[go: up one dir, main page]

RS60402B1 - Dodaci ishrani - Google Patents

Dodaci ishrani

Info

Publication number
RS60402B1
RS60402B1 RS20200357A RSP20200357A RS60402B1 RS 60402 B1 RS60402 B1 RS 60402B1 RS 20200357 A RS20200357 A RS 20200357A RS P20200357 A RSP20200357 A RS P20200357A RS 60402 B1 RS60402 B1 RS 60402B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
inhibitor
use according
treatment
prevention
disease
Prior art date
Application number
RS20200357A
Other languages
English (en)
Inventor
Olov Sköld
Anna Ström
Martin Ahnoff
Original Assignee
Laminaria Group Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laminaria Group Ab filed Critical Laminaria Group Ab
Publication of RS60402B1 publication Critical patent/RS60402B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Preparation or treatment thereof
    • A23L2/385—Concentrates of non-alcoholic beverages
    • A23L2/39—Dry compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Preparation or treatment thereof
    • A23L2/38—Other non-alcoholic beverages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Preparation or treatment thereof
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Preparation or treatment thereof
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A23L2/60—Sweeteners
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
    • A23L29/206—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin
    • A23L29/231—Pectin; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
    • A23L29/206—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin
    • A23L29/256—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin from seaweeds, e.g. alginates, agar or carrageenan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/15—Vitamins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/16—Inorganic salts, minerals or trace elements
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/175—Amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/33—High-energy foods and drinks, sports drinks
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/02—Acid
    • A23V2250/06—Amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/15—Inorganic Compounds
    • A23V2250/156—Mineral combination
    • A23V2250/16—Potassium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/15—Inorganic Compounds
    • A23V2250/156—Mineral combination
    • A23V2250/161—Magnesium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/15—Inorganic Compounds
    • A23V2250/156—Mineral combination
    • A23V2250/1614—Sodium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/15—Inorganic Compounds
    • A23V2250/156—Mineral combination
    • A23V2250/1642—Zinc
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/20—Natural extracts
    • A23V2250/21—Plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/50—Polysaccharides, gums
    • A23V2250/502—Gums
    • A23V2250/5026—Alginate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/50—Polysaccharides, gums
    • A23V2250/502—Gums
    • A23V2250/5072—Pectine, pectinate
    • A23V2250/50722—High methoxy pectine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/50—Polysaccharides, gums
    • A23V2250/51—Polysaccharide
    • A23V2250/5114—Dextrins, maltodextrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/50—Polysaccharides, gums
    • A23V2250/51—Polysaccharide
    • A23V2250/5118—Starch
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/60—Sugars, e.g. mono-, di-, tri-, tetra-saccharides
    • A23V2250/606—Fructose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/60—Sugars, e.g. mono-, di-, tri-, tetra-saccharides
    • A23V2250/61—Glucose, Dextrose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/60—Sugars, e.g. mono-, di-, tri-, tetra-saccharides
    • A23V2250/62—Palatinose, isomaltulose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/60—Sugars, e.g. mono-, di-, tri-, tetra-saccharides
    • A23V2250/628—Saccharose, sucrose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/70—Vitamins
    • A23V2250/708—Vitamin C

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
  • Non-Alcoholic Beverages (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

KORIŠĆENJE INHIBITORA IL- 18
OBLAST TEHNIKE
Ovaj pronalazak se odnosi na terapijsku upotrebu inhibitora IL-18 u nekoliko patoloških stanja. Specifičnije, ovaj pronalazak se odnosi na lečenje i/ili prevenciju artritisa, Ječenje i/ili prevenciju bolesti jetre i lečenje i/ili prevenciju zapaljenske bolesti creva.
STANJE TEHNIKE
Godine 1989, opisana je serumska aktivnost izazvana endotoksinom koja je indukovala interferon-gama (IFN-v) dobijen iz slezine miša (Micallef i sar. 1996). Ova serumska aktivnost je funkcionisala ne kao direktna indukcija IFN-y, već pre kao ko-stimulant zajedno sa IL-2 ili mitogenima. Pokušaj da se purifikuje ova aktivnosti iz post-endotoksinskog seruma miša otkrila je jedan naizgled homogeni 50-55kDa protein. Budući da drugi citokini mogu da deluju kao ko-stimulanti za produkciju IFN-y, neuspeh da se neutralizuju antitela na IL-1, IL-4, IL-5, II-6 ili TNF da se neutralizuje serumska aktivnost, ukazala je daje to zaista uticajan faktor. Godine 1995, isti naučnici su pokazali da endotoksinski indukovan ko-stimulant za produkciju INF-y postoji u ekstraktima jetre miša prethodno kondicioniranog sa P- acnes (Novick i sar. 1992). U ovom modelu, populacija hepatičkih makrofaga (Kupferove ćelije) se širi i kod ovih miševa,
niska doza bakterijskih lipopolisaharida (LPS) koja kod miševa koji nisu prethodno kondicionirani nije letalna, postaje letalna. Ovaj faktor, nazvan faktor koji indukuje INF-y (IGIF)i kasnije nazvan interleukin-18 (IL-18) purifikovan je do homogenosti iz 1200 grama jetre miševa tretiranih sa P. acnes. Degenerisani oligonukleotidi koji su dobijeni iz sekvenci amino kiselina purifikovanog IL-18 korišćeni su za kloniranje mišjeg IL-18 cDNK (Novick et al., 1993). IL-18 je jedan 18-19 kDa protein sa 157 amino kiselina koji nema jasnih sličnosti ni sa jednim peptidom u bazama podataka. Glasničke (m) RNKza IL-18 i interleukin-12 (IL-12) lako se otkrivaju u Kupferovim ćelijama i aktiviranim makrofagima. Rekombinantni IL-18 indukuju INF-gama jače od IL-12, po svoj prilici posebnim putem (Novick i sar. 1992). Slično serumskoj aktivnosti indukovanoj endotoksinom, IL-18 ne indukuje IFN-v sam od sebe, već funkcioniše primamo kao ko-stimulant sa mitogernima ili IL-2. IL-18 pojačava proliferaciju T ćelija,
putem koji zavisi od IL-2, i pojačava produkciju Th1 citokina in vitro i ispoljava
sinergizam kada se kombinuje sa IL-12 u smislu pojačane produkcije IFN-y (Maliszevvski i sar. 1990).
Pokazano je da neutralizacija antitela na mišji IL-18 sprečava letalnost niskih doza LPS kod miša prethodno kondicioniranog sa P. acne. Ostali su zabeležili značaj IFN-y kao medijatora letalnosti LPS kod prethodno kondicioniranog miša. Na primer, neutralizacija anti IFN-y antitela štitila je miša protiv šoka sličnog .Švarcmanovom (Fantuzi i sar. 1998), dok su miševi tretirani galaktozaminom s nedostatkom IFN-y receptora bili otporni na smrt izazvanu LPS-om (Bym, 1990). Zbog toga, nije sasvim neočekivano što je neutralizacija antitela na mišji IL-18 štitila miševe prethodno kondicionirane sa P.- acnes protiv letalnog LPS (Novicki sar. 1992). Anti-mišji IL-18 tretman štitio je i preživele miševe od teže hepatičke citotoksičnosti.
■ Pošto je kloniran ovaj mišji oblik, 1996 (Okamura i sar. 1995) objavili su humanu sekvencu cDNKza IL-18. Rekombinantni humani IL-18 ispoljava prirodnu IL-18 aktivnost (Okamura i sar. 1995). Humani rekombinantni IL-18 nema direktne indukcione aktivnosti na humane T-ćelije, ali deluje kao ko-stimulant na produkciju IFN-y i ostale T-pomažuće ćelije -1 (Th-1) citokine (Okamura i sar. 1995). Do danas, smatra se daje IL-18 prvenstveno ko-stimulant za produkciju Th1 citokina (IFN-y, IL-2 i faktor stimulacije granulocit-makrofagnih kolonija) (Izaki, 1978) i ko-stimulant citotoksičnosti posredovane FAS-ligandom klona mišjih ćelija prirodnih ubica (Novick i sar, 1989).
Kloniranjem IL-18 iz zahvaćenih tkiva i ispitivanjem ekspresije IL-18 gena, utvrđena je tesna veza između ovog citokina i autoimune olesti. Dijabetični miš koji nije debeo (NOD) spontano razvija autoimuni insulitis i dijabetes, koji se mogu ubrzati i sinhronizovani samo jednom injekcijom ciklofosfamida. IL-18 mRNK je pokazana PCR reverzne transkriptaze kod pankreasa NOD miša u ranoj fazi insulitisa. Nivoi IL-18 mRNK su rasli brzo po tretmanu ciklofosfamidom i prethodili su porastu IFN-y mRNK i, potom dijabetesa Zanimljivo je da ova kinetika podražava IL-12-p40 mRNK, što dovodi do brliske korelacije individualnih nivoa mRNK. Kloniranje ILK-18 cDNK iz pankreasne RNK praćeno sekvenciranjem otkrilo je identičnost sa IL-18 sekvencom kloniranom iz Kupferovih ćelija i in vivo prethodno aktiviranim makrofagima. isto tako, makrofagi NOD miša odgovorili su na ciklofosfamid IL-18 genskom ekspresijom dok makrofagi miša paralelno tretiranog Balb/c nisu. Prema tome, ekspresija IL-18 je abnormalno regulisana kod autoimunog NOD miša i tesno povezana s razvojem dijabetesa (Novick i sar. 1992(. IL-18 igra potencijalnu ulogu u imunoregulaciji ili u zapaljenju pojačanjem funkcionalne aktivnosti Fas liganda na Th1 ćelije (Conti i sar. 1997). IL-18 se ispoljava i u adrenalnom korteksu i stoga može da bude sekretovani imunomodulator, i da igra važnu ulogu u orkestraciji imunog sistema posle stresogenog iskustva (Chater, 1986).
In vivo, IL-1§ se formira cepanjem pro-IL-18 i izgleda daje njegova endogena aktivnost odgovorna za produkciju IFN-y kod P.acnes i letalnosti posredovane LPS. Zreli IL-18 se proizvodi iz prekursora uz pomoć IL-1B konvertujućeg enzima, ICE, kaspaze-1). IL-18 receptor se sastoji od najmanje dve komponente, koje sarađuju u vezivanju liganda. Mesta vezivanja IL-18 niskog i visokog afiniteta nađena su kod mišjih IL-12 stimulisanih T ćelija (Yoshimoto i sar. 1998) što govori o multiplom lančanom receptorskom kompleksu. Dve receptorske subjedinice su do sada identifikovane, obe pripadaju receptorskoj familiji IL-1 (Pameri sar. 1996). Provođenje signala IL-18 uključuje aktivaciju NK-kB (DiDonato i sar. 1997).
Nekoliko poznatih citokina koji vezuju proteine su rastvorljivi citokinski receptori i odgovaraju domenima ekstracelularnih vezivanja liganda njihovih odgovarajućih ćelijskih površina citokinskih receptora. Oni se izvode ili alternativnim nadovezivanjem pre-mRNK koja je uobičajena za receptor na ćelijskoj površini ili proteolitičkom cepanjem receptora na ćelijskoj površini. Ovakvi rastvorljivi receptori su opisivani i u prošlosti, uključujući između ostalih i rastvorljive receptore IL-6 i IFGN-y (Nakamura i sar. 1989), TNF (Dao i sar. 1996; Engelmann i sar. 1989), IL-1 i IL-4 (John, 1986), INF^x/p (Mizushima i Nagata, 1990) i druge. Jedan citokin-vezujući protein, po imenu osteoprotegrin (OPG, poznat i kao faktor inhibicije osteoklasta - OCIF), član porodice TNFR/Fas izgleda je prvi primer rastvorljivog receptora koji postoji samo kao sekretovani protein (Ariderson, 1997; Bollon, 1980).
U novije vreme, iz humanog urina kao i humane i mišje cDNK izolovan je jedan rastvorljivi protein koji ima visoki afinitet za IL-18 (Novick i sar. 1999; WO 99/09063). Ovaj protein je nazvan IL-18 vezujući protein (IL18BP). IL-18BP nije vanćelijski domen jednog od poznatih IL-18 receptora, već je sekretovani, prirodno cirkulišući protein, On pripada novoj familiji sekretovanih proteina. Ova familija dalje uključuje nekoliko Poksvirus-enkodiranih proteina koji imaju visoku homologiju sa IL-18BP (Novick i sar. 1999). IL-18BP se konstitutivno eksprimira u slezini, pripada superfamiliji imunoglobulina, i ima ograničenu homologiju sa IL-1 tip II receptorom. Njegov gen je lokalizovan na humanom hromozojnu 11q13, a u jednoj 8.3 genomskoj sekvenci nije nađen ekson koji kodira za transmembranski domen (Novick i sar. 1999).
Četiri humana i dva mišja izoforma IL-18BP, koji nastaju nadovezivanjem i nalaze se u raznim cDNK bibliotekama već su eksprimirani, purifikovani i procenjeni za vezivanje i neutralizaciju IL-18 biološke aktivnosti (Kim i sar. 2000). Humani IL-18BP izoform a (IL-18Bpa) ispoljio je najveći afinitet za IL-18 sa brzim on-rate i sporim off-rate, i konstantom disocijacije (K(d)) od 399 pM. IL-18BPc deli Ig domen IL-18BPa osim 29 C-terminalnih amino kiselina; K(d) IL-18BPc je 10 puta manja (2,94 nM). Ipak, IL-BPa i IL-BPc neutralizuju IL-18 >95% pri molarnom višku od dva. IL-18BPb i IL-BPd izoformi nemaju kompletni Ig domen i nemaju sposobnost da vezuju ili neutrališu IL-18. Mišji IL-18BPc i IL-BPd izoformi koji imaju isti Ig domen, takođe neutralizuju >95% mišjeg IL-18 pri molarnom višku od dva. Međutim, mišji IL-18BPd koji ima isti C-terminalni motiv kao i humani IL-BPa, takođe neutralizuje humani IL-18. Molekulsko modelovanje je identifikovalo jedno veliko elektrostatičko i hidrofobno.mesto vezivanja u Ig domenu IL-BP, koje može da objasni njegov visoki afinitet vezivanja za ligand (Kim i sar. 2000).
U novije vreme, smatra se daje interleukin IL-18 uključen u progresiju patogenosti kod hroničnih inflamatornih bolsti, uključujući endotoksinski šok, hepatitis i autoimuni dijabetes (Kahivvamura i Okamura, 1998). Dalja indikacija eventualne uloge IL-18 u razvoju oštećenja jetre proističe iz eksperimenata koje su objavili Tsuij i sar. (Tsuij i sar. 1999) pokazujući povišene nivoe IL-18 u akutnom oštećenju jetre izazvanom lipopolisaharidom na modelu miša. Međutim, mehanizam multi-funkcionalnog faktora IL-18 u razvoju oštećenja jetre do danas još nije rasvetljen.
Oštećenje jetre može da ima različite uzroke. Može da potiče od virusnih ili bakterijskih infekcija, zloupotrebe alkohola, imunoloških poremećaja ili, na primer, raka.
Virusni hepatitis, uzrokovan virusima hepatitisa B i hepatitisa C, na primer, predstavljaju bolesti koje se teško leće, a pogađaju veliki broj ljudi širom sveta. Stalno raste broj poznatih virusa hepatitisa. Uz hepatitis B i C, otkriveno je najmanje još četiri druga virusa koji uzrokuju virusni hepatitis, i to su virusi hepatitis A, D, I i G.
Alkoholno oboljenje jetre je druga široko rasprostranjena bolest vezana za hronično konzumiranje alkohola. Imuni hepatitis je retko autoimuno oboljenje koje se teško leči. U bolesti jetre spada i oštećenje žučnih puteva. Primarna bilijarna ciroza (PBC)je autoimuno oboljenje jetre koje se odlikuje destrukcijom intrahepatičkih žučnih puteva.
Nekoliko studija je pokazalo da su oštećenja jetre u bolestima kao što je alkoholni hepatitis, ciroza jetre, virusni hepatitis i primarna bilijarna ciroza povezana sa odgovorima T-pomažućih ćelija 1 (Th1). U jednoj studiji, uveden je novi model oštećenja jetre kod miša koji cilja lipozome sa sadržajem ovalbumina u jetri, posle čega sledi adoptivni transfer ovalbumin-specifičnih Th1 ćelija. Kombinovani tretman miša lipozomima sa sadržajem ovalbumina i transfer Th1 ćelija doveo je do povećanja aktivnosti transaminaze u serumu koja je bila paralelna povećanju nivoa IFN-y u serumu. Za razliku od toga, transfer ovalbumin-specifičnih Th2 ćelija doveo je do povećanja nivoa IL-4 u serumu, ali nije doveo do oštećenja jetre. Oštećenje jetre bilo je blokirano anti-INF-y antitelima i antitelima anti-TNF (faktor tumorske nekroze). Ovi nalazi govore da su Th1 ćelije glavne efektorske ćelije kod akutnog oštećenja jetre (Nishimura i Ohta, 1999). U drugoj grupi studija pokazano je da miševi koji previše eksprimiraju IFN-y ispoljavaju i spontani hepatitis bez ikakvog patogena ili drugog stimulanta (Okamoto i sar. 1998).
Još jedna studija je implicirala Th1 odgovor u primarnoj bilijamoj cirozi (PBC). PBC je jedna autoimuna bolest jetre koja se odlikuje destrukcijom intrahepatičkih bilijamih kanala. Smatra se da mehanizmi ćelijskog imuniteta, pre svega oni koji uključuju T ćelije, dovode do oštećenja žučnih puteva. Nedavno je sugerisano da relativna snaga odgovora Th1 i Th2 predstavlja važan faktor u patofiziologiji raznih autoimunih bolesti. U ovoj studiji, ravnoteža podgrupa u PBC je procenjena otkrivanjem citokina specifičnih za dve podgrupe T ćelija, t.j. IFN-y za Th1 ćelije i IL-4 za Th2 ćelije. IFN-y i IL-4 glasnička RNK (mRNK) pozitivne
ćelije su brojane u isečcima jetre 18 pacijenata obolelih od PBC i 35 obolelih kontrola uključujući hronični aktivni hepatitis C, ekstrahepatičku opstrukciju žučnih puteva, i normalnu jetru, korišćenjem ne-izotopnein situhibridizacije i imunohistohemije. Mononukleame ćelije sa ekspresijom IFN-y i IL-4 mRNK agregirane su u inflamiranim portalnim putevima u jetrama PBC, ali su bile retko prisutne u slučajevima ekstrahepatičke bilijarne opstrukcije, alkoholne fibroze ili normalne jetre. IFN-y i IL-4 mRNK pozitivne ćelije u jetrama PBC otkrivene su u signifikantno većem broju nego kod kontrolnih jetri (p<0,01). Štaviše, ekspresija IFN-y mRNK je utvrđena češće od ekspresije IL-4 u PBC jetrama, a nivoi IFN-y mRNK ekspresije bili su visoko korelisani sa stepenom portalne inflamatome aktivnosti. IFN-y mRNK pozitivne ćelije detektovane su prvenstveno oko oštećenih žučnih puteva koji su okruženi limfoidnim agregatima. Ovi podaci kazuju da su Th1 ćelije prominentniji podskup T-ćelija u limfoidnim infiltratima u PBC (Harada i sar. 1997).
Smatra se takođe da citorkinski model na prepoznavanje virusnih antigena vrši ozbiljan uticaj na rešavanje virusnih infekcija i klirens virusa. Jedna studija je ispitivala da li citokinski disbalans orijentisan ka odgovoru tipa Th2 igra ulogu u hroničnom hepatitisu B. Metodom RT-PCR analizirani su profili citokina u mononuklearnim ćelijama periferne krvi praćeni hepatitisom B . Po stimulaciji površinskog antigena hepatitisa B (HbsAg), otkrivena je ekspresija IFN-y kod 41% bolesnika, IL-2 kod 8%, IL-4 kod 41% i IL-10 kod 50% bolesnika. Među ovim citokinima, ekspresija Th1 citokina INFy praćena je visokim nivoima serumskog AST/ALT (aspartat aminotransferaza/alanin aminotransferaza) koji predstavljaju tipične markere oštećenja jetre. Nije se pokazalo da citokini tipa Th2 vrše zaštitno dejstvo na hepatocite. U zaključku, produkcija Th1 citokina, IFN-y od strane HbsAg-reaktivnih ćelija praćeno je oštećenjem hepatocita u hroničnom hepatitisu B (Lee i sar. 1999). Visoki nivoi FAS liganda i njegovih receptora (CD95) zabeleženi su u jetri bolesnika od hepatitisa B (Luo i sar. 1997). FAS ligand se smatra jednim od glavnih citotoksičnih agenasa koji vode do apoptoze hepatocita.
Jedna druga studija je identifikovala faktore povezane sa progresijom oštećenja jetre kod 30 nelečenih bolesnika koji su hepatitis C/RNK (HCV/RNK) pozitivni i imaju hronični hepatitis. Nekroinflamatorna i strukturna oštećenja procenjivana su korišćenjem Ishakovog skora. Aktivirane hepatične zvezdaste ćelije (HSC) vizualizovane su imunohistohemijski na a aktin glatkih mišića (aSMA) i kvantifikovane morfometrijski. HCV/RNK u plazmi određivan je korišćenjem kompetitivne RT-PCR metode. Da bi se ispitao tip imunog odgovora uključen u progresiju oštećenja jetre, IFN-y-pozitivne ćelije (kao ekspresija odgovora sličnog Th1) su takođe procenjivane imunohistohemijski i kvantifikovane morfometrijski. Utvrđeno je da su HSC uglavnom detektovane u blizini oblasti lobularne nekroinflamacije ili površine fibrotičnog septuma. aSMA i Sirius crveno-pozitivni parenhim korelisali su značajno sa nekroinflamatornim i strukturnim skorovipia. IFN-y pozitivne ćelije su utvrđene u periportalnim oblastima praćene inflamatornim infiltratima i značajno su korelisale sa strukturnim oštećenjima. Prema tome, došlo se do zaključka da su aktivacija HSC i progresija oštećenja jetre povezani sa odgovorom sličnim Th-1(Baroni i sar. 1999). Slično slučaju hepatitis B virusa, FAS ligand i njegovi receptori su nađeni u jetri i serumu bolesnika sa hepatitisom C (Hirmatvu i sar, 1994; Okazaki i sar. 1996; Lio i sar. 1998).
Utvrđeno je da suThl citokini i drugi markeri Th1 povezani sa alkoholnim hepatitisom i cirozom jetre. Inflamatorni stimulusi i lipidna peroksidacija aktiviraju nuklearni faktor kB (NF-kB) i ushodno regulišu proinflamatome citokine i hemokine. U jednoj studiji procenjivan je odnos između patološkog oštećenja jetre, endotoksemije, lipidne peroksidacije i aktivacija NF-kB i disbalansa između pro- i anti-inflamatomih citokina. Pacovi (5 po grupi) su hranjeni etanolom i ishrana im se sastojala od zasićenih masti, palminog ulja, kukuruznog ulja ili ribljeg ulja koji su dobijali intragastričnom infuzijom. Kod kontrolnih pacova, dekstroza je izokalorijski zamenjivala etanol. Patološka analiza je urađena i obavljena su merenja nivoa endotoksina, lipidne peroksidacije, NF-kB i glasničke RNK (mRNK) proinflamatornih citokina (TNFa, X-1p, IFN.y i IL-12), C-C hemokina (regulisanih po aktivaciji, normalne T ćelije eksprimirane i sekretovane [RANTES], monocit hemotaktičnog proteina [MCP]-1, makrofag inflamatornog proteina [MIP]-1-a), C-X-X hemokina (citokinom indukovani neutrofilni hemoatraktant [CINC], MIP-2, IP-10 i epitelijalnog neutrofil aktivirajućeg proteina [ENA]78), i antiinflamatornih citokina (IL-10, IL-4, i IL-13). Aktivacija NF-kB i povećana ekspresija proinflamatornih citokina C-C i C-X-C hemokina zabeležena je kod pacova koji su ispoljavali nekroinflamatorno oštećenje (riblje ulje - etanol i kukuruzno ulje - etanol). Ove grupe su imale i najveće nivoe endotoksina i lipidne peroksidacije. Nivoi IL-10 i IL-4 mRNK su bili niži u grupi koja je ispoljavala inflamatorno oštećenje jetre. Tako, aktivacija NF-kB nastaje u prisustvu proinflamacijskih stimulusa i dovodi do povećane ekspresije Th1 proinflamatornih citokina i hemokina (Naji i sar. 1999). FAS ligand i njegov receptor su takođe povišeni kod alkoholnog oboljenja jetre, sugerišući još jednom da su Th1 citokini uključeni u autoimune procese indukovane alkoholnim hepatitisom (Galle i sar. 1995; Taieb i sar. 1998; Fiore i sar. 1999).
TNF-a se takođe pojavio kao uobičajeni put u patogenezi hepatičke nekroinflamacije izazvan alkoholom. Povišeni nivoi TNF u jetri i serumu dokumentovani su u životinjskim modelima alkoholnog oboljenja jetre kao i kod alkoholnog oboljenja jetre čoveka. Smatra se da ovaj disregulisani metabolizam TNF igra ulogu u mnogim metaboličkim komplikacijama i TNF oštećenja jetre kod alkoholnog oboljenja jetre (Grove i sar. 1997; McClain i Cohen, 1989). Na primer, u jednoj studiji je utvrđeno da pacijenti s alkoholnim hepatitisom imaju više nivoe TNF-a (srednja vrednost 26,3 ng/L; 95% Cl; 21,7 do 30,9) od normalnih ispitanika (6,4 ng/L; Cl 5,4 - 7,4). I pacijenti koji su potom umrli imali su više nivoe TNF-a (34,7 ng/L; Cl, 27,8 do 41,6) od onih koji su preživeli (16,6 ng/L; Cl 14,0 do 19,2). Kod pacijenata s alkoholnim hepatitisom, nivoi TNF-a su bili u pozitivnoj korelaciji s bilirubinom u serumu (r = 0,74; P = 0,0009) i kreatininom u serumu (r = 0,81; P =0, 0003).Pacijenti s alkoholnim hepatitisom su imali više nivoe TNF-a od onih sa neaktivnom alkoholnom cirozom (11,1 ng/L, Cl, 8,9 do 13,3) i teško alkoholisanih osoba bez oboljenja jetre (6,4 ng/L; CI5,0 do 7,8). Pacijenti s normalnom bubrežnom funkcijom imali su niže nivoe TNF-a (14,1 ng/L; Cl, 5,4 do 22,8) od pacijenata s alkoholnim hepatitisom. Prema tome, zaključeno je da su povišenja TNF-a kod alkoholnog hepatitisa najupadljivija u težim slučajevima što govori da TNF-a igra ulogu u njegovoj patogenezi (Bird i sar. 1990): TNF posreduje u mnogim biološkim dejstvima endotoksina. Novija istraživanja su pokazala da davanje TNF može da dovede do oštećenja jetre i da TNF može da posreduje u letalnosti hepatotoksina galaktozamina. Jedan od najsnažnijih induktora TNF je endotoksin. Budući da pacijenti s alkoholnim oboljenjem jetre često imaju endotoksemiju i budući da su mnoge kliničke manifestacije alkoholnog hepatitisa poznata biološka dejstva TNF, njegova aktivnost je procenjivana kod pacijenata s alkoholnim hepatitisom. Kod 16 osoba s alkoholnim hepatitisom i 16 zdravih dobrovoljaca procenjivano je oslobađanje bazalnog i lipopolisaharidom stimulisanog TNF iz monocita periferne krvi, koja je glavni izvor produkcije TNF. Merljiva spontana aktivnost TNF otkrivena je kod 8 od 16 pacijenata s alkoholnim hepatitisom i samo 2 od 16 zdravih dobrovoljaca (p manje od 0,05). Po stimulaciji lipopolisaharidom, srednje oslobađanje TNF iz monocita pacijenata s alkoholnim hepatitisom bilo je signifikantno povišeno, čak do dva puta više nego kod zdravih dobrovoljaca (25,3 ±3,7 prema 10,9 ±2,4 jedinice/ml, p manje od 0,005). Zbog toga je bilo zaključeno da monociti pacijenata s alkoholnim hepatitisom imaju signifikantno povišeno oslobađanje spontano i lipopolisaharidom indukovano oslobađanje TNF u poređenju s monocitima zdravih dobrovoljaca (McClain i Cohen, 1989).
Lipopolisaharid (LPS)-vezujući protein (LBP) i CD14 igraju posredničku ulogu u aktivaciji ćelija endotoksinom. Smatra se da LPS dobijen iz creva utiče u promociji patološkog oštećenja jetre kod alkoholne bolesti jetre. Kod pacova je pokazano da kada^e intragastrično hrane etanolom u ulju tokom 4 nedelje razvijaju povišene nivoe CD14 u svojim Kupferovim ćelijama i LBP u hepatocitima. Ekspresija CD14 mRNK je takođe bila povišena u nemijeloidnim ćelijama. Povišena ekspresija LBP i CD14 brzo povećava LPS-indukovanu ekspresiju raznih pro-inflamatomih citokina i korelira s prisustvom patološkog oštećenja jetre kod alkoholne bolesti jetre (Su i sar. 1998; Lukkari i sar. 1999).
Artritis je bolest koja podrazumeva upalu zglobova. Zglobovi otiču, postaju kruti, bolni, crveni i vreli. Ovi simptomi mogu biti praćeni gubitkom telesne težine, povišenom temperaturom ili slabošću. Kada ovi simptomi traju duže od dve nedelje, uzrok može biti inflamatorni artritis, na pr. reumatoidni artritis. Upala zglobova može biti uzrokovana i infekcijom, koja može da dovede do septičkog artritisa. Veoma čest tip artritisa je i degenerativna bolest zglobova (osteoartritis).
Lekovi koji se često prepisuju za artritis i srodna stanja su nesteroidni antiiinflamatorni lekovi (NSAID). U NSAID spadaju aspirin i srodni lekovi. Međutim, NSAID su nespecifični lekovi koji imaju brojna neželjena dejstva uključujući i krvarenje iz želudca (Vidi vebsajt katedre za Ortopediju Univerziteta Vašington o artritisu, Frederick Matsen (šef katedre), www. orthpr. washington. edu). Uz NSAID, za ublažavanje znakova i simptoma osteoratritisa i reumatoidnog artritisa kod odraslih, koristi se i Celebrex™, jedan inhibitor ciklooksigenaze (C0X-2). On je indikovan i za lečenje pacijenata s porodičnom adenomatoznom polipozom.
W0 01/0029 opisuje jednu kombinaciju antagonista faktora tumorske nekroze (TNF) i inhibitora COX-2 za lečenje inflamacije.
Antagonisti TNF se koriste i za lečenje artritisa. Antagonisti TNF su opisani, na pr. u WO 9103553.
Novija istraživanja pokazuju da interleukin IL-18 igra proinflamatornu ulogu u metabolizmu kostiju. Olee i sar. (1999) pokazali su da se IL-18 produkuje u artikularnim hondrocitima i izaziva proinflamatorni i katabolički odgovor. IL-18 mRNK je indukovan IL-1 p u hondrocitima. Hondrociti su produkovali prekursore IL-18 i kao odgovorna stimulaciju IL-1 sekretovali zrelu formu IL-18. Ispitivanja dejstva IL-18 na hondrocite dalje pokazuje da on inhibira TGF-p-indukovanu proliferaciju i pojačava produkciju azot oksida. IL-18 je stimulisao ekspresiju nekoliko gena kod normalnih humanih artikularnih hondrocita uključujući i inducibilnu azot oksid sintazu, inducibilnu ciklooksigenazu, IL-6 i stromelizin. Ekspresija gena je praćena sintezom odgovarajućih proteina. Lečenje normalne humane zglobne hrskavice sa IL-18 povećavalo je oslobađanje glukozaminoglikana. Ovi nalazi su identifikovali IL-18 kao citokin koji reguliše odgovor hondrocita i doprinosi degradaciji hrskavice.
Saha i sar. (1999) su izvšili lokalizaciju lnterleukin-ip-konvertujućeg enzima (ICE)/kaspaze-1 u humanom osteoartritičnom tkivu i njegove uloge u maturaciji interieukinip i interieukin-18. Saha i saradnici su ispitivali ekspresiju i produkciju kaspaze-1 u humanoj normalnoj i osteoartritičnoj (OA) hrskavici i sinovijumu, kvantifikovali nivoe ICE u OA hondrocitima i ispitivali odnos između topografske distribucije ICE, interleukina -ip (IL-1P( i IL-18, kao i apoptoze hondrocita. Eksperimenti obavljeni u voj studiji pokazali su daje ICE eksprimiran i sintetizovan i u humanoj sinovijalnoj membrani i hrskavici, sa signifikantno više ćelija koje se prebojavaju pozitivno u OA tkivu nego u normalnom tkivu. Produkcija ICE je preferencijalno locirana u površinskim i gornjim srednjiim slojevima zglobne hrskavice. Produkcija zrelih IL-1 p u eksplantu OA hrskavice i hondrocitima bila je potpuno blokirana tretmanom specifičnim ICE inhibitorom koji je takođe znatno inhibirao i broj IL-18-pozitivnih ćelija. Odnos između aktivnih IL-1 p i ICE govori da ICE možda promovišu progresiju OA aktiviranjem proinflamatornih citokina, kao i da IL-18 možda igra ulogu u patologiji hrskavice.
Gracie i sar. (1999) su ukazali na proinflamatornu ulogu IL-18 u reumatoidnom artritisu. Gracie i saradnici su otkrili IL-18 mRNK i protein u sinovijalnom tkivu kod reumatoidnog artritisa u signifikantno većem broju nego kod osteoartritičnih kontrola. Pokazano je i da kombinacija IL-12 ili IL-15 sa IL-18 indukuje produkciju IFN-y od strane sinovijalnog tkivain vitro.Štaviše, davanje IL-18 miša imunozovanog kolagenom/nekompletnim Freundovim adjuvantom olakšavalo je razvoj erozivnog, inflamatornog artritisa, ukazujući na to da IL-18 može biti proinflamatoran in vivo.
Međutim, do danas, nezavisno od hemijskih jedinjenja, pokazano je da samo blokada TNFa i IL-1 (3 korišćenjem solubilnih receptora ili monoklonskih antitela smanjuje artritis izazvan kolagenom kod miša (CIA, što je mišji model za reumatoidni artritis) (VVilliams i sar. 1994) i zbog toga je predloženo da se koristi kao terapija za reumatoidni artritis.
Izraz «hronična ili idiopatska bolest creva» obuhvata bar dva stanja: Kronovu bolest i ulcerozni kolitis. Obe su bolesti gastrointestinalnog trakta. Kronova bolest najčešće pogađa tanko crevo. Kada zahvati i kolon, može se pokazati problematičnim difrerencijalna dijagnoza od ulceroznog kolitisa (vidi dole).
Hronična inflamacija i ulceracija kod Kronove bolesti obično započinju sa bilo obrstrukcijom tankog creva ili abdominalnim bolom koji može da liči na akutni apendicitis. Druge kliničke slike mogu da se odnose na komplikacije ove bolesti. Tok bolesti je (ironičan, i može doći do pogoršanja i remisija uprkos terapiji. Početak je obično kod mlađih odraslih, gde oko polovine svih slučajeva započinje između 20 i 30 godine života, a 90% između 10 i 40%. Oboleva nešto više muškaraca nego žena.
Mikroskopija daje makro sliku. Zahvaćenost inflamacijom nije kontinuirana: više fokalna ili rasuta. Kolekcije limfocita iu ćelija plazme nalaze se uglavnom u mukozi i submukozi, ali obično zahvataju sve slojeve (transmuralna inflamacija). Klasični mikroskopski nalaz kod Kronove bolesti je prusustvo granulskih ćelija okruženih obručem limfocita. Incidenca indiopatske inflamatorne bolesti creva pokazuje značajne geografske varijacije. Ove bolesti su daleko češće u severnoj Evropi i SAD nego u zemljama južne Evrope, Africi, Južnoj Americi i Aziji, iako pojačana urbanizacija i prosperitet dovode do veće incidence i u delovima južne Evrope i Japana (General and Systemic Pathology (Opšta i sistematska patologija), Churchill Livingstone, treće izdanje, 2000, JCE, Undervvood, Ed.)
Kod Kronove bolesti, klinički postoje dve glavne grupe, prva obuhvata pacijente koji ulaze u trajne remisije u roku od tri godine po početku bolesti, a druga one kod kojih bolest traje duže od tri godine.
Kakva god daje etiologija bolesti, postoje dokazi od perzistenciji i neodgovarajućoj aktivaciji T-ćelija i makrofaga u Kronovoj bolesti s povećanom
produkcijom proinflamatornih citokina, pre svega interleukina (IL) 1, 2, 6 i 8, Interferona (INF)-y i a-faktora tumorske nekroze (TNF). Kronova bolest se odlikuje održanim (hroničnim) zapaljenjem praćenim fibrozom. Proces proliferacije fibroblasta i depozita kolagena može da bude posredovan tranformacijom faktora rasta p koji ima određeno antiinflamatorno dejstvo, prevashodno regrutaciju fibroblasta, sintezu matriksa i nishodnu regulaciju zapaljenskih ćelija, ali je verovatno da će u ovo biti uključeni i brojni drugi medijatori.
Ulcerozni kolitis je jedan nespecifični zapaljenski poremećaj debelog creva, koji obično počinje od rektuma i širi se proksimalno u promenljivoj meri. Za razliku od Kronove bolesti ulcerozni kolitis je ograničen na debelo crevo.
Postoje sve brojniji dokazi koji govore daje ulcerozni kolitis posledica izmenjene autoimune reaktivnosti do koje dovode citokini, proteaze i reaktivni kiseonički metaboliti iz makrofaga i neutrofila. Ovaj drugi mehanizam oštećenja epitela kolona nazvan je povredom «nevinog posmatrača». Dokaz u korist autoimunosti jeste prisustvo samoreaktivnih T-limfocita i autoantitela protiv epitelnih i endotelijalnih ćelija kolona, kao i anti neutrofil citoplazmična autoantitela (ANCA). Međutim, ulcerozni kolitis ne treba smatrati autoimunim oboljenjem u kome je povreda mukoze direktna posledica imunološke reakcije na auto-antitela (General and Svstematic Pathologv( Opšta i sistematska patologija),gore).
Što se tiče terapije Kronove boelsti, većina ljudi se prvo leče lekovima sa sadržajem mesalamina, supstancom koja pomaže da se kontroliše zapaljenje. Pacijenti koji od ovoga nemaju koristi ili koji ovaj lek ne podnose, mogu da dobijaju druge lekove sa sadržajem mesalamina koji se obično nazivaju 5-ASA. U moguća neželjena dejstva mesalaminskih preparata spadaju mučnina, povraćanje, gorušica, dijareja i glavobolja.
Neki pacijenti za kontrolu inflamacije uzimaju kortikosteroide. Ovi lekovi su najefikasniji za aktivnu Kronovu bolest, ali mogu da dovedu i do težih neželjenih dejstava, uključujući i podložnost infekciji.
Za lečenje Komove bolesti koriste se i lekovi koji suprimiraju imuni sistem. Najčešće se prepisuje 6-merkaptopurin i jedan srodan lek, azatioprin. Imunosupresivni agensi deluju blokiranjem imune reakcije koja doprinosi inflamaciji. Ovi lekovi mogu da dovedu do neželjenih dejstava kao što su mučnina, povraćanje i dijareja i mogu da snize rezistenciju ljudi na infekciju. Kada se pacijenti leče kombinacijom kortikosteroida i imunosupresivnih lekova, doza kortikosteroida može, eventualno, da se smanji. Neka ispitivanja govore da imunosupresivni lekovi mogu da pojačaju dejstvo kortikosteroida.
Američka Uprava za hranu i lekove (FDA) je odobrila lek infliksimab za lečenje umerene do teške Kronove bolesti koja ne reaguje na standardnu terapiju (mesalaminske supstance, kortikosteroide, imunosupresivne lekove) kao i za lečenje otvorenih dreniranih fistula. Infliksimab, prva terapija odobrena specijalno za Kronovu boelst jeste jedno anti-TNF monoklonsko antitelo. Anti-TNF uklanja TNF iz krvotoka pre nego što stigne do creva, i na taj način sprečava zapaljenje.
Antitela se koriste za lečenje prekomemog bakterijskog rasta u tankom crevu izazvanog strikturom, fistulama ili operacijom. Za ovaj čest problem lekar može da prepiše jedan ili više od sledećih antibiotika: ampicilin, sulfonamid, cefalosporin, tetraciklin ili metronidazol.
Dijareja i bol u stomaku u vidu grčeva često prestaju kada se povuče zapaljenje, ali može biti neophodna i dodatna terapija. Može se koristiti nekoliko anti-dijareičnih agenasa uključujući difenoksilat, loperamid i kodein. Pacijenti koji su dehidrirani zbog dijareje obično se još tretiraju davanjem tečnosti i elektrolita.
Ostaje potreba za efikasnom terapijom za lečenje i/ili prevenciju zapaljenske bolesti creva, pre svega Kronove bolesti i ulceroznog kolitisa, koja će imati smanjena neželjena dejstva ili će biti idealno bez neželjenih dejstava.
I biološka i imunološka opažanja govore da ćelijski posredovani imunitet i aktivacija T ćelija predstavljaju ključne osobine Kronove bolesti. Ispitivanja na ljudima i eksperimentalnim modelima govore da u Kronovoj bolesti lokalni imuni odgovor ima tendenciju da buzde predominanto tipa Th1 (Desreumaux i sar.
1997( i da lokalno oslobođeni citokini kao što su IFN-y, IL.1B i TNF-a doprinose inflamatomom odgovoru i pospešuju ga (Reimund i sar. 1996).
Citokin IL-18 igra važnu ulogu u imunom odgovoru posredovanom Th1 u saradnji s citokinom 11-12 stimulacijom sekrecije IFN-y, pojačanjem citotoksičlnosti ćelija prirodnih ubica i stimulacijom diferencijacije Th1 ćelija (Uschito i sar. 1996). IL-18 deluje u sprezi sa IL-12, IL-2, antigenima, mitogenima i verovatno drugim faktorima, da se indukuje produkcija IFN-y. IL-18 takođe pojačava produkciju GM-CSF i IL-2, pojačava proliferaciju T ćelija indukovanu anti-CD3 i pojačava ubijanje ćelija prirodnih ubica posredovano Fas. Zreli IL-18 se proizvodi iz svojih prekursora uz pomoć IL-ip-konvertujućeg enzima (ICE, kaspaze-1). IL-18 receptor se sastoji od najmanje dve komponente, koje sarađuju u vezivanju liganda. Mesta vezivanja IL-18 visokog i niskog afiniteta nađena su u mišjim T ćelijama stimulisanim IL-12 (Okamoto i sar. 1998) što govori0receptorskom kompleksu sa multiplim lancima. Dve receptorske podjedinice su do sada identifikovane, gde obe pripadaju receptorskoj porodici IL-1 (Okamoto i sar. 1999). Provođenje signala IL-18 podrazumeva i aktivaciju NF-kB (Matsumoto i sar. 1997).
Nedavno je sugerisano da IL-18 imaju određene implikacije u zapaljenskoj bolesti creva (Pizarro i sar. 1999; Monteleone i sar. 1999).
Pizarro i saradnici (1999) su okarakterisali ekspresiju i lokalizaciju IL-18 u uzorcima kolona i izolovanoj populaciji mukoznih ćelija obolelih od Kronove bolesti. Koristeći semikavantitativni RT-PCR protokol, pokazali su da su IL-18 mRNK transkripti povećani kod sveže izolovanih intestinalnih epitelijalnih ćelija i mononukleamih ćelija lamine proprie obolelih od Kronove bolesti u poređenju sa onima sa ulceroznim kolitisom i kontrolnom grupom bez zapaljenja. IL-18 mRNK transkripti su bili obilniji u intestinalnim epitelijalnim ćelijama u poređenju sa mononuklearnim ćelijama lamine proprie. Imunohistohemijska analiza hirurški reseciranog kolonskog tkiva lokalizovala je IL-18 i na mononuklearnim ćelijama lamine proprie (pre svih makrofage i dendritske ćelije) kao i u intestinalnim epitelijalnim ćelijama. VVestern blot analiza je otkrila da se jedna 18,3-kDa traka, što je u skladu i sa rekombinantnim i sa zrelim humanim IL-18 proteinom, nalazi predominantno u bioptiranim uzorcima intestinalne mukoze kod Kronove bolesti (a ne kod ulceroznog kolitisa). Jedna druga traka od 24 kDa, koja odgovara neaktivnom IL-18 prekursoru, otkrivena je u bioptiranim uzorcima intestinalne mukoze u nezapaljenim oblastima kod obe grupe bolesnika, i bila je jedini oblik koji je nađen kod kontrolnih ispitanika bez zapaljenja.
Monteleone i saradnici (1999) su potvrdili ove nalaze. Celo mukozno intestinalno tkivo i mononukleame ćelije lamine proprie 12 pacijenata sa Kronovom bolešću i 8 sa ulceroznim kolitisom i 18 kontrolnih ispitanika sa nezapaljenskim oboljenjem creva testirano je na IL-187 semikvantitativnom RT-PCT tehnikom i VVestem blot analizom. U svim testiranim uzorcima nađeni su transkropti za IL-18. Međutim, povećana akumulacija IL-18 mRNK otkrivena je u uzoracima mononukleamih ćelija mukoze i lamine proprie pacijenata s Kornovom bolešću u poređenju s ulceroznim kolitisom i kontrolama. Kod Kronove bolesti, transkripti za IL-18 su bili brojniji u mukoznim uzorcima uzetim sa zahvaćenih oblasti. Jedna 18-kDa traka koja odgovara zrelom IL-18 predominanto je nađena u uzorcima sluznice kod Kronove bolesti. U uzorcima mukoze kontrola bez zapaljenja, IL-18 je bio prisutan kao jedan 24-kDa polipeptid. U skladu sa tim, aktivna podjedinica IL-18-konvertujućeg enzima (ICE) (p20) eksprimirana je u uzorcima obe grupe pacijenta (sa Kronovom bolešću i ulceroznim kolitisom), dok je kod mukoze debelog creva kontrola bez zapaljenja ICE sintetizovan samo kao prekursor (p45).
Dayer (1999) je preispitao različite i delimično kontradiktorne funkcije IL-18. Ukratko, IL-18 je jedan pleiotropni interleukin koji ima funkciju da pojača
zapaljenje i da ga smiri. S jedne strane, on pojačava produkciju proinflamatornih citokina kao što je TNFa, i na taj način promoviše inflamaciju.S druge strane, on indukuje produkciju NO, inhibitora kaspaze-1, i na taj način blokira maturaciju IL-1B i IL-18, i verovatno ublažava inflamaciju. Ova nejasna uloga IL-18 ozbiljno dovodi u pitanje efikasnost inhibitora 11-18 u zapaljenskim bolestima. Štaviše, zbog interakcije širokog spektra različitih citokina i hemokina u regulisanju inflamacije, blagotvorno dejstvo u terapiji ili prevenciji zapaljenskih bolesti blokiranjem samo jednog od učesnika nije predvidljivo.
KRAĆI OPIS PRONALASKA
Ovaj pronalazak zasniva se na nalazu da su inhibitori IL-18 efikasni za lečenje i/ili prevenciju različitih bolesti ili poremećaja.
Prvi cilj ovog pronalaska jeste da se obezbedi novi način za lečenje i/ili prevenciju oštećenja jetre. Ovaj pronalazak se zbog toga odnosi i na upotrebu inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju oštećenja jetre bilo daje akutna ili hronična. Specifičnije, ovaj pronalazak se odnosi na tretman i/ili prevenciju alkoholnog hepatitsa, virusnog hepatitisa, imunog hepatitisa, fulminantog hepatitisa, ciroze jetre i pre svega, bilijarne ciroze.
Drugi cilj ovog pronalaska jeste da se obezbedi novi način za tretman i/ili prevenciju artritisa. Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi i na upotrebu IL-18 inhibitora za pripremu medikamenata za tretman i/ili prevenciju artritisa. Lekovito dejstvo inhibitora IL-18 uključuje smanjenu težinu bolesti, kao i sprečavanje širenja bolesti. Ovaj nalaz je neočekivan, jer iz onoga šta se trenutno o tome zna, ne može se zaključiti da blokada jednog specifičnog faktora uključenog u artritis, znači interleukina IL-18, može da dovede do ublažavanja artritisa, pa čak i do izlečenja artritičnog zgloba.
Utvrđeno je i da davanje jednog inhibitora IL-18 značajno smanjuje eroziju hrskavice u mišjem modelu artritisa. Ovaj pronalazak se na taj način odnosi i na upotrebu inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenata za tretman i/ili prevenciju destrukcije hrskavice.
Treći cilj ovog pronalaska jeste da se obezbedi novi način za tretman i/ili prevenciju zapaljenske bolesti creva (IBD), pre svega Kronove bolesti i ulceroznog kolitisa. Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi i na upotrebu IL-18 inhibitora za pripremu medikamenata za tretman i/ili prevenciju IBD. U skladu sa ovim pronalaskom, utvrđeno je da su koncentracije IL-18BP mRNK i proteina povećane u inflamiranim regionima mukoze u biopsijama obolelih od Kronove bolesti. Štaviše, pokazano je da dva različita inhibitora IL-18 štite životinje od bolesti u mišjem modelu zapaljenske bolesti creva.
Korišćenje kombinacije jednog inhibitora IL-18 i/ili interferona \ Ju\ W antagoniste TNF i/ili jednog COX-2 inhibitora se takođe razmatra, u skladu sa ovim pronalaskom. Da bi se primenio genski terapijski pristup da se IL-18 dopremi na obolela tkiva ili ćelije, dodatni aspekti ovog pronalaska odnose se na ekspresiju vektora uključujući sekvence kodiranja jednog inhibitora IL-18 za tretman i/ili prevenciju stanja bolesti. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje engogene aktivacije gena inhibitora IL-18 i korišćenje ćelija podvrgnutih genetskom inženjeringu da se eksprimiraju inhibitori IL-18 za tretman i/ili prevenciju oštećenja jetre, artritisa i IBD.
KRAĆI OPIS CRTEŽA
Slikal. pokazuje histogram nivoa IFN-y u serumu (pg/ml) po injekciji različitih količina rekombinantnog IL-18BP (0; 0,04; 0,4, 4 mg/kg) u miša 1 h pre injekcije LPS. Uzorci krvi uzimani su 5 h po injekciji LPS i analizirani na IFN-y u cirkulaciji uz pomoć ELISA testa.
Slika 2. pokazuje histogram nivoa alanin aminotransferaze (ALT) u serumu.
Miševima koji su senzitivisani sa P. acne su ubrizgavane rastuće doze rekombinantnog humanog IL18BP (0; 0,04; 0,4, 4 mg/kg) pre injekcije LPS. Uzorci krvi uzimani su 5 h po injekciji LPS i mereni su nivoi ALT u serumu. SF - Sigma Frankel: 1 SF jedinica AST/ALT će oformiti 4,82 x 10"4jimol glutamata/ minuti pri pH 7,5 na 25°C.
Slika 3. pokazuje vreme preživljavanja miša po injekciji LPS. Miševima koji su senzitivisani sa P. acne su ubrizgavane rastuće doze rekombinantnog humanog IL18BP (0; 0,04; 0,4, 4 mg/kg) 20 minuta pre injekcije LPS. Trouglovi: 4 mg/kg; mali romb 0,4; veliki romb 0,04; krug bez IL18BP (samo LPS).
Slika 4. pokazuje histogram nivoa IFN-y u serumu mereno 5 h po injekciji različitih doza rekombinantnog humanog IL18BP (0; 0,4, 4 mg/kg) miševima koji su sezitivisani sa P. acne 20 minuta pre injekcije
LPS.
Slika 5. pokazuje vreme preživljavanja miša po injekciji bilo poliklonskog IL-18 antiseruma ili normalnog zečjeg seruma (NDS = kontrola) 30
minuta pre injekcije 40 mg/ml (letalna doza) LPS dobijenog od E. coli (Slika 5A) ili S: thvphimurium (SL. 5B). Trouglovi: miševi kojima je ubrizgan IL-18 antiserum; krugovi: miševi kojima je ubrizgan NDS. Na x osi su dani po provokaciji LPS.<*>p<0,05.
Slika 6. pokazuje histogram srednje vrednosti + SEM za pet miševa po grupi tretiranih na sledeći način. Miševima je intraperitonealno (i.p.) ubrizgavan bilo anti-IL-18 antiserum, rastvorljivi TNF receptori (TNFsRp55) ili nosač (fiziološki rastvor), a odmah zatim intravenski
(i.v.) im je dat konkavalin A (Con A; SI. 6A) ili PEA (Pseudomonas aeruginosa, SL. 6B).<**>p<0,01;<***>p<0,001 vs. samo Con A ili PEA;
# p<0,01 vs. bilo TNFsRp55 ili anti-IL-18 faktorijal ANOVA.
Slika 7. pokazuje dejstvo IL-18BP na kliničke skorove mišjeg modela artritisa. SI. 7A pokazuje dijagram kliničkih skorova merenih posle dnevrie administracije različitih količina IL-18BP ili IFN-B ili nosača (NaCI) i.p. (intraperitonealno); mišu. Simboli: crni trouglovi: 10.000 U IFN-B; beli trouglovi: 10 mg/kg IL-18BP, izokrenuti trouglovi: 3 mg/kg IL-18 BP;-rombovi: 1 mg/kg IL-18BP; krugovi: 0,5 mg/kg IL-18BP; beli kvadrati: 0,25 mg/kg IL-18BP, crni kvadrati: NaCI. Dani tretmana su prikazani na x osi, a srednje vrednosti kliničkih skorova na y osi. za statistiku je korišćen Mann-Whitney test. Na SI. 7B prikazan je histogram površine ispod krive (AUC) dobijen sa grafikona Slike 7A. n = broj životinja.
Slika 8. pokazuje dejstvo IL-18BP na otok šape. Na SI. 8A vidi se dijagram rezultata dobijenih merenjem debljine šape (otok) obolele zadnje šape životinja tretiranih različitim količinama IL-18BP. Na y osi prikazana je pramena debljine šape u milimetrima od početka tretmana. Simboli su isti kao na SI. 7. SI. 8B pokazuje histogram AUC dobijen sa Slike 8A. n = broj životinja.
Slika 9. pokazuje analizu broja obolelih zadnjih šapa u vreme akutnog artritisa, t.j. širenja bolesti na okolne zglobove. Simboli: crni kvadrati: NaCI (kontrola); trouglovi: 10 mg/kg IL-18BP; okrenuti trouglovi: 3 mg/kg IL-18BP; rombovi: 1 mg/kg IL-18BP; krugovi: 0,5 mg/kg IL-18BP; i beli kvadrati: 0,25 mg/kg IL-18BP.
Slika 10. pokazuje histogram skorova erozije hrskavice obolelih zglobova.
Slika 11. pokazuje histopatologiju zgloba miša. Na kraju eksperimenta, šapa u kojoj se prvo razvio artritis je disecirana, fiksirana i obrađena kako je opisano u primeru 10, dole. Slika 11A: normalni zglob miša; Slika 11B: zglob artritičnog miša; Slika 11C: zglob miša tretiranog sa
rhlL-18BP.
Slika 12. pokazuje histogram nivoa antikolagen tip II antitela izotipa lgG1
(beli stubići) miševa tretiranih sa 3 mg/kg IL-18BP i lgG2a (šrafirani stubići) miševa tretiranih fiziološkim rastvorom. Merenja su obavljana četvrtog (D4) ili osmog (8D) dana bolesti.
Slika 13. pokazuje histogram nivoa IL-6 u pg/ml životinja tretiranih sa 1, 3, ili 10 mg/kg IL-18BP, 10.000 U interferona p (IFN-p), normalnim mišjim serumom (NMS) ili fiziološkim rastvorom (NaCI).
Slika 14. pokazuje ekspresiju hil_-18BP i IL-18 mRNK transkripta u biopsijama creva obolelih od Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa i zdravih dobrovoljaca. Reprezentativnmi RT-PCR proizvodi su prikazani za IL-18BP, IL-18 i za housekeeping gen (p-aktin) (SI. 14A). Relativna kvantifikacija traka obojenih etidiumbromidom obavljena je korišćenjem Kodak Digital Imaging Sowftware i zabeležena je kao odnos ciljnog gena prema p-aktinu. Ciljni gen je IL-18 na SI. 14B i IL-18BP na SI. 14C.
Slika 15. pokazuje ekspresiju hiL-18BP transkripta i proteina u HUVEC
(humane ćelije endotelijuma pučane vrpce) i ekspresija proteina u THP1 (humana monocitna ćelijska linija). RNKje izolovana iz netretiranih endotelijalnih ćelija (medijum) i endotelijalnih ćelija stimulisanih sa IL-1p, TNFa, IFNy. Pozitivna kontrola: Kolon obolelih od Kronove bolesti; negativna kontrola: bez cDNK. Ekspresija IL-18BP i IL-18 je analizovana semikvantitativnom RT-PCR analizom (SI. 15A). Supernatant kulture netretiranog medijuma i po 24h aktivaciji sa IL-ip. TNFa, IFNy HUVEC (SI. 15B) ili THP1 (SI. 15C) ćelija analizirani su na produkciju IL-18BP i IL-18 ELISA testom.
Slika 16. pokazuje razvoj telesne težine između dana 1 i dana 10 kod mišjeg modela IBD posle intraperitonealne (ip) injekcije bilo fiziološkog rastvora (NaCI) ili IL-18BP (8 mg/kg). Pramena težine izražena je kao procenat promene telesne težine od prvog dana. Prikazane su srednje vrednosti i SEM dve grupe, 8 miševa po grupi.
Slika 17. pokazuje rezultate analize kolona, kaudalnih limfnih čvorova i slezine dobijenih od miševa obolelih od IBD tretiranih IL-18BP i netretiranih. Na SI. 17A vidi se težina poslednjih 6 cm kolona u mg. Na SI. 17B vidi se ukupni broj ćelija prisutnih u kaudalnom limfnom čvoru. Na SI. 17C vidi se procenat ćelija koje se prebojavaju pozitivno na CD4<*>/CD69<*>u slezini. Ovi podaci predstavljaju srednje vrednosti i SEM.<*>označava značajnu razliku.
Slika 18. pokazuje količinu IFNy (SI, 18A i B) i TNFa (SI. 18C i D)
proizvedenih posle 48 sati u ćelijama kaudalnog limfnog čvora (SI. 18A i C) i ćelijama slezine ( SI. 18C i D) po stimulaciji CD3/CD28 prisutnim u supertnatantima. Prikazane su srednje vrednosti i SEM.
Slika 19. pokazuje TNFa (SI. 19A) i IFNy )SI. 19B) sadržaj homogenata kolona. Podaci su korigovani za težinu kolona. Prikazane su srednje vrednosti i SEM.<*>označava značajnu razliku.
OPIS PRONALASKA
Ovaj pronalazak se zasniva na povoljnom dejstvu inhibitora IL-18 u različitim slučajevima i poremećajima.
Izraz «inhibitor IL-18» u kontekstu ovog pronalaska odnosise na svaki molekul koji modulira produkciju IL-18 i/ili dejstvo na takav način da produkcija IL-18 i/ili dejstvo budu ublaži, smanjeni, ili delimično, substancijalno ili potpuno sprečeni ili blokirani. Izraz «inhibitor IL-18» ima za cilj da obuhvati inhibitor produkcije IL-18 kao i inhibitore delovanja IL-18.
Inhibitor produkcije može da bude ma koji molekul koji negativno deluje na sintezu, procesiranje ili maturaciju IL-18. U inhibitore obuhvaćene ovim pronalaskom mogu da spadaju, na primer, supresori genske ekspresije interleukina IL-18, antisens mRNK koja smanjuje ili sprečava transkripciju IL-18 mRNK ili dovodi do degradacije mRNK, slabljenje pravilnog savijanja proteina , ili delimično ili znatno sprečavanje sekrecije IL-18, proteaze koja razgrađuje IL-18 kada se ovaj jednom sintentizuje, inhibitore proteaze koji cepaju pro IL-18 da bi se generisao zreli IL-18, kao što su inhibitori kaspaze-1 i slično.
Inhibitor delovanja 11-18 može na primer, da bude i antagonista IL-18. Antagonisti mogu ili da vezuju ili da odvajaju sam molekul IL-18 s dovoljnim afinitetom i specifičnošću da delimično ili znatno neutralizuju IL-18 ili mesta vezivanja IL-18 koja su odgovorna za vezivanje IL-18 za ligande (kao, na pr. za svoje receptore). Antagonista može i da inhibira signalni put IL-18 koji se aktivira u ćelijama po vezivanju IL-18 za receptore.
Inhibitori delovanja IL-18 mogu da budu i rastvorljivi receptori IL-18 ili molekuli koji podražavaju ove receptore, ili agensi koji blokiraju ove IL-18 receptore ili IL-18 antitela, kao što su poliklonska ili monoklonska antitela, ili ma koji drugi agens ili molekul koji sprečava vezivanje IL-18 za svoje ciljeve, i na taj način smanjuje ili sprečava okidanje intra- ili ekstraćelijskih reakcija posredovanih preko IL-18.
Po prvom aspektu ovog pronalaska, inhibitori ili IL-18 koriste se za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju oštećenja jetre. Pre svega, ovaj pronalazak se odnosi na korišćenje inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju akutnih i hroničnih oboljenja jetre, i, još više, alkoholnog hepatitisa, virusnog hepatitisa, imunog hepatitisa, fulminantnog hepatitisa, ciroze jetre i primame bilijarne ciroze.
Izraz oštećenje jetre ili oboljenje jetre u smislu u kome se ovde koristi, obuhvata čitav niz različitih patoloških stanja. Nekoliko uslova o kojima se razmišlja u ovom pronalasku detaljno je objašnjeno u «Stanju tehnike», gore. Druge bolesti jetre koje se mogu lečiti i/ili prevenirati po ovom pronalasku uključuju, na primer, pirogeni apsces jetre. On se naziva i bakterijskom jetrom, i predstavlja šupljinu u jetri koja proizvodi gnoj. Uzroci apscesa jetre su brojni. Može se razviti od abdominalne infekcije kao što je apendicitis, divertikulitis ili perforacija creva; infekcije krvi; infekcije iz bilijamog trakta (sekrecija jetre); ili traume kada se nagnječena jetra inficira. Najčešći organizmi koji uzrokuju apsces jetre su Escherichia coli, Proteus vulgaris i Enterobacter aerogenes. Incidencaje 1 na 10.000 ljudi.
Alkoholna oboljenja jetre mogu da se leče i/ili preveniraju korišćenjem inhibitora IL-18 u skladu sa ovim izumom. Ovde spadaju akutno i hronično zapaljenje jetre izazvano zloupotrebom alkohola. Alkoholni hepatitis obično nastaje posle godina prekomernog pijenja. Što je duže trajanje upotrebe alkohola, veća je verovatnoća da će se razviti bolest. Neuhranjenost se razvija kao posledica praznih kalorija iz alkohola, smanjenog apetita, kao i loše apsorpcije (nedovoljne apsorpcije hranljivih materija iz intestinalnog trakta). Neuhranjenost doprinosi oboljenju jetre. Toksičnost etanola za jetru, individualna podložnost alkoholom izazvanoj bolesti jetre i genetski faktori takođe doprinose razvoju alkoholnog oboljenja jetre.
U skladu sa ovim pronalaskom, ciroza jetre može da se tretira i/ili spreči korišćenjem inhibitora IL-18. Ciroza je hronično oboljenje jetre koje uzrokuje oštećenje hepatičkog tkiva, ožiljavanje jetre (fibroza, nodularna regeneracija), progresivno slabljenje hepatičke funkcije, prekomernu količinu tečnosti u abdomenu (ascites), poremećaje krvarenja (koagulopatija), povećani pritisak u krvnim sudovima (portalna hipertenzija) i poremećaje funkcije mozga (hepatička encefalopatija). Oštećena i ožiljena jetra postaje nesposobna da adekvatno uklanja otpadne materije (toksine) iz krvi, i stvaranje ožiljnog tkiva dovodi do povećanja pritiska (portalna hipertenzija) u venama između creva i slezine do jetre. Prekomerno konzumiranje alkohola je vodeći uzrok ciroze. U ostale uzroke spadaju infekcije (kao što je hepatitis), bolesti i defekti žučnog drenažnog sistema (kao što je bilijarna stenoza ili obstrukcija), cistična fibroza i povećana apsorpcija gvožđa i baka.
Tip ciroze zavisi od uzročnika bolesti. Komplikacije ciroze mogu biti teške. U SAD ciroza je deveti vodeći uzrok smrti. Neurološki problemi (kao što je hepatička encefalopatija) mogu da se razviju. Povećana kolekcija tečnosti u abdominalnoj šupljini (ascites) izazvana je smanjenom količinom proteina u telu, povećanjem natrijuma i povećanjem pritiska u krvnim sudovima jetre (portalna hipertenzija). Portalna hipertenzija može da dovede do povećanog pritiska, veličine i punoće u krvnim sudovima ezofagusa (ezofagealni variksi). Mogu da se razviju problemi sa krvarenjem i zgrušavanjem. Povećani pritisci u krvnim sudovima i problemi sa zgrušavanjem krvi mogu da povećaju verovatnoću teške i po život opasne hemoragije.
Još jedan poremećaj koji treba da bude obuhvaćen izrazom «oštećenja jetre» u skladu sa ovim pronalaskom jeste autoimuni hepatitis. To je zapaljenje jetre izazvano interakcijom s imunim sistemom. Autoimuni hepatitis je tip hroničnog aktivnog hepatitisa. Ćelijske imune reakcije mogu da budu uzrok hroničnog aktivnog hepatitisa. Niz cirkulišućih autoantitela mogu da se nađu u krvi bolesnika s hroničnim aktivnim hepatitisom. I druge autoimune bolesti mogu da budu povezane $ hroničnim aktivnim hepatitisom ili mogu da nastanu kod rođaka ljudi sa hroničnim aktivnim hepatitisom. U ove bolesti spadaju tiroiditis, diabetes mellitus, ulcerozni kolitis, Kumbs-pozitivna hemolitična anemija, proliferativni glomerulonefritis i Sjorgenov sindrom. U faktore rizika mogu da spadaju ove bolesti ili faktori rizika povezani sa hroničnim aktivnim hepatitisom. Incidencaje4 na 10.000 ljudi.
Bilijarna atrezija je još jedan poremećaj obuhvaćen izrazom «oštećenja jetre». On predstavlja opstrukciju žučnih kanala izazvanih time što se do rođenja nisu normalno razvijali (in utero). Bilijarna atrezija je izazvana abnormalnim i neadekvatnim razvojem žičnih kanala u jetri ili izvan nje. Svrha bilijarnog sistema jeste da uklanja otpadne proizvode iz jetre, i da nosi žučne soli koje su neophodne za varenje masti u tanko crevo. U ovom stanju, žučni protok iz jetre do žučne kese je blokiran. Ovo može da dovede do oštećenja jetre i ciroze jetre koja je, ako se ne leći, na kraju fatalna.
U skladu sa ovim pronalaskom, inhibitori IL-18 se koriste i za proizvodnju
lekova za lečenje i/ili prevenciju hroničnog aktivnog hepatitisa, koji se naziva još i hroničnim agresivnim hepatitisom . On predstavlja nastavak inflamacije jetre koja oštećuje hepatičke ćelije. U uzroke hroničnog aktivnog hepatitisa spadaju virusne infekcije, reakcija na lekove/ unošenje lekova, metabolički poremećaji, ili imune bolesti. Ne mora ni biti očiglednog uzroka. Ova bolest se odlikuje nekrozom ili smrću ćelija jetre, aktivnim zapaljenjem i fibrozom koja može da dovede do prestanka rada jetre, ciroze i smrti. Incidenca je 1 na 10.000 ljudi. U faktore rizika ubrajamo autoimune bolesti, prethodnu infekciju hepatitisom C ili pozitivni hepatitis A ili B u trajanju od preko 6 meseci.
Hronični perzistentni hepatitis je blaga, neprogresivna forma zapaljenja jetre i predstavlja bolest koja se obuhvata izrazom «oštećenje jetre» u skladu sa ovim pronalaskom.
U skladu sa ovim pronalaskom, inhibitori IL-18 se koriste i za poizvodnju medikamenata i lečenje i/ili prevenciju primarne bilijarne ciroze (PBS). PBS je jedno zapaljensko stanje koje nastaje od opstrukcije žučnog protoka u jetri, koje uzrokuje oštećenje ćelija jetre. Žučni kanali u jetri postaju zapaljeni iz nepoznatog razloga. Ova bolest najčešće pogađa sredovečne žene. Početak simptoma je postepen, gde je svrab kože prvi simptom. Dolazi do upale žučnih puteva u jetri. Na kraju se razvija ciroza jetre. Ova bolest može da bide praćena autoimunim poremećajima. Incidencaje 8 na 100.000 ljudi. Inhibitori IL-18 o kojima je ovde reč mogu da se koriste i za lečenje akutnog hepatičkog trovanja, na pr. izazvanog velikom količinom paracetamola. Ovakvo akutno trovanje jetre može da bude posledica prekomerne doze paracetamola, bilo slučajno ili namerno.
Kao što je pokazano na primerima dole, pronalazači ovog pronalaska su s iznenađenjem utvrdili da su inhibitori IL-18 posebno efikasni za prevenciju i lečenje fulminantnog (akutnog) hepatitisa. Prema tome, ovaj pronalazak se po mogućstvu odnosi na prevenciju i/ili lečenje fulminantnog (akutnog) hepatitisa.
U skladu sa drugim aspektom ovog pronalaska, inhibitori IL-18 se koriste za proizvodnju medikamenata za prevenciju i/ili lečenje artritisa.
Izraz «artritis» se ovde koristi u značenju koje obuhvata sve različite forme artritisa i artritičnih stanja, i akutni i hronični artritis, kako je definisano na primer na vebsajtu Katedre za ortopediju Univerziteta Vašington o artritisu ( wwvv. orthop. washinqton. edu). U primere artritičnih stanja spadaju ankilozirajući spondilitis, bol u leđima, sindrom karpalnih naslaga, Ehlers-Danlosov sindrom, giht, juvenilni artritis, lupus eritematozus, miozitis, osteogenesis imperfecta, osteoporoza, poliarteritis, polimiozitis, psoijatični artritis, Rajterov sindrom, skleroderma, artritis s oboljenjem creva, Behčetova bolest, dečji artritis, degenerativna bolest kostiju, firbomijalgija, infektivni artritis, Lajmova boelst, Marfanov sindrom, osteoartritis, osteonekroza, Padžetova bolest, reumatična polimialgia, Sjorgenov sindrom, porodična adenomatozna polipoza, i slično.
Po mogućstvu, u skladu sa ovim pronalaskom, inhibitori IL-18 se daju za lečenje i/ili prevenciju inflamatomog artritisa. Inflamatorni artritis se klasifikuje kao hronični artritis, u skladu sa perzistentnim, kontinuiranim i recidivirajućim tokom ove bolesti.
U preferencijalnom obliku ovog pronalaska, inflamatorni artritis je reumatoidni artritis (RA). RA izaziva zapaljenje u omotaču kostiju (sinovijalna membrana, jednoslojni ćelijski epitelijum) i/ili unutrašnjim organima. Ova bolest ima tendenciju da perzistira godinama, tipično pogađa mnoge različite organe u telu i na kraju može da dovede do oštećenja hrskavice, kostiju, tetiva i ligamenata. Zglobovi koji mogu da budu zahvaćeni RA su, na primer, oni zglobovi koji se nalaze u vratu, ramenima, laktovima, kukovima, ručjima, šakama, kolenima, skočnim zglobovima i stopalima. U mnogim slučajevima u RA su zglobovi zapaljeni na simetričan način.
Prevalencija RA u populaciji SAD je oko 1%, i distribuirana je u svim etničkim i starosnim grupama. Ova se bolest javlja širom sveta, a žene obolevaju od RA tri puta češće od muškaraca.
Kao što je pokazano u primerima dole, pokazano je da inhibitor IL-18 ima visoko efikasno blagotvorno dejstvo na eroziju hrskavice. Prema tome. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje inhibitora IL-18 u proizvodnji medikamenata za lečenje i/ili prevenciju destrukcije hrskavice, t.j. na korišćenje inhibitora IL-18 kao hondroprotektivnog agensa. Inhibitori IL-18 mogu da se koriste u svakom stanju u kome dolazi do destrukcije hrskavice ili njene erozije. Destrukcija hrskavice je progresivno slabljenje strukturnog integriteta zglobne hrskavice. Ono se javlja u stanjima koja pogađaju zglobnu hrskavicu kao što je reumatoidni artritis, juvenilni reumatoidni artritis ili osteoartritis, ali, na primer, i infektivni sinovitis.
Treći aspekt ovog pronalaska odnosi se na korišćenje inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju zapaljenske bolesti creva. Ono se bazira na nalazima da su inhibitori IL-18 ushodno regulisani u zapaljenoj mukozi obolelih od Kronove bolesti (KB). Dalje se bazira na nalazu da davanje inhibitora IL-18 ima protektivno dejstvo na mišji model kolitisa. -
Ushodna regulacija inhibitora IL-18 u oboleloj mukozi obolelih od KB već je opisana u stanju tehnike (Montelone i sar. 1999; Pizaro i sar. 1999).
Pošto smo pokazali prisustvo visokih količina IL-18BP u zapaljenim regionima intestinalne mukoze u skladu sa ovim pronalaskom, još više nas je iznenadilo kada smo našli i izraženo dejstvo IL-18BP kada se sistemski daje na razvoj kolitisa i simptome kolitisa na životinjskom modelu, lako je IL-18BP već endogeno ushodno regulisan u crevima obolellih od KB, kao to je pokazano u primerima datim dole, izgleda da količina IL-18BP koji je telo u stanju da proizvede nije dovoljna da se izbori sa bolešću.
Preferencijalno je u skladu sa ovim pronalaskom zapaljenska bolest creva Kronova bolest ili ulcerozni kolitis.
U preferiranom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se odabire iz inhibitora kaspaze-j (ICE), antitela protiv IL-18, antitela protiv ma koje od receptorskih podjedinica IL-18, inhibitora signalnog puta IL-18, antagonista IL-18 koji su u kompeticiji sa IL-18 i blokiraju IL-18 receptor, i proteini koji vezuju IL-18, izoforme, muteini, fuzirani proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili njihovi cirkularno permutovani derivati koji imaju istu aktivnost.
Izraz «proteini koji vezuju IL-18» ovde se koristi kao sinonim za «IL18BP». On obuhvata proteine koji vezuju IL-18 kako su definisani u WO 99/09063 ili u Novick i sar. 1999, uključujući i varijantu ukrojavanja odnosno nadovezivanja i/ili izoforme proteina koji vezuju IL-18, kako ih je definisao Kim i sar. 2000. Pre svega, humane izoforme a i c IL18BP su korisne u skladu sa ovim pronalaskom. Korisni proteini u skladu sa ovim pronalaskom mogu biti glikozilirani ili ne-glikozilirani, mogu biti izvedeni iz prirodnih izvora, kao što je urin, ili mogu da se proizvedu rekombinanntom tehnikom. Rekombinantna ekspresija može da se obavi u sistemima prokariotske ekspresije kao E. coli ili eukariotske i po mogućstvu u sistemima ekspresije sisara.
U smislu u kome se ovde koristi, izraz «muteini» odnosi se na analoge jednog IL-18BP ili analoge virusnog IL-18BP, gde jedan ili više aminokiselinskih ostataka prirodnog IL-18BP ili virusnog IL-18BP biva zamenjen različitim aminokiselinskim ostacima, ili se briše, ili se jedan ili više aminokiselinskih ostataka dodaje prirodnoj sekvenci IL-18BP, ili virusnom IL-18BP ne menjajući znatnije aktivnost rezultantnog proizvoda u poređenju sa divljim tipom IL-18BP ili virusnim IL-18BP. Ovi muteini se pripremaju poznatom sintezom i/ili mutagenim tehnikama usmerenim na određeno mesto, ili ma kojom drugom primerenom tehnikom.
Svaki ovakav mutein po mogućstvu ima sekvencu amino kiselina dovoljno sličnu jednom IL-18BPO, ili koja dovoljno podražava virusni IL-18BP tako da ima supstancijalno istu aktivnost kao IL-18BP. Jedna aktivnost IL-18BP jeste njegova sposobnost da vezuje IL-18. Sve dok mutein ima supstancijalnu vezivnu sposobnost za IL-18, može se koristiti za purifikaciju IL-18, afinitetnom hromatografijom, i na taj način se može smatrati da ima supstancijalno istu aktivnost kao i IL-18BP. Prema tome, može se odrediti da li svaki dati mutein ima supstancijalno istu aktivnost kao i IL-18BP uz pomoć rutinskih eksperimenata koji obuhvataju podvrgavanje takvog muteina, na pr. prostom eseju sendvič kompeticije da se odredi da li se on vezuje ili se ne vezuje za odgovarajuće obeleženi IL-18 , kao što je radioimunoesej ili ELISA test.
Muteini ili IL-18BP polipetidi ili muteini virusnog IL-18BP koji mogu da se koriste u skladu sa ovim pronalaskom, ili kodiranje nukleinskih kiselina za njih,
uključuje konačni skup supstancijalno odgovarajućih sekvenci kao supstitucionih peptida ili polinukeida koji rutinski mogu da se dobiju jednim postupkom iz stanja tehnike, bez nepotrebnog eksperimentisanja, na osnovu pouke i smernica koji su ovde izloženi.
Preferencijalne promene za muteine u skladu sa ovim pronalaskom su one koje su poznate kao «konzervativne» supstitucije. Konzervativne supstitucije amino kiselina IL-18BP polipetida ili proteina iuli virusnih IL-18BP, mogu da uključe sinonimne amino kiseline u grupi koja ima dovoljno slična fizikohemijska svojstva da supstitucija među članovima ove grupe čuva biološku funkciju molekula (Grantham, 1974). Jasno je da umetanje i brisanje amino kiselina može da se obavi i u gore definisanim sekvencama ne menjajući njihovu funkciju, posebno ako ova umetanja ili brisanja uključuju samo nekoliko amino kiselina, na pr. manje od trideset, a po mogućstvu manje od deset, i ne uklanja, niti pomera aminokiseline koje su ključne za funkcionalnu konformaciju, na pr. cisteinski ostatak. Proteini i muteini koji su proizvod takvih umetanja i/ili brisanja spadaju u okvire ovog pronalaska.
Po mogućstvu, grupe sinonimnih amino kiselina su one definisane na Tabeli 1. Bilo bi još poželjnije da su grupe sinonimnih amino kiselina one koje su definisane na Tabeli II; na najbolje bi bilo da su grupe sinonimnih amino kiselina one koje su definisane na Tabeli III.
Primeri produkcije supstitucije amino kiselina u proteinima koji mogu da se koriste za dobijanje muteina IL-18BP polipetida ili proteina, ili muteina virusnog IL-18BP za upotrebu u ovom pronalasku uključuju svaku poznatu metodu ili korak, kao što su oni predstavljeni u SAD patentima RE 33.653, 4,959.314, 4.588.585 i 4.737.462 koji se vode na Marka i sar, 5.116.943 na Kothsa i sar., 4.965.195 na Namena i sar., 4.879.111 na Chonga i sar., i 5.017.691 na Lee i sar, i proteini supstituisani lizinom predstavljeni u SAD patentu br 4.904.584 (Shaw i sar).
Izraz «fuzirani protein« odnosi se na polipeptid koji obuhvata jedan IL-18BP, ili virusni IL-18BP, ili mutein ili njegov fragment, fuziran s drugim proteinom, koji, na primer, ima produženo vreme boravka u telesnim tečnostima. Prema tome, jedan IL-18BP ili virusni IL-18BP mogu da se spoje sa drugim proteinom, polipeptidom ili slično, na pr imunoglobulinom ili njegovim fragmentom.
«Funkcionalni derivati» u smislu u kome se taj izraz ovde koristi obuhvata derivate IL-18BP ili virusnog IL-18BP, i njihove muteine i fuzirane proteine, koji mogu da se pripreme od funkcionalnih grupa koje se pojavljuju kao bočni lanci na ostatcima ili N- ili C-terminalnim grupama, na način koji je poznat u tehnici, i uključeni su u ovaj pronalazak sve dok su farmaceutski prihvatljivi, t.j. ne uništavaju aktivnost proteina koja je supstancijalno ista kao aktivnost IL-18BP ili virusnog IL-18BP, i ne donose toksična svojstva preparatima koji ih sadrže.
Ovi derivati mogu, na primer, da uključe polietilenske glikolne bočne lance, koji mogu da maskiraju antigenska mesta i prošire boravak IL-18BP ili virusnog IL-18BP u telesnim tečnostima. U druge derivate spadaju alifatični estri karboksilnih grupa, amidi karboksilnih grupa reakcijom sa amonijakom ili primamim ili sekundarnim aminima, N-acil derivati slobodnih amino grlupa ostataka amino kiselina oformljenih sa acilnim delovima (na pr alkanoil ili karbociklične aroil grupe) ili O-acil derivati slobodnih hidroksilnih grupa (na primer ostataka serila ili treonila) oformljene sa acilnim delovima.
Pod pojmom «aktivne frakcije» IL-18BP ili virusnog IL-18BP, muteina ili fuziranih proteina, ovaj pronalazak pokriva svaki fragment ili prekursor polipeptidnog lanca samog proteinskog molekula ili zajedno sa pratećim molekulima ili ostatcima vezanim za njega, na pr. šećer ili fosfatni ostatci, ili agregati proteinskih molekula ili šećerni ostatci sami, pod uslovom da ove frakcije imaju supstancijalno istu aktivnost kao i IL-18BP.
U daljem preferencijalnom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 je i IL-18 antitelo. Anti-IL-18 anitela mogu biti poliklonska ili monoklonska, himerska, humanizovana, ili potpuno humana. Njihova rekombinantna antitela i fragmenti se odlikuju visokim afinitetom vezivanja za IL-18 in vivo i niskom toksičnošću. Antitela koja mogu da se koriste u ovom pronalasku odlikuju se svojom sposobnošću da se leće bolesnici tokom perioda dovoljnog da se postigne dobra do odlična regresija,ili uklanjanje patogenog stanja ili ma kog simptoma ili grupe simptoma koji su vezani za to patogeno stanje, i niskom toksičnošću.
Neutralizujuća antitela se lako dobijaju kod životinja kao što-je zec, koza ili miš imunizacijom IL-18. Imunizovani miševi su posebno pogodni za obezbeđivanje izvora B ćelija za proizvodnju hibridoma, koji se, za uzvrat gaje za proizvodnju velikih količina anti IL-18 monoklonskih antitela.
Himerska antitela su imunoglobulinski molekuli koji se odlikuju sa dva ili
više segmenata ili delova koji se dobijaju iz različitih životinjskih vrsta. Generalno, promenljivi region himerskih antitela se dobija iz antitela ne-humanog sisara, kao što je mišje monoklonsko antitelo, a konstantni region imunoglobulina se izvodi iz molekula humanog imunoglobulina. Po mogućstvu, oba regiona i kombinacija imaju nisku imunogenost kako se ona rutinski određuje (Elliot i sar. 1994). Humanizovana antitela su molekuli imunoglobulina koji se proizvode tehnikama genetskog inženjeringa u kojima konstantni mišji regioni bivaju zamenjeni humanim delovima, a zadržavaju mišje regione za vezivanje antigena. Dobijeno mišje-humano himersko antitelo po mogućstvo ima smanjenu imunogenost i poboljšanu farmakokinetiku kod ljudi (Knight i sar. 1993).
Tako, u dodatnom preferencijalnom obliku, IL-18 antitelo je humanizovano IL-18 antitelo. Preferencijalni oblici humanizovanih anti-IL-18 antitela opisani su, na primer, u Evropskoj patentnoj prijavi EP 0 974 600.
U još jednom preferencijalnom obliku, IL-18 antitelo je potpuno humano. Tehnologija proizvodnje humanih antitela detaljno je opisana u, na pr. VVO00/76310, VVO99/53049, US 6.162.963 ili AU536100. Potpuno humana antitela su preferencijalno rekombinantna antitela proizvedena u transgenim životinjama, na pr. ksenomiševima, koji imaju sve ili delove funkcionalnih humanih lokusa Ig.
U visoko preferencijalnom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 je IL-18BP ili njegov izoform, mutein, fuzirani protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili cirkularno permutovani derivat. Ovi izoformi, muteini, fuzirani proteini ili funkcionalni derivati zadržavaju biološku aktivnost IL-18BP, pre svega vezivanje za IL-18, i preferencijalno imaju suštinski najmanje jednu aktivnost sličnu IL-18BP. Idealno, takvi proteini imaju biološku aktivnost koja je čak povećana u poređenju s nemodifikovanim IL-18BP. Preferencijalne aktivne frakcije imaju aktivnost koja je bolja od aktivnosti IL-18BP, ili koja ima dodatne prednosti, kao bolja stabilnost ili manja toksičnost ili imunogenost, ili ih je lakše proizvoditi u većim količinama, ili ih je lakše purifikovati.
Sekvence IL-18BP i njegove ukrojene (nadovezane) varijante/izoforme mogu da se uzmu iz VVO99/09063 ili iz Novick i sar. 1999 kao i Kim i sar. 2000.
Funkcionalni derivati IL-18BP mogu da se konjuguju u polimere da bi se poboljšala svojstva proteina, kao što su stabilnost, poluživot, biološka raspoloživost, tolerisanje od strane ljudskog organizma, ili imunogenost. Da bi se postigao ovaj cilj, 11-18BP mora da se poveže, na pr. za polietilenglikol (PEG). PEGulacija može da se obavi poznatim metodama, koje su opisane u, na pr. WO 92/13095.
Prema tome, preferencijalni oblik ovog pronalaska, IL-18BP je PEGulisan. U dodatnom preferencijalnom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 je jedan fuzionisani protein koji obuhvata sve ili deo jednog IL-18 vezujućeg proteina, koji je fuzionisan sa svim ili sa delom jednog imunoglobulina. Stručnjak za ovu oblast će razumeti da rezultantni fuzioni protein zadržava biološku aktivnost IL-18BP, pre svega vezivanje za IL-18. Ova fuzija može biti direktna, ili da ide preko kratkog linkerskog pepetida koji može da bude i sasvim kratak, samo 1 do 3 amino kiselinska ostatka, ili duži, na primer 13 amino kiselinskih ostataka. Ovaj linker može da bude jedan tripeptid sekvence E-F-M (Glu-Phe-Met), na primer, ili linker sa 13 aminokiselinskih sekvenci koji obuhvata Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gin-Phe-Met koji se uvodi između IL-18BP sekvence i imunoglobulinske sekvence. Rezultujući fuzioni protein ima poboljšana svojstva, kao što je produženi boravak u telesnim tečnostima (polu-život), pojačana specifična aktivnost, povišeni nivo ekspresije, ili je olakšana purifikacija fuzionog proteina.
U preferencijalnom obliku, IL-18BP se fuzioniše za konstantni region
jednog Ig molekula. Po mogućstvu, on se spaja za regione teških lanaca, kao što su, na primer CH2 i CH3 domeni humanog IgGL Generisanje specifičnih fuzionih proteina koji obuhvataju IL-18BP i deo jednog imunoglobulina opisani su, recimo, . u primeru 11 VVP99/09063. I drugi izoformi ig molekula su pogodni za generisanje fuzionih proteina u skladu sa ovim pronalaskom, i to su izoformi lgG2 ili lgG4, ili druge Ig klase, kao što su na primer IgM ili IgA. Fuzioni proteini mogu da budu monomemi ili multimerni, hetero- ili homomultimemi.
Interferoni su prevashodno poznati po svom inhibitomom delovanju na replikaciju virusa i ćelijsku proliferaciju. Na primer, interferon y igra važnu ulogu u promovisanju imunih i inflamatomih odgovora. Smatra se da Interferon p (INF-p, interferon tip II) igra anti-inflamatornu ulogu. Studije koje su objavili Triantaphvllopoulos i sar. (1999) pokazale su da IFN-p ima povoljno dejstvo u - terapiji reumatoidnog artritisa, što je pokazano na mišjem modelu ove bolesti, modelu artritisa izazvanog kolagenom (CIA). Ovo povoljno dejstvo IFN-p potvrđeno je na donjim primerima.
Ovaj pronalazak se odnosi i na korišćenje kombinacije inhibitora IL-18 i interferona za proizvodnju medikamenata za lečenje artritisa, pre svega reumatoidnog artritisa.
Interferoni mogu i da se konjuguju u polimere da bi poboljšali stabilnost proteina. Konjugat interferona p i poliol polietilenglikola (PEG) opisan je, na primer, u VV099/55377.
U još jednom preferencijalnom obliku ovog pronalaska, interferon je
Interferon-p (IFN-p) i, još bolje, IFN-p 1a.
Inhibitor produkcije i/ili dejstva IL-18 po mogućstvu se koristi istovremeno,
sekvencijalno ili posebnno u odnosu na interferon.
U još jednom preferencijalnom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se koristi u kombinaciji sa antagonistom TNF. Antagonisti TNF vrše svoju aktivnost na nekoliko načina. Prvo, antagonisti mogu da se vezuju za sam TNF molekul ili da ga odvajaju s dovoljnim afinitetom i specifičnošću da delimično ili supstancijalno neutralizuju TNF epitop ili epitope odgovorne za vezivanje TNF za receptore (u daljem tekstu ovo se naziva «sekvestrirajući antagonisti»). Sekvestrirajući antagonist može, na primer, da bude i antitelo protiv TNF.
Alternativno, antagonist TNF može da inhibira signalni put TNF koji se aktivira receptorom na površini ćelije po vezivanju TNF (u daljem tekstu ovo se naziva «signalni antagonisti«). Obe ove grupe antagonista su korisne, bilo same, ili zajedno, u kombinaciji sa inhibitorom IL-18, za lečenje artritisa, pre svega reumatoidnog artritisa.
Antagonisti TNF se lako prepoznaju i procenjuju rutinskim skriningom kandidata na njihovo dejstvo nativnog TNF na osetljive ćelijske linije in vivo. Na primer, humane B ćelije, kod kojih TNF dovodi do proliferacije i sekrecije imunoglobulina. Ovaj esej sadrži formulaciju TNF u različitim razblaženjima antagonista kandidata, na pr. od 0,1 do 100 puta više od molame količine TNF koja se koristi u eseju, i kontrole bez sadržaja TNF antagonista (Tucci i sar.
1992).
Sekvestrirajući antagonisti su preferencijalni TNF antagonisti koji se
- koriste za ovaj pronalazak. Među sekvestrirajućim antagonistima, prednost se daje onim polipeptidima koji vezuju TNF s visokim afinitetom i imaju nisku imunogenost. Prednost se daje posebno rastvorljivim molekulima TNF receptora i neutralzujućim antitelima na TNF. Na primer, rastvorljivi TNF-RI i TNF-RII su korisni u ovom pronalasku. Razgranati rastvorljivi TNF tip-inhibitori IL-18 i tip-ll receptori se opisuju u EP914431, na primer.
Razgranate forme TNF receptora su rastvorijive i otkrivene su u urinu i seruma kao TNF inhibitomi vezujući proteini od 30 kDa i 40kDA, koji se nazivaju i TBPI i TBPII (Engleman i sar. 1990). Istovremeno, sekvencijalno ili posebno korišćenje inhibitora IL-18 sa antagonistima TNF i/ili interferonom se preporučuje, u.
U skladu sa ovim pronalaskom TBPI i TBPII su preferencijalni antagonisti TNF za korišćenje u kombinaciji sa IL-18 inhibitorom. Derivati, fragmenti, regioni i biološki aktivni delovi receptorskih molekula funkcionalno liče na receptorske molekule i takođe mogu da se koriste u ovom pronalasku. Ovakav biološki aktivni ekvivalent ili derivat receptorskog molekula odnosi se na deo polipeptida ili sekvencu koja enkodira receptorski molekul, koji je dovoljno veliki i u stanju da veže TNF takvim afinitetom da interakcija s receptorom TNG vezanim za membranu biva inhibirana ili blokirana.
U dodatnom preferencijalnom obliku, humani solubilni TNG-RI /TBPI) je antagonista TNF koji treba da se koristi u skladu sa ovim pronalaskom. Neutralni ili rekombinantni solubilni TNF receptorski molekuli i metode za njihovu produkciju opisani su u evropskim patentima EP 308 378, EP 398 327 i EP 433 900.
Inhibitor IL-18 može da se koristi istovremeno, sekvencijalno ili nezavisno od TNF inhibitora. Koristi se prednost kombinacije IL-18 antitela ili antiseruma i jednog rastvorljivog receptora TNF koji ima inhibitornu aktivnost za TNF.
U dodatnomjDreferencijalnom obliku ovog pronalaska medikament dalje obuhvata jedan COX inhibitor, po mogućstvu COX-2 inhibitor. COX inhibitori su poznati u tehnici. Specifični COX-2 inhibitori su opisani, na primer, u VVO01/00229.
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje kombinacije IL-18 inhibitora i/ili intereferona i/ili TNF antagonista i/ili COX.2 inhibitora. Ova kombinacija je pogodna za lečenje i/ili prevenciju artrtisa, pre svega reumatordnog artitisa, kao i za lečenje i/ili prevenciju oštećenje jetre i za lečenje i/ili prevenciju zapaljenske bolesti creva, pre svega Kronove bolesti i ulceroznog kolitisa. Aktivne komponente mogu da se koriste istovremeno, sekvencijalnu ili posebno.
U preferencijalnom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0,0001 do 10 mg/kg telesne težine, ili oko 0,01 do 5 mg/kg telesne težine, ili oko 0,1 do 5 mg/kg telesne težine, ili oko 0,1 do 3 mg/kg telesne težine, ili oko 1 do 2 mg/kg telesne težine. U još jednom preferencijalnom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0,1 do 1000 (j.g/kg telesne težine ili 1 do 100ng/kg telesne težine ili oko 10 do 50^g/kg telesne težine.
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje vektora ekspresije koji obuhvata sekvencu kodiranja inhibitora IL-18 u pripremi medikamenta za prevenciju i/ili lečenje artritičnih stanja ili artritisa, pre svih reumatoidnog artritisa, za lečenje oštećenja jetre, kao i za lečenje zapaljenske bolesti creva. Genski teorijski pristup se tako koristi za prevenciju i/ili lečenje bolesti. Prednost se postiže jer će ekspresija inhibitora IL-18 tada biti in situ, i na taj način efikasno blokirati IL-18 direktno u tkivima ili ćelijama zahvaćenim bolešću.
Da bismo prevenirali i/ili lečili artritis, vektor genske terapije koji obuhvata sekvencu produkcije inhibitora IL-18 i/ili dejstva može direktno da se ubrizgava u oboleli zglob, na primer, izbegavajući probleme uključene u sistemsku primenu vektora genske terapije, kao što su dilucija vektora, dostizanje i ciljanje ciljnih ćelija ili tkiva i neželjena dejstva.
Korišćenje vektora za indukovanje i/ili pojačavanje endogene produkcije inhibitora IL-18 u ćeliji koja je normalno nema za ekspresiju inhibitora IL-18 ili koja eksprimira količine inhibitora koje nisu dovoljne, i koje su takođe obuhvaćene ovim pronalaskom. Ovaj vektor može da obuhvati regulatome sekvence funkcionalne u ćelijama koje želimo da eksprimiraju inhibitor IL-18. Ovakve regulatome sekvence mogu, na primer, da budu promoteri ili pojačivači. Regulatome sekvence mogu zatim da se uvedu u desni lokus genoma homolognom rekombinacijom, i na taj način operativno da povežu regulatornu sekvencu sa genom, čiju ekspresiju treba indukovati ili pojačati. Ova tehnologija se obično naziva «aktivacijom engogenog gena» (EGA) i opisana je u, na primer, WO 91/09955.
Stručnjaci za ovu oblast će razumeti da je moguće i da se zatvori ekspresija IL-18 korišćenjem iste tehnike, t.j. uvođenjem negatinog regulatornog elementa, kao na pr. utišavajućeg elementa u genski lokus IL-18, što na taj način dovodi do nishodne regulacije ili prevencije ekspresije 11-18. Stručnjaci za ovu oblast će razumeti da ovakva nishodna regulacija odnosno utišavanje ekspresije IL-18 ima isto dejstvo kao i korišćenje inhibitora IL-18 za prevenciju i/ili lečenje bolesti.
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje ćelije koja je već genetski modifikovana da proizvodi inhibitor IL-18 za proizvodnju medikamenata za prevenciju i/ili lečenje bolesti jetre, artritisa i zapaljenske bolesti creva.
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na farmaceutske sastave, posebno korisne za prevenciju i/ili lečenje zapaljenskog artritisa, oštećenja jetre ili zapaljenske bolesti creva, koji obuhvataju terapijski efektivne količine inhibitora IL-18 i terapijski efikasne količine interferona. Kao inhibitor IL-18 , ovaj sastav može da obuhvati i inhibotore kaspaze-1, antitela protiv IL-18, antitela protiv ma koje IL-18 podjedinice, inhibitore IL-18 signalnog puta, antagoniste IL-18 koji su u kompeticiji sa IL-18 i blokiranju IL-18 receptor, i proteine koji vezuju IL-18, njihove izoforme, muteine, fuzionisane proteine, funkcionalne derivate, aktivne frakcije ili cirkularno permutovane derivate koji imaju istu aktivnost. IL-18BP i njegovi izoformi, muteini, fuzionisani proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili cirkulamo permutovani derivati koji su gore opisani, predstavljaju preferencijalne sastojke farmaceutskog preparata.
Interferon sadržan u ovom farmaceutskom preparatu po mogućstvu je IFN-y.
U još jednom preferencijalnom obliku , u ovom farmaceutskom preparatu sadržani su i terapijski delotvorne količine inhibitora IL-18, opciono jedan interferon, kao i antagonista TNF. Antagonisti TNF mogu biti antitela koja neutralizuju aktivnost TNF, ili solubilni razgranati fragmenti TNF receptora koji se nazivaju i TBPI i TPBII. Farmaceutski sastav u skladu-sa ovim pronalaskom može dodatno da obuhvati jedan ili više inhibitora COX, preferencijalno COX-2 inhibitore.
Definicija «farmaceutski prihvatljiv« znači da se uključuje i nosač, koji ne utiče na efikasnost biološke aktivnosti aktivnih sastojaka i da nije toksičan za domaćina kome se daje. Na primer, za parenteralnu administraciju, aktivni protein(i) mogu da se formulišu u jedinici doziranja za injekcije u nosačima kao što su fiziološki rastvor, rastvor dekstroze, serumski albumin i Ringerov rastvor.
Aktivni sastojci farmaceutskog sastava u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se daju pojedincima na niz načina. Putevi primene uključuju intradermalni, transdermalni (na pr. u formulacijama sa sporim oslobađanjem), intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, supkutani, oralni, epiduralni, površinski i intranazalni. Svaki drugi terapijski efikasan način davanja može da se koristi, na primer apsorpcija kroz epitelijalno ili endotelijalno tkivo, ili genskom terapijom gde se molekul DNK koji enkodira aktivni agens daje pacijentu (na pr. preko vektora) što dovodi do to ga da aktivni agens bude eksprimiran i sekretovan in vivo. Uz to, protein(i) u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se daju zajedno sa drugim komponentama biološki aktivnih agenasa kao što su farmaceutski prihvatljivi surfaktanti, ekscipijeni, nosači, razblaživači.
Za parenteralnu (na pr. intravensku, supkutanu, intramuskulamu) primenu, aktivni protein(i) mogu da se formulišu u uvidu rastvora, suspenzije, emulzije ili liofilizovanog praška povezanog sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim nosačem (na pr. voda, fiziološki rastvor, rastvor dekstroze) i dodacima koji održavaju izotonost (na pr. manitol) ili kliniku stabilnost (na pr. konzervansi i puferi). Formulacija se sterilizuje uobičajenim tehnikama.
Biološka raspoloživost aktivnog proteina (ili više njih) u skladu sa ovim pronalaskom može da se poboljša korišćenjem procedura konjugacije koji produžavaju polu-život molekula u telu čoveka, na primer povezujući molekul sa polietilenglikolom, kako je opisano u PCT Patentnoj prijavi WO 92/13095.
Terapijski efikasne količine aktivnih proteina će biti u funkciji mnogih promenljivih, uključujući i tip antagonista, afinitet antagonista za IL-18, svaku rezidualnu citotoksičnu aktivnost koja se ispolji od strane antagonista, način primene, kliničko stanje pacijenta (uključujući i poželjnost održavanja netoksičnog nivoa aktivnosti endogenog IL-18.
«Terapijski efikasna količina« je ona koja kada se daje inhibitor IL-18 dolazi do inhibicije biološke aktivnosti IL-18. Primenjena doza, u vidu pojedinačne doze ili multiplih doza, pojedincu variraće zavisno od niza faktora, uključujući i farmakokinetička svojstva inhibitora IL-18, način primene, stanje i osobine pacijenta (pol, starost, telesna težina, veličina), obim simptoma, paralelnu tekuću terapiju, učestalost tretmana i željeno dejstvo. Podešavanja i manipulacije utvrđenog raspona doziranja su u okvirima sposobnosti onih koji su stručnjaci za ovu oblast, kako zain vitro,tako i zain vivometode određivanja inhibicije IL-18 kod ispitanika.
U skladu sa ovim pronalaskom, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0,0001 do 10 mg/kg telesne težine, ili oko 0,01 do 5 mg/kg telesne težine, ili oko 0,1 do 5 mg/kg telesne težine, ili oko 0,1 do 3 mg/kg telesne težine, ili oko 1 do 2 mg/kg telesne težine. U još jednom preferencijalnom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0,1 do 1000i^g/kg telesne težine ili 1 do 100 |ig/kg telesne težine ili oko 10 do 50^g/kg telesne težine.
Način davanja kome se daje prednost u skladu sa ovim pronalaskom jeste supkutani. Intramuskulami načinje takođe jedan preferencijalni način u skladu sa ovim pronalaskom.
U drugim preferencijalnim oblicima, inhibitor IL-18 se daje svakodnevno ili svaki drugi dan.
Dnevne doze se obično daju u vidu podeljenih doza ili u obliku s kontrolisanim oslobađanjem da bi se postigli željeni rezultati. Druga ili naredna primena može da se obavi u dozi koja je ista, manja ili veća od inicijalne ili prethodne doze koja se daje pojedincu. Druga ili naredna primena može da se daje tokom, za vreme ili pre početka bolesti.
U skladu sa ovim pronalaskom, inhibitor IL-18 može da se daje profilaktički ili terapijski ljudima pre, istovremeno sa, ili posle drugih terapijskih režima ili agenasa (na pr. terapijski režim sa više lekova) u terapijski efikasnim količinama, pre svega sa interferonom i/ili antagonistima TNF i/ili inhibitorom COX. Aktivni agens koji se daje istovremeno s drugim terapijskim agensima može da se daje u istoj ili posebnoj formulaciji.
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu za pripremu preparata farmaceutske formulacije koja uključuje i meša efikasne količine inhibitora IL-18 i/ili interferona i/ili antagoniste TNF i/ili inhibitora COX s farmaceutski prihvatljivim nosačem.
Pošto smo ovaj pronalazak opisali, lakše ćemo ga razumeti ako se pozovemo na sledeće primere koje dajemo kao ilustraciju, a ne da ograničimo obim predstavljenog pronalaska.
PRIMERI
PRVI DEO: Primeriod 1 do 8odnose se na primenu inhibitora IL-18 za
oštećenja jetre
PRIMER 1: Proizvodnja IL- 18BP- His tag
Purifikovani rekombinantni humani IL-18BP koji sadrži his-tag (r-hiL-18BP-His tag) proizveden je u ćelijama CHO. Produkcija rekombinantnih proteina u eukariotskim ćelijama je poznata stručnjacima za ovu oblast. Na raspolaganju su dobro poznate metode za konstrukciju odgovarajućih vektora koji nose DNK koja kodira za IL-18BP i pogodna je za transfekciju eukariotskih ćelija da bi se proizveo rekombinanti IL-18BP. Za ekspresiju u ćelijama, DNK koja kodira za IL-18BP (vidi na pr. Novick i sar. 1999) se otseca i umeće u ekspresione vektore pogodne za transfekciju ćelija. Alternativno, takva DNK može da se pripremi PCR tehnikom odgovarajućim sens i antisens prajmerima. Rezultujući cDNK konstrukti se tada umeću u odgovarajuće konstruisane eukariotske ekspresivne vektore tehnikama koje su stručnjacima dobro poznate (Manaitis, 1982). Ovaj rekombinannti protein purifikovan je do preko 95% čistoće i utvrđeno je da je biološki aktivanin vitroiin vivosa visokim afinitetom za ligande.
PRIMER 2: Protektivno dejstvo IL- 18BP protiv endotoksinski izazvane smrti na
mišjem modelu
Jedan mišji model je korišćen da se testira da li bi IL18BP, inhibitor IL-18 štitio miša od visokih doza lipopolisaharida (LPS). LPS dovodi do akutnog oštećenja jetre, posle čega kod miša sledi brza smrt.
4 mg/kg rekombinantnog humanog IL-18BP (mlL-18BP-his) sa sadržajem his-tag (što je posledica rekombinantne produkcije ovog proteina) ubrizgano je intraperitonealno (i.p.) u C57BL/6 miševe. Jedan sat kasnije, 60 mg/kg LPS je ubrizgano (letalna doza). Preživljavanje ovih miševa upoređeno je sa grupom miševa koji su dobijali samo LPS (a ne i IL18BP). -
Pet od 7 miševa kojima je ubrizgan rhiL18BP-his je preživeo injekciju LPS, za razliku od kontrolnih miševa gde su sve životinje umrle u roku od 3 dana.
Uzorci krvi su uzimani 5 sati po injekciji LPS u odsustvu ili u prisustvu rastućih doza rhlL-18BP-his i analizirani ELISA testom na cirkulišući IFN-y (Slika 1). 0,4 i 4 mg/kg rhlL-18BP-his dovele su dvostrukog smanjenja IFNy u serumu. Ova inhibicija je izgubljena pri nižim dozama rhlL-18BP-his (0,004 i 0,4 mg/kg).
PRIMER 3: IL18BP ima protektivno dejstvo protiv oštećenja jetre u mišjem
modelu bolesti
Mišji model fulminanntog hepatitisa je korišćen da se koristi dejstvo IL18BP. Miševi su razvili akutno oštećenje jetre kada su podvrgnuti sekvencijalnom davanju Propionibacterium acnes (P. acnes) i lipopolisaharidu
(LPS).
Miševima su ubrizgavane rastuće doze rhlL-18BP-his (4; 0,4; 0,04; 0 mg/kg) u različita vremena )1 g, 20 min, istovremeno) pre injekcije LPS u C57BL/R miševima senzitivisnim sa P. acnes. Kada je rhlL-18BP-his davan i.p. istovremeno sa LPS, nijedan od miševa nije preživeo, a nivoi cirkulišućeg IFN-y i TNF-ct ostali su nepromenjeni. Iznenađujuće je daje rhlL-18BP-his (4 i 0,4 mg/kg) izazvao 70% smanjenje cirkulišuće alanin aminotrasferaze (marker oštećenja jetre), kako je prikazano na Slici 2.
Uz ovo, preživljavanje miševa je praćeno (SI. 3): kada je rhlL-18BP-his davan i.p. 20 minuta pre LPS, dve najveće doze IL.18BP (4 i 0,4 mg/kg) usporile su smrt miševa za 10 sati u poređenju s kontrolnim miševima koji su primali NaCI umesto IL-18BP.
Rezultati merenja nivoa IFNy u serumu prikazani su na Slici 4. rhIL-18BP (4 mg/kg) inhibirao je 90% nivoa IFNy u cirkulaciji i 80% alanin aminotrasferaze u cirkulaciji (nije prikazano).
Kada je rhlL-18BP-his davan 1 h pre LPS, krive preživljavanja i nivoi IFNy u cirkulaciji bili su slični nivoima kada je rhlL-18BP-his davan 20 minuta pre LPS, alanin aminotrasferaze ali nivoi u cirkulaciji ostajali su nepromenjeni (nije prikazano).
Uz ovo, tkivo jetre miša analizirano je prebojavanjem hematoksilin-eozinom, kao i tunel mikroskopijom. Jetre miševa, kod kojih je teški hepatitis indukovan ranije, pokazale su tešku nekrozu u poređenju s normalnim tkivom jetre. Za razliku od ovoga, tkivo jetre miševa tretiranih sa IL-18BP pokazivalo je značajno manje nekrotičkih fokusa od nelečenih miševa.
PRIMER 4: Anti- IL- 18 antitela štite od letalne endotoksemije
Da bi se procenilo da li blokada IL-18 sa IL-18 antitelima štiti miševe od letalnih doza bakterijskih lipopolisaharida, C57BL/6J miševi su prvo primili po injekciju neutralizujućeg zečjeg anti-miš IL-18 (poliklonskog) ili normalnog zečjeg (NDS) seruma kao kontrolu. 30 minuta po tretmanu antitelima, ubrizgana im je letalna doza LPS dobijena od bilo E. coli (SI. 5A) ili S. Thvphimurium (SI. 5B). Eksperiment je obuhvatio 5 miševa po grupi, i rađen je dva puta.
Kao što je prikazano na SI. 5A, tretman miševa anti-IL-18 antiserumom sprečioje mortalitet indukovan sa 40 mg/kg E.coli LPS. 100% miševa je preživelo posle anti-IL-18 tretmana u poređenju sa 10% preživljavanja kod miševa tretiranih normalnim zečjim serumom (p<0,005).
Na SL. 5B vidi se da su miševi tretirani ovim antitelima bili zaštićeni i od dejstva S. Tvphimurium (preživljavanje 50% prema 0%, p<0,05).
PRIMER 5: Blokada 1L. 18 i TNFa štiti miševe od hepatotoksičnosti izazvane
ConA i PEA
Dva eksperimentalna modela hepatotoksičnosti korišćena su za procenu uloge IL-18 i TNFa kod oštećenja jetre. Injekcija Konkavalina A (ConA) i Pseudomonas aeruginosa (PEA) i miševe su izazivali oštećenje jetre i predstavljaju istovremeno modele hepatitisa posredovanih T ćelijama.
C57BL/6J miševi su prethodno tretirani anti-IL antiserumom ili rastvorljivim TNF receptorom, TNFsRp55. Nivoi alanin aminotransferaze (ALT) mereni su u serumu kao indikatori oštećenja jetre (SI. 6).
Kao što se vidi na SI. 6A, i IL-18 antiserum i rastvorljivi TNF receptori signifikantno su smanjivali nivoe Alt u serumu izazvane ConA, u poređenju sa kontrolnim injekcijom samog nosača (apirogeni fiziološki rastvor). Paralelno davanje rastvorljivog TNF receptora i IL-18 antiseruma dovelo je do kompletne inhibicije oštećenja jetre izazvanog ConA: Kao što je prikazano na SI. 6B, kod miševa kojima je ubrizgan PEA, neutralizacija bilo inhibitorima TNFa ili anti-IL-18 antitelima dovela je do od 93% odnosno 83% inhibicije nivoa ALT u serumu. Kombinovana blokada sa oba agensa rezultirala je u zaštiti od 99%.
PRIMER 6: Nivoi IL- 18 vezujućeg proteina su povišeni kod pacijenata s
hroničnim oboljenjem jetre
Nivoi IL-18 BP u plazmi mereni su kod 133 pacijenta s hroničnim oboljenjem jetre (CLD) različite etiologije i 31 zdravih kontrolnih ispitanika specifičnim ELISA testom korišćenjem IL-18BP monoklonskih antitela.
Nivoi IL-18 u plazmi bili su signifikantno veći kod CLD pacijenata (12,91 ± 0,89 ng/ml, prosečna vrednost ± SEM) nego kod zdravih kontrolnih ispitanika (4,96 ± 0,43 ng/ml, p<0,001). Cirotični bolesnici su imali signifikantno više nivoe od pacijenata s necirotičnim CLD (19,23 ±1,28 ng/ml, n=67 prema 6,49±0,51 ng/ml, n=66, p<0,001). Pacijenti u stadijumu B Child-Pughove klasifikacije imali su više nivoe IL-18 BP od onih u stadijumu A (22,48±2,44 ng/ml prema 9,57± 1,25 ng/ml, p<0,001). Međutim, nije bilo signifikantne razlike između Child B i C (22,48±2,44 ng/ml prema 20,62± 4,75 ng/ml). Nivoi IL-18BP u plazmi bili su u pozitivnoj korelaciji s GOT, bilirubinom i sedimentacijom. Negativna korelacija utvrđena je za protrombinsko vreme.
U zaključku, rezultati pokazuju da su nivoi IL-18 BP u plazmi povišeni kod CDC i da su u korelaciji s težinom bolesti nezavisno od njene etiologije. lako je IL-18 endogeni antagonista proinflamatomog IL-18 BP, povećanje nivoa IL-18 izgleda nije bilo dovoljno da se suprotstavi preovlađujućim proinflamatornim medijatorima u CDC.
PRIMER 7: Inhibicija alkoholnog hepatitisa sa IL- 18BP
Četiri grupe pacova (5 po grupi) su hranjene etanolom i ishranom sastavljenom od kukuruznog ulja davanog intragastričnom infuzijom tokom 4 nedelje. Dekstroza je izokalorijski zamenjivala etanol kod kontrolnih pacova. Oni su dnevno dobijali injekciju mišjeg IL-18BP (1 mg/kg) ili fiziološki rastvor. Patološka analiza je obavljena na presecima jetre i merenju enzima jetre u serumu, a rađeni su i TNFa, Fas ligand i IFN-y. Nekroinflamatomo oštećenje i ekspresija enzima jetre, TNFa, Fas ligand i IFN-y nađeni su kod pacova hranjenih etanolom kojima je ubrizgavan fiziološki rastvor.
Pacovi kojima je ubrizgavan mišji IL-18BP zaštićeni su od nekroinflamatornog oštećenja, a nivoi enzima jetre, TNFa, Fas ligand i IFN-y značajno su smanjeni (>90%).
PRIMER 8: Inhibicija hepatitisa indukovanog konkavalinom A uz pomoć IL- 18BP
Balb/c miševima je ubrizgavano 12 mg/kg konkavalina A (ConA) sa injekcijom mišjeg IL-18BP (1 mg/kg) ili bez nje 2 h pre davanje ConA, a potom svakodnevno. Oštećenje jetre je procenjivano određivanjem serumskih nivoa enzima jetre, TNFa, Fas ligand i IFN-y. Hepatička histopatologija je upoređena sa miševima tretiranim samo konkavalinom A: Prethodni tretman IL-18BP značajno je smanjivao serumske nivoe enzima jetre i TNF-a bez dokaza o inflamaciji na histopatološkom pregledu u poređenju s kontrolnim miševima tretiranim sa ConA.
DRUGI DEO: Primeri9 i10 koji se odnose na korišćenje inhibitora IL- 18 u
artritisu
PRIMER 9: Produkcija IL- 18BP- His tag
Za eksperiment koji je detaljno opisan u primeru 10, dole, rekombinantni humani IL-18BP sa sadržajem his-tag 6 ostataka (r-hil-18BP-His tag) proizveden je u CHO ćelijama i purifikovan kako je to opisao Kim i sar. 2000. Ovaj rekombinantni protein purifikovan je do preko 95% čistoće i utvrđeno je da je biološki aktivanin vitroiin vivosa visokim afinitetom za svoj ligand.
Produkcija rekombinantnih proteina u drugim eukariotskim sistemima sa ili bez tags koji olakšavaju purifikaciju rekombinantnih proteina poznata je stručnjacima za ovu oblast. Za konstrukciju odgovarajućih vektora koji nose DNK koja kodira za IL-18BP i pogodna je za transfekciju eukariotskih ćelija za proizvodnju rekombinantnog IL-18BP postoje dobro poznate metode. Za ekspresiju u ćelijama, DNK kodiranje za IL-18BP (vidi Novick i sar. 1999) seče se sa klonirajućeg vektora i umeće u eksresioni vektor pogodan za transfekciju ćelija. Alternativno, ovakva DNK može da se pripremi PCR s odgovarajućim sens i antisens prajmerima. Rezultujući cDNK konstrukt se onda umeće u odgovarajuće konstruisani eukariotski ekspresioni vektor tehnikama koje su poznate u struci (Maniatis i sar. 1982).
PRIMER 10: Blokada endogenog IL- 18 u mišjem modelu artritisa
Metode
Indukcija artritisa izazvanog kolagenom ( CIA)
CIA je indukovan kod muških miševa DBA/1 starosti 8-12 nedelja imunizacijom nativnim tip II goveđim kolagenom (Cll) kako je to već opisano (Plater-Zvberk i sar. 1995). Od dana 25 post-CII imunizacije, miševi su ispitivani svakodnevno da bi se identifikovao početak bolesti.
Tretman rhlL- 18BP- 6his
Tretman Cll-imunizovanih miševa DBA/1 započeo je s prvom pojavom kliničkih znakova bolesti. Rekombinantni humani IL-18BP sa sadržajem tag 6 histidina (rh-IL-18Bpa 6 his) korišćenje za neutralizaciju endogenog IL18 kod miševa tretiranih kolagenom. rh-IL-18Bpa 6 his je ubrizgavan svakodnevno tokom 7 dana u 5 različitih koncentracija, 10, 3, 1, 0,5 i 0,25 mg/kg intraperitonealno (i.p.). Placebo kontrolni miševi primali su samo nosač (0,9% NaCI).
Procena razvoja bolesti
Klinička procena ( klinički skorovi)
Od prve pojave kliničkih simptoma miševi su pregledani svakodnevno od strane istraživača koji nije znao koju vrstu tretmana miševi primaju. Svaki ekstremitet je meren i određivana je težina bolesti (skorovi 0-3,5, maks. Skor 14/mišu). Progresija edema (inflamacija) merena je na prvoj šapi koja pokaže znakove bolesti korišćenjem preciznih instrumenata (Proctest 21, Kroeplin Langenmesstechnik).
Progresija bolesti je procenjivana dnevno tokom 8 dana po početku bolesti kada su miševi žrtvovani i šape skupljene za histopatološki pregled.
Histološki pregled erozije hrskavice i mikroskopske inflamacije
Na završetku eksperimenta, t.j. osmog dana po početku bolesti, miševi su ubijani, a prva šapa na kojoj su identifikovani znaci bolesti bila je odsečena.
Zglobovi su fiksirani, dekalcifikovani i ukalupljeni u parafin. Rađene su standardne sekcije (5 do 7^m) zglobova i bojene hematoksilin/eozin safranin 0. Svaki zglob su ocenjivala 2 istraživača koji nisu bili upoznati s protokolom tretmana (bez destrukcije hrskavice ili kosti = 0; lokalizovana erozija hrskavice = 1-2; obimnije erozije = 3; generalizovana destrukcija hrskavice i prisustvo erozije kostiju = 4). Konačnim skorovima za svakog miša smatrane su srednje vrednosti ocenjivanih zglobova. Mikroskopska inflamacija ili sinovitis su ocenjivani od 0 do , na sledeći način: bez inflamacije = 0; malo zadebljanje površinskog sloja i/ili izraženiji influks ćelija u sloju ispod njega = 3; prisustvo ćelija u sinovijalnom prostoru i sinovijum visoko infiltriran brojnim inflamatomim ćelijama = 4.
Određivanje anti- koiagenskih antitela
Antitela protiv goveđeg kolagena tip II ispitivana su korišćenjem enzimski povezanog imunosorbentnog eseja 8ELISA). Mereni su tftri lgG1 i lgG2a . Ukratko, ploče su oblagane sa 10 jig goveđeg kolagena i potom su nespecifična mesta vezivanja blokirana s 0,1 M etanolamina (Sigma). Dodavane su serijske dilucije 1:2 seruma po inkubaciji izotip specifičnom kozjom anti-miš peroksidazom (Southern Biotechnologv Asociates, Birmingham, AL, USA) i supstratom (5-aminosalicilna kiselina, Sigma). Ploče su očitavane na 492 nm,. Titri su eksprimirani kao srednje vrednosti ±SD razblaženja, što daje polovinu maksimalne vrednosti.
IL- 6 eseji
Nivoi IL-6 su određivani komercijalnim ELISA (R&D sistemi, Minneapolis, MN, USA). Bioaktivnost korišćenjem inhibitora IL-18-18 određivana je proliferativnim esejem korišćenjem B9 ćelija. Ukratko, 5 x 10<3>B9 ćelija u 200 |J 5% FCS-RPMI 1640 medijumu po udubljenju na ploči postavljeno je na ploču za mikrotitraciju sa zagbljenim dnom i inkubirano 3 dana korišćenjem humanog rekombinantnog IL-6 (R&D sistemi, Minneapolis, MN, USA) kao standard. Na kraju inkubacije dodavanoje 0,6 (iCi 3[H]timidin (NEN-Dupont, Boston, MA, USA) po udubljenju. Tri sata kasnije, ćelije su ubirane i određivana je inkorporacija timidina. Granica detekcije za IL.6 bioesej iznosila je 1 pg/ml.
Statistička analiza
Značajnost razlike procenjivana je Mann Whitney testom i SigmaStat program za statističku analizu i GraphpadPrism program.
Rezultati
Eksperimentalni model miša, CIA (artritis indukovan kolagenom) je upotrebljen za procenu efikasnosti IL-18BP kao agens za lečenje artritisa. Davanje kolagena i nekompletnog Freundovog adjuvanta DBA/1 miševima indukovalo je razvoj erozivnog, inflamatornog artritisa i predstavlja idealnu priliku da se ispita terapijski potencijal IL-18BP. U ovom cilju, endogeni IL-18 je neutralizovan korišćenjem IL-18BP i procenjivano je dejstvo različitih patogenih parametara.
Obavljena je studija određivanja dozne zavisnosti. Tri grupe miševa DBA/1 sa kolagenski izazvanim artritisom lečene su terapijski (t.j. po početku bolesti) sa 5 doza IL-18BP i.p. intraperitonealno. IL-18BP u koncentracijama od 10, 3, 1, 0,5 ili 0,25 mg/kg davane su po prvoj pojavi kliničkih znakova bolesti. Injekcija fiziološkog rastvora (natrijum hlorid, NaCI) korišćena je kod kontrola. Uz to, 10.000 U interferona y (IFN-y) davano je i.p. da se proceni dejstvo IFN u ovom eksperimentalnom modelu artritisa. Dejstvo na težinu bolesti praćeno je svakodnevno vizuelnim ocenjivanjem svake pojedine šape, kako je gore opisano. Miševi su žrtvovani osam dana po početku bolesti.
Merene su sledeće vrednosti:
• Vizuelni klinički skorovi (0 - 3,5 po šapi) (SI. 7A i B),
• Oticanje zglobova/edemi ( u mm, mereno preciznim instrumentom) prve obolele šape, pod uslovom daje to zadnja šapa (SI. 8),
• Broj šapa regrutovanih tokom bolesti (SI. 9)
• Skorovi erozije prve obolele šape (0-4 destrukcija hrskavice, SI. 10)
• Histopatološka analiza šape koja je porva razvila artritis (SI. 11)
• Nivoi anti-kotagen tip II antitela (SI. 12)
• Nivoi IL-6 (SI. 13).
Klinička težina bolesti
Kako je pokazano na SI. 7A i B, klinička težina bolesti je bila signifikantno smanjena u grupama tretiranim s 1 mg/ml (p<0,01) i 0,5 mg/ml (0,01 < p<0,05) rhlL-18BP. Miševi koji su primali niske doze rhlL-18BP(0,25 mg/kg) ili visoke doze od 10 mg/kg imali su klinički skor sličan placebo grupi. Doza od 1 mg/kg IL-18BP bila je otprilike efikasna kao i interferon p (označen kao INFp na SL. 7A).
Upala zglobova i oticanje šapa ( edemi)
Makroskopska inflamacija (edemi) ispiivana je merenjem edema od prvog dana po početku bolesti do osmog dana, na kraju eksperimenta. Rezultati su prikazani na SI. 8A i B. Efikasne doze IL-18BP bile su 1, 3 i 10 mg/kg. Davanje nižih doza nije dovodilo do povoljnog dejstva na oticanje šapa. Kao što je prikazano na SI. 8A i 8B, Interferon p (IFNp) u koncentracijama od 10.000 U imao je povoljno dejstvo na otoke šapa.
Mikroskopski sinovitis je ispitivan na kraju eksperimenta na histopatološkim presecima i izražavan je u vidu skorova («skor sinovitisa»). Rezultati inflamacije (otoci) i skorovi sinovitisa prikazani su na Tabeli 1. Dok je tretman rhlL-18BP u dozama 1 i 3 mg/kg dovodio do trenda ka smanjenju otoka, tretman svim dozama IL-18BP imao je samo ograničeno dejstvo na inflamatorni sinovitis (Tabela 1).
Na SL. 9 vidimo daje broj šapa koje su zahvaćene bolešću smanjen po davanju IL-18BP. Pre svega, terapijske injekcije IL-18BP u dozama od 1 i 0,5 mg/kg smanjivale su broj šapa koje su razvile bolest, pokazujući da blokada IL-18in vivozaustavlja širenje artritisa na dodatne zglobove.Tretman sa 1 i 0,5 mg/kg IL-18BP izgleda čak sposoban da neke zahvaćene zglobove vrati u normalno stanje.
Zaštita od uništenja zglobova
Tretman miševa rhlL-18BP doveo je do zaštite zglobova od destrukcije (SI. 10). Polukvantitativni sistem skorovanja pokazao je da erozija kostiju ima dozno zavisno zaštitno dejstvo koje je bilo signifikansnto na 10 i 3 mg/kg (p<0,05, SL. 10). Miševi koji su primali 1 mg/kg rhlL-18BP imali su manju eroziju od miševa koji su primali samo nosač. Nije zabeležena zaštita pri dozama od 0,5 mg/kg i 0,25 mg/kg. Zanimljivo je daje dejstvo na zaštitu zglobova pri dozama od 3 i 10 mg/kg IL-18BP bilo slično pa čak i jače od korisnog dejstva 10.000 U interferona p (IFNp).
Na slici 11 prikazana je histologija zdravog (A) i obolelog (B) zgloba u poređenju sa zglobom koji se dobija od životinje tretirane IL-18BP (C). Uzeti su preseci na kraju eksperimenta iz šapa koje su prve razvile artritis.
Zglob artritičnog miša pokazao je težak destruktivni artritis sa deplecijom hrskavice i erozijom i brojnim infiltrativnim ćelijama u inflamiranom sinovijumu. U zglobu miša tretiranog rhlL-18BP, hrskavica je izgledala skoro normalno uprkos prisustvu zapaljenskih ćelija u sinovijalnom prostoru. Tamo je bilo ne samo više hrskavice, već je ta hrskavica imala i glatkiji izgled.
Anti- IL18 tretman modulira nivoe anti- tip II kolagen antitela
CIA miševi imaju povišene nivoe lgG1 i lgG2a anti tip II kolagen antitela u cirkulaciji. Antitela izotipa lgG1 su povezana s TH2 posredovanim bolestima, dok antitela izotipa lgG2a i lgG2b su povezana s TH1 posredovanim bolestima. Artritis se obično klasifikuje kao bolest posredovana TH1.
Izotipovi Anti tip II kolagen antitela(CII) lgG1 i lgG2a antitela određivani su u serumima životinja koj su tretirane sa IL-18BP (SI. 12). Nivoi anti Cll IgG izotipova lgG1 i lgG2a nisu bili signifikantno modifikovani tretmanom IL-18BP četvrtog dana ili osmog dana (D4, D8) kliničke bolesti. Međutim, posle osam dana tretmana rhlL-18BP primećen je pad kolagen specifičnih odnosa lgG1/lgG2a za 2,6 puta pri dozi od 1 mg/kg i 3,4 puta pri dozi od 3 mg/kg. Na Slici 12 vidimo eksperiment u kome je korišćeno 3 mg/kg. U suštini dobijeni su isti rezultati korišćenjem količine od 1 mg/kg IL-18BP. Smanjeni odnos lgG1/lgG2a anti-CII antitela govori o smanjenoj koncentraciji anti-tip II kolagen antitela izotipa lgG2a i povećanoj koncentraciji anti-tip II kolagen antitela izotipa lgG1, što govori da postoji pomak ka TH2-posredovanoj bolesti u ovom modelu artritisa.
Smanjenje nivoa IL- 6 posle neutralizacije IL- 18
Da bi se dobio uvid u dejstvo IL-18 blokade, IL-6 je meren u serumima životinja tretiranih IL-18BP. Na Slici 13 vidimo da su nivoi bioaktivnog IL-6 signifikantno smanjeni kod životinja koje su primale IL-18BP u svim merenim dozama, t.j. 1, 3 i 10 mg/kg, kao i sa interferonom p (INFp). Imunoaktivni nivoi IL-6 mereni u serumima životinja tretiranih sa 3 mg/kg rhlL-18BP signifikantno su smanjeni (p<0,0023) u poređenju sa životinjama tretiranim fiziološkim rastvorom: IL-6 serumski nivoi obolelih životinja tretiranih sa 1, 3 ili 10 mg/kg IL-18BP ili 10.000 U IFNp bili su slični normalnom serumu miša (NMS) koji se dobija od zdravih životinja, t.j. od onih koje nemaju zapaljenskih bolesti.
Ovi nalazi pokazuju da IL-18 kontroliše nivoe IL-6 tokom početka bolesti. Budući da je IL-6 marker inflamacije, ovi nalazi pokazuju da tretman obolelog miša sa IL-18BP smanjuje inflamaciju kod ovih životinja.
Iz gore navedenih eksperimenata mogu se izvući sledeći zaključci:
• Davanje IL-T8BP smanjuje kliničku težinu artritisa,
• IL-18BP inhibira dalju progresiju ili šiirenje bolesti,
• Davanje IL-18BP smanjuje edem,
• Davanje IL-18BP smanjuje destrukciju hrskavice,
• Nivoi IL.6 u serumu se smanjuju, a odnosi lgG1/lgG2a anti Cll su smanjeni posle terapije IL-18BP.
Podaci koji su gore predstavljeni pokazuju da neutralizacija bioaktivnosti IL-18 posle početka bolesti predstavlja antireumatsku terapiju koja modifikuje bolest. Rezultati jasno pokazuju da blokada IL18 smanjuje kliničku progresiju artritisa i još važnije, zaustavlja progresiju destrukcije hrskavice i kostiju. Blokada IL18 uz pomoć IL-18BP, anti-IL-18 antitela ili ma kojim drugim agensom koji blokira IL-18 prema tome predstavlja novu terapiju antireumatsku terapiju koja modifikuje bolest.
Gore opisani specifični oblici otkrivaju opštu prirodu pronalaska tako da i drugi mogu, primenjujući tekuće znanje, da lako modifikuju i/ili podese različite aplikacije ovakvih oblika, a da se ne udalje od opšteg koncepta, i na taj način takve modifikacije i adaptacije treba i namera je da budu obuhvaćeni smislom i obimom ekvivalenata opisanih oblika. Podrazumeva se da frazeologija ili terminologija koja se ovde koristi služi samo za opis, a nikako za ograničenja.
TREĆI DEO: Primeri 11i12 kji se odnose na zapaljensku bolest creva
PRIMER 11: Ekspresija IL-18 BP u endotelijalnim ćelijama i makrofagima tokom aktivne Kronove bolesti
Uzimanje uzoraka
Biopsijom su uzeti uzorci crevne mukoze iz uzoraka koji su resecirani hirurški od pacijenata sa Kronovom bolešću (KB) i ulecroznim kolitisom (UK). Obuhvaćeno je četrnaest obolelih od KB (tri muškarca i jedanaest žena) srednje starosti 37,8 godina (raspon 20 - 78) i trajanjem bolesti od 8,3 godine (raspon 1 - 21).. Kod osam bolesnika bolest je bila locirana u ileumu,a kod šest u kolonu. Dvanaest bolesnika je bilo na imunosupresivnoj terapiji. Dijagnoza aktivne KB postavljena je histopatološkim pregledom i zasnovana na sledećim kriterijumima: prisustvo ulceraćija, povećani broj inflamatornih ćelija i transmuralno zapaljenje. Identifikovano je sedam bolesnika sa aktivnom KB i sedam sa neaktivnom. Nije bilo signifikantne razlike u starosti, lokalizaciji bolesti, polu, lekovima i trajanju bolesti između grupe obolelih od aktivne i neaktivne KB. Srednja starost 5 UC bolesnika (tri muškarca i dve žene) bila je 37,6 godina (raspon 30 - 44 godine). Kod svih je bolest bila locirana u kolonu i svi su bili na imunosupresivnoj terapiji. Prosečno trajanje bolesti bilo je 4 godine (raspon 1 - 9 godina). Kontrolni uzorci uzimani su od 5 bolesnika podrvgnutih operaciji zbog oboljenja nevezanih za IBD (tri muškarca i dve žene). Srednja starost ovih bolesnika bila je 55,2 godine (raspon 24 - 76). Kod svih bolest je bila locirana u kolonu.
Semikvantitativni R T- PCR za humani IL- 18 i IL- 18bp
Ukupna RNK ekstrahovana je iz zamrznutih intestinalnih biopsija pacijenata sa KB, UC i kontrolnih. Ekstrakcija RNK obavlhena je korišćenjem Trizola (Gibco) u skladu sa instrukcijama proizvođača. Dobijeni uzorci su kvantifikovani merenjem apsorbance na 260 nm. Integritet RNK procenjen je elektroforezom na 1% agaroznom gelu. CDNK je sintetizovana od 1 |ig cele RNK korišćenjem Promega reverznog transkripcionog sistema u skladu sa protokolom proizvođača. PCR reakcije su obavljene u ukupnoj zapremini od 50 \ x\ u prisustvu 1 J AmpliTaq DNK polimeraze (Perkin Elmer, Roche, USA), 2,5 mM dNTPa
(Amersham, SAD) i 50 pmola uzvodni f nizvodni PCR prajmera. Reakcije su inkubirane u PTC-200 Peltier Effect Thermal Cycler(MJ Research, USA) pod sledećim uslovima: denaturacija 1 min na 94°C, žarenje 1 min na 55°C i
ekstenzija 1 min na 72°C. Određen je optimalni broj ciklusa za IL-18BP, IL-18 i p-aktin pre saturacije traka (koji je iznosio 31, 28 i 25 ). PCR prajmeri su određeni na bazi objavljenih sekvenci (AF110799, D49950, X00351) na sledeći način: GCGTCACTACACTAGCTAA-3'; unapred 5'-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3'; IL- 18BP, unpared 5'-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3'; reverzno 5'-GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3'; p-aktin, reverzno 5'-GGAGGAGCAATHATCTTGATCTTC-3'; unapred 5'-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3'. Da bi se isključila amplifikacija genomskog DNK koja kontaminira uzorke, reakcije PCR su obavljane u odsustvu cDNK templata. Proizvodi PCR (?!) su analizovani na 1% agaroznom gelu elektroforezom u 1x TAE puferu. Veličina PCR poizvoda je verifikovana poređenjem sa 1 Kb DNK standard za veličinu (Gibco) po prebojavanju gela. Relativna kvantifikacija traka bojenih etidijum bromidom obavljena je korišćenjem UV svetla i Kodak Digital Sciences analitičkom softverom, i zabeležena je kao odnos ciljnog gena (hlL-18BP, hlL.18) prema genu koji se eksprimira u svim ćelijama (housekeeping) (hp-aktin).
Generisanje monoklonskih antitela protiv hlL- 18BP
Miševi BALB/c su supkutano dobijali injekcije u četiri ekstremiteta kao i u zglobove, 50 \ ±q izoforma rhlL-18BP-6his (purufikovanog iz jajnih ćelija kineskog hrčka, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Izrael) u PBS s adjuvantom (MPL + TDM Emulsion, RIBI Immunochem Research, Inc.) nultog, 7-og i 28-og dana. Četiri dana po trećoj imunizaciji, uzeti su limfni čvorovi i digestirani sa 2,4 ?g/ml kolagenaze (kolagenaze IV, VVorthington Biochemical Corp.) i 0,1% Dnase (Sigma). Izolovane ćelije su onda fuzirane s Sp2/0 mijelomskim ćelijama korišćenjem PEG 1000 (FLUKA). Ove ćelije su ponovo suspendovane u DMEM-F12 (Gibco) u prisustvu HAT (hipoksantin, aminopterin, timidin) i distribuirane u 96 udubljenja na ploči pri koncentraciji od 5 x 10"4 ćelija po ml. Uzorci supernatanta kulture hibridoma ispitivani su na prisustvo reaktivnih antitela direktnim testom. Za ovo su ELISA ploče obložene kozjim anti-miš (F(ab')2antitelima (Jackson Immuno Research, Milan analvtica, Švajcarska), dodati su i supernatanti kulture hibridoma a onda i biotinilirani rhlL-18BP-6his (purifikovani iz COS ćelija kako je već opisano - Novick i sar. 1999) sa ili bez rhlL-18
(purifikovanim iz rekombinantne E. coli, Serono Pharmaceutical Research Institute, Geneva) i konačno streptavidin-ren peroksidaza /HRP) (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Švajcarska) razvijen korišćenjem o-fenilendiamin (OPD) (Sigma). Ne-neutralizujuća antitela su odabrana i subklonirana. U ovoj studiji korišćeno je 95-H20 , mišje lgG1 monoklonsko antitelo.
Imunohistohemijske studije za lokalizaciju IL- 18bp pozitivnih ćelija
Uzorci tkiva su zamrzavani i čuvani na -80°C. Uzimani su serijske kriopreseci (10 ^m) i postavljani na poli-korišćenjem inhibitora IL-18-lizinom premazane Superfrost/Plus staklene pločice (Polylabo, Plan-les-Ouates, Švajcarska) i fiksirane ledenim acetonom. Lokalizacija humanog IL-18BP proteina analizirana je imunihistohemijski korišćenjem Mab 95-H20. Posle kraće rehidracije u PBS, ovi preseci su prethodno inkubirani 30 minuta u PBS sa dodatkom 2% fetalnog telećeg seruma (FCS) Cansera, Ontario, Kanada), 1% humanom seruma, (AB+ serum, Centar za transfuziju, Annemasse, Francuska) i 0,5% albumina goveđeg seruma (BSA) (Sigma, St. Louis, MO, USA). Aktivnost endogene peroksidaze je blokirana postavljanjem ovih slajdova u rastvor PBS, 2% FCS, 1% humanog seruma, 0,5% BSA i 1% hidrogen peroksida (H202)
(Fluka, Švajcarska) tokom 1 sat. Po ispiranju PBS, ovi preseci su inkubirani preko noći sa nerazblaženim supernatantom kulture Mab 99-H20. Po još jednom pranju sa PBS, ovi odsečci su inkubirani biotiilatiranim kozjim anti-miš antitelom (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Švajcarska) (5 ?g/ml) u PBS sa sadržajem 0,5% BSA tokom 1 sat. Osetljivost prebojavanja povećana je inkubacijom sa avidinDH/ biotiilatiranim HRP kompleksom (Vectastain Lite ABC Kit, Vector Laboratories, CA, USA) 30 minuta. "Zatim su ove staklene pločice (slajdovi) ispirani sa PBS i razvijani korišćenjem rastvora 30% H202, 3,3-amino-9-etil karbazola (AEC) (Sigma), N,N-dimetilformamida (Merck) u acetatnom puferu, pH 5. Po kontra-prebojavanju sa hematoksilinom (Sigma), ovi preseci su oblagani glicerolom i na njih su naneti slajdovi za pokrivanje. Kao kontrola izotipa korišćeni su mišja lhG1 antitela (R&D sistem).
Da bi se identifikovala ćelijska lokalizacija humanog IL-18BP, na sekcijama intestinalne mukoze rađene su imunohistohemijske studije sa dve boje. Posle 10 minutne rehidracije u PBS, ove sekcije su prethodno inkubirane 30 minuta u PBS sa dodatkom 2% FCS, 1% humanog seruma i 0,5% BSA. Za ko-lokalizaciju sa endotelijalnim ćelijama, ove sekcije su inkubirane preko noći biotinilatiranim Mab 95-H20 (20 p.g/ml) mešanim sa FITC-konjugovanim mišjim anti-humanim CD31 (1:50) (Pharmingen, CA. USA) u PBS/0,5%BSA. Za ko-lokalizaciju sa makrofagima, ovi odsečci su inkubirani preko noći biotinilatiranim Mab 95-H20 (20ng/ml) mešanim sa FITC-konjugovanim mišjim anti-humanim CD68 (Dako, Danska). Po ispiranju u PBS, streptavidin Teksas crveno (Southern Biotechnologv Associates, AL, USA) je dodavan 1 sat. Ovi slajdovi su opet ispirani i preseci su oblagani moviolom pa su onda postavljani stakleni slajdovi za pokrivanje. Kao kontrola izotipa kotišćenoje biotinilirano mišje lgG1 antitelo (Pharmingen) praćeno streptavidin Teksas crvenim.
Ćelijska kultura
U kulturi su gajene endotelne ćelije humane pupčane vene (HUVEC)
(Clonetics Corp. San Diego, CA) korišćenjem EGM (medijuma za gajenje endotelijalnih ćelija) uz dodatak humanog rekombinantnog epidermalnog faktora rasta (hEGF) (10 ng/ml), hidrokortizona (1 ?g/ml), gentamicina i amfotericina B (50??g/ml), ekstrakta goveđeg mozga (BBE) (3 mcg/ml) i 2% goveđeg fetalnog seruma (FBS) (Clonetics Corp. San Diego, CA) u skladu sa uputstvima proizvođača. Posude za kulturu tkiva su prethodno oblagane humanim fibronektinom (10 ?g/cm<2>) (Boehringer, Mannheim). Ćelije su inkubirane u humidifikovanom 5% C02 inkubatoru i eksperimenti su obavljani korišćenjem HUVEC u tri prolaza. HUVEC su tretirane humanim IL-1 p (10 ng/ml), TNFa (10 - ng/ml) i IFNy (20 ng/ml) (R&D Svstem, Nemačka) 24 sata. Na kraju perioda gajenja kulture, ćelije su prikupljene, RNK je izolovana i podvrgnuta RT-PCR na IL-18BP i IL-18 mRNKtranskript analizu. Supernatanti su prikupljeni i analizirani na IL-18BP i IL-18 proteinsku ekspresiju korišćenjem ELISA testa.
Humana monocitna ćelijska linija THP-1 je održavana u suspenziji kulture u medijumu RPMI sa dodatkom 10% toplotom inaktiviranog FCS, korišćenjem inhibitora IL-18-glutamina (2mM), penicilin-streptomicina (10 J/ml) (Gibco BRL, Life Technologies) i p-merkaptoetanola (50 M) (Fluka). Oni su inkubirani u humidifikovanom 5% C02 inkubatoru i i propuštani na 1:10 svakih 5 dana. Tri dana pre eksperimenta, humane monocitne ćelije su diferencirane pri gustini od 0,4 x 10<6>ćelija po ml s vitaminom D3 (80 nM) (Biomol Research Laboratories,
USA) i ostavljene da prianjanju. Kada su jednom diferencirane, LPS (100 ng/ml)
(Calbiochem), humani IL-1p (10 ng/ml), TNFa (10 ng/ml), i IFNy (20 ng/ml), su dodati u ćelijske kulture. Posle 48 sati, supernatanti su prikupljeni i analizirani na ekspresiju IL-18BP i IL-18 proteina korišćenjem ELISA testa.
Merenje produkcije humanog IL- 18bp i IL- 18
Prisustvo IL-18BP procenjivano je korišćenjem ELISA testa u supernatantu bez ćelija iz HUVEC, nestimulisanog i stimulisanog tokom 24 časa koktelom citokina (IL-ip, TNGa, IFNy) kao i iz ćelijske linije THP-1, nestimulisane i stimulisane tokom 24 časa (IL-1 p, TNGa, IFNy). Za ovo, ploče su preko noći oblaganecaptureMab (klon 657.27 na 0,5 ng / 10071/ po udubljenju na ploči, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Izrael) upravljenih protiv rhlL-18BP (izoform
a). Zatim je rastvorljivi hlL-18BP detektovan korišćenjem zečjeg poliklonskog antitela (razblaženog na 1/10.000) podignutog protiv rhlL-18BP-6his
(purifikovanog izjajnih ćelija kineskog hrčka, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Izrael), a zatim praćeno inkubacijom purifikovanim kozjim anti-zečjim IgG konjugovan peroksidazom (razblaženim na 1/20.000) (Jackson Immuno Research, Milan analvtica, Švajcarska). OvajcaptureMab
kao i zečje poliklonsko antitelo testirani su VVestern Blot sistemom da bi se potvrdila specifičnost IL-18BP. Kao standard korišćenje rekombinantni hlL-18BP-6his. Osetljivost ELISA testa je 100 pg/ml. Paralelno, nivoi IL-18 su kvantifikovani korišćenjem ELISA kompleta za humani IL-18 (MBL, Immunotech). Osetljivost ELISA testa je 12,5 pg/ml.
Ekspresija hlL- 18Bpa- His6 u ćelijama CHO
Rekombinantni humani IL-18BP (hlL-18Bpa His6-tag) purifikovan je iz jajnih ćelija kineskog hrčka (Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Izrael).
Rezultati
Ekspresija IL- 18BP mRNK transkripta u biopsijama creva
Analiza ekspresije IL-BP mRNK obavljana je uz pomoć RT-PCR na tkivnim homogenatima uzoraka kolona dobijenih hirurški od pacijenata s aktivnom KB, neaktivnom KB ili UC kao i iz neinflamiranog intestinalnog tkiva (SI.
14). IL-18BP i aktinski transkripti detektovani su na testiranim homogenatima creva. Isto tako, transkripti za IL-18 nađeni su u svim homogenatima KB, UC i ne-IBD kontrola (SI..14A). Odnos IL-18BP ili IL-18 prema kontrolnim nivoima aktinske mRNK pokazali su statistički signifikantan porast (kako je dole opisano) u količini transkripta za obe, i IL-18BP i IL-18, u biopsijama dobijenim od poacijenata s KB u poređenju s biopsijama pacijenata s neaktivnom KB, UC i ne-IBD kontrolama (SI. 14B i C). Ovi podaci govore da se IL-18BP ushodno reguliše u mukoznom tkivu tokom aktivne KB i daje prvi dokaz da nivoi ekspresije IL-18BP jasno prave razliku između aktivne KB sjedne strane i neaktivne KB, UC i ne-IBD kontrola.
Statistička analiza ekspresije IL- 18BP mRNK transkropta u biopsijama creva
Izvršena je analiza varijanse, grupisanjem svih podataka i jednu grupu. Rezultat jasno pokazuje statistička odstupanja koja se odnose na rezultate za jednog od pacijenata iz grupe aktivne KB (veoma visok koeficijent OD za IL-18: 16252 i veoma nizak koeficijent OD za IL-18BP: 1058). Ovaj jedini i veoma atipični parmerenja nije dozvoli validaciju ANOVA modela (p vrednost testa Shapiro-VVilks za normalnost ostataka <0,0001). Zato je odlučeno da se ovaj par zanemari u statističkoj analizi.
ANOVA model koji smo koristiti uzima u obzir faktor grupe (kontrola, aktivna KB, neaktivna KB i UC), protein (IL-18 ili IL-18BP) i broj pacijenata (23 bolesnika). Postoji signifikantna razlika među grupama (vrednost p<0,0001). Interesantno je i napomenuti da razlika OD odnos između IL-18 i IL-18BP nije signifikantan (vrednost p = 0,369). Štaviše, urađena je i korelacija između ekspresije IL-18 i IL-18BP. Koeficijent korelacije korelacija između ekspresije IL-18 i IL-18BP jednak je 0,67, što govori o jakoj vezi između OD odnosa merenog - za IL-18 i IL-18BP. Prateći rezultate za efekte grupe, upotrebljen je metod Scheffea da se uporede različite grupe. Može se zaključiti da je OD odnos za aktivnu KB signifikantno veći od kontrolnog (+3280) UC (+2590) a posebno za neaktivnu KB (+4580) za ekspresiju kako IL-18 tako i IL-18BP.
Imunohistohemijska lokalizacija IL- 18BPu crevnom tkivu
Za procenu ćelijske ekspresije IL-18BP in situ, obavljena je imunohistohemijsa korišćenjem antihlL-18BP specifičnih monoklonskih antitela na kriosekcijama pripremljenim iz intestinalnog tkiva dobijenog od pacijenata sa aktivnom KB i kontrolnim ispitanicima bez IBD. IL-18BP pozitivne ćelije su detektovane u lamini proprii, submukozi i u mišićnom sloju (nije prikazano). Pozitivno prebojene mononuklearne ćelije u lamini proprii i submukoza imale su obilnu citoplazmu, vezikularna retiformna jedra i bile su morfološki konzistentne sa tkivnim makrofagima. U mišićnom sloju, pozitivno prebojene ćelije imale su obilnu citoplazmu, s ponekad otvorenim lumenom u sredini sugerišući pozitivno prebojavanje mikro sudova, a bile su morfološki konzistentne sa endotelijalnim ćelijama. Inhibitor IL-18 veliki sudovi su bili specifično bojeni anti-hlL18-BP monoklonskim antitelima. Značajan porast pozitivno prebojenih ćelija koji je primećen u uzorcima pacijenata sa aktivnom KB u poređenju sa uzorcima kontrole bez IBD korelisao je sa povećanom ekspresijom IL-18BP zabeleženom analizom RT-PCR. Okolni preseci inkubirani su odgovarajućom kontrolom mišjeg izotipa.
Identifikacija ćelija koje produkuju IL- 18BP prisutnih u biopsiji mukoze
IL-18BP pozitivne ćelije prisutne u inflamiranom intestinalnom tkivu identifikovane su korišćenjem specijalnih markera makrofaga (anti-CD68) i endotelijalnih ćelija (anti-CD31) (nije prikazano). CD68 pozitivne ćelije (zeleno) i IL-18BP pozitivne ćelije (crveno) detektovane su u lamini proprii i submukozi intestinalnog tkiva sa aktivnom KB (nije prikazano). CD31 pozitivne ćelije (zeleno) i IL-18BP pozitivne ćelije (crveno) detektovane su u submukozi. Da bi se potvrdilo da su makrofagi i endotelijalne ćelije takođe pozitivne na IL-18BP, obe boje, zelena od anti-CD68 ili anti-CD31 i crvena od anti-IL-18BP analizirane su zajedno pokazujući da sve ćelije koje vezuju anti-IL-18BP antitela su ili CD-68 ili CD-31 pozitivne (narandžasto-žuta boja). Dvostruko imunološko obeležavanje . pokazalo je da makrofagi i endotelijalne ćelije predstavljaju glavni izvor IL-18BP prebojavanja u inflamiranom tkivu dobijenom od obolelih od KB.
Ekspresija IL- 18BP mRNK i proteina u endotelijalnim ćelijama
Da bi se ispitala sposobnost humanih ćelija da produkuju IL-18BP kao i da se potvrde rezultati dobijeni imunološkim prebojavanjem i RT-PCR na totalnim biopsijama, obavljeni su dodatni eksperimenti RT-PCR na endotelijalnim ćelijama humane pupčane vene (HUVEC) (SI. 15A). Endotelijalne ćelije su tretirane koktelom citokina (hlL-1 p, hTNFa, hlNFy) i prikupljane posle 24 sata za ekstrakciju RNK i analizu PCR. Odnos IL-18BP prema kontrolnim nivoima mRNK aktina pokazao je povećanje količine IL-18BP transkripta kod tretiranih kontrola u poređenju s stimulisanim ćelijama posle 24 sata. Štaviše IL-18BP mRNK je izgleda konstitutivno eksprimirana u endotelijalnim ćelijama. Nivo IL-18BP mRNKje takođe analiziran i pokazan je blag porast tretiranih ćelija. Međutim, IL-18 mRNK nije eksprimiran u nestimulisanim endotelijalnim ćelijama.
ELISA sa supematantima kulture nestimulisanih ćelija (medijum) i HUVEC tretirani 24 sata otkrili su daje IL-18BP protein bio prisutan i u medijumu i u stimulisanom ćelijama povećanjem od 30X posle 24-satne stimulacije (SI. 15B).
Ekspresija IL- 18BP proteina monocitnom ćelijskom linijom ( THP- 1)
Ekspresija IL-18 i IL-18BP je analizirana u supernatantu kulture nestimulisanih i stimulisanih diferenciranih THP-1 ćelija ELISA testom (SL. 15C). Ovaj eksperiment je otkrio porast IL-18BP ekspresije posle 48 sati stimulacije s LPS, hIL-ip, hTNFa i hlFNy. Paralelno, sekrecija IL-18 je povećana po stimulaciji (SI. 15C).
Rezime
U ovoj studiji, određivana je ekspresija IL-18BP i lokalizcija mukoznih ćelija dobijenih od pacijenata s Kronovom bolešću i ulceroznim kolitisom. Korišćenjem semikvantitativnog RT-PCR protokola, utvrđeno je da su transkripti IL-18BP mRNK povećani u mukoznim biopsijama pacijenata s aktivnom Kronovom bolešću u poređenju sa onima sa ulceroznim kolitisom i kontrolnim pacijentima bez zapaljenja. Imunohistohemijska analiza mukoznih biopsija lokalizovala je IL-18BP proteine u endotelijalnim ćelijama i makrofagima koji infiltriraju mukozu tokom Kronove bolesti. Ekspresija IL-18BP u endotelijalnim ćelijama i aktiviranim makrofagima potvrđena je u primarnim endotelijalnim ćelijama humane pupčane vene (HUVES) i u THP1 monocitnoj ćelijskoj liniji stimulisanimin vitro.PO stimulaciji, ove ćelije su sekretovale bioaktivni IL-18BP.
PRIMER 12: Tretman inhibitorima IL- 18 ublažava eksperimentalni kolitis
Materijal i metode
Miševi i indukcija kolitisa
Etički komitet za studije na životinjama Univerziteta u Amsterdamu, Holandija, odobrio je sve eksperimente. BALB/c miševi su dobijem' iz Harlan Sprague Dawley Ine (Horst, Holandija). Miševi su čuvani u standardnim uslovima i dobijali su pijaću vodu i hranu (AM-II 10 mm, Hope Farms, VVoerden, Holandija).
Eksperimenti su obavljani na ženkama BALB/c miševa starim 8 i 10 nedelja. Kolitis je indukovan rektalnom administracijom dve doze (odvojene sedmodnevnim intervalom) 2 mg 2,4,6-trinitrobenzen sulfonske kiseline (TNBS)
(Sigma Chemical Co. St. Lous, MO, USA) u 40% etanolu (Merck, Darmstadt, Nemačka) korišćenjem vinilnog katetera koji je postavljan 3 cm od anusa (10 miševa po grupi). Tokom instilacije, miševi su bili anestezirani izofluranom (1-hloro-2,2,2-tirfiuoroetil-izofluran-difluorometil-eter, Abbott Laboratories Ltd. Oueenborough, Kent, Velika Britanija) i posle instilacije oni su držani vertikalno 60 sekundi. Kontrolni miševi su žrtvovani devetog dana po prvoj primeni TNBS (t.j. 48 sati po drugom davanju TBNS).
Miševi su tretirani humanim IL-18BP u 500 (il 0,9% fiziološkom rastvoru intraperitonealno.
HIL-18BP je S puta histidinom obeležen humani rekombinantni protein proizveden u ekspresionom sistemu CHO. Ovaj hlL-18BP je bio biološki aktivan jer je inhibirao produkciju IFNy u ćelijskoj liniji KG-1 i smanjivao produkciju IFNy u ćelijama slezine miša (Kim i sar. 2000).
Procena inflamacije
Telesna težina je merena svakodnevno. Po žrtvovanju životinja uzeti su im slezina, kaudalni limfni čvorovi i kolon. Koloni su uklanjani incizijom po srednjoj liniji i longitudinalno otvarani. Po uklanjanju fekalnog sadržaja, mokra težina distalnih 6 cm je zabeležena i korišćena kao indeks zadebljanja intestinalnog zida vezanog za bolest. Posle toga, ovi koloni su londitudinalno podeljeni u dva dela, od kojih je jedan korišćen za histološku analizu.
Histološka analiza
Londitudinalno podeljeni koloni su urolani, fiksirani u 4% formalinu i ukalupljeni u parafin za rutinsku histologiju. Dva istraživača nisu znala način tretmana miševa kada su ocenjivali sledeće parametre: 1) procenat zahvaćene površine, 2) hiperplazuju folikularnih agregata, 3) edem, 4) eroziju/ulceraciju, 5) gubitak kripta, i 6) infiltraciju mono- i polinukleranih ćelija. Procenat zahvaćene površine i gubitak kripta ocenjivani su na skali od 0 do 4 na sledeći način: 0 - normalno; 1 - manje od 10%; 2 - 10%; 3 - 10% - 30%; 4 - preko 50%. Erozije su definisane kao 0 ako je epitelijum bio intaktan; 1 za zahvaćenost lamine proprie; 2 za ulceracije koje zahvataju submukozu, i 3 kada su ulceracije bile transmuralne. Težina ostalih parametara određivana je na skali od 0 do 3 na sledeći način: 0 - nema; 1 - blago; 2 - umereno, 3 - teško. Ovi skorovi su, znači mogli da se kreću od 0 do najviše 26 poena.
Homogenati kolona
Kolon je uziman, a homogenati su pravljeni u tkivnom homogenatoru u 9 zapremina Greenburger lizispufera (300 mM NaCI, 15 mM Tris,, 2 mM MgCI, 2 mM Triton (X-100), Pepstatin A, Lupeptin, Aprotinin (svi 20 ng/ml), pH 7,4). Tkivo je lizirano 30 minuta na ledu po dva centrifugiranja (10 min, 10.000 g). Homogenati su čuvani na -20°C do upotrebe.
Kultura ćelija i ELISA za citokine
Za pripremu suspenzije slezine i ćelija kaudalnih limfnih čvorova korišćene su cediljke za filtriranje ćelija (Beckton/Dickinson Labvvare, new Jersey, USA). Ćelije su supendovane u RPMI 1640 medijumu (BioVVhittaker-Boehringer, Verviers, Belgija) sa sadržajem 10% FCS i ciproksina (10 ng/ml) (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA). Ćelije slezine su centrifugirane s sterilnim Ficoll (Pharmacia, Uppsala, Švedska), mononukleame ćelije su prenesene u RPMI i brojane su ćelije u suspenziji. Ukupni broj od 1 x 105 ćelija po mišu inkubiran je u 200 \ x\ RPMI (BioVVhittaker Europe, A Cambrex Company, Verviers, Belgija) sa sadržajem antibiotika i 10% seruma fetusa teleta u triplikatnim udubljenjima. Ćelije su stimulisane prethodnim oblaganjem anti-CD3 antitelima (koncentracija 1:30; Pharmingen). Supernatanti su uklanjani posle 48 sati pa su ELISA testom merene koncentracije IFNy (Pharmingen) i TNFa /R&D Systems, Abingdon, Velika Britanija).
Flou citometrija
Izolovane ćelije slezine isprane su Facs puferom (PBS, sa sadržajem 0,5% BSA, 0,3 mmol/korišćenjem inhibitora IL-18 EDTA i 0,1% natrijum azida) i čuvane na ledu do kraja postupka. Inkubirano je 2 ■ 105 ćelija po udubljenju(mikroploča oblika V sa 96 udubljenja, Greiner B.V. labor techniek, Alphen aan de Rijn, Holandija) sa sledećim antitelima (mAbs): Cy-hromom-konjugovani anti-m+šji CD4 pacova (klon RM4-5), Fitc-konjugovani pacovski anti-mišji CD69 pacova i Fitc-konjugovani anti-mišji CD25 pacova (Pharmingen, San Diego, CA). Limfociti su propuštani prednjim i bočnim rasipanjem korišćenjem FACScan flou citometra u kombinaciji sa Fascan softverom (Becton Dickinson, Mountain View, USA) i izbrojano je 5000 ćelija. Rezultati su izraženi kao procenat otvorenih ćelija pozitivnih na korišćena mAbs.
Statistička analiza
Vrednosti su date kao srednja vrednosti i SEM po tretiranoj grupi. Razlike između grupa su analizirane ne-parametrijskim Mann-Whitney U testom. Promene težine tokom vremena analizirane su jednosmernom analizom varijanse. Vrednost p<0,05 smatrana je signifikantnom. Za sve analize korišćen je statistički softver SPSS (SPSS Inc. Čikago, USA).
Rezultati
IL- 18BP štiti od gubitka telesne težine u mišjem modelu kolitisa
Da bi se ispitala uloga IL-18 u eksperimentalnom kolitisu i posebno zaštitno dejstvo IL-18 vezujućeg proteina (IL-18BP) TNBS kolitis je izazivan kod BALB/c miševa. Ovaj model se sastoji od lokalnog izlaganja tri-nitrobeznen sulfonskoj kiselini (TNBS) u 40% etanolu. Ovo izaziva odloženu reakciju preosetljivosti na haptenom (trinitrofenil) modigikovani auto antigen i odgovor je jedan Th-1 tip s pojačanom produkcijom zapaljenskih citokina.
Miševi su tretirani humanim IL-18BP ili kontrolom, intrapeirtonealno (i.p.) svakodnevno.
Svakodnevne intraperitonealne doze u rasponu od 12,5 uig do 50 u.g hlL-18BP nisu uticale na težinu bolesti (podaci nisu prikazani). Međutim, svakodnevno intrapeirtonealno korišćenje doze od 200 fig ML-18BP efikasno je ublažavalo gubitak težine vezan za indukciju bolesti.
Kao što se očekivalo, intrarektalna instilacija TBNS je dovela do dijareje i gubitka težine. Kako je prikazano na SI. 16, životinje su u obe tretirane grupe gubile 15% bazalne težine do trećeg dana. Međutim, za razliku od kontrolnih miševa, od četvrtog dana po instilaciji TNBS, životinje tretirane hlL-18BP brzo su se oporavile od inicijalnog gubitka težine, vraćali su se na bazalnu telesnu težinu osmog dana. Kod kontrolnih miševa, drugo davanje TBNS osmog dana ponovo je izazivalo signifikantan gubitak telesne težine koji je esencijalno sprečen davanjem hlL-18BP. Davanje hlL-18BP miševima tretiranim fiziološkim rastvorom nije imalo dejstva (podaci nisu prikazani). Otuda, davanje hlL-18BP je signifikantno ublažavalo gubitak telesne težine praćen kolitisom izazvanim davanjem TNBS (p<0,05).
Dejstvo na parametre zapaljenja
Desetog dana miševi su bili žrtvovani i određivana je težina poslednjih 6 centimetara kolona (SI. 17A). U kolitisu izazvanom TBNS težina kolona povećava se u poređenju sa miševima tretiranim fiziološkim rastvorom (181,6 mg ± 11,4 u poređenju sa 268 mg ±27,3 kod miševa tretiranih fiziološkim rastvorom (p<0,05)). Još ranije je zabeleženo da je kolitis izazvan TBNS praćen povećanom migracijom ćelija u kaudalne limfne čvorove (Camoglio i sar. 2000).Tretman IL-18BP je smanjio broj ćelija koje dolaze u kaudalne limfne čvorove u poređenju sa brojem ćelija u kaudalnim limfnim čvorovima TBNS miševa stretiranih fiziološkim rastvorom (SI. 17B).
Promena ekspresije CD69, koji je rani marker aktivacije T limfocita, određivan je Fascan analizom (SI. 17C). Procenat CD4+ ćelija slezine koje eksprimiraju CD69 iznosio je 11,4% kod miševa tretiranih TBNS, ali kod TBNS miševa tretiranih hlL-18BP procenat CD4+/CD69 bio je 7,3% (p<0,05).
Produkcija citokina u slezini, ćelijama kaudalnih limfnih čvorova i homogenatu
kolona
Da bi se ispitalo dejstvo hlL-18BP na sposobnost T-limfocita da produkuju sintezu pro-inflamatomih citokina po aktivaciji receptora T-ćelija, ćelije su izolovane iz kaudalnih limfnih čovorova i slezine i stimulisane 48 sati anti CD3/CD28 antitelima. U supernatantima je merena produkcija IFNy i TNFa (Slika 18). Nisu zabeležene signifikantne razlike između produkcije citokina između miševa tretiranih hlL-18BP i kontrole. Znači, neutralizacija IL-18 uz pomoć hIL-18BP nije dovela do generalizovanog smanjenja sposobnosti T-limfocita da odgovori na aktivaciju receptora T-ćelija.
Homogenati kolona su analizirani na njihove nivoe citokina i na taj način je merena lokalna produkcija citokina (SI. 19). Nije utvrđena razlika u nivoima IFNy u homogenatima kolona TNBS miševa i TNBS miševa tretiranih hlL-18BP (134 pg/ml ± 7,8 i 138 ±23). Međutim, nivoi TNFa su bili signifikantno smanjeni u homogenatima kolona miševa tretiranih hlL-18BP sa 110 pg/ml ± 3 kod TNBS miševa na 59 pg/ml ± kod TNBS miševa tretiranih hll_-18BP.
Histološki nalazi
Da bi se ispitalo da lije smanjenje inflamatornih parametara posredovano hlL-18BP uticalo i na histološki skor, na parafinskim presecima je urađen histopatološki pregled. Ukupni inflamatorni skor na ovoj histologiji bio je signifikantno smanjen kod TNBS miševa tretiranih hlL-18BP u poređenju sa kontrolnim (15,9 ± 1 kod netretiranih miševa u poređenju sa 9,8 ± 1,3 kod TNBS miševa tretiranih hlL-18BP) (nije prikazano), uglavnom kao rezultat smanjenja broja leukocita koji inflitriraju mukozu (p < 0,05). Izvanredan rezultat je bio potpuno odsustvo mukoznih ulceracija kod TNBS miševa tretiranih hlL-18BP (p < 0,05). Ovi rezultati su rezimirani na Tabeli 2 dole. Kompletna prevencija ulceracija kod TNBS miševa tretiranih hlL-18BP je posebno upečatljiva.
Anti- mlL- 18 poliklonska antitela štite od bolesti u mišjem modelu kolitisa
izazvanog dekstran- sulfat natrijumom
U ovom modelu, dekstran sulfat natrijum (DSS) id davan je sa pijacom vodom od nultog dana do žrtvovanja životinja. Anti-IL-18BP poliklonska antitela su davana nultog, 4 i 8 dana i.p. Doze su se kretale u rasponu od 200 i 400 ?l zečjeg seruma. Najveća doza (400^l) dovela je do signifikantnog gubitka telesne težine, smanjenja kiiničkog skora, rektalnog krvarenja i skraćenja kolona (nije prikazano). Tretman zečjim anti-mlL-18 pokazao je usporenje početka bolesti i sprečavao je progresiju (nije prikazano).
Rezime
U Primeru 12 koji je gore prikazan pokazana je neutralizacija IL-18 davanjem bilo hlL-18BP ili poliklonskog antiseruma protiv IL-18 kojim se efikasno smanjivala težina eksperimentalno izazvanog kolitisa kod miševa.
Miševi koji su svakodnevno intrapeirtonealno tretirani hlL-18BP brzo su se oporavili od primarnog gubitka težine u poređenju sa kontrolnim životinjama., inhibitor IL-18 ostali parametri inflamacije kolona mereni težinom kolona i influksom ćelija u kaudalne limfne čvorove bili su smanjeni kod miševa tretiranih hlL-18BP. Histopatologija tretiranih miševa odlikovala se smanjenjem težine destrukcije tkiva (ulceracija) i značajnim smanjenjem količine infiltrativnih ćelija . Dejstvo hlL-18BP je bilo i sistemsko, kako je već pokazano smanjenom ekspresijom CD69 u ćelijama slezine.
Lokalna produkcija TNFa merena u homogenatima kolona signifikantno je bila smanjena kod TNBS miševa tretiranih hlL-18BP. Ovo govori da TNFa igra važnu ulogu u progresiji bolesti. Nivoi IFNy su bili slični kod kontrolnih TNBS miševa i TNBS miševa tretiranih hlL-18BP, što može da se objasni velikim brojem stimulusa koji indukuju IFNy.
U zaključku, podaci koji su gore prikazani pokazuju blagotvorno dejstvo inhibitora IL.-18 u lečenju zapaljenske bolesti creva.

Claims (52)

1. Korišćenje inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju oštećenja jetre.
2. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 1, naznačeno time da je oštećenje jetre akutno.
3. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 1, naznačeno time da je oštećenje jetre hronično.
4. Korišćenje u skladu sa Zahtevima od 1-3, naznačeno time da je to oštećenje jetre alkoholni hepatitis, virusni hepatitis, imuni hepatitis, fulminantni hepatitis, ciroza jetre i primarna bilijarna ciroza.
5. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 4, naznačeno time da je to oštećenje jetre fulminantni hepatitis.
6. Korišćenje inhibitora IL-18 u proizvodnji medikamenata za lečenje i/ili prevenciju artritisa.
7. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 6, naznačeno time da je taj artritis inflamatorni artritis.
8. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 7, naznačeno time da je taj. inflamatorni artritis reumatoidni artritis.
9. Korišćenje inhibitora IL-18 u proizvodnji medikamenata za lečenje i/ili prevenciju destrukcije hrskavice.
10. Korišćenje inhibitora IL-18 u proizvodnji medikamenata za lečenje i/ili prevenciju zapaljenske bolesti creva.
11. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 10, naznačeno time da je ta zapaljenska bolest creva Kronova bolest.
12. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 10, naznačeno time da je ta zapaljenska bolest creva inflamatorni kolitis.
13. Korišćenje u skladu sa Zahtevima 1-12, naznačeno time da se taj inhibitor IL-18 odabira iz inhibitora kaspaze-1 (ICE), antitela protiv IL-18, antitela protiv ma koje pod podjedinica IL-18 receptora, inhibitora signalnog puta IL-18, antagonista IL-18 koji su u konkurenciji sa IL-18 i blokiraju receptore IL-18, i IL-18 vezujući proteini, njihovi izoformi, muteini, fuzirani proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili cirkularno permutovani derivati koji imaju suštinski istu aktivnost kao IL-18 vezujući protein.
14. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 13, naznačeno time da je taj inhibitor IL-18 jedno IL-18 antitelo.
15. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 14, naznačeno time da je taj inhibitor IL-18 jedno humanizovano IL-18 antitelo.
16. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 15, naznačeno time da je taj inhibitor IL-18 jedno humano IL-18 antitelo.
17. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 13, naznačeno time daje taj inhibitor IL-18 jedan IL-18 vezujući protein, njegovi izoformi, muteini, fuzirani proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili cirkularno permutovani derivati.
18. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 17, naznačeno time da je taj IL-18 vezujući protein PEGilisan.
19. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 17, naznačeno time da je taj inhibitor IL-18 fuzirani protein koji obuhvata sve ili neke delove jednog IL-18 vezujućeg proteina koji je fuziran za sve ili neke delove jednog imunoglobulina i gde se taj fuzirani protein vezuje za IL-18.
20. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 19, naznačeno time da taj fuzirani protein obuhvata sve ili neke delove konstantnog regiona jednog imunoglobulina.
21. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 19, naznačeno time da je taj imunoglobulinizotip lgG1 ili lgG2.
22. Korišćenje u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da ovaj medikament obuhvata još i interferon.
23. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 22 naznačeno time da je taj interferon zapravo interferon-p.
24. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 22 ili 23, naznačeno time da se inhibitor IL-18 koristi istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno od interferona.
25. Korišćenje u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da ovaj medikament obuhvata još i antagonist faktora tumorske nekroze (TNF).
26. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 25, naznačeno time da je antagonista TNF zapravo TBPI i/ili TBPII.
27. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 25, naznačeno time da se inhibitor IL-18 i/ili interferon koriste istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno od antagonista faktora tumorske nekroze (TNF).
28. Korišćenje u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da ovaj medikament obuhvata još i COX-inhibitor.
29. Korišćenje u skladu sa Zahtevom 25, naznačeno time da je COX-inhibitor zapravo COX-2 inhibitor.
30. Korišćenje u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da se inhibitor IL-18 koristi u količini od oko 0,0001 do 10 mg/kg telesne težine, ili oko 0,01 do 5 mg/kg telesne težine, ili oko 0,01 do 3 mg/kg telesne težine, ili oko 1 do 2 mg/kg telesne težine.
31. Korišćenje u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da se inhibitor IL-18 koristi u količini od oko 0,1 do 1000^g/kg telesne težine, ili 1 do 100ng/kg telesne težine, , ili 10 do 50ng/kg telesne težine.
32. Korišćenje u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da se inhibitor IL-18 daje supkutano.
33. Korišćenje u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da se inhibitor IL-18 daje intramuskulamo.
34. Korišćenje u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da se inhibitor IL-18 daje svakodnevno.
35. Korišćenje u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da se inhibitor IL-18 daje svaki drugi dan.
36. Korišćenje vektora ekspresije koji obuhvata sekvencu kodiranja inhibitora IL-18BP za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju oštećenja jetre.
37. Korišćenje vektora ekspresije koji obuhvata sekvencu kodiranja inhibitora IL-18BP za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju artritisa.
38. Korišćenje vektora ekspresije koji obuhvata sekvencu kodiranja inhibitora IL-18BP za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju zapaljenske bolesti creva artritisa.
39. Korišćenje u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva za gensku terapiju.
40. Korišćenje vektora za indukovanje i/ili pojačanje endogene produkcije inhibitora IL-18 u ćeliji za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju oštećenja jetre.
41. Korišćenje vektora za indukovanje i/ili pojačanje endogene produkcije inhibitora IL-18 u ćeliji za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju artritisa.
42. Korišćenje vektora za idnukovanje i/ili pojačanje endogene produkcije inhibitora IL-18 u ćeliji za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju zapaljenske bolesti creva.
43. Korišćenje ćelije koja je genetski modifikovana za proizvodnju inhibitora IL-18 za za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju oštećenja jetre.
44. Korišćenje ćelije koja je genetski modifikovana za proizvodnju inhibitora IL-18 za za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju artritisa.
45. Korišćenje ćelije koja je genetski modifikovana za proizvodnju inhibitora IL-18 za za proizvodnju medikamenata za lečenje i/ili prevenciju zapaljenske bolesti creva.
46. Farmaceutski sastav koji obuhvata terapijski efikasnu količinu inhibitora IL-18 i terapijski efikasnu količinu interferona.
47. Farmaceutski sastav koji obuhvata terapijski efikasnu količinu inhibitora IL-18 i terapijski efikasnu količinu antagonista TNF.
48. Farmaceutski sastav koji obuhvata terapijski efikasnu količinu inhibitora IL-18 i terapijski efikasnu količinu inhibitora COX-2.
49. Farmaceutski sastav koji obuhvata terapijski efikasnu količinu inhibitora IL-18 i terapijski efikasnu količinu svih od sledećih, ili samo nekih od sledećih supstanci: interferona, antagoniste TNF ili inhibitora COX-2.
50. Metodu za tretman i/ili prevenciju oboljenja jetre koji obuhvata davanje efikasne inhibirajuće doze IL-18 inhibitora domaćinu kome je to potrebno.
51. Metodu za tretman i/ili prevenciju artritisa koji obuhvata davanje efikasne inhibirajuće doze IL-18 inhibitora domaćinu kome je to potrebno.
52. Metodu za tretman i/ili prevenciju zapaljenske bolesti creva koji obuhvata davanje efikasne inhibirajuće doze IL-18 inhibitora domaćinu kome je to potrebno.
RS20200357A 2016-04-29 2017-04-28 Dodaci ishrani RS60402B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1630098 2016-04-29
SE1730056 2017-03-03
EP17720135.7A EP3379944B1 (en) 2016-04-29 2017-04-28 Nutritional supplements
PCT/EP2017/060261 WO2017186940A1 (en) 2016-04-29 2017-04-28 Nutritional supplements

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60402B1 true RS60402B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=58640898

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200357A RS60402B1 (sr) 2016-04-29 2017-04-28 Dodaci ishrani

Country Status (22)

Country Link
US (4) US11510430B2 (sr)
EP (2) EP3379944B1 (sr)
JP (1) JP6980761B2 (sr)
KR (1) KR102458275B1 (sr)
CN (1) CN109152399B (sr)
AU (1) AU2017255960B2 (sr)
CA (1) CA3022192C (sr)
CY (1) CY1123032T1 (sr)
DK (2) DK3662764T3 (sr)
ES (2) ES2782201T3 (sr)
HR (1) HRP20200510T1 (sr)
HU (1) HUE049195T2 (sr)
LT (1) LT3379944T (sr)
MX (1) MX2018013148A (sr)
PL (1) PL3379944T3 (sr)
PT (2) PT3662764T (sr)
RS (1) RS60402B1 (sr)
RU (1) RU2739601C2 (sr)
SI (1) SI3379944T1 (sr)
SM (1) SMT202000218T1 (sr)
WO (1) WO2017186940A1 (sr)
ZA (1) ZA201807868B (sr)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3095096A1 (en) 2018-03-27 2019-10-03 Laminaria Group Ab Nutritional supplements
CN117356669A (zh) * 2022-06-29 2024-01-09 水力速健康科技(深圳)有限公司 用于制备功能饮料的饮料混合物、功能饮料及其制备方法

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2935409A (en) 1956-11-12 1960-05-03 Alginate Ind Ltd Powdered alginate jelly composition and method of preparing the same
US5866190A (en) * 1995-03-16 1999-02-02 Systems Bio-Industries Composition for the stabilization of acid drinks
US5980968A (en) 1996-10-09 1999-11-09 Booth; Garcia Paul Controlled-release formula for performance drinks
EP0980214B1 (en) * 1996-11-12 2005-09-21 Garcia Paul Booth Controlled-release formula for performance drinks
DE29701817U1 (de) 1997-02-03 1997-03-20 Falarzik, Andreas, Dr.med., 44866 Bochum Optimales, isotonisches Sportgetränk
GB2327074B (en) 1997-07-07 2001-09-12 Norsk Hydro As Improvements in or relating to capsules
US6475539B1 (en) * 1998-05-07 2002-11-05 Abbott Laboratories Nutritionally complete low pH enteral formula
SE512093C2 (sv) 1998-05-22 2000-01-24 Dan W Ericson Förfarande och anordning för tillförsel av definierade energimängder
US6774111B1 (en) * 2000-03-14 2004-08-10 Abbott Laboratories Carbohydrate system and a method for providing nutrition to a diabetic
CA2449202A1 (en) 2001-05-23 2002-11-28 Institut National De La Recherche Scientifique Biocompatible compositions as carriers or excipients for pharmaceutical and nutraceutical formulations and for food protection
US6989166B2 (en) * 2001-12-20 2006-01-24 N.V. Nutricia Soft drink replacer
US6884445B2 (en) * 2001-12-20 2005-04-26 N.V. Nutricia Matrix-forming composition containing pectin
AU2004267938B2 (en) * 2003-09-03 2007-11-22 Ksf Acquisition Uk Limited Satiety enhancing food compositions
RU2350123C2 (ru) 2003-09-03 2009-03-27 Юнилевер Н.В. Пищевые композиции, усиливающие чувство сытости
US20060093720A1 (en) * 2004-10-28 2006-05-04 Ed Tatz Pumpable, semi-solid low calorie sugar substitute compositions
US20070087038A1 (en) 2005-10-05 2007-04-19 Fmc Biopolymer As Gelling compositions and methods
US20070082114A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Catani Steven J Methods for reducing weight
US20070082029A1 (en) 2005-10-07 2007-04-12 Aimutis William R Fiber satiety compositions
CA2624554A1 (en) 2005-10-07 2007-04-19 Cargill, Incorporated Fiber satiety compositions
MX2009001608A (es) * 2006-08-24 2009-02-23 Unilever Nv Composicion liquida que aumenta la saciedad.
US8563066B2 (en) * 2007-12-17 2013-10-22 New World Pharmaceuticals, Llc Sustained release of nutrients in vivo
WO2009079537A1 (en) * 2007-12-17 2009-06-25 New World Pharmaceuticals, Llc Sustained release of nutrients in vivo
EP2098124A1 (en) * 2008-03-03 2009-09-09 Nestec S.A. Carbohydrate gel
US20100196577A1 (en) * 2009-02-03 2010-08-05 Tropicana Products, Inc. Microencapsulated citrus phytochemicals comprising citrus limonoids and application to sports drinks
US8518448B2 (en) 2009-06-26 2013-08-27 Robert Niichel Sustained release beads and suspensions including the same for sustained delivery of active ingredients
US8663714B2 (en) 2009-11-26 2014-03-04 D.Xign Limited Appetite regulating dietary supplement
US20110135791A1 (en) 2009-12-07 2011-06-09 The Coca-Cola Company Concentrate composition for providing edible calcium-fortified products using stabilized buffering protein component
MY171835A (en) * 2012-12-25 2019-11-01 Taisho Pharmaceutical Co Ltd Aqueous carbonated beverage
JP6408984B2 (ja) 2013-06-14 2018-10-17 株式会社カネカ 液状食品組成物の製造方法
EP3013156A1 (en) 2013-06-24 2016-05-04 N.V. Nutricia Induced viscosity fibre system for the treatment or prevention of gastro-oesophageal reflux (gor)
US20150118365A1 (en) 2013-10-31 2015-04-30 Steven J. Hollenkamp Alcohol containing beads and method for making same
JP6284264B2 (ja) * 2013-11-06 2018-02-28 ユニテックフーズ株式会社 新規なゲル化剤
CN105454967A (zh) * 2015-12-11 2016-04-06 北京康比特体育科技股份有限公司 一种减缓运动疲劳或提高运动能力的组合物及其运动饮料
US20180000743A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Wake Forest University Modified Alginate Hydrogels for Therapeutic Agents, their Preparation and Methods Thereof

Also Published As

Publication number Publication date
PT3662764T (pt) 2022-01-26
KR20190008542A (ko) 2019-01-24
SI3379944T1 (sl) 2020-07-31
DK3662764T3 (da) 2022-01-24
RU2018141144A3 (sr) 2020-07-17
RU2739601C2 (ru) 2020-12-28
CY1123032T1 (el) 2021-10-29
US12121050B2 (en) 2024-10-22
EP3379944B1 (en) 2020-01-01
ES2782201T3 (es) 2020-09-11
PT3379944T (pt) 2020-04-03
DK3379944T3 (da) 2020-04-06
US20250134150A1 (en) 2025-05-01
EP3379944A1 (en) 2018-10-03
ES2902450T3 (es) 2022-03-28
KR102458275B1 (ko) 2022-10-24
CA3022192A1 (en) 2017-11-02
WO2017186940A1 (en) 2017-11-02
ZA201807868B (en) 2020-05-27
HRP20200510T1 (hr) 2020-07-10
US20200187541A1 (en) 2020-06-18
NZ748521A (en) 2025-02-28
BR112018077016A2 (pt) 2024-01-09
AU2017255960B2 (en) 2021-10-21
SMT202000218T1 (it) 2020-05-08
RU2018141144A (ru) 2020-05-29
MX2018013148A (es) 2019-04-22
JP2019514427A (ja) 2019-06-06
EP3662764A1 (en) 2020-06-10
HUE049195T2 (hu) 2020-09-28
LT3379944T (lt) 2020-04-10
CN109152399B (zh) 2023-07-18
JP6980761B2 (ja) 2021-12-15
US20230225384A1 (en) 2023-07-20
EP3662764B1 (en) 2021-10-27
US11510430B2 (en) 2022-11-29
CA3022192C (en) 2023-11-21
CN109152399A (zh) 2019-01-04
AU2017255960A1 (en) 2018-12-06
PL3379944T3 (pl) 2020-06-15
US20190133171A1 (en) 2019-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS51737B (sr) Korišćenje inhibitora il-18
AU2001240636A1 (en) Use of IL-18 inhibitors
US20110177065A1 (en) Methods of treating/preventing inflammation using combination of il-1 antagonist and il-18 binding protein
RS60402B1 (sr) Dodaci ishrani
CA2456247C (en) Use of il-18 inhibitors in hypersensitivity disorders
AU2002331376A1 (en) Use of IL-18 inhibitors in hypersensitivity disorders
ES2365600T3 (es) Uso de inhibidores de il-18.
HK1051965B (en) Use of il-18 inhibitors