MXPA02003069A - Vacuna intranasal contra el virus de la influenza.. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al uso de una preparacion de antigeno del virus de la influenza no vivo, particularmente una preparacion del virus de la influenza fragmentado en la fabricacion de una formulacion de vacuna para una vacunacion intranasal de una dosis contra la influenza, en donde la vacunacion de una dosis cumple con los requerimientos regulatorios internacionales para las vacunas contra la influenza. Ademas, se proporcionan metodos para la produccion de la vacuna, y un equipo farmaceutico que comprende un aparato de administracion intranasal y una vacuna de una dosis.

Description

VACUNA INTRANASAL CONTRA EL VIRUS DE LA INFLUENZA Campo del Invención La presente invención se refiere a formulaciones novedosas de vacuna contra la influenza, métodos para prepararla y su uso en la profilaxis o terapia. En particular, la presente invención se refiere a vacunas para administración a la mucosa, más particularmente para la administración nasal. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de vacunas para la influenza las cuales pueden ser administradas intranasalmente en una sola dosis, para lograr una respuesta inmunológica suficiente para cubrir los recubrimientos reglamentarios. Antecedentes de la Invención El virus de la influenza es uno de los víruses más ubicuos presentes en el mundo, que afectan tanto a humanos como al ganado. El impacto económico de la influenza es importante. El virus de la influenza es un virus encerrado en el ARN con un tamaño de partícula de aproximadamente 125 nm de diámetro. Consiste básicamente de un nucleocápsido interno o núcleo de ácido ribonucleico (ARN) asociado con la nucleoproteína, rodeado por una envoltura viral con una estructura bicapa de lípido y glicoproteínas externas. La capa interior de la envoltura viral está compuesta predominantemente de proteínas de la matriz y la capa exterior en su mayoría del material lípido derivado del huésped. La neuraminidasa de la glicoproteína de la superficie (NA) y la hemaglutinina (HA) parecen como picos, con una longitud de 10 a 12 nm, en la superficie de las partículas. En estas proteínas de la superficie, particularmente la hemaglutinina, es la que determina la especificidad antigénica de los subtipos de influenza. Las epidemias típicas de influenza ocasionan aumentos en la incidencia de neumonía, y enfermedades respiratorias inferiores tal y como lo evidencian los índices aumentados de hospitalización y mortalidad. Los ancianos y aquellos con enfermedades crónicas subyacentes es más probable que experimenten dichas complicaciones, pero los niños pequeños también pueden sufrir una enfermedad severa. Por lo tanto estos grupos en particular necesitan ser protegidos. Las vacunas contra la influenza disponibles actualmente son ya sea vacunas contra la influenza inactivadas o vivas atenuadas. Las vacunas inactivadas contra la gripe están compuestas de tres tipos de preparación de antígeno: virus total inactivado, sub-viriones en donde las partículas purificadas del virus son desbaratadas con detergentes u otros reactivos para solubilizar la envoltura lípida (denominadas vacuna "fragmentadas"), o HA y NA purificado (vacuna de subunidad). Estas vacunas inactivadas se administran de manera intramuscular (i.m.). Las vacunas contra la influenza, de todos los tipos, generalmente son vacunas trivalentes. Generalmente contienen antígenos derivados de dos cepas del virus A de la influenza, y una cepa de la influenza B. Un estándar de 0.5 ml de dosis inyectable en la mayoría de los casos contiene 15 µg del componente del antígeno de hemaglutinina de cada cepa, tal y como lo mide la inmunodifusión radial simple (SRD) (J.M. Wood et al.: Una técnica mejorada de inmunodifusión radial simple para el ensayo del antígeno de hemaglutinina de la influenza: adaptación para la determinación de la potencia del virus total inactivado y las vacunas de subunidad. J. Biol. Stand. 5 (1977) páginas 237 a 247; J. M. Wood et al., estudio colaborativo Internacional de una difusión radial simple y técnicas de inmunoelectrofóresis para el ensayo del antígeno de hemaglutinina del virus de la influenza. J. Biol. Stand. 9 (1981) páginas 317 a 330. La cepa del virus de la influenza para ser incorporado en la vacuna de la influenza en cada etapa son determinadas por la Organización Mundial de la Salud en colaboración con las autoridades de salud nacionales y los fabricantes de vacunas. Los esfuerzos actuales para controlar la morbosidad y mortalidad asociadas con las epidemias anuales de influenza están basadas en el uso de las vacunas contra la influenza inactivadas que son administradas intramuscularmente. La eficacia de dichas vacunas para prevenir la enfermedad respiratoria y las complicaciones de la influenza se encuentran en un rango del 75% en los adultos sanos y menos del 50% en los ancianos. Los víruses de la influenza, como muchos patógenos, invaden las superficies de la mucosa, inicialmente en el aparato respiratorio superior. La inmunidad de la mucosa constituye la primera línea de defensa para el huésped y es un componente importante de la ¿ÉAÍ* respuesta inmunológica en los pasajes nasales y en las vías respiratorias del aparato respiratorio inferior. Aunque las vacunas contra la influenza inyectables que se usan en la actualidad estimulan el IgG específico-HA del suero en la mayoría de los individuos sanos, ocurre un aumento considerable en el anticuerpo IgA nasal específico- HA en solamente la minoría de los sujetos vacunados. Las vacunas mejoradas contra la influenza con una inmunogenicidad mayor y eficacia clínica necesitan ser dirigidas tanto para las respuestas del anticuerpo local como el sistémico. La exposición intranasal experimental de los humanos a las vacunas contra la influenza inactivadas datan de la década de los años 40 (ver una revisión en Eyles et al., 2000 BioDrugs 13(1): páginas 35 a 59). Aunque ha habido un resurgimiento en el interés en el uso del virus inactivado para la inmunización IN en la década de los 60s y los 70s, se ha dirigido la mayor parte de la atención al campo intranasal para el método vivo atenuado. Administradas intranasalmente, las vacunas contra la influenza vivas atenuadas por ejemplo vacunas adaptadas por frío ofrecen una inmunidad de la mucosa mejorada, con resultados promisorios particularmente en los niños. Sin embargo, este método ha fallado en lo que se refiere a ganar la aceptación a nivel mundial. Por lo tanto, la mayor parte de las vacunas contra la influenza disponibles en el mercado son ya sea fragmentadas o vacunas inyectables o subunidades. Estas vacunas son preparadas, fragmentando la partícula del virus, generalmente con un solvente orgánico o un detergente, y separando o purificando la proteína viral hasta cantidades variables. Las vacunas fragmentadas son preparadas mediante la fragmentación del virus total de la influenza, ya sea infeccioso o inactivado, con concentraciones de solubilización de solventes orgánicos o detergentes y la remoción subsecuente del agente de solubilización y algo o la mayor parte del material lípido viral. Las vacunas fragmentadas generalmente contienen la proteína matriz contaminante, y la nucleoproteína y algunas veces el lípido, así como las proteínas de envoltura de la membrana. Las vacunas fragmentadas generalmente contendrán la mayor parte o todas las proteínas estructurales del virus aunque no necesariamente en las mismas proporciones que se encuentran en el virus completo. Las vacunas de subunidad por otra parte consisten esencialmente de proteínas de superficie viral altamente purificadas, hemaglutinina y neuraminidasa, las cuales son las proteínas de la superficie que actúan en repuesta para la producción de los anticuerpos neutralizadores de virus deseable al momento de la vacunación. Más recientemente, han sido combinadas vacunas contra la influenza fragmentadas mejor caracterizadas altamente purificadas combinadas con adyuvantes en un intento para mejorar la inmunogenicidad en los adultos y la gente mayor. A pesar de los aumentos importantes en las respuestas inmunológicas en los ratones, una cantidad de métodos que utilizan adyuvantes de la nueva generación no han probado posible confirmación en el hombre.

J???a .i. ^, Internacionalmente se aplican estándares para medir la eficacia de la vacuna contra la influenza. Los criterios oficiales de la Unión Europea para una vacuna efectiva contra la influenza son establecidos en la tabla siguiente. Teóricamente, para cubrir los requerimientos de la Unión Europea, una vacuna contra la influenza tiene que cubrir solamente uno de los criterios de la tabla, para todas las cepas de la influenza incluidas en la vacuna. Sin embargo en la práctica, se necesitan cubrir dos o todos los tres criterios para cubrir todas las cepas, particularmente para una vacuna nueva tal como una vacuna intranasal nueva. Bajo algunas circunstancias, pueden ser suficientes dos criterios. Por ejemplo, puede ser aceptable que se cubran dos de los tres criterios por todas las cepas mientras que el tercer criterio es cubierto por algunas pero no todas las cepas (por ejemplo, dos de tres cepas). Los requerimientos son diferentes para las poblaciones de adultos (de 18 a 60 años) y para las poblaciones de ancianos (>60 años). * índice de seroconversión es definido como el porcentaje de vacunas las cuales tienen un aumento de por lo menos 4 potencias en la inhibición de hemaglutinina en el suero (Hl) titulada después de la vacunación, para cada cepa de vacuna.

** El factor de conversión es definido como el aumento en la potencia en los titulados del medio geométrico Hl en el suero (GMTs) después de la vacunación, para cada cepa de vacuna. *** El índice de protección se define como el porcentaje de vacunas con un titulado Hl en el suero igual a o mayor de 1:40 después de la vacunación (para cada cepa de vacuna) y es normalmente aceptado como la protección indicada. Para que una vacuna intranasal contra la gripe sea útil comercialmente, no solamente necesita cumplir todos estos estándares, sino que también en la práctica necesitará ser por lo menos tan eficaz como las vacunas inyectables disponibles en la actualidad. También se necesitará que sea comercialmente viable en términos de la cantidad de antígeno y el número de administraciones requeridos. Las vacunas intranasales contra la gripe basadas en virus inactivados han sido estudiadas en las décadas pasadas y no han cubierto estos criterios. Fulk et al., 1969 en (J. Immunol. 102, páginas 1102 a 1105) comparado con la administración intranasal (nebulización las gotas en la nariz) de virus contra la influenza muertos con la administración subcutánea (s.c.) en pacientes ancianos. Mientras el 56% de los pacientes recibieron la administración s.c. que recibieron la administración subcutánea presentaron un aumento de 4 potencias en los titulados del anticuerpo (Hl), el aumento correspondiente fue observado solamente en el 25% de aquellos que recibieron una .*»«....«.«» »~í..* administración intranasal. Dos administraciones intranasales dieron como resultado una seroconversión del 75%. Gluck et al., 1999 en (J. Virol. 73, páginas 7780 a 7786) demostraron que dos inoculaciones intranasales consecutivas administradas por medio de un rocío contienen adyuvantes potentes para la mucosa (Toxina Lábil al Calor de E. Coli, HLT) se requirieron para inducir la seroconversión (un aumento de 4 potencias en la respuesta humoral del anticuerpo) comparable con una administración intramuscular. Una sola administración intranasal de 15 µg de HA por cepa en la presencia del adyuvante, y hasta dos administraciones en la ausencia del adyuvante no tuvieron la capacidad para proporcionar una seroconversión equivalente. El antígeno de la influenza se encontraba en la forma de virosomas, bicapas lípidas reconstituidas, utilizando fosfatidilcolina, y proteínas del virus de superficie extractadas del virus de la influenza derivado del huevo. El concepto de usar dos o más administraciones ¡ntranasales con el objeto de intentar lograr niveles más altos de seroconversión también ha sido usado por otros investigadores. Petrescu et al., en (1979. Rev. Rom. Med-Virol. 30, páginas 109 a 115) administraron el virus inactivado (1000 unidades internacionales por dosis de vacuna) intranasalmente dos veces durante un período de dos semanas. Oh et al., (1992 Vaccine 10, páginas 506 a 511) administrada la vacuna fragmentada en la forma de un rocío nasal cuatro veces en intervalos semanales, 15 µg de HA por cepa en cada administración (0.25 ml por fosa nasal en cada ocasión). Kuno-Sakai et al., (1994. Vaccine 12, i l ÍJ í; ,j...¡L,.i,fca_.aai -* ? fea» «..¿.¿.,5, Ja _,«. páginas 1303 a 1310) administrada, dos veces en un intervalo de 1 semana, la vacuna de aerosol inactivada triplicó la fuerza de la vacuna contra la influenza fragmentada que se consigue comercialmente. Recientemente, Muszkat et al., en (2000 Vaccine 18, páginas 1696 a 1699) administraron dos inmunizaciones intranasales con el virus completo de la gripe inactivada (20 µg de una cepa A y una cepa B y 40 µg de otra cepa A, por dosis) a pacientes ancianos, y se observó una seroconversión sistémica inferior para la administración nasal para la inyección intramuscular de una dosis estándar de una vacuna contra la gripe fragmentada inactivada comercial. De este modo, la literatura de 1969 a 2000 muestra que aunque la vacunación intranasal con una vacuna contra la influenza inactivada ha sido investigada ampliamente, ningún grupo ha podido lograr una seroconversión sistémica equivalente a la inyección intramuscular o subcutánea, administrando una sola dosis de la vacuna nasalmente. Además, con el objeto de lograr un efecto con administraciones múltiples de la vacuna con el paso del tiempo, la dosis del antígeno utilizado ha sido considerablemente mayor que la dosis estándar convencional de 15 µg de HA por cepas de cada vacunado. Los datos de hecho señalan hacia una necesidad de administraciones múltiples, y preferentemente en la presencia de inmunoestimulantes fuertes tales como el HLT de E. coli. Kimura et al., en (1988. Acta Paediatr Jpn. 30, páginas 601 a 603) demostraron que la administración de dos dosis del virus contra la influenza inactivada por medio de un atomizador fue tan efectiva como una sola administración subcutánea, pero esa administración de las dos dosis por medio de un rocío intranasal fue mucho menos efectiva. La atomización genera un rocío muy fino el cual alcanza los pulmones. Por lo tanto también existe una indicación en los ensayos clínicos publicados de que el rocío nasal puede no ser efectivo, y que la atomización puede ser mejor. La literatura indica además la necesidad de adyuvantes potentes, más específicamente inmunoestimulantes potentes, en las vacunas intranasales. Por ejemplo, Gluck et al., (citado anteriormente) demostraron que la administración intranasal de la vacuna contra la influenza en la ausencia de un estimulante es significativamente menos eficiente que en la presencia de un inmunoestimulante. Los autores muestran que aún dos administraciones intranasales de la vacuna que carecen del inmunoestimulante no pueden inducir la misma seroconversión lograda por la administración subcutánea. Hashigucci et al., en 1996 (Vaccine 14, páginas 113 a 119) demostraron que dos administraciones intranasales, separadas cuatro semanas, de una vacuna contra la influenza fragmentada ayudada con una mezcla de toxina lábil al Calor de E. coll y su subunidad-B (LTB) dieron como resultado un índice de seroconversión del 50%. En la ausencia del adyuvante, solo se obtuvo una seroconversión del 31%. Generalmente la administración subcutánea da como resultado una seroconversión del 75 al 90%. Íi i a¿ Aaj.aáifc-fc.* wifc.

Por lo tanto, la literatura indica claramente que con el objeto de lograr una seroconversión sistémica equivalente a la obtenida con las vacunas contra la gripe convencionales, se requiere más de una administración, y además la vacuna debe estar ayudada con una toxina. Ahora se ha descubierto que el antígeno del virus contra la influenza no vivo puede ser utilizado en una vacuna intranasal contra la gripe comercialmente viable. En particular, una sola administración de una preparación de vacuna del virus de la influenza intranasal estimula la inmunidad sistémica en un nivel protector. Además, este cubre los criterios internacionales de una vacuna efectiva contra la gripe. Más específicamente, la administración intranasal de la preparación del antígeno del virus de la influenza no vivo puede producir una seroconversión sistémica (un aumento de 4 potencias en titulados anti-HA) equivalentes al obtenido con la administración subcutánea de la misma vacuna. Sorprendentemente, el antígeno de la influenza puede ser proporcionado por una dosis significativamente inferior por vacuna que la indicada en la técnica anterior. Una sola administración nasal de una dosis estándar del virus contra la influenza inactivado da como resultado una seroconversión equivalente a la obtenida por la inyección que no había sido reportada anteriormente. Sumario del Invento La presente invención proporciona por primera vez, una vacuna contra la influenza de una sola administración para administración ¡ i.» .j.A.Á..í*j'-k. intranasal. La vacuna cubre con algunos o todos los criterios para las vacunas contra la influenza de los Estados Unidos establecidos anteriormente, de modo que la vacuna se puede aprobar en Europa como una vacuna de una sola dosis comercial. Preferentemente, por lo menos dos de cada tres criterios de los Estados Unidos son cubiertos para la ó todas las cepas de la influenza representadas en la vacuna. Más preferentemente, por lo menos dos criterios se cubren para todas las cepas, y el tercer criterio es cubierto por todas las cepas o al menos por todas menos una de las cepas. Más preferentemente, todas las cepas cubren todos los tres criterios. Por lo tanto, la invención proporciona en una aspecto, el uso de una preparación de antígeno del virus contra la influenza no vivo en la fabricación de una formulación de vacuna para una vacunación nasal de una sola dosis contra la influenza. La vacuna puede ser administrada en un formato de mono-dosis o un formato de bi-dosis (generalmente una sub-dosis por cada fosa nasal). La presente invención proporciona en otro aspecto el uso de un material de antígeno del virus contra la influenza no vivo en la fabricación de una vacuna para la mucosa para la inmunización contra la influenza. Preferentemente, la preparación del antígeno del virus de influenza no vivo contiene al menos un tensoactivo el cual puede ser en particular un tensoactivo no iónico. Preferentemente el tensoactivo no iónico es por lo menos un tensoactivo seleccionado del grupo consistente de octil- o nonilfenoxi polioxietanoles (por ejemplo, la ?y ' - e .^£« ¡g^ serie Tritón™ que se consigue en el mercado), esteres de polioxietileno de sorbitán (series Tween™) o esteres de polioxietileno de la fórmula (I): (I) HO(CH2CH2O)n-A-R en donde n es de 1 a 50, A es un enlace ó -C(O)-, R es alquilo C1.50 ó alquilfenilo C1.50. y combinaciones de dos o más de estas. Los tensioactivos preferidos que se encuentran dentro de la fórmula (I) son moléculas en las cuales n es de 4 a 24, más preferentemente de 6 a 12, y aún más preferentemente 9; el componente R es alquilo C1.50, preferentemente C4-C2o y más preferentemente alquilo C?2. Los octilfenoxi polioxietanoles y los esteres de polioxietileno de sorbitán se describen en "Sistemas de tensioactivos" Eds: Attwood y Florence (1983, Chapman y Hall). Los octilfenoxi polioxietanoles (octoxinoles), que incluyen t-octilfenoxipolietoxietanol (Tritón X-100™) también se describen en el Merck Index Entry 6858 (página 1162, 12A Edition, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., EUA; ISBN 0911910-12-3). Los esteres de polioxietileno de sorbitán, que incluyen monooleato de polioxietileno de sorbitán (Tween 80 ™) se describen en el Merck Index Entry 7742 (Página 1308, 12A Edition, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., EUA; ISBN 0911910-12-3). Ambos pueden ser fabricados utilizando los métodos descritos en esta referencia, o comprados de fuentes comerciales tales como Sigma Inc. Los tensioactivos no iónicos particularmente preferidos incluyen Tritón X-45, t-octilfenoxi polietoxietanol (Tritón X-100), Tritón X-102, kA¿ J l j J&ifeteg" ^»-*-¿h- >--*»- *m4JAa>**Ji Tritón X-114, Tritón X-165, Tritón X-205, Tritón X-305, Tritón N-57, Tritón N-101, Tritón N-128, Breij 35, éter polioxietileno-9-laurilo (laureto 9) y éter polioxietileno-9-estearilo (esteareto 9). Son particularmente preferidos el Tritón X-100, y el laureto 9. También son particularmente preferidos el éster de polioxietileno de sorbitán, el monooleato de polioxietileno de sorbitán (Tween 80™). Los éteres de polioxietileno adecuados adicionales de la fórmula (I) son seleccionados del grupo siguiente: éter polioxietileno-8- estearilo, éter polioxietileno-4-laurilo, éter polioxietileno-35-laurilo, y éter polioxietileno-23-laurilo. Los términos o nombres alternativos para el éter polioxietileno laurilo se describen en el registro CAS. El número de registro CAS del éter polioxietileno-9 laurilo es: 9002-92-0. Los éteres de polioxietileno tales como el éter polioxietileno laurilo se describen en el Merck index (12A ed: entry 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., EUA; ISBN 0911910-12-3). El laureto 9 es formado haciendo reaccionar un óxido de etileno con alcohol dodecílico, y tiene un promedio de nueve unidades de óxido de etileno. La proporción de la longitud de la sección de polioxietileno a la longitud de la cadena alquilo en el tensoactivo (es decir, la proporción de n: longitud de cadena alquilo), afecta la solubilidad de esta clase de tensioactivos en un medio acuoso. Por lo tanto, los tensioactivos de la presente invención pueden ser en solución, o pueden formar estructuras particulares tales como micela o vesículas. Como solución, los tensioactivos de la presente invención, son seguros, fácilmente esterilizables, simples de administrar y pueden ser fabricados de un modo simple sin los problemas de GMP y QC asociados con la formación de estructuras de particulado uniforme. Algunos éteres de polioxietileno, tales como laureto 9, tienen la capacidad de formar soluciones no vesiculares. Sin embargo, el éter de polioxietileno-8 palmitoilo (d8E8) tiene la capacidad de formar vesículas. Por consiguiente, las vesículas de éter de polioxietileno-8 palmitoilo en combinación con al menos un tensoactivo no iónico adicional, pueden ser empleados en las formulaciones de la presente invención. De preferencia, el éter de polioxietileno utilizado en las formulaciones de la presente invención, tiene actividad hemolítica. La actividad hemolítica de un éter de polioxietileno puede ser medida in vitro, con referencia al siguiente ensayo, y es tal y como lo expresa la concentración más alta de tensoactivo la cual falla para causar la lisis de las células de glóbulos rojos: 1. La sangre fresca de conejillos de indias es lavada con solución salina regulada por fosfato (PBS) 3 veces en una centrifuga de mesa. Después de una nueva suspensión al volumen original, la sangre es diluida adicionalmente a 10 potencias en PBS. 2. 50 µl de esta suspensión de sangre es agregada a 800 µl de PBS con un contenido de diluciones de dos potencias de detergente. 3. Después de 8 horas la hemolisis es evaluada visualmente, o midiendo la densidad óptica del sobrenadante. La presencia del i?¿?l,a J.?.?.?. ?, . ^ " i ..-* .i :í dtil, ÍJ sobrenadante rojo, el cual absorbe la luz en 570 nm indica la presencia de la hemolisis. 4. Los resultados se expresan como la concentración de la primera dilución del detergente en el cual ya no ocurre la hemolisis. Dentro de la variabilidad experimental inherente de dicho ensayo biológico, los esteres de polioxietileno, o tensioactivos de la fórmula (I), de la invención preferentemente tienen una actividad hemolítica, de entre aproximadamente el 0.5 al 0.0001%, más preferentemente entre el 0.05 y el 0.0001%, todavía más preferentemente entre 0.005 y el 0.0001%, y todavía más preferentemente de entre el 0.003 y el 0.0004%. De un modo ideal, dichos éteres o esteres de polioxietileno deben de tener una actividad hemolítica similar (por ejemplo, dentro de una diferencia de diez potencias) a la del ya sea el éter polioxíetileno-9 laurilo o el éter polioxíetileno-8 esteaplo. Pueden estar presentes dos o más tensioactivos no iónicos de grupos de tensioactivos diferentes descritos en la formulación de la vacuna de la presente invención. En particular, se prefiere una combinación de un éster de polioxietileno de sorbitán tal como monooleato de polioxietileno de sorbitán (Tween 80™), y un octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Tritón) X-100™. Otra combinación particularmente preferida de tensioactivos no iónicos comprende el laureto 9 más un éster de polioxietileno de sorbitán o un octoxinol o ambos. De preferencia el o cada uno de los tensioactivos no iónicos están presentes en la formulación final de la vacuna en una concentración de entre 0.001 y 20%, más preferentemente entre 0.01 y 10%, y aún más preferentemente hasta de aproximadamente el 2% (p/v). En donde están presentes dos o más tensioactivos, estos generalmente están presentes en la formulación final en una concentración de hasta aproximadamente el 2% de cada uno, generalmente en una concentración de hasta aproximadamente el 0.6% de cada uno. Pueden estar presentes uno o más tensioactivos adicionales, generalmente hasta una concentración de aproximadamente el 1% de cada uno y generalmente con trazas de hasta el 0.2% ó el 0.1% de cada uno. Cualquier mezcla de tensioactivos puede estar presente en la formulación de la vacuna de acuerdo con la presente invención. Los tensioactivos no iónicos tales como los que se explicaron anteriormente tienen concentraciones preferidas en la composición de la vacuna final de la manera siguiente: los esteres de polioxietileno de sorbitán tales como el Tween 80™: del 0.01 al 1%, más preferentemente de aproximadamente el 0.1% (p/v); octil- o nonilfenoxi polioxietanoles tales como Tritón X-100™ u otros detergentes de la serie Tritón: del 0.001 al 0.1%, más preferentemente del 0.005 al 0.02% (p/v); éteres de polioxietileno de la fórmula general (I) tales como el laureto 9: del 0.1 al 20%, preferentemente del 0.1 al 10% y aún más preferentemente del 0.1 al 1% o aproximadamente el 0.5% (p/v). Para ciertas formulaciones de vacuna, se pueden incluir otros componentes de la vacuna en la formulación. Como tales las formulaciones de la presente invención pueden comprender un ácido de hiél o un derivado del mismo, en particular en la forma de una sal. Estos incluyen derivados de ácido cólico y sales de los mismos en particular sales de sodio de ácido cólico o derivados de ácido cólico. Los ejemplos de los ácidos de hiél y derivados de los mismos incluyen ácido cólico, ácido desoxixólico, ácido quenodesoxicólico, ácido litocólico, ácido ursodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico y derivados tales como glico-, tauro-, amidopropil-1-propanosulfónico-, y derivados amidopropil-2-hidroxi-1-propanosulfónicos de los ácidos de hiél anteriormente mencionados o N. N-bis (3Dgluconoamidopropil) desoxicolamida. Un ejemplo particularmente preferido es el desoxicolato sódico (NaDOC) el cual puede estar presente en la dosis final de la vacuna. De preferencia, las formulaciones de la presente invención son en la forma de una solución acuosa o una suspensión de formas no vesiculares. Dichas formulaciones son fáciles de fabricar de manera reproducible, y también de esterilizar (filtración final a través de una membrana de un poro de 450 ó 220 nm) y son fáciles de administrar a la mucosa nasal en la forma de un rocío sin la degradación de la estructura física compleja del adyuvante. La preparación de antígeno contra la gripe no vivo para usarse en la presente invención, puede ser seleccionada del grupo consistente de preparaciones fragmentadas de antígeno del virus, antígenos de subunidades (ya sea expresados de manera recombinante o preparados a partir del virus completo), el virus total inactivado el cual puede ser inactivado químicamente con por ejemplo, formaldehído, ß-propiolactona, o inactivado de otra manera, por ejemplo, inactivado por calor o rayos U.V. De preferencia la preparación del antígeno es ya sea una preparación fragmentada del virus, o un antígeno de subunidad preparado del virus completo, particularmente por medio de un proceso de fragmentación seguido por purificación del antígeno de superficie. En una modalidad preferida la formulación de la vacuna comprende una preparación del virus de la gripe fragmentado en combinación con uno o más tensioactivos no iónicos. El uno o más tensioactivos no iónicos pueden ser residuales del proceso por medio del cual se produjo la preparación del antígeno de la gripe fragmentado, y/o agregado a la preparación del antígeno posteriormente. Se considera que el material del antígeno de la gripe fragmentado puede ser estabilizado en la presencia de un tensoactivo no iónico, aunque deberá quedar entendido que la presente invención no depende necesariamente de que esto sea el caso. La presente invención proporciona en otro aspecto el uso de una preparación de un antígeno del virus de la influenza no vivos, preferentemente una preparación del virus de la gripe fragmentado, en la fabricación de una vacuna contra la influenza intranasal de una sola dosis sin un inmunoestimulante agregado. En el contexto de la presente invención, un inmunoestimulante es una substancia la cual tiene la capacidad de estimular directamente las células del sistema inmunológico, opuesto a aquellos que estimulan solamente i .íiá. ?. k, A. ¡ÉU ?? indirectamente, por ejemplo actuando como un vehículo para un antígeno que tiene el mismo efecto estimulante cuando se encuentra en combinación con el vehículo. En un aspecto alternativo de la presente invención, la formulación comprende además adyuvantes o inmunoestimulantes que incluyen toxina del Cólera y subunidad B, lípido A destoxificado de cualquier fuente, y derivados no tóxicos de lípido A incluyendo aquellos que se describen en la Patente Norteamericana No. 4,912,094, y la Patente GB 2,220,211 incluyendo derivados no tóxicos de Lípido A monofosforilo y difosforilo tales como lípído A 3-de-O- acilado por monofosforilo (3D-MPL) y lípido A 3-de-O-acilado difosforilo, saponinas tales como Quil A (como la corteza del árbol de Quillaja Saponaria Molina, de Sur América), y fracciones del mismo, incluyendo QS21 y QS17 (Patente Norteamericana No. 5,057,540; otorgada a Kensil, C.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996. 12 (1- 2): páginas 1 a 55; la Patente Europea EP 0 362 279 B1; Kensil et al. (1991. J. Inmunology vol 146, páginas 431 a 437; y el documento WO 99/10008) y el sistema adyuvante de oligonucleótidos que contiene un dinucleótido CpG no metilado (tal y como se describe en el documento WO 96/02555). En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, la formulación comprende un derivado no tóxico de lípido A seleccionado a partir de 3D-MPL, y derivados no tóxicos de lípido A difosforilo, particularmente 3D-MPL. Más preferentemente, la formulación comprende 3D-MPL junto con un éter o éster de polioxietileno de la fórmula general (I) tal y como se definió anteriormente, en particular laureto 9. Por lo tanto, la presente invención proporciona además, una vacuna que comprende una combinación de 3D-MPL y laureto 9, y una preparación del antígeno del virus de la influenza, particularmente una preparación de antígeno fragmentado. Esta vacuna es particularmente, aunque no exclusivamente, adecuada para la administración en la mucosa incluyendo la administración intranasal tal y como aquí se describe. Los componentes adicionales que están de preferencia presentes en la formulación de acuerdo con este aspecto de la invención, incluyen además detergentes no iónicos tales como octoxinoles y esteres de polioxietileno tal y como se describieron anteriormente, en particular t-octilfenoxi polietoxietanol (Tritón X-100) y monooleato de polioxietileno de sorbitán (Tween 80); y derivados de sales de hiél o ácido cólico tal y como aquí se describen, en particular desoxicolato o taurodesoxicolato de sodio. Por lo tanto, una formulación particularmente preferida comprende 3D-MPL, laureto 9, Tritón X-100, Tween 80 y desoxicolato de sodio, los cuales pueden ser combinados con una preparación de antígeno del virus de la influenza para producir una vacuna adecuada para su aplicación en la mucosa o intranasal. La presente invención también proporciona un método para la fabricación de una vacuna que comprende la mezcla con adiciones de 3D-MPL, laureto 9 y la preparación del antígeno del virus de la influenza, preferentemente una preparación del antígeno fragmentado tal como una preparación de antígeno fragmentada empleada en una vacuna contra la influenza intramuscular convencional. En un aspecto adicional, la invención proporciona un equipo farmacéutico que comprende un aparato de rocío intranasal y una vacuna del virus contra la influenza no vivo de una dosis.

Preferentemente el aparato es un aparato de administración de bi-dosis para dos sub-dosis de la vacuna. La dosis baja de hemaglutinina de acuerdo con la presente invención, es preferentemente una dosis de hemaglutinina comparable con la dosis de las vacunas contra la gripe comerciales actuales. Por lo tanto, la dosis baja preferida, es de preferencia no mayor de aproximadamente 30 µg, más preferentemente no mayor de aproximadamente 15 µg de hemaglutinina por cepa de la influenza. Esto es igual a algo normalmente entre el 0.1 y 2 µg/kg de peso corporal. Preferentemente, pero no necesariamente las vacunas de dosis baja de la invención son administradas en la forma de una vacuna de una dosis, por ejemplo en dos sub-dosis, una para cada fosa nasal. De una manera ventajosa, la dosis de la vacuna de acuerdo con la invención es proporcionada en un volumen más pequeño que las vacunas fragmentadas contra la gripe inyectadas convencionales, las cuales generalmente son de 0.5 a 1 ml por dosis La dosis de volumen bajo de acuerdo con la presente invención, es preferentemente inferior a 500 µl, más preferentemente inferior a 300 µl y aún más F8Ü ? Á. ?L¿ii.,iM^^..í--^ ?,xtittíí*:*.., ^a ^.^.. ^. preferentemente no mayor a 200 µl o menor por dosis. Cuando se administran dos sub-dosis, el volumen preferido por sub-dosis es de la mitad de los volúmenes totales de la dosis mencionados anteriormente. Por lo tanto, una dosis de vacuna preferida de acuerdo con la presente invención, es una dosis con una dosis baja de antígeno en un volumen bajo, por ejemplo, de aproximadamente 15 µg o aproximadamente 7.5 µg de HA (por cepa) en un volumen de aproximadamente 200 µl. La presente invención proporciona además, un método para la profilaxis de la infección o enfermedad de la influenza en un sujeto, cuyo método comprende la administración al sujeto de una dosis de la vacuna contra la influenza no viva por medio de la superficie de la mucosa. La presente invención proporciona además un método para la profilaxis de la infección o la enfermedad de la influenza en un sujeto cuyo método comprende la administración al sujeto de una dosis baja de una vacuna del virus de la influenza no vivo por medio de la superficie de la mucosa. Preferentemente la vacuna es administrada intranasalmente. Más preferentemente, la vacuna es administrada localmente al área nasofaríngea, preferentemente sin ser inhalada en los pulmones. Es deseable utilizar un aparato de administración intranasal el cual administra la formulación de la vacuna al área nasofaríngea, sin o substancialmente sin entrar en los pulmones. t«.:¿ jJ,£l.i^.- »!.¿>éf>?'l?.rl.«¿tJ...a-.áui¿JA.. », " Í*. - lt .it.

Los aparatos preferidos para la administración intranasal de las vacunas de acuerdo con la invención son aparatos de rocío. Los aparatos de rocío nasal adecuados que se consiguen comercialmente incluyen Accuspray™(Becton Dickinson). Los atomizadores producen un rocío muy fino el cual puede ser inhalado fácilmente en los pulmones y por lo tanto no alcanza de manera eficiente la mucosa nasal. Por lo tanto no se prefieren los atomizadores. Los aparatos de rocío preferidos para el uso intranasal son aparatos para los que el funcionamiento del aparato no depende de la presión aplicada por el usuario. Estos aparatos son conocidos como aparatos de umbral de presión. El líquido es liberado desde la boquilla solamente cuando se aplica una presión del umbral. Estos aparatos hacen más fácil lograr un rocío con un tamaño de gotitas regulares. Los aparatos de umbral de presión adecuados para usarse con la presente invención son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo, en los documentos WO 91/13281 y EP 311 863 B y EP 516 636, incorporados a la presente descripción como referencia. Dichos aparatos se consiguen comercialmente en Pfeiffer GmbH y también se describen en la Tecnología Farmacéutica de Europa de Bommer, R. de Septiembre de 1999. El aparato intranasal preferido produce gotitas (medidas utilizando agua como líquido) en un rango de 1 a 200µm, preferentemente de 10 a 120µm. En medidas inferiores a 10µm existe un riesgo de inhalación, y por lo tanto es deseable no tener más de aproximadamente el 5% de gotitas inferiores a 10µm. Las gotitas superiores a 120µm no se esparcen tan bien como las gotitas más pequeñas, de modo que es deseable no tener más de aproximadamente el 5% de gotitas que excedan de 120µm. La administración bi-dosis, es una característica adicional preferida del sistema de administración intranasal para usarse con las vacunas de acuerdo con la presente invención. Los aparatos bi-dosis contienen dos sub-dosis de una dosis simple de vacuna, una subdosis para administrar en cada fosa nasal. Generalmente, las dosis están presentes en una sola cámara y la construcción del aparato permite la administración eficiente de una sola sub-dosis a la vez. Alternativamente, se puede utilizar un aparato de mono-dosis para la administración de vacunas de acuerdo con la presente invención. La invención proporciona, en un aspecto adicional, un equipo farmacéutico que comprende un aparato de administración intranasal, tal y como aquí se describió, que contiene una formulación de vacuna de acuerdo con la presente invención. La invención no necesariamente está limitada a la administración del rocío de las formulaciones líquidas. Las vacunas de acuerdo con la presente invención pueden ser administradas en otras formas, por ejemplo, en la forma de un polvo. La vacuna contra la influenza de acuerdo con la presente invención es preferentemente una vacuna contra la influenza multivalente que comprende dos o más cepas de influenza. Más preferentemente, es una vacuna trivalente que comprende tres cepas. Las vacunas contra la influenza convencionales comprenden tres cepas de la influenza, dos cepas A y una cepa B. Sin embargo, las vacunas monovalentes, las cuales pueden ser útiles, por ejemplo, en una situación pandémica, no están excluidas de la invención. Una vacuna pandémica contra la gripe monovalente es más probable que contenga un antígeno de influenza de una sola cepa A. Las preparaciones del virus de la influenza no vivos, pueden ser derivadas a partir de métodos de huevos embrionados convencionales, o pueden ser derivadas de cualquiera de la nueva generación de métodos utilizando cultivos de tejido para cultivar el virus. Los substratos celulares adecuados para el cultivo del virus incluyen, por ejemplo, células de riñon de perro, tales como MDCK o células de un clon de las células MDCK, y similares a la MDCK, células de riñon de mono tales como células AGMK incluyendo células Vero, o cualquier otro tipo de células de mamífero adecuadas para la producción del virus de la influenza para propósitos de vacunación. Los substratos celulares adecuados también incluyen células humanas, por ejemplo, células MRC-5. Los substratos celulares adecuados no están limitados a líneas celulares; por ejemplo también están incluidas células primarias tales como fibroblastos de embrión de pollo. La preparación del antígeno del virus de la influenza puede ser producida por cualquiera de un número de procesos comercialmente aplicables, por ejemplo, el proceso de la gripe fragmentado descrito en la Patente Norteamericana No. DD 300 833 y DD 211 444, incorporadas a la presente descripción como referencia.

Tradicionalmente, la gripe fragmentada puede ser producida utilizando un tratamiento de solvente/detergente, tal como fosfato tri-n-butilo, o dietiléter en combinación con Tween™ (conocido como fragmentador "Tween-éter") y este proceso todavía es utilizado en algunas instalaciones de producción. Otros agentes de fragmentación ahora empleados, incluyen detergentes o enzimas proteolíticas o sales de hiél, por ejemplo desoxicolato de sodio, tal y como se describió en la Patente Norteamericana No. DD 155 875, incorporada a la presente descripción como referencia. Los detergentes que pueden ser utilizados como agentes de fragmentación incluyen detergentes catiónicos, por ejemplo, bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB), otros detergentes iónicos, por ejemplo, laurilsulfato, taurodesoxicolato, o detergentes no iónicos tales como los que se describieron anteriormente, incluyendo Tritón X-100 (por ejemplo, en un proceso descrito por Lina et al, 2000, en Biologicals 28, 95-103) y Tritón N-101, o combinaciones de cualesquiera de dos o más detergentes. Los agentes de fragmentación adecuados adicionales que pueden ser utilizados para producir el virus de gripe fragmentado ¡ncluyen: 1. Ácidos de hiél y derivados de los mismos incluyendo: ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido quenodesoxi cólico, ácido litocólico, ácido ursodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico y derivados como ácidos de hiél glico-, tauro-, amidopropil-1-propanosulfónico-, amidopropil-2-hidroxi-1-propanosulfónico anteriormente mencionados, o desoxicolamida N,N-bis(3Dgluconoamidopropil). Un ejemplo particular ÍÉ J.^ A J.A, w.¿k.w .. , ... ^. — ^ ™^ d es el desoxicolato de sodio (NaDOC), el cual puede estar presente en cantidades de trazas en la dosis final de la vacuna. 2. Alquilglicósidos o alquiltioglicósidos, en donde la cadena alquilo es de entre C6 y C18, típicamente entre C8 y C14, las porciones de azúcar en cualquier pentosa ó hexosa o combinaciones de los mismos con enlaces diferentes tales como 1->6, 1->5, 1->4, 1->3, 1-2. La cadena alquilo puede ser saturada, insaturada y/o ramificada. 3. Derivados de dos de los anteriores, en donde uno o más grupos hidroxilo, preferentemente, el grupo 6 hidroxilo es/está modificado como esteres, etoxilatos, sulfatos, éteres, carbonatos, sulfosuccinatos, ¡setionatos, etercarboxilatos y compuestos de amino cuaternarios. 4. Azúcares acilo, en donde la cadena acilo es de entre C6 y C18, generalmente entre C8 y C12, la porción de azúcar es cualquier pentosa o hexosa o combinaciones de las mismas con enlaces diferentes como 1->6, 1->5, 1->4, 1->3, 1-2. La cadena acilo puede ser saturada o insaturada y/o ramificada, cíclica o no cíclica, con o sin uno o más heteroátomos, por ejemplo, N, S, P ó O. 5. Sulfobetaínas de la estructura R-N,N-(R1 ,R2)-3-amino-1-propanosulfonato, en donde R es una cadena alquilo o una cadena arilalquilo de entre C6 y C18, generalmente entre C8 y C16. La cadena alquilo R puede ser saturada, insaturada y/o ramificada. R1 y R2 son preferentemente cadenas alquilo de entre C1 y C4, generalmente C1 ó R1 y R2 y pueden formar un anillo heterocíclico tíi?á ii áj¿..iiÚ?i ..í. „¡A. ..¿ y.iss.5* tiaiE. i. junto con el nitrógeno. 6. Betaínas de la estructura R-N,N-(R1 ,R2)-glicina, en donde R es cualquier cadena alquilo de entre C6 y C18, generalmente entre C8 y C16. La cadena alquilo puede ser saturada, insaturada y/o ramificada. R1 y R2, preferentemente son cadenas alquilo de entre C1 y C4 y generalmente C1, ó R1 y R2 pueden formar un anillo heterocíclico junto con el nitrógeno. 7. N,N-dialquil-glucamidas de la estructura R-(N-R1)- glucamida, en donde R es cualquier cadena de entre C6 y C18, generalmente entre C8 y C12. La cadena alquilo puede ser saturada, insaturada y/o ramificada o cíclica. R1 y R2 son cadenas alquilo de entre C1 y C6, generalmente C1. La porción de azúcar podría ser modificada con pentosas o hexosas. 8. Compuestos de amonio cuaternario de la estructura R, -N + (-R1, -R2, -R3), en donde R es una cadena alquilo de entre C6 y C20, generalmente C20. La cadena alquilo puede ser saturada, insaturada y/o ramificada. R1, R2 y R3, preferentemente son cadenas alquilo de entre C1 y C4, generalmente C1 ó R1, R2 pueden formar un anillo heterocíclico junto con el nitrógeno. Un ejemplo particular es el bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB). El proceso de preparación de la vacuna fragmentada incluirá un número de pasos diferentes de filtración y/o pasos de separación, tales como ultracentrifugación, ultrafiltración, centrifugación por zonas y cromatografía (por ejemplo, intercambio de iones) en una variedad de combinaciones, y opcionalmente un paso de inactivación, por "-*" ejemplo, con formaldehído o (-propiolactona o U.V., el cual se puede llevar a cabo antes o después de la fragmentación. El proceso de fragmentación se puede realizar en la forma de un lote, un proceso continuo o semicontinuo. 5 De preferencia, la sal de hiél tal como desoxicolato de sodio está presente en cantidades de trazas en una formulación de vacuna fragmentada de acuerdo con la presente invención, preferentemente en una concentración no mayor del 0.05%, o no mayor de aproximadamente el 0.01%, más preferentemente de aproximadamente 10 0.0045% (p/v). Las preparaciones del antígeno de la vacuna de la gripe fragmentada de acuerdo con la presente invención comprende una cantidad residual de Tween 80 y/o Tritón X-100 que permanece desde el proceso de producción, aunque éstos pueden ser agregados o sus 15 concentraciones ajustadas después de la preparación del antígeno fragmentado. De preferencia están presentes tanto el Tween 80 como el Tritón X-100. Los rangos preferidos para las concentraciones finales de estos tensioactivos no iónicos en la dosis de vacunas son: Tween 80: del 0.01 al 1%, más preferentemente de aproximadamente 20 el 0.1% (v/v). Tritón X-100: del 0.001 al 0.1 (% p/v), más preferentemente del 0.005 al 0.02% (p/v). La presencia de la combinación de estos dos tensioactivos, en concentraciones bajas, se descubrió que promueve la estabilidad del 25 antígeno en la solución. Es posible que esta estabilidad mejorada ll¿A¿,AJrf hásá?&~aai haga que el antígeno sea más inmunogénico nasalmente de lo que habían sido las formulaciones anteriores. Dicha mejora podría originarse de una prevalencia de agregados pequeños del antígeno, o de la mejora de la conformación natural del antígeno. Se podrá apreciar que la invención no depende de que esta explicación teórica sea correcta. También existe evidencia que muestra que en el caso de la preparación del virus de la influenza fragmentado, la presencia de fragmentos del virus de la influenza total asociados con las proteínas virales o que contienen proteínas virales, en particular HA, puede conservar la presentación del antígeno y puede contribuir a inducir una respuesta inmunológica fuerte. Por lo tanto, el virus de la influenza fragmentado es el antígeno de elección para usarse en los diferentes aspectos de la presente invención. En una modalidad particular, la preparación del virus fragmentado preferida contiene también laureto 9, preferentemente en un rango de 0.1 a 20%, más preferentemente de 0.1 a 10%, y aún más preferentemente de 0.1 a 1% (p/v). Las vacunas de acuerdo con la presente invención, generalmente no contienen más del 25% (p/v) de detergente tensioactivo, preferentemente menos del 15% y más preferentemente no más de aproximadamente el 2%. La invención proporciona en otro aspecto, un método de fabricación de una vacuna contra la influenza para aplicación nasal, cuyo método comprende: (i) proporcionar una preparación del virus de influenza fragmentado, producido esencialmente como para una vacuna contra la influenza convencional inyectada (por ejemplo, intramuscular), y que comprende al menos un tensioactivo no iónico; y (ii) opcionalmente ajustar la concentración de hemaglutinina y/o la concentración del tensioactivo no iónico de la preparación; (iii) llenar un aparato de administración intranasal con una dosis de vacuna de la preparación del virus de la influenza fragmentado, siendo dicha dosis en un volumen adecuado para la administración intranasal, opcionalmente en un formato de bi-dosis. Un paso opcional adicional en el método de acuerdo con este aspecto de la invención, incluye la adición de un tensioactivo que mejora la absorción tal como laureto 9, y/o la adición de un adyuvante, tal como un derivado no tóxico del lípido A, especialmente 3D-MPL. El proceso para producir vacunas contra la gripe inactivadas inyectadas convencionales es bien conocido y descrito en la literatura. Dichos procesos pueden ser modificados para producir una vacuna para la mucosa de una sola dosis para usarse en la presente invención, por ejemplo, mediante la inclusión de un paso de concentración antes de la filtración estéril final de la vacuna, ya que las vacunas intranasales emplean de manera ventajosa un volumen menor de la formulación de vacuna que las vacunas inyectadas. O el proceso puede ser modificado mediante la inclusión de un paso para ajustar la concentración de otros componentes, por ejemplo, los tensioactivos no iónicos a un porcentaje adecuado (p/v) para una vacuna intranasal de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, el ingrediente activo de la vacuna, por ejemplo el antígeno de la influenza puede ser esencialmente el mismo para la vacuna intramuscular convencional y las vacunas intranasales de una dosis de acuerdo con la presente invención. De preferencia, las formulaciones de vacuna de acuerdo con la presente invención, no incluyen formulaciones que no cubran por lo menos dos de los criterios de los Estados Unidos para todas las cepas, cuando son administradas en la forma de una vacuna de una sola dosis. Descripción Detallada de la Invención La presente invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes ejemplos no limitativos. Ejemplo 1 - Preparación de la vacuna de la influenza fragmentada La vacuna monovalente fragmentada fue preparada de acuerdo con el siguiente procedimiento. Preparación del inoculo del virus En el día de la inoculación de los huevos embrionados se preparó un inoculo fresco mediante la mezcla de un lote de siembra de trabajo con una solución salina regulada por fosfato con un contenido de fosfato de gentamicina en una cantidad de 0.5 mg/ml e hidrocortisona en 25 µg/ml (dependiendo de la cepa del virus). El inoculo del virus se mantuvo a una temperatura de 2 a 8°C.

Lii.-.id.? a¡ í " , itSfclifctfa Inoculación de los huevos embrionados Se utilizaron huevos enmbríonados de 9 a 11 días de edad para la duplicación del virus. Los cascarones son descontaminados. Los huevos son inoculados por 0.2 ml del inoculo del virus. Los huevos inoculados son incubados a una temperatura apropiada (dependiendo de la cepa del virus) durante un período de 48 a 96 horas. Al final del período de incubación, los embriones son exterminados mediante el enfriamiento y los huevos son almacenados durante un período de 12 a 60 horas a una temperatura de 2 a 8°C. Recolección El fluido alantóico de los huevos embrionados exterminados es recolectado, generalmente se recolectan de 8 a 10 ml de fluido alantóico crudo por huevo. Al volumen del virus monovalente crudo se le agregan de manera opcional 0.100 mg/ml de tiomersal. Concentración y purificación del virus completo a partir del fluido alantóico 1. Clarificación El fluido alantóico recolectado es clarificado mediante centrifugación de velocidad moderada (rango de 4000 a 14000 g). 2. Paso de adsorción Para obtener un gel de CaHPO en conjunto del virus clarificado, se agregaron soluciones de 0.5 mol/L de Na2HPO y 0.5 mol/L de CaCI2 para alcanzar una concentración final de CaHPO de 1.5 g de 3.5 g de CaHPO4/litro dependiendo de la cepa del virus. Después de la sedimentación por las 8 horas finales, el faiJHÍ<¿ *. » ri» . í-~. sobrenadante es removido y el sedimento que contiene el virus de la influenza se vuelve a solubilizar mediante la adición de 0.26 mol/L de EDTA-Na2 en solución, dependiendo de la cantidad utilizada de CaHPO4. 3. Filtración El sedimento que se volvió a suspender es filtrado en una membrana de filtro de 6 µm. 4. Centrifugación del gradiente de sacarosa El virus de la influenza es concentrado mediante la centrifugación isopícnica en un gradiente linear de sacarosa (0.55% (p/v)) que contiene 100 µ/ml de Tiomersal. El rango de flujo es de 8 a 15 litros/horas. Al final de la centrifugación, el contenido del rotor es recuperado por cuatro factores diferentes (la sacarosa es medida en un refractómetro): fracción 1 de 55 a 52% de sacarosa fracción 2 aproximadamente de 52 a 38% de sacarosa fracción 3 de 38 a 20% de sacarosa* - fracción 4 de 20 a 0% de sacarosa *dependiendo de la cepa del virus: la fracción 3 puede ser reducida al 15% de sacarosa. Para la preparación adicional de la vacuna solamente se usaron las fracciones 2 y 3. La fracción 3 es lavada mediante diafiltración con regulador de fosfato con el objeto de reducir el contenido de sacarosa a un contenido aproximadamente inferior al 6%. El virus de la influenza presente en esta fracción diluida es peletizado para remover los contaminantes solubles. El botón se vuelve a suspender y es mezclado completamente para obtener una suspensión homogénea. La fracción 2 y el botón que se volvió a suspender de la fracción 3 son cortados en conjunto y se les agrega regulador de fosfato para obtener un volumen de aproximadamente 40 litros. Este producto es el concentrado del virus total monovalente. 5. Centrifugación del gradiente de sacarosa con desoxicolato de sodio El concentrado del virus de influenza total monovalente es aplicado a una ultracentrífuga ENI-Mark II. El rotor K3 contiene un gradiente linear de sacarosa (055% (p/v)) en donde el gradiente de desoxicolato de sodio es puesto en capas adicionalmente. El Tween 80 está presente durante la fragmentación hasta en un 0.1% (p/v). La concentración máxima de desoxicolato de sodio es de 0.7 a 1.5% (p/v) y depende de la cepa. El rango del flujo es de 8 a 15 litros/hora. Al final de la centrifugación, el contenido del rotor es recuperado por tres fracciones diferentes (la sacarosa es medida en un refractómetro) la Fracción 2 se utiliza para el procesamiento adicional. El contenido de sacarosa para los límites de fracción (de 47 a 18%) varía de acuerdo a las cepas y es mezclado después de la evaluación: 6. Filtración estéril La fracción del virus fragmentado es filtrado sobre un filtro de membranas que termina con una membrana de 0.2 µm. El regulador de fosfato que contiene 0.025% (p/v) de Tween 80 es utilizado para la 5 dilución. El volumen final de la fracción 2 filtrada es 5 veces el volumen de la fracción original. 7. Inactivación El material monovalente filtrado es incubado a una temperatura de 22 ± 2°C durante por lo menos 84 horas (dependiendo de las cepas 10 del virus, esta incubación puede ser acortada). Entonces se le agrega regulador de fosfato con un contenido de 0.025% de Tween 80 con el objeto de reducir el contenido total de proteínas a un máximo de 250 µg/ml. Se le agrega formaldehído a la concentración final de 50 µg/ml y la inactivación tiene lugar a una temperatura de 20°C ± 2°C durante 15 por lo menos 72 horas. 8. Ultrafiltración El material del virus fragmentado inactivado es concentrado a por lo menos dos potencias en una unidad de ultrafiltración equipada con membranas de acetato de celulosa con 20 kDa MWCO. El material 20 es lavado posteriormente con un regulador de fosfato que contiene 0.025% (p/v) de Tween 80 y seguido por la solución salina amortiguada por fosfato con un contenido de 0.01% (p/v) de Tween. 9. Filtración estéril final El material después de la ultrafiltración es filtrado en 25 membranas de filtro terminando con una membrana de 0.2 µm. La concentración final de Hemaglutinina medida por SRD (método recomendado por WHO) debe exceder de 450 µg/ml. 10. Almacenamiento El producto final monovalente es almacenado a una temperatura de 2 a 8°C por un máximo de 18 meses. Pureza La pureza fue determinada por medio de exploración O.D. de gel poliacrilamida marcados con Coomassie. Los picos fueron determinados manualmente. Los resultados de las muestras se proporcionan en la Tabla 1: 1 = 100% menos todos los picos no identificados Ejemplo 2 - Preparación de dosis de vacuna de la vacuna a granel La vacuna final es preparada formulando una vacuna trivalente a partir de la vacuna monovalente con las concentraciones de detergente ajustadas según sea requerido.

El agua para inyección, el PBS de pH 7.4 10x concentrado, Tween 80 y Tritón X-100 son mezclados para obtener las concentraciones finales requeridas (PBS 1x concentrado, Tween 80 0.15% y Tritón X-100 0.02%) Se agregaron los siguientes tres viriones fragmentados inactivados con agitación de 10 minutos entre cada adición: 30 µg HA A/Beijing/262/95 (H1N1) 30 µg HA A/Sidney/5/97 (H3N2) 30 µg HA B/Harbin/7/94 Después de 15 minutos de agitación el pH es ajustado a 1.2+1- 0.2. El volumen de la dosis es 200 µL La vacuna formulada con laureto 9, el laureto 9 es agregado antes del ajuste del pH para obtener una concentración final del 0.5% (p/v). Ejemplo 3 - Métodos utilizados para medir las respuestas de los anticuerpos 1. Detección antigripal específico, IgA total en secreciones nasales humanas por medio de la prueba de ELISA. Método de recolección para las secreciones nasales humanas Se aplican dos mechas contra el turbinato inferior (uno por cada fosa nasal) del voluntario. Las mechas se dejan en la nariz durante 1 minuto antes de ser colocadas en 2 ml de NaCI 0.9%, BSA 1% y azida de sodio 0.1% (regulador conservador). Todas las muestras se dejan por un período de 2 horas en hielo. Las mechas 1,Í? A.Í...^Í^Í. entonces son comprimidas para recuperar los anticuerpos. Después de la centrifugación (10', 2000g, 4°C) los fluidos de todas las muestras son recolectadas, alicuotados* y congelados a una temperatura de - 20°C hasta la fecha de la prueba. Los botones son suspendidos en 400 µl de aguas fisiológica y observados con el microscopio para ver la contaminación de las células sanguíneas. Después de la recolección utilizando las mechas nasales y el tratamiento de las secreciones nasales humanas, se realiza la detección del IgA antigripal específico y total con dos diferentes pruebas de ELISA. ELISA de captura para la detección del IgA total El IgA total es capturado con afinidad policlonal de IgA antihumano de Ig purificado inmovilizado en placas de microtitulación y subsecuentemente detectado utilizando una Ig de afinidad purificada de IgA antihumana policlonal acoplada con peroxidasa. Se utiliza un slgA humano purificado como estándar para permitir la cuantificación del slgA en las secreciones nasales recolectadas. Se utilizaron 3 referencias del slgA humano purificado como las referencias baja, media y alta en este ensayo. ELISA directo para la detección del IgA antigripal específico Se llevaron a cabo tres pruebas de ELISA diferentes, una en cada cepa de la gripe presente en la formulación de la vacuna. Los IgA antigripales específicos son capturados con antígenos de gripe inactivados fragmentados recubiertos con placas de microtitulación, y subsecuentemente son detectados utilizando la misma IgA de afinidad purificada del Ig antihumano policlonal acoplado con peroxidasa como el que se usó para la prueba de ELISA del IgA total. Reactivos Reactivos biológicos Ig de afinidad purificada IgA anti Humano de cabra (Sigma I-0884). IgA secretorio Humano purificado (ICN-Cappel 55905 (Estándar para la cuantificación total del IgA). IgA secretorio Humano (Calostro) (Biogénesis páginas 5111 a 5504). (Bioreferencia para el IgA total), diluido para obtener referencias baja, media y alta. - IgA Humano purificado (Sigma 1-1010) (referencia Sig para el IgA total). Referencia negativa para la prueba de ELISA específica antigripal (concentración de secreciones nasales con respuestas no detectables contra las tres cepas; corte = Referencia positiva baja para la prueba de ELISA específica antigripal (conjunto de secreciones nasales con respuestas bajas detectables contra las tres cepas). Referencia media positiva para la prueba de ELISA específica antigripal (conjunto de secreciones nasales con respuestas medias detectables contra las tres cepas; corte = 0.6 OD). HRP de afinidad purificado del suero IgA antihumano de cabra conjugado (ICN 674221). - Huevo inactivado fragmentado derivado del antígeno A/Beijing/262/95 H1N1. Huevo inactivado fragmentado derivado del antígeno A/Sidney/5/97 H3N2. Huevo inactivado fragmentado derivado del antígeno B/Harbin/7/94. Preparación de los reactivos Regulador de saturación (PBS, Tween 20 0.1%, BSA 1%, NCS 4%). NaCI T20 (NaCI 9g/l, Tween 200.05%). Método Detección total del IgA humano Agregar 100 µl/depósito del IgA antihumano policlonal de cabra en 1 µg/ml en DPBS e incubarlo durante la noche a una temperatura de 4°C. - Agregar 200 µl/depósito de regulador de saturación e incubarlo durante 1 hora a una temperatura de 37°C. Agregar en una primera fila: 100 µl/depósito de diluciones de dos potencias del IgA estándar en el regulador de saturación iniciando desde 250 ng/ml descendiendo hasta 0.12 ng/ml. ifcásüiA Agregar en las otras filas: 100 µl/depósito de dos potencias de las muestras (fluido nasal) en el regulador de saturación iniciando desde 1/100 y descendiendo a 1/102400, agregar 100 µl de regulador de saturación en la columna 12 e incubar durante 2 horas a una temperatura de 22°C. Lavar las placas cuatro veces con NaCI T20. Agregar 100 µl/depósito de IgA antihumano conjugado con peroxidasa de cabra diluido en regulador de saturación a 1/10000 e incubar durante 1 V2 horas y media a una temperatura de 22°C. Lavar las placas cuatro veces con NaCI T20. Agregar 100 µl/depósito de TMB (tetrametilbencidina) e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en la obscuridad. Detener la reacción agregando 100 µl/depósito de H2SO4 0.4N. Medir la absorbancia (OD) de cada placa utilizando un espectrofotómetro en 450 nm con una referencia en 630 nm. Detección del IgA específico Agregar 100 µl/depósito de cada cepa del virus de la gripe en 1 µg/ml en DPBS e incubar durante la noche una temperatura de 4°C. - Agregar 200 µl/depósito de regulador de saturación e mm& incubar durante 1 1/2 horas a una temperatura de 37°C. Agregar 100 µl/depósito de diluciones de dos potencias de las muestras en el regulador de saturación iniciando desde 1/5 descendiendo a 1/640 e incubar las placas durante 2 horas a una temperatura de 22°C. Lavar las placas cuatro veces con NaCI T20. Agregar 100 µl/depósito de IgA antihumano conjugado con peroxidasa de cabra diluido en regulador de saturación a 1/10000 e incubar durante 1 1/2 horas y a una temperatura de 22°C. Lavar las placas cuatro veces con NaCI T20. Agregar 100 µl/depósito de TMB (tetrametilbencidina) e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en la obscuridad. - Detener la reacción agregando 100 µl/depósito de H2SO4 0.4N. Medir la absorbancia (OD) de cada placa utilizando un espectrofotómetro en 450 nm con una referencia en 630 nm. Resultados - expresiones y cálculos Expresión total de IgA Los resultados son expresados como µg del IgA total en 1 ml de fluidos nasales, utilizando un programa Softmaxpro. Expresión del IgA específico antigripal Los resultados son expresados como el punto final de unidad de titulación los cuales son calculados a la inversa de la última dilución la cual proporciona un OD 50nm arriba del corte (OD 0n = 0.6). El valor de corte es definido como la densidad óptica más alta de la referencia negativa (del protocolo de validación) en una dilución de 1/5. El límite de detección correspondiente al título de la unidad de punto final en el corte puede ser calculado de este modo como que son cinco unidades del punto final. Las muestras con una unidad de punto final de titulación de <5 consideradas como negativas y la muestra con una titulación de unidad de punto final >5 serán consideradas como positivas. Los resultados finales de las pruebas son expresados de la manera siguiente: Normalización de la respuesta específica mediante el cálculo de la proporción entre la respuesta específica y la concentración total de IgA: unidad de punto final/µg totales de IgA (los métodos de cálculo más usados generalmente en la literatura). 2. Actividad de inhibición de Hemaglutinina (HAI) del Abs del suero específico de la gripe. El suero (50 µl) son tratados con 200 µl de RDE (enzima destructora del receptor) durante 16 horas a una temperatura de 37°C. La reacción es detenida con 150 µl de citrato Na al 2.5% y el suero inactivado a una temperatura de 56°C durante 30 minutos. Se prepara una dilución 1:10 agregando 100 µl de PBS. Posteriormente, se prepara una serie de dilución de dos potencias en placas de 96 depósitos (fondo-V) diluyendo 25 µl de suero (1:10) con 25 µl de PBS. Se le agregan a cada depósito 25 µl de los antígenos de referencia en una concentración de 4 unidades de hemaglutinación por 25 µl. El antígeno y la dilución antisuero son mezcladas utilizando un agitador de placa de microtitulación e incubadas durante 60 minutos a temperatura ambiente. Entonces se le agregan 50 µl de sus células sanguíneas de pollo (RBC) (0.5%) y se permite que el RBC se asiente durante 1 hora a temperatura ambiente. La titulación HAI corresponde a la inversa de la última dilución del suero que inhibe completamente la hemaglutinación inducida por el virus. Ejemplo 4 - Una comparación de la inmunogenicidad de una vacuna contra la influenza fragmentada intranasal con la de una vacuna parenteral convencional autorizada (Fluarix™) en sujetos adultos sanos. Formulaciones utilizadas en el estudio Se evaluaron dos formulaciones (A, B) de antígenos de influenza fragmentados derivados del huevo. A es una formulación intranasal y B es la Fluarix™/a-Rix® administrado intramuscularmente. Las formulaciones contienen tres antígenos de virión fragmentado inactivado preparados a partir de las cepas recomendadas por WHO de la temporada 1998/1999. El aparato utilizado para la administración de la vacuna fue una jeringa intranasal Accuspray™ de Becton Dickínson. El aparato funciona en una base similar a una jeringa convencional pero tiene una punta especial que contiene canales espirales los cuales dan Í???.Á?. k.uÁ?&.i , ..jb*,>.,iJt?.^ * l .^ ....^....i... -.,.,«.^ ¡ como resultado la producción de un rocío cuando se le ejerce una presión equilibrada sobre el émbolo. El aparato fue llenado con 200µl de la formulación de la vacuna y 100 µl de una formulación A fue rociada en cada fosa nasal. Composición de las formulaciones El comparador Fluarix™/a-Rix® es la vacuna contra la influenza bivalente fragmentada inactivada comercial de SmithKIine Beecham Biologicals. La dosis de 500µl fue administrada de manera intramuscular. Esta dosis contiene: 15µg de HA de las tres cepas mencionadas anteriormente, Tween 80 entre 500 y 1000 µg por ml (0.05% a 0.1%), Tritón X-100 entre 50 y 170 µg/ml (0.005% a 0.017%), deoxicolato de sodio máximo 100 µg/ml, tiomersal 100 µg/ml y solución salina regulada por fosfato con un pH entre 6.8 y 7.5. Estudio de Inmunogenicidad Un estudio abierto, controlado y aleatorizado, evaluó la inmunogenicidad de una vacuna contra la influenza fragmentada intranasal formulada con Tween 80 y Tritón X-100, comparada con una vacuna parenteral convencional (por ejemplo: Fluarix™). Veinte sujetos adultos sanos (con edades entre 18 y 40 años) recibieron una dosis de Fluarix™ y diez sujetos recibieron una dosis de la vacuna contra la influenza intranasal. La formulación intranasal (200 µl) contenía los siguientes viriones inactivados: 30 µg de hemaglutinina A/Beijing/262/95(H1N1), 30 µg de hemaglutinina A/Sidney/5/97(H3N2), 30 µg de hemaglutinina B/Harbin/7/94(H3N2), con solución salina regulada por fosfato (pH 7.4 ± 0.1). Tween 80 (0.1%), Tritón X-100 (0.015%), desoxicolato de sodio (0.0045%) y tiomersal (<35µg/ml). Se mantuvieron ocho días para un período de seguimiento de los síntomas locales y generales solicitados y ambas vacunas fueron bien toleradas con respecto a la seguridad y a la reactogenicidad. No se reportaron eventos adversos serios relacionados con la vacunación. La inmunogenicidad de las bacterias fue examinada evaluando los títulos (Hl) de inhibición de hemaglutinación en el suero para determinar el índice de seroconversión (definido como el porcentaje de vacuna que tiene por lo menos un aumento de cuatro dobleces en los títulos Hl del suero en el día 21 comparados con el día 0 para cada cepa de vacuna). El factor de conversión, definido como el aumento del doblez del Hl del suero de Títulos Promedio Geométricos (GMTs) de Hl en el día 21, (comparados con el día 0 para cada cepa de la vacuna), y el índice de seroprotección definido como el porcentaje de vacunas con un título Hl del suero >40 después de la vacunación (para cada cepa de la vacuna) es aceptado como una protección indicada. Además, se evaluó la respuesta del anticuerpo IgA de la mucosa, mediante el Ensayo Inmunoabsorbente de Enzima Enlazada (ELISA). En la Tabla 2, se pueden observar los índices de seropositividad, seroconversión y seroprotección del Hl 21 días Esi-Ég ?, k .-te ná U g^-^i&feüE^fr después de una dosis de Fluarix™ o la formulación intranasal. El factor de conversión se puede observar en la Tabla 2a. Tabla 2: índices de seropositividad, seroconversión y seroprotección Hl a los 21 días posteriores a la dosis 1 Seropositividad (n,%): número y porcentaje de sujetos con una titulación de > 10 Seroprotección (n,%): número y porcentaje de sujetos con una titulación de > 40 Seroconversión (n,%): número y porcentaje de sujetos con un aumento de por lo menos 4 dobleces en los títulos del día 0 al día 21. En todos los casos, el factor de conversión (aumento de dobleces en los GMTs de Hl en el suero después de la vacunación) fue superior 2.5, del nivel requerido para una vacuna exitosa contra la influenza.

En la Tabla 3, se puede observar el porcentaje de sujetos cort un aumento de dos dobleces o un aumento de cuatro dobleces en la proporción del anticuerpo IgA de la mucosa específico/total entre el día 21 y el día 0 (1 dosis). Tabla 3: Porcentajes de sujetos con un aumento de dos dobleces o cuatro dobleces en la proporción IgA específico/total entre el día 21 y el día 0 (1 dosis). 10 15 Resumen Los resultados de inmunogenicidad tabulados anteriormente, muestran que la formulación intranasal produjo niveles similares de 20 seropositividad, seroconversión y seroprotección a aquellos producidos por la vacuna parenteral convencional (Fluarix™) veintiún días después de una dosis. La formulación intranasal produjo una respuesta mejor de IgA de la mucosa después de una dosis de la vacuna parenteral convencional (Fluarix™). 25 Ejemplo 5 - Una comparación de la inmunogenicidad de la vacuna as. AÜLÍ Í??A?I* ****** *--f - •• • contra la influenza fragmentada intranasal formulada con laureto 9, Tritón X-100 y Tween 80, con la inmunogenicidad de una vacuna parenteral convencional con licencia (FluarixTM) en sujetos adultos sanos. Se evaluó una formulación intranasal de antígenos de influenza fragmentados derivados del huevo, formulada con laureto 9, Tritón X-100 y Tween 80 (A) con FluarixTM/a-Rix® (B). Las formulaciones contenían tres antígenos de virión fragmentado, preparado a partir de las cepas recomendadas por WHO de la temporada 1998/1999. El aparato utilizado para la administración de las vacunas fue una jeringa intranasal Accuspray™ de Becton Dickinson. El aparato trabajó de manera similar a una jeringa convencional, pero tiene una punta especial que contiene canales espirales los cuales dan como resultado la producción de un rocío cuando se ejerce una presión equilibrada sobre el émbolo. Se rociaron 100 µl de la formulación en cada fosa nasal. Composición de la formulación La formulación intranasal (A) contenía los siguientes viriones fragmentados inactivados: 1. 30 µg HA A/Beijing/262/95(H1N1) 2. 30 µg HA A/Sidney/5/97(H3N2) 3. 30 µg HA de B/Harbin/7/94 y solución salina regulada por fosfato con pH de 7.4 ± 0.1, Tween 80 0.1%, Tritón X-100 0.015%, desoxicolato de sodio 0.0045% y tiomersal menos de 35 µg/ml.

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El volumen de una dosis fue de 200 µl (sub-dosis de 10Oµl para cada fosa nasal). La formulación A, fue formulada con laureto 9 para obtener una concentración final de 0.5% (p/v). El comparador FluarixTM/a-Rix®(B) es la vacuna contra la influenza fragmentada trivalente inactivada comercial de SmithKIine Beecham Biologicals, la cual es administrada de manera intramuscular en una dosis de 500 µl. Estudio de Inmunogenicidad Un estudio abierto, controlado y aleatorizado, evaluó la inmunogenicidad de una vacuna contra la influenza fragmentada intranasal formulada con laureto 9 suplementada con Tween 80 y Tritón X-100, comparada con una vacuna parenteral convencional (por ejemplo, Fluarix™). Veinte sujetos adultos sanos (con edades de 18 a 40 años) recibieron una dosis de Fluarix™ y diez sujetos recibieron una dosis (dos sub-dosis, una por fosa nasal) de la vacuna contra la influenza intranasal. Se tuvo un período de ocho días de seguimiento para los síntomas locales y generales solicitados y ambas vacunas fueron bien toleradas con relación a la seguridad y la reactogenicidad. No se reportaron eventos adversos serios relacionados con la vacunación. La inmunogenicidad de las vacunas fue examinada evaluando los títulos (Hl) de inhibición de hemaglutinación en el suero para determinar el índice de seroconversión (definido como el porcentaje de las vacunas que tienen por lo menos un aumento de cuatro dobleces en los títulos Hl del suero en el día 21 comparados en el día I?.?.?.? idLi...i,JL.ÍÉt??é?i.^. 0, para cada cepa de vacuna), el factor de conversión (definido como el aumento del doblez en los Títulos Promedio Genéricos Hl en el suero (GMTs) en el día 21 comparados con el día 0, para cada cepa de vacuna) y el índice de seroprotección (definido como el porcentaje de vacuna con un título >40 Hl en el suero después de la vacunación (para cada cepa de vacuna)) es aceptado como una protección indicada. Además, se evaluó la respuesta del anticuerpo IgA de la mucosa, mediante el Ensayo Inmunoabsorbente de Enzima Enlazada (ELISA). Los índices de seropositividad, seroconversión y seroprotección del Hl, 21 días después de una dosis de Fluarix™ o la formulación intranasal, se pueden observar en la Tabla 4. Tabla 4: índices de seropositividad, seroconversión y seroprotección Hl 21 días posteriores a la dosis 1: Seropositividad (n,%): número y porcentaje de sujetos con una titulación de > 10 Seroprotección (n,%): número y porcentaje de sujetos con una titulación de > 40 Seroconversión (n,%): número y porcentaje de sujetos con un aumento de por lo menos 4 dobleces en los títulos del día 0 al día 21 En todos los casos, el factor de conversión (aumento de dobleces en los GMTs de Hl en el suero después de la vacunación) fue superior a 2.5, el nivel requerido para una vacuna contra la influenza exitosa. En la Tabla 5, se puede observar el porcentaje de sujetos con un aumento de dos dobleces o un aumento de cuatro dobleces en la proporción del anticuerpo IgA de la mucosa específica/total entre el día 21 y el día 0 (1 dosis). Tabla 5: Porcentajes de sujetos con un aumento de dos dobleces o cuatro dobleces en la proporción de IgA específico/total entre el día 21 y el día 0 (dosis 1).

Resumen Los resultados de ¡nmunogenicidad tabulados anteriormente, muestran que la formulación intranasal produjo niveles similares de seropositividad, seroconversión y seroprotección a aquellos producidos por la vacuna parenteral convencional (Fluarix™) veintiún días después de una dosis. La formulación intranasal, generalmente produjo una respuesta mejor del IgA de la mucosa después de una dosis de la vacuna parenteral convencional (Fluarix™). Ejemplo 6 - Evaluación de una vacuna para la gripe intranasal con y sin laureto 9 + 3D-MPL en ratones preparados. 6.1 En un primer experimento, se vacunaron ratones con las formulaciones candidato, conteniendo las mismas cepas de la influenza que aquellas utilizadas para su preparación. Procedimiento del experimento Los ratones hembras Balb/c (8 semanas de edad) fueron "preparados" intranasalmente el día 0 con un virus completo de la influenza trivalente derivado del huevo ¡nactivado de ß-propiolactona A/Beijing/262/95, A/Sidney/5/97 y B/Harbin/7/94; (5 µg HA/cepa) para imitar la preparación natural que ocurre en los humanos. Después de 28 días, los ratones (10 animales por grupo) fueron vacunados intranasalmente con las siguientes formulaciones de vacuna trivalente con un contenido de las mismas cepas que aquellos utilizados para la preparación: Las formulaciones de la vacuna intranasal administradas a los ratones, son similares a aquellas que son suministradas a los humanos en el ejemplo 7, excepto que la dosis administrada por ratón corresponde a 1/10a de la dosis para humanos. Las muestras de suero fueron recolectadas en el día 42 y se probaron los anticuerpos de inhibición de hemaglutinación (Hl). Después del sacrificio, (el día 42), se realizaron los lavados nasales y se probaron los títulos del anticuerpo IgA por medio de la prueba de ELISA. Los anticuerpos IgA específicos fueron medidos como los títulos de punto final (EPT) y los resultados expresados como el EPT de IgA específico por µg total de IgA, con el objeto de excluir cualquier diferencia debida al método de muestreo. Resultados El primer objetivo fue confirmar que las formulaciones de vacuna intranasal son capaces de producir títulos Hl en el suero, no significativamente diferentes a aquellos que son el resultado de la administración parenteral. La figura 1, muestra los títulos Hl observados en el suero en el día 42 (por ejemplo, 14 días posteriores a la vacunación) con diferentes vacunas. Se realizó un análisis estadístico (ensayo estadístico comparativo Tukey-HSD) en los títulos Hl observados, con el objeto de comparar las vacunas intranasales con las vacunas parenterales. Los títulos Hl observados con los grupos del plano 1 y 2 fueron significativamente diferentes (p<0.05) de aquellos inducidos por la vacuna parenteral para dos de las tres cepas de la gripe (cepas A/H1N1 y B). Los títulos de la cepa anti-A/H3N2 no fueron significativamente diferentes. La formulación L9 fue tan inmunogénica como la vacuna parenteral para dos de tres de las cepas (cepas A/H3N2 y B). En contraste, la vacuna formulada con L9 + MPL produjo anticuerpos Hl contra las tres cepas de la gripe con títulos que no difieren de manera importante de aquellos observados con la vacuna parenteral. El segundo objetivo fue determinar si la respuesta IgA nasal a la vacuna intranasal era superior o no a la observada en los animales administrados de manera intramuscular. La figura 2, representa la respuesta del IgA nasal, registrada 14 días después de la aplicación de la vacuna (día 42). No existieron diferencias significativas entre las respuestas inducidas por cualesquiera de las formulaciones intranasales. La administración intranasal indujo respuestas de dos a cuatro dobleces superiores, comparadas con la ruta parenteral. Finalmente, la vacuna ? • ilA-MJ?.Ml,*., . * * ^ ÉMüaáu^k^ ÁAJ^I formulada con L9 + MPL puede obtener el mismo nivel de respuesta comparado con otras vacunas intranasales, pero con una dosis de antígeno inferior. Conclusiones Los antígenos de la influenza fragmentados trivalentes formulados con L9 + MPL (0.75 µg HA + 0.5% Laureto 9 + 5 µg MPL) fueron la formulación de vacuna intranasal más inmunogénica en términos de respuestas del anticuerpo Hl. Todas las vacunas administradas por la vía nasal probadas fueron más potentes para inducir anticuerpos IgA locales que las vacunas administradas parenteralmente. La formulación L9 + MPL indujo una respuesta similar a las otras formulaciones, pero con un contenido reducido del antígeno. 6.2 En un segundo experimento, se inmunizaron intranasalmente los ratones con cepas, las cuales fueron diferentes a aquellas utilizadas en la preparación. El antígeno administrado es responsable de las epidemias anuales. Las cepas incluidas cada año en la vacuna contra la gripe son aquellas que se encuentran con más frecuencia, y también pueden ser encontradas en el campo aún otras cepas más o menos relacionadas. Como consecuencia, la mejor vacuna contra la gripe candidato tendrá que inducir protección que sea eficiente contra un amplio rango de cepas. Por lo tanto, fue de interés investigar hasta qué punto una formulación administrada de manera intranasal tenía la capacidad de producir una respuesta inmunológica después de una "preparación" con cepas heterólogas a aquellas contenidas en la vacuna. Procedimiento del Experimento Se "prepararon" ratones hembra Balb/c (de 8 semanas de edad) intranasalmente en el día 0 con virus de la influenza total trivalente, derivado del huevo inactivado por ß-propiolactona (A/Johannesburg/82/93 H1N1, A/Johannesburg/33/94 H3N2 y B/Panama/45/90; 5 µg HA/cepa) para imitar la preparación natural que ocurre en los humanos. Después del día 28, los ratones (10 animales por grupo) fueron vacunados intranasalmente con las siguientes formulaciones de vacuna trivalente (con un contenido de a/Beijing/262/95 H1N1, A/Sydney/5/97 y B/Harbin/7/94 como cepas heterólogas).

Las cantidades de viriones fragmentados trivalentes contenidos en las diferentes formulaciones de vacuna intranasales formuladas para ser probadas en los ratones, correspondieron nuevamente a 1/10a de la dosis que fue administrada a los voluntarios humanos en el ejemplo 7. Las muestras de suero fueron recolectadas en el día 42 y se analizaron los anticuerpos de inhibición de hemaglutinación (H l). Después del sacrificio (día 42) , se realizaron los lavados nasales y se probaron los títulos del anticuerpo IgA por medio de la prueba de ELISA. Los anticuerpos IgA específicos fueron medidos como los títulos de punto final (EPT) y los resultados se expresaron como el EPT IgA específico por µg total de IgA con el objeto de excluir cualquier diferencia debida al método de muestreo. Resultados El primer objetivo del estudio fue determinar si las formulaciones de vacuna intranasal tenían la capacidad de producir respuestas Hl en el suero contra los antígenos de la vacuna cuando se utilizaron para la infección de cepas heterosubtípicas. La figura 3, muestra los títulos Hl observados en el suero, 14 días después de la vacunación (día 42) con las diferentes formulaciones de vacuna. Todas las form ulaciones intranasales con L9 ó L9 + M PL, pudieron inducir respuestas inmunológicas dirigidas hacia las tres cepas de la influenza, la cuales fueron com parables con aquellas producidas por la administración parenteral de la vacuna simple. El análisis estadístico (ensayo comparativo estadístico Tukey-HSD) confirmó que la respuesta producida por todas las formulaciones intranasales no era significativamente diferente (p > 0.05) de las l._t_.. jtÍ*,iÍ át?it áfii¡áá* tm?má ¿*..«.*¿,,?.., , , *.. .*~ . *~~. *..~ ¡tr<*~>~?lní . - u? ^jb.í^ ., ^?A^,.JA.??.J de la administración parenteral. Dentro de las intranasales, no se observaron diferentes estadísticas. Aunque las formulaciones con L9 + MPL y L9 fueron generalmente más inmunogénicas, conteniendo las anteriores la mitad del contenido del último antígeno (0.75 µg contra 1.5 µg de HA). El segundo objetivo fue determinar (1) si una respuesta IgA específica nasal a las cepas heterólogas se podía medir después de la vacunación intranasal y (2) si esta respuesta era superior a la observada en los animales vacunados ¡ntramuscularmente. La figura 4, presenta la respuesta IgA antí-heteróloga específica nasal, registrada 14 días posteriores a la vacunación (día 42). Se cubrieron ambos criterios del segundo objetivo. Todas las formulaciones intranasales indujeron respuestas IgA hacia las tres cepas heterólogas que fueron de tres a ocho dobleces mayores que aquellas observadas con las vacunas simples que fueron inyectadas de manera intramuscular. La amplitud de las respuesta IgA no fue significativamente diferente dentro de las formulaciones intranasales. La magnitud de la respuesta observada con la vacunación heteróloga alcanzó el mismo rango que para la vacunación homologa (ver figura 2). Aquí nuevamente, la vacuna formulada con L9 + MPL pudo sostener la misma amplitud de respuesta con una dosis inferior del antígeno (0.75 µg HA) en comparación con la vacuna simple o las formulaciones con L9 (3 y 1.5 µg HA). Conclusión La administración intranasal para la vacuna contra la influenza fragmentada trivalente, con o sin el tensioactivo para mejorar la absorción o adjuvación, fue capaz de inducir respuestas hetero- subtípicas tanto en términos de suero de anticuerpo Hl como IgA específico intranasal para cepas de vacuna de gripe. A pesar de que las diferencias entre los grupos no fueron estadísticamente significativas, las vacunas en donde los viriones fragmentados bivalentes son formulados con L9 ó L9 + MPL, generalmente indujeron una respuesta inmunológica más potente, tanto sistémica como local. Además, comparada con la vacuna que contiene L9, la vacuna formulada con L9 + MPL indujo el mismo nivel de inmunidad, pero con una dosis inferior del antígeno. Ejemplo 7 - Evaluación de una vacuna contra la influenza de virión fragmentado trivalente derivado del huevo, administrada intranasalmente con o sin laureto 9 ó con laureto 9 + 3D-MPL, administrado después de un programa de dosis, comparado con una vacuna contra la influenza de virión fragmentado trivalente y administrada de manera intramuscular en adultos sanos en edades de entre 18 y 40 años. En este estudio, se evaluaron las respuestas inmunológicas sistémicas y locales de la mucosa para las vacunas en aproximadamente 120 sujetos, hombres y mujeres saludables. Composición de Vacunas Candidato Se evaluaron 5 formulaciones de antígenos de influenza fragmentados derivados del huevo en este estudio. Las vacunas candidato son administradas ¡ntranasalmente. Además, se usó como comparador la vacuna contra la influenza de virión fragmentada inactivada Fluarix™ de SmithKIine Beecham Biologicals, administrada intra muscul arm ente. Las vacunas intranasales candidato contienen los tres antígenos del virión fragmentado inactivado, utilizados en la formulación del Fluarix™. Las cepas son aquellas que han sido recomendadas por el WHO para la Temporada del Hemisferio del Sur 2000. Una descripción general de las diferentes formulaciones se presenta en la Tabla 6. Tabla 6: Descripción General de las vacunas Vacunas contra la influenza fragmentadas trivalentes intranasales formuladas con L9 ó MPL (30 µg de dosis y 15 µg de dosis) El volumen de una dosis es de 0.2 ml.

*Cada vial intranasal contiene un promedio del 20% en volumen Vacunas contra la influenza fragmentadas trivalentes intranasales formuladas con L9 (dosis de 15 µg y 7.5 µg) El volumen de una dosis es de 0.2 ml. La formulación es tal y como se ilustra en la tabla 7, e incluye además un mg de laureto 9 por dosis, junto con 15 o 7.5 µg de dosis de HA por cepa. El laureto 9 es obtenido de Kreussler, Alemania. Vacuna contra la influenza fragmentada trivalente intranasal formulada con L9 + 3D-MPL (dosis de 7.5 µg) El volumen de una dosis es de 0.2 ml. La formulación es tal y como se ilustra en la tabla 7, e incluye además 1 mg de laureto 9 y 50 µg de 3D-MPL por dosis, junto con una dosis de 7.5 µg de HA por cepa. La vacuna contra la influenza fragmentada trivalente inactivada comercial Fluarix™ utilizada como comparador El Fluarix™ 2000 (Hemisferio Sur), es utilizado como comparador. Esta vacuna de 0.5 ml de dosis es administrada intra muscul arm en te. Una dosis contiene 15 µg de hemaglutinina de cada cepa del virus de influenza (A/Caledonia Nueva/20/99 /H1N1) - A/Sidney/5/97 (H3N2 - B/Yamanashi/166/98) y 50 µg de tiomersal como conservador por dosis. Formulación de las vacunas candidato contra la influenza fragmentadas trivalentes. 1. Concentración de los tres viriones fragmentados inactivados. Antes de la formulación de las vacunas candidato finales, los tres viriones fragmentados inactivados fueron concentrados por separado por medio de una filtración de flujo tangencial de hasta 1000 a 1500 µg de HA por ml. Se utilizaron cassettes de membrana equipados con una membrana de triacetato de celulosa con un corte de 10 kDa. 2. Formulación de las vacunas contra la influenza fragmentadas trivalentes. El diagrama de flujo de la formulación se presenta a continuación: ^f ^H ,^^^^ ^fc-ji-j^te^->5A^- - agua por inyección + solución salina regulada por fosfato pH 7.4 + Tween 80 a 0.15% + Tritón X100 a 0.02% + - agitación de 5 minutos a temperatura ambiente Cepa A/Caledonia Nueva/20/99 150 ó 75 ó 3.7 µg HA/ml + ? agitación de 10 minutos a temperatura ambiente Cepa A/Sydney/5/97 150 ó 75 µg HA/ml + -» agitación de 10 minutos a temperatura ambiente Cepa B/Yamanashi/166/98 150 ó 75 µg HA/ml agitación de 15 minutos a temperatura ambiente ajustar pH a 7.2 ± 0.2 almacenado a una temperatura de +2 a +8°C Para las formulaciones que contienen laureto 9, el laureto 9 al 0.5% es agregado inmediatamente antes del ajuste del pH y se continúa la agitación a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para las formulaciones que contienen laureto 9 + 3D-MPL, se agregan 250 µg/ml de 3D-MPL, inmediatamente antes de la adición del laureto 9, y la formulación es agitada durante 15 minutos antes de que se le agregue el laureto 9. Llenado de las vacunas candidato contra la influenza fragmentadas trivalentes Los volúmenes totales son llenados asépticamente en frascos de vidrio del tipo 1 (Ph.Eur.) de Pfeiffer (Alemania). Inmediatamente después del llenado, estos frascos son cerrados con un tapón de hule. Todas las operaciones se realizan en una habitación aséptica (sistema de flujo laminar). Después del llenado y cerrado, los viales tapados son insertados dentro del émbolo plástico y ensamblados dentro del aparato de boquilla rociadora para la generación del rocío. Este aparato permite la administración de dos rocíos de 100 µl. Resultados Para todos los sujetos, se realizaron los siguientes análisis: 1. En los días 0, 21 y 42: titulaciones ELISA del IgA de la mucosa (respuesta inmunológica local) probados por separado para cada una de las tres cepas del virus de la influenza representados en la vacuna. 2. En los días 0, 21 y 42: se probaron los titulados del anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (Hl) en el suero por separado contra cada una de las tres cepas de la influenza. Los derivados de estos son: 1. GMTs del anticuerpo Hl del suero (con intervalos de confianza del 95%) en todos los puntos del tiempo. 2. Para Hl: índices de seroconversión en el día 21. 3. Para Hl: factores de conversión en el día 21. 4. Para Hl: índices de protección en los días 21 y 42. 5. Solamente para el IgA: porcentaje de sujetos quienes tuvieron un aumento de 2 dobleces y de 4 dobleces en los títulos de IgA del día 0 al día 21 y del día 0 al día 42.

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES 1. El uso de una preparación de antígeno del virus de la influenza no vivo en la fabricación de una formulación de vacuna para una vacunación intranasal de una dosis contra la influenza, en donde la vacunación de una dosis genera tiene una respuesta inmunológica la cual cubre los requerimientos reglamentarios internacionales para las vacunas contra la influenza.
2. 2. El uso tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde la vacunación de una dosis, logra por lo menos dos de los tres criterios de la Unión Europea para el índice de seroconversión, el índice de seroprotección y el factor de seroconversión para la, o todas las cepas de la influenza presentes en la vacuna.
3. 3. El uso tal y como se describe en la reivindicación 2, en donde se cumplen todos los tres criterios de la Unión Europea para la, o todas las cepas de la influenza representadas en la vacuna.
4. 4. El uso tal y como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la preparación del antígeno del virus de la influenza es seleccionado del grupo que consiste de preparaciones de antígeno de virus fragmentadas, antígenos de subunidad, antígenos complejos inactivados químicamente o de otro modo.
5. 5. El uso tal y como se describe en la reivindicación 4, en donde la preparación del antígeno de la influenza es una preparación de antígeno de virus fragmentado. l*.*.?.A?.i.k..tf¡*»M^..*É^?L*i . ,., ...„,,,, _ ?..**¿tA*^*» *mFt... fe ...^««fc
6. 6. El uso tal y como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la formulación comprende al menos un tensioactivo.
7. 7. El uso tal y como se describe en la reivindicación 6, en donde el tensioactivo es por lo menos un tensioactivo no iónico seleccionado del grupo consistente de octílfenoxipolietoxietanoles (por ejemplo, de la serie Tritón™ que se consigue en el mercado), esteres de polioxietileno de sorbitán (series Tween™ ) y esteres o éteres de polioxietileno de la formula general (I): (I) HO(CH2CH2O)n-A-R en donde n es 1-50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo C1.50 o fenilo C1.50, y combinaciones de dos o más de éstos.
8. 8. El uso tal y como se describe en la reivindicación 7, en donde el tensioactivo no iónico es por lo menos un tensioactivo seleccionado del grupo de t-octilfenoxipolietoxietanol (Tritón X-100), monooleato de polioxietileno de sorbitán (Tween 80) o laureto 9, o una combinación de dos o más de los mismos.
9. 9. El uso tal y como se describe en la reivindicación 8, en donde la vacuna comprende una combinación de dos de los tres tensioactivos no iónicos, es decir el monooleato de polioxíetileno de sorbitán (Tween 80) y t-octilfenoxipolietoxietanol (Tritón X-100).
10. 10. El uso tal y como se describe en la reivindicación 9, en donde la vacuna comprende una combinación de todos los tres tensioactivos no iónicos. J it i¿ B i tnllri 11 Itlilt? m f??í"?l ^-^-^.--..-J»-^*.^. ^.^ - ^..^-.^A..^
11. 11. El uso tal y como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la vacuna comprende además un ácido de hiél o ácido cólico o derivados del mismo, tal como desoxicolato de sodio.
12. 12. El uso tal y como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde cada dosis de formulación de vacuna contiene una dosis baja de hemaglutinina.
13. 13. El uso tal y como se describe en la reivindicación 12, en donde el contenido de hemaglutinina por cepa de influenza es de aproximadamente 30 µg o menor por dosis.
14. 14. El uso tal y como se describe en la reivindicación 13, en donde el contenido de hemaglutinina por cepa de influenza es de aproximadamente 15 µg o menor por dosis.
15. 15. El uso tal y como se describe en la reivindicación 14, en el cual el contenido de hemaglutinina es de aproximadamente 7.5 µg o menor de hemaglutinina por cepa del virus por dosis de la vacuna.
16. 16. El uso tal y como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la formulación de la vacuna se encuentra en un volumen bajo por dosis.
17. 17. El uso tal y como se describe en la reivindicación 16, en donde el volumen por dosis es menor de 500 µl o menor de 300 µl o no mayor de aproximadamente 200 µl por dosis.
18. 18. El uso tal y como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde la vacuna es administrada en un formato bi-dosis en dos sub-dosis.
19. 19. El uso tal y como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la vacuna no contiene un inmuno- estimulante agregado.
20. 20. El uso tal y como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la vacuna comprende además un derivado no tóxico del lípido A, preferentemente seleccionado de los derivados no tóxicos del lípido A monofosforilo y el lípido A difosforilo.
21. 21. El uso tal y como se describe en la reivindicación 20, en donde la vacuna comprende 3D-MPL.
22. 22. El uso tal y como se describe en la reivindicación 21, en donde la vacuna comprende 3D-MPL y laureto 9.
23. 23. Un método para la profilaxis de la infección o enfermedad de la influenza en un sujeto, cuyo método comprende la administración al sujeto de una sola dosis de una vacuna del virus de la influenza no vivo por medio de la superficie de la mucosa para inducir una respuesta inmunológica, la cual cubre por lo menos dos de los siguientes criterios para todas las cepas de influenza presentes en la vacuna: (i) un índice de seroconversión mayor o igual al 40%; (ii) un índice de seroprotección mayor o igual al 70%; y (iii) un factor de conversión mayor o igual a 2.5.
24. 24. Un método para la profilaxis de la infección o enfermedad de la influenza en un sujeto, cuyo método comprende la administración al sujeto de una sola dosis de una vacuna del virus de la influenza no vivo con HA bajo por medio de la superficie de la mucosa para inducir una respuesta inmunológica, la cual cubre por lo menos dos de los siguientes criterios para todas las cepas de la influenza presentes en la vacuna: (i) un índice de seroconversión mayor o igual al 40%; (ii) un índice de seroprotección mayor o igual al 70%; y (iii) un factor de conversión mayor o igual a 2.5.
25. 25. El método tal y como se describe en la reivindicación 23 ó la reivindicación 24, en donde todos los tres criterios son cumplidos para todas las cepas de influenza presentes.
26. 26. El método tal y como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en donde la vacuna es administrada intranasalmente.
27. 27. Un equipo farmacéutico que comprende un aparato de administración intranasal y una vacuna de una dosis, la cual comprende una preparación de antígeno del virus de la influenza no vivo sin un inmuno-estimulante agregado.
28. 28. Un equipo farmacéutico que comprende un aparato de administración intranasal y una vacuna contra la influenza de una dosis, la cual genera una respuesta inmunológica que cubre los requerimientos de regulación internacionales para una vacuna contra la influenza.
29. 29. El equipo farmacéutico que comprende un aparato de administración intranasal y una vacuna de una dosis, la cual comprende una dosis baja de HA de una preparación del antígeno del virus de la influenza no vivo.
30. 30. El equipo farmacéutico tal y como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 27 a 29, en donde el aparato es un aparato de administración bi-dosis para la administración de dos sub-dosis en una sola administración.
31. 31. El equipo farmacéutico tal y como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 27 a 30, en donde el aparato es un aparato de rocío ¡ntranasal.
32. 32. Un método para la manufactura de una vacuna contra la influenza para aplicación nasal cuyo método comprende: (i) proporcionar una preparación del virus de la influenza fragmentado, producido esencialmente como para una vacuna de la influenza convencional inyectada y que comprende al menos un tensioactivo no iónico; y (ii) ajustar opcionalmente la concentración de hemaglutinina y/o la concentración del tensioactivo no iónico en la preparación; (iii) llenar un aparato de administración intranasal con una dosis de vacuna de la preparación del virus de influenza fragmentado, siendo dicha dosis de un volumen adecuado para la administración intranasal, y opcionalmente en un formato de bi-dosis.