MXPA02009335A

MXPA02009335A - Promotores del virus de la rizadura amarilla del cestrum.

Info

Publication number: MXPA02009335A
Application number: MXPA02009335A
Authority: MX
Inventors: Hope Thompson Ligon
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2000-03-27
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2003-02-12
Also published as: AR062483A2; IL151886A; US7166770B2; US20040086847A1; IL151886A0

Abstract

Esta invencion describe secuencias de ADN nuevas que funcionan como promotores de la transcripcion de las secuencias de nucleotido asociadas. Mas especificamente, esta invencion describe las secuencias de ADN que confieren una expresion constitutiva a una secuencia de nucleotido asociada. La invencion ademas describe secuencias recombinantes que contienen a dichas secuencias promotoras. Dichas secuencias de ADN recombinantes se pueden utilizar para crear plantas transgenicas, pero especialmente, plantas que expresan una secuencia de nucleotido de interes en todo momento y en la mayoria de los tejidos y organos.

Description

PROMOTORES DEL VIRUS DE LA RIZADURA AMARILLA DEL CESTRUM DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las secuencias de ADN nuevas que funcionan como promotores de la transcripción de las secuencias de nucleótido asociadas en las plantas. Más específicamente, esta invención se refiere a promotores nuevos que confieren la expresión constitutiva a la secuencia de nucleótido asociada de interés. En el campo de la agricultura existe un deseo constante de modificar plantas de acuerdo con las necesidades particulares. Una manera de lograrlo es utilizando las técnicas de ingeniería genética modernas. Por ejemplo, introduciendo un gen de interés en la planta, la planta se puede modificar específicamente para expresar una caracteristica fenotipica conveniente. Para esto, las plantas se transforman más comúnmente con un gen heterólogo que comprende a un promotor de región, una región de codificación y una región de terminación. Cuando se trabaja genéticamente con el gen heterólogo para la expresión en las plantas, es un factor critico la selección de un promotor. Mientras que es conveniente expresar ciertos genes que sólo como respuesta a estímulos particulares o confinados a células o tejidos específicos, otros genes se expresan más convenientemente de manera constitutiva, es decir, por medio de la planta en todo Ref. 141893 momento y en la mayoría de los tejidos y órganos. En el pasado, el promotor 35S del Virus mosaico del Coliflor (promotor CAMV 35S) se ha utilizado ampliamente para la expresión constitutiva de los genes heterologos en las plantas. Sin embargo, existen ocasiones en las que es conveniente utilizar promotores alternativos. Por lo tanto, es un objetivo principal de la presente invención proveer estos promotores alternativos para la expresión de una secuencia de nucleotido de ínteres en las plantas. La invención ademas, provee moléculas de ADN recombinantes, vectores de expresión y plantas transgenicas que comprenden a los promotores de la presente invención. La presente invención provee, de este modo: una secuencia de ADN capaz de portar la expresión de una secuencia de nucleotido asociada, donde dicha secuencia de ADN se obtiene del genoma del virus de la rizadura amarilla del Cestrum (CmYLCV) . Se prefiere la secuencia de ADN que se obtiene del promotor de transcripción de longitud completa CmYLCV y comprende a la secuencia de nucleotido ilustrada en el NR ID de SEC: 1. En particular, se proveen las secuencias de ADN, donde • dicha secuenc±a de ADN comprende a la secuencia de nucleotido ilustrada en el NR ID de SEC: 2 • dicha secuencia de ADN comprende a la secuencia de nucleótido ilustrada en el NR ID de SEC: 3 • dicha secuencia de ADN comprende a la secuencia de nucleótido ilustrada en el NR ID de SEC: 4 • dicha secuencia de ADN comprende a la secuencia de nucleótido ilustrada en el NR ID de SEC: 5 • dicha secuencia de ADN comprende a la secuencia de nucleótido ilustrada en el NR ID de SEC: 6 • dicha secuencia de ADN hibridiza bajo condiciones astringentes en cualquiera del NR ID de SEC: 1, Nr ID de SEC: 2, NR ID de SEC: 3, NR ID de SEC: 4, NR ID de SEC: 4, NR ID de SEC: 5 o NR ID de SEC: 6, en particular, cuando la secuencia de ADN, como mencionamos anteriormente, comprende a la secuencia de nucleótido ilustrada en el NR ID de SEC: 19 o el NR ID de SEC: 20. La invención además provee secuencias de ADN que comprenden al tramo consecutivo de al menos 50 nt, preferentemente, entre alrededor de 400 bases y alrededor de 650 bases, más preferentemente, entre alrededor de 200 bases y alrededor de 400 bases y más preferentemente, de alrededor de 350 bases de longitud del NR ID de SEC: 1, donde dichas secuencias de ADN son capaces de portar la expresión de una secuencia de nucleótido asociada. En una realización particular de la invención, dicho tramo consecutivo de al menos 50 nt, preferentemente, entre alrededor de 400 y alrededor de 650 bases, más preferentemente, entre alrededor de 200 bases y alrededor de 400 bases y mas preferentemente, entre alrededor de 350 bases de longitud tiene al menos el 75 % ; preferentemente, el 80 %, más preferentemente, el 90 % y más preferentemente, el 95 %, de identidad de secuencia con respecto al tramo correspondiente consecutivo de al menos 50 nt, preferentemente, entre alrededor de 400 bases y alrededor de 650 bases, más preferentemente, entre alrededor de 200 bases y alrededor de 400 bases y más preferentemente, de alrededor de 350 bases de longitud del NR ID de SEC: 1. La invención además provee las moléculas de ADN recombinantes que comprenden una región promotora de transcripción de longitud completa aislada de la rizadura amarilla del cestrum. Además, la invención provee las moléculas recombinantes y los cassettes de expresión de ADN que comprenden una secuencia de ADN de acuerdo con la invención operativamente ligada a una secuencia de nucleótido de interés. La invención además provee los vectores de expresión de ADN que comprenden dicho ADN recombinante y cassettes de expresión, respectivamente. En particular, las moléculas de ADN recombinante y los cassettes de expresión de ADN se proveen cuando la secuencia de nucleótido de interés comprende una secuencia de codificación, particularmente cuando, • la secuencia de codificación codifica una caracteristica fenotipica conveniente • la secuencia de codificación codifica un gen marcador seleccionaba o clasificable • la secuencia de codificación codifica a una proteina que confiere resistencia al antibiótico, resistencia a los virus, resistencia a los insectos, resistencia a las enfermedades, o resistencia otras pestes, tolerancia al herbicida, valor nutricional mejorado, rendimiento mejorado en el proceso industrial o capacidad reproductora alterada. • la secuencia codificadora codifica una proteina que confiere una ventaja selectiva positiva para las células que han sido transformadas con dicha secuencia codificadora • la secuencia codificadora codifica a una proteina que confiere una ventaja metabólica a las células que han sido transformadas con dicha secuencia de codificación, que consiste en ser capaz de metabolizar a un compuesto, donde dicho compuesto es mañosa o xilosa o un derivado o un precursor de estos, o un sustrato de la proteina, o es capaz de ser metabolizada por las células transformadas con dicha secuencia de codificación en este tipo de sustrato • la secuencia de codificación codifica a una enzima seleccionada del grupo de xiloisomerasas, fosfomano-isomerasa, manosa-6-fosfato isomerasa, manosa-1-fosfato isomerasa, fosfomano mutasa, mañosa epimerasa, mañosa o xilosa fosfatasa, manosa-6-fosfatasa, manosa--l-fosfatasa y mañosa o xilosa permeasa • la secuencia de codificación codifica a la fosfomano isomerasa • la región de codificación no se puede traducir • la región de codificación que no se puede traducir pertenece a un gel viral, en particular de TS V, más particularmente, del gen TSWV NP • la secuencia de codificación codifica a las enzimas o metabolitos valiosos comercialmente en la planta • la secuencia de codificación tiene la orientación antisentido La invención además provee vectores de expresión de ADN que comprenden una secuencia de ADN o una molécula de ADN recombinante como mencionamos anteriormente. En una realización particular de la invención, dicho vector de expresión ADN es pNOV2819 o pNOV2819. Además, se proveen los vectores de expresión de ADN que comprenden una primer secuencia de ADN de acuerdo con la invención operativamente ligada a una secuencia de nucleótido de interés, y una secuencia de ADN de acuerdo con la invención está operativamente ligada a una secuencia de nucleótido de interés. En una realización especifica de la invención, los vectores de expresión ADN, como mencionamos anteriormente, son capaces de alterar la expresión del genoma viral. Incluso en una realización más especifica, el vector de expresión de ADN como mencionamos anteriormente comprende una primer secuencia de ADN capaz de expresar en una célula, un fragmento de ARN sentido de dicho genoma viral o su porción y, una secuencia de ADN capaz de expresar en una célula un fragmento ARN anti-sentido de dicho genoma viral o su porción, donde dicho fragmento ARN sentido y dicho fragmento anti-sentido son capaces de formar un ARN de doble hebra. Se proveen los vectores de expresión, como mencionamos anteriormente, donde: • dicho virus se selecciona del grupo formado por tospovirus, potivirus, potexvirus, tobamovirus, luteovirus, cucumovirus, bromovirus, ciosteorvirus, tombusvirus y furovirus • dichas secuencias de ADN derivan del virus del bronceado del tomate (TSWV) • dicho ADN deriva de un gen de proteina de la nucleocápside La invención además provee Células huésped transformadas de manera estable con una secuencia de ADN, una molécula de ADN recombinante o un vector de expresión de ADN de acuerdo con la invención. En particular, donde • la célula huésped es una bacteria • la. célula huésped es una célula de planta • la célula huésped es una célula de planta seleccionada del grupo formado por arroz, maiz, trigo, cebada, centeno, remolacha, garbanzo, guisantes, endibias, lechuga arrepollada, repollo blanco, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, pimienta, apio, calabaza, calabacín, cáñamo, succino, manzana, pera, quince, melón, ciruela, cereza, melocotones, nectarina, albaricoque, frutilla, uva, frambuesa, zarzamora, pina, avocado, papaya, mango, banana, poroto de soja, tomate, sorgo, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, semilla de colza, trébol, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, papa, berenjena, pepino, Arabidopsí s tha liana , y plantas leñosas como por ejemplo, coniferas y árboles de la especie caducifolia, pero particularmente, arroz, maiz, trigo, cebada, col, coliflor, pimienta, calabaza, melón, poroto de soja, tomate, remolacha azucarera, girasol o algodón, arroz, maiz, trigo Sorghum bi color , grama, remolacha azucarera y células de poroto de soja . • la célula huésped es una célula de planta de una planta dicotiledónea • la célula huésped es una célula de una planta de una planta dicotiledánea seleccionada del grupo formado por poroto de soja, algodón, tabaco, remolacha azucarera y cañóla • la célula huésped es una célula de planta de una planta monocotiledónea • la célula huésped es una célula de planta de una planta monocotiledánea seleccionada del grupo formado por maiz, trigo, sorgo, centeno, avena, hierba de césped, arroz y cebada . Además, las plantas y su progenie incluyendo a las semillas, se proveen transformadas de manera estable con una secuencia de ADN, una molécula de ADN recombinante o un vector de expresión ADN de acuerdo con la invención. En particular, cuando • la planta se selecciona del grupo formado por arroz, maiz, trigo, cebada, centeno, batata, maiz dulce, judia, guisante, achicoria, lechuga arrepollada, col, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, pimienta, apio, calabaza, calabacín, cáñamo, succino, manzana, pera, quince, melón, ciruela, cereza, melocotones, nectarina, albaricoque, frutilla, uva, frambuesa, zarzamora, pina, avocado, papaya, mango, banana, poroto de so a, tomate, sorgo, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, semilla de colza, trébol, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, papa, berenjena, pepino, Arabidopsis thaliana , y plantas leñosas como por ejemplo, coniferas y árboles de la especie caducifolia, pero particularmente, arroz, maíz, trigo, cebada, col, coliflor, pimienta, calabaza, melón, poroto de so a, tomate, remolacha azucarera, girasol o algodón, arroz, maiz, trigo Sorghum bi color , grama, remolacha azucarera y células de poroto de soja. La presente invención además describe: el uso de la secuencia de ADN de acuerdo con la invención para expresar una secuencia de nucleótido de interés un método para producir una secuencia de ADN de acuerdo con la invención, donde el ADN se produce por medio de una reacción de cadena de polimerasa donde, al menos se utiliza un oligonucleatido que comprende una secuencia de nucleótidos que representa un tramo consecutivo de 15, 18, 20, 22, 24 o mas pares base del NR ID de SEC: 1. Para asegurar una comprensión clara y consistente de la especificación y reivindicaciones, se proveen las siguientes definiciones : CMYLCV- Virus de la rizadura amarilla del Cestrum. Shufflmg (duplicaciones y transposiciones) de ADN: el "shuffling" (duplicaciones y transposiciones) de ADN es un método para introducir rápida, fácil y eficazmente redistribuciones, preferentemente, de manera aleatoria, en una molécula de ADN o para generar intercambios de secuencias de ADN entre dos o mas moléculas de ADN, preferentemente, de manera aleatoria. La molécula de ADN resultante del "shuffling" del ADN es una molécula de ADN que no ocurre en la naturaleza derivada de al menos una molécula de ADN matriz . Expresión : se refiere a la transcripción y/o traducción de un gen endógeno o un transgen en las plantas. En el caso de las construcciones anti-sentido, por ejemplo, la expresión se puede referir a la transcripción del ADN anti-sentido solamente . Secuencia funcionalmente equivalente: se refiere a la secuencia de ADN que tiene una actividad del promotor sustancialmente similar a la del promotor de transcripción de longitud completa del CMYLCV o sus partes, y que, bajo condiciones astringentes de hibridización, hibridiza con las secuencias de dicho promotor. Gen : se refiere a una secuencia de codificación y secuencia reguladora asociada donde la secuencia de codificación se transcribe en el ARN como por ejemplo, mARN, rARN, tARM, snARN, ARN sentido o ARN anti-sentido. Los ejemplos de las secuencias reguladores son las secuencias promotores, secuencias 5'- y 3'- no traducidas y secuencias de terminación. Otros elementos pueden . también estar presentes, como por ejemplo, los intrones. Gen de interés: se refiere a cualquier gen que, cuando se transfiere a una planta, le confiere una característica deseada como por ejemplo, resistencia al antibiótico, resistencia al virus, resistencia a los insectos, resistencia a una enfermedad, resistencia a otras pestes, tolerancia a los herbicidas, valor nutricional mejorado, rendimiento mejorado en una proceso industrial o capacidad reproductora alterada. El "gen de interés" también puede ser uno que, se transfiere a las plantas para la producción de las enzimas o metabolitos comercialmente valiosos en la planta. Heterólogo, como se utiliza aqui, se refiere a un origen natural o sintético diferente. Por ejemplo, si una célula huésped se transforma con una secuencia de ácido nucleico que no ocurre en la célula huésped no transformada, esta secuencia de ácido nucleico se dice que es heteróloga con respecto a la célula huésped. El ácido nucleico transformador puede comprender un promotor heterólogo, una secuencia de codificación heteróloga, o una secuencia de terminación heteróloga. Alternativamente, el ácido nucleico transformador puede ser completamente heterólogo o puede comprender cualquier combinación posible de secuencias de ácido nucleico heterólogas o endógenas. Región lider: es la región en un gen entre el sitio de inicio de transcripción y el sitio de inicio de traducción. Gen marcador: se refiere a un gen que codifica una caracteristica seleccionable o seleccionaba. Operativamente ligado a / asociado con: una secuencia de ADN regulatoria, se dice que está "operativamente ligado a" o "asociado con" una secuencia de ADN que codifica a un ARN o un proteina si las dos secuencias .están situadas de manera tal que, la secuencia de ADN regulatoria afecta la expresión de la secuencia de ADN de codificación. Planta : se refiere a cualquier planta, particularmente, a las plantas de semilla. Célula de planta: unidad estructural y fisiológica de la planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula de planta puede tener la forma de una célula sola aislada o una célula cultivada, o puede formar parte de una unidad más organizada como por ejemplo, un tejido de planta u órgano de planta. Material de la planta: se refiere a las hojas, brotes, raices, flores o partes de flores, frutos, polen, filamentos de polen, óvulos, sacos embrionarios, células de huevo, zigotos, embriones, semillas, gajos, cultivos celulares o de tejido y cualquier otra parte o producto de- una planta. Promotor : se refiere a una secuencia de ADN que inicia la transcripción de una secuencia de ADN asociada. La región promotora también puede incluir elementos que actúan como reguladores de la expresión del gen como por ejemplo, activadores, fomentadores y/o represores y pueden incluir a toda o parte de la secuencia lider 5' no traducida. Molécula de ADN recombinante: una combinación de secuencias de ADN que están unidas usando la tecnología de ADN recombinante. Tecnología de ADN recombinante: los procedimientos utilizados para unir las secuencias de ADN como se describe, por ejemplo, en Sambroo et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Gen marcador seleccionable: se refiere a un gen cuya expresión no confiere una ventaja selectiva a la célula transformada, pero cuya expresión hace que la célula transformada sea fenotipicamente diferente de las células no transformadas . Gen marcador seleccionable: se refiere a un gen cuya expresión en una célula de una planta le da a la célula una ventaja selectiva. La ventaja selectiva que posee la célula transformada con el gen marcador seleccionable puede deberse a su capacidad para desarrollarse ante la presencia de un agente selectivo negativo, como por ejemplo, un antibiótico o un herbicida, comparado con el desarrollo de las células no transformadas. La ventaja selectiva que posee las células transformadas, comparada con la de las células no transformadas, puede también, deberse a su capacidad aumentada o nueva de utilizar un compuesto agregado como nutriente, factor de crecimiento o fuente de energía. El gen marcador seleccionaba también se refiere a un gen o una combinación de genes cuya expresión en una célula de planta ante la presencia de un agente selectivo, comparado con la ausencia de un agente selectivo, tiene un efecto positivo sobre la célula de la planta transformada y un efecto negativo sobre la célula de la planta no transformada, por ejemplo, con respecto al crecimiento; y, de este modo, ofrece a la célula de la planta transformada, una ventaja selectiva positiva . Identidad de secuencia: el porcentaje de identidad de secuencia se determina usando programas de computación, que están basados en los algoritmos dinámicos de programación. Los programas de computación que se prefieren dentro del alcance de la presente invención incluyen al programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) diseñado para explorar todas las bases de datos de secuencia disponibles sin tener en cuenta si la búsqueda es una proteína o ADN. BLAST versión 2,9 (Gapped BAST) de esta herramienta de búsqueda está disponible al público en Internet (normalmente en http : //www. ncbi . nlm. nih . gov/BLAST/ ) . Utiliza un algoritmo heurístico, que busca tanto las alineaciones locales, como opuestas a las globales y, por lo tanto, es capaz de detectar relaciones entre las secuencias, que comparten sólo regiones aisladas. Los valores asignados en la búsqueda BLAST tienen una interpretación estadística bien definida. Dichos programas preferentemente, corren con parámetros opcionales determinados en valores por omisión (default) . Transformación : se refiere a la introducción de un ácido nucleico en una célula. Sn particular, se refiere a la integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un organismo de interés. TSWV: virus del bronceado del tomate. La presen?:e invención se refiere a secuencias de ADN que se obtienen del genoma dei virus de la rizadura amarilla del Cestru (CmYLCV) . Se prefieren las secuencias de ADN que se obtienen del promotor de transcripción de longitud completa CmYLCV que son capaces de portar la expresión de una secuencia de nucleótido asociada de interés. Las secuencias de ADN que comprenden a sas equivalentes funcionales y/o estructurales tambi n están incluidas en la invención. La presente invención, por lo tanto, se refiere a las secuencias de ADN que funcionan como promotores de transcripción de las secuencias de nucleótido asociadas. La región del promotor también puede incluir elementos que actúan como reguladores de la expresión del gen como por ejemplo, activadores, fomentadores y/o represores y pueden incluir a la secuencia líder 5' no traducida del mARN transcripto. En una realización preferida de la invención, dicha secuencia de ADN confiere una expresión constitutiva a una secuencia de nucleótido asociada. La expresión constitutiva se refiere a que la secuencia de nucleótido de interés se expresa todo el tiempo y en la mayoría de los te idos u órganos. Cuando se prueban en asociación con un gen reportero GUS o CAT en los ensayos de expresión transitorios, la secuencia de ADN de acuerdo con la invención confiere un elevado nivel de expresión del gen reportero GUS o CAT. De este modo, la secuencia de ADN de acuerdo con la invención, es útil para un elevado nivel de expresión de una secuencia de nucleótido asociada de interés, que preferentemente, es una secuencia codificadora. Ei experto en la materia sabe que la secuencia codificadora asociada de interés se puede expresar en la orientación sentido y anti-sentido. Más aún, la secuencia codificadora de interés puede ser de origen heterólogo u homólogo con respecto a ia planta a ser transformada. En el caso de una secuencia de codificación homologa, la secuencia de ADN de acuerdo con la invención es útil para la expresión ectopica de dicha secuencia. En una realización particular de expresión de la invención de la secuencia de codificación de interés bajo el control de una secuencia de ADN de acuerdo con la invención, suprime su propia expresión y la de la copia original del gen por medio de un proceso llamado co-supresión . Los promotores de la presente invención se pueden obtener del ADN genómico del virus de la pzadura amarilla del Cestrum (CmYLCV), que se puede aislar, por ejemplo, de las plantas Ces trum parqui infestadas. Las plantas Cestrum parqui infestadas con CmYLCV se identifican por medio de su malformación tipo mosaico en la hoja u hoja arrugada. Luego, este ADN se secuencia y analiza. La comparación de secuencia con las secuencias en la base de datos muestra que la organización genómica del CmYLCV está relacionada entre sí con otros miembros de la familia Caulimovirus . El CmYLCV contiene 8 cuadros de lectura abiertos. La comparación de secuencia de los productos del gen CmYLCV muestra que el producto del gen I está involucrado con los movimientos intracelulares: el gen A codifica una proteína pequeña de función desconocida, el gen B codifica el factor de transmisión de áfidos, el gen C codifica una proteína asociada con un vipon: el gen IV es la proteína de la cápside principal: el gen V codifica para la transcpptasa inversa y el gen VI se activa en la traducción de los genes virales en la transcripción de longitud completa. Es de particular interés el llamado promotor de transcripción de longitud completa CmYLCV. El experto en la materia sabe que se pueden utilizar varias regiones del promotor de transcripción de longitud completa del CmYLCV de acuerdo con la invención. Una realización particular de la invención es la región del promotor de transcripción de longitud completa CmYLCV ilustrada en el NR ID de SEC: 1, llamado promotor CmpD. Esta secuencia contiene 350 pb del promotor de transcripción de longitud completa del CmYLCV y 320 bp de la secuencia lider 5' no traducida de transcripción de longitud completa del CmYLCV. Esta secuencia se obtiene secuenciando al ADN genómico CmYLCV. El promotor y las secuencias lider, respectivamente, se identifican por comparación con la secuencias en la base de datos. Una variante del NR ID de SEC: 1, llamada CmpE, donde la secuencia líder no traducida ?5 de transcripción de longitud completa del CmYLCV tiene 318 bp en lugar de 320 bp de longitud, se ilustra en el NR ID de SEC: 19. Una realización preferida de la invención es la secuencia de ADN ilustrada en el NR ID de SEC: 2, llamado promotor CmpC. El promotor CmpC es un fragmento de la secuencia ilustrada en el NR ID de SEC: 1 y contiene 346 bp del promotor de transcripción de longitud completa CmYLCV correspondiente a una base de 5 a 350 del NR ID de SEC: 1. Esta secuencia de ADN se obtiene por PCR con ADN genómico del virus de la rizadura amarilla del Cestrum o de plantas Cestrum parquí infestadas con el virus de la rizadura amarilla del Cestrum usando el cebador directo (forward) Cmp 1 (NR ID de SEC: 13) y un cebador inverso (reverse) CmpC2 (NR ID de SEC: 14) . La caja TATA putativa del promotor CmpC está ubicada entre la base 308 y la base 315 del NR ID de SEC: 2. El promotor CmpC contiene al menos tres regiones fomentadoras putativas. La región del fomentador 1 que tiene la secuencia de nucleótido CAAT está ubicada en entre la base 232 y la base 235 del NR ID de SEC: 2, y la región del fomentador 2 que también tiene la secuencia de nucleótido CAAT está ubicada entre la base 243 y la base 246 del NR ID de SEC: 2. El promotor CmpC contiene al menos 3 regiones fomentadoras putativas. La región fomentadora 1 que tiene la secuencia de nucleótido CAAT está ubicada entre la base 232 y la base 235 del NR ID de SEC: 1, y la región fomentadora 2 que también tiene la secuencia de nucleótido CAAT está ubicada entre la base 243 y la base 246 del NR ID de SEC: 2. La región fomentadora 3 está ubicada entre la base 246 y la base 253 del NR ID de SEC: 1 y tiene la secuencia de nucleótido TGACGTAA. Otra realización preferida de la invención es el ADN ilustrado en el NR ID de SEC: 3, llamado promotor CmpS. El promotor CmpS también es un fragmento de la secuencia ilustrada en el NR ID de SEC: 1 y contiene 346 bp del NR ID de SEC: 2 más 54 bp de la región lider del promotor de transcripción de longitud completa CmYLCV. La región líder es una secuencia de nucleótido que precede a la región de codificación que está transcripta pero no traducida en la proteína. El experto en la materia sabe que la región líder puede contener elementos reguladores con funciones importantes para la expresión del gen. El promotor CmpS se obtiene por PCR con ADN genómico del virus de la rizadura amarilla del Cestrum o de plantas Cestrum parqui infestadas con el virus de la rizadura amarilla del Cestrum utilizando el cebador directo Cmpl (NR ID de SEC: 13) y el cebador inverso CmpS2 (NR ID de SEC: 15). El promotor CmpS contiene al menos dos regiones fomentadoras putativas en la región lider. La región fomentadora 4 (GAGAGA) está ubicada entre la base 354 y la base 359 del NR ID de SEC: 3, y la región fomentadora 5 (GAGAGAGA) está ubicada entre la base 368 y la base 375 del NR ID de SEC: 3. Incluso, otra realización preferida de la invención son las secuencias ilustradas en el NR ID de SEC: 4, llamadas promotor CmpL. Como los promotores precedentes, el promotor CmpL es un fragmento de la secuencia . ilustrada en el NR ID de SEC: 1 y contiene 346 bp del NR ID de SEC: 2 más 288 bp de la secuencia líder no traducida 5' de longitud completa del CmYLCV. El promotor CmpL se obtiene por PCR con el ADN genómico del virus de la rizadura amarilla del Cestrum o de plantas Cestrum parqui infestadas con el virus de la rizadura amarilla del Cestrum usando un cebador directo Cmpl (NR ID de SEC: 13) y el cebador inverso CmpL2 (NR ID de SEC: 16) . Una variante del NR ID de SEC: 4, llamada CmpF, donde la secuencia lider no traducida 5' de la transcripción de longitud completa del CmYLCV es de 286 bp en lugar de 288 bp de longitud, se ilustra en el NR ID de SEC: 20. El experto en la materia sabe que las secuencias de nucleótido ilustradas en los NRs ID de SEC: 1, 2, 3, 4, 119 y 20 se pueden extender en sus extremos 5'- y 3'- con secuencias de nucleótido homologas o heterólogas. Por ejemplo, el extremo 5'- del los NRs ID de SEC: 1, 2, 3, 4, 19 y 20 se pueden extender en todos o parte de los nucleótidos ilustrados en el NR ID de SEC: 6. El NR ID de SEC: 6 se encuentra naturalmente corriente arriba de los NRs ID de SEC: 2, 3, 4 y 20 y contiene parte de ORF VI de CmYLCV (base 1 a base 100 del NR ID de SEC: 6) así como también, parte del promotor de transcripción de longitud completa CmiLCV (base 101 a base 104 del NR ID de SEC: 6) . De igual modo, los extremos 3'- de los NRs ID de SEC: 2, 3, 4 y 20 se pueden extender en todos o parte de los nucleótidos ilustrados en el NR ID de SEC: 5, representando la secuencia de nucleótido naturalmente encontrada en el extremo 3'- de los NRs ID de SEC: 4 y 20 y comprendiendo parte de la secuencia líder de transcripción de longitud completa del CmYLCV. Como describimos anteriormente, las secuencias de ADN de la invención se pueden obtener, por ejemplo, por PCR con ADN genómico del virus de la pzadura amarilla del Cestrum o de plantas Ces trum parqui infestadas con el virus de la pzadura amarilla del Cestrum. Alternativamente, las secuencias de ADN de la invención se pueden obtener de cualquier otro virus de la familia Caulimovirus que comprende a los homólogos de la secuencia de ADN de la invención usando los cebadores específicos de secuencia. Es obvio para los expertos que, basándose en las secuencias de nucleótido ilustrada en el NR ID de SEC: 1 al NR ID de SEC: 6 y los NRs ID de SEC 19 y 20, se puede elegir cualquier combinación de cebadores de interés para amplificar por PCR a los fragmentos de ADN de varias longitudes que se pueden usar de acuerdo con la invención. La invención además incluye a los fragmentos derivados de los promotores de transcripción de longitud completa del CmYLCV que funcionan de acuerdo con la invención, es decir, son capaces de conferir la expresión de una secuencia de nucleótido asociada. Esto se puede probar generando estos fragmentos de promotor, fusionándolos en un gen marcador seleccionable o clasificable y probando las construcciones de fusión para la retención de la actividad del promotor. Estos ensayos están incluidos dentro de la capacidad el experto en la materia. Los fragmentos de ADN preferidos de la invención tienen, al menos, alrededor de 50 bases, preferentemente, entre alrededor de 400 bases y alrededor de 650 bases, más preferentemente, entre alrededor de 200 bases y alrededor de 400 bases y más preferentemente, de alrededor de 350 bases de longitud. También es claro para el conocedor de la materia que se pueden introducir mutaciones, inserciones, eliminaciones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos en las secuencias de ADN de los NRs ID de SEC: 1, 2, 3, 4, 5, y 6 o fragmentos más largos o más cortos derivados de la información de su secuencia, usando los métodos conocidos en la técnica. Además, se puede variar una secuencia de nucleótido no modificada o modificada por medio del "shuffling" de la secuencia de la invención. Para probar una función de las secuencias de ADN variantes de acuerdo con la invención, se enlaza operativamente la secuencia de ínteres a un gen marcador seleccionable o clasificable y se prueba ia expresión del gen marcador en los ensayos de expresión transitoria con protoplastos o en las plantas transformadas de manera estable. El experto en la materia sabe que las secuencias de ADN capaces de portar la expresión de una secuencia de nucleótido asociada se construyen de manera modular. De acuerdo con esto, los niveles de expresión de los fragmentos de ADN más cortos pueden ser diferentes a los del fragmento mas largo y, pueden variar entre sí. Por ejemplo, la eliminación de un elemento corriente arriba que regula en forma descendente producirá un aumento en los niveles de expresión de la secuencia de nucleótido asociada mientras que, la eliminación de un elemento que regula hacia arriba disminuirá los niveles de expresión de la secuencia de nucleótido asociada. El conocedor de la materia sabe que la eliminación del elemento específico del desarrollo o especifico de un tejido producirá un perfil de expresión temporal o especialmente alterado de la secuencia de nucleótido asociada. También se incluye en la presente invención los equivalentes funcionales de los promotores de la presente invención, es decir las secuencias de nucleótido que nibridizan ba o condiciones de astringencia a cualquiera de: NR ID de SEC: 2-, NR ID de SEC: 2, NR ID de SEC: 3, NR ID de SEC: 4, NR ID de SEC: 5 o NR ID de SEC: 6, como por ejemplo, las secuencias ilustradas en el NR ID de SEC: 19 y el NR ID de SEC: 20. Se realiza la hibridización en condiciones de astringencia a una temperatura de 65 °C, preferentemente, de 60 °C y más preferentemente, de 55 °C en una solución salina de citrato regulada (SSC) de doble concentración (2X) que contiene 0.1 % SDS seguido por el enjuague del soporte a la misma temperatura pero con un regulador que tiene una concentración SSC reducida. Estos reguladores de concentración reducida típicamente son SSC donde la concentración es una décima (0.1X SSC) que contiene 0.1 % SCC; preferentemente, 0.2X SCC que contiene 0.1 % SCC y mas preferentemente, SSC de media concentración (0.5X SSC) que contiene 0.1 % SDS. De hecho, los equivalentes funcionales de todo o parte del promotor de transcripción de longitud completa CmYLCV de otros organismos se pueden hallar hibridizando cualquiera de: NR ID de SEC: 1, NR ID DE SEC: 2, NR ID de SEC: 3, NR ID de SEC: 4, NR ID de SEC: 5, NR ID de SEC: 6, NR ID de SEC: 19 o NR ID de SEC: 20 con el ADN genómico aislado de un organismo de interés, particularmente de otro Caulimovirus . El experto en la materia sabe cómo proceder para encontrar estas secuencias ya que hay muchas formas conocidas en la técnica para identificar a las secuencias homologas en otros organismos. Estas moléculas de ADN recientemente identificadas se pueden secuenciar y la secuencia se puede comparar con cualquiera de: NR ID de SEC: 1, NR ID de SEC: 2, NR ID de SEC: 3, NR ID de SEC: 4, NR ID de SEC: 5, NR ID de SEC: 6, NR ID de SEC: 19 o NR ID de SEC: 20 y se pueden probar en cuanto a la actividad del promotor. Dentro del alcance de la presente invención están las moléculas que tienen al menos el 75 %, preferentemente, el 80 %, más preferentemente, el 90 %, y más preferentemente, el 95 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de nucleótido de cualquiera de los NRs ID de SEC: 1, 2, 3, 4 o 6 en una longitud de al menos 50 nucleotidos. El porcentaje de la identidad de secuencia se determina usando los programas de computación que están basados en los algoritmos de programación dinámicos. Los programas de computación preferidos dentro del alcance de la presente invención incluyen a los programas de búsqueda BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) diseñados para explorar a todas las bases de datos de secuencias disponibles sin tener en cuenta si la búsqueda es una proteína o ADN. BLAST Versión 2.0 (Gapped BLAST) de esta herramienta de búsqueda está disponible al público en Internet (normalmente en http : /lwww. nebí . nlm. nih . gov/BLAST/) . Utiliza un algoritmo heurístico, que busca tanto las alineaciones locales, como opuestas a las globales y, por lo tanto, es capaz de detectar relaciones entre las secuencias, que comparten sólo regiones aisladas. Los valores asignados en la búsqueda BLAST tienen una interpretación estadística bien definida. Dichos programas preferentemente, corren con parámetros opcionales determinados en valores por omisión (default). Es otro objetivo de la presente invención proveer moléculas de ADN recombinante que comprenden una secuencia de ADN de acuerdo con la invención operativamente ligadas a una secuencia de nucleótido de interés. La secuencia de nucleótido de interés puede, por ejemplo, codificar un ARN de ribosoma, un ARN anti-sentido o cualquier otro tipo de ARN que no está traducido en la proteina. En otra realización preferida de la invención, la secuencia de nucleótido de interés se traduce en un producto de la proteina. Las secuencias de nucleótido asociadas con la secuencia promotora pueden ser de origen homólogo o heterólogo con respecto a la planta a ser transformada. La secuencia también puede ser completa o parcialmente sintética. Sin tener en cuenta el origen, la secuencia de ADN asociada se expresará en la planta transformada de acuerdo con las propiedades de expresión del promotor al que está unida. En el caso de las secuencias de nucleótido homologas asociadas con la secuencia promotora, el promotor de acuerdo con la invención es útil para la expresión ectópica de dichas secuencias homologas. La expresión ectopica se refiere a que la secuencia de nucleotido asociada con el promotor esta expresada en los tejidos y órganos y/o a veces, dicha secuencia puede no estar expresada ba o el control de su propio promotor. En una realización particular de la invención, la expresión de la secuencia de nucleotido asociada con la secuencia promotora suprime su propia expresión y la de la copia original del gen por medio de un proceso llamado co-supresión. En una realización preferida de la invención, la secuencia de nucleotido asociada puede codificar a una proteina que se desea expresar en todas la planta en todo momento y en la mayoría de los tejidos y órganos. Estas secuencias de nucleótido preferentemente, codifican a las proteínas que confieren una característica deseada a la planta transformada. Los ejemplos son secuencias de nucleótido que codifican proteínas que confieren resistencia al antibiótico, o resistencia a otras pestes, tolerancia al herbicida, valor nutricional mejorado, rendimiento mejorado en el proceso industrial o capacidad reproductora alterada. La secuencia de nucléotido asociada también puede ser una que se transfiera a las plantas para la producción de enzimas o metabolitos, comercialmente valiosos, en la planta. Están incluidos en la presente invención los genes marcadores seleccionabas o clasificables, es decir, genes que comprenden una secuencia de ADN de la invención operativamente enlazada a una región de codificación que codifica una característica seleccionable o clasificables. Los ejemplos de genes marcadores seleccionabas o clasificables se describen a continuación. Para ciertas especies objetivo, se prefieren diferentes marcadores de selección de antibiótico o herbicida. Los marcadores de selección utilizados rutinariamente para la transformación incluyen al gen nptll que confiere resistencia a la kanamicina, paromomicina, genticina y antibióticos relacionados (Vieira y Messing, 1982, Gene 19, 259-268; Bevan et al., 1983, Nature 304: 184-187), al gen aadA bacteriano (Goldschmidt-Clermont, 1991, Nucí. Acids Res. 19: 4083-4089), que codifica a la aminoglicosido 3'-adenililtransferasa y confiere resistencia a la higromicina (Blochlinger and Diggelmann, 1984, Mol. Cell. Bio. 4: 2929-2931), y el gen dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Bourouis and Jarry, 1983, EMBO J. 2: 1099-1104). Otros marcadores para utilizar, incluyen al gen de fosfinotricina acetiltransferasa, que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White et al., 1990, Nucí. Acids. Res. 18: 1062; Spencer et al., 1990, Theor. Appl. Genet. 79 : 625-631), un gen de sintasa EPSP mutante que codifica la resistencia al glifosato (Hmchee et al., 1988, Bio/Technology 6: 915-922), un gen de acetolactato smtasa mutante (ALS) que confiere resistencia a la ímidazoliona o sulfonilurea (Lee et al., 1988, EMBO J 7: 1241-1248), un gen psbA mutante que confiere resistencia a la atrazma (Smeda et al., 1993, Plant Physiol 103: 911-917), o un gen protoporfínnogen oxidasa mutante como se describe en la EP 0 769 059. La identificación de las células transformadas también se puede lograr a través de la expresión de genes marcadores clasificabas como por ejemplo, los genes que codifican para cioramfenicol acetil transferasa (CAT) , ß-glucuronidasa (GUS), luciferaza (LUC), y proteina fluorescente verde (GFP) o cualquier otra proteina que confiera una característica fenotípicamente distintiva a la célula transformada. También se utilizan los marcadores de selección que resultan en la selección positiva, como por ejemplo, el gen de fosfomanosa isomerasa, como se describe en la solicitud de patente WO 93/05163. Otros genes para utilizar en la selección positiva se describen en la WO 94/20627 y codifican a las xiloisomerasas y fosfomano-ísomerasas como por ejemplo, manosa-6-fosfato isomerasa y manosa-1-fosfato isomerasa, fosfomano mutasa; mañosa epimerasas como por ejemplo, aquellas que convierten los carbohidratos en mañosa o la mañosa en carbohidratos como por ejemplo, glucosa o galactosa; fosfatasas como por ejemplo, mañosa y xilosa fosfatasa, manosa-6-fosfatasa y manosa-1-fosfatasa, y permeasas que están incluidas en el transporte de la mañosa, o su derivado o su precursor a la célula. El agente que reduce la toxicidad del compuesto en las células típicamente es un derivado de glucosa como por ejemplo, met?l-3-0-glucosa o flopdzm. Las células transformadas se identifican sin dañar o matar a las células no transformadas de la población y sin la co-introducción de genes de resistencia al antibiótico o herbicida. Como se describe en la WO 93/05163, además del hecho de que se elimina la necesidad de genes de resistencia al antibiótico o herbicida, se ha demostrado que el método de selección positiva a menudo es más eficiente que el de selección negativa tradicional. Por lo tanto, los promotores de la presente invención preferentemente, están operativamente enlazados a una secuencia de nucleotido que codifica a una proteína que comprende una región que: (a) codifica una proteína que está involucrada en el metabolismo del compuesto, y/o (b) regula la actividad del gen que codifica a la protema, cuando el compuesto es mañosa o xilosa o un derivado o un precursor, o un sustrato de la proteína, o es capaz de ser metabolizado por las células transformadas en este tipo de sustrato. Dicha secuencia de nucleotido puede codificar a la manosa-6- fosfato isomerasa y el compuesto puede ser mañosa. Alternativamente, la secuencia de nucleótido puede codificar una fosfoazúcar-isomerasa, una fosfoazúcar-mutasa como por ejemplo, fosfomano mutasa, una fosfatasa como por ejemplo, manosa-6-fosfatasa, azúcar-epimerasa, azúcar-permeasa, fosfoazúcar-permeasa o una xilosa isomerasa, y el compuesto puede ser mañosa, manosa-6-fosfato, D-manosamina o xilosa.

En una realización preferida de la invención, los promotores de la invención están operativamente enlazados a la región de codificación del gen manA de E. Coli (Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reports (Informes sobre células de plantas) 16 : 219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19; 798-803), que codifica a la fosfomanosa isomerasa (PMI), y un terminador Nos (nopalina sintetasa) obtenido de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573 (1982)). El experto en la técnica sabe que el terminador Nos puede sustituirse por cualquier otro terminador que funcione en las plantas. El promotor de la invención puede ser el promotor CmpD, CmpC, CmpS, CmpL, CmpB, CmpB, CmpA, CmpE o CmpF, ilustrado en el NR ID de SEC: 1 a 6 y 19 a 20, o cualquier promotor derivado.

Incluso en una realización más preferida de la invención, el promotor es un promotor CmpS ilustrado en el NR ID de SEC: 3.

Los promotores de la presente invención también se pueden utilizar para proveer resistencia o tolerancia a los virus por medio del enlace operativo de los promotores de la invención con las regiones de codificación de los genes de los virus a ser controlados. Para el control de virus de los virus de hebra negativa como por ejemplo, virus del bronceado del tomate (TSWV), se pueden utilizar las secuencias del gen de la proteina de la nucleocápside viral (NP) y de la proteina de movimiento (MP) , y para los virus pertenecientes al supergrupo tipo Alfa de virus como por ejemplo, TMV y CMV, se pueden usar las secuencias el gen de ARN-polimerasa dependiente del ARN (RdRp) y las secuencias del gen de la proteína de movimiento (MP) . Para los virus pertenecientes al supergrupo tipo Picorna de virus, incluyendo al potivirus, se pueden enlazar cualquier secuencia viral a los promotores de la invención. Finalmente, para todos los otros virus, incluyendo a los virus ADN, se pueden usar las secuencias del gen de ARN-polimerasa dependientes de ARN (RdRp) o las secuencias del gen asociado con replicasa. Estas construcciones para el control de virus se pueden construir como se explica en el Ejemplo 8 y en el Ejemplo 9 de la WO 00/68374. El reemplazo de los promotores descrito en la WO 00/68374 con los promotores de la presente invención, está incluido en las tareas ordinarias de la persona entrenada en la técnica.

Siguiendo las explicaciones de la WO 00/68374, el experto en la materia también sabe preparar construcciones que comprendan a los promotores de la invención, operativamente enlazadas a las secuencias virales mencionadas aquí anteriormente, para conferir resistencia o tolerancia a dicho virus . En lugar de expresar ARN viral de doble hebra en las plantas transgénicas, como se describe en la WO 00/68374, el ARN viral también se puede expresar como una molécula de ARN viral sentido positivo ARN no traducible como se describe por ejemplo, en la Patente estadounidense 55832 o en los Ejemplos 12 y 13 de la presente invención. Es otro objetivo de la invención, proporcionar vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de ADN de la invención fusionada a una secuencia de nucleótido asociada de interés. En estos vectores, el ADN extraño se puede insertar en una región poliligador (sitio de clonación múltiple) de manera tal que estas secuencias exógenas se puedan expresar en una célula huésped adecuada que puede ser, por ejemplo, de origen bacteriano o de planta. Por ejemplo, el plásmido pBHOl derivado del vector pBIN19 binario de Agrobacterium tumefaciens permite la clonación y prueba de promotores usando- la señal de expresión beta-glucuronidasa (GUS) (Jefferson et al, 1987, EMBO J 6; 3901-3907) . El tamaño del vector es de 12.2 kb . Tiene un origen RK2 de replicación de bajo copiado y confiere resistencia a la kanamicina tanto en bacterias como en plantas. Existen muchos .otros vectores de expresión conocidos para los expertos en el arte, que se pueden utilizar de acuerdo con la invención. Es otro objetivo de la presente invención proporcionar plantas transgénicas que comprenden a las secuencias de ADN recombinante de la invención. La invención, de este modo, se refiere a las células de plantas, a las plantas derivadas de dichas células, al material de la planta, a la progenie y semillas derivadas de estas plantas y a los productos agricolas con propiedades mejoradas obtenidos por medio de cualquiera de los métodos de transformación descritos más adelante. Las plantas transformadas de acuerdo con la presente invención pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas e incluyen, pero no están limitadas a: arroz, maiz, trigo, cebada, centeno, remolacha, garbanzo, guisantes, endibias, lechuga arrepollada, repollo blanco, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, pimienta, apio, calabaza, calabacín, cáñamo, succino, manzana, pera, quince, melón, ciruela, cereza, melocotones, nectarina, albaricoque, frutilla, uva, frambuesa, zarzamora, pina, avocado, papaya, mango, banana, poroto de soja, tomate, sorgo, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, semilla de colza, trébol, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, papa, berenjena, pepino, Arabidopsis tha liana , y plantas leñosas como por ejemplo, coniferas y árboles de la especie caducifolia. Las plantas preferidas para ser transformadas son: arroz, maíz, trigo, cebada, col, coliflor, pimienta, calabaza, melón, poroto de soja, tomate, remolacha azucarera, girasol o algodón, arroz, maíz trigo Sorghum bi color, grama, remolacha azucarera y células de poroto de soja. Las secuencias de ADN recombmante de la invención se pueden introducir en la célula de la planta por medio de una cantidad de métodos muy conocidos. Los expertos en la materia, apreciarán que la elección del método dependerá del tipo de planta objetivo para la transformación, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea. Los métodos adecuados para transformar las células de una planta incluyen a la microinyección (Crossway et al, 1986, Bio Techniques 4: 320-334), electroporacion (Riggs and Bates, 1986, Proc. Nati. Acad. Sci, USA (3: 5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium (Hinchee et al., 198, Bio/Technology 6: 915-922; EP 0 853 675), transferencia directa del gen (Paszkowski et al, 1984, EMBO J 3: 2717-2722), y aceleración de partícula usando los dispositivos disponibles por Agracetus, Inc., Madison, Wisconsm y Dupont, Inc., Wilmmgton, Delaware (ver por ejemplo, la Patente estadounidense 4.945.050 y McCabe et al., 1988, Bio/Technology 6: 923-926). Las células a ser transformadas pueden ser células de hoja diferenciadas, células embriogénicas o cualquier otro tipo de célula. En la transformación directa de protoplastos, la toma de material genético exógeno en el protoplasto se puede aumentar por medio del uso de un agente químico o un campo eléctrico. El material exógeno luego se puede integrar al genoma nuclear. El trabajo previo se llevó a cabo en plantas de tabaco dicotiledóneas, que resultaron en el ADN extraño a ser incorporado y transferido a las plantas de la progenie (Paszkowski et al., 1983, EMBO J 3: 2712-2722; Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet 199: 169-177). Los protoplastos de las monocotiledóneas, por ejemplo, de Triticum monococcum, Lolium multiflorum (Ray-grass de Italia), maiz y maiz dulce negro mexicano, se transforman por medio de este procedimiento. Una realización preferida adicional es el método de transformación del protoplasto para el maiz como se describe en EP 0 292 435, asi como también en EP 0 846 771. Para la transformación del maíz ver, también, Koziel et al, 1993, Bio/technology 11: 194-200. La transformación del arroz se puede llevar a cabo por medio de las técnicas de transferencia del gen directas utilizando protoplastos o bombardeo de partículas. La transformación mediada por protoplasto se describe para los tipos Japónica e índica (Zhang et al., 1988, Plant Cell Rep., 7: 379- 384; Shimamoto et al., 1989, Nature (Naturaleza) 338: 274-276; Datta et al., 1990, Bio/Technology 8: 736-740), Ambos tipos se describieron anteriormente y, además, se pueden transformar de rutina usando el bombardeo de partículas (Christou et al., 1991, Bio/technology 9: 957-962). La solicitud de patente EP 0 332 581 describe las técnicas para la generación, transformación y regeneración de protoplastos Pooideae. Estas técnicas permiten la transformación de todas las plantas Pooideae incluyendo a Dactylis y trigo. Más aun, la transformación del trigo se describe en la solicitud de patente EP 0 674 715; y en Weeks et al., 1993, (Plant Physiol 102: 1077-1084). El vector de expresión de planta construido de este modo puede, por ejemplo, ser introducido en el callo del arroz de acuerdo con el método de transformación de planta convencional e introducir allí la diferenciación de raices y hojas, y luego, se puede transferir a maceta para el cultivo, obteniendo, de este modo, al arroz transformado. Las plantas resultantes de la transformación con las secuencias o vectores de ADN de la presente invención, expresarán una secuencia de nucleótido de interés en toda la planta y la mayor parte de los tejidos y órganos. Las propiedades genéticas trabajadas en las plantas transgénicas descritas anteriormente se someten a la reproducción sexual o desarrollo vegetativo y, por lo tanto, se pueden mantener y propagar en las plantas de la progenie. Generalmente, dicho mantenimiento y propagación hace uso de los métodos agrícolas conocidos desarrollados para adecuarse a propósitos específicos, como por ejemplo, laboreo de la tierra, siembra y cosecha. Los procesos especializados como por ejemplo, las tecnologías hidropónicas o de invernadero, también se pueden aplicar. El uso de las propiedades genéticas ventajosas de las plantas transgenicas de acuerdo con la invención, se puede realizar en la reproducción de las plantas que busca el desarrollo de plantas con propiedades mejoradas como por ejemplo, la tolerancia a las pestes, herbicidas, o stress, un valor nutricional mejorado, rendimiento aumentado, o estructura mejorada para producir una perdida menor en el vuelco de la cosecha o rotura del suelo. Los diversos pasos de reproducción están caracterizados por una intervención humana bien definida como por ejemplo, la selección de las lineas a ser cruzadas, la polinización directa de las lineas parentales, o la selección adecuada de las plantas de progenie. Dependiendo de las propiedades deseadas se toman diferentes medidas en la reproducción. Las técnicas relevantes son conocidas en la técnica e incluyen, pero no están limitadas a la hibpdizacion, consanguinidad, reproducción por retrocruzamiento, reproducción, multilínea, mezcla de variedades, hibridización inter-especifica, técnicas aneuploide, etc. Las técnicas de hibridización también incluyen la esterilización de plantas para producir plantas estériles masculinas y femeninas por medio de los medios mecánicos, químicos o bioquímicos. La polinización cruzada de una planta estéril masculina con polen de una línea diferente asegura que el genoma de la planta estéril masculina pero fértil femenina obtenga uniformemente las propiedades de ambas líneas parenterales. De este modo, las plantas transgénicas de acuerdo con la invención, se pueden utilizar para la reproducción de líneas de plantas mejoradas que, por ejemplo, aumentan la efectividad de los métodos convencionales como por ejemplo, el tratamiento con herbicida o pesticida o permiten desarrollar dichos métodos debido a sus propiedades genéticas modificadas. Alternativamente, se pueden obtener nuevas cosechas con una tolerancia al stress mejorada, debido a su "equipo" genético optimizado, rinden un producto cosechado de mejor calidad que los productos que no fueron capaces de tolerar condiciones de desarrollo adversas comparables. Es otro objetivo de la presente invención proporcionar secuencias de ADN que se puedan usar para expresar una secuencia de nucleótido de ínteres en un organismo deseado.

Este organismo puede ser una bacteria, una planta o cualquier otro organismo de interés. Más aun, la descripción de los NRs ID .de SEC: 1 a 6 permite a la persona experta en la técnica diseñar oligonucleótidos para las reacciones de cadena de polimerasa que intentan amplificar los fragmentos ADN de las matrices que comprenden una secuencia de nucleótidos caracterizada por cualquier secuencia continua de 15, y preferentemente, de 20 a 30 o más pares de base en los NRs ID de SEC: 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Dichos nucleótidos comprenden una secuencia de nucleótidos que representa 15 y preferentemente, de 20 a 30 o más pares base de los NRs ID de SEC: 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Las reacciones de cadena de polimerasa realizadas usando al menos uno de estos oligonucleótidos y sus productos de amplificación, constituyen otra realización de la presente invención . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS EN EL LISTADO DE SECUENCIAS NR ID de SEC: 1 CmpD NR ID de SEC: 2 CmPC NR ID de SEC: 3 CmPS NR ID de SEC: 4 CmpL NR ID de SEC: 5 CmpB NR ID de SEC: 6 CmpA NR ID de SEC: 7 Cebador directo SI NR ID de SEC: 8 Cebador inverso S2 NR ID de SEC: 9 Cebador directo GUS NR ID de SEC: 10 Cebador inverso GUS NR ID de SEC: 11 Cebador directo CAT NR ID de SEC: 12 Cebador inverso CAT NR ID de SEC: 13 Cebador directo Cmpl NR ID de SEC: 14 Cebador inverso CmpC2 NR ID de SEC: 15 Cebador inverso CmpS2 NR ID de SEC: 16 Cebador inverso CmpL2 NR ID de SEC: 17 Cebador directo PA NR ID de SEC: 18 Cebador inverso PA NR ID de SEC: 19 CmpE NR ID de SEC: 20 CmpF NR ID de SEC: 21 Cebador directo del terminador NOS NR ID de SEC: 22 Cebador inverso del terminador NOS NR ID de SEC: 23 Cebador directo del gen TSWV NP NR ID de SEC: 24 Cebador inverso del gen TSWV NP NR ID de SEC: 25 Cebador directo del promotor CmYLCV NR ID de SEC: 26 Cebador inverso del promotor CmYLCV NR ID de SEC: 27 Sitio de multiclonación AGLINK NR ID de SEC: 28 Sitio de multiclonación BIGLINK NR ID de SEC: 29 Cebador Cmpf-B NR ID de SEC: 30 Cebador CmpS-B NR ID de SEC: 31 PNOV2804; vector binario, contiene un cassette de expresión del terminador PMI-nos sin promotor NR ID de SEC: 32 PNOV3604; vector para la transformación por biolística, contiene un cassette de expresión del terminador PNI-no sin promotor NR ID de SEC: 33 Cebador inverso CmpMr NR ID de SEC: 34 Cebador directo CmpMF NR ID de SEC: 35 Cebador inverso CmpMF NR ID de SEC: 36 Cebador directo CmpMFs NR ID de SEC: 37 SynGFPI-1 gen de GFP optimizado de planta con intrón NR ID de SEC: 38 GIG; gen GUS con intrón NR ID de SEC: 39 Cebador inverso Cmp-C NR ID de SEC: 40 Cassette de expresión CmpS-synGFPI-nos NR ID de SEC: 41 Cassette de expresión CmpS-GIG-nos NR ID de SEC: 42 Cassette de expresión CmpC-synGFPI-nos NR ID de SEC: 43 Cassette de expresión CmpC-GIG-nos NR ID de SEC: 44 Vector pNOV2117 NR ID de SEC: 45 Vector pNOV4200 NR ID de SEC: 46 Cassette de expresión del término ZmUbi-GFP-35S NR ID de SEC: 47 Cassette de expresión ZmUbi-GIG-nos NR ID de SEC: 48 Cassette de expresión Ubq3 (At ) -synGFPI-nos NR ID de SEC: 49 Cassette de expresión Ubq3 (At ) -GIG-nos EJEMPLOS Las técnicas de ADN recombmante y clonación molecular estándar utilizadas aquí son conocidas en la técnica y se describen por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, "Molecular Ciomng" ("Clonación molecular"), Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en Ausubel et al., 1994, "Current protocols m molecular biology" ("Protocolos comunes en la biología molecular"), John Wiley and Sons, New York. Ejemplo 1: Clonación de virus 1. Extracción de ADN. El ADN genómico viral se extrae de las plantas Ces trum parqui infestadas con el virus de la rizadura amarilla del Cestrum. Se homogenizan cinco gramos de hojas infestadas en 30 ml de un regulador para molido (0.2 M Tris pH 7.0, 0.02 M EDTA, 2 M Urea) durante 60 segundos a una velocidad máxima en un homogeneizador Brikman Polytron con una sonda PT10 y se agita suavemente a 4 °C durante la noche con Tritón X-100 (concentración final del 2 %). El virus se purifica del homogenato crudo por medio del centrifugado a baja velocidad (10,000 rpm durante 20 min en un rotor Sorvall SS-34) y del sobrenadante obtenido por centrifugado de alta velocidad (27,000 rpm durante 2 horas en un rotor Beckman SW-28) a través de un colchón de sacarosa (3 ml de sacarosa al 15 %) . El pellet que contiene el virus luego se resuspendió en 0.1 M Tris, pH 7.4, 2.5 mM MgCl2. Se agregó DNasa 1 (Sigma) y RNasa A (Sigma) a una concentración de 10 mg/ml cada uno. Después de 30 min a 37 °C, la reacción se detuvo con el agregado del EDTA a 10 mM. El ADN de virus se aisló de partículas CmYLCV tratando con proteasa K (E. Merck, 0.5 mg/ml de concentración final) ante la presencia de SDS 1 % a 65 °C durante 15 min. El ADN viral luego se purificó por extracción de fenol y por medio de la precipitación deL etanol. El ADN viral contenido en el precipitado de etanol final se disolvió en agua. 2. Amplificación de ADN y clonación. Cien nanogramas del ADN obtenido se utilizaron como matriz para la amplificación PCR en un volumen de reacción de 50 µl que contiene 10 µM de cada cebador, 25 mM cada uno de dNTP, 5 µl de un regulador de reacción pfu (Stratagene) y 2.5 unidades de polimerasa ADN turbo pfu (Stratagene). Se utilizó un cebador directo SI (gaccacaaacatcagaag, NR ID de SEC: 7) y un cebador inverso S2 (caaacttattgggtaatc, NR ID de SEC: 8) para la reacción PCR.

Los parámetros de ciclado para PCR son: Ix (94 °C para 1 min); 30x (94 °C para 1 min, 50 °C para 1 min, 72 °C para 1 min) ; Ix (72 °C para 10 min) . Cada fragmento de ADN simple se clonó en un plásmido pPCR-SCript™ Amp SK( + ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ejemplo 2 : Secuenciado de ADN El secuenciado de los clones del virus ADN se llevo a cabo usando un secuenciador de ADN ABI PRISM 377 (Perkín Elmer) y un kit de secuenciacion de ciclo terminador ABI PRISM drhodamme (Perkín Elmer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cebador SI y los cebadores S2 (Ejemplo 1) se utilizaron para las reacciones de secuenciacion asi como también los cebadores Universal M13-20 y Reverse. Ejemplo 3: Construcción de plásmidos para la expresión transitoria Todas las reacciones PCR se llevaron a cabo con polimerasa Pfu (Stratagene) como describimos en el Ejemplo 1. 1. Amplificación de los genes reporteros (Repórter) . Se amplificaron los genes reporteros beta-glucuronidasa (GUS) y cloranfenicol acetiltransferasa (CAR) . Para la amplificación del gen GUS, se utilizan los oligonucleotidos GUS directo (cagggtaccactaaaatcacc, NR ID de SEC: 9) y GUS inverso (aggggatccccaattccc, NR ID de SEC: 10) a la temperatura de hibridación molecular de 60 °C. Los oligonucleotidos CAT directo (agggtaccatcgatatggag, NR ID de SEC: 11) y CAT inverso (ttaggatccgccctgccac, NR ID de SEC: 12) se híbrida a 62 °C. Los cebadores directos se designan para que contengan un sitio de reconocimiento Kpnl y los inversos un sitio BamHl . 2 . Amplificación del promotor CmYLCV. Se seleccionaron tres fragmentos de promotor diferentes. Se utilizó CmpC (NR ID de SEC: 2); CmpS (NR ID de SEC: 3) y CmpL (NR ID de SEC: 4). Se usó el cebador directo Cmpl (cttctagacaaagtggcagac, NR ID de SEC: 13) para las tres amplificaciones a la temperatura de hibridación molecular de 52 °C. Se modificó (ilustrado en negritas) la secuencia original para que contenga un sitio de reconocimiento Xbal. El cebador inverso CmpC2 (ttggtaccttaacaatgaggg, NR ID de SEC: 14) se utilizó para la amplificación del fragmento CmpC y el cebador inverso CmpS2 (ctacttctaggtaccttgctc, NR ID de SEC: 15) para el fragmento CmpS. Ambos, se modificaron para que contengan un sitio de reconocimiento Kpnl. El cebador inverso CmpL2 (ttggtaccttaacaatgaggg, NR ID de SEC: 16) se utilizó para la amplificación del fragmento CmpL y se modificó para que contenga un sitio de restricción Clal. 3. Amplificación de la señal de poliadenilación. Los fragmentos de señal de poliadenilación son amplificados del clon infeccioso del virus mosaico del coliflor (CaMV) (Franck et al., Cell (Célula) 21 (1), 285-294, 1980). Los oligonucleótidos PA (amplificación de señal de poliadenilación) directo (ggggatccccagtctctctc, NR ID de SEC: 17) y PA inverso (gtgaattcgagctcggta, NR ID de SEC: 18) se utilizaron para PCR y se hibrida a 60 °C. El cebador directo se diseñó para que contenga un sitio de reconocimiento BamHl y el inverso, un sitio EcoRl . 4. Construcciones producidas • pCmpCG (fragmento del promotor CmpC + gen GUS + poLyA) • pCmpSG (fragmento del promotor CmpS + gen GUS + polyA) • pC pCC (fragmento del promotor CmpC + gen CAT + polyA) • pCmpSC (fragmento del promotor CmpS + gen CAT + polyA) • pCmpLC (fragmento del promotor CmpL + gen CAT + polyA) Los cassettes que contienen al fragmento del promotor, los genes reporteros y la señal de poliadenilación se insertan en un vector pUC19 (Stratagene) restringido con Xbal y EcoRl .

. Construcciones utilizadas para comparación • pCapG (fragmento del promotor Cap + gen GUS + polyA) • pCapSG (fragmento del promotor CapS + gen GUS + polyA) • pCapC (fragmento del promotor Cap + gen CAT + polyA) Los fragmentos del promotor contenidos en estas construcciones se obtienen de CaMV (Franck et al., Cell (Célula) 21 (1), 285-294, 1980, ver el NR de Acceso del GenBank V00141) . Los fragmentos GUS, CAT y polyA son idénticos a aquellos utilizados para las construcciones CmYLCV. Cap corresponde al fragmento de la base -227 a la base +33 de la caja TATA (base 7175 a base 7438 del genoma CaMV, ver NR de acceso GenBank V00141) y CapS corresponde al fragmento de la base -227 a la base +82 de la caja TATA (base 7175 a la base 7486 del genoma CaMV, ver NR de acceso GenBank V00141). Estas posiciones corresponden aproximadamente a las elegidas para los fragmentos CmYLCV. Ejemplo 4: Experimentos de expresión transitoria 1. Cultivos de suspensión y preparación del protoplasto Orychophragmus viola ceus . Los cultivos de suspensión se mantuvieron en 30 ml de un medio MS (Murashige and Skoog, Physiol Plant 15, 474-497, 1961) incluyendo 100 mg/ml de inositol, 2 % de sacarosa y 0.1 mg/ml de 2.4D. Los protoplastos se aislaron de los cultivos de 4- a 5- días de antigüedad. Las paredes celulares fueron digeridas a 26 °C durante 1 hora en 0.1 % de pectoliasa Y23 (Seishin Pharmaceutical Co., Japón), 1 % celulasa Onozuka RIO (Yakult Honsha Co., Japón), 0.4 M de D-manitol y 0.1 % MES, pH 5.5. Los protoplastos se filtraron a través de un tamiz de 50 µm y se lavó dos veces con una solución electroporación (EP) (10 mM HEPES, 150 mM NACÍ, 5 mM CaCl2, 0.2 M manitol, pH 7.1).

Ni cotiana ciruelabagini fol ia . Las plantas se mantuvieron en un cultivo axénico en un medio RPM2 (Blonstein et al., Mol Gen Genet 211, 252-259, 1988) más 7 g/1 de agar bacto, pH 5.6. Para la preparación de los protoplastos, se cortaron las hojas y se incubó durante la noche a 26 °C en una solución de 0.5 % de driselasa (Fluka), 0.25 mM de PVP 10 (polivinilpirrolidona PM 10,000), 3.85 mM CaCl2, 6 mg/l NAA, 2 mg/l BAP, y 0.5 M de sacarosa, pH 5.7. Los protoplastos se filtraron a través de un tamiz de 100 µm. La solución de sacarosa (0.6 M sacarosa, 0.1% MES, y 15 mM CaCl2, pH 5.7) se agregó a la suspensión del protoplasto para el primer paso de purificación, y la suspensión se reviste con una solución W5 (150 mM NACÍ, 125 CaCl2, 5 mM KCl, 6 mM de glucosa; Menczel et al., Theor Appl Genet 59, 191-195, 1981). Los protoplastos luego se lavaron una vez con una solución W5 y finalmente con una solución EP. Oryza sa tiva . Los protoplastos se prepararon de un cultivo en suspensión de arroz morfogénico determinados de O. Sa ti va cv. Nipponbare como se describe en Datta et al., 1990, Bio/Technology 8: 736-740). 2. Experimen to de expresi ón transi ti va . La transfeccion por electroporacion de 2x10° de protoplastos de Orychophragmus viola ceus en 0.66 ml en un regulador EP se llevó a cabo por medio de la descarga de un capacitar 960 µF a una distancia de 4 mm de la suspensión del protoplasto. El capacitor se carga con 450 Voltios. Se realizó la electroporación ante la presencia 5-10 µg de ADN plásmido, luego se cultivaron los protoplastos de 16 a 24 horas a 25°C. La transfeccion de protoplastos de Ni cotiana círuelabagínifolia 2xl0D en 0.3 ml de suspensión se llevó a cabo ante la presencia de 0.3 ml de PEG (40 % polietilenglicol 6000) y 5-10 µg de ADN plásmido. Los protoplastos se cultivaron en 04 ml de un medio K3 (Godall et al., Methods Enzymol 181, 148-161, 1990) de 16 a 24 horas a 25°C y se agregaron 10 ml de un regulador W5 antes de cosechar. Los extractos de proteina se prepararon en al menos tres ciclos de congelamiento y descongelamiento y se clarificó por centrifugado . Ejemplo 5: Ensayos CAT y GUS Para la detección de la expresión del gen CAT, se llevó a cabo el ensayo doble sandwich de anticuerpo (DAS) -ELISA usando un kit CAT ELISA (Boehringer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midió la actividad CAT con un aparato Dynex MRXII. Las muestras para el ensayo GUS se diluyeron en un regulador GUS (0.05 M NaP04, pH 7 , 0.01 m EDTA; 0.1% Triton-X-100 , 0.1% Sarkosyl). La reacción se llevó a cabo ante la presencia de una cantidad igual de un regulador de reacción GUS (100 ml/1 10 x regulador GUS, 200 mg/l BSA, 705 mg/l 4-metilumbeliferil-glucoronideo) a 37°C y se detuvo con 2 M de Ammediol. La actividad se midió en un Titertek Fluoroskan II. Ambos resultados de los ensayos CAT y GUS se normalizan en un valor de clon estándar. Los resultados obtenidos de diez experimentos diferentes muestran que varios fragmentos del promotor CmYLCV funcionan como promotores altamente activos.

Expresión transitoria del protoplasto de N. Ciruelabagino folia Gen reportero GUS Gen reportero CAT Expresión transitoria del protoplasto de O. víola ceus Gen reportero GUS Gen reportero CAT Expresión transitoria del protoplasto de O. Sa tiva Gen reportero GUS Ejemplo 6: Preparación de las soluciones y medios para la regeneración y transformación de la planta Los medios de cultivo GM, CIM y SIM son los medios descriptos por Valvekens et al (1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 85: 5536-5540) . El medio de cultivo GM contiene las sales minerales de Murashige y Skoog (1962, Pysiol. Plant. 15: 473-497), 1.0 mg/l de tiamina (muestra 1 mg/ml), 0.5 ml/1 de piridoxina HCl (muestra 1 mg/ml), 0.5 mg/l ácido nicotinico (muestra 1 mg/ml), 0.5 g/1 ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES), 10 g/1 de sacarosa, 8 g/1 de agar, con el pH en 5,8 ajustado con 1 N KOH. CIM contiene las saies minerales y vitaminas del medio B5 (Gamborg et al., 1969, Exp. Cell Res 50: 151-158), 0.5 g/1 de ácido 2 (N-morfolino) etanosulfónico (MES), 20 g/1 de glucosa, 0.5 mg/l ácido 2, 4diciorofenoxiacético (2.4-D) (muestra 10 mg/ml en DMSO), 0.05 mg/l cinetina (muestra 5 mg/mi en DMSO), pH 5.8. El medio CIM sólido contiene 8 g/1 de agar. SIM contiene las sales minerales y vitaminas del medio B5 (Gamborg et al., 1968, supra), 0.5 g/1 de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES), 20 g/1 de glucosa, 5 mg/l de N6- (2-isopentenil) adenina (2iP) (muestra 20 mg/ml en DMSO), 0.15 mg/l de ácido indol-3-acético (IAA) (muestra 1.5 mg/ml en DMSO), 8 g/1 de agar, pH 5.8. SIM V750 K100 es an medio SIM sup.l ementado con 750 mg/l vancomicina y 100 mg/l de kanamicina. SIM V500 K100 es un medio SIM suplementado con 500 mg/l vancomicina y 100 mg/l kanamicina.- GM K50 es un medio GM suplementado con 50 mg/l de kanamicina. •t Los medios de cultivo se esterilizan por medio dei autoclave (20 min, 121 °C) . Las vitaminas se disuelven en agua y se agregan al medio antes del autoclave. Las hormonas se disolvieron en dimetil sulfóxido (DMSO) . Los antibióticos se disolvieron en agua y se esterilizaron por filtración (0.22 µm? . Las hormonas y antibióticos se agregaron después del autoclave y enfriando el medio a 65°C. En todos los casos, se utilizaren las placas Petri de 9 cm (Falcon, 3003), excepto por GM y GM K50 que usualmente se vertió en placas Petri de 15 cm (Falcon, 3025) . Las placas con un medio solido se secaron antes de usar en un flujo laminar para remover el condensado. Ejemplo 7: Cepa Arab±dops±s y condiciones de crecimiento Las semillas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia (Col-0) del tipo silvestre son comercializadas por Lehle Seeds, USA (1102 South Industrial Blvd. Suite D, Round Rock TX 78681, USA) . Las plantas se desarrollaron a 22 °C en ciclos de 16/8 horas luz/oscuridad en macetas con una mezcla de 4 partes de arena, 4 partes de tierra y 1 parte de agplit . Ejemplo 8: Cepa Ag-COJacterium y cultivo Se introdujeron los plásmidos de vector en un recipiente con Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404 (Clontech) por medio del apareamiento triparental de acuerdo con el protocolo descppto por Walkerpeach y Velten ( "Agrobactepum-mediated gene transfer to plant cells- Cointegrate and bmary vector systems 'J ("Transferencia del gen mediado por Agrobacterium a las células de las plantas: sistemas de co-íntegrado y vector binario" en: Plant Molecular Biology Manual (Manual de biología molecular en plantas), Bl: 1-19, 1994. Editor: S. B. Gelvín, R. A., Schilperoort , Kluvers Acad. Publishers.). La cepa movilizadora utilizada es E.

Coli HB101 que ancla al plásmido de conjugación pRK2013 (Ditta et al., 1980, Broad host range DNA cloning system from Gram-negative bacteria. Construction of gene bank of Rhi zobi um meliloti (Sistema de clonación de AND en un rango amplio de huéspedes de bacterias gram negativas. Construcción del banco de genes de Rhi zobí um meli l oti) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351). La agrobacteria utilizada para la transformación de raíz se desarrolla en un medio LB (Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning" (Clonación molecular) , Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) sin antibióticos a 28 °C y 200 rpm. Ejemplo 9: Esterilización de semilla Las semillas se colocan en 70 % EtOH/0.05 % Tween durante 1 minuto en un tubo Eppendcrf de 2 ml . Se removió 70 % EtOH/0.05 % Tween 20 con una pipeta y se reemplazó con 5 % NaOCl/0.05 % Tween 20 durante 15 minutos. Las semillas se agitaron regularmente. La solución se removió en condiciones estériles y las semillas se lavaron en agua destilada estéril 3 veces durante 10 minutos cada vez. Después del último lavado, las semillas se mantuvieron en 0.5-1 ml de agua. Las semillas se pueden usar inmediatamente o se almacenan a 4 °C durante dos-tres semanas. Las semillas esterilizadas (20-30) se transfieren con fórceps al medio GM en placas Petri 15 cm. Las plántulas se desarrollan en placas colocadas verticalmente en una cámara de crecimiento (22 °C; ciclo de 16/8 horas luz/oscuridad). Ejemplo 10: Transformación de explantes de raiz de Arab±dops±s thalíana Se utilizaron raíces de plántulas de tres semanas de antigüedad en el procedimiento de transformación. Las raíces no deben estar verdes o marrones. Las partes verdes de las plántulas se removieron con un escalpelo y fórceps. Las raices restantes se recogieron y se colocaron aproximadamente 5 sistemas radiculares completos por placa con un medio CIM sólido. Se presionaron suavemente las raices sobre la superficie de la placa para asegurarse el contacto completo con ei medio, pero no se deben sumergir en el agar. Las raíces se incubaron durante tres días en una cámara de crecimiento (22 °C; ciclo de 16/8 horas luz/oscuridad) . Las raíces luego se transfirieron a una placa Petri estéril con filtro de papel humedecido con un medio CIM líquido y se cortaron con un escalpelo en piezas de 0.5-1 cm. Los explantes de raíz luego se transfirieron a un tubo Falcon estéril de 50 ml que contiene 10 ml del medio CIM líquido. A esto, se agregaron 0.5 ml de un cultivo de Agroba cteri um durante la noche (OD 0.6-1) y se incubó durante 1-2 minutos mientras se agitaba suavemente. El líquido se vertió en el tubo pasándolo a través de tamices de metal estériles (malla 50, Sigma, S-0895), que se sostuvo con un fórceps. Las raíces usualmente permanecen en la pared del tubo cerca de su borde. Luego, los explantes de raíz se transfieren a una placa Petri estéril con filtro de papel y brevemente, se transfirió seco para remover el exceso de liquido. Los explantes de raíz se colocan en placas con un medio CIM sólido y se incuban en una cámara de crecimiento durante 2 días bajo una luz tenue (1.5-2 klux) . Se deben observar, después del período de co-cultivo, señales leves de proliferación de Agroba cteri um . Los expiantes de raiz luego se transfieren a tubos Falcon estériles de 50 ml con 20 ml de un medio CIM líquido suplementado con 100 mg/l de vancomicina. Los tubes Falcon luego se sometió al efecto vórtice suavemente para remover la Agroba cteria . Se vierte ei líquido fuera dei tubo como describimos anteriormente y los explantes se transfirieron secos sobre un papel de filtro. Los expiantes luego se transfieren a placas que contienen un medio SIM V750 K100. Las raíces deben estar en contacto con el medio. Se incuban los explantes en una cámara de crecimiento en condiciones normales durante una semana y luego se transfieren a un medio SIM V500 K100 y se incuban durante una semana adicional. Luego, se reduce la cantidad de vancomicina a 250 mg/l. Deben aparecer las primeras raíces al final de la tercer semana de cultivo en el medio SIM. Las raíces se cortan cuando tienen 0.3-0.5 cm de largo, se remueve todo callo residual y las raices se transfieren a placas de 15 cm que contienen el medio GM K50. Se colocan, como máximo, 3 raíces por placa. Para obtener más raices, los explantes de raíz restantes se pueden transferir a placas SIM frescas suplementadas con 125 mg/l de vanccmicina y 100 mg/l de kanamicina durante dos semanas adicionales. os brotes de las raíces se pueden transferir a la tierra para arraigar. Los brotes que no formaron raíces se transfieren a recipientes Magenta (uno por recipiente) que contiene un medio GM para producir las semillas in vitro. Las semillas de las plantas transgénicas individuales se germinan en un me io GM K50 en una cámara de crecimiento durante 2 semanas. Las plántulas resistentes a la kanamicjna fenotipícamente normales, que conforman las hojas verdes y el sistema de raíces ramificadas, se seleccionan para los análisis posteriores. Ejemplo 11: Ensayo de histoquimico ß-glucuronidasa (GUS) Las pl ntulas desarrolladas in vitro o las plantas desarrolladas en tierra, se utilizan en los ensayos GUS. Tanto las plántulas completas u órganos diseccionados se sumergen en una soiución de manchado GUS. La solución de manchado GUS contiene 1 mM 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucoronídeo (X-Gluc, Duchef , 20 mM muestra en DMSO), 100 mM de un regulador de Na-fosfato pH 7.0, 10 mM EDTA pH 8.0, y 0.1 % Tritón XlOO. Las muestras de tejido se incuban a 37 °C durante 1-16 horas. Si fuera necesario, las muestras se pueden clarificar con varios lavados de 70% ETOH para remover la clorofila. Ejemplo 12 : Construcción del vector de transformación del tabaco pZU627 Todas las reacciones PCR se llevaron a cabo con polimerasa de ADN Platinum Pfx (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 1. Amplificación y clonación del terminador NOS El terminador NOS se amplifica de pBIN19 (Bevan et al 1984) usando el cebador directo del terminador NOS (NR ID de SEC: 21) y el cebador inverso del terminador NOS (NR ID de SEC: 22) . EL cebador directo se modifica para que contenga un sitio Pstl y el cebador inverso se modifica para que contenga un sitio Hindl. El producto para la amplificación del terminador NOS se clona como un fragmento Pstl/Hindl en los mismos sitios del pBluescript (Stratagene) resultando en un plásmido pZU400A. 2. Amplificación y clonación del virus del gen de la proteina de la nucleocápside bronceado del tomate (TSWV NP) Para poder obtener un gen TSWV NP no traducible, se utilizan los cebadores del gen TSVW NP modificado usado para amplificar al gen TSWV NP. El cebador directo del gen TSWV NP introduce un codón BamHl, Sphl, un codón de iniciación y un condón stop (NR ID de SEC: 23) . El cebador inverso se modifica para introducir un sitio Pstl (NR ID de SEC: 24) . EL producto de la amplificación se clona como un fragmento BamHl/Pstl en el sitio BamHl/Pstl corriente arriba de pZU400A y en la misma dirección a la del termmador NOS. En el clon pZU400b resultante, el sitio Pstl entre el gen TSWV NP y el terminador NOS se remueve usando un tratamiento con polimerasa de ADN T4 (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Del clon resultante denominado pZU40OC, el gen TSWV NP y el termmador NOS se clonan como fragmento Sphl/Hmdlll en el sitio Sphl/Hmdlll del vector de clonación ambivalente ("shuttle") pZO1560 resultando en el plásmido pZU400. pZO1560 es un derivado pBluescppt donde el sitio de multiclonación original se reemplaza por el sitio de multiclonacion AGLINK (NR ID de SEC: 27). 3. Amplificación V clonación del promotor CmYLCV El promotor viral CmYLCV se amplifica usando el cebador directo del promotor CmYLCV (NR ID de SEC: 25) y el cebador inverso del promotor CmYLCV (NR ID de SEC: 26) . El cebador directo se modifica para que contenga un sitio Sstl y el cebador inverso se modifica para que contenga un sitio Pstl. El promotor viral CmYLCV amplificado se clona como fragmento Sstl/Pstl, en la misma dirección que y corriente arriba del gen TSWV-N, en el sitio Sstl/Pstl de pZU400. Esto produce un clon pZU625 que contiene un cassette de gen viral que produce un ARN TSWV NP no traducible. 4. Clonación del cassette del gen viral en pVictorHiNK El cassette del gen viral se clona como el fragmento Ascl/Pacl de pZU625 en el sitio Ascl/Pacl de pVictorHiNK vector pZU494. Éste resulta en el vector de transformación de la planta pZU627. pVictorHiNK es un vector binario que comprende un origen de replicación (ORÍ) derivado del plásmido pVSl de Pseudomonas aeruginosa que se sabe que es altamente estable en A . Tumefaciens (ltoh et al., 1984. Plasmid (Plásmido) 11:206-220; ltoh and Haas, 1985. Gene (Gen) 36; 27-36) . El ORÍ pVSl es solamente funcional en Agroba cteri um y puede ser movilizado mediante el plásmido auxiliar pRK2013 de E. Coli en A . Tumefa ciens por medio de un procedimiento de apareamiento triparental (Ditta et al . , 1980. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351). Este vector binario también comprende un origen de replicación ColEl que es funcional en E . Coli y derivado de pUC 19 (Yannisch-Perron et a l . , 1985 Gene (Gen) 33: 103-119).

Para mantenerse en E . Coli y A . Tumefa ciens , este vector contiene un gen de resistencia bacteriana a la espectomicina y estreptomicina codificado por un gen de 0.93 kb de transposón Tn7 (Fling et al., 1985. Nuci. Acid Res. 13:7095) que funciona como un marcador de selección para el mantenimiento del vector en E . Coli y A . Tumefa ci ens . El gen se fusiona al promotor tac para la expresión bacteriana eficiente (Ammán et al., 1983. Gene (Gen) 25: 167-178). Los fragmentos de bordes de T-ADN derecho e izquierdo de 1.9 kb y 0.9 kb, respectivamente, que comprenden las repeticiones de bordes de 24 bp, son derivados del plásmido Ti del tipo de la nopalina las cepas de A . Tumefa ciens pTH37 (Yadev et al., 1982. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 79:6322-6326). Subsiguientemente, la región de T-ADN entre los bordes se modifica mediante la eliminación de las secuencias M13 derivadas y, para mejorar su versatilidad de clonación, el sitio BIGLINK de multiclonación (NR ID de SEC: 28) se introduce produciendo el pVictorHiNK. El pVictorHiNK contiene un cassette de gen NPTII para la selección de transformantes durante el proceso de transformación de la planta. El cassette de gen contiene un promotor NOS, el gen NPTII y un terminador NOS, obtenido de A . Tumefa ciens . Ejemplo 13 : Transformación de la planta y clasificación para la resistencia 1. Transformación de vectores binarios a material de la planta Los métodos para transferir vectores binarios en material de la planta son bien conocidos y establecidos para una persona versada en el arte. Existen variaciones en los procedimientos debidos, por ejemplo a diferencias en las cepas de Agroba cteri um usadas, fuentes diferentes de material de explante, diferencias en sistemas de regeneración que dependen tanto del trabajo del suelo como de la especie de planta utilizados. Se usa el vector binario pZU627 en experimentos de transformación de plantas de acuerdo a los siguientes procedimientos. PZU627 es transferido mediante apareamiento tri-parental a una cepa aceptora de Agroba cteri um tumefa ciens , seguido por un análisis Southern Blot de los exconjugantes para la verificación de la transferencia apropiada de la construcción de la cepa aceptora, la inoculación y el co-cultivo del material axénico del explante con la cepa recombinante de Agroba cteri um tumefa ciens , la eliminación selectiva de la cepa de Agroba cteri um t umefa ci ens usando los antibióticos apropiados, la selección de las células transformadas mediante el crecimiento en un medio selectivo que contiene kamamicina, la transferencia de piantines a la tierra, la prueba para comprobar la integridad del T-ADN integrado por medio del análisis Southern Blot del ADN cromosómico aislado de la planta . 2. Resistencia de las plantas contra las infecciones de TSWV Las plantas transformadas se cultivan en un vivero bajo condiciones estándar de cuarentena con el propósito de prevenir cualquier infección de patógenos. En una etapa de cuatro hojas, las plantas son infectadas con TSWV por inoculación mecánica. El tejido de las plantas infectadas sistemáticamente con TSWV se trituran en 5 volúmenes de una solución reguladora de inoculación de hielo seco (solución reguladora de fosfato 10 mM suplementada con Na2S03 al 1%) y frotó con presencia de polvo de carborundo sobre las primeras dos nuevas hojas plenamente extendidas. Las plantas inoculadas se monitorean en cuanto al desarrollo de sintomas durante tres semanas luego de la inoculación. Las plantas que contienen las secuencias pZU627 no muestran sintomas de TSWV, mientras que las plantas de control no transformadas presentan síntomas sistémicos severos de TSWV dentro de los 7 días luego de la inoculación. Las plantas resistentes se autopolinizan y las semillas se recolectan. Las plantas de la progenie se analizan para la segregación del gen insertado y subsiguientemente se vuelven a clasificar en cuanto la resistencia contra la infección de TSVVV como se describió más arriba. Ejemplo 14: Construcción de las construcciones Cmp- fosfomanosa isomerasa-nos para la transformación de la planta El promotor CmpS es amplificado por PCR utilizando los cebadores Cmpf-B (cgc gga tec tgg cag acá aag tgg cag a; NR ID de SEC: 29) y el CmpS-B (cgc gga tec tac ttc tag gct act tg, NR ID de SEC: 30) que tienen sitios de flancos BamHl. El fragmento resultante de PCR se clona dentro del sitio BamHl -de pBluescript KS (+) para formar pNOV4211. Para crear un vector binario para la transformación por medio de Agroba cterí um tumefaciens , el promotor CmpS se corta desde pNOV4211 utilizando BamHl y se inserta corriente arriba en BamHl digerido pNOV2804 (NR ID de SEC: 31) del gen PMI, y el vector resultante se llama pNOV2819. pNOV2804 (NR ID de SEC: 31) es un vector binario con origen VS1 de replicación, una copia del gen Agroba cteri um virG en la cadena principal y un cassette terminador de expresión sin el promotor PMI-nos entre los bordes izquierdo y derecho de T-ADN. PMI (fosfomanosa isomerasa) es la región codificadora del gen E. Col i manA (Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16:219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19:798-803) . El terminador nos (nopalína sintasa) se obtiene del T-ADN de Agroba cteri um tumefa ciens (Depicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573. La región codificadora de la fosfanosa isomerasa y el terminador nos se localizan en nt 290 a nt 1465 y nt 1516 a 1789 respectivamente, del nov2804 (NR ID de SEC: 31) . Para crear un vector para la transformación biolistica, el promotor CmpS es escindido a partir de pNOV4211 usando BamHl e insertado en pNOV3604 BamHl digerido (NR ID de SEC: 32) para formar pNOV2820, creando asi un cassette PMI de expresión dirigido por el promotor CmpS. El pNOV3604 es un vector para preparar fragmentos biolisticos y se basa en pUC19 con un origen ColEl de replicación y un gen de beta lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina. Como el pNOV2804, el pNOV3604 también contiene un cassette terminador de expresión sin el promotor PMI-nos (ver más arriba) . La región codificadora de la fosfomanosa isomerasa y el terminador nos se localizan en nt 42 a nt 1217 y nt 1268 a 1541 respectivamente, del pNOV3604 (NR ID de SEC: 32) . El vector binario pNOV2819 se utiliza para la transformación por medio del Agroba cteri um tumefa ciens y el vector pNOV2820 se usa para la transformación biolistica. Ejemplo 15: Construcción de los plásmidos CmpC-GUS para la expresión estable ±n planta . 1. Construcción del vector binario El vector pcambia 1302 (Cambia, Canberra, Australia; Roberts, C.S., Ra agopal, S., Smith, L., Nguyen, T., Yang, W., Nugroho, S., Raví, K. S. Cao, M. L., Vijayachandra, K. , et al . , A comprehensive set of modular vectors for advanced manipulation and efficient transformation of plants (Un grupo amplio de vectores modulares para la manipulación avanzada y la transformación eficiente de plantas) . Presentado en el Encuentro de la Fundación Rockefeller del Programa Internacional de la Biotecnología del Arroz, Malaca, Malasia, Septiembre 15-19, 1997) se elige y se modifica para los experimentos: El promotor CAMV 35S en frente del gen GFP se remueve por medio de la digestión a la posición 9788 con endonucleasa Hindilll y a la posición 1 con endonucleasa Ncol y el vector es relegado a los dos extremos compatibles. La digestión con endonucleasa Xhol a las posiciones 7613 y BstXl a la posición 9494 escinde el gen de higromicina y el promotor CaMV 35S en frente de él. Las secuencias del promotor 35S se eliminan del vector para evitar cualquier riesgo de silenciado del gene mediado por homología. El gen bar dirigido por el promotor 1' (Mengiste et al., Plant J, 1997, 12(4): 945-948) se introduce en el sitio EcoRI en la posición 9737 como un marcador seleccionaba. El vector obtenido se denomina pCamBar. 2. Construcciones producidas Los cassettes CmpCG y CapG descritos en el Ejemplo 3 se insertan en el vector pCamBar entre el sitio Xbal en la posición 9764 y EcoRI en la posición 9737 para obtener los plásmidos pCamBarCmpCG y pCamBarCapG, respectivamente. Las dos construcciones se usan para transformar las células de Agrobacteri um tumefaciens , Ejemplo 16: Expresión estable en Arabidopsis thaliana 1. Producción y transfección de plantas Se siembran semillas de Arabidopsis thaliana wt . (Columbia 0), tratadas con frío durante 3 días a 4°C en la oscuridad para sincronizar la germinación y se transfieren a la cámara de crecimiento (22°C/24 horas con luz). Las plantas germinadas se infiltran cuando han producido un máximo número de brotes sin abrir. La infiltración se lleva a cabo de acuerdo al protocolo descripto por Clough y Bent, Plant J. 16: 735-743, 1987. 2. Selección de las plantas transqénicas Las plántulas obtenidas por la generación TI de semillas se seleccionan mediante la pulverización con herbicida BASTA (Plúss-Staufer AG/SA) (150 mg/l) cada cinco días, tres veces.

Veinte plantas resistentes pCamBarCmpCG y nueve pCamBarCapG se recogieron luego de la selección. Éstas crecieron bajo las condiciones descritas para obtener las semillas de la generación T2. Estas semillas se sometieron al mismo procedimiento como se describió más arriba para el wt, las plántulas T2 son seleccionadas por la pulverización con BASTA, y los mutantes resistentes se analizaron por expresión de gen GUS. 3. Expresión histoquímica GUS en plantas estables transformadas de Arabidopsis El manchado histoquímico GUS se realizó como se describe en el Ejemplo 11. El análisis se llevó a cabo en tubos de cultivo de 15 ml por inmersión de las plántulas transformadas en una solución de X-gluc, se aplicó una presión de 130 mbar durante 10 minutos y se incubó a 37°C durante la noche. Los resultados obtenidos de las plantas de Arabidopsis transformadas con pCamBarCmpG indican una expresión constitutiva del gen reportero GUS dirigido por el promotor CmpC en todos los órganos vegetativos. 4. Ensayos cuantitativos enzimáticos de GUS en plantas estables transformadas de Arabidopsis A. Preparación de las muestras Se seleccionaron para la prueba cuatro plantas por linea transgénica y una hoja por cada una de esas plantas. Las cuatro hojas se recogieron en el mismo tubo eppendorf, congeladas con nitrógeno líquido y molidas a un polvo fino con los molinos disponibles. Esto se diluyó en 150 µl de solución reguladora de GUS (NaP04 0.05 M, pH 7, EDTA 0.01 M, Triton-X-100 0.1 %, Sarkosyl 0.1 %), se incubó 5 minutos a 37°C y se revolvieron en una microcentrífuga durante 5 minutos a velocidad máxima. Se transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf y estas muestras se usan para la prueba enzimática. Las proteínas en los extractos de estas plantas se estiman, de acuerdo al método Bradford (Bradford, M. M. Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976) usando BSA como un estándar. La presencia del promotor y el gen GUS en las líneas de mutantes se confirmaron mediante el análisis de PCR usando las muestras extractadas como patrones. B. Ensayo fluorométrico de GUS El ensayo fluorometrico de GUS se realiza como se describió en el Ejemplo 5. Para la detección del gen GUS, las muestras de expresión se diluyen en una solución reguladora GUS. La reacción se lleva a cabo ante la presencia de una cantidad igual de solución reguladora de reacción de GUS a 37°C y se detiene con Am ediol 2M. Se mide la actividad en un Titertek Fluoroskan II. Quince de las veinte lineas seleccionadas transformadas con pCamBarCmpCG y ocho de nueve líneas transformadas con pCamBarCapG, mostraron actividad enzimática GUS en las hojas.

El nivel de actividad en varias lineas transformadas con CmpCG es comparable al de CapG. Sin embargo los resultados son variables para las diferentes lineas transgénicas debido a las diferencia en sus genotipos (numero de locus y número de inserciones transgénicas por locus). Ejemplo 17 : Construcción de las variantes promotores CmpC Todas las reacciones de PCR se llevan a cabo con polimerasa Pfu (Stratagene) como se describió en el Ejemplo 1. 1. Amplificación y clonación del ADN Se produjeron las dos variantes, pCmpMG y pCmpMsG, del plásmido pCmpCG (Ejemplo 3) . La primera elimina la secuencia "GTGGTCCC" en el promotor CmpC y la última produce su mutación a la secuencia "GTGCTCGC" . Para obtener pCmpMG, se amplifican tres productos de PCR: CmpMl utilizando el cebador Cmpl directo (ver Ejemplo 3, NR ID de SEC: 13), el cebador CmpMr inverso (CCATCGTGGTATTTGGTATTG, NR ID de SEC: 33) y el plásmido pCmpCG como matriz. CmpM2 utilizando el cebador CmpMf directo (CAATACCAAATACCACATGG; NR ID de SEC: 34), el cebador CmpC2 inverso (ver Ejemplo 3; NR ID de SEC: 14) y el plásmido pCmpCG como matriz. CmpM usando el cebador Cmpl directo, el cebador CmpC2 inverso y una mezcla equimolar de los productos de PCR, CmpMl y CmpM2 como matriz. Para obtener el pCmpMsG tres productos de PCR son amplificados : CmpMsl utilizando el cebador Cmpl directo, el cebador CmpMrs inverso (CGTGGTAGCGAGCACTTTGGT, NR ID de SEC: 35) y el plásmido pCmpCG como matriz.

CmpMs2 usando el cebador CmpMfs directo, (AAGTGCTCGCTACCACGATGG, NR ID de SEC: 36), el cebador Cmp2 inverso y el plásmido pCmpCG como matriz. CmpsM usando el cebador Cmpl directo, el cebador Cmp2 inverso y una mezcla equimolar de los productos de PCR CmpMsl y CmpMs2 como matriz. Para obtener los plásmidos pCmpMG y el pCmpMsG el plásmido original mCmpCG se restringe con endonucleasas Xbal y BamHl para eliminar el fragmento CmpC y para insertar en lugar de éste los productos de PCR CmpM y CmpMS . Ejemplo 18: Experimentos de expresión transitoria con las construcciones de pCmpM y pCmpMs 1. Cultivos de suspensión y preparación del protoplasto Los cultivos de suspensión y los protoplastos se producen como se describe en el Ejemplo 4. 2. Ensayos GUS La transfección y la preparación de los extractos de proteínas se realizan como se describió en el Ejemplo 4, y el ensayo GUS se lleva a cabo como se describe en el Ejemplo 5. Los resultados del ensayo GUS se obtienen a partir del promedio de diez experimentos diferentes y se normalizan a un valor de clon estándar. La eliminación de la secuencia "GTGGTCCC" en la construcción CmpCG reduce la expresión del gen reportero GUS a alrededor del 50% de la expresión del gen reportero GUS del CmpC en todas las especies de protoplastos (ver más abajo) . El efecto inducido por la mutación "GTGCTCGC" depende de las especies de plantas. En los protoplastos de 0. vi olaceus y 0. sa ti va el nivel de la expresión del gen GUS está disminuida en 65.2¿ y 73.6 respectivamente. En los protoplastos de N. pl umbagi ni fol i a la actividad del promotor CmpMs es similar a la del promotor CmpM. ?. piumbaginifolia O. violaceus O. sativa Ejemplo 19: Construcción de los vectores de transformación de plantas que contienen los fragmentos del promotor 5' enlazados operativamente a los genes reporteros GFP o GUS 1. Amplificación y clonación del promotor Se construye un gen quimérico de manera que incluya una secuencia de ADN del promotor de transcripción CmYLCV de longitud completa (NR ID de SEC: 1) fusionado al GFP de la planta optimizado con el intrón (synGFPI, NR ID de SEC: 37) o el gen reportero GUS con la secuencia del intrón (GIG; NR ID de SEC: 38) . El gen GIG contiene al intrón ST-LS1 deL Solanum tuberosum entre nt 385 y nt 576 del NR ID de SEC: 38 (obtenido de Dr . Stanton Gelvin, Purdue University, y descrito en Narasimhulu, et al 1996, Plant Cell (La Célula de la Planta), 8: 873-886). SynGFPI es un gen GFP de planta optimizado en el que se introduce el intrón ST-LS1 (nt 278 a nt 465 de NR ID de SEC: 37) . Para los promotores, se usa el ADN CmYLCV genómico como una matriz para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los cebadores genéticos específicos se designan para amplificar la secuencia de ADN. Un fragmento de gen correspondiente a CmpC (NR. ID de SEC: 2) se aisla usando un cebador Cmpf-B directo (NR ID de SEC: 29) en combinación con los cebadores 5' a 3' CGCGGATTGCTCCCTTAACAATGAGG (NR ID de SEC: 39) como cebador inverso. Un fragmento de gen correspondiente a CmpS (NR ID de SEC: 3) se aisla utilizando el cebador Cmpf-B (NR ID de SEC: 29) hacía delante en combinación con el cebador CmpS-B inverso (NR ID de SEC: 30). Estos tres cebadores contienen el sitio BamHl de reconocimiento de la enzima de restricción CGCGGA en su terminación 5' . Todas las reacciones PCR se llevan a cabo con la polimerasa Pfu de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes (Stratagene). Se utiliza un termociclador (DNA Engine, MJResearch, Inc. Waltham, MA USA) para amplificar los fragmentos del promotor usando las siguientes condiciones de PCR: [(94°C: lOs): (94°C: 10s/ 56°C: 30s/72°C:lmin)x2O] : (72 °C-1.5m) ] . Luego de la digestión de la restricción con BamHl, los fragmentos del promotor son enlazados dentro de los vectores basados en pUC con el gen GIG o el gen synGFPI para crear las fusiones promotor-gen reportero enlazadas operativamente con el terminador nos. 2. Cassettes producidos promotor-reportero • Fragmento promotor CmpS + gen synGFPI + nos (NR ID de SEC: 40' Fragmento promotor CmpS + gen GIG + nos (NR ID de SEC: 41' • Fragmento promotor CmpC + gen synGFPI + nos (NR ID de SEC: 42) • Fragmento promotor CmpC + gen GIG + nos (NR ID de SEC: 43) 3. Subclonación dentro del vector binario de Agrobacterium Los cassettes promotor-reportero (NR ID de SEC: 40 a 43) que contienen el fragmento del promotor, el gen reportero y el terminador nos se insertan dentro del vector binario pNOV2117 para la transformación de maiz y el vector binario pNOV4200 para la transformación de tomate. El pNOV2117 (NR ID de SEC: 44) es un vector binario con origen de replicación VSl, una copia del gen de Agroba cteri um virG en la cadena principal, y un cassette de expresión promotor de Ubiquitma del Maíz-gen PMI-terminador nos entre los bordes izquierdo y derecho del T-ADN. PMI (fosfomanosa isomerasa) es la región codificadora del gen manA de E . coli (Joersbo and Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16: 219-221, Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803). El terminador nos (nopalina sintasa) se obtiene del T-ADN del Agroba cteri um tumefa ci ens (Depicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573). El promotor de ubiquitina del maíz, la región codificadora de la fosfomanosa isomerasa y el terminador nos se localizan en nt 31 a nt 2012, nt 2109 a nt 3212 y nt 3273 a 3521 respectivamente, del pNOV2117 (NR ID de SEC: 44) . Los cassettes reportero-promotor se insertan cercanos al borde derecho. El cassette del marcador de expresión seleccionable en los vectores binarios está cercano al borde izquierdo. Para la transformación de tomate, se utiliza como vector binario el pNOV4200 (NR ID de SEC: 45), que contiene el origen de replicación VSl, una copia del gen virG del Agroba cteri um en la cadena principal, y un cassette de higromicina de marcador seleccionable entre las secuencias de los bordes izquierdo y derecho. El cassette del marcador seleccionable de higromicina comprende al promotor Arabidopsis Ubiquitina 3 (Ubq3(At), Callis et al., J. Biol.

Chem. 265: 12486-12493 (1990)) enlazado operativamente ai gen que codifica la resistencia a la higromicina (nombrado aquí como "HYG", gen sintético de higromicina B fosfotransferasa del E. coli , Patente: JP 1986085192-A 1 30-ABR- 1986) y el terminador nos (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1(6), 561-573 (1982). El promotor de Arabidopsis ubiquitina, el gen HYG y el terminador nos están ubicados en nt 162 a nt 11494, nt 1897 a nt 2939 y nt 2939 a nt 3236, respectivamente del pNOV4200 (NR ID de SEC: 45) . Los cassettes reportero-promotor (NR ID de SEC: 40 A 43) se insertan lo más cerca posible del borde derecho. El cassette seleccionaba del marcador de expresión en los vectores binarios está lo más cerca posible del borde izquierdo. Se muestran, más adelante, las orientaciones del marcador seleccionaba y de los cassettes promotor-reportero en las construcciones de los vectores binarios. . Construcciones de los vectores binarios • NOV4215 (fragmento promotor RB CmpS + gen synGFPI + nos - ZmUbi + gen PMI + nos LB) • NOV4216 (RB nos + gen synGFPI + fragmento del promotor CmpS - ZmUbi + gen PMI + nos LB) • NOV4217 (fragmento promotor RB CmpS + gen synGFPI + nos - Ubq3(At) + gen HYG + nos LB) • NOV4220 (fragmento promotor RB CmpS + gen GIG + nos -Ubq3(At) + gen HYG + nos LB) • NOV4224 (fragmento promotor RB CmpC + gen GIG + nos - ZmUbi + gen HYG + nos LB) • NOV4226 (fragmento promotor RB CmpC + gen synGFPI + nos - ZmUbi + gen PMI + nos LB) Se construyen cassettes adicionales con los promotores conocidos para ser usados como comparación. Para este fin, se construye un cassette de promotor, término ZmUbi-GFP-35S (NR ID de SEC: 46) que comprende al promotor de ubiquitina del maíz (Christensen et al. Plant , Molec. Biol. 12: 619-632 I (1989)) enlazado operativamente con synGFP y el terminador 35S (término 35S) y también se construye un cassette de promotor que comprende el promotor de ubiquitina del maíz operativamente enlazado con el gen GIG y el terminador nos (NOV 3612, NR ID de SEC: 47) . El promotor ZmUbi, el gen GFP y el terminador 35S, se ubican en nt 1 a nt 2019, nt 2020 a nt 2751 y nt 2876 a nt 2949, respectivamente del NR ID de SEC: 46. El promotor ZmUbi, el gen GIG y el terminador nos, se ubican en nt 1 a nt 1982, nt 2015 a nt 4015 y nt 4069 a nt 4341, respectivamente del NR ID de SEC: 47. El cassette ZmUbi-GIG nos (NR ID de SEC: 47) se clona dentro del vector basado en pUC. El cassette ZmUbi-GFPnos (NR ID de SEC: 46) se clona dentro del vector binario pNOV2117 para la transformación de maíz, como se describió más arriba. Se construyen los cassettes de promotor que comprenden el promotor de Arabidopsis Ubiquitin3 (Ubq3(At)) enlazado operativamente al synGFPI y el terminador nos (NR ID de SEC: 48) y el promotor Arabidopsis Ubiquitin3 operativamente enlazado al gen GIG y al terminador nos (NR ID de SEC: 49) . El promotor Ubiquitin3, el synGFPI y el terminador nos, se ubican en nt 1 a nt 1332, nt 1738 a nt 2658 y nt 2670 a nt 2943, respectivamente del NR ID de SEC: 48. El promotor Ubiquitin3, el gen GIG y el terminador nos, se ubican en nt 1 a nt 1335, nt 1746 a nt 3746 y nt 3800 a nt 4072, respectivamente del NR ID de SEC: 49. Como se describió anteriormente, los cassettes de promotor se clonan dentro del vector binario pNOV4200 que contiene el cassette de marcador seleccionable de higromicina para la transformación de tomate. Se muestran más abajo las orientaciones de los marcadores seleccionables y los cassettes promotor-reportero en las construcciones de los vectores binarios. 5. Construcciones de vectores binarios • NOV2110 (Promotor RB ZmUbi + gen synGFP + terminación 35S - ZmUbi + gen PMI + nos LB) • NOV4209 (promotor RB Ubq3(At) + gen synGFPI + nos -Ubq3(At) + gen HYG + nos LB) • NOV4208 (promotor RB Ubq3(At) + GUS - intrón - gen GUS + nos - Ubq3(At) + gen HYG + nos LB) Ejemplo 20: Transformación del maiz mediada por Ag-ro-ba cterl um La transformación de embriones inmaduros de maiz se realiza esencialmente como se describe en Negrotto et al., (2000) Plant Cell Reports 19:798-803. Para este ejemplo, todos los constituyentes del medio son los descritos en Negrotto et al., supra . Sin embargo, algunos de los constituyentes del medio descritos en la literatura, pueden sustituirse . 1. Plasmados de transformación y marcador seleccionable Los genes utilizados para la transformación se clonan dentro de un vector apropiado para la transformación de maíz como se describe en el Ejemplo 19. Los vectores utilizados contienen el gen de la fosfomanosa isomerasa (PMI) (Negrotto et al. (2000) Plant Cell Reports 19: 798-803). 2. Preparación del Aprobactep um tumefa ciens Las cepas de Agroba cteri um LBA4404 (pSBl) que contienen el plasmido de transformación de la planta se cultiva en medio solido YEP (extracto de levadura (5 g/L), peptona (10 g/L), NaCl (5 g/L), 15 g/1 de agar, pH 6.8) durante 2 a 4 días a 28 °C. Se suspenden aproximadamente 0.8 x 109 de Agroba ctepa en medio LS-inf suplementado con acetosirmgona 100 µM (As) (Negrotto et al . , (2000) Plant Cell Rep. 19: 798-803) . La bacteria se pre-induce en este medio durante 30-60 minutos . 3. Inoculación Los embriones inmaduros del genotipo de maíz A188 u otro apropiado se escinden de las espigas de 8-12 días de edad en LS-inf .- As 100 µM líquido. Los embriones se enjuagan una vez con medio de infección fresco. e agrega luego la solución de Agroba cteri um y los embriones se agitan vertiginosamente durante 30 segundos y se los deja reposar con la bacteria durante 5 minutos. Los embriones se transfieren luego con el escutelo hacia arriba a un medio LSAs y se cultivan en la oscuridad durante dos a tres días. Subsiguientemente, se transfieren entre 20 y 25 embriones por caja de petp a medio LSDc suplementado con cefotaxima (250 mg/l) y nitrato de plata (1.6 mg/l) y se cultiva en la oscuridad a 28°C durante 10 días. 4. Selección de las células transformadas y regeneración de las plantas transformadas Los embriones inmaduros que producen callos embriogenicos se transfieren a un medio LSD1M0.5S. Los cultivos se seleccionan sobre este medio durante 6 semanas con una etapa de subcultivo a las 3 semanas. Las células que sobreviven se transfieren también al medio LSD1M0.5S para ser guardadas o a un medio Regí. Siguiendo al cultivo a la luz (ciclo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad), los tejidos verdes se transfieren, luego al medio Reg2 sin reguladores de crecimiento y se incuban durante 1-2 semanas. Las plántulas se transfieren a cajas Magenta GA-7 (Magenta Corp., Chicago III.) que contienen al medio Reg3 y se dejan crecer con luz. Las plantas que son positivas a PCR para el cassette promotor-reportero se transfieren al suelo y se dejan crecer en un vivero . Ejemplo 21: Transformación estable de tomate La transformación de tomate se realiza esencialmente como se describe en Meissner et al., The Plant Journal 12, 1465-1472, 1997. 1. Plásmidos de transformación y marcador seleccionable Los genes utilizados para la transformación se clonan dentro de un vector binario apropiado para la transformación de tomate como se describe en el Ejemplo 19. Los vectores contienen el gen de resistencia a la higromicina para la selecció . 2. Preparación de Agrobacteri um t umefaci ens La cepa de Agrojbacteriu-t¡ GV31 01 que contiene el plásmido de transformación de la planta se hace crecer en medio líquido LB (extracto de levadura (5 g/L), peptona (10 g/L), NACÍ (5 g/L), 15 g/1 de agar, pH 6.8) durante 2 días a 22°C. Se suspenden aproximadamente 0.8 x 10s de Agrobacteri a en un medio de inoculación KCMS (sales MS (4.3 g/1), Myo-Inositol, Tiamina (1.3 µg/ml), 2,4-D (0.2 ug/ml), Cinetina 0.1 µg/ml y sucrosa al 3%, pH 5.5) suplementado con acetosirmgona 100 µM. La bacteria se pre-induce en este medio durante 60 minutos. 3. Esterilización y Terminación de las semillas Las semillas del cultivo Micro-Tom de tomate (Meissner et al., The Plant Journal 12: 1465-1472, 1997) y los cultivos ZTV-840 son remojados en una solución de blanqueador al 20% con Tween durante 20 minutos. Las semillas son luego lavadas tres veces con agua esterilizada y se colocan en placas sobre un medio TSG (1/2 sales MS, sucrosa al 1%, fitoAgar al 1%, pH 5.8) en cajas Magenta (Magenta Corp, Chicago III) para la germinación. Los cotiledones se escinden y los pecíolos de cotiledón se cortan en segmentos de 5 mm 7 a 10 días después de la germinación. 4. Inoculación Los cotiledones de siete a diez días de edad y los segmentos de los pecíolos de cotiledones se incuban durante 24 horas sobre placas de tabaco BY-2 de alimento de células (sales MS, Myo-inisitol 0.1 mg/ml, hidrolisato de caseína 0.2 mg/ml, Tiamina-HCl 1.3 µg/ml, sucrosa al 3%, pH 5.5) antes de la inoculación con Agroba cteri um . Los cotiledones se sumergen en una suspensión líquida CMS de Agrobacterium durante 5 minutos. Se transfieren luego entre 20 y 25 cotiledones con el lado abaxial hacia arriba en las mismas placas de alimentación de células y se cultivan en la oscuridad durante dos a tres días. 5^ Selección de los cotiledones y pecíolos transformados y regeneración de las plantas transformadas.

Los cotiledones y los fragmentos de pecíolos se transfieren a un medio de selección TSM-1 (4.3 g/1 de sales MS, Vitaminas 1XB5, sucrosa al 2%, glucosa al 1%, Zeatma 1 µg/ml, IAA 0.05 µg/ml, Higromicma 5 µg/ml y Carbenicilma 250 µg/ml, pH 5.8) dos a tres días luego de la inoculación con Agroba cteri um a la luz. Los cotiledones y los fragmentos de pecíolos que producen callos embriogénicos se transfieren a un medio TSM-2 (4.3 g/1 de sales MS, Vitaminas 1XMS, Sucrosa al 2%, Zeatma 1 µg/ml, Higromicina 5 µg/ml y Carbenicilma 250 µg/ml, pH 5.8) . Los callos que sobreviven que forman las plántulas se transfieren a cajas Magenta GA-7 (Magenta Corp, Chicago III) que contienen medio TRM (4.3 g/1 de sal MS, Vitaminas 1XMS, sucrosa al 2%, pH 5.8) y se dejan crecer con luz. Después los transformantes con formación de raíces primarias se transfieren al suelo, Ejemplo 22 : Ensayo fluorométrico de Proteina Verde Fluorescente (GFP) Para la detección de la expresión del gen synGFP se realiza el ensayo fluorométrico . Los discos de hojas de maíz y tomate estables transformados se congelan sobre hielo seco. El tejido congelado es molido cuidadosamente y mezclado con 300 µl de solución reguladora de extracción GFP (Tris-HCl 10 mM (pH 7.5), NaCl 100 mM, MgCl2 1 mM, DTT 10 mM y sarcosil 0.1%).

Los extractos se separan de los restos de hojas mediante centrif gación seguida por la transferencia a una placa negra de 96 recipientes con fondo claro (Coastar 3615) . Se miden las unidades de fluorescencia relativa (RFU) mediante una lectora de placa Spectra Fluor Plus a 465 nm en excitación y 512 nm en emisión. Se normaliza la actividad de GFP a la medida de proteína total usando el ensayo BCA (de acuerdo a Pierce) . Ejemplo 23: Análisis de expresión de las plantas de maiz y tomate estables transformadas 1. Plantas transqénicas To de Zea mays La expresión de GFP es 10 a 20 veces más grande bajo el control del promotor CmpS (NOV4215, NOV4216) comparada con el del promotor ZmUbi (NOV2110). Estos resultados se obtuvieron de las muestras de hojas de 42 líneas independientes To que representan un total de 93 plantas To. 2. Ensayo Elisa de GFP Se llevó a cabo un inmunoensayo cuantitativo sandwicn para la detección de la proteína verde fluorescente (GFP) . Se usaron dos anticuerpos policlonales disponibles comercialmente . Se purificaron por mmunoafmidad el anti-GFP IAP de cabra (Rockland, #600-1-1-215) y el anticuerpo anti- GFP de conejo (Torrey Pmes Biolabs, #TP401) es proteína A purificada. La proteína GFP en el extracto de la planta se captura sobre un microtitulador de fase sólida mediante el anticuerpo de conejo. Luego se forma un "sandwich" entre el anticuerpo de conejo en fase sólida, la proteína GFP, y el anticuerpo secundario de cabra que está en el recipiente. Luego de una etapa de lavado, en donde se remueve el anticuerpo secundario no ligado, el anticuerpo ligado se detecta usando un anticuerpo alcalino marcado con fosfatasa. Se agrega el substrato para la enzima y se mide el desarrollo de color mediante la lectura de la absorbancia de cada recipiente. La lectura se ajusta a una curva estándar para graficar las concentraciones de GFP versus la absorbancia. Gen reportero SynGFP 2. Plantas To de Lycopersi con escul en t um El fragmento CmpS del promotor CmYLCV (NOV4217) resulta en el nivel de expresión de synGFP que es significativamente más alto que el nivel de expresión del promotor Ubq3 de Arabi dopsi s (NOV4209) . Gen reportero synGFP Se obtienen los resultados de la evaluación de la intensidad de la fluorescencia de synGFP mediante microscopio a en los callos y brotes primarios de 5 líneas independientes de callos estables transformados, transformados con el cassette NOV4217 y 2 líneas independientes de callos estables transformados, transformados con el cassette NOV4209.

Gen reportero Gus-intron-GUS Se obtienen los resultados de la evaluación de la intensidad del manchado GUS en 11 líneas independientes de callos estables transformados que contienen los cassettes promotor-reportero de CmpsS (líneas NOV4220-1 a NOV4220-11) . Se evalúan dos líneas de callos estables transformados que contienen el fragmento del promotor CmpC del promotor CmYLCV (NOV4224-1, NOV4224-2) . Se evalúan para comparación dos líneas de callos estables transformados que contienen el promotor Arabidopsis Ubiquitin 3 (Ubq3) (NOV4208-1, NOV4208-2) .

Ejemplo 24: Experimentos de expresión transitoria en maíz 1. Preparación de embriones Los embriones inmaduros del A188 y otros genotipos apropiados se escinden de las espigas de 8-12 días de edad en 2DG4 + 0.5 de líquido (medio D de Duncan modificado hasta contener 20 mg/l de glucosa y suplementado con 10 g/1 de mañosa) y se cultivó durante 1 a 2 dias. 2_._ Plasmolisis Los embriones inmaduros fueron incubados en solución de sucrosa al 12% durante 3-4 horas previo al bombardeo. Los embriones se acomodaron en círculos de 8-1 0 mm sobre una placa . 3. Bombardeo La transfección mediante el Bombardeo de Partículas de embriones de Maíz se realizó en la presencia de 5 µg de ADN plásmido a 650 psi como se describió (Wright et al, 2001, Plant Cell Reports, In Press). En el caso en que la referencia no se encuentre en impresa, éstos son los detalles recogidos del documento: El fragmento de ADN se precipitan en microportadores de oro (<1 um) como se describe en el Manual Biolistico de DuPont. Los genes se reparten en las células de tejido blanco usando el dispositivo Biolístico PDS-lOOOHe. Las especificaciones en el dispositivo son las siguientes: 8 mm entre el disco de ruptura y el macroportador, 10 mm entre el macroportador y la pantalla de detención y 7 cm entre la pantalla de detención y el blanco. Las placas son bombardeadas dos veces con partículas de ADN revestidas usando discos de ruptura de 650 psig. Para reducir el daño en el tejido a partir de la onda de choque de la descarga de helio, se ubica un tamiz de acero inoxidable, 200 aberturas por pulgada lineal en sentidos horizontal y vertical (McMaster-Carr, New Brunswick, NJ) entre la pantalla de detención y el tejido blanco. Los embriones se cultivan sobre las placas durante 48 horas en la oscuridad a 25°C. Los extractos de proteína se preparan mediante las células rotas en una solución de lisis GUS y clarificadas por centrifugación. Ejemplo 25: Ensayos GUS Se realizan los ensayos histoquímicos y quimiolummiscentes para la detección de la expresión del gen GUS. 1. Ensayo histoquímico de ß-qlucuronidasá (GUS) Las líneas de callos de los embriones de maíz y tomate m vi tro se usan en los ensayos GUS. Tanto el total de los embriones como los trozos pequeños de los callos se sumergen dentro de una solución de manchado GUS. La solución de manchado GUS que contiene 5-bromo-4-cloro-3-?ndol?l glucoronida (X-Gluc, Duchefa, muestra 20 mM en DMSO) , de solución reguladora de fosfato de sodio 100 mM, pH 7.0, EDTA 10 mM pH 8.0, y Tritón XlOO al 0.1%. Las muestras de tejido se incuban a 37°C durante 1-16 horas. Si es necesario, las muestras se clarifican con varios lavados con ETOH al 70% para remover la clorofila. 2. Ensayo de quimioluminiscencia de ß-qlucuronidasa (GUS) Para el análisis cuantitativo de la expresión Gus, se realiza el ensayo de quimiolummiscencia de GUS usando el kit GUS-Light (Tropix, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad se mide en un Luminómetro. Los resultados de GUS con construcciones pCmpS y pCmpMG (Ejemplo 17) son normalizados para una comparación del valor del clon (pNOV3612, Ejemplo 19) . Los resultados obtenidos de los dos experimentos diferentes muestran que la eliminación de 8 bp en el promotor CmYLCV (pCmpMG, Ejemplo 17) no afecta significativamente los niveles de expresión de los reporteros GUS comparados con pCmpS . Expresión transitoria en embriones de Z . mays Actividad GUS a las 48 y 72 horas luego de la transfeccion Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada ±nvención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Syngenta Participations AG <120> Virus de la pzadura amarilla del Cestrum <130> S-31359A <140> <141> <150> GB 0007427.8 <151> 2000-03-27 <150> GB 0010486.9 <151> 2000-04-28 <150> EP 01101802.5 <151> 2001-01-26 <150> US <151> 2001-02-28 <160> 49 <170> PatenCln Ver. 2.2 <210> 1 <211> 670 <212> t-NA <213> Virus de la pzadura amarilla del Cestrum <400> i attactggca gacaaagtgg cagacatact gtcccacaaa tgaagatgga atctgtaaaa 60 gaaaacgcgt gaaataatgc gtccgacaaa ggttaggtcg gctgccttta atcaatacca 120 aagcggtccc taccacgatg gaaaaactgt gcagtcggtt tggctttttc tgacgaacaa 180 ataagattcg tggccgacag gtgggggtcc accatgtgaa ggcatcttca gactccaata 240 atggagcaat gacgtaaggg cttacgaaat aagtaagggt agtttgggaa atgtccactc 300 acccgtcagt ctataaatac ttagcccctc cctcattgtt aagggagcaa aatctcagag 360 agatagtcct agagagagaa agagagcaag tagcctagaa gtagtcaagg cggcgaagta 420 ttcaggcagg gtggccagga agaagaaaag ccaagacgac gaaaacaggt aagagctaag 480 ctttctcatc tcaaagatga ttcttgatga tttttgtctc cacggtccgt ataggatcca 540 ctgaattgat aaatatcata tggtttgtat aaaacccgat atttaaatct gtatcattct 600 gtttgaataa aacttgatac tt gt ggag tcgtttgtaa aaacataaac aattataatc 660 tgttaaaaac 670 <120>2 <211>346 <212>ADN <213> Virus de la pzadura amarilla del Cestrum -100-- 2 .•rg cagaca aagtggcaga catactgtcc cacaaatgaa gatggaatct gt-.c.t.?ir;.?,i?i ?>.i acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctctaatca atac-rv?...??r l.:o qgtccctacc acgacggaaa aaccgcgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180 gattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagacc ccaataatgg 240 oycaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt Cgggaaatgt ccacccaccc 300 yccagcctat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaa 346 <210>3 <211>400 <212> ADN <213> virus de la pzadura amarilla del Cestrum <400> 3 ctggcagaca aagtggcaga caCactgtcc cacaaatgaa yatyyaat l yLd ddy-iau 60 acgcytgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cccctaacca ataccaaagt 120 ggt cctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tctttctgac gaacaaataa 180 yattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca Cg gaaggca cccccagact ccaataatgg 240 -igcaatgacg Caagggccca cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcacc-- 300 gtcagtctat aaatacttaq cccctccctc attgttaagg gagcaaaatc tcagagagat 360 agcccCagag agagaaagag agcaagcagc ctagaagtag 400 <210>4 <211>634 <212> ADN <213> virus de la pzadura amarilla del Cestrum 400> 4 ctggcagaca aagtggcaga catactgtcc cacaaatgaa gatggaatct gtaaaagaaa 60 acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctttaatca ataccaaagt 120 ggtccctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180 gatfrgrggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagact ccaataatgg 240 agcaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcaccc 300 gtcagCcCat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaaaatc tcagagagat 360 agtccCagag agagaaagag agcaagtagc ctagaagtag tcaaggcggc gaagtattca 420 ggcagggcgg ccaggaagaa gaaaagccaa gacgacgaaa acaggCaaga gcCaagcttt 480 ctcatctcaa agaCgaCCcC tgatgatttt tgtctccacg gtccgtatag gatccactga 540 attgataaat atcatatggt ttgtataaaa crrg,.t-at-t-t- a??i-<~t-gt-ai- r-^tt tgttt 600 gaataaaact tgatactttg ttggagtcgt ttgt 634 <210>5 <211> 32 <212> ADN <213> virus de la pzadura amarilla del Cestrum <400> 5 aaaaacataa acaattataa tctgttaaaa ac 32 <210> 6 <21 1 > 104 <212> ADN <213> virus de la pzadura amarilla del Cestrum <400> 6 gqcacagctg tcagttgtgc aaatccgagt catctggacc acaaacatca gaagagggt-r- 60 tacaagagCc agaagacgaa gacctttcgg tgctagttta atta 104 <210>7 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial oligonucleotido <400>7 gaccacaaac atcagaag 18 <210>8 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial oligonucleotido 0 <400>8 caaacttatt gggtaatc 18 <210>9 <211>21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial -je oligonucleotido <400>9 cagggtacca ctaaaatcac c 21 <210> 10 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial 20 oligonucleotido <400>10 aggggatccc caattcccc <210> 1 1 <21 1 > 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial oligonucleótido <400>n aggggtacca tcgatatgga g 21 <210> 12 <21 1 > 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial oligonucleotido <400>12 ttaggatccg ccctgccac <210> 13 <21 1 > 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial o gonucleótido <400>13 cttctagaca aagtggcaga c 21 <210> 14 <21 1 > 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial o gonucleótido <400>14 ttggtacct aacaatgagg g 21 <210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial oligonucleotido <400>15 ctacttctag gtaccttgct c 21 <210> 16 <21 1 > 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial oligonucleótido <400>16 ttggtacct aacaatgagg g 21 <210> 17 <21 1 > 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descppción de la secuencia Artificial oligonucleótido <400>17 ggggatcccc agtctctctc 20 <210> 19 <21 1 > 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descppción de la secuencia Artificial oligonucleótido <400>18 gtgaattcga gctcggta 18 <210> 19 <21 1 > 668 <212> ADN <213> Virus de la rizadura amarilla del Cestrum <400> 19 attactggca gacaaagtgg cagacatact gtcccacaaa tgaagatgga atctgtaaaa 60 gaaaacgcgt gaaataatgc gtctgacaaa ggttaggtcg gctgccttta atcaatacca 120 aagtggtccc taccacgatg gaaaaacCgC gcagtcggtt tggctctttc tgacya-.cc i 180 ataagattcg tggccgacag gtgggggtcc accatgtgaa ggcatcttca gactccaata 240 atggagcaat gacgtaaggg cttacgaaac aagtaagggt agtttgggaa atgtccactc 300 acccgtcagt ctataaatac ttagcccctc cctcattgtt aagggagcaa aatctcagag 360 agatagtcct agagagagaa agagagcaag tagcctagaa gtagtcaagg cggcgaagta 420 ttcaggcagg tggccaggaa gaagaaaagc caagacgacg aaaacaggta agagctaagc 480 tttcccatct caaagatgat tcttgatgat ttttgtctcc acggtccgta taggatcact 540 gaattgataa atatcatatg gtttgtataa aacccgatat ttaaatctgt atcattctgt 600 ttgaataaaa cttgatactt tgtcggagtc gCCtgtaaaa acataaacaa ttataaCctg 660 ctaaaaac 668 <210>20 <211>632 <212> ADN <213> Virus de la rizadura amarilla del Cestrum <400> 20 ctggcagaca aagtggcaga cataeLytc a aLyua yatyyaut t ytaaaagaaa 60 acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctttaatca ataccaaagt 120 ggtccctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180 gattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagact ccaataatgg 240 agcaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcaccc 300 gtcagtctat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaaaatc tcagagagat 360 agtcctagag agagaaagag agcaagtagc ctagaagtag tcaaggcggc gaagtattca 420 ggcaggtggc caggaagaag aaaagccaag acgacgaaaa caggtaagag ctaagctttc 480 tcatct aaa gatgaCtctt gatgattttt gtctccacgg tccgtatagg atcactgaat 540 tgataaatat catatggttt gtataaaacc cgatatttaa atctgtatca ttctgtttga 600 ataaaacttg atactttgtt ggagtcgttt gt 632 <210> 21 <211>28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial- oligonucleótido <400>21 ccgctgcag atcgttcaaa catttggc 28 <210> 22 <21 1 > 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial oligonucleótido <400>22 cccgaagctt tctagagatc tagtaac 27 <210> 23 <21 1 > 41 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial- oligonucleótido <400> 23 gggcggatcc gcatgcatgt cttaaggtaa gctcactaag g 41 <210> 24 <21 1 > 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial oligonucleótido <400> 24 ccgcgctgca ggctgctttc aagcaagttc tgcg 34 <210> 25 <21 1 > 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial oligonucleótido <400>25 ttgagagctc gtttaattac tggcagacaa agtgg 35 <210> 26 <21 1 > 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descppción de la secuencia Artificial oligonucleótido <400>26 ttgactgcag gtttatgttt ttacaaacga ctcc 34 <210> 27 <21 1 > 137 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial Sitio de multiclonación AGLINK <400>27 gcggccgctc cggattcgaa t-raat-t-^cq tacgaagctt gcatgcctgc agtgatcacc 60 atggtcgact ctagaggatc cccgggtacc gagctcgaat tcggcgcgcc caattgattt 120 aaatggccgc tgcggcc 137 <210>28 <211>216 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial sitio de multiclonación BIGLINK <400>28 ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc gcgccgaatt cgagctcggt acccggggat 60 cctctagagt cgaccatggt gatcactgca ggcaCgcaag cCCcgtacgt taattaattc 120 gaatccggag cggccgcacg cgtgggcccg tttaaacctc gagagatctg ctagccctgc 180 aggaaattta ccggtgcccg ggcggccagc atggcc 216 <210>29 <211>28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descppción de la secuencia Artificial oligonucleótido <400>29 cgcggatcct ggcagacaaa gtggcaga 28 <210> 30 <21 1 > 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial oligonucleótido <400>30 cgcggatcct acttctaggc tacttg <210> 31 <21 1 > 7195 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial- vector pNOV2804 <400>31 gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac 60 aalctyatca tgagcggaga attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg 120 acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg 180 gccatttaaa tcaattgggc gcgtacgtag cactagtgcg cgatcgctta attaagcggc 240 gcgcctaaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tccccgatca tgcaaaaact 300 cattaactca gtgcaaaact atgcctgggg cagcaaaacg gcgttgactg aactttatgg 360 tatggaaaat ccgtccagcc agccgatggc cgagctgtgg atgggcgcac atccgaaaag 420 cagttcacga gtgcagaatg ccgccggaya latcgtttca ctgcgtgatg tgattgagag 480 tgataaatcg actctgctcg gagaggccgt tgccaaacgc tttggcgaac tgcctttcct 540 gttcaaagta ttatgcgcag cacagccact ctccattcag gttcatccaa acaaacacaa 600 ttctgaaatc ggttttgcca aagaaaatgc cgcaggtatc ccgaCggaCg ccgccgagcg 660 taactataaa gatcctaacc acaagccgga gctggttttt gcgctgacgc ctttccttgc 720 gatgaacgcg tttcgtgaát tttccgagaC tgtctcccta ctccagccgg tcgcaggtgc 780 acatccggcg attgctcact ttttacaaca gcctgatgcc gaacgtttaa gcgaactgtt 840 cgccagcctg ttgaatatgc agggtgaaga aaaatcccgc gcgctggcga ttttaaaatc 900 ggccctcgat agccagcagg gtgaaccgtg gcaaacgatt cgtttaattt ctgaatttta 960 cccggaagac agcggtctgt tctccccgct attgctgaat gtggtgaaat tgaaccctgg 1020 cgaagcgatg ttcctgttcg ctgaaacacc gcacgcttac ctgcaaggcg tggcgctgga 1080 agtgatggca aactccgaCa acgtgctgcg tgcgggtcCg acgcctaaat acattgatat 1140 tccggaactg gttgccaatg tgaaattcga agccaaaccg gctaaccagt tgttgaccca 1200 gccggtgaaa caaggtgcag aactggactt cccgattcca gtggatgatt ttgccttctc 1260 gctgcatgac cttagtgata aagaaaccac cattagccag cagagtgccg ccattttgtt 1320 ctgcgtcgaa ggcgatgcaa cgttgtggaa aggttctcag cagCCacagc taaaccggg 1380 tgaatcagcg tttattgccg ccaacgaatc accggtgact gtcaaaggcc acggccgttt 1440 agcgcgtgtt tacaacaagc tgtaagagct tactgaaaaa attaacatct cttgctaagc 1500 10 Cgggagctct agacccccga atttccccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtctctt 1560 aagattgaac cctgttgccg gtcttgcgat gattatcaca Caatttctgt tgaattacgt 1620 taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgcCattt atgagatggg tttttatgat 1680 tagagtcccg caattacaca t^Caacacgc gatagaaaac aaaatacagc gcgcaaacCa 1740 ggacaaatta tcgcgcgcgg CgCcatcCaC gctactagac cgggaattgg gtaccatgcc 1800 cgggcggcca gcaCggccgC atccgcaatg tgtcattaag ttgtctaagc gtcaatttgt 1860 ttacaccaca atatatcctg cc-accagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca 1920 caaaatcacc actcgataca ggcagcccac cagaattaat tctcatgttt gacagcttat 1980 catcgactgc acggtgcacc aatgcttctg gcgtcaggca gccatcggaa gctgtggtat 2040 ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgtcctg 2100 gataatgttt tttgcgccga o-atcaCaacg Ctccggcaa atatcctgaa atgagctgtt 2160 gacaattaat catccggctc '-gg-tattgtg agcggataac aatCCcacac 2220 aggaaacaga ccatgaggga agcgttgaCc gccgaagtat cgactcaact a cagaggta 2280 gtCggcgtca tcgagcgcca Cctcgaaccg acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc 2340 cctggagaga gcgagatt t ;cgcgrcg.a gaagtcacca ttgCCgtgca cgacgacatc 2520 attccgcggc gttatccagc ~aagcg gaa tgcaattcg gagaatggca gcgcaacgac 2580 atrct:gcag gtatcttcga gccayccacg atcgacattg atctggctat cttgctgnca 2640 aaagcaagag aacatagcgc tgc-.;tggt:a ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg 2700 ytt ctyaac aggatctatt .gacgcgcta ".atgaaacct taacgctatg gaactcgccg 2760 f ccaacr.ggg ctggcgatga gcsaaatgta 'jtgctcacgC tgtcccgcat ttggtacagc 2820 gcagtaaccg gcaaaatcgc gcc aaggat atcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg 2880 ccygcccagt atcagcccgt catacttgaa ctaggcagg ci atcttgg acaagaagat 2940 "scttggcct cgcgcgcaga tcagttggaa ?aetttgttc acta ytydd ayycy-igatc 3000 accaaagtag tcggcaaata aagctctagt gatctccgt acccccgggg gatcCggctc 3060 gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc -?taggcgacc trctaaatca atagtagctg 3120 taaccccgaa gcgCttcact cgtaacaacg attgagaatt tccgCcaCaa aaCCgaaaCa 3180 cttggttcgc atttttgtc-, tccgcggt a gccgcaactc CgacgaacCg cccaCttagc 3240 , tggagaCgat tgtacatc -, -x-argtgaaa stttctcaag cgctgtgaac aagggttcag 3300 ateceagatt- qaaa??rgar, cgttgaaac acgtccttct egr.csatgac gacgtcgcta 3360 tacyycat'.'C taCCaCtgaa tr>ccttacga tccu gcctt caaagCga c gcggtagccg 3420 acaycaccca gcccacaag-' gtacr.ctctt ccgcgacggt cgatgtcgtg gttgttgatc 3480 taaatctagg ccgtgaagat ggg tcgaga tcgttcgtaa tctggcggca aagt tgata 3540 CtccaaCcaC aatCaCcagt ggcgaccgcc c gaggagac ggacaaagct gttgcactcg 3600 agctaggagc aagtgattct ateyetaage cgttcagtat cagasagttc ctsgcacg a 3660 ttcgggtcgc cttgcgcgtg ciccccaarg ttgt cgc.c caaagacega cggtcctttt 3720 gttttactga ctggaca tt qat tcaggc aacgtcgccc gatgtccgaa g tggrggtg 3780 aygtgaaact tacggcaggt gagtecaate ttctcctcgc gtttttagag aaaccccgcg 3840 acgccccacc gcgcgagcaa ctCctcattg ccagtcgagt acgcgacgag gaggtttatg 3900 acaggagtat agatgttctc a.tttgaggc tgcgrcgcaa acttgaggca gatccgtcaa 3960 gccctcaact gataaaaaca gcaagaggtg ceg ttattt ctttgacgcg gacgtgcagg 4020 tttcgcacgg gggga gatg g agcctgag ccaattccca gacccccgag gact ggcgt 4080 gagcggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt 4140 ygagaagttg aaggccgcgc aggccgccca ycggcaacgc atcgaggcag aagcacg cc 4200 -ggtgaatcg tggcaagcgy ccgr*.gatcg aatccgcaaa gaaCcccggc aaccgccggc 4260 agccggCgcg ccgtcgacta ggaagergee caaggg gac gagcaaccag attttttcqt 4320 -ccgatgctc tatgacgtgg g acccgc a tagtegeage atcacggacg tggccgcctt 4380 ccgtctgt g aagcg gacc gacgagctgg cgaggCgaCc cgctacgagc ttccagacgg 4440 gcacgtagag gttcccgcag ggccgg cgg a ggccagt gtyCgggaCC acgacctggt 4500 actgatggcg gtttcccatc taacegaate atgaacega ta cgggaag ggaagggaga 4550 caagcccggc cgcgtgttrc g* c-dcaegt tgcggacgta ctcaagttct gccggcqagc 4620 gatggcgga aagcagaaag acg-.cc ggc agaaac tgc attcggCtaa acac acgca 4680 cgctgccaCg caqcgtacga agaaygccaa gaacggccgc ctggtgacgg tatcr-g-jggg 4740 tgaagcctcg accagccgct acaagat gt aaa^ag gaa accgggcggc cggagtacat 4800 egagategay tagctgatt gydtgtaccg ga-atcaca gaaggcaaga acccggacgt 4860 gctgacggCC caccccgatt acttttCgat gatrc ggc atcggccgtt ttctctaccg 4920 cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga sg cagatgg ttgttcaaga cgaCcCacga 4980 acgcagtggc a cgccggag agfraag a ott<-tgtttc accgtgcgca agctgat gg 504C gtcaaacgac ctgccggagt acga-tcgaa gaggaggcg ggg aggctg gcccgatcct 5100 agtcatgcgc taccgcaacc tgaccga.ggg cga-. catcc gccggttcct aatgta gga 5160 geagatgeta gggcaaattg creragedyy qyaaaaaggt cgaaaaggtc t tt cctgt 5220 gg-?tagcaca tacatcggga a caaagcc cri-acatcgag aaccggaacc cgtacaCgg 5280 gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa 5340 aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt aaaactctta aaacccgccC 5400 ggcccgtgca taactgtctg gccagcgcac agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct 5460 tcggccgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg 5520 tcaaaaatg yctyyci-Ld-: yyccaggcaa tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc 5580 gccactcgac cgccggcgct gaggtctgcc tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca 5640 gtcgggaaga tgcgtyatct gatccttcaa ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaíi?g 5820 ccgccgtccc gtcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt acaaccaatt aaccaa tct 5880 gattagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca 5940 ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc 6000 cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa 6060 cctattaatc CccccCcgCc aaaaataagg tCaCcaagCg agaaaCcacc aCgagtgacg 6120 actgaacccg gcgagaatgg caaaagcCct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 6180 aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 6240 cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 6300 atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 6360 taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 6420 aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 6480 tccccctgga agctccctcg tgcgrfrfrr rgt rrrqptrr rfqrrqctta ccgqatac t 6540 gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 6600 cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 6660 cgaccgctgc gcctcaCccg gCaacCaccg ccttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 6720 atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 6780 tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 6840 ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt ga ccqqcaa 6900 acaaaccacc gcCggCagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 6960 aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg ccCgacgcCc agtggaacga 7020 aaactcacgt taagggactt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 7080 ttgatccgg aattaattcc tgtggttggc atgeacatac aaatggacga acggataaac 7140 cttttcacgc ccttttaaat atccgattaC Cctaataaac gctctttccc ectag 7195 12 <210> 32 <21 1 4224 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descppción de la secuencia Artificial: vector pNOV3604 <400>32 a cccgcatg cctgcaggt yucL tagag gatccccgat catgcaaaaa ctC-.tt-K.c-t 60 rv?jr.jrv?,.r.a ctat cptgg ggcagcaaaa cggcgttgar t-qa rrrrar gqtatqqr.aa I.'O atccgtccag ccaqccqatg gccgagctgt ggatgggcgc acatccgaaa agcagtt .it.- IHO gagtgcagaa tgccgccgga gatatcgttt cactgcgtga tgtgattgag agtgata rit .MO cqactctgct cygagaggcc gttgccaaac gctttggcga accgcccctc ctgctca..,?g iOO tattatgcgc agcacagcca ctctccattc aggttcatcc aaacaaacac aattct-jana 360 t- ygttttyc caaagaaaat gccgcaggta tcccgatgga tgccgccgag cgtaactata 4:'(l 'jagatcc.-taa ccacaayccg gagcCggttt ttgcgctgac gcctttcctt gcgatgaacy 480 r-gtttcgtya attttccgag attgtctccc tactccagcc ggtcgcaggc gcacatcc-yy 540 ?--qattgr.-tca ctttttacaa cagcctgatg ccgaacgttt aagcgaactg ttcgccayc-c 600 ryctgaatat ycagggtgaa gaaaaatccc gcgcgctggc gattttaaaa tcggccctcq 660 dtayecayca gggtgaaccg tggcaaacga ttcgtttaat ctctgaattt taccr-gya q 7.!0 a aycyytct gttctccccg ctaLLgctga atgtggtgaa actgaac.ec.- (jyeyu.iyrq. i 7H0 i qttr.-ctytc cgctgaaaca ccgcacgctt acctgcaagg cgtggcgctg gaaqtg<?t cjq 840 r.-iao-tr.- ga taacytgctg cgtgcgggtc Lgacgcctaa atacatcgat ttcogq....<- ''00 rqyttgr.-r.-aa tgCgaaattc gaagccaaac cggctaacca gttgttgacc cagocgcjrq.i ?.O rjrjc yqcyc agaactggac ttcccgattc cagtggatga CCCtgccccc tcgctgeatq 1020 a ct -ay.r.. rarif-gaaacc accattagcc agcagaqtqc cqccaCCtCg tCctycyCcg 1080 aacjycqatcj aacytcgcgg aaaggCtctc agcagttaca gcCCaaaccg ggcgaatc-.iq 1140 cgCttaCtgc cgccaacgaa tcaccggtga ccgtcaaagg ccacggccgt ttagcgcgtg 1200 tctacaacaa gctgtaagag cttactgaaa aaattaacat ctcttgctaa gctgggagct 1260 ctagatcccc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagt tc ttaagattga 1320 atcctgttgc cggccccgcg aCgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg 1380 caacaattaa catgtaacgc aCgacgttat ttaCgagaCg gg ttttatg attagagtcc 1440 cgcaatcata catctaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat 1500 tatcgcgcgc yytgtcatct atgttactag atcgggaatt gggtaccgaa ttcactggcc 1560 gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca 1620 gcacatcccc cccccgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 1680 caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 1740 ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 1800 tagttaagcc y c yd d c cy caaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 1860 ctcccggcac ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 1920 tttCcaccgC caCcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc Ccgtgatacg cctattttta 1980 taggccaaCg CcaCgataaC aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat 2040 gcqr-gcqgaa r- cctatttg ttcatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 2100 ayacaataac cctyacaaaC gcttcaatgg cgcgccgcgg ccgcttaaga atattgaaaa 2160 ?ggflagagta tgagtatt a acatttccgt gtcgccctta ctccctcttt tgcggcattt 2220 tgccttcctg ttttCgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 2280 ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 2340 tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 2400 gtattatccc gtaccgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 2460 aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 2520 agagaatcac gcagCgcCgc cataaccatq aqtqataaca ctqcqqccaa cttacttctg 2580 acaacgatcg gaqgaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 2640 actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 2700 accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 2760 actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 2820 cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 2880 cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 2940 gCCacccaca cgacggggag Ccaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 3000 ataggtgcct cactgattaa gcattggCaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 3060 tagatcgacc aaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 3120 aacctcatga cc:-u-utc-cc ttaacgtgag ttllcyttcc actgagcgtc agaccccgta 3180 gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 3240 acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 3300 tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 3360 ccgtagttag yccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 3420 atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 3480 agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 3540 cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc Cacagcgtga gctatgagaa 3600 agcgccacgc rtcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 3660 acagyagagc yrargagyya yctt-x-ayyy yydaa yccL yylaLcLLLa tagtcctgtc 3720 gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 3780 ctatggaaaa acyccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 3T40 gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 3900 gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 3960 gaagcggaag agcttaagcg gccgcggcgc gccgcccaat acgcaaaccg cctctccccg 4020 cgcgrtggcc yatCcateaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca 4080 gtgagcgcaa cycaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact 4140 ttatgcttcc ggc cgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 4200 acagctatga catqattac gcca 4224 <210> 33 <21 1 21 <212> ADN 213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial, oligonucleótido <400>33 ccatcgtggt atttggtatt g 21 <210> 34 <21 1 > 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial 14 <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial o gonucleótido <400>34 caataccaaa taccacgatg g 21 <210>35 <211>21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial o gonucleótido <400> 35 cgtggtagcg agcactttgg t 21 <210>36 <211>21 <212>ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia Artificial oligonucleótido <400>36 aagtgctcgc taccacgatg g 21 <210>37 <211> 912 <212> ADN <213> artificial <220> <223> gen GFP sintético de la secuencia artificial con intrón <400>37 atgagcaagg gcgaggagct gttcaccggc gtggtgccaa tcctggtgga gclyy-?-yyc GO gacgtgaacg gccacaagtt cagcgtgagc ggcgagggcg agggcgacgc gacctar-gqc 120 aagctgaccc tgaagttcat ctgtaccacc ggcaagctcc cggccccgty gcc-garrcrc; 180 gtgaccacct tcacctacgg cgtgcagtgt ttcagccgct acccggacca catgnagogr 240 cacgacttct ccaagagcgc caCgccggag ggcCacgcaa gtttctgctt ctacctttga ?00 tatatatata ataattatca Ctaattagta gtaacataat atttcaaaca cctcttcca. 360 aacaaaagaa tgtagtatat agcaattgct tttctgtagt ttataagtgt qcacacttc. 4?n atttataacc cccctaatat atgaccaaaa tttgttgatg tgcaggtgca ggagcgcacc 480 atcagcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgfic 540 acactagtga accgcatcga gctgaagggc atcgactcca aggaggacgg caacatrctg 600 ggccacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtgt acatcaccgc ggacaagcag 660 aagaacggca tcaaggcgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 720 ctggccgacc actaccagca gaacaccccg atcggcgacg gtcctgtgct gctgccggac 780 aaccacCacc gagcaccca gagcgccc g agcaaggacc cgaacgagaa gcgcgaccar 840 aCggCgcCgc tggagttcgt gaccgccgcc ggcatcaccc acggcatgga cgagctgtac 900 aaggttaact ag 9! <210>38 <211> 2001 <212>ADN <213> artificial <220> <223> gen GUS de secuencia artificial con mtrón <400>38 acggtccgtc ccgcagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aacccgacgg cctgtgggca 60 tccagCcCgg aCcgcgaaaa ccgcggaatc gatcagcgct ggcgggaaag cgcgctacaa 120 gaaagccggg caactgctgt gccaggcagt cttaacgatc agttcgccga tgcagatacc 180 cgcaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240 ggccagcgca cgcgccgcg cttcgaCgcg gtcactcact acggcaaage gcgggccaat 300 aatcaggaag tgacggdyc. tcdy gcggc laldc-grcat Ctgaagccqa rgtcargccg 360 Cacgtcattg ccgggaaaag tgtacgtaag tttctgcttc CaccCCCgat aCaCaCataa 420 16 taattatcat taattagtag taatataata tctcaaatat tccccccaaa ataaaagaat 480 gtagtatata gcaattgccc ttctgtagtt CataagtgCg catatcctaa tttataactt 540 tcctaataca cgaccaaaat ttgccgacgt gcaggtaCca ccgcttgcgt gaacaacgaa 600 ctgaactggc agactatccc gccgggaatg gtgattaccg acgaaaacgg caagaaaaag 660 cagtctcact tccatgattt ctttaactat gccggaatcc atcgcagcgt aatgctctac 720 accacgccga acacctgggt ggacgatatc accgtggtga cgcatgccgc gcaagactgt 780 aaccacgcgt ctgttgactg gcaggtggtg gccaatggtg aCgCcagcgt tgaactgcgt 840 gatgcggatc aacaggtggt tgcaactgga caaggcacca gcgggacttt gcaagtggtg 900 aatccgcacc tctggcaacc gggcgaaggc taCcCcCatg aacCgCgcgt cacagccaaa 960 agccagacag agcgcgacat ctacccgctc cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag 1020 ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa 1080 gatgcggact cgcgcggcaa aggatccgac aacgtgctga Cggtgcacga ccacgcatta 1140 atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg 1200 0 ctcgactggg casatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt 1260 aacctctctc taggca tgg ttCcgaagcg ggcaacaagc cgaaagaacc gtacagcgaa 1320 gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg cacttacagg cgactaaaga gctgatagcg 1380 cgtgacaaaa accacccaag cgtggtgatg tggagtattg ccaacgaacc ggatacccgt 1440 ccycaaggtg cacgggaata tttcgcgcca ctggcggaag caacgcgtaa actcgacccg 1500 acgcgtccga tcacctgcgt caatgtaatg ttctqcqacg ctcacaccga taccatcagc 1560 c gatctctttg atgtgctgtg cctgaaccgt tattacggat ggtatgtcca aagcggcgat 1620 ctggaaacgg cagagaaggt actggaaaaa gaacttctgg cctggcagga gaaactgcat 1680 cagccgatta tcar.raccga atargg gtg gatacgttag ccgggctgca ctcaat.gtac 1740 accgacatgt ggagtgaaga gtatcagtgt gcatggctgg atatgtatca ccgcgtcttt 1800 gatcgcgtca gcgccgtcgt cggtgaacag gtatggaatt tcgccgattt tgcgacctcg 1860 caaggcatat tgcgcgttgg cggtaacaag aaagggatct CcacCcqcqa ccqcaaaccg 1920 aagccggcgg ccctcctgct gcaaaaacgc tggactggca tgaacttcgg tgaaaaaccg 1980 cagcagygag gcaaacaatg a 2001 17 <210> 39 <21 1 > 26 <212> ADN <21 3> artificial <220> <223> Cebador PCR de secuencia artificial <400>39 cgcggattgc tcccttaaca atgagg 26 <210> 40 <2 l 1 - 1618 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cassete de expresión CmpS-synGFPI-nos de secuencia artificial <40O40 tcct gcaga caaagtggca gacatactgt cccacaaatg aagatggaat ctgtaaaaga 60 aaacgcgtga aataatgcgt ctgacaaagg ttaggtcggc tgcctttaat caatacca-.a 120 gtggtcccta ccacgatgga aaaactgtgc agtcggtttg gctttttctg acgaacaaat 180 aagattcgtg gccgacaggt gggggtccac catgtgaagg catcttcaga cteran ant 240 ggagcaatga cgtaagggct ta gaaataa gtaagggtag tttgggaaat gtccactcac 300 ccgtcagtct ataaatactt agcccctccc tcaLtgttaa gggagcaaaa tetcagagag 360 atagtcctag agagagaaag agagcaagta geetragaagt aggatccacc atgctgcaga 420 tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccggcg tggtgccaat cctggtggag ctggacggcg 480 acgtgaacgg ccacaagttc agcgtgagcg gcgagggcga gggcgacgcg acctacggca 540 agctgaccct gaaqttcatc tqtaccaccq qcaaqctccc qqtcccqtqq ccqaccctqq 600 tgaccacctt cacctacggc gtgcagtgtt tcagccgcta cccggaccac atgaagcgcc 660 acgacttctt caagagcgcc atgccggagg gctacgtaag tttctgcctc tacctttgat 720 atatatataa taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatat ttttttcaaa 780 ataaaagaat gtagtatata gcaattgctt ttctgtagtt tataagtgtg tatattttaa 840 tttataactt ttctaatata tgaccaaaat ttgttgatgt gcaggtgcag gagcgcacca 900 tcagcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 960 cactagtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatccCgg 1020 gccacaagct ggagrtacaac tacaacagcc acaacgtgta catcaccgcg gacaagcaga 1080 agaacggcat caaggcgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 1140 tggccgacca ctaccagcag aacaccccga tcggcgacgg tcctgtgctg ctgccggaca 1200 accactacct gagcacccag agcgccctga gcaaggaccc gaacgagaag cgcgaccaca 1260 tggtgctgct ggagttcgtg accgccgccg gcatcaccca cggcatggac gagctgtaca 1320 aggttaacta gagctcaaga tcccccgaat ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa 1380 agtttcttaa gattgaatcc CgCtgccggt cCCgcgaCga CCaCcaCcta atttctgttg 1440 aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt 1500 tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc 1560 gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgc CacCagatcc gggaatcg 1618 <210>41 <211>2730 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cassette de expresión CmpS-GIG-nos de secuencia artificial <400>41 aggatcctgg cagacaaagt ggcagacata ctgtcccaca aatgaagatg gaatctgtaa 60 aagaaaacgc gtgaaataat gcgtctgaca aaggttaggt cggctgcctt taatcaatac 120 caaagtqqtc cctaccacga tggaaaaact gtgcagtcgg tttggctttt tctgacgaar 1 RO aaataagatt cgtggccgac aggtgggggt ccaccatgtg aaggcatctt cagactccaa 240 taatggagca atgacgtaag ggcttacgaa ataagtaagg gtagtttggg aaatgtccac 300 tcacccgtca gtctataaat acttagcccc tccctcattg ttaagggagc aaaatctcag 360 agagatagtc ctagagagag aaagagagca agtagcctag aagtaggatc ccctcgaggt 420 cgaccatggt ccgtcctgta gaaaccccaa cccgtgaaat caaaaaactc gacggcctgt 480 gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg gaattgatca gcgttggtgg gaaagcgcgt 540 tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa cgatcagttc gccgatgcag 600 atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga agtctttata ccgaaaggtt 660 gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgrggt ac t^atta gg aaagtgtggg 720 tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca 780 cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtaagtttct gcttctacct ttgatatata 840 tataataatt atcattaatt agtagtaata taatatttca aatatttttt tcaaaataaa 900 agaatgtagt atatagcaat tgcttttctg tagtttataa gtgtgtatat tttaatttat 960 aacttLL La dtdLalgacc aaaatttgtt gatgtgcagg tatcaccgtt tgtgtgaaca 1020 acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga 1080 aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc 1140 tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat gtcgcgcaag 1200 actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc agcgttgaac ' 1260 tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg actttgcaag 1320 tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg tgcgtcacag 1380 ccaaaagcca gacagagtgt gatatccacc cgcttcgcgt cggcatccgg tcagtggcag 1440 tgaagggcga acagttectg attaaccaca aaccgtccca ccccactggc tttggtcgtc 1500 atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tegataaegt gctgatggtg cacgaccacg 1560 cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct tacgcCgaag 1620 agatgetega cLgyycaydt gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact gctgctgtcg 1680 gctctaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa gaactgtaca 1740 c/cgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcacCC acaggcgatt aaagagctga 1800 tagcgcgtga caaaaac ac caaycytyy tyatgtggag tattgecaac gaaccggata 1860 cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc ggaagcaacg cgtaaact g 1920 acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg cgacgctcac accgatacca 1980 c dycyaLc-c c-tttyatgtg ctgtgcctga accgttatta cggatggtat gtccaaagcg 2040 gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact tctggcctgg caggagaaac 2100 tgcaccagcc gaCCaCcaCc accgaaCacg gcgtggatac gttagccggg ctgcactcaa 2160 tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg gctggatatg tatcaccgcg 2220 tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg gaatttcgcc gattttgcga 2280 ccccgcaagg caCaCtgcgc gctggcggta acaagaaagg gatetteact cgcgaccgca 2340 aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac tggcatgaac ttcggtgaaa 2400 aaccgcagca gggaggcaaa caatgaatca acaactctcc tggcgcacca tcgtcggcta 2460 cagcctcggg aattagatec ccgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt 2520 tettaagatt gaatcccgCC gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt 2580 acgttaagca tgtaacaaCt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggccttta 2640 tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa 2700 actaggaCaa aCCatcgcgc gcggtgtcat 2730 <210> 42 <21 1 > 1577 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cassette de expresión CmpS-synGFPI-nos de secuencia artificial <400>42 tggcagacaa agtggcagac atactgtccc acaaatgaag atggaatctg taaaagaaaa 60 cgcgtgaaat aatgcgtctg acaaaggtta ggtcggctgc ctttaatcaa taccaaagtg 120 gtccctacca cgatggaaaa actgtgcagt cgyLLLyyet Ltttctgacg aacaaacaay 180 attcgtggcc gacaggtggg ggtccaccat gtgaaggcat cttcagactc caataatgga 240 gcaatgacgt aagggcttac gaaataagta agggtagttt gggaaatgtc cactcacccg 300 tcaqtctata aatacttagc ccctccctca ttgttaaggg agr-aargatc cgcgaagggc 360 gaattcgttt aaacctgcag atgagcaagg gcgaggagct gttcaccggc gtggtgccaa 420 tcctggtgga gctggacggc gacgtgaacg gccacaagtt cagcgtgagc ggcgagggcg 480 aggqcgacgc ga ctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgtaccacc ggcaagctcc 540 cggtcccgtg gccgaccctg gtgaccacct tcacctacgg cgtgcagtgt ttcagccgct 600 acccggacca catgaagcgc cacgacttct tcaagagcgc catgccggag ggctacgtaa 660 gtttctgctt ctacctttga tatatatata ataattatca ttaattagrta gtaatataat 720 atttcaaata tttttttcaa aataaaagaa tgtagtatat agcaattgct tttctgtagt 780 ttataagtgt gtatatttta atttataact tttctaatat atgaccaaaa tttgttgatg 840 tgcaggtgca ggagcgcacc atcagcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg 900 aggtgaagtt cgagggcgac acactagtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca 960 aggaggacgg caacatcctg ggccacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaatgtgt 1020 acatcaccgc ggacaagcag aagaacggca tcaaggcgaa cttcaagatc cgccacaata 1080 tcgaggacgg cagcgtgcag ctggccgacc actaccagca gaacaccccg atcggcgacg 1140 gtcctgtgct gctgccggac aaccactacc tgagcaccca gagcgccctg agcaaggacc 1200 cgaacgagaa gcgcgaccac atggtgctgc tggagttcgt gaccgccgcc ggcatcaccc 1260 acggcatgga cgagctgtac aaggttaact agagctctag atccccgaat ttccccgatc 1320 gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga 1380 2 ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aat aacatg taatgcatga 1440 cgCCatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga 1500 tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt 1560 tactagatcg ggaattg 1577 <210>43 <211>2725 <212> ADN " <213> artificial <220> <223> cassette de expresión C pC-GIG-nos de secuencia artificial <400>43 tggcagacaa agtggcagac atactgtccc acaaatgaag atggaatctg taaaagaaaa 60 cgcgtgaaat aatgcgtctg acaaaggtta ggtcggctgc ctttaatcaa taccaaagtg 120 gtccctacca cgatggaaaa actgtgcaqt cqqtttqqct ttttctgacq aacaaataaq 180 attcgCggcc gacaggtggg ggtccaccat gcgaaggcat cttcagactc caacaatcj .i .'40 ycaatgacgt aagggcttac gaaataagta agggtagtCC gggaaaCgtc cactcaccpj !00 Ccagtctata aatacttagc ccctccctca ttgttaaggg agcaacgatc cgcgaaggyc ...0 gaattcctgc agcccggggg atcccctcga ggtcgaccat ggtccgtcct gtagaaaccc 1 "O caacccgtga aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaaei 480 gtggaattga tcagcgttgg tgggaaagcg cgctacaaga aagccgggca attgctqt?/< 510 aggcagttt Caacgatcag ttcgccgatg cagaCattcg taattatgcg ggcaarcj -r (.00 ggtatcagcg cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gcgctgcqtt 660 c ga gcggt cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa ccaggaagtg atgg.igc.it r 2 agc/qcggcta cacgccactt gaagccgatg tcacgccgca tgttattgcc gggaaa.iqrii /'<(' rarytaagtc ftgcttcta cctttgatat acatataata actatcatta att-icjt aqr.i 8-10 atataatatt tcaaatattt ttttcaaaae aaaagaacgt agtatatagc aattgcttti l)()0 ctgtacjttta taagtgtgta tattttaatt C CauctttL ctuatatatg accaaaattt 9G0 gttgatgtgc aggtatcacc gtttgtgtga acaacyaa(-.t yaa(-Cyyt.dy accaccccgc 1020 cgqgaatgst gattacrgar gaa arg c? agaaaaagca gtcttacttc catgatttct 1080 ! ?-aactatgc cqqaatccat cgcagcgr a rqrrrr i ¿o < ..< tjt'-<, d.'.--ggg-gg ? ?4Q a gatatcae cgtggtgacg catgtcgcgc aagactgtaa eeacyCyCcE yttyactggc 1200 aggtggtggc caatggtgat gtcagcgttg aactgcgtga t?fcgyatcaa cayyCyyt?.y 1260 caactggaca aggcactagc gggactttgc aagtggtgaa tccgeacctc Eyy ddceyy 1320 gtqaaggtta t tctatgaa ctgtg gtca cagccaaaay ccagacagag tyEyatatc- 1380 acccycttcg cgtcggcatc cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagecc CEyattadi-c 1440 acaaaccgtt ctactttact gg tttggtc gtcatgaaga tgcggaCEEy cyC yCc-ddy 1500 gattegataa cgtgctgatg gtgcacgacc acgcattaat ggactggatt ggggccaact 1560 cctaccgtac ctcgcattac ccttacgceg aayagaEget cyacEyyyca yacgaacatg 1620 g atcqtqqt qattqatqaa actqctgctg EeggeEEEaa eeceECEEE-. ygcattggtt 1680 tcgaagcggg caacaagccg aaagaactyE acag yaaya yycaytcaác ggggaaactc Í740 agcaagcgca cttacaggcg attaaagagc egaeagcyey Ey ¿d d-.--c cacec dgeg 1800 tggtgatytg gagtattgcc aacgaaccgg atacccgEcc gcaaggty a cyyyaaCdEE 1360 tcgcgccact ggcggaagca acgcgtaaac Ei?yaeeeyae yc-yEcuyaE d ctgcgtca 1920 atgtaatgtt ctgcgacgct cacaccgata ccaEcagcya ECECECEy-.t ycyctgtgcc 1980 tgaaccgtta ttacggatgg tatgtccaaa geyyCyaEEE yga-i-icgyca gagaaggtac 2040 tggaaaaaga acttctggcc tgg ayyaga aCEycaC d yccgattdtc ateacegaat 2100 acggcgtgga tacgttagcc ggg tgcact eaaEgEaeac -.yac-dEyEyy ayEyaagagt 2160 atcagtgtgc atggcCyyafe aEgtaEcace ycgtctttga ccgcgtcagc gccgtcgtcg 1220 gtgaacaggt atggaatttc gccgattttg cgaecEsgea aygedEatty cycyLLyycg 2280 gtaacaagaa agggatcttc actcgcgacc gc aaC ydd yLcyycyycc cttctgctgc 2340 aaaaacgctg gactggcatg aactteggEy cta?dac- y ycayyydyyc ddacddtgdd 2 GO tcaacaactc tcctggcgca ccatcgtcgg rtaragretc gggaa.taga t cccgaatt 2460 tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggec 2520 ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt 2580 aatgcatgac gttatttatg agatgggttt tcatgattag agtcccgcaa ttatacattt 2640 aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt 2700 catctatgtt actagatcgg gaatt -72- <210> 44 <21 1 > 9172 <212> ADN <213> artificial <220> <223> vector de secuencia artificial pNOV21 17 <400>44 aagcctggcg cgccggtacc agcttgcatg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc 60 ctctcCagag atdacgagca CCgcatgtct aagttataaa addltaccac atattttttt 120 cgtcacacct gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct 180 acgaataata CaaCcCaCag Cactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg 240 aacagtcaga cacggcctaa aggacaattg agcaccccga caacaggact ctacagt.Ctc 300 acccccccag CgCgcaCgcg cCcCccCCCC CCCCtgcaaa tagcttcacc tatataatac 360 ttcatccatt CtaCCagCac atccatttag ggttcagggc taatggtttt tatagactaa 420 tttcttcagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct 480 attctagttt CCCCaCCCaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa 540 aCCaaacaaa Caccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag 600 Cagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 660 agcagcgtcg cgccgggcca agcgaagcag acggcacggc aCcCcCgCcg cCgccCcCgg 720 acccctcccg agagttccgc Cccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 780 gcgcggcgga gcggcagacg Cgagccggca cggcaggcgg ccCccCccCc cCcCcacggc 840 accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 900 gtaataaata gacacccccc ccacaccccc CCtccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca 960 cacacacaca accagatctc c ccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc 1020 cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt 1080 tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc 1140 cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa 1200 cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg cagacgggat 1260 cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt 1320 caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt 1380 gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact 1440 acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt catagttacg 1500 aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgcgggttt 1560 tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg 1620 ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt 1680 tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag tttaagatgg 1740 atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac 1800 atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat 1860 aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc 1920 agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt 1980 -¡ r tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct gcagggatcc ccgatcatgc 2040 aaaaactcat taactcagtg caaaactatg cctggggcag caaaacggcg ttgactgaac 2100 tttatggtat ggaaaatccg tccagccagc cgatggccga gctgtggatg ggcgcacatc 2160 cgaaaagcag ttcacgagtg cagaatgccg ccggagatat cgtttcactg cgtgatgtga 2220 ttgagagtga taaatcgact ctgctcggag aggccgttgc caaacgcttt ggcgaactgc 2280 ctttcctgtt caaagtatta tgcgcagcac agccactctc cattcaggtt catccaaaca 2340 aacacaattc tgaaatcggt tttgccaaag aaaatgccgc aggtatcccg atggatgccg 2400 0 ccgagcgtaa ctataaagat cctaaccaca agccggagct ggtttttgcg ctgacgcctt 2460 tccttgcgat gaacgcgttt cgtgaatttt ccgagattgt ctccctactc cagccggtcg 2520 caggtgcaca tccggcgatt gctcactttt tacaacagcc tgatgccgaa cgtttaagcg 2580 aactgttcgc cagcctgttg aatatgcagg gtgaagaaaa atcccgcgcg ctggcgattt 2640 26 Caaaaccggc ccCcgaCagc cagcagggtg aaccgCggca aacgacccgt ttaatttctg 2700 aattttaccc ggaagacagc ggtctgttct ccccgctatt gctgaatgtg gtgaaatCga 2760 accccggcga agcgacgccc cCgtCcgcCg aaacaccgca cgcCCaccCg caaggcgCgg 2820 cgctggaagt gatggcaaac tccgataacg tgctgcgtgc gggtctgacg cctaaataca 2880 CCgatattcc ggaactggtt gccaatgtga aattcgaagc caaaccggct aaccagttgt 2940 tgacccagcc ggtgaaacaa ggtgcagaac tggactCccc gaCCccagCg gaCgacccCg 3000 cccccccgct gcatgacctt agtgataaag aaaccaccat tagccagcag agtgccgcca 3060 tttcgccctg cgtcgaaggc gacgcaacgc tgtggaaagg tccccagcag ttacagctta 3120 aaccgggtga atcagcgttt atcgccgcca acgaaccacc ggtgaccgCc aaaggccacg 3180 gccgctCagc gcgcgtttac aacaagctgt aagagcttac tgaaaaaatt aacatctctt 3240 gctaagctgg gagctcgatc cgtcgacctg cagatcgttc aaacatttgg caataaagCC 3300 tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt 3360 acgttaagca tgtaacaaCt aacaCgCaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta 3420 tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa 3480 actaggacaa attatcgcgc gcggtgtcat ctdtyttauL dydLctycLd yccctg agg 3540 aaatttaccg gtgcccgggc ggccagcatg gccgtatccg caatgtgtta ttaagttgtc 3600 taagcgtcaa CCCgCCtaca ccacaatata tcctgccacc agccagccaa cagctccccg 3660 accggcagct cggcacaaaa tcaccactcg ata ayy ay ctLdL dydd ttaaCCctca 3720 tgtCCgacag cttatcatcg actgcacggt gcaccaatgc ttctggcgtc aggcagccat 3780 cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg ccgctcaagg 3840 cgcactcccg ttctggataa Cgttttttgc gccgacatca taacggttcc ggcaaacacc 3900 ccgaaacgag ctgttgacaa cCaaCcaCcc ggcCcgcata atgtgtggaa ttgtgagcgg 3960 ataacaattt cacacaggaa acagaccatg agggaagcgt tgatcgccga agtatcgact 4020 caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag cgccatctcg aaccgacgtc gctggrrgra -1080 cattcgcacg gccccgcagt ggatggcggc ctgaagccac acagtgatat tgatttgctg 4140 gttacggtga ccgtaaggc tgatgaaaca acgcggcgag ctttgatcaa cgaccttttg 4200 gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag attctccgcg ctgtagaagt caccattgtt 4260 gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat ccagctaagc' gcgaactgc-d aLttygagaa 4320 tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc ttcgagccag ccacgatcga cattgatctg 4380 gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat agcgttgcct tggtaggtcc agcggcggag 4440 gaactctrtg atccggttcc tgaacaggat ctat.ttgagg cgctaaatga aaccttaacg 4500 ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc gatgagcgaa atgtagtgct tacgttgtcc 4560 cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa atcgcgccga aggatgtcgc tgccgactgg 4620 gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag ccc-gtcatac ttgaagctag gcaggcttat 4680 cttggacaag aagatcgctt ggcctcgcgc gcagatcagt tggaagaatt tgttcactac 4740 gtgaaaggcg agatcaccaa agtagtcggc aaataaagct ctagtggatc tccgtacccc 4800 cgggggatct ggctcgcggc ggacgcacga cgccggggcg agaccatagg cgatcLc- ta 4860 aatcaatagt agctgtaacc tcgaagcgtt tcacttgtaa caacgattga gaatttttgt 4920 cataaaattg aaatacttgg ttcgcatttt tgtcatccgc ggtcagccgc aattctgacg 4980 aactgcccat ttagctggag atgar.tgtac atccttcacg tgaaaatttc tcaagcgctg 5040 tgaacaaggg ttcagatttt agattgaaag gtgagccgtt gaaacacgtt cttcttgtcg 5100 atgacgacgt cgctatgcgg catcttatta ttgaatacct tacgatccac gccttcaaag 5160 tgaccgcggt agccgacagc acccagttca caagagtact ctcttccqcq acgqtcgatg 5220 tcgtggttgt tgatctaaat ttaggtcgtg aagatgggct cgagatcgtt cgtaatctgg 5280 cggcaaagtc tgatattcca atcataatta tcagtggcga ccgccttgag gagacggata 5340 aagttgttgc actcgagcta ggagcaagtg attttatrgc taagccgtt agtatcagag 5400 agtttctagc acgcattcgg gttgccttgc gcgtgcgccc caacgttgtc cgctccaaag 5460 accgacggtc tttttgtttt actgactgga cacttaatct caggcaacgt cgcttgatgt 5520 ccgaagctgg cggtgaggtg aaacttacgg caggtgagtt caatcttctc ctcgcgtttt 5580 tagagaaacc ccgcgacgtt ctatcgcgcg agcaacttct cattgccagt cgagtacgcg 5640 acgaggaggt ttatgacagg agtatagatg ttctcatttt gaggctgcgc cgcaaacttg 5700 aggcagatcc gtcaagccct caactgataa aaacagcaag aggtgccggt tatttctttg 5760 acgcggacgt gcaggtttcg cacgggggga cgatggcagc ctgagccaat tcccagatcc 5820 ccgaggaatc ggcgtgagcg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg gcgcggcgct - 5880 gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc aacgcatcga 5940 ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc gcaaagaatc 6000 ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca 6060 accagattcc cccgctccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc gcagcatcat 6120 ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg tgatccgcta 6180 cgagcttcca gacgggcacg cagaggCCCc cgcagggccg gccggcaCgg ccag gtgtg 6240 ggattacgac ctggtactga tggcggtccc ccatcCaacc gaaCccaCga accgataccg 6300 ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa 6360 gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa cctgcattcg 6420 gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg gccgcctggt 6480 gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga gcgaaaccgg 6540 gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga tcacagaagg 6600 caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg 6660 ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca gatggttgtt 6720 caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt 6780 gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca 6840 ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg 6900 ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa 6960 aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg 7020 gaacccgcac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac 7080 tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac 7140 ccttaaaacc cgcctggccc gCgcaCaacC gtctggccag cgcacagccg aagagctgca 7200 aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat 7260 cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg 7320 acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgctgaggt ctgcctcgtg aagaaggtgt 7380 tgctgaccca CaccaggccC gaatcgcccc atcatccagc cagaaagtga gggagccacg 7440 gttgatgaga gctttgttgt aggtggacca gttggtgatt ttgaactttt gctttgccac 7500 ggaacggtct gcgttgtcgg gaagatgcgt gatctgatcc ttcaactcag caaaagttcg 7560 atttattcaa caaagccgcc gtcccgtcaa gtcagcgtaa tgctctgcca gtgttacaac 7620 caattaacca attctgatta gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg caatctattc 7680 atatcaggat tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac -7740 ccaccgaggc agCCccatag gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt 7800 ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa 7860 tcaccatgay tgdcydctya atccggtgag aatggcaaaa gctctgcatt aatgaatcgg 7920 ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 7980 ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 8040 acggtr.atcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagcn fUOO aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 8160 tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 8220 aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 8280 gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 8340 acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttc -. tcc aagctgggct gtgtgcacga 8400 accccccqtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 8460 ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 8520 gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aacCacggcC acactagaag 8580 aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 8640 ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 8700 gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 8760 cgctcagtgg aacgaaaacC cacgCCaaqq qattttqqtc atqaqattat caaaaaggat 8820 cttcacctag aCccCCttga tccggaatta attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg 8880 gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt taaatatccg attattctaa taaacgctct 8940 ' tttctcttag gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc 9000 gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga attaagggag tcacgttatg acccccgccg 9060 atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatc 9120 ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc gcgccgaatt cgagctcggt ac ' 9172 <210> 45 <211 > 8849 <212> ADN <213> artificial <220> <223> vector de secuencia artificial pNOV4200 <400>45 ggtacccccg ggggatcctc tagagtcgac catggtgatc actgcaggca tgcaagcttc 60 gtacgttaat taattcgaat ccggagcggc cgcacgcgtg ggcccgttta aacctcqaqa 120 gatctgctag ccctgcagga aatttaccgg tgcccgtacc ggatttggag ccaagtctca 180 taaacgccat tgtggaagaa agtcttgagt tggtggtaat gtaacagagt agtaagaaca 240 gagaagagag agagtgtgag atacatgaat tgtcgggcaa caaaaatcct gaacatctta 300 ttttagcaaa gagaaagagt tccgagtctg tagcagaaga gtgaggagaa atttaagctc 360 ttggacttgt gaattgttcc gcctcttgaa tacttcttca atcctcatat attcttcttc 420 tatgttacct gaaaaccggc atttaatctc gcgggtttat tccggttcaa catttttttt 480 gttttgagtt attatctggg cttaataacg caggcctgaa ataaattcaa ggcccaactg 540 tttttttttt taagaagttg ctgttaaaaa aaaaaaaagg gaattaacaa caacaacaaa 600 aaaagataaa gaaaataata acaattactt taattgtaga ctaaaaaaac atagatttta 660 tcatgaaaaa aagagaaaag aaataaaaac ttggatcaaa aaaaaacata cagatcttct 720 aattattaac ttttcttaaa aattaggtcc tttttcccaa caattaggtt tagagttttg 780 gaattaaacc aaaaagattg ttctaaaaaa tactcaaatt tggtagataa gtttccttat 840 tttaattagt caatggtaga tacttttttt tcttttcttt attagagtag attagaatct 900 tttatgccaa gtattgataa attaaatcaa gaagataaac tatcataatc aacatgaaat 960 taaaagaaaa atctcatata tagtattagt attctctata tatattatga ttgettatt 1020 ttaatgggtt gggttaacca agacatagtc ttaatggaaa gaatcttttt tgaaettttt 1080 ccttattgat taaattcttc tatagaaaag aaagaaatta tttgaggaaa agtatataca 1140 aaaagaaaaa tagaaaaatg tagtgaagc agatgtaatg gatgacctaa tccaaccacc 1200 accataggat gtttctactt qaqtcqgtct tttaaaaacg cacggtggaa aatatgacac- 1260 gtatcatatg attccttcct ttagtttcgt gataataatc ctcaactgat atcttccttt 1320 ttttgttttg gctaaagata ttttattctc attaatagaa aagacggttt tgggcttttg 1.380 gtttgcgata taaagaagac cttcgtgtgg aagataataa ttcatccttt cgtcttt.tr- J440 tgactcttca atctctccca aagcctaaag cgatctctgc aaatctctcg cgactctctc 1500 tttcaaggta tattttctga ttctttttgt ttttgattcg tatctgatct ccaatttttg 1560 ttatgtggat tattgaatct tttgtataaa ttgcttttga caatattgtt cgtttcgtca 1620 atccagcttc taaattttgt cctgattact aagatatcga ttcgtagtgt ttacat tgt 1680 gtaatttctt gcttgattgt gaaattagga ttttcaagga cgatctattc aatttttg.g 1740 ttttctttgt tcgattctct ctgttttagg tttcttatgt ttagatccgt ttctctttqq 1800 tgttgttttg atttctctta cggcttttga tttggtatat gttcgctgat tggtttctac 1860 ttgttctatt gttttatttc aggtggatct cgactctagg ggggcaataa gatatgaaaa 1920 agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga agtttctgat cgaaaagttc gacagcgtct 1980 ccgacctgat gcagctctcg gagggcgaag aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag 2040 ggcgtggata tgtcctgcgg gtaaatagct gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg 2100 tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc cgattccgga agtgcttgac attggggcat 2160 tcagcgagag cctgacctat tgcatctccc gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc 2220 tgcctgaaac cgaactgccc gctgttctgc agccggtcgc ggaggccatg gatgcgatcg 2280 ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc 2340 aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg cgattgcfga tccccatgtg tatcactggc 2400 aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt ccgtcgcgca ggctctcgat gagctgatgc 2460 tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc acctcgtgca cgcggatttc ggctccáaca 2520 atgtcctgac ggacaatggc cgcataacag cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg 2580 gggattccca atacgaggtc gccaacatct tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg 2640 agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc atccggagct tgcaggatcg ccgcggctcc 2700 gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc aactctatca gagcttggtt gacggcaatt 2760 tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga 2820 ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag 2880 aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc ccagcacCcg tccgagggca aaggaacaga 2940 gtagatgccg accgggatcc ccgaatttcc ccgaCcgCCc aaacaCCCgg caataaagtc 3000 CcCCaagaCC gaaCcccgCC gccggCcCCg cgaCgaCCac caCaCaaccc ctgCCgaatt 3060 acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgCC acccaCgaga cgggCCCCCa 3120 Cgattagagt cccgcaatta tacattCaaC acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa 3180 _ actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa ttgggtacgg 3240 b gcggccagca tggccgtatc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc aatttgttta 3300 caccacaata tatcctgcca ccagccagcc aacagcCccc cgaccggcag cCcggcacaa 3360 aatcaccact cgatacaggc agcccatcag aaccaaCCcC caCgCCCgac agcCCaCcac 3420 cgacCgcacg gCgcaccaac gcCtctggcg tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc 3480 tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat 3540 aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg agttgttgac 3600 0 aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 3660 aaacagacca tgagggaagc gttgatcgcc gaagtatcga ctcaactatc agaggtagtt 3720 ggcgtcatcg agcgccatct cgaaccgacg ttgctggccg tacatCCgCa cggcCccgca 3780 g ggatggcg gccCgaagcc acacagtgat attgatccgc CggCCacggC gaccgCaagg 3840 cCCgaCgaaa caacgcggcg agcCCtgatc aacgaccttt tygaaacttc ggcttc-L.-i-.ct 3900 ggagagagcg agatCcCccg cgcCgCagaa gccaccaccg CCgCgcacga cgacaCcatt 3960 ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg caat tggag aacggcagcg caaCgacaCC 4020 5 cCCgcaggCa Cccccgagcc agccacgaCc gacaCCgacc CggcCaCcCt gctgacaaaa 4080 gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg aggaactcCC CgaCccggtt 4140 cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa cgctatggaa ctcgccgccc 4200 gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt cccgcatttg gtacagcgca 4260 gtaaccggca aaaCcgcgcc gaaggaCgCc gctgccgact gggcaatgga gcgcctgccg 4320 gcccagtatc agcccgtcac acccgaagcc aggcaggctt atcttggaca agaagatcgc ,4380 0 ttggcctcgc gcgcagatca gttggaagaa tttgttcacc acgCgaaagg cgagatcacc 4440 aaagtagtcg gcaaataaag ctctagtgga tctccgta c cccgagggat tga t g g 4500 gcggacgcac gacgccgggg cgagaccata ggcgatctcc taaatcaata gtagctgtaa 4560 cctcgaagcg tttcacttgt aacaacgatt gagaattttt qtcataaaat tqaaatactt 4620 ggttcgcatt tttgtcatcc gcggtcagcc gcaattctga cgaactgccc atttagctgg 4680 agatgattgt acatccttca cgtgaaaatt tctcaagcgc tgtgaacaag ggttcagatt 4740 ttagattgaa aggtgagccg ttgaaacacg ttcttcttgt cgatgacgac gtcgctatgc 4800 ggcatcttat tattgaatac cttacgatcc acgccttcaa agtgaccgcg gtagccgaca 4860 gcacccagtt cacaagagta ctctcttccg cgacggtcga tgtcgtggtt gttgatctag 4920 atttaggtcg tgaagatggg ctcgagatcg ttcqtaatct qqcqgcaaaq tctgatattc 4980 caatcataat tatcagtggc gaccgccttg aggagacgga taaagttgtt gcactcgagc 5040 taggagcaag tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgca tc 5100 gggttgcctt gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt 5160 ttactgactg gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg 5220 tgaaacttac ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg 5280 ttctatcgcg cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca 5340 ggagtataga tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc 5400 ctcaactgat aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt 5460 cgcacggggg gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag 5520 cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga 5580 gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg 5640 tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc 5700 cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc 5760 gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg 5820 tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca 5880 cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact 5940 gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa 6000 gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga 6060 tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt • 6120 tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga 6180 agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga 6240 gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct 6300 gacggttcac cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgtttCc ccCaccgccc 6360 ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg 6420 cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc 6480 aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt 6540 catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca 6600 gatgctaggg caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga 6660 tagcacgCac accgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa 6720 cccaaagccg tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa 6780 aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc 6840 ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg 6900 gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc 6960 aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc 7020 actcgaccgc cggcgctgag gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc 7080 ctgaatcgcc ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt 7140 gtaggtggac cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc 7200 gggaagatgc gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg 7260 ccgtcccgtc aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat 7320 tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaacCCaC ccaCaCcagg aCCaCcaata 7380 ccatattttt gaaaaagccg tttctstaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat 7440 aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct 7500 ac aatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact 7560 , gaatccggtg agaatggcaa aagcCcCgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 7620 cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgcccac gacccgccgc gcccggccgc 7680 tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggca atacggctat ccacagaatc 7740 aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 7800 aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 7860 tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc '7920 ccctggaagc tcccLcytyc ycLctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gaeacccgrr 7980 cqc tttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcay 8040 ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 8100 ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 8160 gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 8220 ayagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg 8280 cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttgqt qctcttgat ccgg aaa a 8340 aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 8400 aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 8460 ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 8520 gatccggaat taattcctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt 8580 ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct cttttctctt aggtttaccc 8640 ycc-ddLdtat cctgtcaaac actgatagtt taaactgaag gcgggaaacg acaatctgat 8700 catgagcgga gaattaaggg agtcacgtta tgacccccgc cgatgacgcg ggacaagccg 8760 ttttacgttt ggaactgaca gaaccgcaac gctgcaggaa ttggccgcag cggccattta 8820 aatcaattgg gcg gccgaa ttcgagctc 8849 <210>46 <211>2949 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cassette de expresión del término ZmUb¡-GFP-35S de la secuencia artificial <400>46 gcatgcctgc agtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat gagcattgca 60 tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt 120 tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtacta 180 caataacatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac 240 aattgagta tccgacaaca ggacCcCaca gccccacccc ccagcgtgc atyLyLLcLc 300 ctttttcttc gcaaacagcc ccaccCacat aatacttcat ccattttatt agtacatcca 360 tttagggccc agggCCaaCg gCCCCCaCag actaattttt ttagtacatc tattttattc 420 tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaataatt 480 tagatataaa acagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat 540 taaaaaaact aaggaaacaC cccccccgct tcgagtagac aacgccagcc CgCCaaacgc 600 cgccgacgag cccaacggac accaaccagc gaaccagcag cgCcgcgCcg ggccaagcga 660 agcagacggc acggcacctc tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt tccgctccac 720 cgttggactt gctccgctgt cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc 780 cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcacggc agcCacgggg gattcctttc 840 ccaccgctcc ttcgcccccc cccccCcgcc cgccgCaaCa aaCagacacc cccCccacac 900 ccCctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa 960 atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccctct 1020 ctaccttctc CagaCcggcg CCccggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt 1080 catgtttgtg ttagatccgt gttcgCgcca gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat 1140 gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaactcgcc agCgCCCcCc CCCggggaaC 1200 cccgggacgg cCctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt 1260 • tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc 1320 gggtcatctt tCcaCgcCCC tttttgtctt ggttgtgacg aCgCggtctg gtcgggcggt 1380 cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggacccaCC aaccccggac 1440 ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc 1500 gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt 1560 ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcatccg ttctagatcg 1620 gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg taCttatCaa ttttggaact gtatgtgtgt 1680 gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta 1740 37 tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca 1800 tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttca taattatttt 1860 gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggactt ttttagccct 1920 gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgccc accctgttgt 1980 ttggtgttac ttctgcaggt cgactctaga ggatccacca tgctgcagat gagcaagggc 2040 gaggagctgt tcaccggcgt ggtgccaatc ctggtggagc tggacggcga cgtgaacggc 2100 cacaagttca gcgtgagcgg cgagggcgag ggcgacgcga cctacggcaa gctgaccctg 2160 aagttcatct gtaccaccgg caagctcccg gtcccgtggc cgaccctggt gaccaccttc 2220 acctacggcg tgcagtgttt cagccgctac ccggaccaca tgaagcgcca cgacttcttc 2280 aagagcgcca tgccggaggg ctacgtgcag gagcgcacca tcagcttcaa ggacgacggc 2340 aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca cactagtgaa ccgcatcgag 2400 ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg gccacaagct ggagtacaac 2460 tacaacagcc acaacgtgta catcaccgcg gacaagcaga agaacggcat caaggcgaac 2520 ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tggccgacca ctaccagcag 2580 aacaccccga tcggcgacgg tcctgtgctg ctgccggaca accactacct gagcacccag 2640 agcgccctga gcuaggaccc gaacgagaag cgcgaccaca tggtgctgct ggagttcgtg 2700 accgccgccg gcatcaccca cggcatggac gagctgtaca aggttaacta gagctcaaga 2760 tctgttctgc acaaagtgga gtagtcagtc atcgatcagg aaccagacac cagactttta 2820 ttcatacagt gaagtgaagt gaagtgcagt gcayl-yagtt gctggttttt gtacaactta 2880 gtatgtattt gtatttgtaa aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc taaaaccaaa 2940 atccagtgg 2949 <210>47 <211> 4341 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cassette de exDresión ZmUBi-GIG-nos de secuencia artificial <400>47 38 cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag acaatgagca ttgcatgtct 60 aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct 120 atctttatac atacacttaa acCtcacCct acgaaCaaCa taatctacag acCacaata 180 atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga catggtctaa aggacaattg 240 agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt 300 tCCCCgcaaa cagctccacc cacacaatac ttcatccatt ttattagtac atcrarrr g 360 ggcctagggt caacggctcc tatagacCaa CCCttttagt acatctattt tattctactt 420 tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat 480 ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa 540 aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg 600 acgagtccaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag 660 acggcacggc atctccgccg cCgccCcCgg accccCcCcg agagttccgc tccaccgttg 720 gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca 780 cggcaggcgg cctcctcctc cCctcacggc accggcagct acgggggact cctttcccac 840 cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccc ccacacccCc 900 CCCccccaac ctcgtgtCgC Ccggagcgca cacacacaca accagaCccc ccccaaatcc 960 acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac 1020 cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tct.gttcatg 1080 tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga 1140 cctgcacgCc agacacgctc Cgattgctaa cttgccagtg CCtcCcCttg gggaatcctg 1200 ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg atcccccccg ccccgttgca 1260 tagggtttgg CCCgcccttt Ccctttattt caatatatgc cgCgcacCCg CCCgCcgggt 1320 caCcCCCCca tgctttcttc tgtcttggtt gCgaCgaCgC ggCcCggCCg ggcggCcgtt 1380 ccagaccgga gcagaacccc gtttcaaact acctggtgga CCCaCCaaCC Ctggatccgc 1440 atgtgtgtgc cacacatatc catagt acg aattgaagac gaCggatgga aacaccgacc 1500 taggataggt atacatgCCg acgcgggttc CacCgaCgca CaCacagaga CgcCCCttgt 1560 39 tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt 1620 agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca 1680 tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtntnca 1740 tgttyatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg 1800 ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc 1860 rtgatat ct tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct 1920 tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 1980 tgttacttct gcagggatcc cctcgaggtc gaccatggtc cgtcctgtag aaaccccaac 2040 ccqtqaaatc aaaaaactcq acqqcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg 2100 aattgatcag cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg 2160 cagttttaac gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta 2220 tcagcgcgaa gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga 2280 tgcggtcact cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg 2340 cggctatacg ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg 2400 taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta gtagtaatat 2460 aatatttcaa atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt gcttttctgt 2520 , agtttataag tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca aaatttgttg 2580 atgtgcaggt atcaccgttt gtgtgaacaa cgaactgaac tggcagacta tcccgccggg 2640 aatggtgatt accgacgaaa acggcaagaa aaagcagtct tacttccatg atttctttaa 2700 i ctatgccgga atccatcgca gcgtaatgct ctacaccacg ccgaacacct gggtggacga 2760 j tatcaccgtg gtgacgcatg tcgcgcaaga ctgtaaccac gcgtctgttg actggcaggt 2820 ¡ ggtggccaat ggtgatgtca gcgttgaact gcgtgatgcg gatcaacagg tggttgcaac 2880 > tggacaaggc actagcggga ctttgcaagt ggtgaatccg cacctctggc aaccgggtga 2940 aggttatctc tatgaactgt gcgtcacagc caaaagccag acagagtgtg atatctaccc 3000 gcttcgcgtc ggcatccggt cagtggcagt gaagggcgaa cagttcctga ttaaccacaa 3060 accgttctac tttactggct ttggtcgtca tgaagatgcg gacttgcgtg gcaaaggatt 3120 cgataacgtg ctgatggtgc acgaccacgc attaatggac tggattgggg ccaactccta ' 3180 ccgtacctcg cattaccctt acgctgaaga gatgctcgac tgggcagatg aacatggcat 3240 cgtggtgatt gatgaaactg ctgctgtcgg ctttaacctc tctttaggca ttggtttega 3300 agcgggcaac aagccgaaag aactgtacag cgaagaggca gtcaacgggg aaaetcagea 3360 agegeaetta caggcgatta aagagctgat agcgcgtgac aaaaaccacc caagcgtggc 3420 gatgtggagt attgccaacg aaccggatac ccgtccgcaa ggtgcacggg aatat tege 3480 gccactggcg gaagcaacgc gtaaactcga cccgacgcgt ccgatcacct gcgtcaatgt 3540 aatgttctgc gacgctcaca ccgataccat cagcgatctc tttgatgtgc tgtgcctgaa 3600 ccgttattac ggatggtatg tccaaagcgg cgatttggaa acggcagaga aggtactgga 3660 aaaagaactt ctggcctggc aggagaaact gcatcagccg attatcatca cegaataegg 3720 cgtggatacg ttagccgggc tgcactcaat gtacaccgac atgtggagtg aagageacca 3780 gtgtgcatgg ctggatatgt atcaccgcgt ctCCgaCcgc gCcagcgccg CcgCcggCga 3840 acaggtatgg aatttcgccg attttgcgac ctcgcaaggc atattgcgcg ttggcggtaa 3900 caagaaaggg atcttcactc gcgaccgcaa accgaagtcg gcggcttttc tgctgcaaaa 3960 acgctggact ggcatgaact tcggtgaaaa accgcagcag ggaggcaaac aatgaatcaa 4020 caactctcct ggcgcaccat cgtcggctac agcctcggga attagat ce cyaatttccc 4080 cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 4140 gatgattatc atataattte tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg 4200 catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc cegeaattat acatttaata 4260 cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 4320 tatgttacta gatcgggaat t 4341 <210> 48 <21 1 > 2943 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cassette de expresión UbP3(At)-synGFP,-nos de secuencia artificial <400>48 accggatttg gagccaagtc tcataaacgc cattgtggaa gaaagtcttg agttggtggt 60 aatgtaacag agtagtaaga acagagaaga gagagagtgt gagatacatg aattgtcggg 120 caacaaaaat cctgaacatc ttattttagc aaagagaaag agttccgagt ctgtagcaga 180 agagtgagga gaaatttaag ctcttggact tgtgaattgt tccgcctctt gaatacttct 240 tcaatcctca tatattcttc ttctatgtta cctgaaaacc ggcatttaat ctcgcgggtt 300 tattccggtt caacattttt tttgttttga gttattatct gggcttaata acgcaggcct 360 gaaataaatt caaggcccaa ctgttttttt ttttaagaag ttgctgttaa aaaaaaaaaa 420 agggaattaa caacaacaac aaaaaaagat aaagaaaata ataacaatta ctttaattgt 480 agactaaaaa aacatagatt ttatcatgaa aaaaagagaa aagaaataaa aacttggatc 540 aaaaaaaaaa catacagatc ttctaattat taacttttct taaaaattag gtcctttttc 600 ccaacaatta ggtttagagt tttggaatta aaccaaaaag attgttctaa aaaatactca 660 aatttggtag ataagtttcc ttattttaat tagtcaatgg tagatacttt tttttctttt 720 ctttattaga gtagattaga atcttttaLy eaayLüLLy atuauLLaaa t aagaagat 780 aaactatcat aatcaacatg aaattaaaag aaaaatctca tatatagtat tagtattctc 840 tatatatatt atgattgctt attcttaatg ggttgggtta accaagacat agtcttaatg 900 gaaagaatct tttttgaact ttttccttat. t.gattaaatt cttctataga aaagaaagaa 960 attatttgag gaaaagtata tacaaaaaga aaaatagaaa aatgtcagtg aagcagatgt 1020 í-aatggatgac ctaatccaac caccaccata ggatgtttct acttgagtcg gtcttttaaa 1080 aacgcacqqt qqaaaatatq acacgtatca tatgattcct tcctttagtt tcgtgataat 1140 aatcctcaac tgatatcttc ctttttttgt tttggctaaa gatattttat tctcattaat 1200 agaaaagacg gttttgggct tttggtttgc gatataaaga agaccttcgt gtggaagata 1260 ataattcatc ctttcgtctt tttctgactc ttcaatctct cccaaagcct aaagcgatct 1320 ctgcaaatct ctcgcgactc tctctttcaa ggtatatttt ctgattcttt ttgtttttga 1380 ttcgtatctg atctccaatt tttgttatgt ggattattga atcttttgta taaattgctt 1440 ttgacaatat tgttcgtttc gtcaatccag cttctaaatt ttgtcctgat tactaagata 1500 tcgattcgta gtgtttacat ctgtgtaatt tcttgcttga ttgtgaaatt aggattttca 1560 | aggacgatct attcaatttt tgtgttttct ttgttcgatt ctctctgttt taggtttctt 1620 ' atgtttagat ccgtttctct ttggtgttgt tttgatttct cttacggctt ttgatttggt 1680 42 atatgttcgc tgattggttt ctacttgttc tattgtttta tttcaggtgg atccaccacg 1740 ¡ ctgcagatga gcaagggcga ggagctgttc accggcgtgg tgccaatcct ggtggagetg 1800 gacggcgacg tgaacggcca caagttcagc gtgagcggcg agggcgaggg cgacgcgacc 1860 tacggcaagc tgaccctgaa gtteatctgt accaccggca agctcccggt cccgtggccg 1920 accctggtga ccaccttcac ctacggcgtg cagtgtttca gccgctaccc ggaccacatg 1980 aagcgccacg acttcttcaa gagcgccatg ccggagggct acgtaagttt ctgcttctac 2040 ctttgatata tatataataa ttatcattaa ttagtagtaa tataatattt caaatatttt 2100 tttcaaaata aaagaatgta gtatatagea attgcttttc tgtagtttat aagtgtgcat 2160 acectaattt ataacttttc taatatatga ccaaaatttg ttgatgtgca ggtgcaggag 2220 cgcaccatca gcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 2280 ggcgacacac tagtgaaccg categagetg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 2340 atcctgggcc acaagctgga gtacaactac aacagccaca atgtgtacat caccgcggae 2400 aageagaaga acggcatcaa ggcgaacttc aagatccgcc acaatatega ggacggcagc 2460 | gtgcagctgg ccgaccacta ccagcagaac accccgatcg gcgacggtcc tgtgctgctg 2520 ccggacaacc actacccgag cacccagagc gcccCgagca aggacccgaa cgagaagcgc 2580 gaccacatgg tgctgctgga gttcgtgacc gccgccggca tcacccacgg catggacgag 2640 ctgtacaagg ttaactagag ctctagatcc ccgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg 2700 . caataaagtt tettaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 2760 ' ctgttgaatt acgttaayca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 2820 tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 2880 tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctacgctact agatcgggaa 2940 ttg 2943 , <210> 49 <21 1 > 4072 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cassette de expresión Ubq3(At)-GIG-nos de secuencia artificial <400>49 43 cggatttgga gccaagtctc ataaacgcca ttgtggaaga aagtcttgag ttggtggtaa 60 tgtaacagag tagtaagaac agagaagaga gagagtgtga gatacatgaa ttgtcgggca 120 acaaaaatcc tgaacatctt attttagcaa agagaaagag ttccgagtct gtagcagaag 180 agtgaggaga aatttaagct cttggacttg tgaattgttc cgcctcttga atacttcttc 240 aatcctcata tattcttctt ctatgttacc tgaaaaccgg catttaatct cgcgggttta 300 ttccggttca acattttttt tgttttgagt tattatctgg gcttaataac gcaggcctga 360 aataaattca aggcccaact gttttttttt ttaagaagtt gctgttaaaa aaaaaaaaag 420 ggaattaaca acaacaacaa aaaaagataa agaaaataat aacaattact ttaattgtag 480 act--aaaaaa catagatttt atcatgaaaa aaagagaaaa gaaataaaaa LLyyaLcaa 540 aaaaaaacat acagatette taattattaa cttttcttaa aaattaggtc ctttttccca 600 acaattaggt ttagagtttt ggaattaaac caaaaagatt gttctaaaaa atactcaaat 660 ttggtagata agttteetta ttttaattag tcaatggtag atactttttt ttcttttctt 720 tattagagta gattagaatc ttttatgcca agtattgata aattaaatca agaagataaa 780 ctatcataat caacatgaaa ttaaaagaaa aatctcatat atagtattag tattctctat 840 atatattatg attgcttatt cttaatgggt tgggttaacc aagacatagt cttaatggaa 900 agaatctttt ttgaactttt tccttattga ttaaattctt ctatagaaaa gaaagaaatt 960 atttgaggaa aagtatatac aaaaagaaaa atagaaaaat gtcagtgaag cagatgtaat 1020 ggatgaccta atccaaccac caccatagga tgtttctact tgagr.cggt.c tr.rtaaaaar 10RO gcacggtgga aaatatgaca cgtatcatat gattccttcc tttagtttcg tgataataat 1140 cctcaactga tatetteett tttttgtttt ggctaaagat attttattct cattaataga 1200 aaagacggtt ttgggctttt ggtttgcgat ataaagaaga ccttcgtgtg gaagataata 1260 attcatcctt tcgtcttttt ctgactcttc aatctctccc aaagcctaaa gcgatctctg 1320 caaatctctc gcgactctct ctttcaaggt atattttctg attetttttg tttttgattc 1380 gtatctgatc tccaattttt gttatgtgga ttattgaatc ttttgtataa attgcttttg ' 1440 acaatattgt tcgtttcgtc aatccagctt ctaaattttg tcctgattac taagatatcg 1500 actcgtagtg tttacatctg tgtaatttct tgcttgattg tgaaattagg atttccaagp ...0 acgacctatt caatttttgt gtttcctttg ttcgattctc tctgttttag gtttettaty 1620 CCtagatccg tttcCcCCCg gCgCCgtttt gattccccCC acggcCCCCg attcggcac.i 1680 CgCCcgcCga ccggCCCcCa cCtgttctat tgttttaCCC caggCggacc cccccgaggl 1 MO cgacca ggc ccgCccCgta gaaaccccaa cccgCgaaaC caaaaaactc gacggcctgl L800 gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg gaattgatca gcgttggtgg gaaagcgcgl 1800 Cacaagaaag ccgggcaact gctgtgccag gcagccccaa cgatcagttc gccgatgcací ll>20 atattcgCaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga agcccccaca ccgaaaggtt M80 gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac tcatcacggc aaagcgcggy .'040 ccaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa gccgatgtoi .MOO cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtaagtttct gctcccaccc ttgatatata 2160 tataataatt atcatcaaCC agCagtaata CaaCaCCCca aaCatttttt tcaaaataaa 222.0 agaatgtagt atatagcaat tgcttttctg tagtttataa gtgtgtataC CCCaaCCCat 2280 aacccctcta atatatgacc aaaatttgtt gatgtgcagg tatcaccgtt tgtgtgaaca 2.340 acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga 2400 aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccaccgc agcgCaaCgc 246 Cccacaccac gccgaacacc cgggCggacg aCaccaccgC ggcgacgcac gccgcgcaacj ."VO acCgcaacca cgcgcccgcc gacCggcagg cggtggccaa cggcgatgcc agcgttgaac "'.HO CgcgCgacgc ggaCcaacag gCggCCgcaa cCggacaagg cactagcggg accttgcaaq 2640 tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg tgcgtcacay '700 ccaaaagcca gacagagtgC gacaCccacc cgcCCcgcgc cggcaCccgg tcagtggcay '760 tgaagggcga acagttectg attaaccaca aaccgttcta ctttactggc tCCggtcgtc '820 atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tegataaegt gctgaCggCg cacgaccacq 'Krio caCCaaCgga cCggaCCggg gccaaccccc accgCaccCc gcactacccc CacgcCgaaq 'TOO agacgcccga ccgggcagat gaacacggca Ccgcgg gat tgacgaaact gctgctgtcg '.000 gctCCaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa gaactgcaca U.00 gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgacc aaagagctga U'20 45 tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgecaac gaaccggata 3180 cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttc-g cyccacLyyc yy-idgcadcy cgtdHdctcg 3240 acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg cgacgctcac accgatacca 3300 tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta cggatggtat gtccaaagcg 3360 gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact tctggcctgg caggagaaac 3420 tgcatcagcc gattatcatc acegaataeg gcgtggatac gttagccggg ctgcactcaa 3480 tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg gctggatatg tatcaccgcg 3540 tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg gaatttcgcc gattttgcga 3600 cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg gatetteact cgcgaccgca 3660 aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac tggcatgaac ttcggtgaaa 3720 aaccgcagca gggaggcaaa caatgaatca acaactctcc tggcgcacca tcgtcggcta 3780 cagcctcggg aattagatec ccgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt 3840 tettaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt 3900 acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta 3960 tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa 4020 actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa tt 4072

Claims

-
REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido por las siguientes reivindicaciones : l'. Una secuencia de ADN capaz de portar la expresión de una secuencia de nucleótido asociada, caracterizada porque la secuencia de ADN comprende la secuencia de nucleótido descrita en SEQ ID NO: 1. 2. La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de ADN comprende la secuencia del nucleótido descrita en SEQ ID NO: 2. 3. La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de ADN comprende la secuencia del nucleótido descrita en SEQ ID NO:
3. 4. La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de ADN comprende la secuencia del nucleótido descrita en SEQ ID NO:
4.
5. La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de ADN comprende la secuencia del nucleótido descrita en SEQ ID NO:
6. La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de ADN comprende la secuencia del nucleótido descrita en SEQ ID NO: 6.
7. La secuencia de ADN que hibridiza bajo condiciones severas en cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5 o SEQ ID NO : 6.
8. La secuencia ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la secuencia de ADN comprende la secuencia de nucleótido descrita en SEQ ID NO: 19.
9. La secuencia ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la secuencia de ADN comprende la secuencia de nucleótido descrita en SEQ ID NO: 20.
10. La secuencia de ADN que comprende un tramo consecutivo de al menos 50 nt de SEQ ID NO: 1, caracterizada porque la secuencia de ADN es capaz de portar la expresión de una secuencia de nucleótido asociada.
11. La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el tramo consecutivo de al menos 50 nt tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con un tramo consecutivo de al menos 50 nt de SEQ ID NO: 1.
12. La molécula de ADN recombinante que comprende una región promotora de transcripción de longitud completa aislada del virus de la rizadura amarilla del Cestrum.
13. La molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 operativamente enlazada a una secuencia de nucleótido de interés.
14. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia de nucleótido de interés comprende a una secuencia codificadora.
15. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la secuencia de codificación codifica a una característica fenotípica conveniente .
16. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la secuencia de codificación codifica una proteína que confiere una ventaja selectiva positiva a las células que han sido transformadas con dicha secuencia de codificación.
17. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 15 o 16, caracterizada porque la secuencia de codificación codifica una proteína que confiere una ventaja metabólica a las células que han sido transformadas con dicha secuencia que consiste en ser capaz de metabolizar un compuesto, donde dicho compuesto es mañosa o xilosa o un derivado o precursor, o un substrato de la proteína, o es capaz de ser metabolizado por las células transformadas con dicha secuencia de codificación en este tipo de substrato.
18. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la secuencia de codificación codifica a una enzima seleccionada del grupo de xiloisomerasas , fosfomano-isomerasa, manosa-6-fosfato isomerasa, manosa-1-fosfato isomerasa, fosfomano mutasa, mañosa epimerasa, mañosa o xilosa fosfatasa, manosa-6-fosfatasa, manosa-1-fosfatasa y mañosa o xilosa permeasa.
19. La molécula recombinante de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la secuencia de codificación codifica a una fosfomano isomerasa.
20. El ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la región de codificación no es traducible.
21. El ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la región codificadora no traducible es de un gen viral .
22. El ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el gen viral se deriva del TSWV, en particular del gen TSWV NP .
23. La molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la secuencia de codificación esta en la orientación anti-sentido.
24. Un vector de expresión de ADN que comprende una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una molécula de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 23.
25. El vector de expresión de ADN de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el vector de expresión ADN es pNOV2819.
26. El vector de expresión de ADN de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el vector de expresión de ADN es pNOV2820.
27. Un vector de expresión de ADN que comprende una primer secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 operativamente ligadas a una secuencia de nucleótido de interés, y una segunda secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 operativamente enlazada a una secuencia de nucleótido de interés .
28. Un vector de expresión de ADN de conformidad con la reivindicación 27, capaz de alterar la expresión de una genoma viral .
29. Un vector de expresión de ADN de conformidad con la reivindicación 28 que comprende una primer secuencia de ADN capaz de expresar en una célula, un fragmento de ARN sentido de dicho genoma viral o su porción y, una segunda secuencia de ADN capaz de expresar en una célula un fragmento de ARN anti-sentido de dicho genoma viral o su porción, caracterizado porque el fragmento de ARN sentido y el fragmento de ARN anti-sentido son capaces de formar un ARN de doble hebra.
30. El vector de expresión de ADN de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el virus se selecciona del grupo que consiste de tospovirus, potivirus, potexvirus, tobamovirus, luteovirus, cucumovirus, bromovirus, closteorvirus, to busvirus y furovirus.
31. El vector de expresión de ADN de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque las secuencias de ADN comprenden una secuencia de nucleótido derivada de un gen de proteína de revestimiento viral, un gen de proteína de la nucleocáspide viral, un gen de replicasa viral, o un gen de proteína de movimiento viral o sus porciones.
32. El vector de expresión de ADN de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la secuencia de ADN se deriva del virus del bronceado del tomate (TSWV) .
33. El vector de expresión de ADN de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el ADN se deriva de un gen de proteína de la nucleocápside .
34. Una célula huésped transformada de manera estable con una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una molécula de ADN recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 23 o un vector de expresión de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 33.
35. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la célula huésped es una célula de planta.
36. Una planta y su progenie transformada de una manera estable con una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una molécula de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 23 o un vector de expresión de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 33.
37. La planta de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, trigo, sorgo, centeno, avena, hierba de césped, arroz, cebada, poroto de soja, algodón, tabaco, remolacha azucarera y cañóla.
38. El uso de la secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para expresar una secuencia de nucleótido de interés.
39. Un método para producir una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN se produce por medio de la reacción de la cadena de polimerasa en donde al menos un oligonucleótido utilizado comprende una secuencia de nucleótidos que representan un tramo consecutivo de 15 o mas pares base de SEQ ID NO: 1.