MXPA02004118A - Peptidos para el tratamiento de la disfuncion erectil. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a los peptidos pequenos que provocan erecciones del pene en animales macho cuando se inyectan en el nucleo paraventricular del hipotalamo o cuando se administran sistemicamente (intravenosamente o subcutaneamente) a tales animales. Estos peptidos son utiles en el tratamiento de la disfuncion erectil.

Description

PEPTIDOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA DISFUNCION ERECTIL CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a los péptidos que pueden ser administrados para tratar la disfunción eréctil en animales macho.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La etiología de disfunción eréctil (ED) o impotencia, es compleja y es usualmente dividida en la disfunción primaria o la secundaria más frecuente. La causa principal de la ED es vascular, pero otras causas frecuentes incluyen desórdenes hormonales, uso de fármacos y desórdenes neurológicos. Los tratamientos para la ED pueden ser clasificados como iniciadores centrales o periféricos, condicionadores centrales o periféricos y otros. Para una revisión extensa de la materia, con discusión sobre el papel de los neurotransmisores y los neuropéptidos, ver A. Argiolas y M. R. Melis, Progress in Neurobiology , 47, 235-255 (1995) . Para la clasificación a los tratamientos, ver J. P. . Heaton y colaboradores, Int. J. Impotence Research 9, 115-121 (1997) . Entre los neuropéptidos que actúan centralmente para inducir la erección del pene, los mejor conocidos son los péptidos ACTH/MSH y la oxitocina. Estos péptidos centralmente activos no obstante, no son específicos en su acción y no pueden ser utilizados terapéuticamente debido a sus efectos colaterales importantes . Los productos no peptídicos son conocidos como útiles en el tratamiento de la ED . Entre éstos, el alprostadil (PGEX) se utiliza tópicamente, y la apomorfina y el sildenafil se administran mediante aplicación sublingual u oral. Todos los agentes conocidos no están desprovistos de inconvenientes importantes tales como propiedades eméticas (apomorfina) y efectos colaterales cardiovasculares (sildenafil) . Los péptidos en el tratamiento de la disfunción eréctil son ya conocidos y son descritos en CA-A-2 158 425 (Competitive Tech. Inc.) WO 94/22460A (University Patentes Inc.), US-A 5,214,030 (Stief Georg) y en Wessels H. y colaboradores,: "Synthetic melanotropic peptide initiates erections in men with psychogenic erectile dysfunctions : double-blind, placebo controlled crossove study", Journal of Urology, UZ , Baltimore, MD, vol. 160, Agosto 1998, páginas 389-393, XP 002922952 ISSN: 0022-5347. WO 97/22620 A (Deghenghi R.) , incluyen los péptidos de la fórmula general A-D-X-D-Mrp-B (con A=H, Aib, GAB, X=Mrp, B=C Lys-NH2 con B=Phe, Mrp) . La diferencia a la fórmula general de la presente solicitud es la estereoquímica del Mrp C-terminal en el grupo Mrp-Lys-NH2. La Patente de los Estados Unidos No. US-A-5,955,421 (Deghenghi, R.) y la Patente de los Estados Unidos No. US-A-5 , 932 , 548 (Deghenghi R.) como la técnica antecedente relevante han reportado respecto al péptido GAB-D-2-Mrp-D-2-Mrp-Lys-NH2 y su uso terapéutico . Es claramente necesario un tratamiento que sea tan específico como sea posible, que provoque un mínimo de efectos colaterales y que sea fácil de administrar.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al hallazgo sorprendente de que los péptidos pequeños que no pertenecen a ninguna de las clases de péptidos previamente conocidas que afectan las erecciones del pene pueden provocar erecciones del pene en animales macho cuando se inyectan en el núcleo paraventricular del hipotálamo o cuando se administran sistémicamente (intravenosamente o subcutáneamente) a tales animales.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS En esta descripción, se utilizan las siguientes abreviaturas: D es el enantiómero dextro, Aib es a-aminoisobutirilo, TXM es tranexamilo (por ejemplo, 4- (aminometil) -ciclohexancarbonilo) , INIP es isonipecotinilo, GAB es ?-aminobutirilo, IMA es imidazolilacetilo, Mrp es 2-metil-Trp, ß-Nal es ß-(2-naftil) alanina, Trp es triptofano, Phe es fenilalanina, Lys es lisina, Arg es arginina, H es hidrógeno, y NH2 es amida terminal . Los péptidos que son útiles en la presente invención incluyen aquellos que tienen la siguiente fórmula general : X-A-B-C-Y-NH2 En la cual: X es Aib, TXM, INIP, GAB, H o IMA; A es D-Mrp, D-ßNal, o D-Trp; B es D-Mrp, D-ßNal, D-Trp, o no está presente; C es D-Mrp, Phe o no está presente; Y es Lys o Arg; En las cuales: nil indica que B y/o C están ausentes. Los péptidos preferidos de la presente invención incluyen: GAB-D-Mrp-D-ßNal-Phe-Lys-NH2; GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH2 ; GAB-D-Mrp-D-ßNal-Phe-Arg-NH2; y GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH2; Cualesquiera sales farmacéuticamente aceptables de los péptidos de la presente invención pueden ser utilizados, si se desea. Tales sales podrían incluir, pero no están limitadas a, sales orgánicas o inorgánicas por adición, tales como por ejemplo, las sales de clorhidrato, bromhidrato, fosfato, sulfato, acetato, succinato, ascorbato, tartrato, gluconato, benzoato, malato, fumarato, estearato, y pamoato . Los péptidos anteriores pueden ser convenientemente preparados de acuerdo a los métodos usuales de la química de los péptidos mediante síntesis en fase sólida utilizando los Fmoc-aminoácidos (Fmoc es fluorenilmetoxicarbonilo) como se describe en Atherton y Shppard "Solid Phase Peptide Synthesi s" (IRL Press a Oxford University Press, 1989) , o en J. Jones n The Chemi cal Synthesis of Peptides" (Clarendon Press, Oxford, 1994) . La síntesis en fase sólida comienza a partir del extremo C-terminal del péptido. Un material inicial adecuado puede ser preparado, por ejemplo, mediante el acoplamiento del alfa-aminoácido protegido, requerido a una resina clorometilada, una resina hidroximetilada, una resina benzhidrilamina (BHA) o a una resina de para-metilbenzhidrilamina (p-Me-BHA) . Como un ejemplo, una resina clorometilada disponible es BIOBEADS® SX 1 por BioRad Laboratories, Richmond, California. La preparación de la resina de hidroximetilo es descrita por Bodansky y colaboradores, Chem. Ind. (Londres) 38, 15997 (1966) . La resina BHA es descrita por Pietta y Marshall, Chem. Comm., 650 (1970) y es comercialmente disponible por Península Laboratories Inc., Belmont, California. Después del acoplamiento inicial, el grupo protector del alfa-aminoácido puede ser removido por medio de diferentes reactivos ácidos, que comprenden ácido trifluoroacético (TFA) o ácido clorhídrico (HCl) disuelto en solventes orgánicos a temperatura ambiente. Después de la eliminación del grupo protector del alfa-aminoácido, los aminoásidos protegidos remanentes pueden ser acoplados paso por paso en el orden deseado.

Cada aminoácido protegido se puede hacer reaccionar en general en un exceso de aproximadamente tres veces utilizando un grupo activación del carboxilo, adecuado tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC) o diisopropilcarbodiimida (DIC) disuelto, por ejemplo, en cloruro de metiieno (CH2C12) , dimetilformamida (DMF) o sus mezclas. Después de que ha sido completada la secuencia de aminoácidos deseada, el péptido deseado puede ser escindido de la resina de soporte mediante tratamiento con un reactivo tal como fluoruro de hidrógeno (HF) que rompe no solamente el péptido de la resina, sino también los grupos protectores de las cadenas laterales. Cuando una resina clorometilada o una resina hidroximetilada es utilizada, el tratamiento con HF conduce a la formación del péptido ácido terminal en la forma libre. Cuando se utiliza la resina BHA o p-Me-BHA, el tratamiento con HF conduce directamente a la formación del péptido de amida terminal en la forma libre. Los péptidos anteriores pueden ser administrados sistémicamente, sublingualmente, bucalmente, oralmente, intranasalmente, intrapulmonarmente o intraocularmente a dosis entre 0.02 y 2 mg/kg de peso corporal, apropiadamente formulados con excipientes farmacéuticamente aceptables o en la forma de soluciones acuosas o como polvos sólidos en forma micronizada. Otras formas de dosificación, aunque no específicamente listadas, son conocidas por aquellos expertos en la técnica y están dentro del alcance de la presente invención. Los medicamentos útiles para el tratamiento de la disfunción eréctil o para inducir una erección en el animal macho incluyendo un humano pueden comprender un péptido de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o combinaciones de los péptidos de la presente invención o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, opcionalmente, en mezcla con un portador, excipiente, vehículo, diluyente, matriz, o recubrimiento de liberación retardada. Los ejemplos de tales portadores, excipientes, vehículos y diluyentes pueden ser encontrados en Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18a. Edición, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son proporcionados únicamente como ilustrativos de las modalidades preferidas de la presente invención, y no se pretende que limiten el alcance y la amplitud de la invención, como es fácilmente comprendida por aquellos expertos con la técnica. Los siguientes ejemplos ilustran la actividad de los cuatro péptidos que son representativos de algunas modalidades preferidas de la invención: (1) GAB-D-Mrp-D-ßNal -Phe-Lys -NH2; (2) GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH2; (3) GAB-D-Mrp-D-ßNal-Phe-Arg-NH2; y (4) GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH2; Antes de la formulación para la prueba biológica apropiada, los péptidos sintetizados fueron purificados hasta una pureza >95% mediante cromatografía en columna.

PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA: El procedimiento descrito por M.R. Melis y colaboradores, European Journal of Pharmacology 328, 115-123 (1997) fue esencialmente adaptado como sigue: Animales : Ratas macho Sprague Dawley (200-220 g) (Charles River, Como, Italia) fueron utilizadas en todos los experimentos. Los animales fueron enjaulados en grupos de 4-6 a 24°C, con 60% de humedad, las luces estuvieron encendidas de las 07:00 a las 19:00 horas con agua, y alimento para laboratorio estándar ad libitum. Los experimentos fueron realizados entre 9:00 y las 13:00 horas.

Compuestos Farmacéuticos: La [d(CH2) 5Tyr (Me) 20rn8] vasotocina y la ?-conotoxina-GVIA fueron adquiridas de Península Eur. Ltd. (St. Helen, Merseyside, Reino Unido), el éster metílico de la NG-nitro-l-arginina y dizolcipina (MK-801) de Sigma (S. Louis, MO, EUA), cis-flupentixol-HCl de RBI (Natick, MA, EUA) y clorhidrato de morfina de SALARS (Como, Italia) .

Microinyecciones en los ventrículos laterales (i.c.v.) y en el núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN) : Cánulas de guía de acero inoxidable (de calibre 22, de 0.71 mm) dirigidas unilateralmente al PVN fueron estereotáxicamente implantadas (David Kopf Instruments, EUA) bajo anestesia con hidrato de cloral dos días antes de los experimentos (coordenadas: 0.2 mm anterior a bregma, 0.4 mm lateral a la línea intermedia y 2.0 mm ventral a la duramadre) . Cada rata fue utilizada sólo una vez. La misma cánula de guía fue utilizada para i.c.v. y las inyecciones PVN. Para las inyecciones i.c.v., todas las sustancias fueron inyectadas en un volumen de 10 µl de solución salina en 1 minuto, vía una cánula interna (calibre 28) que se extendió a 1 mm por debajo de la punta de la cánula guía y conectada por tubería de polietileno a una jeringa Hamilton de 10 µl accionada por un tornillo micrométrico . Los controles recibieron 10 µl de solución salina. Después de la inyección, la punta de la cánula fue dejada en el sitio de la inyección por 30 segundos para permitir la dispersión de la solución inyectada. Para las inyecciones PVN, todas las sustancias fueron inyectadas en un volumen de 0.3 µl de solución salina, en 2 minutos a través de una cánula interna que se extendió 5.3 mm por debajo de la punta de la cánula de guía y conectada por una tubería de polietileno a una jeringa Hamilton de 10 µl accionada por una bomba de microinfusión Stoelting. Los controles recibieron 0.3 µl de solución salina en PV?. Después de la microinyección, la punta de la cánula se dejó en el sitio de la inyección por 30 segundos para permitir la dispersión de la solución inyectada.

Estudios de Comportamiento: Cuando se realizaron las curvas de dosis, cada péptido o solución salina fue microinyectada en un periodo de 2 minutos dentro de PVN de las ratas implantadas con cánulas guía crónicas. Se inyectaron solución salina, ?-conotoxina, morfina, [d(CH2)3Tyr (Me)2-Orn8] -vasotocina, L-NAME MK 801 o cis-flupentixol en un periodo de 2 minutos, 10 ó 15 minutos antes de la solución salina, dentro de PVN de las ratas implantadas con cánulas guía crónicas. L-NAME se inyectó i.c.v. en un periodo de 1 minuto, 10 ó 15 minutos antes de la solución salina o del compuesto de prueba . Poco después del tratamiento, los animales fueron colocados individualmente en jaulas de Plexiglás (30 x 30 x 30 cm) y se observaron por 60 minutos, tiempo durante el cual se contaron los episodios de erección del pene por un observador que no estaba enterado de los tratamientos, para eliminar las evaluaciones subjetivas.

Histologías : Al final de los experimentos, los animales fueron sacrificados mediante decapitación, los cerebros fueron inmediatamente removidos y almacenados en formaldehído acuoso al 2% por 10-12 días. Para localizar el sitio de inyección, secciones cerebrales transversales de 50 µm, preparadas por medio de microtomo de congelamiento, fueron teñidas con Rojo Neutro e inspeccionadas en un microscopio de contrastes de fases. El sitio de la inyección fue localizado siguiendo el tracto de la cánula interna a través de una serie de secciones cerebrales. Únicamente aquellos animales encontrados como poseedores de la punta de la cánula interna correctamente colocada i.c.v. o en el PVN, fueron incluidos para la evaluación estadística de los resultados.

Estadísticas : La evaluación estadística de los resultados fue realizada con análisis de una sola vía de varianza (ANDEVA) para mediciones repetidas, seguido por la prueba del intervalo múltiple de Duncan para la comparación de diferencias entre grupos múltiples. La prueba t de Student se utilizó para comparar las diferencias entre dos grupos. Una p < 0.025 se consideró significativa.

EJEMPLO 1 Efecto sobre las erecciones espontáneas del pene de la inyección de los presentes péptidos dentro de la PVN Los cuatro péptidos probados inyectados en la PVN se encontró que eran capaces de incrementar el número de episodios de erección del pene espontáneo dependientes de la dosis en ratas macho. La dosis efectivamente mínima de 20 a 50 ng que incrementa la respuesta en más del 70% de los animales tratados. Se encontró que el efecto máximo era con 2 a 5 µg que indujeron la respuesta en más de 90% de los animales. Después de una dosis activa, la respuesta comenzó de 5 a 8 minutos después del tratamiento y duró por 50 a 60 minutos. Cada episodio de erección del pene duró 0.5-2 minutos y estuvo asociado con o seguido por un acicalamiento de los genitales. Las dosis anteriores también incrementaron el número de episodios espontáneos de bostezos, aunque este efecto no fue tan marcado como aquel sobre la erección del pene y no se encontró una clara dependencia a la dosis. EJEMPLO 2 Efecto de la [d (CH2) sTyr (Me) 2-Orn8] -vasotocina, sobre la erección inducida del pene de los presentes péptidos La [d (CH2) sTyr (Me) 2 -Orn8] -vasotocina , un antagonista del receptor de oxitocina, (0.1, 0.5 y 1 µg) inyectada i.c.v. 10 minutos antes de los presentes péptidos redujo la dependencia a la dosis en el incremento del número de episodios de erección del pene inducidos por inyección 2 µg de los presentes péptidos en el PVN . En contraste, el antagonista del receptor de oxitocina (0.1, 0.5 y 1 µg) no fue efectiva cuando se inyectó en la PV? 10 minutos antes de los presentes péptidos .

EJEMPLO 3 Efecto de L-?AME sobre la erección del pene inducida por los presentes péptidos L-?AME, un inhibidor de la sintasa de ?O, (10-20 µg) inyectada en la PV? 10 minutos antes de los presentes péptidos, redujo de una manera dependiente de la dosis, las erecciones del pene inducidas por inyección de 2 µg de los péptidos de prueba en la PVN. Una prevención similar fue observada cuando L-NAME se inyectó i.c.v. a dosis de 75 y 150 µg 10 minutos antes de la inyección de 2 µg de los péptidos de prueba dentro de la PVN.

EJEMPLO 4 Efecto de ?-conotoxina-GVIA sobre la erección del pene inducida por el péptido de prueba El bloqueador de los canales de Ca2+ tipo N coconotoxina-GVIA (2 y 4 µg) inyectada en la PVN 10 minutos antes de inyectar 2 µg de los péptidos de prueba dentro de la PVN, redujo la erección del pene.

EJEMPLO 5 Efecto de la morfina sobre la erección del pene inducida por los péptidos de prueba El opiasio morfina (1.5 y 10 µg) inyectado dentro de la PVN 15 minutos antes de los péptidos de prueba, redujo, de una manera dependiente de la dosis, las erecciones del pene inducidas inyectando 2 µg de los péptidos de prueba dentro de la PVN.

EJEMPLO 6 Efecto de MK-801 del cis-flupentixol sobre la * erección del pene inducida por los péptidos de prueba 10 El antagonista del receptor de aminoácidos excitatorios NMDA MK 801 (1 µg) o el antagonista del receptor de dopamina, cis-flupentixol (10 µg) inyectado dentro de la PVN 15 minutos antes de los péptidos de • prueba, no modificó la erección del pene. 15 EJEMPLO 7 Administración sistémica 20 Se observó erección del pene en todos los animales en los cuales se inyectaron los presentes péptidos (50 µg/50 µl) subcutáneamente o en la vena yugular . 25

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método para provocar la erección del pene en un animal macho, que comprende el administrar a dicho animal un péptido que tiene la siguiente fórmula: X-A-B-C-Y-NH2; en donde X es a-aminoisobutirilo, tranexamilo (por ejemplo 4- (a inometil) ciclohexancarbonilo) , isonipectinilo, ?-aminobutirilo, hidrógeno, o imidazolilacetilo; A es D-2-metil-tritofano, D-ß- (2-naftil) alanina, o D-triptofano; B es D-2 -metil-triptofano, D-ß-(2-naftil) alanina, D-triptofano, o está ausente; C es D-2-metil-triptofano, fenilalanina, o está ausente; Y es lisina o arginina; en donde D significa el isómero dextro; o una sal por adición farmacéuticamente aceptable del péptido, en una cantidad efectiva para provocar dicha erección.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en el cual el péptido es administrado intranasalmente, intrapulmonarmente o intraocularmente .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, en el cual el péptido es administrado bucalmente, sublingualmente u oralmente.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el péptido es: GAB-D-Mrp-D-ßNal-Phe-Lys-NH2; GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH2 ; GAB-D-Mrp-D-ßNal-Phe-Arg-NH2; y GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH2 ; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el péptido es administrado a una dosis de entre 0.2 y 2 mg/kg de peso corporal del animal .

6. El método de tratamiento de la disfunción eréctil en un animal macho, que comprende administrarle a dicho animal un péptido que tiene la fórmula siguiente: X-A-B-C-Y-NH2; en donde X es a-aminoisobutirilo, tranexamilo (por ejemplo 4- (aminometil) ciclohexancarbonilo) , isonipecotinilo, ?-aminobutirilo, hidrógeno, o imidazolilacetilo; A es D-2-metil-tritofano, D-ß- (2 -naftil) alanina, o D-triptofano; B es D-2 -metil-triptofano, D-ß-(2-naftil) alanina, D-triptofano, o está ausente; C es D-2-metil -triptofano, fenilalanina, o está ausente; Y es lisina o arginina; en donde D significa el isómero dextro; o una sal por adición farmacéuticamente aceptable del péptido, en una cantidad efectiva para provocar dicha erección.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, en el cual el péptido es administrado intranasalmente, intrapulmonarmente o intraocularmente .

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, en el cual el péptido es administrado bucalmente, sublingualmente u oralmente.

9. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde el péptido es: GAB-D-Mrp-D-ßNal-Phe-Lys-NH2; GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH2; GAB-D-Mrp-D-ßNal-Phe-Arg-NH2; y GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH2 ; o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

10. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde el péptido es administrado a una dosis de entre 0.2 y 2 mg/kg de peso corporal del animal .

11. El péptido de conformidad con la reivindicación 7, que tiene la fórmula: GAB-D-Mrp-D- ßNal-Phe-Lys-NH2; GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH2; y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

12. Una composición farmacéutica que comprende el péptido de conformidad con la reivindicación 12 y un portador farmacéuticamente aceptable .