radical digoxigenina, Z y Z' son, independientemente entre ellos, hidroxilo, mercapto, oxianión, tioato o bien NR?R2, alquilo C-C22, arilalquilo C?-C3, alquilo C?-C22-U, arilalquilo C?-C8-U, hidroxi-UCi-Clß, aminoalquilo-U o bien mercaptoalquilo-U, o bien un grupo de la fórmula R7 (CH2CH2-0)ra, en donde R7 es hidroxilo, amins o bien alcoxi C1-C22 y m es de 1 a 100, de preferencia de 2 a 10, o bien son un grupo marcador, o bien un grupo para reticulación, o bien un grupo que promueve la absorción intracelular, o bien un grupo que incrementa la afinidad de enlace del derivado de PNA por ácidos nucleicos, por ejemplo, una fluoresceína monofuncicnal o bifuncional, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilc, vitamina E, colorante de cianina, Dabcyl, Edans, lexitrcpsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R G o bien radical digoxigenina, Ri y R son, independientemente entre ellos, un radical que consiste de hidrógeno o alquilo C.-C , de preferencia hidrógeno, R3 y R4 son, independientemente^ entre ellos, un rauícal que consiste de hidrógeno o alquilo C;-Ce, o bien el radical de una cadena lateral de aminoácidos, de preferencia hidrógeno, siendo posible que radicales adyacentes R3 y R en V formen también un anillo cicloalquilo C¿-Cs, n es de 0 a 10, de preferencia de 0 a 3, m es de 0 a 10, de preferencia de 0 a 3, y en donde {POLI} se describe a través de la fórmula II Fórmula II en donde {BLOQUE} es también, independientemente entre ellos, un grupo seleccionado a partir de la fórmula IHA, Fórmula IHA o bien a partir de la fórmula 11IB, Fórmula IIIB o bien a partir de las fórmulas IV A a IV G, Fórmula IV A Fórmula IV B Fórmula IV C Fórmula IV D Fórmula IV E Fórmula IV F Fórmula IV G en donde cada bloque de construcción {BLOQUE} puede ser diferente, y en donde se aplica además que Z" es de 0 a 100, de preferencia de 1 a 20, especialmente de 4 a 15, G se selecciona dentro de los grupos (CRsRe.u'.- C(0)NH-(CR?R2)t- o C(0)NH-(CH2CH20)U'-CH2CH2, en donde t' es de 2 a 10, de preferencia 6, A es, independientemente entre ellos, un grupo (CRiR ?, en donde s de 1 a 3, de preferencia 1, B es, independientemente entre ellos, ya sea un radical aromático que puede poseer también un carácter heteroaromático, o bien hidrógeno, o bien hidroxilo o bien alquilo Ci-Ciß, o bien una nucleobase que ocurre naturalmente, y es habitual en la química de los nucleótidos, o bien que no ocurre naturalmente, o bien su forma de profármaco, D es, independientemente entre ellos, un grupo (CR3R)-' en donde t es de 2 a 10, de preferencia de 2 a 4, especialmente 2, E es, independientemente entre ellos, un grupo (CR5R6.u', en donde los radicales R5 y Re adyacentes pueden formar también un anillo cicloalquilo C5 a C8 o bien un compuesto espiro, Rs y Re son, independientemente entre ellos, un radical que consiste de hidrógeno o alquilo C?-C6, o bien el radical de una cadena lateral de aminoácidos, de preferencia hidrógeno, y en donde u' , Ri, R2, R3 y R4 tienen los mismos significados que los descritos arriba, así como sales fisiológicamente toleradas de los derivados de PNA de la fórmula I, a condición que por lo menos uno de los radicales Y, Y' , Z o Z' sea hidroxilo, mercapto, oxianión o tioato, y que por lo menos un radical B sea una nucleobase. Un derivado de PNA de conformidad con la reivindicación 3, en donde por lo menos un radical Y, Y', Z o Z' en la fórmula I es oxianión o tioato en un rango de pH de 4.5 a 14, de preferencia de 6.5 a 12, de manera particularmente preferible de 6.5 a 9. Un derivado de PNA de conformidad con las reivindicaciones 3 y 4 en donde n y m son, independientemente entre ellos, 0. Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde q es 1. Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde W y W' son oxo. Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en donde Y y Y' son hidroxilo u oxianión. Un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en donde V y V son oxi. Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en donde X y X' son, independientemente entre ellos, un grupo U- (alcandiilo C2-C22)-U, de preferencia O- (alcandiilo C2-C22) -O, de manera particularmente preferible 0-{CH2)2-6?, o bien son un grupo U- (CH2CH2-0) u> , de preferencia 0(CH2CH2-0) u, en donde u' es de preferencia de 1 a 6. Un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 10 en donde X, X', Z y Z' se seleccionan, independientemente entre ellos, dentro dei grupo que consiste de fluoresceína, rodamina, TAMRA o bien colorante de cianina, biotina, dabcyl, psoraler.o, acridina, DNP, colesterol, o bien vitamina E, dabcyl, edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G o digoxigenina. 12. Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicacicnes 3 a 1, en donde X, X', Z y Z' se seleccionan, independientemente entre ellos, dentro del grupo que consiste de monofosfato, derivado de biotina y derivado de fluoresceína. 13.Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicacicnes 3 a 11, en donde Z es un marcador de fluorescencia y Z' es un apagador. 14. Un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de ias reivindicaciones 3 a 11, en donde Z es un apagador y Z' es un marcador de fluorescencia. 15. Un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en donde Z y Z' son, independientemente entre ellos, un radical alquilo C?-C22 o bien un radical U C?~C22, de preferencia un radical alccxi C?-C22, de manera particularmente preferible alcoxi Cj.6. o bien hidroxi-Ci-Cie-U, de preferencia hidroxi-Ci-Cis-O, de manera particularmente preferible HO- (CH2) 3-?20, o bien un radical aminoalquilo-U, de preferencia un radical aminoalcoxi, de manera especialmente preferible 6-aminohexoxi o bien 5-aminopentoxi, o bien un grupo de la fórmula R7- (CH:CH;-0) m, en donde R- es de preferencia OH o bien NH y m es de 1 a 6, con preferencia particular HC (CH2CH;-0) 2, HO (CRJCH2-0) 6 y H2N- (CH2CH2-0) _, o bien un radical mercaptoalquilo-V, de preferencia un radical mercaptoalcoxi, de manera especialmente preferida 6-mercaptshexiloxi . 16.Un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde q es 0. 17. n derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 16, en donde D' es acilamino, de preferencia acetilamino. 18.Un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones - 3 a 17, en donde D es (CH2)t, de preferencia (CH)2. 19.Un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 18, en donde A, E y G son CH2-. 20.Un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 19, en donde B es adenina, citosina, 5-metilcitosina, guanina, timina y uracilo o bien es purina, 2, 6-diaminopurina, N 4-N?fi- etanccitosina, N°Ne-etano-2, 6-diaminopurina, 5- alquinüuracilo (C..-C6, , 5-alquinil (C3-C6) -citosina, 5- (1-prcpargilamino) uracilo, 5-(l- prepargilamino) citosina, fenoxazina, 9- amince oxifenoxazina, 5-flucrouracilo o pseudcisocitosina, 5- (hidroximetil) uracilo, 5- a inouracilo, pseudouracilo, dihidrouracilo, 5- alquiluracilo {C_- -Ce) , 5-alquilo C—Ce) -citosina, 5- alquenücitosina (C2-C6) , 5-fluorocitosina, 5- clorouracilo, 5-clorocitosina, 5-bromouracilo, 5- bro ocitosina, 7-deazadenina, "'-deazaguanina, 8- azapurina, o bien una purina 7-deaza-7-sustituida. 21.Un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 3 a 20, en donde la secuencia de bases está enfocada hacia partes de genes supresores de tumor, oncogenes o telomerasas, o bien sus productos de transcripción. 22.Un derivado de P?A de conformidad con la reivindicación 21, en donde la secuencia de bases de la porción de P?A está enfocada contra el inicio de traducción de AR?m de HA-ras. 23.Un derivado de P?A de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1-12 o 15-22 para su uso como agente farmacéutico. 24. El uso de un derivado de P?A de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-12 o 15-22 para la producción de un agente farmacéutico para la terapia del tumor. 25. Un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 22 para su uso como agente de diagnóstico. 26.El uso de un derivado de FNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 22 para la detección de microorganismos y/o virus. 27.El uso de un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 22 para detectar y/o cuantificar ácidos nucleicos. 28.El uso de un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 22 como agentes de detección para la hibridación in situ o hibridación in situ con fluorescencia. 29.El uso de un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 22 como agente de antisentido, agente anti-gen, agente señuelo, o agente de quimeraplasto. 30.El uso de un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 13 o 14 como fanal molecular. 31.Un reactivo de detección, que comprende un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 22. 32.Un chip de PNA, que comprende un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 22. 33.Un biosensor, que comprende un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 22. 34.Un agente farmacéutico, que comprende un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1-12 o 15-22 y, en caso apropiado, otros aditivos y/o excipientes farmacológicamente tolerados . 35.Un agente de antisentido, agente anti-gen, agente señuelo o agente de quimeraplasto que comprende un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 22. 36.Un proceso para separar un derivado de PNA de la fórmula I, en donde a) la terminal C de un ácido amidonucleico está unida a un reactivo de fosforilación unido a fase sólida, o un ácido amidonucleico fosforilado en terminal C es unido a un soporte sólido. b) La estructura del oligómero de PNA es extendida secuencialmente mediante acoplamiento con monómero de ácido amidonucleico, c) Si se desea, la terminal N reacciona con un reactivo de fosforilación. 7. El proceso de conformidad con la reivindicación 36 en donde el PNA es preparado empleando los grupos de protección t-butiloxicarbonilo (BOC) , 9- fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o bien monometoxitritilo (Mmt) . 38.El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 36 y 37, en donde el PNA se prepara empleando soportes sólidos. 39.El proceso de conformidad con la reivindicación 38, en donde CPG, tentagel o aminometilpoliestireno se utiliza como soporte sólido. 40. Un proceso para la producción de un agente farmacéutico, en donde a) un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1-12 o bien 15-22 se prepara, y b) Aditivos y/o excipientes farmacológicamente tolerados adicionales se agregan, en caso apropiado. 41. Un proceso para la producción de un chip de PNA, en donde un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 22 es ya sea preparado primero, y después fijado en un soporte sólido, o bien el derivado de PNA es preparado directamente sobre el soporte. 2.Un proceso para la preparación de un derivado de PNA de la fórmula I de conformidad con lo reclamado en las reivindicaciones 36 a 39, en donde, además, el PNA es purificado a través de cromatografía o electroforesis mientras se explota el carácter ácido del radical de fósforo. 43.El proceso de conformidad con la reivindicación 42 en donde el derivado de PNA es purificado a través de cromatografía empleando una fase estacionaria básica y un gradiente de un ácido o diluyente que contiene sal . 44.El proceso de conformidad con la reivindicación 43, en donde la fase estacionaria es un intercambiador de aniones o una fase de modo mixto.