MXPA02008079A - Uso de inhibidores de il-18. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere al uso de los inhibidores de IL-18 en la preparacion de un medicamento para el tratamiento y/o la prevencion de la lesion hepatica. La invencion ademas se refiere al uso de los inhibidores de IL- 18 en la preparacion de un medicamento para el tratamiento y lo la prevencion de la artritis, en particular, la artritis reumatoidea. Ademas de esto, la invencion se refiere al uso de inhibidores de IL-18 en la preparacion de un medicamento para el tratamiento y /o la prevencion de las enfermedades inflamatorias del intestino, en particular la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa.

Description

USO DE LOS INHIBIDORES DE INTERLEUC1NA 18 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso terapéutico de los inhibidores IL-18 en varias condiciones patológicas. Más específicamente, la invención se refiere al tratamiento y/o a la prevención de la artritis, al • tratamiento y/o prevención de las enfermedades del hígado y al tratamiento y/o prevención de las enfermedades inflamatorias del intestino (IBD). ?o « i ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN • En 1989, se describió la actividad del suero inducida por endotoxina que indujo al interferon-? (IFN-?) obtenido de las células del bazo 15 de ratón (Micallef y colaboradores, 1996). Esta actividad del suero funcionó no como un inductor directo de IFN-? sino más como un co-estimulante junto con el IL-2 o con los mitógenos. Un intento para purificar la actividad del suero del ratón post endotoxina reveló una proteína kDA 50-55 aparentemente homogénea. Debido a que otras citocinas pueden actuar como co- 20 estimulantes para la producción de IFN-?, la falla en la neutralización de los anticuerpos a IL-1 , IL-4, IL-5, IL-6 o TNF para neutralizar la actividad del suero, sugiere que fue un factor diferente. En el año 1995 los mismos científicos demostraron que el co-estimulante de la endotoxina-inducida para ta---á _St.«l.¿l a"»'-i*>*- » ~r.. ?- ~?r. l... , -»ai--- -l->lJJL -,AJ.,M?-...-l. ----,^ --!---« la producción IFN-?, estaba presente en los extractos del hígado de los ratones pre - acondicionados con P.acnes (Novick y colaboradores 1992). En este modelo, la población macrófaga hepática (células de Kupffer) se expande y en estos ratones, una dosis baja del lipopolisacárido bacteriano (LPS) se vuelve letal, no siendo letal en los ratones no pre - acondicionados. El factor, denominado factor de inducción IFN-? (IGIF), luego denominado ¡nterleukin-18 (IL-18), fue purificado hasta la homogeneidad de 1.200 gramos de hígados de ratón tratado con P.acnes. Los oligonucleótidos degenerados derivados de las secuencias aminoácidos de IL-18 purificado se usaron para clonar un ADNc I L-18 de ratón (Novick y colaboradores, 1992). El IL-18 es una proteína kDa 18-19 de 157 aminoácidos que no tiene similitudes obvias con cualquier péptido en la base de datos. Los ANR mensajeros para el IL-18 y interleukin-12 (IL-12) son rápidamente detectados en las células Kupffer y en los macrófagos activados. El recombinante IL-18 induce el Gamma IFN más potentemente de lo que hace el IL-12, aparentemente por medio de un sendero separado (Novick y colaboradores, 1992). Similar a la actividad del suero inducido de endotoxina, el IL-18 no induce IFN-? por si mismo, pero funciona primariamente como un co-estimulante con mitógenos o con el IL-2. El IL-18 aumenta la proliferación de las células T, aparentemente por medio de un sendero IL-2 dependiente y aumenta la producción de citocina Th1 in vitro y exhibe sinergismo cuando se combina con I L-12 en términos de la producción aumentada IFN-? (Maliszewski y colaboradores, 1990). Los anticuerpos neutralizantes del ratón IL-18 se mostraron para ?¡kJ^ prevenir la letalidad de la dosis baja LPS en el ratón pre - acondicionado P.acnes. Otros han informado la importancia del IFN-? como mediador de la letalidad de LPS en el ratón pre-acondicionado. Por ejemplo, los anticuerpos anti-IFN protegieron al ratón contra el shock tipo Shwartzman (Fantuzzi y 5 colaboradores, 1998), y la deficiencia del ratón tratado con galactosamina en el IFN-? receptor fueron resistentes a la muerte inducida de LPS (Byrn, 1990). Por lo tanto, no resultó inesperado que los anticuerpos neutralizantes al IL-18 del ratón protegieron al ratón pre-acondicionado del P.acnes contra el LPS letal (Novick y colaboradores, 1992). El tratamiento con IL-18 anti- ratón 10 también protegió a los ratones sobrevivientes contra una importante toxicidad s hepática. Luego que la forma del ratón fue clonada, la secuencia de ADNc humano para el IL-18 fue informada en 1996 (Okamura y colaboradores, 1995). El IL-18 humano recombinante exhibe actividad natural IL-18 (Okamura 15 y colaboradores, 1995). El recombinante humano IL-18 está sin actividad inducidora directa IFN-? en las células T- humanas, pero actúa como un coestimulante para la producción de IFN-? y de otras citocinas (Th1) de célula-1 (ayudante T) (Okamura y colaboradores, 1995). En el presente, se piensa que I L-18 es primariamente, como un co-estimulante para la producción de 20 citocina Th1 (IFN-?, I L-2 y factor estimulante de colonia granulocito-macrófago) (Izakim 1978) y también como un co-estimulante para la citotoxicidad mediada de ligando FAS de los clones de la célula asesina natural del ratón (Novick y colaboradores, 1989).

Clonando el IL-18 de los tejidos afectados y estudiando la expresión del gen IL-18, se descubrió una asociación estrecha de esta citocina con una enfermedad autoinmune. El ratón (NOD) diabético no obeso (NOD) espontáneamente desarrolla isulitis autoinmune y diabetes, que puede ser 5 acelerada y sincronizada por una inyección única de ciclofosfamida. El ANRm I L-18 se demostró por PCR transcriptasa reversa en el páncreas de ratón NOD durante las etapas tempranas de insulitis. Los niveles de ANRm IL-18 se incrementaron rápidamente luego del tratamiento de ciclofosfamida y precedió una elevación en el IFN-?, ANR, y subsecuentemente la diabetes. En forma "10 interesante, esta cinética imita aquella de IL-12-p40 ANRm resultando en una ? correlación estrecha de niveles ANRm individuales. El clonado de IL-18 ADNc del ANR del páncreas seguido por el secuenciamiento, reveló la identidad con • la secuencia IL-18 clonada de las células Kupffer y de los macrófagos preactivados in vivo. También los macrófagos de ratón NOD respondieron al 15 ciclofosfamida con la expresión de gen IL-18 mientras los macrófagos del ratón Balb/c tratados en paralelo no lo hicieron. Por lo tanto, la expresión IL-18 es anormalmente regulada en el ratón NOD autoinmune e íntimamente asociada con el desarrollo de la diabetes (Novick y colaboradores, 1992). ; IL-18 juega un rol potencial en la inmunoregulación o inflamación 20 por el aumento de la actividad funcional del ligando Fas en las células Th1 (Conti y colaboradores, 1997). El IL18 también se expresa en la corteza suprarrenal y por lo tanto, podría ser un neuroinmunomodulador secretado, jugando un rol importante en orquestar el sistema inmune siguiendo una ttf,.*-J¿_t*-------¿--i ..-*.---*--. experiencia estresante (Chater, 1986). In vivo, el IL-18 se formó por la partición de pro-IL-18, y su actividad endógena parece contar para la producción de IFN-? en el P.acnes y la letalidad mediada de LPS. El IL-18 maduro se produce de su precursor por 5 la enzima convertidota IL-1 ß (enzima convertidora-1 beta-IL, Ice, caspasa-1 ). El receptor IL-18 consiste de al menos dos componentes, cooperando en la unión ligando. Se descubrieron sitios de unión de baja y alta afinidad para el IL-18 en las células T estimuladas de IL-12 en los ratones (Yoshimoto y colaboradores, 1998), sugiriendo un complejo receptor de 10 cadena múltiple. Dos subunidades de receptor han sido identificadas, ambas s perteneciendo a la familia de receptor IL-1 (Parnet y colaboradores, 1996). La transducción de señal de IL-18 involucra la activación de NF-?B (DiDonato y • colaboradores, 1997). Varias proteínas de unión de citocina conocidas son receptoras 15 de citocina solubles y corresponden a los dominios de unión de ligando extracelular de sus respectivos receptores de citocina de superficie de su respectiva célula. Ellos derivan tanto por partición alternativa de un pre-ANRm común al receptor de superficie de célula, o por partición proteolítica del f receptor de superficie de célula. Tales receptores solubles han sido descriptos 20 en el pasado, incluyendo, entre otros, los receptores solubles de IL-6 y IFN-? (Nakamura y colaboradores, 1989), TNF (Dao y colaboradores, 1996; Engerlmann y colaboradores, 1989), IL-1 e IL-4 (John, 1986), IFN-a/ß (Mizushima y Nagata, 1990) y otros. Una proteína de unión de citocina, denominada osteoprotegerin (OPG, también conocida como factor inhibitorio osteoclast - OCIF), un miembro de la familia TNFR/Fas, parece ser el primer ejemplo de un receptor soluble que existe solamente como una proteína secretada (Anderson, 1997); (Bollón, 1980). Recientemente, la proteína soluble que tiene una afinidad alta para el IL-18 ha sido aislada de la orina humana y de los ADNs del ratón y de los humanos, fueron descriptas por (Novick y colaboradores, 1999; WO 99/09063). La proteína ha sido designada proteína de unión IL-18 (IL-18BP). El IL-18BP no es un dominio extracelular de uno de los receptores IL18 conocidos, sino una proteína circulante naturalmente secretada. Pertenece a la familia novedosa de las proteínas secretadas. La familia demás incluye varias proteínas codificadas Poxvirus que tienen una homología a IL-18BP (Novick y colaboradores, 1999). IL-18BP se expresa constitutivamente en el bazo, pertenece a la superfamilia de la inmunoglobulina, y tiene homología limitada al receptor tipo II IL-1. Su gen fue localizado en el cromosoma humano 11 q13 y no se descubrió ningún código exon para un dominio de transmembrana en la secuencia genómica 8.3 kb (Novick y colaboradores, 1999). Cuatro isoformos humanos y dos isoformos de ratón de IL-18BP, resultado de la partición ANRm y descubiertos en varias colecciones de ADNc ya han sido expresadas, purificadas y evaluadas para unión y neutralización de las actividades biológicas IL-18 (Kim y colaboradores, 2000). El isoformo a IL-18BP humano (IL-18BPa) exhibió la mayor afinidad para el IL-18 con una velocidad de entrada rápida, una velocidad de salida lenta, y una constante de disociación (K(d)) de 399 pM. El IL-18BPc comparte el dominio de Ig de IL- 18BPa excepto para los 29 aminoácidos C-terminal; el K(d) de IL-18BPc es 10 veces menos (2.94nM). Sin embargo, el IL-18Bpa y el IL-18BPc neutralizan al 5 IL-18 >95 por ciento a un exceso molar de dos. Los isoformos IL-18BPb e IL- 18BPd carecen de un dominio Ig completo y carecen de capacidad para unir o neutralizar IL.18. Los isoformos IL-18BPc e IL-18BPd de los ratones, poseen • dominio idéntico Ig, también neutralizan >95 por ciento de IL-18 de ratón a un exceso molar de dos. Sin embargo, el IL-18BPd de ratón que comparte un *10 motivo de C-terminal común con IL-18BPa humano, también neutralizan el 11- ¡ 18 humano. El modelaje molecular identificó un sitio de unión hidrofóbico y electrostático muy mezclado en el dominio Ig de IL-18BP, que puede tomar en • cuenta para su alta afinidad uniendo al ligando (Kim y colaboradores, 2000). Recientemente se ha sugerido que el interleukin IL-18 está 15 involucrado en la progresión de la patogenicidad en las enfermedades inflamatorias crónicas, incluyendo el shock endotoxina, hepatitis y diabetes autoinmune (Kahiwamura y Okamura, 1998). Una posterior indicación de un rol posible de IL-18 en el desarrollo del daño del hígado resultó de los f experimentos publicados por Tsuij y colaboradores. (Tsuij y colaboradores 20 1999), mostrando un nivel elevado de IL-18 en el daño agudo del hígado inducido por lipopolisacáridos en un modelo de ratón. Sin embargo, el mecanismo del factor multi funcional IL-18 en el desarrollo del daño del hígado no ha sido elucidado hasta ahora.

El daño del hígado o la lesión puede tener diversas causas. Puede deberse a infecciones bacterianas o virales, abusos del alcohol, o por desórdenes inmunológicos, el cáncer, por ejemplo. La hepatitis viral, debida al virus de la Hepatitis B y el virus de la 5 Hepatitis C, por ejemplo, son enfermedades manejadas pobremente que afligen a un gran número de personas en el mundo. El número conocido de los virus de hepatitis conocidas está constantemente incrementándose. Aparte • del virus de la Hepatitis B y C, al menos cuatro otros virus que causan la hepatitis asociada de virus han sido descubiertos, se llaman virus de la 10 Hepatitis A, D, E y G. Í La enfermedad del hígado debido al alcohol es una enfermedad diseminada asociada con el consumo crónico del alcohol. La hepatitis inmune • es una enfermedad autoinmune que está pobremente manejada. La lesión del hígado también incluye daños a los conductos biliares. La cirrosis biliar 15 primaria (PBC) es una enfermedad del hígado autoinmune caracterizada por la destrucción de los conductos intrahepáticos biliares. Varios estudios han demostrado que el daño al hígado en las enfermedades tales como la hepatitis por alcohol, cirrosis del hígado, hepatitis A viral y cirrosis biliar primaria se asocian con las respuestas de la célula-1 20 ayudante-T (Th1). En un estudio, un modelo de lesión de hígado novedosa se estableció en el ratón mediante objetivo de los liposomas que contienen ovalbúmina en el hígado, seguido por la transferencia adoptiva de células Th1 específicas de ovalalbúmina. El tratamiento combinado del ratón con liposomas que contienen ovalbúmina y la transferencia de célula Th1 causaron un incremento en la actividad de la transaminasa del suero que fue paralelo con una elevación de los niveles de IFN-? del suero. En contraste agudo, la transferencia de célula Th2 específica ovalbúmina, resultó en un 5 incremento de los niveles de IL-4 de suero pero no indujo la lesión del hígado. La lesión del hígado fue bloqueada por los anticuerpos anti-IFN-? y por los anticuerpos (TNF)-a® factor de necrosis de anti- tumor. Estos descubrimientos indican que las células Th1 son las células efectoras principales en la lesión aguda del hígado (Nishimura y Ohta, 1999). En otro conjunto de estudios se 10 mostró que el ratón que sobre-expresa IFN-? exhibe hepatitis espontánea sin » ningún patógeno o cualquier otro estimulante (Okamoto y colaboradores, 1998). • Otro estudio implicó las respuestas TH1 en la cirrosis biliar primaria (PBC). El PBC es una enfermedad del hígado autoinmune 15 caracterizada por la destrucción de los conductos biliares intrahepáticos. Se cree generalmente que los mecanismos inmunes celulares, particularmente involucrando las células T, resultan en este daño del conducto biliar. La fuerza relativa de las respuestas de Th1 y Th2 ha sido propuesto recientemente f' como un factor importante en la patofisiología de varias enfermedades 20 autoinmunes. En este estudio, el balance del subjuego en PBC fue evaluado por la detección de las citocinas específicas a dos subjuegos de célula T, es decir IFN-? para las células Th1 e IL-4 para las células Th2. El IFN-? y las células positivas (ANRm)ANR mensajeras de IL-4 fueron contadas en las secciones del hígado de 18 pacientes con PBC y 35 controles de enfermedad incluyendo la hepatitis C activa crónica, la obstrucción biliar extrahepática y el hígado normal, utilizando inmunohisoquímica e hibridización in situ no isotópica. Las células mononucleares expresando IFN-? y ANRm IL-4 fueron 5 agregadas en los tractos portales inflamados en los hígados PBC, pero estuvieron raramente presentes en la obstrucción biliar extrahepática, la fibrosis por alcohol o las secciones del hígado normales. El IFN-? y las células positivas ARNm IL-4 en los hígados PBC fueron detectadas en números significativamente más altos que en los hígados de control (P<0.01 ). Además, 10 la expresión de ANRm IFN-? fue más comúnmente detectada que la expresión * I L-4 en los hígados PBC, y los niveles de expresión de ANRm IFN-? fueron altamente correlacionados con el grado de la actividad inflamatoria portal. Las • células positivas ANRm IFN-? fueron detectados primariamente alrededor de los conductos biliares dañados que fueron rodeados de agregados linfoides. 15 Los datos indican que las células Th1 son el subjuego de la célula T más prominente en los infiltrados linfoides en PBC (Harada y colaboradores, 1997). El modelo de citocina en el reconocimiento del antígeno viral también se cree que ejerce una influencia profunda en la resolución de las • infecciones virales y la limpieza viral. Un estudio investigó si un desbalance de 20 la citocina orientado hacia la respuesta tipo Th2 juega un rol en la hepatitis crónica B. Los perfiles de citocina de las células mononuclureares de sangre periférica asociadas con la hepatitis B crónica fueron analizados por RT-PCR. En la estimulación (HbsAg) del antígeno de superficie de la hepatitis B, la expresión de IFN-?, IL-2, IL-4 e IL-10 fue detectada en el 41 por ciento, 8 por ciento, 41 por ciento y 50 por ciento de los pacientes, respectivamente. Entre estas citocinas, la expresión de la IFN-? de citocina de Th1 fue asociada con altos niveles de suero AST/ALT (Aminotransferasa de 5 aspartato/aminotransferasa de Alanina), representando los marcadores típicos del daño del hígado. Las citocinas del tipo Th2 no mostraron que ejerzan un efecto protector en los hepatocitos. En conclusión, la producción de una citosina Th1 , IFN-? por las células reactivas-HbsAg fue asociada con el daño de hepatocito en la hepatitis B crónica (Lee y colaboradores, 1999). Altos 10 niveles de ligando FAS y su receptor (CD95) fueron informados en el hígado ¡ de la hepatitis B de los pacientes (Luo y colaboradores, 1997). El ligando FAS se considera que es uno de los agentes citotóxicos principales llevando a la apoptosis hepatocito. Otro estudio identificó los factores asociados con la progresión 15 del daño del hígado en 30 pacientes no tratados con (HCV/ANR)-positivo de ARN/virus de la hepatitis C. El daño necroinflamatorio y arquitectural fue evaluado utilizando la puntuación de Ishak's. Las células (HSC) estrelladas hepáticas activadas visualizadas por ¡nmunohistoquímica para una actina (aSMA) del músculo suave-a t cuantificadas por morfometría. El HCV/ARN de 20 plasma fue evaluado utilizando un método RT-PCR competitivo. Para estudiar el tipo de respuesta inmune involucrada en la progresión de la lesión del hígado, las células positivas IFN-? (como expresión de una respuesta tipo Th1) se evaluaron por inmunohistoquímica y se cuantificaron por morfometría. Se j, ¿ , , „ X t t. i. & ? ,*#£ * descubrió que el HSC fue, en su mayor parte, detectado muy cerca de las áreas de la necroinflamación lobular o recubriendo el septo fibrótico. El parénquima Rojo-positivo y aSMA correlacionaron en forma significativa con las puntuaciones arquitecturales y necro-inflamatorios. Las células positivas 5 IFN-? se detectaron en las áreas periportales asociadas con los infiltrados inflamatorios y significativamente correlacionados con el daño arquitectural. Se concluyó por lo tanto que la activación HSC y la progresión de la lesión del • hígado estaban asociadas con una respuesta tipo TH1 (Baroni y colaboradores, 1999). En forma similar al caso de la Hepatitis B, el ligando 10 FAS y el receptor se encontraron en el hígado y en el suero de los pacientes de la hepatitis C (Hiramasu y colaboradores, 1994; Okazaki y colaboradores, 1996; Lio y colaboradores, 1998). • Se descubrió que las citocinas Th1 y otros marcadores Th1 estaban asociados con la hepatitis por alcohol y la cirrosis del hígado. El 15 estimulo inflamatorio y la peroxidación lípida activan el factor nuclear « B (NF- KB) y regula hacia arriba las citocinas proinflamatorias y las quimocinas. En un estudio, fue evaluada, la relación entre el daño del hígado patológico, la endotoxemia, la peroxidación lípida y la activación de NF-?B y un desequilibrio - entre las citocinas antiinflamatorias y pro inflamatorios. Las ratas (cinco por 20 grupo) fueron alimentadas con etanol y una dieta conteniendo grasa saturada, aceite de palmera, aceite de maíz o aceite de pescado por infusión intragástrica. La dextrosa isocalóricamente reemplazo al etanol en las ratas de control, fue llevado a cabo el análisis patológico y se tomaron las medidas de a- ¿j||& OíJt? ? -.- É-uiá-t---.. M¿ --MU--,.- ? .L.. ... . -,dlt»i^-*--ibi^l¿...- la endotoxina, de la peroxidación lípida, de los niveles de ANRm) del mensajero y del NF-?B de las citocinas (TNFa, IL-1 beta, IFN-? e IL-12), de las quimocinas C-C (reguladas en la activación, la célula T normal expresó y secretó [RANTES], la proteína quimotáctica monocito [MCP]-1 , proteína 5 inflamatoria macrófaga [MIP]-1-a), las quimocinas C-X-C (el quimoatrayente neutrófilo inducido por citosina [CINC], MIP-2, IP-10, y la proteína activante de neutrófilo epitelial [ENAJ-78), y las citocinas antiinflamtorias (IL-10, IL-4 e IL- • 13). La activación del NF-?B y la expresión aumentada de las citocinas proinflamatorias C-C y las citocinas C-X-C se vieron en las ratas exhibiendo '10 daño necroinflamatorio (aceite de pescado- etanol y aceite de maíz-etanol). Estos grupos también tenían los niveles más altos de endotoxina y de peroxidación de lípido. Los niveles de ANRm IL-10 e IL-4 fueron más bajos en el grupo que exhibía la lesión inflamatoria del hígado. De esta manera, la activación de FN-«B ocurre en la presencia del estimulo proinflamatorio y 15 resulta en la expresión aumentada de las citocinas proinflamatorias de Th1 y las quimocinas (Naji y colaboradores, 1999). El FAS ligando y su receptor también se elevan en las enfermedades del hígado por alcohol, sugiriendo ora vez que la citocina Th1 está involucrada en los procedimientos autoinmunes ?, inducidos en la hepatitis por alcohol (Galle y colaboradores, 1995; Taieb y 20 colaboradores, 1998, Fiore y colaboradores, 1999). TNF-a también ha emergido como un sendero común en la patogénesis de la necro-inflamación hepática relacionada con el alcohol. Los niveles aumentados de TNF de suero y hepático han sido documentados en los modelos animales de la enfermedad del hígado por alcohol y en la enfermedad del hígado por alcohol humana. Este metabolismo TNF desregulado ha sido postulado para jugar un rol en muchas de ías complicaciones metabólicas y en la lesión del hígado de la enfermedad del 5 hígado por alcohol (Grove y colaboradores, 1997); McCIain y Cohén, 1989). Por ejemplo se descubrió en un estudio que los pacientes con hepatitis por alcohol tenían más altos niveles de TNF-a (es decir, 26.3 ng/L; 95% Cl, 21.7 a • 30.9) que los sujetos normales (6.4 ng/L; Cl, 5.4 a 7.4). Los pacientes que subsecuentemente murieron tenían más altos niveles de TNF-a (34.7 ng/L; Cl, "10 27.8 a 41.6) que los sobrevivientes (16.6 ng/L; Cl, 14.0 a 19.2). En los ? pacientes con hepatitis por alcohol los niveles de TNF-a correlacionaron positivamente con suero bilirrubina (r=0.74; P=0.0009) y el suero creatinina • (r=0.81; P= 0.0003). Los pacientes con hepatitis por alcohol tenían niveles de TNF-a más altos que los pacientes con cirrosis por alcohol inactiva (11.1 ng/L; 15 Cl, 8.9 a 13.3) y que las personas severamente alcohólicas sin enfermedad del hígado (6.4 ng/L; Cl, 5.90 a 7.8). Los pacientes con función renal anormal tuvieron niveles TNF-a más bajos (14.1 ng/L; Cl, 5.4 a 22.8) que los pacientes con hepatitis por alcohol. Se concluyó, por lo tanto que los aumentos en el TNF-a en la hepatitis por alcohol son más marcados en los casos severos 20 sugiriendo que el TNF-a juega un rol en la patogénesis (Bird y colaboradores 1990). El TNF media muchas de las acciones biológicas de la endotoxina. Los estudios recientes han mostrado que la administración de TNF puede causar el daño del hígado y que el TNF puede mediar la letalidad de la galactosamina de hepatotoxina. Uno de los más potentes inducidores TNF es la endotoxina. Debido a que los pacientes con enfermedad del hígado por alcohol frecuentemente tienen endotoxemia y debido a que muchos de las 5 manifestaciones clínicas de la hepatitis por alcohol son las acciones biológicas de TNF, su actividad fue evaluada en los pacientes con hepatitis por alcohol. La liberación del TNF basal y estimulado con lipopolisacáridos de los • monocitos de la sangre periférica, una fuente de mayor producción, fue determinada en 16 pacientes con hepatitis por alcohol y 16 voluntarios "10 saludables. Ocho de los 16 pacientes de hepatitis por alcohol y solamente dos i de los 16 voluntarios saludables tuvieron actividad de TNF espontánea detectable (menor al 0.05). Luego de la estimulación de lipopolisacárido, la • liberación de TNF monocito media de los pacientes de hepatitis por alcohol fue aumentada significativamente a dos veces los controles saludables (25.3 +/- 15 3.7 vs 10.9+/-2.4 unidades por ml, (menos que 0.005). Se concluyó, por lo tanto que los monocitos de los pacientes con hepatitis por alcohol habían aumentado en forma importante la liberación de TNF estimulado por el lipopolisacárido y espontáneo comparado con los monocitos de los voluntarios f (McCIain y Cohén, 1989). 20 La (LBP)proteína de unión -(LPS)de lipopolisacárido y CD14 juegan roles intermediarios claves en la activación de las células por endotoxina. La LPS derivada- intestinal ha sido postulada para participar en promover el daño del hígado patológico en la enfermedad de hígado por alcohol. Se demostró que las ratas que se alimentaron intragástricamente con etanol en aceite durante 4 semanas tenían altos niveles de CD 14 y LBP en su células Kupffer y hepatocitos, respectivamente. La expresión de CD14 ANRm fue también elevada en las células no-mieloides. El LBP aumentado y la 5 expresión CD14 rápidamente incrementa la expresión inducida LPS de varias citocinas pro-inflamatorias y correlaciona con la presencia de la lesión del hígado patológica en la lesión del hígado por alcohol (Su y colaboradores, 1998; Lukkari y colaboradores, 1999). La artritis es una enfermedad que involucra la inflamación de la •10 articulación. Las articulaciones muestran hinchazón, rigidez, suavidad, 5 enrojecimiento y calidez. • Los síntomas pueden estar acompañados por pérdida de peso, fiebre y debilidad. Cuando estos síntomas duran más que '^ ' dos semanas, la artritis inflamatoria por ejemplo la artritis reumatoidea puede ser la causa. La inflamación de la articulación puede ser también causada por 15 infección, que puede luego llevar a la artritis séptica. Un tipo muy común de artritis es la enfermedad de la articulación degenerativa (oesteoartritis). Los medicamentos comúnmente prescriptos para la artritis y las condiciones relacionadas son drogas antiinflamtorias no esferoides (NSAIDs). Los NSAIDs incluyen la aspirina y las drogas tipo aspirina. Las mismas • 20 reducen la inflamación que es la causa del dolor de la articulación, de la rigidez e hinchazón de las articulaciones. Sin embargo, las NSAIDs son drogas no específicas que tienen un número de efectos secundarios, involucrando la hemorragia del estómago (Página Principal del Departamento de Ortopedia de la Universidad de Washington en Artritis, Frederick Matsen (Director), www.orthop.washington.edu). Además de NSAIDs, Celebrex ®, un inhibidor (COX-2) de ciclooxigenasa se usa para aliviar los síntomas de la osteoartritis y de la artritis reumatoidea en los adultos. También se indica para el tratamiento de los paciente con poliposis adenomatus familiar. La WO 01/00229 describe una combinación de antagonistas (TNF) de factor de necrosis de tumor y a los inhibidores COX-2 para el tratamiento de la inflamación. Los antagonistas también se usan para el tratamiento de la artritis. Los antagonistas TNF se describen por ejemplo, en la WO 9103553. Recientes estudios indican que el interleukin IL-18 juega un rol proinflamatorio en el metabolismo de la articulación. Olee y colaboradores (1999) mostró que IL-18 se produce por condrocitos articulares e induce las respuestas proinflamatorias y las respuestas catabólicas. El IL-18 ANRm fue inducido por IL-1 ß en los condrocitos. Los condorcitos produjeron el precursor IL-18 y en respuesta a la estimulación IL-1 secretó la forma madura de IL-18. Los estudios en los efectos de IL-18 aumentan la producción de óxido nítrico. El IL-18 estimuló la expresión de varios genes en los condorcitos articulares humanos normales, incluyendo la sintasa de óxido nítrico inducible, la ciclooxigenasa inducible, IL-6, y estromelisina. La expresión del gene fue asociada con la síntesis de las proteínas correspondientes. El tratamiento del cartílago articular humano normal con IL-18 aumentó la liberación de los glicosaminoclicanos. Este descubrimiento identificó a IL-18 como una citocina que regula las respuestas condrocito y contribuye a la degradación del cartílago. La localización de la caspasa-1 (ICE) de la enzima Interleukin- 1 ß-convertidora en los tejidos osteoartriticos humanos y su rol en la 5 maduración de la interleukin-1 beta y del interleukin-18 han sido mostrados por Saha y colaboradores, (1999). Saha y colaboradores estudiaron la expresión y la producción de la caspasa-1 en el cartílago (OA) osteoartrítico y normal humano y el sinovium, cuantificó el nivel de ICE en los condrocitos OA y examinó la relación entre la distribución topográfica de ICE, interleukin-1 ß 10 (IL-1ß), e IL-18 tanto como la apoptosis de los condrocitos. Los experimentos llevados a cabo en este estudio indicaron que el ICE fue expresado sintetizado en la membrana sinovial humana y en el cartílago, en un número # significativamente mayor de células manchadas positivas en el tejido OA que en el tejido normal. La producción de ICE fue preferentemente ubicada en las 15 capas superficiales y en las capas intermedias superiores del cartílago articular. La producción de IL-lbeta madura en los explantes de cargílago OA y los condrocitos fue completamente bloqueada por el tratamiento con el inhibidor ICE especifico, que también disminuyó marcadamente el número de ^ células IL-18 positivas. La relación entre IL-1 beta activo y el ICE sugiere que 20 el ICE puede promover la progresión de OA por la activación de la citosina proinflamatoria y que IL-18 puede jugar un rol en la patología del cartílago. Grade y colaboradores (1999) sugirieron un rol proinflamatorio para IL-18 en la artritis reumatoidea. Grade y colaboradores detectaron el IL- 18 ANRm y la proteína dentro de los tejidos sinoviales de artritis reumatoidea en niveles significativamente más altos que en los controles de la osteoartritis. También se mostró que una combinación de IL-12 o IL-15 con IL-18 indujo la producción de IFN-? por los tejidos sinoviales ¡n vitro. Además, la administración de IL-18 del ratón inmunizado adyuvante de Freund de colágeno/incompleto facilitó el desarrollo de una artritis inflamatoria erosiva, sugiriendo que IL-18 puede ser proinflamatoria in vivo. Sin embargo, aparte de los compuestos químicos, solamente el bloque de TNFa e IL-1 ß utilizando los receptores solubles o los anticuerpos monoclonales han mostrado que disminuyen la artritis inducida por colágeno del ratón (CÍA, que es un modelo de ratón para la artritis reumatoidea) (Williams y colaboradores, 1994) y fueron, por lo tanto sugeridos como una terapéutica para la artritis reumatoidea. El término "enfermedades del intestino inflamatorias idiopáticas o crónicas" abarca al menos dos condiciones: La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Ambas enfermedades del tracto gastrintestinal. La enfermedad de Crohn más comúnmente afecta el intestino delgado. Cuando también involucra al colon, el diagnóstico diferencial de la colitis ulcerosa(ver abajo) puede ser un problema. La inflamación crónica y la ulceración en la enfermedad de Cronh usualmente comienza con la obstrucción intestinal delgada o el daño abdominal que puede imitar a la apendicitis aguda; otras presentaciones pueden relacionar a sus complicaciones. El curso de la enfermedad es crónica Ü X1X fc jb- -A.... ..- ^A^----.. - ^^^^*HÉÉtflt ^^ y puede haber exacerbaciones y remisiones a pesar de la terapia. El comienzo es usualmente en la vida adulta temprana, con la mitad de todos los casos que comienzan entre las edades de 20 y 30 y el 90 por ciento entre los 10 y los 40 años. Muy pocos hombres comparando con mujeres son afectados. 5 La microscopía refleja las formas evidentes. El envolvimiento de la inflamación es discontinuo: es focal o desigual. Las colecciones de linfocitos y las células de plasma se encuentran principalmente en la mucosa y la • submucosa, pero usualmente afecta todas las capas (inflamación transmural). La característica microscópica clásica de la enfermedad de Crohn es la '10 presencia de células granuladas rodeadas por un puñado de linfocitos. La incidencia de las enfermedades intestinales inflamatorias idiopáticas muestran una variación geográfica considerable. Estas enfermedades tienen mayor incidencia en el norte de Europa y los Estados Unidos de Norte América, que en los países del sur de Europa, África, Sud América y Asia, aunque la 15 urbanización creciente y la prosperidad lleva a una incidencia más alta en las partes del sur de Europa y Japón ("General and Systematic Pathology" (Patología Sistemática y General), Churchill Livingstone, 3* Edición 2000, JCE Underwood, Ed.). ,A En la enfermedad de Crohn, hay clínicamente dos grupos 20 principales, la primera incluye los pacientes cuya remisión de la enfermedad va a durar durante un periodo de tres años desde su comienzo, la segunda comprende los pacientes que continúan con la enfermedad más allá de los tres años. ; .iJ.A b ..fc,. ....-.^a^fa^j^,, »^^ Cualquiera sea la etiología, hay evidencia de la persistencia e inapropiada activación de los macrófagos y células T en la enfermedad de Crohn con el aumento de la producción de las citodnas inflamatorias, en particular interleukinas (IL) 1 , 2, 6 y 8, Interferon (IFN-?) y del Factor de 5 Necrosis del Tumor (TNF)a. La enfermedad de Crohn se caracteriza por inflamación sostenida (crónica) acompañada por fibrosis. El procedimiento de la proliferación fibroblástica y la deposición de colágeno puede ser mediada transformando el crecimiento del factor ß, que tiene ciertas acciones antiinflamatorias, principalmente reclutamiento de fibroblastos, la síntesis de 10 matriz y la regulación hacia abajo de las células inflamatorias, pero es probable que muchos otros mediadores estén implicados. La colitis ulcerosa es un desorden inflamatorio no especifico del • intestino grueso, usualmente comenzando en el recto y extendiéndose aproximadamente en una extensión variante. De forma diferente a la 15 enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa está limitada al intestino grueso. Existe una evidencia importante para indicar que la colitis ulcerosa es una consecuencia de la reactividad autoinmune alterada, pero la lesión mucosal podría resultar de la activación de la célula T inapropiada y el ^ daño indirecto acercado por las citocinas, las proteasas y los metabolitos de 20 oxigeno reactivo, de los macrófagos y neutrófilos. Este último mecanismo de daño al epitelio colónico ha sido denominado lesión del "innocent bystander" (espectador inocente). La evidencia a favor de la autoinmunidad es la presencia de linfocitos T autoreactivos y anticuerpos dirigidos contra las células epiteliales colónicas y las células endoteliales y los auto-anticuerpos citoplásmicos anti-neutrófilos (ANCA). Sin embargo, la colitis ulcerosa no debería ser pensada como una enfermedad autoinmune en la cual el daño mucosal es una consecuencia directa de la reacción inmunológica de los auto- 5 antígenos (General and sytematic Pathology, nombrada anteriormente). Con respecto a la terapia de la enfermedad de Crohn, mucha gente se trata primero con drogas que contengan mesalamina, una substancia que ayuda a controlar la inflamación. Los pacientes que no se benefician de ello o que no la toleran pueden ponerse otras drogas que * 10 contengan mesalamina generalmente conocida como agentes 5-ASA. Los efectos laterales posibles de las preparaciones con mesalamina incluyen nauseas, vómitos, ardor estomacal, diarrea y dolor de cabeza. • Algunos pacientes toman corticosteroides para controlar la inflamación. Estas drogas son las más efectivas para activar la enfermedad de 15 Crohn, pero pueden causar serios efectos secundarios, incluyendo mayor susceptibilidad a la infección. Las drogas que suprimen el sistema inmune también se usan para tratar la enfermedad de Crohn. Las más comúnmente proscriptas son la fc. 6-mercaaptopurina y la droga relacionada, azatioprina. Los agentes 20 inmunosupresores trabajan por bloqueo de la reacción inmune que contribuye a la inflamación. Estas drogas pueden causar efectos secundarios como nauseas, vómitos y diarrea y pueden bajar la resistencia de la persona a la enfermedad. Cuando se trata los pacientes con una combinación de corticosteroides y drogas inmunsupresoras, la dosis de corticosteroides puede eventualmente ser bajada. Algunos estudios sugieren que las drogas ¡nmunosupresoras pueden aumentar la efectividad de los corticosteroides. La U.S. Food and Drug Administration (Administración de Drogas 5 y Alimentos de los Estados Unidos de Norte América) ha aprobado la droga infliximab para el tratamiento de la enfermedad de Crohn moderada a severa que no responde a las terapias estándar (substancias de mesalamina, corticosteroides, agentes inmunsupresores) y para el tratamiento de las fístulas abiertas que drenan. El infliximab, el primer tratamiento aprobado 10 específicamente para la enfermedad de Crohn, es un anticuerpo monoclonal (TNF) de factor de necrosis de anti-tumor. El anti-TNF quita el TNF de la corriente sanguínea antes que alcance el intestino, por lo tanto previene la • inflamación. Los anticuerpos se usan para tratar el sobrecrecimiento 15 bacteriano en el intestino delgado causado por la constricción, por las fístulas o por una previa cirugía. Para este problema común, el médico puede prescribir uno o más de los siguientes antibióticos, ampicilina, sulfonamida, cefalosporina, tetraciclina, o metronidazola. jÉfe La diarrea y el calambre abdominal son a menudo aliviados 20 cuando la inflamación aminora, pero el agregado de medicamentos puede también ser necesario. Se pueden usar varios agentes antidiarreicos, incluyendo al difenoxilato, la loperamida y la codeína. Los pacientes que están deshidratados debido a la diarrea se tratan usualmente con fluidos y electrolitos. Continúa siendo una necesidad para la terapia efectiva para el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades del intestino inflamatorias, en particular la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, que han reducido 5 los efectos secundarios o que están idealmente libres de efectos secundarios. Tanto las observaciones histológicas e inmunológicas indican que la inmunidad de célula mediada y la activación de las células T son las • características claves de CD. Los estudios de los humanos y los modetos experimentales sugieren que, en CD, la respuesta local inmune tiende a ser 10 predominantemente Th1 en el tipo (Desreumaux y colaboradores, 1997) y que las citocinas liberadas localmente, tales como IFN-?, IL-1ß, y el TNF-a, contribuyen a promover y expandir la respuesta inflamatoria (Reimund y • colaboradores, 1996). La citocina IL-18 juega un rol importante en la respuesta inmune 15 mediada de Th1 en colaboración con la citocina IL-12 estimulando la secreción de IFN-?, aumentando la citoxicidad de la célula matadora natural y estimulando la diferenciación de la célula TH1 (Uschito y colaboradores, 1996). ^p El IL-18 actúa junto con los antígenos IL-12, IL-2, los mitógenos y 20 posiblemente otros factores posteriores, para inducir la producción de IFN-?. El IL-18 también aumenta la producción de GM-CSF e IL-2, potencia la proliferación de la célula T inducida de anti-CD3 e incrementa al Fas-mediado para matar las células matadoras naturales. El IL-18 maduro se produce de su precursor por (ICE, caspasa-1 ) la enzima conversora IL-1 ß. El receptor IL-18 consiste en al menos dos componentes, cooperando en la unión de ligando. Los sitios de unión de baja y alta afinidad para el IL-18 se encontraron en las 5 células T estimuladas IL-12 de los ratones (Okamoto y colaboradores, 1998), sugiriendo un complejo receptor de cadena múltiple. Dos unidades de receptor han sido identificadas, ambas perteneciendo a la familia del receptor IL-1 (Okamoto y colaboradores, 1999). La transducción de la señal de IL-18 involucra activación de NF-«B (Matsumoto y colaboradores, 1997). 10 Se ha sugerido recientemente que el IL-18 tiene alguna implicancia en las Enfermedades del Intestino Inflamatorias (Pizarra y colaboradores, 1999; Monteleone y colaboradores, 1999). • Pizarra y colaboradores (1999) caracterizaron la expresión y localización de IL-18 en los especimenes colónicos y las poblaciones de célula 15 mucosal aislada de los pacientes con la enfermedad de Crohn. Se descubrió que utilizando un protocolo RT-PCR semicuantitativo, se descubrió que los transcriptos de ANRm IL-18 se aumentaban en las células epiteliales del intestino aisladas recientemente y las células mononucleares lámina propia de -Ai CD comparados con la colitis ulcerosa y los pacientes de control no 20 inflamados. Los transcriptos ANRm IL-18 fueron más abundantes en las células epiteliales intestinales comparadas con las células mononucleares de lámina propia. El análisis inmunohistoquimico de los tejidos colonices reseccionados quirúrgicamente localizaron IL-18 en ambas células mononucleares de lámina propia (específicamente raacrófegos y células dendríticas) tanto como células epiteliales intestinales. El análisis por Western blot reveló que una banda de 18.3-kDa, consistente con ambas proteínas IL- 18 la madura humana y la recombinante, se encontró predominantemente en 5 CD vs biopsias mucosales intestinales UC; una segunda banda de 24kDa, consistente .con el precursor IL-18 inactivo se detectó en las áreas no inflamadas de ambas biopsias CD y UC y fue la forma única encontrada en los controles no inflamados. Monteleone y colaboradores (1999) confirmaron estos 10 descubrimientos. El tejido mucosal intestinal completo y las células mononucleares de lámina propia de la enfermedad de Crohn y 9 pacientes con colitis ulcerosa y 15 controles de la enfermedad intestinal no inflamatoria, fueron probados para IL-18 por el análisis Western blot y RT-PCR semicuantitativo. Los transcriptos para IL-18 se encontraron en todas las 15 muestras probadas. Sin embargo, la acumulación ANRm IL-18 incrementada fue detectada en las muestras de las células mopopwcleares lámina propia y mucosales de la enfermedad de Crohn en comparación con la colitis ulcerosa y los controles. En la enfermedad de Crohn, los transcriptos para I L-18 fueron más abundantes en las muestras mucosales tomadas de las áreas 20 involucradas. Una banda 18-kDa consistente con IL-18 maduro fue predominantemente encontradas en las muestras mucosales de 4a enfermedad de Crohn. En las muestras mucosales de los controles no-IBD, el IL estuvo presente como el pollpéptido 24-kDa. Consistentemente, la subunidad (p20) (ICE) enzima IL-1 eta-convertidora fue expresada en las muestras de CD o UC, mientras, en la mucosa colónica de los controles de no-IBD, ICE fue sintetizada como precursor (p45) solamente. Dayer (1999) revisó las funciones contradictorias parcialmente 5 y diferentes de IL-18. En resumen, el IL-18 es un interleukin pleiotrópico tanto aumentador inflamatorio como atenuador de funciones. Por un lado, aumenta la producción de las citocinas pro-inflamatorias como la TNFa; por lo tanto, promueve la inflamación. Por otro lado, induce la producción de NO, un inhibidor de caspasa-1, así bloqueando la maduración de IL-lß e IL-18, y 10 posiblemente atenuando la inflamación. Este rol ambiguo del IL-18 seriamente cuestionó la eficacia de los inhibidores, IL-18 en las enfermedades inflamatorias. Además, debido a la interacción de una variedad grande de • citoquínas diferentes y quimocinas en la regulación de la inflamación, no es predecible un efecto beneficioso en la terapia o prevención de las 15 enfermedades inflamatorias por bloqueo solamente de uno de los jugadores.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN -A¡ La presente invención está basada en el descubrimiento que los 20 inhibidores de IL-18 son efectivos en el tratamiento y/o prevención de diferentes enfermedades o desórdenes. Es un primer objeto de la presente invención proporcionar un medio novedoso para tratar y/o prevenir el daño del hígado. La invención, por lo tanto, se refiere al uso de un inhibidor IL-18 para la fabricación df .Mn medicamento para el tratamiento y/o prevención el daño del hígado, sea este agudo o crónico. Más específicamente, la invención se refiere al tratamiento y/o a la prevención de la hepatitis por alcohol, la hepatitis viral, la hepatitis inmune, la hepatitis fulminante, la cirrosis del hígado y la cirrosis biliar primaria. Es un segundo objeto de la presente invención proporcionar los medios novedosos para tratar y/o prevenir la artritis. La invención por lo tanto también se refiere al uso de los inhibidores IL-18 en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la artritis. El efecto beneficioso de los inhibidores IL-18 incluye tanto a bajar la importancia de la enfermedad, como a prevenir la diseminación de la enfermedad. Este descubrimiento es inesperado, debido a que en el estado de la técnica delineada anteriormente, no se podría haber concluido que el bloqueo de un factor específico involucrado en la artritis, principalmente el interleukin IL-18, llevaría al alivio de la artritis o aún la cura de una articulación artrítica enferma. También se ha descubierto que la administración de un inhibidor IL-18 significativamente disminuye la erosión del cartílago en un modelo de ratón de la artritis. La presente invención de esta manera además se refiere al uso de un inhibidor de IL-18 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la destrucción del cartílago. Es un tercer objeto de la presente invención proporcionar un medio novedoso para el tratamiento y lo prevención de la enfermedad inflamatoria (IBD) del intestino, en particular la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. La invención por lo tanto también se refiere al uso de un inhibidor IL-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de IBD. De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto 5 que las concentraciones de ANRm IL-18BP y la proteína son incrementadas en las regiones inflamadas de la mucosa en las biopsias derivadas de los pacientes de la enfermedad de Crohn. Además, se ha mostrado que dos ^N diferentes inhibidores de IL-18 protegió a los animales de la enfermedad en el modelo de ratón de la enfermedad del intestino inflamatoria. 10 El uso de las combinaciones de un inhibidor I L-18 y/o un interferón y /o un antagonista TNF y/o un inhibidor COX-2 también se consideran de acuerdo con la invención. Para aplicar los acercamientos terapéuticos para administrar el inhibidor IL-18 a los tejidos enfermos o las células, otros aspectos de la invención se refieren al uso de los vectores de 15 expresión que comprenden la secuencia de codificación de un inhibidor IL-18 para el tratamiento y/o la prevención de las condiciones de la enfermedad. La invención además se refiere al uso de activación del gen endógeno de los inhibidores IL-18 y el uso de las células genéticamente realizadas por 0 ingeniería para expresar inhibidores IL-18 para la prevención y/o el tratamiento 20 de la lesión del hígado, la artritis e IBD.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOt EBUJOS La Figura 1 : muestra un histograma que delinea los niveles de suero de IFN-? (pg/ml) luego de la inyección de varias cantidades de IL-18BP 5 recombinante (0; 0.04; 0.4; 4 mg/kg) en los ratones 1 hora antes de la inyección de LPS. Las muestras de sangre fueron tomadas 5 horas luego de la inyección LPS y analizados por ELISA para el IFN-? circulante. La Figura 2:muestra un histograma que delinea los niveles de suero de aminotransferasa de Alanina (ALT). Los ratones fueron inyectados 10 con dosis en aumento de IL-18BP humano recombinante (0; 0.04; 0.4; 4 mg/kg) antes de la inyección de LPS en ratones sensibilizados de P. acnés. Las muestras de sangre se tomaron 5 horas luego de la inyección y los niveles • de suero de ALT fueron medidos. SF=Sigma-Frankel: 1 SF Unidad de AST/ALT va a formar 4.82x 10"4 µmol glutamato/minuto a pH 7.5 a 25° C, 15 La Figura 3: muestra el tiempo de supervivencia del ratón luego de la inyección de LPS. Los ratones fueron inyectados con diferentes dosis de IL18BP humano recombinante (0.04; 0.004; 4 mg/kg) 20 minutos antes de la inyección de ratón sensibilizado con P.acnes. Los triángulos: 4 mg/kg; ^ pequeño diamante: 0.4; diamante grande: 0.04; circuios: ningún IL18BP 20 (solamente LPS). La Figura 4: muestra un histograma que delinea los niveles de suero de IFN-?, medido 5 horas luego de la inyección de diferentes cantidades de IL18BP (0; 0.4; 4mg/kg), lo que fue administrado 20 minutos antes df la inyección de LPS en los ratones sensibilizados P. acnés. Las Figuras 5A y 5B: muestran la supervivencia del ratón inyectado con antisuero IL-18 policlonal o suero de conejo normal (NDS *= control) 30 minutos antes de la inyección con 40 mg/ml (dosis letal ) de LPS 5 derivada de E coli (Fig. 5A) o S thyphimurium (Fig. 5B). Triángulos: los ratones fueron inyectados con antisuero I L-18; círculos: ratones fueron inyectados con NDS. En el eje X los días luego del desafío de LPS se delinean. * p<0.05. Las Figuras 6A y 6B: muestran un histograma delineando la media + SEM de cinco ratones por grupo tratado en la siguiente forma. Los 10 ratones fueron inyectados intraperitonealmente (i.p.) tanto con antisuero anti- IL-18, con receptores TNF-a (TNFsRp55) o con un vehículo (salina) inmediatamente seguida por la administración intravenosa (i.v.) de Concanavali A (ConA; Gi 6 A) o PEA (Pseudomonas aeruginosa, Fig. 6B) ** p<0.01; ***p<0.001 vs ConA o PEA solamente; # p<0.01 vs tanto T NFsRpßS o 15 ANOVA factorial anti-IL-18. Las Figuras 7A y 7B: muestran el efecto de IL-18BP en los puntajes clínicos en el modelo de ratón de la artritis. La Figura 7 A muestra un diagrama delineando los puntajes clínicos medidos luego de la administración Jfe diaria de las cantidades diferentes de IL-18BP o ÍFN-ß o vehículo (naCf)Lp. 20 (intraperitonealmente) al ratón. Los símbolos: Triángulos llenos: 10000 IU I^ - ß; triángulos abiertos: 10 mg/kg IL18BP, triángulos invertidos mg/kg IL-18BP, diamantes: Img/kg IL18BP; círculos; 0.5 mg/kg IL-18BP; cuadrados abtertfs: 0.25 mg/kg IL-18BP, y cuadrados llenos: NaCl. Los días de tratamiento se delinean en el eje-x, los puntajes clínicos (valores medios) se delinean en el eje-y. Las estadísticas fueron calculadas por el test Mann Whitney. La Figura 7B muestra un histograma delineando el AUC (área bajo la curva) derivada del gráfico de la Figura 7A. n=número de animales 5 Las Figuras 8A y 8B: muestran el efecto de IL-18BP en la hinchazón de la pata. La figura 8A muestra un diagrama que delinea tos resultados obtenidos por la medida del grosor de la pata (hinchazón) de las * patas posteriores enfermas de los animales individuales tratados con diferentes cantidades de IL-18BP- El eje-y muestra el cambio del grosor de la 10 pata en milímetros desde el comienzo del tratamiento. Los símbolos son como en las Figuras 7A y 7B. La Figura 8 B muestra un histograma delineando el AUC derivado de la Figura 8A. N= número de animales. F La Figura 9: muestra el análisis del número de patas traseras enfermas en el momento de la artritis aguda, es decir la diseminación de la 15 enfermedad a las articulaciones adicionales. Cuadrados llenos: NaCKcontrol), triángulos: 10 mg/kg IL-18BP, triángulos invertidos: 3 mg/kg IL-18BP, diamantes: 1 mg/kg IL-18BP, círculos: 0.5 mg/kg IL-18BP y los cuadrados abiertos: 0.25 mg/kg IL-18BP. • La Figura 10: muestra un histograma que delínea los puntajes de 20 erosión el cartílago de las articulaciones enfermas. Las Figuras 11 A, 11 B y 11C: muestran la histopatología de fas articulaciones del ratón. Al finalizar el experimento, la pata que primero desarrolló artritis fue disecada, fijada y procesada como se describe en el Ejemplo anterior. La Figura 11 A- articulación de un ratón normal; la Pipiana 11 B, articulación de un ratón artrítico; y la Figura 11 C articulación de un ratón tratado con rhl L-18BP. La Figura 12: muestra un histograma delineando los niveles de 5 los anticuerpos tipo II de anti-colágeno del isotipo lgG1 (columnas abiertas) o lgG2a (columnas rayadas) del ratón tratado con 3 mg/kg de IL-18BP o salina' (vehículo), respectivamente. Las medidas fueron tomadas en el día 4 (D4) o en el día 8 (D8) de la enfermedad. La Figura 13:muestra un histograma delineando los niveles IL-6 * 10 en pg/ml de los animales tratados con 1.3 o 10 mg/kg de IL-18BP, 10.000 JU » de Interferón ß (IFN-b) suero de ratón normal (NMS) o salina (NaCI), respectivamente. Las Figuras 14A, 14B y 14C: muestran la expresión de los transcriptos ANRm de hlL-18BP e IL-18en las biopsias intestinales de los 15 pacientes que sufren de la enfermedad de Crohn activa, la colitis ulcerosa o los Individuos saludables normales. Los productos RT-PCR representativas se muestran para IL-18BP para IL-18 y para un gen de locación (P-actina) (Fíg. 14 A). Se llevó a cabo la relativa cuantificación de bandas teñidas de « etidiumbromuro utilizando el Kodak Digital Imaging Software y se informan 20 como la proporción del gen objetivo a la actina-a. El gen objetivo es IL-18 en la Figura 14 B e IL-18BP en la Figura 14 C. Las Figuras 15A, 15B y 15C: muestran la expresión de los transcriptos ANRm e NL-18BP y de una proteína mediante la HUVEC S (células endotelíales de la vena umbilical Humana) y la expresión dé fa proteína mediante la THP1 (línea de células monocitica humana). El AWF µe aislado desde las células endoteliales no tratadas (medio) y desde las células endoteliales estimuladas con el IL-lß, TNFa, IFN?. Control Positivo: el colón de 5 un paciente con la enfermedad de Crohn, Control Negativo- sin ADNc El IL18- BP y la expresión IL-18 fueron analizados mediante el RT-PCR semicuantitativo (Figura 15 A). El supernaciente del cultivo desde el no tratado (medio) y luego de 24 horas de activación con el IL-1ß, el TNFa, el IFN? de HUVEC (Figura 15 B) o las células THP1 (Figura 15 C) fueron analizadas 10 mediante el IL-18BP y la producción de la proteína IL-18 mediante ELISA. La Figura 16: muestra el desarrollo del peso corporal entre el día 1 y el día 10 en un modelo de ratón IBD después de la administración • intraperitoneal (ip) de tanto salina (NaCI) o el IL-18BP (8 mg/kg). El cambio en el peso se expresa en el porcentaje del cambio del peso corporal desde el día 15 1. Se muestran los valores medios y los del SEM de dos grupos, 8 ratones por grupo. Las Figuras 17A, 17B y 17C: muestran los resultados de fos análisis de los colons, el caudal de los nodulos de la linfa y del bazo derivado de la IL-18BP en los ratones IBD tratados versus los no tratados. La Figura 17 ^^-^ 20 A delinea el peso de los últimos 6 centímetros del colon en mg. La Figura 17B muestra el número total de las células presentes en el caudal del nodulo de la linfa. Las figura 17 C delinea el porcentaje de las células con manchas- positivas para el CD4+/CD69"1" en el bazo. Los datos representan los valores á ¡ llili Artfti ? t, ni medios y el SEM. * Indica a diferencia importante. Las Figuras 18A, 18B 18C y 18D: muestran la cantidad de IFN? (Figura 18 A y B) y TNFa (Fig. 18 C y D) producida luego de 48 horas por las células del nóduío del caudal de la linfa (Figura 18 A y C) y las células del 5 bazo (Fig. 18 B y D luego de la estimulación con CD3/CD28 presentes en los supemacientes. Se muestran la media y el SEM. Las Figuras 19A y 19B: muestraN el contenido (Fig. 19A) IFNa y « (Fig. 19B) IFN^y en los homogenatos del colon. Los datos están corregidos para el peso del colon. Se muestran los valores medios y el SEM * Indica una 10 diferencia importante.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN • La presente invención está basada en el descubrimiento de un 15 efecto beneficioso de un inhibidor de IL-18 en diferentes enfermedades y desórdenes. El término "inhibidor de IL-18" dentro del contexto de esta invención se refiere a cualquier producción de IL-18 moduladora de molécula y/o acción en tal forma que la producción de I L-18 y/o fa acción sea atenuada, 20 reducida o, parcialmente, substancialmente o completamente impedida o bloqueada. El término "inhibidor IL-18" significa que abarca inhibidores de la producción L18 tanto como ios inhibidores de la acción IL-18. Un inhibidor de la producción puede ser cualquier molécula que * •& •* afecte negativamente la sfrrtesis, procesamiento o maduración de I L-18. ?jos inhibidores considerados de acuerdo con la invención pueden ser, por ejemplo, supresores del gen de expresión del interleukin IL-18, ANRos antisentido reduciendo o impidiendo la transcripción del AI Rm de IL-18 o 5 llevando a la degradación del ANRm, proteínas que deterioren el doblaje correcto, o que parcialmente o substancialmente impidan la secreción de IL- 18, proteasas degradando IL-18, una vez que ha sido sintetizada, los • inhibidores de proteasas partiendo del pro-IL-18 para generar I L-18 maduro, tal como los inhibidores de la caspasa-1 y lo similar. 10 Por ejemplo un inhibidor de la acción IL-18 puede ser un antagonista IL-18. Los antagonistas pueden unir o secuestrar la molécula IL- 18 en si misma con suficiente afinidad y especificidad para neutralizar parcialmente o substancialmente el IL-18 o el sitio(s)de • unión 1L-18 responsables de la unión de IL-18 a sus ligandos (como, por ejemplo, a sus 15 receptores). Un antagonista puede también inhibir el sendero de señalización IL-18, que es activado dentro de las células en la unión de IL-18/receptor. Los inhibidores de la acción de IL-18 pueden ser también receptores IL-18 solubles o las moléculas que imitan los receptores, o agentes F-' c que bloquean los receptores IL-18, o los anticuerpos IL-18, tales como los 20 anticuerpos policlonales o monoclonales, o cualquier otro agente o molécula que impida la unión de IL-18 a sus objetivos, de esta manera disminuyendo o impidiendo el accionar de las reacciones intra- o extra- celulares mediadas por IL-18. i De acuerdo con el primer aspecto de la presente invencfen,' to& l inhibidores o IL-18 se usan para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención del daño del hígado. Preferiblemente, la invención se refiere al uso de un inhibidor I L-18 para la fabricación de un medicamento 5 para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades del hígado agudas o crónicas, y más preferiblemente, la hepatitis por alcohol, la hepatitis viral, la hepatitis inmune, la hepatitis fulminante, la cirrosis hepática y la cirrosis biliar primaria. El término daño del hígado o enfermedad del hígado, como se 10 usa en la presente, comprende una variedad de condiciones patológicas diferentes. Varias de las condiciones contempladas en la presente invención han sido explicadas en detalle en "'Antecedentes de la Invención", ^ anteriormente descripta. Las enfermedades del hígado que pueden ser tratadas y/o impedidas de acuerdo con la invención comprende, por ejempjo, 15 abscesos de hígado pirogénico. También se llama hígado bacteriano y es t ia cavidad que produce pus dentro del hígado. Las causas de un absceso del hígado son múltiples. Puede ser desarrollado de una infección abdominal tal como la apendícitis, de la diverticulitis o de un intestino perforado; de una infección en la sangre; de una infección en el tracto biliar (secreción del 20 hígado); o trauma cuando el hígado lesionado se infecta. Los organismos más comunes que causan el absceso del hígado son el Esterichia coli, el Proteus vulgaris y el Enterobacter aerogenes. La incidencia es de 1 en 10.0D0 personas. Ü¿ Las enfermedades del hígado por alcohol pueden ser tratadas y/o prevenidas utilizando los inhibidores IL-18 de acuerdo con la presente invención. Incluyen la inflamación aguda o crónica del hígado inducida por los abusos del alcohol. Las hepatitis por alcohol ocurren luego de años de bebida 5 excesiva. Cuanto más larga la duración del uso del alcohol y cuanto mayor sea el consumo del alcohol, mayor será la probabilidad de desarroBar enfermedades del hígado. La mala nutrición se desarrolla como resultado de calorías vacías desde el alcohol, falta de apetito y mala absorción (inadecuada absorción de los nutrientes del tracto intestinal). La mala nutrición contribuye a 10 ia enfermedad del hígado. La toxicidad del etanol al hígado, la susceptibilidad individual a la enfermedad del hígado inducida por el alcohol y los factores genéticos también contribuyen al desarrollo de la enfermedad del hígado por alcohol. De acuerdo con la presente invención, la cirrosis del hígado 15 puede ser tratada y/o impedida utilizando los inhibidores IL-18. La cirrosis es una enfermedad del hígado crónico que causa daño al tejido del hígado, dejando una cicatriz en el hígado (fibrosis; regeneración nodular), disminución progresiva en la función del hígado, fluido excesivo en el abdomen (ascitis), desórdenes hemorrágicos (coagulapatía), aumenta de la presión en los vasos 20 sanguíneos (hipertensión portal) y desordenes en la functón del cerebro (encefalopatía hepática). El hígado dañado y cicatrizado se vuelve incapaz de eliminar adecuadamente los desperdicios (toxinas) de la sangre, y la formación de un tejido cicatrizado lleva a un aumento de la presión (hipertensión portal) en las venas entre el intestino y el bazo al hígado. El uso excesivo del alcohol es la causa que lleva a la cirrosis. Otras c usas- incluyen infecciones (tal como la hepatitis), enfermedades y defectos del sistema de drenaje (tal como estenosis u obstrucción), la fibrosis cística y el aumento de 5 la absorción de hierro y el cobre. El tipo de cirrosis depende de la causa de la enfermedad. Las complicaciones de la cirrosis puede ser severas. En los Estados Unidos de Norteamérica la cirrosis es la novena causa que lleva a la muerte. Pueden desarrollar problemas neurológicos (tales como encefalopatía hepática). El 10 aumento de la acumulación de fluido en la cavidad abdominal (ascitis) es '•>- causada por la disminución de las proteínas def cuerpo, el aumento del sodio y el incremento de la presión en los vasos de sangre del hígado (hipertensión F portal). La hipertensión portal puede causar el aumento de la presión, de la medida y de la plenitud en los vasos sanguíneos del esófago (várices del 15 esófago). Pueden ocurrir problemas de hemorragias y de coagulación. Los aumentos de la presión en los vasos sanguíneos y los problemas de coagulación sanguínea puede incrementar la posibilidad de amenaza severa de vida por hemorragia. F Otro desorden que está abarcado por el término "lesión del 20 hígado" de acuerdo con la presente invención es la hepatitis autoinmune. Es una inflamación del hígado causada por la interacción del sistema inmune. La hepatitis autoinmune es un tipo de hepatitis activa crónica. Las reacciones inmunes celulares puede ser una causa de la hepatitis activa crónica. Una variedad de tos autoanticuerpos circulantes puede encontrarse en la sangre de los pacientes con hepatitis activa crónica. Otras enfermedades autoinmunes pueden estar asociadas con la hepatitis activa crónica, o puede ocurrir en los parientes de los pacientes con hepatitis activa crónica. Estas 5 enfermedades son la tiroiditis, la diabetes mellitus, la colitis ulcerosa, la anemia hemolítica Coombs-positiva, la glomerulonefritis proliferativa, el síndrome de Sjorgren. Los factores de riesgo pueden incluir estas enfermedades o los factores de riesgo asociados con la hepatitis activa crónica. La incidencia es de 4 de 10.000 personas. 10 La atresia biliar es un posterior desorden dentro del alcance del término "lesión del hígado". Es una obstrucción de los conductos biliares causado por su falla en desarrollarse normalmente antes del nacimiento (en el ^^F útero). La atresia biliar es causada por el desarrollo anormal e inadecuado de los conductos biliares dentro o fuera del hígado. La finalidad del sistema biflar 15 es eliminar los desperdicios del hígado y conducir las sales biliares necesarias para la digestión de la grasa al intestino delgado. En estas condiciones, el flujo biliar del hígado a la vesícula biliar se bloquea. Esto puede llevar al daño del hígado y a la cirrosis del hígado, la cual, si no es tratada, eventualmente es fatal. 20 De acuerdo con la invención, los inhibidores de I L-18 se usan también para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la hepatitis activa crónica, también llamada hepatitis agresiva crónica. Es una inflamación continua del hígado que daña las células del " *- hígado. Las causas de la hepatitis activa crónica incluyen la infección viral^ la ingestión/reacción de la droga, los desórdenes metábólicos, o \ S enfermedades autoinmunes. Puede no haber, también, ninguna causa aparente. La enfermedad está caracterizada por la necrosis o muerte de las 5 células del hígado, la inflamación activa y la fibrosis que puede llevar a la falla del hígado, a la cirrosis y a la muerte. La incidencia es de 1 en 10.000. Los factores de riesgo son las enfermedades autoinmunes, la infección previa, con • la hepatitis C, o una hepatitis A positiva o antígeno B de hepatitis por más de 6 meses. 10 La hepatitis persistente crónica es una forma no progresiva, suave de la inflamación del hígado y es también una enfermedad abarcada por el término "lesión del hígado" de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con la presente invención, los inhibidores IL-18 también se usan para la fabricación de un medicamento para el tratamiento 15 y/o la prevención de la cirrosis biliar primaria (PBC). El PBC es una condición inflamatoria que resulta de la obstrucción del flujo de la bilis en el hígado, causando daño a las células del hígado. Los conductos biSares dentro del hígado se inflaman debido a causas desconocidas. La enferm dad más f frecuentemente, afecta a las mujeres de mediana edad. El comienzo de tos 20 síntomas es gradual, con la picazón de la piel como primer síntoma. Ocurre una inflamación de los conductos biliares dentro del hígado. Eventualmente, „ se desarrolla una cirrosis del hígado. La enfermedad puede estar asociada con fos desordenes autoinmunes. La incidencia es de 8 en 100.000 personas. j¿¿li?¿L?-- ^-^ Los inhibidores de IL-18 contemplados en la presente pueden también ser usados para el tratamiento del envenenamiento hepático agudo, por ejemplo, causado por una cantidad alta de paracetamol. Tal envenenamiento hepático agudo puede ser debido a una sobredosis de paracetamol, ya sea accidental o deliberada. Como se muestra en los ejemplos más adelante, los inventores de la presente invención han encontrado sorprendentemente que los inhibidores IL-18 son particularmente efectivos en la prevención y en el tratamiento de la hepatitis fulminante (hepatitis aguda). Por lo tanto, la invención preferiblemente se refiere a la prevención y/o al tratamiento de la hepatitis fulminante. De acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, los inhibidores IL-18 se usan en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la artritis. El término "artritis" como se usa en la presente incluye todos los tipos diferentes de artritis y las condiciones artríticas, tanto agudas y crónicas, como se define por ejemplo en el Página Principal del Departamento de Ortopedia de la Universidad de Washington en Artritis: (www.orthop.washington.edu) los ejemplos para las condiciones artríticas son la espondilitis anquilosante, dolor de espalda, síndrome de deposición carpal, síndrome de Ethlers-Danlos, gota, artritis juvenil, lupus eritematoso, miositis, osteogenesis imperfecta, osteoporosis, políarteritís, polimiositis, artritis psoriatica. Síndrome de Reiter, escleroderma, artritis con enfermedad intestinal, enfermedad de Behcets, artritis del niño, enfermedad de la articulación degenerativa, fibromialgia, artritis infecciosa, enfermedad de lima, síndrome de Marfan, osteoartritis, osteonecrosis, Enfermedad de Pagets, Polimiafgia reumática, pseudogota, distrofia simpática refleja, artritis 5 reumatoidea, reumatismo, síndrome de Sjorgren, poliposis adenomatosa familiar y lo similar. Preferiblemente, de acuerdo con la invención, los inhibidores de IL-18 se proporcionan para el tratamiento y/o la prevención de la artritis inflamatoria. La artritis inflamatoria se clasifica como una artritis crónica, de 10 acuerdo con el curso persistente, continuo o recurrente de la enfermedad. En una realización preferida de la invención, la artritis inflamatoria es la artritis reumatoidea (RA). La RA causa inflamación en el ^K f lineamiento de las articulaciones (la membrana sinovial, un epitelio de capa de célula) y/o los órganos internos. La enfermedad tiende a persistir durante 15 muchos años, normalmente afecta muchas articulaciones diferentes a través del cuerpo y últimamente puede causar daño del cartílago, huesos, tendones y ligamentos. Las articulaciones que pueden estar afectadas por RA son las -articulaciones ubicadas en el cuello, hombros, codos, cadera, cintura, manos, rodillas, tobillo y pies, por ejemplo. En muchos casos, las articulaciones se 20 inflaman en el modelo simétrico en la RA. RA prevalece en alrededor del 1 por ciento de la población en tos Estados Unidos de Norteamérica, estando distribuida dentro de todos tos grupos étnicos y edades. Afecta a todo el mundo, entre aquellos que tienen RA las mujeres superan a la cantidad de hombres por 3 a 1. Como se muestra en los ejemplos de abajo, un inhibidor de I L-18 se ha probado que exhibe un efecto beneficioso de alta eficacia en la erosión dei cartílago. La invención, por lo tanto, además se refiere al uso de un 5 inhibidor de I L-18 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la destrucción del cartílago, es decir, el uso de un inhibidor IL- 18 como agente condroprotector. El inhibidor IL-18 puede ser usado en cualquier condición en la cual ocurre la destrucción del cartílago o la erosión. La destrucción del cartílago es la declinación progresiva de la integridad 10 estructural del cartílago articular de la coyuntura. Ocurre por ejemplo en condiciones que afectan el cartílago articular tal como la artritis reumatoidea, la artritis reumatoidea juvenil o en la osteoartritis, pero también en la sinovítis F infecciosa. El tercer aspecto de la presente invención se refiere al uso del 15 inhibidor IL-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad inflamatoria del intestino. Se basa en el descubrimiento que un inhibidor de IL-18 es regulado hacia arriba en la mucosa inflamada de los pacientes CD. Luego se basa en el descubrimiento de que la administración de diferentes inhibidores de IL-18 tengan un efecto 20 protector de la colitis en un modelo de ratón. La regulación hacia arriba de IL-18 en la mucosa enferma de tos pacientes CD ha sido descripta en la técnica (Monteléone y colaboradores 1999; Pizarra y colaboradores, 1999).

Luego de haber demostrado la presencia de altas cantidades de IL-18BP en las regiones inflamadas de la mucosa intestinal de acuerdo con la invención, fue más sorprendente encontrar un efecto beneficioso pronunciado de IL-18BP administrado en forma sistémica en el desarrollo y los síntomas de la colitis en un modelo animal. Aunque IL-18BP es ya regulado hacia arriba en forma endógena en el intestino de los pacientes CD como se demostrara en los ejemplos de más adelante, la cantidad de IL-18BP que el cuerpo es capaz de producir no parece ser suficiente para pelear la enfermedad. Preferiblemente, de acuerdo con la invención, la enfermedad del intestino inflamatoria es la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa. En una realización preferida de la presente invención, el inhibidor de IL-18 se selecciona de los inhibidores de la caspasa-1 (ICE), tos anticuerpos dirigidos contra IL-18, los anticuerpos dirigidos contra cualquiera de las subunidades receptores IL-18, los inhibidores del sendero de señalamiento de IL-18, los antagonistas de I L-18 que compiten con I L-18 y bloquean el receptor de IL-18, y las proteínas de unión de IL-18, los isoformos, las muteínas, las proteínas fundidas, los derivados funcionales, las fracciones activas o derivados permutados circularmente de tos mismos teniendo la misma actividad. El término "proteínas de unión IL-18" se usa en la presente como sinónimo del "IL-18BP". Comprende las proteínas de unión IL-18 como se definen en WO 99/09063 o en Novick y colaboradores, 1999, incluyendo fas variantes de empalme y/o isoformos de las proteínas de unión IL-18, como se define en Kim y colaboradores, 2000. En particular, los isoformos humanos a y c de IL-18&P son útiles de acuerdo con la presente invención. Las proteínas útiles de acuerdo con la presente invención pueden ser glicosiladas o no giicosiladas. Pueden ser derivadas de fuentes naturales, tales como la orina, o 5 pueden ser preferiblemente producidas en forma recombinante. La expresión recombinante puede ser llevada a cabo en tos sistemas de expresión procariótica como el E. coli, o en eucariótica y preferiblemente en los sistemas ^P^ de expresión de los mamíferos. Como se usa en la presente el término " muteínas " se refiere a 10 los análogos de un IL-18BP, o los análogos de una viral IL-18BP, en la cual uno o más de los residuos de amino ácido de un 1L-18BP natural o IL-18BP viral se reemplazan por los diferentes residuos aminoácidos, o están ^^!P eliminados, o uno o mas residuos aminoácidos son agregados a la secuencia natural de un IL-18BP, o un IL-18BP viral, sin cambiar considerablemente la 15 actividad de los productos resultantes como se compara con el tipo salvaje IL- 8BP o viral IL-18BP. Estas muteínas son preparados por la síntesis conocida y/o por las técnicas de mutagénesis de sitio dirigida o por cualquier técnica adecuada conocida para lo mismo. Cualquiera de tales muteínas preferiblemente tiene una 20 secuencia de aminoácido suficientemente dupijcadora que aquella de un IL- 18BP, o suficientemente duplicadora de un IL-18BP viral, tai como que tiene substancialmente actividad similar a IL-18BP. Una actividad de IL-18BP es su capacidad de unir IL-18. Mientras que la muteína tenga actividad de unión substancial al I L-18 puede ser usado en la purificación de I L-18, tal como por los medios de cromatografía de afinidad, y de esta manera puede ser considerado como que tiene actividad substancialmente similar al IL-18BP. De esta manera puede ser determinado si cualquier muteína tiene 5 substancialmente la misma actividad como IL-18BP por medio de la rutina de experimentación que comprende someter tal muteína, por ejemplo a un ensayo de competición sandwich para determinar si o no se une a un IL-18 • apropiadamente etiquetado, tal como el ensayo ELISA o el radioinmunoensayo. 10 Las muteínas de los polipéptidos IL-18BP o las muteínas del IL- 18BPs viral que pueden ser usadas de acuerdo con la presente invención, o el ácido nucleico que codifica para lo mismo, incluye un juego finito de las # secuencias que corresponden substancialmente a los péptidos de substitución o a tos polinucleótidos que pueden ser obtenidos en forma rutinaria por una 15 persona experta en la técnica sin la experimentación debida, basado en tes enseñanzas y en la guía presentada en la presente. Los cambios preferidos para las muteínas de acuerdo con la presente invención son lo que se conoce como substituciones '"conservadoras". Las substituciones de aminoácido conservadoras de los 20 polípéptidos IL 18BP o las proteínas o IL-18BPs virales pueden incluir aminoácidos sinónimos dentro un grupo que ha sido suficientemente similar a las propiedades fisioquímicas que la substitución entre los miembros del grupo que van a preservar la función biológica de la molécula (Grantham, 1974). Es claro que tes inserciones y las eliminaciones de los aminoácidos puede también ser realizada en las secuencias anteriormente definidas sin alterar su función, particularmente si las inserciones o eliminaciones solamente involucran unos pocos aminoácidos, por ejemplo, abajo de treinta y 5 preferiblemente abajo de diez, y no quitan o desplazan tos aminoácidos que son críticos a la conformación funcional, por ejempto los residuos de cisteína. Las proteínas y las muteínas producidos por tales eliminaciones y/o inserciones caen dentro del alcance de la presente invención. Preferiblemente, los grupos aminoácidos de sinónimos son 10 aquellos definidos en el Cuadro 1. Más preferiblemente, los grupos de aminoácidos de sinónimos son aquellos definidos en el Cuadro H, y más preferiblemente los grupos aminoácidos sinónimos son aquellos definidos en el Cuadro III. 15 CUADRO 1 Aminoácidos Grupo sinónimos Ser Ser, Thr, Gly, Asn A Arg Arg, Gln, Lys, Met, Val, Leu 20 Leu ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, Gln, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, ile, Leu, Val Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly lie Met, Tyr, Phe, Val, Leu, ile Phe Trp, Met, Tyr, ile, Val, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, ile, Val, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Gly, Lys, Gln, Thr, Arg, His Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gln, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Met Phe, ile, Val, Leu, Met Trp Trp CUADRO II Los grupos más preferidos de sinónimos de Aminoácidos Aminoácido Grupo sinónimos Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, ile, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Val Val, Met, ile Gly Gly lie ¡le, Met, he, Val, Leu Phe Met, Tyr, ile, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gln, Arg Gln Glu, Gln, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gln Met Met, Phe, ¡le, Val, Leu Trp Trp CUADRO lll Los Grupos Más Preferidos de Sinónimos de Aminoácidos Aminoácido Grupo de sinónimos Ser Ser Arg Arg Leu Leu, ile, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Val Val lie ile, Met, Leu 10 Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser Gln Gln 15 Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu 20 Trp Met Los ejemplos de producción de las substituciones de aminoácido en las proteínas que se pueden usar para obtener las muteínas de los ^polipéptidas de IL-18BP o fas proteínas, o las muteínas de IL-18BPs viral para usar en la presente invención incluyen cualquier paso de método conocido, tal como el presentado en la patente de los Estados Unidos de Norte América RE 33.653, en la patente de los Estados Unidos de Norte América 4.959.314, en la patente de los Estados Unidos de Norte América 4.588.585 y en la patente de los Estados Unidos de Norte América 4.737.462 a Mark y colaboradores; en la patente de los Estados Unidos de Norte América 5.116.943 a Koths y colaboradores, en la patente de los Estados Unidos de Norte América 4.965.195 a Ñamen y colaboradores; en la patente de los Estados Unidos de Norte América 4.879.111 a Chong y colaboradores; y en la patente de los Estados Unidos de Norte América 5.017.691 a Lee y colaboradores; y las proteínas substituidas de lisina presentadas en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4.904.584 (Shaw y colaboradores). El término "proteína fusionada" se refiere a un polipéptido que comprende un IL-18BP, o un IL-18BP viral, o un muteína o fragmento del mismo, fusionado con otra proteína, la que, por ejemplo tiene un tiempo de residencia extenso en los fluidos corporales. Una IL-18BP o viral IL-18BP, puede, de esta manera, ser fusionado a otra proteína, polipéptido u lo similar, por ejemplo una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. Los "derivados funcionales" como se usan en la presente cubren los derivados de IL-18BPs o un IL-18BP viral, y sus muteínas y las proteínas fusionadas, las que pueden ser preparadas de los grupos funcionales que ocurren como cadenas laterales en los residuos o los grupos C-terminales o N-terminales, por los medtos conocidos en la técnica, y sor} incluidos en la invención si se mantienen farmacéuticamente aceptables, es decir, si no destruyen la actividad de la proteína que es substancialmente similar a la actividad de IL-18BP, o viral IL-18BPs, y no confiere propiedades tóxicas en 5 las composiciones que la contienen. Estos derivados, pueden, por ejemplo, incluir cadenas laterales de polietilenglicol, que pueden disfrazar sitios antigénicos y extienden la residencia de un IL-18BP o un IL-18BP viral en los fluidos corporales. Otros derivados incluyen los esteres alifáticos de los grupos carboxílicos, las amidas 10 de los grupos carboxilo por reacción con amonio o con aminas primarias o secundarias, los derivados N-acilo de los grupos amino libres de residuos aminoácidos formados con fas fracciones de acilo (por ejemplo alcanoílo o ^¡--^ grupos aroilo carbocíclicos) o derivados O-acilo de los grupos hidroxilo libres (por ejemplo aquel de los residuos de serilo o treonilo) formado con fracciones 15 acifo. Como "las fracciones activas" de un IL-18BP, o un IL-18BP viral, las muteínas y las proteínas fusionadas, la presente invención cubre cualquier fragmento o precursor de la cadena de polipéptido de la molécula de proteína sola o junto con las moléculas asociadas o los residuos unidos a la misma, por ^ 20 ejempto, los residuos de azúcar o fosfato, o agregados de la molécula de proteína o de los residuos de azúcar por si mismos, siempre que dicha fracción tenga actividad substancialmente similar a IL-18BP. En una realización posterior preferida de la invención, el inhibidor liui^^^^ de IL-18 es un anticuerpo IL-18. Los anticuerpos IL-18 pueden ser policlonales o monoclonales, quiméricos, humanizados o aún totalmente humanos. Los anticuerpos recombinantes y los fragmentos de los mismos están caracterizados por unión de alta afinidad a IL-18 in vivo y baja toxicidad. Los 5 anticuerpos que se pueden usar en la invención se caracterizan por su capacidad para tratar a los pacientes durante el periodo suficiente para tener buena a excelente regresión o alivio de la condición patogénica o cualquier síntoma o grupo de síntomas relacionados a una condición patogénica y a te baja toxicidad. 10 Los cuerpos neutralizantes son fácilmente construidos en los animales tales como los conejos, las cabras o los ratones por la inmunización con IL-18. Los ratones inmunizados son particularmente útiles para (P proporcionar las fuentes de las células B para la fabricación de hibridomas, los que a su vez son cultivados para producir grandes cantidades de anticuerpos 15 monoclonales anti-l L-18. Los anticuefos quiméricos son moléculas de inmunoglobulina caracterizada por dos o más segmentos o porciones derivadas de las especies animales diferentes. Generalmente, la región variable del anticuerpo {^k quimérico se deriva de un anticuerpo de mamífero no humano, tal como el 20 anticuerpo monoclonal del ratón, y la región constante de inmunoglobulina se deriva de una molécula humana inmunoglobulina. Preferiblemente, ambas regiones y la combinación tienen baja inmunogenicidad como lo determina en forma rutinaria (Elliot y colaboradores, 1994). Los anticuerpos humanizados •fsbfr moléculas de inmunogtobulina creadas por técnicas de ingeniería genética en la cual las regiones constantes de ratón son colocadas con contrapartes humanas mientras retienen las regiones de anticuerpo de antígeno de ratón. El anticuerpo quimérico humano de ratón resultante, preferiblemente tiene 5 inmunogenrcidad reducida y farmacoquinéticos mejorados en los humanos (Knigh y colaboradores). De esta manera, en una realización posterior. El anticuefo IL-18 f es un anticuerpo I L-18 humanizado Los ejemplos preferidos de anticuerpos anti-IL-18 humanizados se describen en la solicitud de Patente Europea EP 0 10 974600, por ejemplo. En aún otra realización preferida, el anticuerpo I L-18 es totalmente humano. La tecnología para producir los anticuerpos humanos se describen en detalle, por ejemplo en las patentes WO00/76310, WO99/53049, en la patente de los Estados Unidos de Norte América No. 6.162.963 o en la 15 patente No. AU5336100. Los anticuefos humanos totalmente son anticuerpos recombinantes preferiblemente, producidos en tos animales transgénicos, por ejempto el xenoratón, comprendiendo todo o partes del Ig loci humano funcional. En una realización altamente preferida de la presente invención, 20 el inhibidor de fL-18 es IL-18BP, o un isoformo, un muteína, una proteína fusionada, un derivado funcional, una fracción activa o derivado permutado circularmente de la misma. Estos ísoformos, muteínas, proteínas fusionadas o derivados funcionales retienen la actividad biológica de IL-18BP, en particular, la unión a IL-18 y preferíbterrfente tienen esencialmente * al menos una actividad similar a IL-18BP. Idealmente, tales proteínas tienen una actividad biológica que es aún incrementada en comparación con el IL-18BP modificado. Las fracciones 5 activas preferidas tienen una actividad que es mejor que la actividad de IL- 18BP, o la cual tíene posteriores ventajas, como una estabilidad mejor o una toxicidad más baja o ¡nmunogenicidad, o son más fáciles de producir en cantidades grandes, o más fáciles de purificar. Las secuencias de IL-18BP y sus ¡soformos/ variantes de corte 10 pueden ser tomados de la WO 99/09063 o de Novick y colaboradores, 1999, tanto como de Kim y colaboradores, 2000. Los derivados funcionales de IL-18BP pueden ser conjugados a • polímeros para mejorar las propiedades de la proteína, tal como la estabilidad, vida media, biodisponibilidad, tolerancia por el cuerpo humano o 15 inmunogenicidad. Para lograr esta meta IL 18-BP puede ser unida por ejempto al* Polietilenglicol (PEG). La PEG-ilación puede ser llevada a cabo por los métodos conocidos, descríptos por ejemplo, en la patente WO 92/13095. Por lo tanto, en una realización preferida de la presente invención, IL-18BP es PEG-ilado. 20 En una posterior realización de la invención, el inhibidor de IL-18 es una proteína fusionada que comprende todo o parte de una proteína de unión IL-18, que se fusiona a todo o parte de una inmunoglobulina. La persona experta en la técnica va a entender que la proteína de fusión resultante retiene la actividad biológica de IL-18BP, en particular, la unión a IL-18. La fusión puede ser directa, o vía un péptido unido corto que puede ser tan corto como 1 a 3 residuos de aminoácido en longitud o más largo, por ejemplo, 13 residuos aminoácidos en longitud. Dicho conector puede ser un tripéptido de 5 la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met), por ejemplo o una secuencia de conector de aminoácido Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introducido entre la secuencia IL-18BP y la secuencia de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante ha mejorado las propiedades, tal como el tiempo de residencia extendido en los fluidos corporales (vida media), incrementó la 10 actividad específica, aumentó los niveles de expresión o facilitó la purificación de la proteína de fusión. En una realización preferida, IL-18BP está fusionada a la región • constante de una molécula Ig. Preferiblemente, está fusionada a las regiones de cadena pesada, como tos dominios CH2 y CH3 del lgG1 humano, por 15 ejemplo. La generación de las proteínas de fusión especificas que comprenden IL-18BP y una porción de una inmunoglobuHna están descriptas en el ejemplo 11 de la WO99/09063, por ejempto. Otros isoformos de las moléculas Ig son también adecuados para la generación de las proteínas de # fusión, de acuerdo con la presente invención, tales como los isoformos lgG2 o 20 IgGt, u otras clases de Ig, como IgM o IgA, por ejemplo. Las proteínas de fusión pueden ser monoméricas o multiméricas, hetero o homomultiméricas. Los interferones son predominantemente conocidos por tos efectos inhibitorios en la replicación y la proliferación celular. El interferón-?, por ejemplo, juega un rol importante en promover tes respuestas inmunes e inflamatorias. El ínterferón ß (IFN-ß, un ¡nterferón tipo I), se dice que juega un rol anti-inflamatopo. Los estudios publicados por Tpantaphyllopoutos y colaboradores (1999) indicaron que IFN-ß tiene un efecto beneficioso en la terapia de la artritis reumatoidea, como se muestra en el modelo del ratón de la enfermedad, el modelo (CÍA) de te artritis inducida por colágeno Este efecto beneficioso de IFN-ß fue confirmado en los ejemplos de más adelante. La invención también se refiere al uso de una combinación de un inhibidor de IL- 8 y un interferón en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la artritis, en particular la artritis reumatoidea. Los interferones pueden también estar conjugados a polímeros para mejorar la estabilidad de las proteínas. Un conjugado entre el rnterferón ß y el Polietilenglicol de poliol (PEG) se ha descripto en la W099/55377, por ejemplo. En otra realización preferida de la invención, el interferón es Interferón-ß (IFN-ß), y más preferiblemente IFN-ß 1A. El inhibidor de la producción de IL-18 y/o acción es preferiblemente utilizado simultáneamente, en forma secuencial, o separadamente con el interferón. En aún otra posterior realización de la invención, un inhibidor de IL-18 se utiliza en combinación con un antagonista TNF. Los antagonistas TNF ejercen su actividad en varias maneras. Primero, tos antagonistas pueden unir a un secuestrador de la molécula TNF en si misma con suficiente afinidad y especificidad para parcialmente o substancialmente neutralizar el epitopo TNF o los epitopos responsables, para la unión del receptor TNF (en adelante denominado "antagonistas secuestrantes"). Un antagonista secuestrante puede ser, por ejemplo, un anticuefo dirigido contra TNF. 5 Alternativamente, los antagonistas TNF pueden inhibir el sendero de señalización TNF activado por el receptor de superficie de célula luego de la unión de TNF (en adelante denominado "antagonistas señalantes"). Ambos ^^^ grupos de antagonistas son útiles, tanto solos o juntos, en combinación con un inhibidor IL-18, en la terapia de la artritis, en particular la artritis reumatoidea. 10 Los antagonistas TNF son fácilmente identificados y evaluados por el filtrado de rutina de los candidatos para su efecto en la actividad del TNF nativo en las líneas de célula susceptibles in vitro, por ejemplo las células B humanas, en las cuales TNF causa la proliferación y la secreción de inmunoglobulina. B ensayo contiene la formulación de TNF a disoluciones 15 variantes de antagonistas candidatos, por ejemplo, desde 0.1 a 100 veces la cantidad molar de TNF utilizado en el ensayo, y los controles con ningún TNF o solamente antagonista (Tucci y colaboradores, 1992)'. Los antagonistas secuestrantes son los antagonistas TNF t preferidos para usar de acuerdo con la presente invención. Entre tos 20 antagonistas secuestrantes, aquellos polipéptidos que unen TNF con alta afinidad y posee baja inmunogenicidad son los preferibles. Las moléculas de receptor TNF solubles y los anticuerpos neutralizantes a TNF son 1os particularmente preferidos. Por ejemplo, el TNF-RI y TNF-RII solubles son Á¿Lá.A tiAA^É^^^j ^ ^^ útiles en la presente invención. Las formas truncadas de estos receptores, que comprenden los dominios extracelulares de los receptores o las porciones funcionales de los mismos, son más particularmente tos antagonistas preferidos de acuerdo con la presente invención. Los receptores de TNF de tipo I y de tipo II truncados solubles se describen en la EP914431 , por ejemplo. Las formas truncadas de los receptores TNF son solubles y han sido detectados en la orina y el suero como proteínas de unión inhibitorias de TNF 30 kDa y 40 kDa, que son llamados TBPI y TBPII, respectivamente (Epgelmapn y colaboradores, 1990). El uso simultáneo, secuencial o separado del inhibidor I L-18 con el antagonista TNF y/o un interferón es preferido, de acuerdo con la invención. De acuerdo con la invención, TBPI y TBPII son los antagonistas TNF preferidos a ser usados en combinación con el inhibidor IL-18. Los derivados, los fragmentos, las regiones y las porciones biológicamente activas de las moléculas de receptor funcionalmente se parecen a las moléculas del receptor que puede también ser usada en la presente invención. Tal equivalente biológicamente activo o derivado de la molécula receptora se refiere a te porción del polipéptido, o de la secuencia que codifica la molécula de receptor, que es de medida suficiente y capaz de unir TNP con tal afinidad que la interacción con el receptor de membrana-unida TNF es inhibido o bloqueado. En una realización posterior preferida, la TNF-RI (TBPI) soluble humana es el antagonista TNF a ser usado de acuerdo con la invención. Las moléculas receptoras TNF solubles recombrpaptes y naturales y los métodos de su producción han sido descriptas en las Patentes Europeas EP 308 378, EP 398 327 y EP 433 900. 5 El inhibidor IL puede ser usado en forma simultánea, secuencialmente o separadamente con el inhibidor TNF. Ventajosamente, se usa una combinación de un anticuerpo IL-18 o antisuero y un receptor soluble de TNF, que tiene actividad inhibidora TNF. En una realización posterior preferida de la invención, el 10 medicamento además comprende un inhibidor COX, preferiblemente un inhibidor COX-2. Los inhibidores COX son conocidos en la técnica. Los inhibidores específicos COX-2 son revelados en la WO 01/00229, por ejemplo.

^^^ La invención además se refiere al uso de una combinación de IL- 18 y o a los interferones y/o antagonistas TNF y/o inhibidores COX-2. La 15 combinación es adecuada para el tratamiento y/o la prevención de la artritis. En particular la artritis reumatsidea y para el tratamiento y/o la prevención del daño del hígado y para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad del intestino inflamatoria, en particular, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Los componentes activos pueden ser usados en forma simultánea, 20 secuencialmente o separadamente. En una realización preferida de la presente invención, el inhibidor de IL-18 se usa en una cantidad de alrededor de 0.0001 a 10 mg/kg de peso coforal, o alrededor de 0.01 a 5 mg/kg de peso corporal o alrededor de 0J a 3 mg/kg de peso corporal o alrededor de 1 a 2 mg/kg de peso corporal. En aún otra realización preferida, el inhibidor de IL-18 se usa en una cantidad de alrededor de OJ a 1000 µg/kg de peso corporal o 1 a 100 µg/kg de peso corporal o alrededor de 10 a 50 µg/kg de peso corporal. 5 La invención además se refiere al uso de un vector de expresión que comprende te secuencia de codificación de un inhibidor de IL-18 en la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de las • . condiciones artríticas o la artritis, en particular, la artritis reumatoidea, para el tratamiento de la lesión del hígado y para el tratamiento de la enfermedad del 1 intestino inflamatoria. Un método terapéutico de gen es de esta manera usado para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad. Ventajosamente, la expresión del inhibidor IL-18 va a estar luego in situ, de esta manera bloquea eficientemente al I L-18 directamente en el tejido o en las células afectadas por la enfermedad. 15 Para tratar y/o impedir la artritis, el vector de terapia de gen que comprende la secuencia de un inhibidor de la producción IL-18 y/o la acción puede ser inyectada directamente en la articulación enferma, por ejemplo, as| evitando problemas involucrados en la administración sístémica de tos vectores de terapia de gen, como la disolución de los vectores, alcanzado y 20 haciendo objetivo en las células objetivo o tos tejidos y de los efectos secundarios. El uso de un vector para inducir y/o aumentar la producción endógena de un inhibidor de IL-18 en una célula normalmente silenciosa para la expresión de un inhibidor IL-18, o que expresa cantidades del inhibidor que no son suficientes, están también contempladas de acuerdo con la invención El vector puede comprender secuencias reguladoras funcionales en las células deseadas para expresar al inhibidor o IL-18. Tales secuencias 5 reguladoras pueden ser promotores o aumentadores, por ejempto. La secuencia reguladora puede luego ser introducida en el sitio justo del genoma por la recombinación homologa, de esta manera une operativamente te f^Ht secuencia reguladora con el gen, la expresión del cual se requiere para ser inducida o aumentada. La tecnología es normalmente denominada como 10 "activación de gen endógena" (EGA), y se describe por ejemplo en la WO 91/09955. Se debe entender, por una persona experta en la técnica, que es <^ también posible silenciar la expresión IL-18 utilizando la misma técnica, es decir introduciendo un elemento de regulación negativo, como, por ejemplo 15 elementos de silenciamiento, en el sitio del gen de IL-18, de esta manera llevando la regulación hacia abajo o la prevención de la expresión IL-18. La persona experta en la técnica va a entender que tal regulación hacia abajo o silenciamiento de la expresión IL-18 tiene el mismo efecto que el uso de un f inhibidor IL-18 para impedir y/o tratar la enfermedad. 20 La invención además se refiere al uso de una célula que ha sido genéticamente modificada para producir un inhibidor de IL-18 en la fabricación de un medicamento para ei tratamiento y /o la prevención de la lesión del hígado, te artritis o te enfermedad inflamatoria del intestino.

La invención además se refiere a las composiciones farmacéuticas, particularmente útiles para la prevención y/o el tratamiento de la artritis inflamatoria, la lesión del hígado o la enfermedad inflamatoria del intestino, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un 5 inhibidor de tL-18 y una cantidad terapéuticamente efectiva de un interferón. Como inhibidora de I L-18, la composición puede comprender los inhibidores de caspasa-1 , los anticuefos contra IL-18, los anticuefos contra las ? subunidades del receptor IL-18, los inhibidores del sendero de señalamiento I L-18, los antagonistas de I L-18 que compiten con I L-18 y bloquean el receptor tO de IL-18, y tes proteínas de unión IL-18, tos isoformos, las muteínas, las proteínas de fusión, los derivados funcionales, las fracciones activas o los derivados circularmente permutados de los mismos teniendo la misma actividad. IL-18BP y sus isoformos, las muteínas, las proteínas fusionadas, 15 los derivados funcionales, las fracciones activas o los derivados permutados circularmente como se describiera anteriormente son los ingredientes preferidos activos de las composiciones farmacéuticas. El interferón comprendido en la composición farmacéutica es preferiblemente IFN-ß. ^ w 20 En aún otra realización preferida, la composición farmacéutica comprende las cantidades terapéuticamente efectivas de un inhibidor IL-18, spcionatmente un interferón, y un antagonista TNF. Los antagonistas TNF pueden ser anticuerpos neutralizantes de la actividad TNF, o fragmentos de ' receptor TNF truncados, también llamado TBPI y TPBH. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede posteriormente comprender uno o más inhibidores COX, preferiblemente inhibidores COX-2. La definición de "farmacéuticamente aceptable" significa abarcar 5 cualquier vehículo que no interfiere con efectividad de te actividad biológica del ingrediente activo y que no es tóxico al huésped al cual se administra. Por ejemplo, para la administración parenteral, la proteína(s) activa puede ser formulada en una forma de unidad de dosis para inyección en vehículos tales como salina, solución dextrosa, suero de albúmina y solución de Ringer. 10 Los ingredientes activos de te composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención pueden ser administrados a un individuo en una variedad de maneras. Las rutas de administración incluyen las vías intradérmica, transdérmica (por ejemplo en las formulaciones de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, epidural, 15 tópica e intranasal. Cualquier otra vía eficaz terapéuticamente puede ser usada, por ejemplo la absorción por medio de los tejidos epiteliales o endoteliales o por la terapia de gen donde una molécula de ADN que codifica el agente activo se administra al paciente (por ejemplo vía un vector) que causa al agente activo a ser expresado y secretado in vivo. Además, la ^ ^ 20 proterna(s) de acuerdo con la invención puede ser administrada junto con otros componentes de los agentes activos biológicamente tales como los surfactantes farmacéuticamente aceptables, tos excipientes, los portadores, los diluyentes y los vehículos.

Para la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular) la(s) proteína(s) activa(s) puede ser formuladas como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable (por ejemplo agua, 5 salina, solución dextrosa) y aditivos que mantengan la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o estabilidad química (por ejemplo conservantes y amortiguadores). La formulación es esterilizada por las técnicas utilizadas F comúnmente. La biodisponibilidad de la(s) proteína(s) activa(s) de acuerdo GO? 10 la invención pueden también ser mejoradas por el uso de procedimientos de conjugación que aumentan la vida media de la molécula en el cuefo humano, por ejemplo uniendo la molécula al polietilenglicol, como se describe en la F solicitud de Patente PCT WO 92/13095. Las cantidades terapéuticamente efectivas de las proteína(s) 15 activas serán una función de muchas variables, incluyendo el tipo de antagonista, ta afinidad del antagonista para IL-18, cualquier actividad citotóxica residual exhibida por los antagonistas, la ruta de administración, la condición clínica del paciente (incluyendo el deseo de mantener un nivel no tóxico de actividad endógena I L-18). 20 Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es tal que cuando se administra, el inhibidor IL-18 resulta en la inhibición de la actividad biológica de IL-18. El dosaje de administración como dosis únicas o múltiples a un individuo va a variar dependiendo de una variedad de factores, incluyendo las propiedades farmacocinéticas def inhibidor IL-18, la ruta de administración, las condiciones del paciente y las características (sexo, edad, peso corporal, salud, tamaño), importancia de los síntomas, tratamientos concurrentes, frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. Los ajustes y la manipulación 5 de las gamas de dosaje establecido están bien dentro de la habilidad de aquellos expertos en la técnica, tanto como de los métodos in vitro e in vivo para determinar la inhibición de IL-18 en un individuo.

De acuerdo con la invención, el inhibidor de I L-18 se usa en una cantidad de alrededor de 0.0001 a 10 mg/kg o alrededor de 0.01 a 5 mg/kg de 10 peso corporal o alrededor de 0.01 a 5 mg/kg de peso coforal o alrededor de 0J a 3 mg/kg de peso corporal o alrededor de 1 a 2 mg/kg de peso corporal. Otras cantidades preferidas de tos inhibidores IL-18 son tas cantidades de A- alrededor de OJ a 1000 µg/kg del peso corporal o alrededor de 1 a 100 µg/kg del peso corporal o alrededor de 10 a 50 µg/kg del peso corporal. 15 La ruta de administración que es preferida de acuerdo con la invención es la administración por la vía subcutánea. Luego se prefiere ta administración intramuscular, de acuerdo con la invención. En las realizaciones preferidas, el inhibidor de IL-18 es administrado diariamente o día por medio. 20 La dosis diaria es usualmente administrada en dosis divididas o en la forma de liberación sostenida efectiva para obtener los resultados deseados. La segunda administración o las subsecuentes puede ser llevadas a cabo a un dosaje que es el mismo, menos que o mayor que o la dosis inicial o previa administrada al individuo. Una segunda o administración subsecuente puede ser administrada durante o antes del comienzo de la enfermedad. De acuerdo con la invención, el inhibidor IL-18 puede ser administrado profilácticamente o terapéuticamente a un individuo antes de, 5 simultáneamente o en forma secuencial, con otros regímenes terapéuticos o agentes (por ejemplo los regímenes de droga múltiple) en una cantidad terapéuticamente efectiva, en particular con un interferón y/o un antagonista • TNF y/o un inhibidor COX. Los agentes activos que son administrados en forma simultánea con otros agentes terapéuticos pueden ser administrados en 10 la misma o en composiciones diferentes. La invención además se refiere a un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende mezclar una cantidad efectiva del inhibidor IL-18 y/o un interferón y /o un antagonista TNF y/o un inhibidor COX con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 15 Habiendo ahora descripto la invención, será más fácilmente entendida por referencia a los siguientes ejemplos que son proporcionados por modo de ilustración y no se intenta ser limitativo con la presente invención.

^??^ EJEMPLOS PARTE I: Ejemplos 1 a 8, referentes al uso de los inhibidores IL-18 en la lesión hepática.

EJEMPLO 1 :PRODUCCION DE ROTULO IL-ISBP-HIS El IL18BP humano recombinante que contiene el rótulo his (rótulo r-hIL-ISBP-His) fue producido en las células CHO. La producción de las proteínas recombinantes en las células eucarióticas es conocida por la persona experta en la técnica. Los métodos conocidos están disponibles para la construcción de los vectores apropiados, transportando ADN que codifica para IL-18BP y es adecuado para la transfección de las células eucarióticas para producir el recombinante IL-18BP. Para la expresión en las células, el ADN que codifica para IL-18BP (ver, por ejemplo (Novick y colaboradores, 1999) se corta y se inserta en los vectores de expresión adecuados para la transfección de las células. Alternativamente, tal ADN puede ser preparado por PCR con el sentido adecuado y los primers antisentido. Los constructos ADNc resultantes se insertan luego en los vectores de expresión eucariótica construidos por técnicas bien conocidas en el arte (Manaitis, 1982). La proteína recombinante fue purificada por sobre una pureza del 95 por ciento y se descubrió que era biológicamente activa in vitro e in vivo con una afinidad alta a su ligando.

EJEMPLO 2. EFECTO PROTECTOR DEL IL18BP CONTRA LA MUERTE INDUCIDA POR ENDOTOXINA EN EL RATÓN MODELO Un modelo de ratón se utilizó para probar si IL18BP, un inhibidor 5 de IL-18 protegería a los ratones contra una dosis alta de lipopolisacáridos (LPS). Los LPS provocan daño de hígado agudo, seguido por la rápida muerte de tos ratones ^F 4 mg/kg de recombinante, humano IL-18BP (rhlL18BPhis) conteniendo un rótulo his (resultando de la producción recombinante de la * 10 proteína) fue inyectado en forma intraperitoneal (i.p.) en los ratones C57BL/6, 1 hora más tarde, se inyectaron 60 mg/kg de LPS (dosis letal). La supervivencia de los ratones fue comparada con un grupo de animales que # recibió LPS solo (ningún IL18BP). Cinco de 7 ratones inyectados con rhIL-18BP-his sobrevivió la 15 inyección de LPS en contraste con los ratones de control, en los cuales todos tos animales murieron dentro de los 3 días. Las muestras de sangre se tomaron 5 horas luego de la inyección de LPS en la ausencia o presencia de la dosis creciente de rhlL- 18BP-his y analizado por ELISA para IFN-? (Fig. 1) circulante. 0.4 y 4 mg/kg 20 rhlL-18BP indujo una reducción de dos veces en el suero IFN^y. Esta inhibición se perdió a dosis más bajas de rhlL-18BP (0.004 y 0.4 mg/kg).

EJEMPLO 3: EL IL-18BPT1ENE UpfeftECTO PROTECTOR CONTRA LA LESIÓN HEPÁTICA EN LA ENFERMEDAD DE UN RATQN MODELO. Se usó un ratón como modelo de hepatitis fulminante para probar el efecto del IL18BP. Los ratones desarrollaron lesión del hígado aguda 5 cuando se sometieron a la administración secuencial del Proplonibacterium acnés (P.acnes) y del iipopolisacárido (LPS). Los ratones fueron inyectados con dosis incrementada de rhlL- 18BP-his (4; 0.4; 0.04; O mg/kg) en varias oportunidades (1 hora, 20 minutos, simultáneamente) antes de la inyección de LPS en el ratón sensibilizado 10 C57BL/6 con el P. acnés. Se le aplicó vía i.p. al mismo tiempo que el LPS. Cuando se aplicó i.p. (intraperitonealmente) rhlL-18BP-his, al mismo tiempo que el LPS ninguno de los ratones sobrevivió y los niveles de IFN-? circulante y el TNS-a no fueron afectados. Sorprendentemente, el rhlL-18BP (4 y 0.4 mg/kg) indujo un 70 por ciento de reducción de la aminotransferasa de Alanina 15 (un marcador de la lesión hepática), como lo muestra la Figura 2. Además de esto, fue monitoreada la supervivencia del ratón (Figura 3): Cuando rhIL-ISBP se le aplicó vía i.p. 20 minutos antes LPS, las dos dosis más altas de IL-18BP (4 y 0.4 mg/kg) retrasaron la muerte del ratón # por 10 horas en comparación con 5 el ratón de control que recibió NaCI en 20 lugar del IL-18BP. Los resultados de la medida de suero de los niveles de IFN-? se muestran en la Figura 4. (4 mg/kg) de rhlL18BP inhibieron el 90 por ciento de los niveles IFN-? circulante y el 80 por ciento de la aminotransferasa de áláMi Má?., ^-^.L^?^^^k^LL^&?^L^ Alanina circulante (no mostrada). Cuando se le aplicó rhlL-18BP 1 hora antes del LPS, las curvas de supervivencia y los niveles del circulante IFN-? fueron similares a los que se observaron cuando se le aplicó el rhlL-18BP-his 20 minutos antes del LPS, 5 pero no fueron afectados (no se muestra) a niveles de la aminotransferasa de Alanina circulante. Además de esto, el tejido hepático del ratón fue analizado mediante teñido con hematoxilina-eosina, tanto como por microscopio de túnel. Los hígados del ratón, en los cuales la hepatitis severa se indujo antes, 10 mostró una importante necrosis en comparación con el tejido del hígado normal. En contraste con ello, el tejido del hígado de los ratones tratados con IL-18BP mostraron significativamente menos focos de necrosis que los ratones no tratados. 15 EJEMPLO 4: LOS ANTICUERPOS ANTI-IL-18 PROTEGEN CONTRA LA ENDOTOXEMIA LETAL Para evaluar, si el bloqueo de IL-18 con los anticuerpos IL-18 p protegerían los ratones contra la dosis letal de los lipopolisacáridos 20 bacterianos, los ratones C57BL/6J fueron inyectados con un anticuerpo IL-18 antiratón de conejo neutralizante (policlonal) o suero de conejo (NDS) como un control. 30 minutos luego del tratamiento del anticuerpo, se inyectó una dosis letal de LPS derivada de E. coli (Fig. 5 A) o de S. typhimurium (Fig. 5B). ¿^É É^i Los experimentos involucraron 10 - 12 ratones/grupo, y fueron llevados a cabo dos veces en dos diferentes ocasiones. Como to muestra la Figura 5 A, el tratamiento del ratón con antisuero anti-IL-18 impidió la mortalidad inducida por 40 mg/kg LPS de E. coli. El 100 por ciento de los ratones sobrevivieron luego del tratamiento anti- IL-18 vs 10 por ciento supervivencia en los ratones tratados con suero de conejo normal (p< 0.005). La Figura 5 B muestra que los ratones tratados con anticuerpo fueron también protegidos contra los efectos letales de S. typhimurium (50 por ciento vs. 0 por ciento supervivencia; p< 0.05).

EJEMPLO 5: EL BLOQUEO DEL IL-18 YTNF-a PROTEGE LOS RATONES DE LA HEPATOXICIDAD INDUCIDA DE CONA-Y PEA Dos modelos experimentales de hepatotoxicidad fueron usados para evaluar el rol de IL-18 y TNF-a en una lesión hepática. La inyección de Concanavalin A (Con A) y de pseudomonas a eruginosa (PEA) en los ratones inducen a la lesión del hígado, y son modelos de la hepatitis mediada de célula T. Los ratones C57BL/6J fueron pretratados con un antisuero anti- IL-18 o un receptor TNF-a, TNFsRp55. Los niveles (ALT) de la aminotransferasa de suero de Alanina fue medida como indicadora de la lesión hepática (Figs. 6A y 6B).

Como se muestra en \& "tg. 6 A ambos el antisuero IL-18 y los receptores TNF- solubles redujeron significativamente los niveles ALT de suero inducido por ConA, en comparación con una inyección de control del vehículo solo (salina libre de pirógeno). La co-administración del receptor TNF soluble y el antisuero IL-18 llevaron a la inhibición completa de la lesión hepática inducida por el Con-A. Como lo muestra la Figura 6B, en los ratones inyectados con PEA, la neutralización de los inhibidores de TNF-a o de los anticuefos anti-l- 18 dieron como resultado el 93 por ciento y 83 por ciento de inhibición de tos niveles ALT del suero, respectivamente. El bloqueo combinado de ambos dio como resultado el 99 por ciento de protección.

EJEMPLO 6: LOS NIVELES DE PLASMA DE PROTEINA DE UNION IL-18 SON ELEVADAS EN LOS PACIENTES CON ENFERMEDAD HEPÁTICA CRÓNICA Los niveles de plasma IL-18BP fueron medidos en 133 pacientes con enfermedad del hígado crónico (CLD) de etiología variante y 31 controles saludables por un ELISA especifico, utilizando el anticuerpo monoclonal IL-18BP. Los niveles de plasma de IL-18BP fueron significativamente más altos en los pacientes CLD (12.91 + 0.89 mg/ml; promedio + Sem) en los sujetos saludables (4.96 + 0.43 mg/ml, p< 0.001 ). Los pacientes cirróticos tienen niveles significativamente más altos que los pacientes con CLD no cirrótico (19.23 + 1.28 mg/ml, n=7d, 6.49 + 0.51 mg/ml, n=66, p< 0,001 ). Los pacientes con etapa B de la clasificación Child-Pugh tuvieron niveles más altos de IL-18BP que aquellos con la etapa A (22.48 + 2.44 mg/ml 9.57 + 1.25 mg/ml, p< 0.001 ). Sin embargo, no hubo diferencia importante entre Chile B y C (22.48 + 2.44 mg/ml vs 20.62 + 4.75 mg/ml, p=0.7). Los niveles de plasma de I L-18 BP correlacionaron positivamente con GOT, con la proporción de la bilirrubina y los eritrocitos. En la correlación negativa se encontró con tiempo la protrombina. En conclusión, los resultados muestran que los niveles de plasma de IL-18BP son elevados en CLD y correlacionan con la severidad de la enfermedad independientemente de la etiología de la enfermedad. Aunque un antagonista endógeno de la proinflamatoria IL-18 aumentó la etiología de la enfermedad, el aumento de los niveles de IL-18 parecen no ser suficiente para contrarrestar los mediadores proinflamatorios abrumadores en CLD.

EJEMPLO 7: INHIBICIÓN DE LA HEPATITIS POR ALCOHOL MEDIANTE IL-18BP Cuatro grupos de ratas (5 por grupo) se alimentaron con etanol y una dieta que contenía aceite de maíz por infusión intragástrica durante 4 semanas. La dextrosa reemplazó isocalóricamente al etanol en el control de las ratas. Se inyectó a las ratas diariamente el IL-18BP de ratón (1 mg/kg), o salina. Ei análisis patológico es llevado a cabo en las secciones del hígado y se toman las medidas de las enzimas hepáticas en el suero, TNF-a, FAS ligando e INF-?. Se observa lesión necroinflamatoria y la expresión de las enzimas hepáticas, TNF-a, del ligando Fas y del INF-? en las ratas alimentadas con etanol que fueron inyectadas con salina. Las ratas inyectadas con IL-18BP de ratón fueron protegidas de ia lesión necroinflamatoria y los niveles de las enzimas hepáticas, TNF-a, del ligando Fas y del IFN-? se reducen en forma importante (>90 por ciento). 10 EJEMPLO 8: INHIBICIÓN DE LA HEPATITIS INDUCIDA - CONCANAVALIN A POR IL-18BP Los ratones Balb/c se inyectaron con 12 mg/kg Concanavalin A 15 (Con A) con o sin inyección de IL-18BP de ratón (1 mg/kg), 2 horas antes de la administración de Con A y luego diariamente. El daño del hígado es evaluado por la determinación de los niveles de suero de las enzimas hepáticas, del TNF-a, del ligando Fas y del IFN-?. La histopatologia hepática es comparada T^^ soto con los ratones tratados con Concanavalin A. 20 El pretratamiento con IL-18BP significativamente redujo tos niveles de suero de las enzimas del hígado y del TNF-a sin ninguna evidencia de inflamación en el examen histopatológico comparado con el ratón de control tratado con Con A.

PARTE II: Ejemplos 9 v 10 referentes al uso dé los Inhibidores en la artritis EJEMPLO 9: PRODUCCIÓN DEL ROTULO IL-18BP-HIS Para el experimento descripto en detalle en el Ejemplo 10 de más abajo, el IL-18BP recombinante humano conteniendo un rótulo his de 6 residuos (rótulo r-hlL-18BP-His) se produjo y se purificó en las células CHO como lo describe Kim y 20 colaboradores, 2000. La proteína recombinante fue purificada en más del 95 por ciento de pureza y se descubrió que era biológicamente activa in vitro e in vivo con una afinidad a su ligando. La producción de las proteínas recombinantes y otros sistemas eucarióticos, con o sin rótulos facilitando la purificación de las proteínas recombinantes se conoce por la persona experta en la técnica. Los métodos bien conocidos están disponibles para la construcción de vectores apropiados transportando ADN que codifica para IL-18BP y adecuado para la transfección de las células eucarióticas para producir IL-18BP recombinante. Para la expresión en las células, la codificación de ADN para IL-18BP (ver, por ejemplo Novick y colaboradores, 1999) se corta del vector de clonación y se inserta en los vectores de expresión adecuados para la transfección de las células. Alternativamente, tal ADN puede ser preparado por PCR con sentido adecuado y primers antisentido. Los constructos de ADNc resultante se insertan luego en los vectores de expresión eucarióticos apropiadamente construido por las técnicas conocidas en el arte (Maniatis y colaboradores, 1982).

EJEMPLO 10, BLOQUEO DE IL-18 ENDÓGENO EN UN MODELO DE RATÓN DE ARTRITIS Métodos Inducción de artritis inducida por colágeno (CÍA) La CÍA fue inducida en ratones DBA 1 machos (8-12 semanas de edad) por inmunización con colágeno (Cll) bovino tipo II nativo como se describiera previamente (Plater-Zyaberk y colaboradores, 1995). Desde el día post-inmunización Cll, los ratones fueron examinados diariamente para el comienzo de la enfermedad. Tratamiento con rhlL-18BP-6his El tratamiento de los ratones DBA/1 inmunizados con Ctl fue comenzado en la primer aparición de la señal clínica de la enfermedad. El recombinante, humano IL-18BP conteniendo un rótulo de 6 histidinas (rh-IL- 18Bpa 6 his) se usó para neutralizar IL18 endógeno en los ratones tratados con colágeno. rh-IL-18BP-6his se inyectó diariamente durante 7 días a 5 concentraciones diferentes, 10, 3, 1 , 0.5, 0.25 mg/kg/inyección intraperitoneal (i.p.). Los ratones de control de placebo recibieron el vehículo solamente (0.9 por ciento NaCl). Confirmación del desarrollo de la enfermedad Evaluación clínica (puntaje clínico) Desde la primer aparición de los síntomas clínicos, los ratones fueron examinados cada día mediante una investigación ciega del tratamiento. Cada miembro fue evaluado por la importancia de la enfermedad (los puntajes 0-3.5, el puntaje max = 14/ratones). La progresión del edema (inflamación) fue medida en las primeras patas que mostraron las señales de la enfermedad utilizando calibradores de precisión (Proctest 2TR, Kroeplin Langenmesstechnik). La progresión de la enfermedad fue confirmada diariamente durante 8 días después del comienzo en cuyo momento todos los ratones fueron sacrificados y las patas recolectadas para su examen histopatológico. Confirmación histológica de las erosiones del cartílago y la inflamación microscópica. Cuando terminaron los experimentos, es decir al día 8 posterior al comienzo, los ratones fueron muertos y la pata que primero desarrolló la señal de la enfermedad fue analizada. Las articulaciones se fijaron, descalcificaron y embebieron en parafina. Las secciones estándar (5 a 7 µm) de las articulaciones fueron realizadas y teñidas con hematoxilina/eosin/Safranin O. Se tomó el puntaje de cada articulación por medio de dos investigadores que no conocían el protocolo de tratamiento (ninguna destrucción de cartílago o hueso = 0, erosiones de cartílago localizado = 1-2; más erosiones extendidas = 3; destrucción general del cartílago y presencia de erosiones óseas = 4). Los puntajes finales de cada ratón fueron el punto medio del resultado en todas las articulaciones medidas. La inflamación microsopical o sinovitis fue medida desde 0 a 4, como sigue: ninguna inflamación = 0; engrosamiento pequeño de la capa de revestimiento = y/o y algunas células infiltradas en la capa subcobertora = 1-2; 5 engrosamiento de la capa de revestimiento y/más influjo pronunciado de tes células de la capa de sub-revestimiento = 3; presencia de células en el espacio sinovial y sinovium altamente infiltrado con muchas células inflamatorias = 4. Determinación de los anticuerpos del anti-colágeno. 10 Los anticuerpos contra el colágeno tipo II bovino fueron examinados utilizando una enzima-ensayo inmuno-absorbente unida (ELISA). Los títulos de lgG1 e lgG2a fueron medidos. Brevemente, las placas fueron revestidas con 10u.g de colágeno bovino y luego los sitios de unión no específicos fueron bloqueados con OJ M de etanolamina (Sigma). La serie de 15 disoluciones 1 :2 del suero fueron agregados seguido por la incubación con peroxidasa anti-ratón de cabra isotipo específica (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, Estados Unidos de Norteamérica ) y substrato (5-ácido aminosalicílico, Sigma). Las placas fueron rojas a 492 nm. Los títulos fueron expresados como medio +. Disolución SD que da el valor medio ^F 20 máximo. Ensayos IL-6 Los niveles de IL-6 fueron determinados por ELISA comercial (sistemas R&D, Minneapolis, MN, Estados Unidos de Norteamérica). La bioactividad IL-6 fue determinada por et ensayo proliferativo utilizando tas células B9, Brevemente, 5 x 103 células B9 en 200 µl 5 por ciento radio FCS- RPMI 1640 por recipiente fueron plaqueados en una placa de microtitulación de fondo redondo e incubadas durante 3 días utilizando IL-6 humano 5 recombinante (sistemas R&D, Minneapolis, MN, Estados Unidos de Nortemérica) como estándar. Al finalizar la incubación, 0.5 µCi de 3[H]tidimina (NEN-Dupont, Bostón, MA, Estados Unidos de Norteamérica) se agregó por fuente. Tres horas más tarde, ias células fueron cultivadas y se determinó la incorporación de timidina. El limite de detección para el bioensayo IL-6 de fue 10 1 pg/ml.

Análisis estadístico F Se confirmó la importancia de las diferencias por el test Mann Whitney utilizando el programa de análisis estadístico SigmaStat y el 15 programa GraphPad Prism.

Resultados Un ratón modelo experimental, (CÍA (artritis inducida por ^ colágeno) se utilizó para confirmar la efectividad de IL-18BP como un agente 20 para el tratamiento de la artritis. La administración del colágeno y el adyuvante de Freund incompleto en los ratones DBA/1 induce el desarrollo de una artritis inflamatoria erosiva y representa una oportunidad ideal para explorar el potencial terapéutico de IL-18BP. En este punto, el IL-18 endógeno fue neutralizado utilizando IL-188P y el efecto en varios parámetros patogénicos fue evaluado. Un estudio de dosis relacionado se llevó a cabo. Tres grupos de ratones DBA/1 artríticos inducidos por colágeno se trataron en forma 5 terapéutica (es decir luego del comienzo de la enfermedad) con 5 dosis de IL- 18BP i.p. (intraperitoneal). IL-18BP en concentraciones de 10, 3, 1 , 0,5 o 0,25 mg/kg fue administrado a la primer señal clínica de la enfermedad. La ^P inyección de la salina fisiológica (cloruro de sodio, NaCI) se usó como un control. Además de ello, 10 000 lu de ¡nterferón ß (IFN-ß) se administró i.p. 10 para confirmar el efecto de IFN en este modelo experimental de la artritis. El efecto en la importancia de la enfermedad fue monitoreado por el puntaje visual diario de cada pata individual como se describiera anteriormente. Los • ratones fueron sacrificados en el día 8 posterior al comienzo. 15 Se midieron los siguientes valores: • Puntajes clínicos visuales (0-3.5 por pata )(Figura 7A y B) • Hinchazón/edema de la articulación (en mm, medido con calibradores)de la primer pata enferma, siempre que no fuera pata trasera F (Figura 8). 20 • Número de patas reclutadas en la enfermedad (figura 9) • Puntajes de erosión de la primer pata enferma (0-4 destrucción del cartílago. Figura 10). • Análisis histopatológico de la pata que primero desarrolló la artritis (Figuras 11 A, 11 B y 1 ffe). • Niveles de anticuerpos tipo II anti colágeno (Figura 12). • Niveles de lL-6 (Figura 13). 5 Importancia clínica de la enfermedad. Como se muestra en las Figuras 7 A y B, la importancia clínica de la enfermedad fue disminuida en forma significativa en los grupos tratados • con Img/lml (PO.01 ) y 0.5 mg/ml (0.01 <P<0.05) de rhlL-18BP. Los ratones recibieron la dosis baja de rhlL-18BP (0.25 mg/kg) o la dosis alta de 10 mg/kg 10 tuvo un puntaje clínico similar al grupo placebo. La dosis de 1 mg/kg de IL- 18BP aproximadamente, fue efectiva como Interferón ß (designado IFNb en la Figura 7A). • nflamación de la articulación e hinchazón de la pata (edema). 15 La inflamación macroscópica (hinchazón) fue estudiada midiendo el edema de la pata desde el día 1 luego del comienzo de la enfermedad hasta el día 8, la finalización del experimento. Los resultados se muestran en las Figuras 8 A y B. La dosis efectiva de IL-18BP fueron 1 , 3 y 10 mg/kg. La administración de la dosis más baja no resultó de efecto beneficioso en la 20 hinchazón de las patas. Como se muestra en las Figuras 8 A y 8 B, el Interferón ß (IFNb) en la concentración de 10 000 lu mostró un efecto beneficioso en la hinchazón de la pata. La sinovitis microscópica fue examinada al finalizar el experimento en las secciones histopatológícas y fue expresado en puntajes (puntaje sinovitis). Los resultados de la inflamación (hinchazón) y el puntaje de sinovitis se resumen en el Cuadro 1 Mientras que el tratamiento con rhlL- 18BP en dosajes de 1 y 3 mg/kg resultaron en una tendencia hacia la reducción de la hinchazón, el tratamiento con cualquier dopaje de IL-18BP tuvo solamente un efecto limitado en la sinovitis inflamatoria (Cuadro 1 ).

CUADRO 1 EFECTO DEL TRATAMIENTO IL-18BP EN LA INFLAMACIÓN DE LA ARTICULACIÓN La Figura 9 muestra que el número de patas afectadas por la enfermedad disminuyó luego de la administración de IL 18BP. En particular, la inyección terapéutica de IL18BP "at dococ" de 1 y 0.5 mg/kg redujo el número de patas reclutadas en la enfermedad, demostrando que el bloqueo de IL 18 in vivo detiene la diseminación de la artritis a las articulaciones adicionales. El tratamiento con 1 y 0.5 mg/kg de IL-18BP aún parece capaz de devolver alguna de las articulaciones artríticas a ta normalidad. 5 Protección de la destrucción de la articulación. El tratamiento de los ratones con rhlL-18BP resultó en la • protección de las articulaciones de la destrucción (Figura 10). Un sistema de puntaje semi cuantitativo demostró que la erosión ósea mostró un efecto 10 protector relacionado con ta dosis que fue importante a 10 y 3 mg/kg (P<0.05, Figura 10). Los ratones que recibieron 1 mg/kg de rhIL-ISBP presentaron *. menos erosión que los ratones que recibieron el vehículo solamente. Ninguna # protección se observó a dosis de 0.5 mg/kg y 0.25 mg/kg. En forma interesante, el efecto en la protección de la articulación, a dosis de 3 y 10 15 mg/kg IL-18BP fue comparable a, o aún más pronunciado que el efecto beneficioso de 10.000 IU de Inteferon ß (IFM-ß). Las Figuras 11 A, 11 B y 11C muestran la histología de una articulación (A) saludable y una enferma (B) en comparación a una ^ articulación derivada de un animal tratado con IL-18BP (C). Las secciones 20 fueron tomadas al finalizar el experimento de aquellas patas que primero desarrollaron la artritis. La articulación de un ratón artrítico mostró artritis destructiva importante con drástica reducción del cartílago y de las erosiones y numerosas células infiltradas en el sinovtum inflamado. En la articulación de un ratón tratado con rhlL-18BP, el cartílago se mostró casi normal a pesar de la presencia de las células inflamatorias en el espacio sinovial. No hubo solamente una cantidad mayor de cartílago, pero el cartílago no tuvo también 5 una apariencia más suave.

El tratamiento Anti-IL-18 modula los niveles de anticuerpos de ^^B colágeno anti-tipo II. Los ratones CÍA tienen niveles elevados de anticuerpos de 10 colágeno anti-tipo II de lgG1 e lgG2a en la circulación. Los anticuerpos del isotipo lgG1 son asociados a las enfermedades mediadas TH2, mientras los anticuerpos del Isotipo lgG2a y lgG2b son asociados a las enfermedades F mediadas TH1. La artritis es usualmente clasificada como una enfermedad mediada TH1. 15 Los isotipos de anticuerpo lgG1 e lgG2a (Cll) colágeno anti-tipo II fueron determinados en el suero de animales que fueron tratados con IL- 18BP (Fig 12). Los niveles de anti-CII de los lgG1 e lgG2a de isotipos IgG no fueron significativamente modificado por el tratamiento IL-18BP, al día 4 u 8 # (D4, D8) de la enfermedad clínica. Sin embargo, un decremento de 2.6 y 3.4 20 veces en las proporciones en colágeno específico lgG1/lgG2a se observó luego de 8 días de tratamiento con rhlL-18BP, a 1 y 3 mg/kg, respectivamente. La Figura 12 muestra el experimento en el cual 3 mg/kg se usaron. Esencialmente los mismos resultados se obtuvieron utilizando una cantidad de lililí lili 11 f *• *•*-- - -tfto>* ^ «£ +??*tíd* *» »*M^J?Ékk*.í~ A*?¿.1?ÁA. 1 mg/kg de IL-18BP. La proporción lgG1/lgG2a reducida de anticuerpos anti- Cll indican una concentración disminuida de anticuerpos colágeno anti tipo II de isotipo lgG2a y una concentración elevada de anticuerpos de colágeno anti-tipo II de isotipo lgG1, sugiriendo que hay un giro hacia la enfermedad 5 mediada TH2 en este modelo de artritis.

Reducción de los niveles IL-6 luego de la neutralización de IL-18 • Para obtener una visión de los efectos de los bloqueos de I L-18, se midió IL-6 en el suero de los animales tratados con IL-18BP. La Figura 13 10 muestra que los niveles de IL-6 bioactivos fueron significativamente reducido en los animales que habían recibido tratamiento de IL-18BP en todas las dosis medidas, es decir, a 1 , 3, y 10 mg/kg tanto como con Interferón-ßµ, (IFNb).

• Los niveles inmunoactivos de IL-6 medidos en el suero de los animales tratados con 3 mg/kg rhlL-18BP fue reducido significativamente (P<0.0023) 15 como comparado con los animales tratados con salina. Los niveles de suero IL-6 de los animales enfermos tratados con 1 , 3 o 10 mg de IL-18BP o 10 000 lu de IFN-ß fueron similares al suero del ratón normal (NMS) derivado de los animales saludables, es decir de aquellos animales que no tenían enfermedad # inflamatoria. 20 Estos descubrimientos demuestran los niveles IL-6 de los controles IL-18 durante el comienzo de la enfermedad. Debido a que IL-6 es un marcador de la inflamación, estos descubrimientos muestran que el tratamiento de los ratones enfermos con IL-18BP reduce la inflamación en el animal. De los experimentos descriptos anteriormente, se pueden sacar las siguientes conclusiones: • La administración de las enfermedades IL-18BP disminuye la importancia clínica de la artritis • El IL-18BP inhibe la progresión posterior o la diseminación de la enfermedad • La administración de IL-18BP disminuye el edema • La administración de IL-18BP disminuye la destrucción del cartílago • Los niveles de IL-6 de suero son disminuidos y las proporciones anti-CII de lgG1/lgG2a disminuyeron luego de la terapia de IL- 18BP. Los datos presentados anteriormente indican que la neutralización de la bioactividad IL-18 luego del comienzo de la enfermedad representa una terapia anti reumática modificadora de la enfermedad. Los resultados claramente demuestran que el bloqueo IL 18 reduce la progresión clínica de ta artritis y en forma más importante para la progresión del cartílago y la destrucción ósea. El IL 18 bloqueado por IL-18BP, los anticuerpos anti-IL- 18 o por cualquier otro agente de bloqueo I L-18, por lo tanto representan una terapia anti reumática modificadora nueva de la enfermedad. La descripción anterior de las realizaciones especificas revela la naturaleza general de la invención para que otros puedan, por la aplicación corriente, rápidamente modificar y/o adaptar para varias aplicaciones tales realizaciones especificas sin alejarse del concepto genérico, y, por lo tanto, tales adaptaciones y modificaciones debería y se intenta que estén comprendidas en el significado y el alcance de los equivalentes de las 5 realizaciones reveladas. Se debe entender que la fraseología o la terminología empleada en la presente es para la finalidad de la descripción y no una limitación. # Parte III. Ejemplos 11 y 12 referentes a la Enfermedad Inflamatoria 10 Intestinal EJEMPLO 11 : LA EXPRESIÓN IL-18BP POR LAS CÉLULAS • ENDOTELIALES Y LOS MACROFAGOS DURANTE LA ENFERMEDAD ACTIVA DE CROHN 15 Colección de los especimenes Las biopsias de mucosa intestinal fueron aisladas de los especimenes de resección quirúrgica de los pacientes con CD o UC. Catorce ffl pacientes con CD, (tres machos y once hembras) con una edad media de 37.8 20 años (varían 20-78 años) y una duración de la enfermedad de 8.3 años (varían 1-21 años) fueron incluidos. En los ocho pacientes, la enfermedad fue ubicada en el ilio y en seis en el colon. Doce pacientes continuaron las drogas ¡nmunosupresoras. El diagnóstico de CD activos fue realizado por el examen ""' *' faisto-patológico y se basó en los criterios siguientes; presencia de ulceraciones, número incrementado de las células inflamatorias y la inflamación transmurai Los siete pacientes con CD activos y siete pacientes con enfermedad no activa fueron identificados Ninguna diferencia importante 5 en la edad, la localización de 1 enfermedad, sexo, medicación y duración de la enfermedad se observaron entre los pacientes CD no activos y los activos. La edad media de los pacientes 5 UC (tres machos y dos hembras) fue de 37 6 # años ( varia de 30 a 44 años). En todos los pacientes, la enfermedad fue localizada en el colon y todos continuaron con la terapia inmunosupresora. La 10 duración de la enfermedad promedio fue de 4 años (variación 1-9 años). Las muestras de control se obtuvieron de 5 pacientes soportando una resección para los desórdenes de no-IBD relacionados (tres machos y dos hembras). La F edad media de este grupo fue de 55.2 años (variación 24-76). En todos los pacientes, la enfermedad fue ubicada en el colon. 15 RT-PCR semicuantitativo para IL-18 humano e IL-18BP El .ANR total fue extraído de las biopsias intestinales congeladas de los pacientes con Cd, con UC o del paciente de control. La extracción de mm ANR se llevó a cabo utilizando Trizol (Gibco) de acuerdo con las instrucciones 20 del fabricante. Las muestras obtenidas fueron cuantificadas por la medida de la absorbancia a 260 nm. La integridad de ANR fue afirmada por electroforesis en los geis de agarosa al 1 por ciento. El ADNc fue sintetizado de 1 µg del ANR total utilizando sistema de transcripción reversa Promega de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las reacciones PCR fueron llevadas a cabo en un volumen total de 50 µl en la presencia de 1U de Polimerasa ampliTaq ADN (Perkin Elmer, Roche, Estados Unidos de Norteamérica), 2.5 mM dNTPs (Amersham, Estados Unidos de Norteamérica) y 50 pmoles de primers PCR inverso y delantero. Las reacciones fueron incubadas en PTC-200 Pettier Effect Thermal Cycler (Ciclador de Efecto Térmico Peltier) (MJ Research, Estados Unidos de Norteamérica) bajo las siguientes condiciones: desnaturalización 1 min. a 94° C, endureciendo por calor durante 1 minuto a 55° C y con extensión durante 1 minuto a 72° C. El número óptimo de ciclos para IL-18BP, I L-18 y actina-ß antes de la saturación de las bandas fue determinado (31 , 28 y 25 respectivamente). Los primers PCR fueron diseñados basados en 'las secuencias publicadas (AF110799, D49950, X00351 ) como a continuación: IL-18, reversa 5'GCGTCACTACACTCAGCTAA-3'; delantera 5'- GCCTGAGAGGTATGGCTGTAA-3'; IL-18, delantera 5'- ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3'; inverso; 5'-GCACGAAGATAGGAAGTCTG- 3', actina-ß, invertida 5'-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3'; delantera 5'- GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3'. Para excluir la amplificación del ADN genómico contaminando las muestras, las reacciones PCR fueron realizadas en la ausencia del templado ADNc. Los productos PCR (10 µl) fueron analizados en los geles de azarosa al 1 por ciento y se realizó electroforesis de IX de amortiguador TAE. La medida de ios productos PCR fue verificada por comparación con lader 1 Kb (Gibco) seguido por el teñido de los geis. La cuantificación relativa de las bandas teñidas de etidium-bromuro fue realizado bajo luz UV utilizando el Kodak Digital Sciences software analítico, y fue informado como proporción del gen objetivo (NL-18BP, hlL-18) al gen de alojamiento (hß-actina). 5 Generación de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra hlL- 18BP • Los ratones BALB/c fueron inyectados en forma subcutánea en los cuatro miembros tanto como intranucalmente con 50 µg de isoformo un 10 rhlL-18BP-6his (purificado de las células ováricas del hámster chino, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel) en PBS con adyuvante (MPL + TDM emulsión, RIBI Immunochem Research, Inc.) en los días 0, 7 y 28.

# Cuatro días luego de la tercera inmunización, se obtuvieron y digirieron nodulos de linfa con 2.4 mg/ml ¿ de colagenasa (colagenasa IV, Washington 15 Biochemical Corp) y OJ por ciento Dnase (Sigma). Las células aisladas fueron luego fusionadas con Sp2/0 células mieloma utilizando PEG 1000 (FLUKA). Las células fueron resuspendidas en DMEM-F12, 10 por ciento FCs (Gibco) en la presencia de HAT (hipoxantina, aminoperina, timidina) y distribuida en fuentes de 96 placas a una concentración de 5 x 10"4 células/mi. Las muestras 20 del hibridoma de cultivo supernaciente fueron filtrados para la presencia de los anticuerpos reactivos en un ensayo de pantalla directo. Para esto, las placas ELISA fueron revestidas con anticuerpos de anti ratón de cabra F (ab')2 (Jackson Inmuno Research, Milán analítica) Suiza), hibridomas de los supernacientes de cultivo sé a regaron seguidamente por rhlL-18BP 6 His biotinilado (purificado de las células COS como se describiera (Novick y colaboradores, 1999), con o sin rhlL-18 (purificado de recombinante E. coli, Serono Pharmaceutical Research Institute, Genova), y finalmente peroxidasa 5 streptaavidin rábano picante (HRP) (jackson Immuno Research Milán Analytica, Suiza) desarrollado utilizando O-fenilendiamina (OPD)(Sigma). Los anticuerpos no neutralizantes fueron seleccionados y subclonados. En este # estudio se usó 95-H20, un anticuerpo monoclonal tgG1 de ratón. Estudios inmunohistoquímicos para la localización de L-18BP- 10 células positivas Los especimenes fueron congelados destellados y almacenados a -80°C. Las criosecciones seriales (10 µn) se obtuvieron, montadas en placas • de vidrio Superfrost/Plus poli-L-lisina revestida (Polylabo, Plan-tes-. Guates, Suiza) y fijadas en acetona enfriada con hielo. La iocalización de la proteína 15 IL-18BP humana fue analizada por inmunohistoquimica utilizando Mab 95- H20. Luego de una rehidratación breve en PBS, las secciones fueron pre- incubadas durante 30 minutos en PBS suplementado con 2 por ciento suero de Ternera Fetal (FCS) (Cansera, Ontario, Canadá), 1 por ciento suero '^ humano (suero AB+, Transf ussion Center, Annemase, Francia) y 0.5 por ciento 20 albúmina de Suero Bovino (BSA) (Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos de Norteamérica). La actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada colocando tes placas en una solución de PBS, 2 por ciento de FCS, 1 por ciento de suero humano, 0.5 por ciento BSA y 1 por ciento de peróxido de hidrógeno (H202) (Fluka, Suiza) durante 1 hora. Siguiendo un enjuague en PBS, las secciones se incubaron toda la noche con supernaciente de cultivo no diluido de Mab 95-H20. Siguiendo otro lavado en PBS , las secciones fueron incubadas con anticuerpo de ratón de cabra biotinilado (Jackson 5 Inmuno Research, Milán Analytica, Suiza)(5 ?mg/ml) en PBS conteniendo 0.5 por ciento BSA durante Ih. La sensibilidad del manchado fue incrementada por la incubación con un complejo HRP avidinDH/biotinilado (Equipo Vectastain Élite ABC, Vector Laboratories, CA, ESTADOS UNIDOS DE NORTEAMÉRICA) durante 30 min. Se lavaron los placas con PBS y se 10 desarrollaron utilizando una solución de 30 por ciento H20 , 3,3-amino-9-etil carbazola (AEC) (Sigma), N, N-dimetilformamida (Merck) en amortiguador de acetato, pH 5. Siguiendo el contra manchado con hematoxilina (Sigma), se revistieron las secciones con glicerol y se aplicaron cubiertas deslizantes . Un anticuerpo lgG1 de ratón (sistema R y D) se usó como ísotipo de control. 15 Para identificar la Idealización celular del IL-18BP humano, un estudio histoquimico de dos colores se llevó a cabo en las secciones intestinal mucosales. Luego de 10 min. de rehidratación en PBS, las secciones fueron preincubadas durante 30 minutos en PBS suplementado con 2 por ciento (- FCS, 1 por ciento de suero humano y 0.5 por ciento de BSA. Para la co- 20 localización con las células endoteliales, las secciones se incubaron toda la moche con Mab 95-H20 (20µg/ml) biotilinado, mezclado con CD31 (1 :50) antihumano (Pharmingen, CA, Estados Unidos de Norteamérica) de ratón conjugado con FIT. Para la co- localización con los macrófagos, las secciones X ^ fueron incubadas toda la noche con Mab 95-H20 (20µg/ml)biotililado y mezclado con CD68 (1 :25) (Dako, Den1f?ark)anti-humano conjugado con FITC. Siguiendo un lavado en PBS, se agregó durante 1 hora el streptavidin Texas- Red (Southern Biotechnology Associates, AL, Estados Unidos de 5 Norteamérica). Las placas fueron lavados otra vez y las secciones se revistieron con moviol y se aplicaron las cubiertas deslizantes. El anticuerpo lgG1 de ratón biotilinado (Pharmingen) se usó seguido por Texas-Red como un isotipo de control. Cultivo de la Célula 10 Las células endoteliales de vena umbilical humana(HUVECs) (Clonetics Corp., San Diego, CA) se cultivaron utilizando Endothelial Cell Growth Médium (EGM) (Medio de Crecimiento de Célula Endotelíal) • suplementado con factor (hEGF) (10 mg/ml) de crecimiento epidérmico recombinante humano, hidrocortisona (1 ¿ mg/ml), gentamicina y amfotericin 15 B (50 ¿?mg/ml), extracto de cerebro bovino (BBE) (3 mg/ml) y 2 por ciento Suero fetal bovino (FBS) (Clonetics Corp., San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los platillos del cultivo del tejido se pre-revistieron con fibronectín humano(10 ?g/cm2) (Boehringer, Mannheim). Se incubaron las ^ células en un incubador al 5 por ciento C02 y los experimentos se llevaron a 20 cabo utilizando HUVECs en pasaje 3. HUVECs fueron tratados con IL-1 ß (10 ng/ml) humano, TNFa (10 ng/ml) e IFN? (20 ng/ml) (R y D System, Germany) durante 24h. al finalizar el periodo de cultivo, se colectaron las células, se aisló el ANR y se sometió a RT-PCR para el análisis del transcripto ANRm de IL- '^-^ '^ ^Mlü rtÉ»«aÉt.^fa.tt 18BP e IL-18 mRNA. Los superpacientes se colectaron y analizaron para la expresión de la proteína de IL-18BP y IL-18 por ELISA. La línea de célula THP-1 de monocito humana se mantuvo en cultivo de suspensión en medio RPMI suplementado con 10 por ciento de FCS 5 inactivado por calor, L-glutamina (2 mM), estreptomicina-penicilina (10 U/ml) (Gibco BRL, Life Technologies) y ß-mercaptoetanol (50 ?M) (Fluka). Se incubaron en un incubador humidificado al 5 por ciento C02 y se pasaron a 1 :10 cada cinco días. Tres días antes de la experimentación, las células de monocito humanas se diferenciaron a una densidad de células/mi 0.4xl06 con 10 Vitamina D3 (80 nM) (Biomol Research Laboratorios, Estados Unidos de Norteamérica) y se dejaron alli para adherencia Una vez diferenciadas, se agregó LPS (100 ng/ml) (Calbiochem), IL-1ß humano (10 ng/ml), TNFa (10 # ng/ml) e IFN? (20 ng/ml) a los cultivos de las células. A las 48 horas se colectaron los supemacientes y se analizaron para la expresión de la proteína 15 IL-18BP y lL-18 por ELISA.

Medida de ta producción IL-18BP e IL-18 humana Se evaluó la presencia de IL-18BP por ELISA en los • supernacientes libres de célula de HUVECs, no estimulado y estimulados 20 durante 24 horas con un cóktel de citocinas (¡L-1 ß, TNFa, IFN?), tanto como la línea de célula THP-1 , no-estimulada y estimulada durante 48 horas (LPS, IL- 1ß, TNFa, IFN?). Para estos, se revistieron las placas durante toda la noche con capturador Mab (clon 657.27 a 0.5 µg / 10071 / fuente, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel) dirigido contra rhlL-18BP (isoformo a). El rhlL- 18BP soluble fue luego detectado utilizando un anticuerpo cultivado policlonal de conejo (diluido con 1/10.000) contra rhlL-18BP-6his (purificado de las células de ovario de hámster chino, Interpharm Laboratorios, Nes Ziona, 5 Israel), seguido por la incubación con IgG anti-conejo de cabra purificada de afinidad conjugada de peroxidasa (diluida a 1/20.000) (Jackson Immuno Research, Milán analytica. Suiza). El Mab capturador tanto como el anticuerpo • policlonal del conejo se probaron por medio del Western Blot para confirmar la especificidad de IL-18BP El rhlL-18BP-6his recombinante se utilizó como 10 estándar. La sensibilidad de ELISA fue 100 pg/ml. En paralelo, los niveles de IL-18 se cuantificaron utilizando un Equipo ELISA de IL-18 humano (MBL, Immunotech). La sensibilidad del ELISA fue 12.5 pg/ml. # Expresión de hlL-18BPa-His6 en las células CHO 15 El IL-18BP (hlL-18BPa HisG-rótulo)humano recombinante se purificó de las células de ovario de hámster Chino (Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel).

• Re ' sultados 20 Expresión de los transcriptos de ANRm de IL-18BP en las biopsias intestinales Se llevó a cabo el análisis para la expresión de ANRm de IL- 18BP por RT-PCR en los tejidos homogenatos de los especimenes quirúrgicos A.^^?...... .-^,^.^-^^¿ iia i¿i Mi ^ del colon de los pacientes con CD activo, CD no activo o UC y para los tejidos intestinales no inflamados (Figs. 14A, 14B y 14C). El IL-18BP y los transcriptos de actina fueron detectados en todos los homogenatos intestinales probados. En forma similar, los transcriptos para IL-18 se 5 descubrieron en todos los tejidos de homogenatos tanto de los controles de CD, UC o no IBD (Fig. 14 A). La proporción de IL-18BP o IL-18 para controlar los niveles de ANRm de actina demostraron un incremento estadísticamente importante (como se describe más abajo) en la cantidad .de los transcriptos para ambas biopsias IL-18BP e IL-18 obtenidas de los pacientes con CD 10 activo en comparación con las biopsias de los pacientes con los controles de CD, UC e IBD no activo (Fig. 14 B y C). Estos datos muestran que IL-18BP es regulado hacia arriba en el tejido mucosal durante el CD activo y proporciona # la primer evidencia que el nivel de la expresión de IL-18BP claramente diferencia el CD activo de los controles de CD no activo, UC y no IBD. 15 Análisis estadístico en la expresión de los transcriptos de ANRm de IL-18BP en las biopsias intestinales Un análisis de la variante fue llevado a cabo, combinando todos ? tos datos disponibles juntos. La salida claramente indicó un perfil estadístico 20 respecto de. los resultados para uno de los pacientes del grupo Activo CD (una proporción OD muy alta para IL 18, principalmente 16252, y una proporción OD baja para IL 18BP, principalmente 1058.). Esta pareja única y muy atípica de medidas no permitió la validación del modelo ANOVA(valor-p iii ni t ?i?lrr'-',fclr?-a**~t- *TÉ M de la prueba de Shapiro-Wilks para la normalidad de los residuos < 0.0001). De esta manera, se decidió ignorar esta pareja de medidas en el análisis estadístico. El modelo ANOVA usado tomó en cuenta el Grupo de factor (Control, CD activo, CD inactivo, y UC), proteína (I L-18 o IL-18BP), y número de pacientes (23 pacientes). Hay una diferencia importante entre el grupo (valor-p < 0.0001 ). Es también interesante hacer notar que la diferencia de la proporción OD entre IL-18 y IL-18BP no es importante (valor-p =0.369). Además, la correlación entre la expresión de I L-18 e IL-18BP también se llevó a cabo. El coeficiente de correlación entre IL-18 y IL-18BP es igual a 0.67, lo cual sugiere una unión fuerte entre la proporción OD medida para IL-18 e IL 18-BP. Siguiendo estos resultados respecto del efecto del Grupo, el método de Scheffé se utilizó para comparar los grupos diferentes. Se puede concluir que la proporción de D para CD activo es significativamente mayor que el Control (+3280), el UC (+2590), y especialmente el CD lnactivo(+4580) ambos para la expresión de IL-18BP e I L-18.

Localización inmunohistoquímica de IL-18BP en los tejidos intestinales. Para afirmar te expresión celular de IL-18BP in situ, se llevó a cabo la inmunohistoquimica utilizando anticuerpos monoclonales específicos anti-hlL-18BP en las criosecciones preparadas de los tejidos intestinales obtenidos de los controles a los pacientes con CD adivo y de no-IBD. Las células positivas IL-18BP se detectaron en la lámina propia, la submucosa y con la capa del músculo (que no se muestra) Las células mononucleares manchadas positivas presentes con la lámina propia y la submucosa poseyeron abundante citoplasma núcleo 5 retiforme vesicular y fueron morfológicamente consistentes con tos macrófagos de tejido. En la capa del músculo, las células manchadas positivamente tenían citoplasma abundante, con algún lumen abierto algunas • veces en el medio, sugiriendo manchado positivo de microvasos, y eran morfológicamente consistentes con las células endoteliales. Los vasos 10 grandes fueron también específicamente manchados por los anticuerpos monoclonales anti-hIL-ISBP. El incremento importante en las células manchadas positivas observado en los especimenes obtenido de los pacientes con CD activo cuando se comparó con los especimenes obtenidos de los controles no-IBD correlacionó con la expresión de IL-18BP observada 15 por el análisis RT-PCR. Las secciones adyacentes fueron incubadas con el control de isotipo de ratón correspondiente.

Identificación de las células gue producen IL-18BP presentes en las biopsias mucosales 20 Las células positivas IL-18BP presentes en los tejidos intestinales inflamados fueron identificadas utilizando marcadores específicos de macrófagos (anti-CD68), y células entoteliales (anti-CD31) (no se muestra). Las células CD68 positivas (en verde) y las células positivas IL-18BP (en rojo) se detectaron con lámina propia y submucosa de tejidos intestinales del CD activo (no se muestra). Las células CD31 posltivas(en verde) y las células positivas IL-18BP (en rojo)se detectaron en la submucosa. Para confirmar que las células macrófagas y endoteiiales eran también positivas para IL-18BP, ambos colores, el verde del anti-CD68 o anti-CD31 y el rojo del anti-IL-18BP se analizaron juntos para demostrar que todas las células que unían anticuerpos anti-IL-18BP eran CD68 positiva o CD31 positiva (color naranja- amarillo). La inmunoetiquetación doble demostró que los macrófagos y las células endoteliales eran la fuente principal del manchado IL-18BP dentro de los tejidos inflamados obtenido de los pacientes con CD Expresión de ANRm de IL-18BP v proteína por las células endoteliales. Para investigar la capacidad de las células endoteliales humanas para producir IL-18BP tanto como para confirmar el resultado descubierto por inmunomanchado y RT-PCR en las biopsias totales, los experimentos RTPCR posteriores se llevaron a cabo en células endoteliales de vena humbilícal humana (HUVECs) (Fig. 15 A). Se trataron las células endoteliales con un cocktail de citocinas (hlL-1 ß, hTNFa, hlFN?) y se colectaron luego de 24 horas para la extracción de ANR y análisis de PCR. La proporción de IL-18BP para controlar los niveles de ANRm de actina demostraron un incremento en la cantidad de los transcriptos de IL-18BP en las células tratadas comparado con las células no estimuladas luego de 24 horas. Además, el ANRm de IL-18BP ' ' pareció estar constitutivamente expresado en las células endoteliales. El nivel de ANRm de IL-18 se analizó y se demostró un incremento pequeño en tes células tratadas. Sin embargo, el ANRm de IL-18 no se expresa en las células endoteliales no estimuladas. 5 El ELISA con los supernacientes de cultivo de las células no estimuladas (medio) y HUVECs tratados durante 24 horas reveló que la proteína IL-18BP estaba presente en el medio y las células estimuladas con • 30x se incrementaron luego de 24 horas de estimulación (Figura 15B). Expresión de la proteína IL-18BP por la línea de célula 10 monocítica (THP-1) Se analizó la expresión de IL-18 e IL-18BP en los supernacientes de cultivo de las células THP-1 diferenciadas y estimuladas y no estimuladas por ELISA (Fig. 15 C). Este experimento reveló incremento de la expresión de IL-18BP luego de 48 horas de estimulación con LPS, hlL-1 ß, 15 hTNFa, hlFN?. En paralelo, la secreción de IL-18 incrementó luego de la estimulación (Fig 15 C).

Resumen P En el estudio presente, se caracterizó la expresión de IL-18BP y 20 la localización en el tejido mucosal obtenido de los pacientes con la Enfermedad de Crohn y la Colitis Ulcerosa. Utilizando el protocolo RT-PCR sem ¡cuantitativo, los transcriptos de ANRm de IL-18BP se descubrió que incrementaban en la biopsia mucosal de los pacientes con la enfermedad de Crohn activa comparado con los de colitis Ulcerosa y de los pacientes de control no inflamados. El análisis inmunohistoquimico de las biopsias mucosales localizó la proteína IL-18BP dentro de las células endoteliales y en los macrófagas que infiltran la mucosa durante la Enfermedad de Crohn. La expresión de IL-18BP por las células endoteliales y los macrófagos activados se confirmó en las células endoteliales de la vena umbilical humana primaria (HUVECs) y en la línea de célula monocitica THP1 estimulada in vitro. Siguiendo la estimulación, estas células secretaron IL-18BP bioactivo.

EJEMPLO 12: EL TRATAMIENTO CON INHIBIDORES DE IL-18 AMINORA LA COLITIS EXPERIMENTAL MATERIAL Y MÉTODOS Los ratones v la inducción de la colitis El Comité de Etica de Estudios Animales de la Universidad de Amsterdam, de Holanda, aprobó todos los experimentos. Los ratones BALB/c fueron obtenidos de Harían Sprague Dawley Ine (Horst, Holanda). Los ratones fueron alojados en condiciones estándar y se les suministró que bebieran agua y comieran (AM-II lOmm, Hope Farms, Woerden, Holanda). Los experimentos fueron conducidos en ratones BALB/c hembras de 8 a 10 semanas de edad. Se indujo la colitis por administración rectal de dos dosis (separadas por un intervalo de 7 días) de 2 mg de ácido ^ ^ ^ a^^A ^- .l.lü sulfónico 2,4,6-trinítrobenceno (TNBS)(Sigma Chemical Co, St Louís, MO, USA) en un 40 por ciento de etanol (Merck, Darmstadt, Germany), utilizando un catéter de vinilo que fue posicionado a tres centímetros del ano (10 ratones por grupo). Durante la instilación, los ratones fueron anestesiados utilizando isoflurano (1 -cloro-2,2,2,-trifluoroetil-isoflurano-diflúorometil-éter, Abbott Laboratories Ltd., Queenborough, Kent, UK), y luego de te instilación se tos mantuvo en forma vertical durante 60 segundos. Los ratones de control soportaron procedimientos idénticos, pero fueron instilados con sal fisiológica. Todos los ratones fueron sacrificados a los 9 días siguiendo la administración 10 de TNBS (es decir 48 horas siguiendo el segundo desafío TNBS). Los ratones fueron tratados con IL-18BP humano en 500 µl 0.9 por ciento de salina en forma intra peritoneal. • El HIL-18BP es una proteína recombinante humana rotulada de histídina seis veces producida en un sistema de expresión CHO. El WL-18BP 15 fue activo biológicamente mientras inhibía la producción de IFN? en la línea de célula KG-1 y reduce la producción de IFNy por las células del bazo del ratón (Kim y colaboradores, 2000).

• Confirmación de la inflamación 20 Se registraron los pesos corporales diariamente. El bazo los nodulos del caudal de linfa y tos colons se cultivaron cuando se sacrificaron. Se quitaron los colons por medio de la incisión en la línea media y fueron abiertos longitudinalmente. Luego de la remoción de la materia fecal, el peso húmedo del distal 6 cm se registró y se utilizó un índice de engrosamiento de pared intestinal relacionada con la enfermedad. En forma subsecuente, los colons fueron divididos longitudinalmente en dos partes, una de las cuales se uso para confirmación histológica.

Análisis histológico Los colons divididos longitudinalmente fueron enrrollados, se fijaron en formalina al 4 por ciento y se embebieron en parafina para la histología de rutina. Se llevaron a cabo dos investigaciones ciegas sobre et lugar del tratamiento de los ratones regidos por los siguientes parámetros l)porcentaje de área involucrada, 2) hiperplasia de los agregados de folículo, 3) edema, 4) erosión/ulceración, 5) pérdida de cripta, 6) infiltración de las células mono- y polimorfonucleares. El porcentaje del área involucrada y la pérdida de cripta se midieron en la escala variando de 0 a 4 como a continuación se detalla: 0, normal; 1 , menos que 10 por ciento; 2, 10 por ciento; 3, 10 por ciento a 50 por ciento; 4, más del 50 por ciento. Las erosiones se definieron como 0 si el epitelio estaba intacto, 1 para la involucración de lamina propia, 2 la ulceración involucrando la submucosa, y 3 cuando la ulceración fue transmural. La importancia de otros parámetros se midió en una escala de 0 a 3 como sigue: 0 ausente,; 1 débil; 2 moderada; 3 severa. Este puntaje varía de 0 a un máximo de 26 puntos.

Homogenatos de colon El colon fue cultivado y los homogenatos fueron realizados con un homogeneizador de tejido en amortiguador de lisis de 9 volúmenes de Greenburger (300 mM NaCI, 15 mM Tris, 2mM MgCl, 2mM Tritón (X-100), Pepstatin A, Leupeptin, Aprotinine (todos 20 ng/ml), pH 7 4) El tejido se liso durante 30 minutos en hielo seguido por la centrifugación dos veces (10 min., 14-000g). Los homogenatos se almacenaron en -20°C hasta su uso Cultivo de célula y ELISA para citocinas Para preparar el bazo y la suspensión de célula de nodulo de caudal de linfa, se utilizaron los cedazos de célula de filtro (Becton/Dickinson Labware, New Jersey, Estados Unidos de Norteamérica). Las células se suspendieron en medio RPMI 1640 (BioWhittaker-Boehringer, Verviers, Bélgica) conteniendo 10 por ciento FCS y ciproxin (10 µg/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Estados Unidos de Norteamérica). Las células del bazo se centrifugaron con Ficoll estéril (Pharmacia, Uppsala, Suecia), las células mononucleares se transfirieron a RPMI y las suspensiones de células se contaron. Un número total de células 1 x 105 por ratón se incubó en 200 µl RPMI (BioWittaker Europe, A Cambrex Company, Verviers, Bélgica) conteniendo antibióticos y un 10 por ciento de suero de ternera fetal en fuentes triplicadas. Las células fueron estimuladas revistiendo con anticuerpo anti-CD3 (concentradón 1 :30; clon 145 2C11 ) y anticuefo soluble anti-CD28 (concentración 1:1000; Pharmingen). Los supernacientes fueron eliminados x ^ ^ im^ .^ ^,^^, luego de 48 horas y las concentraciones IFN-? (Pharmingen) y TNF-a (Sistemas R&D, Abingdon, Reino Unido) fueron medidas por el ensayo de ELISA.

Citometría de Fluio Las células deí bazo aisladas fueron lavadas con amortiguador Facs (PBS, conteniendo 0.5 por ciento BSA, 0.3 mmol/L EDTA y 0.01 por ciento azida de sodio) y se mantuvieron en hielo por el resto del procedimiento. 2J05 células por fuente ( microplato de forma-v de 96 fuentes , Greiner B.V. Labor Techniek, Alphen aan de Rijn, Holanda) se incubaron con los siguientes anticuerpos (mAbs)- anti ratón CD4 (clon RM4-5)de rata conjugada con cromo-C?, anti ratón CD69 de rata conjugada con Fitc y antiratón CD25 de rata conjugada con Fitc (Pharmingen, San Diego, CA). Los linfocitos fueron entrados por diseminación lateral y delantera utilizando citómetro de flujo Facscan en conjunto con software Facscan( Becton Dickinson, Mountain View, Estados Unidos de Norteamérica) y se contaron 5000 células. Los resultados se expresan como porcentaje de las células entradas positivas para el mAbs usado.

Análisis estadístico Los valores se dan como medio y SEM por grupo de tratamiento. Las diferencias entre los grupos se analizaron utilizando el testo Mann-Withney U no paramétrico. Los cambios de peso se analizaron a tiempo por un análisis de una forma de variante El P<0.05 se consideró importante, et software estadístico SPSS (SPSS Inc., Chicago, Estados Unidos de Norteamérica) se utilizó para el análisis. 5 Resultados El IL-18BP protege contra la pérdida de peso en un modelo de colitis de ratón Para investigar el rol de IL-18 en la colitis experimental y en particular el efecto protector de la proteína de unión IL-18 (IL-18BP), se indujo 10 colitis TNBS en los ratones BALB/c. este modelo consiste en la exposición local al ácido sulfónico tri-nitrobenceno (TNBS) y en un 40 por ciento de etanol. Evoca la reacción de hipersensibilidad de tipo retrasado al Antígeno automodificado de haptén (trinitrofenilo) y la respuesta es un tipo-Th1 con producción de citocina pro-inflamatoria. 15 Los ratones fueron tratados con IL-18BP humano o fueron rntra peritonealmente controlados (ip) en una base diaria. La dosis intraperitoneal varió de 12.5µg a 50 µg, el L-18BP no afectó la importancia de la enfermedad (los datos no se muestran) . Sin —^- embargo, utilizando una dosis de 200 µg hlL-18BP diariamente administrada 20 en forma intraperitoneal fue efectivo para reducir la pérdida de peso en relación con la inducción de la enfermedad. Como se espera, la instilación ¡ntrarectal de TNBS resultó en diarrea y desperdicios. Como se muestra en la Fig. 16, los animales en ambos grupos de tratamiento perdieron un por ciento del peso base en el día 3 Sin embargo, en contraste al ratón del control, comenzando en el día 4 luego de la instilación de TNBS, los animales tratados con hlL-18BP- rápidamente se recuperaron de la pérdida de peso inicial, retornando al peso corporal base al día 8. En el ratón de control, la segunda administración de TNBS en el día 8 otra vez resultó en una pérdida de peso importante, que fue esencialmente impedida por la administración de hlL-18BP. La administración de hlL-18BP en los ratones tratados con salina no tuvo efedo (los datos no se muestran). Por lo tanto, la administración de hlL-18BP atenuó en forma importante la pérdida a de peso asociada con la colitis inducida con TNBS (p<0.05).

Efectos en los parámetros inflamatorios En el día 10 los ratones fueron sacrificados y el peso de los últimos 6 centímetros de colon se determinó (Fig. 17 A). En la colitis de TNBS el peso del colon se incrementó comparado con los ratones tratados con salina. Este incremento en peso fue significativamente menor en los ratones tratados con hlL-18BP (181.6 mg ± 11.4 en comparación a los 268 mg ± 27.3 en los ratones tratados con salina (p<0.05)). Se ha informado previamente que la colitis TNBS se asocia con la migración de célula aumentada en los nodulos del caudal de la linfa (Camoglio y colaboradores, 2000). El tratamiento de IL- 18BP redujo el número de células que invaden el caudal del nodulo de la linfa comparado con el número de las células en el caudal del nodulo de la linfa de los ratones tratados de TNBS con salina (Fig. 17 B).

?M ^ ^ ^., .Ji^¡^^.,^ ^^,---.^^i^ ^a^áL^a?^ i.lfl Un cambio en la expresión de CD69, es un marcador de activación de linfocito T temprano, se determinó por el análisis de Facsan (Fig. 17 C). El porcentaje de CD69 de células del bazo de CD4+ expresando fue del 11.4 por ciento en los ratones tratados-TNBS, pero en los ratones TNBS 5 tratados con hiL-18BP el porcentaje de CD4+/CD69+ fue 7.3 por ciento (PO.05).

Producción de citocina del bazo, células del caudal del nodulo de la linfa y homogenatos del colon. 10 Para investigar el efecto de hlL-18BP en la capacidad de los linfocitos T para producir síntesis de la citosina proinftemtopa, siguiendo la activación del receptor de la célula T, las células fueron aisladas del nodulo • del caudal de la linfa y del bazo y estimuladas estas durante 48 horas con anticuerpos anti CD3/CD28. En los supernacientes, la producción de IFN? y 15 TNFa se midió (Figure 18). Ninguna diferencia importante se observó entre la producción de citocina de los ratones NL-18BP y de los ratones tratados de control. Por lo tanto la neutralización de IL-18 por WL-18BP no causó una reducción generalizada de la capacidad de los linfocitos T para responder a la ^ activación del receptor de las células T. 20 Los homogenatos del colon fueron analizados por los niveles de citocina, por lo tanto midiendo la producción local de citocinas (Fig. 19). Ninguna diferencia en los niveles de IFN? se detectó en los homogenatos det colon en los ratones TNBS y en los ratones TNBS tratados con NL-18BP (134 Atmm±^, pg/ml ± 7.8 y 139 pg/ml ± 23 respectivamente). Sin embargo, los niveles de TNFa se redujeron en forma significativa en los homogenatos del colon de los ratones tratados con hlL-18BP de 110 pg/ml ± 3 en los ratones TNBS a 59 pg/ml + 2.7 en los ratones TNBS tratados con NL-18BP.

Descubrimientos histológicos Para investigar si la reducción mediada por NL-18BP de los parámetros inflamatorios también afectó el puntaje histológico, la histopatología se llevó a cabo en las secciones de parafina. El puntaje inflamatorio total en la histología fue disminuida en forma importante en tos ratones tratados con hlL-18BP comparado con los ratones tratados de control (15.9 ± 1.1 en los ratones no tratados a 9.8 ± 1.3 en los ratones tratados hJL-18BP )(no se muestra), principalmente como un resultado de una reducción del número de leucocitos infiltrando la mucosa (p<0.05). Un descubrimiento importante fue la ausencia completa de las ulceraciones mucosales en tos ratones tratados con IL-18BP (p<0.05). Los descubrimientos se resumen en el Cuadro 2 de más abajo. La prevención completa de las ulceraciones en los ratones tratados con IL-18BP es particularmente remarcable.

CUADRO 2 ítems diferentes del puntaje de colitis de los ratones TNBS tratados con rhlL-18Bpa ó salina. ^^ . 4. • tt^iggdb 10 # Los datos se presentan como medio + SEM en un escala de 0-4, 15 * representa una diferencia importante.

Los anticuerpos policlonates anti-mlL-18 protegen de la enfermedad en un modelo de ratón de colitis inducida por sulfato de sodio ^P dextrano. 20 En este modelo el sulfato de sodio dextrano (DSS), id fue dado dentro del agua para beber comenzando en el día 0 hasta el sacrificio de los animales. Los anticuerpos policlonales anti-IL-ISBP se administraron en el día 0, 4 y 8 10 i.p. Esta dosis fue 200 y 400 ? del suero del ratón. La dosis más alta (400 µl) dio una reducción importante en la pérdida de peso en el puntaje clínico en el sangrado rectal y en el acortamiento del colon (no mostrado). El tratamiento anti-miL-18 mostró un retraso en la iniciación de la enfermedad e impidió la progresión (no se muestra).

Resumen El Ejemplo 12 presentado más arriba demuestra que la neutralización de IL-18 por la administración de hlL-18BP o antisuero policlonal contra IL-18 eficientemente redujo la severidad de la colitis inducida experimentalmente en los ratones. Los ratones tratados diariamente con hiL-18BP en forma intraperitoneal, rápidamente recuperaron la pérdida de peso primaria en comparación con los ratones tratados de control. Otros parámetros de inflamación colónica medidos por el peso del colon y el influjo de las células en el nodulo del caudal de la linfa fueron reducidos en los ratones tratados con el hlL-18BP. La histopatologia de los ratones tratados fue caracterizado por una reducción de la importancia de la destrucción del tejido (ulceraciones) y la cantídad de i las células infiltradas fue considerablemente reducida. El efecto de hlL-18BP fue también sistémico, como se demostró por la expresión reducida de CD69 por las células del bazo. La producción local de TNFa, medida en los homogenatos del colon, fue significativamente reducida en los ratones TNBS tratados con hlL- 18BP. Esto indica que TNFa juega un rol importante en la progresión de la enfermedad. Los niveles de IFN? fueron comparados entre los ratones TNBS y los ratones TNBS tratados con hlL-18BP, que puede ser explicado por la redundancia del estimulo inducido de IFN?. En conclusión, los datos presentados anteriormente demuestran 5 el efecto beneficioso de los inhibidores de I L-18 en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias del intestino « REFERENCIAS 10 1. Afford, S.C., y colaboradores, Distinct patterns of chemokine expression are associated with leukocyte recruitment in alcoholic hepatitis and alcohol ic cirrhosis. J Pathol, 1998. 186(1 ): p. 82-9. # 2. Anderson, D.M., y colaboradores, A homologue of the TNF receptor and its ligand enhance T-cell growth and dendritic-celi function. 15 Nature, 1997. 390(6656): p. 175-179. 3. Baroni, G.S., y colaboradores, Hepatic stellate cell activatton and liver fibrosis are associated with necroinflammatory injury and Th1-like response in chronic hepatitis C. Liver, 1999. 19(3): p. 212-9. ^P 4. Bird, G.L., y colaboradores, Increased plasma tumor necrosis 20 factor in severe alcoholic hepatitis. Ann Intern Med, 1990. 112(12): p. 917-20. 5. Bollón, D. P., y colaboradores (1980) J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48. 6. Botstein, D., y colaboradores (1982) Miami Wint. Symp. 19:265-274. 7. Broach, J. R-, in "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 445-470 (1981 ). 5 8. Broach, J. R., (1982) Cell 28:203-204. 9. Byrn R. A. y colaboradores, 1990, Nature (London) 344:667- 670. # 10. Camoglio L, te Velde AA, de Boer A, ten Kate FJ, Kopf M, van Deventer SJ. Hapten-induced colitis associated with maintained Th1 and 10 inflammatory responses in IFN-gamma receptor-deficient mice. Eur J Immunol 2000;30:1486-95. 11. Car, B. D., V. M. Eng, B. Schnyder, L. Ozmen, S. Huang, P.

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Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- El uso de un inhibidor IL-18 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la lesión hepática. 2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde la lesión hepática es aguda. 3.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la lesión hepática es crónica. 4.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la lesión hepática es hepatitis por alcohol, hepatitis viral, hepatitis inmune, hepatitis fulminante, cirrosis hepática y cirrosis biliar primaria. 5.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 4, en donde la lesión hepática es hepatitis fulminante. 6.- El uso de un inhibidor de I L-18 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y /o prevención de la artritis. 7 '.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde la artritis es artritis inflamatoria. 8.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 7, en donde la artritis inflamatoria es artritis reumatoidea. 9.- El uso de un inhibidor de IL-18 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la destrucción del cartílago. 10.- El uso de un inhibidor de I L-18 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y /o prevención de una enfermedad 5 inflamatoria del intestino. 1 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en donde la enfermedad inflamatoria del intestino es la enfermedad de Crohn. F 12.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en donde la enfermedad inflamatoria del intestino es ia colitis ulcerosa. 10 13.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 la 12, en donde el inhibidor de I L-18 está seleccionado de los inhibidores de caspasa-1 (ICE),de los anticuerpos contra IL-18, los anticuerpos contra cualquiera de las subunidades de receptor de tL-18, los inhibidores del sendero de señalamiento de IL-18, los antagonistas de IL-18 15 que compiten con I L-18 y bloquean el receptor IL-18 , y las proteínas de unión de IL-18, los isoformos, las muteínas, las proteínas fusionadas, los derivados funcionales, las fracciones activas, o los derivados permutados circularmente de los mismos que tienen una misma actividad como una proteína de unión de IL-18. ^1^ 20 14.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 13, en donde el inhibidor de IL-18 es un anticuerpo IL-18. 15.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde el anticuefo IL-18 es un anticuerpo humanizado IL-18. 16.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 15, en donde el anticuerpo IL-18 es un anticuerpo humano IL-18. 17.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 13, en donde el inhibidor de IL-18 es una proteína de unión IL-18, o un isoformo, una muteína, una proteína fusionada, un derivado funcional, una fracción activa o derivado permutado circularmente. 18.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde la proteína de unión IL-18 es PEGilada. 19.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde el inhibidor de IL-18 es una proteína fusionada que comprende todo o parte de una proteína de unión IL-18 fusionada en todo o parte de una inmunoglobulina y donde la proteína fusionada se une a IL-18. 20.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 19, en donde la proteína fusionada comprende todo o parte de la región constante de una inmunoglobulina. 21.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, en donde la inmunoglobulina es de tipo lgG1 o lgG2. 22.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento además comprende un interferón. 23.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 22, en donde el interferón es interferón-ß. 24.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 22 o 23, ,3O1L.Í'£*. I ?¡ ¿i4 en donde el inhibidor de IL-18 se usa en forma simultánea, secuencialmente o separadamente con el interferón. 25.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento además comprende 5 un antagonista de Factor de Necrosis de tumor (TNF). 26.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el antagonista de TNF es TBPI y/o TBPII. # 27.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25 o 26, en donde el inhibidor de I L-18 y/o el interferón se usa en forma simultánea, 10 secuencialmente o separadamente con el antagonista TNF. * 28.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las ,. reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento además comprende ^F inhibidor 15 COX. 29.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en 15 donde el inhibidor COX es un inhibidor COX-2. 30.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento provee de 0.0001 a 10 mg del inhibidor de IL-18 por kg de peso corporal, o alrededor de 0.01 a 5 •\ mg del inhibidor de IL-18 por kg de peso corporal o aproximadamente 0J a 3 20 mg por kg de peso corporal o aproximadamente 1 a 2 mg por kg de peso corporal. 31- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento provee aproximadamente OJ a 1000 µg del inhibidor de IL-18 por kg de peso corporal o 1 a 100 µg por kg de peso corporal o aproximadamente 10 a 50 µg por kg de peso corporal. 32.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las 5 reivindicaciones precedentes, en donde el inhibidor IL-18 es administrable en forma subcutánea. 33.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el inhibidor de IL-18 es administrable en forma intramuscular. 10 34.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el inhibidor de IL-18 es administrable en forma diaria. 35.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el inhibidor de IL-18 es administrable 15 día por medio. 36.- El uso de un vector de expresión que comprende la secuencia de codificación de un inhibidor de IL-18 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la lesión hepática. 37.- El uso de un vector de expresión que comprende la 20 secuencia de un inhibidor de I L-18 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la artritis. 38.- El uso de un vector de expresión que comprende la secuencia de codificación de un inhibidor de IL-18 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y /o la prevención de una enfermedad ^de artritis inflamatoria del intestino. 39.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38 para la terapia del gen. 5 40.- El uso de un vector para inducir y/o aumentar la producción endógena de un inhibidor de IL-18 en una célula para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la lesión hepática. 41- El uso de un vector para inducir y /o aumentar la producción endógena de un inhibidor de IL-18 en una célula para la preparación de un * 10 medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la artritis. * 42.- El uso de un vector para inducir y/o aumentar la producción endógena de un inhibidor de IL-18 en una célula para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad inflamatoria dei intestino. 15 43.- El uso de una célula que ha sido genéticamente modificada para producir un inhibidor de IL-18 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la lesión hepática. 44.- El uso de una célula que ha sido genéticamente modificada para producir un inhibidor de IL-18 para la preparación de un medicamento 20 para el tratamiento y/o la prevención de la artritis. 45.- El uso de una célula que ha sido genéticamente modificada para producir un inhibidor de IL-18 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad inflamatoria del intestino. 46.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de I L-18 y una cantidad terapéuticamente efectiva de un interferón. 47.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de I L-18 y una 10 cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista TNF. 48.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor I L-18 y una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de COX-2. 49.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad 15 terapéuticamente efectiva de un inhibidor de IL-18 en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera o todo de un interferón, un antagonista de TNF o un inhibidor de COX-2.