MXPA02002391A

MXPA02002391A - Proteina iren, su preparacion y uso.

Info

Publication number: MXPA02002391A
Application number: MXPA02002391A
Authority: MX
Inventors: Nikolay Malinin
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1999-09-02
Filing date: 2000-08-31
Publication date: 2002-08-20
Also published as: ZA200201401B; EE200200096A; US7429648B1; IL131719A0; EA200200319A1; CN1384878A; AU6723100A; KR100820526B1; NO20020919D0; AU784582B2; JP2003508053A; KR20020059386A; HK1051876A1; CN100482795C; IL148446A0; BR0014167A; NO20020919L; EA005775B1; WO2001016314A1; CA2383606A1

Abstract

Se proveen secuencias de ADN que codifican proteinas de union TRAF, proteinas codificadas por las mismas, y su uso en el tratamiento o prevencion de condiciones patologicas asociadas con la induccion de NF-kB, o una actividad mediada por una TRAF.

Description

PROTEINA IREN, SU PREPARACIÓN Y USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a secuencias de ADN que codifican una proteína de unión de factor asociado del receptor de TNF (TRAF por sus siglas en inglés). Más específicamente, se refiere a secuencias de ADNc que codifica una proteína biológicamente activa designada IREN y sus isoformas capaces de unirse a TRAF2. La invención también se refiere a las proteínas codificadas por los ADN anteriores y al uso de dichas proteínas y secuencias de ADN en el tratamiento o prevención de condiciones patológicas asociadas con inducción de NF-?B, o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2, o con otras moléculas a las cuales se unen las proteínas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La superfamilia del receptor del Factor de Necrosis Tumoral/Factor de Crecimiento del Nervio (TNF/NGF, por sus siglas en inglés) representa una familia creciente con más de 20 miembros identificados en su mayoría en células de mamíferos. Aunque los receptores de esta superfamilia difieren en la secuencia primaria de sus dominios extracelulares, los miembros de la superfamilia del receptor de TNF/NGF comparten subdominios ricos en cisteína que se piensa que adoptan pliegues terciarios generalmente similares. (Bazan, 1993; Beutler y van Heffel, 1994; Smith y otros, 1994). Excepto para dos receptores, el receptor de TNF p55 y Fas/APO1 , los diferentes miembros de esta familia de receptores puede tener diferencias estructurales variantes. Sin embargo, hay mucha similitud de función entre los receptores, indicando que comparten rutas de señalamiento comunes. Un ejemplo para esta similitud es la capacidad de varios receptores de la familia de TNF/NGF para activar el factor de transcripción NF-?B (ver más adelante). TRAF2 es un miembro de una familia recién descrita de proteínas designadas TRAF (Factor Asociado del Receptor de TNF) que incluye varias proteínas identificadas como, por ejemplo, TRAF1 , TRAF2 (Rothe, M., y otros (1994); solicitud publicada del PCT WO 95/33051 ), TRAF (Cheng, G. Y otros (1995), TRAF4 (CART1 , motivo rico en C asociado con los dominios RING y TRAF, Régnier y otros 1995), TRAF5 (Ishida y otros, 1996a, Nakano y otros 1996) y TRAF6 (ver Cao y otros, 1996a, Ishida y otros 1996b). Todas las proteínas que pertenecen a la familia de TRAF comparten un alto grado de identidad de aminoácidos en sus dominios C-terminales, mientras sus dominios N-terminales pueden no estar relacionados. Como se muestra en una ilustración esquemática de TRAF2 (Fig. 1 en la presente), la molécula contiene un motivo de dedo anular y dos motivos de dedo de zinc similar a TFIIIA en su extremo N-terminal. La mitad C-terminal de la molécula incluye una región conocida como el "dominio TRAF" que contiene una región de cierre de leucina potencial que se extiende entre los aminoácidos 264-258 (llamado N-TRAF). Un dominio adicional hacia el extremo carboxi de la molécula entre los aminoácidos 359-501 (llamado C-TRAF) es responsable de la unión de TRAF a los receptores y a otras moléculas de TRAF para formar homo o heterodímeros. El reclutamiento de proteínas adaptadoras de TRAF a los dominios citoplásmicos de moléculas receptoras puede conducir al ensamble de complejos de señalamiento más grandes que consisten de distintas moléculas adaptadoras de TRAF y otras proteínas efectoras con funciones enzimáticas. Numerosos reportes han examinado la activación de cinasas intracelulares en respuesta a la transducción de señales que dependen de TRAF. En particular, se ha mostrado que las cinasas de la familia de proteína cinasa activada con mitógeno (MAPK por sus siglas en inglés) son piezas clave para señalar rutas que se accionan por complejos que contienen TRAF. Estas rutas parecen culminar en la activación de cinasa amino-(N)-terminal c- Jun (JNK) (Reinhard y otros, 1997; Song y otros 1997). Las proteínas de TRAF por lo tanto pueden servir para modular la capacidad de los receptores para accionar diferentes rutas de señalamiento que conducen a la fosforilación y activación de proteínas cinasas y, subsecuentemente, a la activación de factores de transcripción de la familia Reí y AP-1. El factor de transcripción c-Jun se fosforila en su terminación amino por JNK, el miembro que está corriente debajo de una ruta de señalamiento de MAPK (Hibi y otros 1993). Para activarse, JNK necesita ser fosforilado por una cinasa de MAPK (MAPKK, SEK, MEK). Esta propia cinasa se fosforila por un MAPKKK (MEKK1 ), que puede activarse mediante la fosforilación por la proteína de GCKR (por sus siglas en inglés) (cinasa central germinal relacionada), la cinasa que está corriente arriba descrita en esta ruta (miden y otros, 1994; Lin y otros, 1995; Shi y Kehrl 1997). Las mutantes negativas dominantes de cualquiera de estas proteínas que carecen de la actividad de cinasa bloquean la activación de JNK mediada por TRAF que se induce por miembros de la superfamilia de TNF/NGFR. Por lo tanto, las proteínas de TRAF parecen regular la ruta de activación de JNK a un paso muy proximal (Liu y otros 1996; Lee y otros 1997; Reinhard y otros 1997). Las células de ratones deficientes de TRAF2 no activaron JNK en respuesta a TNF-a (Yeh y otros, 12997). Se ha demostrado que JNK media la integración de una señal co-estimuladora por CD28 durante la activación de linfocitos T (Su y otros, 1994). Tomados juntos, estos resultados sugieren que la co-estimulación por CD28 y la co-estimulación mediada por TRAF, después de la ligadura de las moléculas relacionadas de TNFR, utilizan los mismos componentes de señalamiento distales. Las proteínas de TRAF también parecen jugar un papel importante para modular un paso temprano en la activación inducida por el receptor de NF-?B (Rothe y oros, 1995b; Cao y otros 1996; Nakano y oros 1996). NF-?B comprende miembros de una familia de proteínas de formación de dímeros con homología al oncogeno Reí que, en su forma dimérica, actúa como factores de transcripción. Estos factores son ubicuitos y participan en la regulación de la expresión de múltiples genes. Aunque se identifica inicialmente como un factor que está constitutivamente presente en las células B en la etapa de la expresión de cadena ligera de lg?, NF-?B se conoce principalmente para su acción como un activador transcripcional inducible. En la mayoría de los casos conocidos NF-?B se comporta como un factor primario, a saber la inducción de su actividad es mediante activación de moléculas preexistentes presentes en la célula en su forma inactiva, en lugar de su síntesis de-novo que a su vez se basa en los factores de transcripción inducibles que encienden el gen de NF-?B. Los efectos de NF-?B son altamente pleyotrópicos. La mayoría de estos numerosos efectos comparten los aspectos comunes de inducirse rápidamente en respuesta a un estímulo extracelular. La mayoría de los agentes de activación de NF-?B son inductores de defensa inmune, incluyendo componentes de viruses y bacterias, citoquinas que regulan la respuesta inmune, luz UV y otros. Consecuentemente, muchos de los genes regulados por NF-?B contribuyen a la defensa inmune (véase Blank y otros, 1992; Grilli y otros, 1993; Baeuerle y Henkel, 1994, para su revisión). Una característica principal de la regulación de NF-?B es que este factor puede encontrarse en una forma de unión sin ADN citoplásmica que puede inducirse para trastocar al núcleo, unir ADN y activar la transcripción. Esta forma dual de las proteínas de NF-?B se regula por l-?B - una familia de proteínas que contiene repeticiones de un dominio que inicialmente se identificó en la proteína de anquirina de eritrocitos (Gilmore y Morin, 1993). En la forma no estimulada, el dímero de NF-?B ocurre en asociación con una molécula de l-?B que impone su localización citoplásmica previniendo su interacción con la secuencia de ADN que se une a NF-?B, y la activación de transcripción. La disociación de l-?B del dímero NF-?B constituye su paso de activación crítica por muchos de sus agentes inductores (DiDonato y otros, 1995) Hasta ahora hay poco entendimiento de la forma en la cual la especificidad de células se determina en términos de responsividad para varios agentes inductores de NF-?B. La evidencia de que las proteínas de TRAF pueden influenciar la activación mediada por el receptor de NF-?B proviene de la demostración de que la formas dominantes negativas de TRAF2 pueden inhibir la activación de NF-?B en respuesta a la oligomerización de varias moléculas relacionadas con TNFR, incluyendo TNFRII, CD40, CD30, 4-1 BB y Ox40 (Rothe y otros, 1994, 1995b; Duckett y otros, 1977; Arch y Thompson 1998). Sin embargo, los estudios de eliminación de genes en ratones no implican un papel requerido para un TRAF específico en la activación de NF-?B por ninguno de estos receptores (Lee y otros, 1997; Yeh y oros 1997). Esto sugiere que el acoplamiento del receptor puede activar NF-?B por más de una ruta. Uno de los agentes inductores más potentes de NF-?B es el factor de necrosis tumoral (TNF por sus siglas en inglés) de citoquina. Existen dos receptores de TNF diferentes: los receptores p55 y p75. Sus niveles de expresión varían independientemente entre diferentes células (Vandenabeele y otros, 1995). El receptor p75 responde preferencialmente a la forma unida a -á :i$._i:- í.r- -.j;. M¿_?_. la célula de TNF (TNF se expresa tanto como una proteína transmembrana del tipo II como una proteína soluble) mientras el receptor p55 responde efectivamente a moléculas de TNF solubles (Grell y otros, 1995). Los dominios intracelulares de los dos receptores son estructuralmente no relaciónales y se unen a proteínas citoplásmicas diferentes. Sin embargo, por lo mesón parte de los efectos del TNF, incluyendo efecto citocidal de TNF y la inducción de NF-?B, puede inducirse por ambos receptores. Esta característica es específica para células. El receptor p55 es capaz de inducir un efecto citocidal o activación de NF-?B en todas las células que exhiben dichos efectos en respuesta a TNF. El p75-R puede tener dichos efectos únicamente en algunas células. Otros, aunque expresan el p75-R a niveles altos, muestra inducción de los efectos únicamente en respeta a la estimulación de p55-R (Vandenabeele y otros, 1995). Aparente de los receptores de TNF, otros varios receptores de la familia de receptores TNF/NGF: CD30 (McDonald y otros, 1995), CD40 (Berberich y otros, 1994; Lalmanach-Girard y otros, 1993), el receptor de linfotoxina beta y, en unos cuantos tipos de células, Fas/APO1 (Rensing-Ehl y otros, 1995) también son capaces de inducir la activación de NF-?B. El receptor de IL-1 tipo I, que también acciona efectivamente la activación de NF-?B, comparte la mayoría de los efectos de los receptores de TNF a pesar del hecho de que no tienen similitud estructural con ellos. Las subunidades novedosas del receptor del complejo receptor de IL-18 recientemente se ha clonado y muestra que acciona la traslocación y activación de NF-?B en respuesta a IL-18 (Born y otros, 1998). El IL- Rp así como una proteína novedosa de la familia IL-1 , designada AcPL (por sus siglas en inglés) (Similar a Proteína Accesoria) se requieren ambos para señalar IL-18 La activación de NF-?B al accionar estos diferentes receptores resulta de fosforilación inducida de sus moléculas de l-?B asociadas. Varios componentes de una cascada de transduccióp de señal específica, activada en respuesta a las citoquinas proinflamatorias TNF-a o IL-1 ß, se ha identificado recientemente. Una proteína cinasa novedosa designada NIK por sus siglas en inglés) para la Cinasa Inductora de NF-?B fue la primera en ser identificada (véase la Solicitud de patente copendiente, de copropiedad WO 97/37016, Malinin y otros 1996). Se encontró que NIK se une a TRAF2 y estimula la activación de NF-?B. NIK comparte similitud de secuencia con MAP3K cinasas y participa en cascada de señalamiento inductora de NF-?B común a receptores de la familia de TNF/NGF y al receptor de IL-1 tipo 1. TNF-a y IL-1 ß, inician una cascada de señalamiento conduciendo a la activación de dos l?B cinasas, IKK-1 [IKK-a] y IKK-2 [IKK-ß], que fosforilan l?B en residuos de serina N-terminales específicos [S32 y S36 para l?Ba S19 y S23 para l?Bß] (para revisión ver Mercuro F y Manning AM, 1999). Estas cinasas se identificaron como los componentes de un complejo de proteínas de peso molecular alto designado como 'signalsome' de IKK. IKB fosforilado se ubiquitina selectivamente por una ubiquitina ligasa E3, el miembro terminal de una cascada de enzimas que conjugan la ubiquitina. En el último paso de esta cascada de señalamiento, ka l?}B .-t l-aaJ-i,- __)*_*.. fosforilada y ubiquitinada, que aún se asocia con NF-?B en el citoplasma, se degrada selectivamente por la 'proteasome' 26S. Este proceso expone NLS, liberando así NF-?B para interactuar con la maquinaria de importación nuclear y traslocar al núcleo, en donde se une a sus genes blanco para iniciar la trascripción. La identificación de varios componentes adicionales de la 'signalsome' IKK ha dado una pista a los mecanismos potenciales mediante los cuales la activación del receptor pueden ligarse a la activación de IKK. Uno de estos es un modulador esencial de NF-?B designado NEMO. Se encontró que esta proteína de murinos es esencial para la activación de NF-KB en una variante celular plana de fibroblastos transformados de HTLV-1 Tax que no responde a todos los estímulos probados de NF-?B (Yamaoka y otros, 1998). Se mostró que NEMO homodimeriza e interactúa directamente con IKK2. La misma proteína se clonó independientemente por Kovalenko y otros (véase las solicitudes de patentes israelíes copendientes y de copropiedad Nos. 123758 y 126024) como una proteína de unión RIP y designada RAP-2. Después se clonó independientemente NEMO por otros dos grupos como un componente sin quinasa de la 'signalsome' IKK y designado IKKAP-1 (Mercurio F y otros 1999b, Rothwarf DM y otros, 1998). La misma proteína se clonó también como una proteína de interacción E3, que es una proteína adenoviral, codificada por la región de transcripción temprana y funciona para inhibir los efectos citolíticos de TNF y se mostró que interactúa con RIP cinasa (Li Y y otros, 1998). Estos estudios proveen evidencia de que NEMO media un paso esencial de la ruta de transducción de señal NF-?B. Tres proteínas asociadas con receptores parecen tomar parte en la iniciación de la cascada de fosforilación (véase ilustración diagramática en la figura 29. TRAF2, que cuando se expresa a altos niveles puede accionar por sí mismo la activación de NF-?B, se une a TNF-R p75 activado (Rothe y otros, 1994), el receptor de linfotoxina beta (Mosialos y otros, 1995), CD40 (Mosialos y otros, 1995), CD40 (Rothe y otros, 1995a) y CD-30 (datos no publicados) y media la inducción de NF-?B por ellos. TRAF2 no se une al receptor de TNF p55 ni para Fas/AP01 , sin embargo, puede unirse a la proteína asociada con el receptor p55 llamada TRADD y TRADD tiene la capacidad de unirse a una proteína asociada con Fas/AP01 llamada MORT1 (o FADD - véase Boldin y otros, 1995b y 1996). Otro dominio muerto que contiene proteína de interacción del corrector de serina/treonina cinasa, designado RIP (véase Stanger y otros, 1995) también es capaz de interactuar con TRAF2 así como con FAS/AP01 , TRADD, el receptor de TNF p55 y MORT-1 Por lo tanto, mientras que RIP se asoció inicialmente con la inducción de citotoxicidad de células (muerte de células), su capacidad de interactuar con TRAF2 también se implica en la activación de NF-?B Parece que las moléculas de TRAF están implicadas en la ruta que conduce a la activación de NF-?B. Estas asociaciones permiten aparentemente que el receptor de TNF p55 y Fas/AP01 accione la activación de NF-?B (Hsu y otros, 1995; Boldin y otros, 1995; Chinnaiyan y otros, 1995; Varfolomeev y otros, 1996; Hsu y otros, 1996). El accionamiento de la _t_*± activación de NF-?B por el receptor de IL-1 ocurre independientemente de TRAF2 y puede implicar un homologo de TRA2 - TRAF6 y una proteína-cinasa asociada con el receptor IL-1 recién clonada llamada IRAK (Croston y otros, 1995). También se ha mostrado que TRAF6 e IRAK juegan un papel importante en el señalamiento inducido por IL-18 y función (Kanarakaraj y otros 1999). Las cascadas de señalamiento que se inicial por el reclutamiento de receptores de moléculas de TRAF o proteínas adaptadoras que contienen dominio muerto se regulan por proteínas que pueden interferir con pasos específicos modificando la composición de los complejos de multiproteínas y/o bloqueando interacciones de proteína-proteína y funciones efectoras corriente abajo. Se han identificado varias moléculas citoplásmicas que se unen a TRAF. Entre ellos A20, c-IAPs (por sus siglas en inglés) (Inhibidotes celulares de apoptosis), TRIP (por sus siglas en inglés (proteína que interactúa con TRAF) y l-TRAF TANK ( por sus siglas en inglés) (proteína que interactúa con TRAF, activador de NF-?B asociado con miembros de la familia de TRAF). (Rothe y otros, 1994; Rothe y otros, 1995b; Cheng y Baltimore 1996; Lee y otros, 1997; Roy y otros 1997) y dos más, uno de los cuales se designa clon 9, que muestra alguna homología de secuencia a las proteínas de la presente invención y otro clon 15 designado (véase la solicitud de patente copendiente y de copropiedad WO 97/37016). Se ha mostrado que cada una de estas proteínas es capaz de unirse por lo menos, y algunas también interactúan con miembros de la familia de TRAF. Todavía _¿?A aún, se ha demostrado que los roles funcionales de estas interacciones son muy distintas. Estas proteínas puede ser un enlace importante en la capacidad de transducción de señal que depende de TRAF para modular la sobrevivencia de células. De hecho, aún no está claro cómo TRAF, acciona la fosforilación de l-?B. Tampoco hay información en cuanto a los mecanismos que dictan el patrón específico de células de activación de TRAF por diferentes receptores, tales como los observados por la inducción de NF-?B por los dos receptores de TNF. La estructura de cristal del dominio de TRAF de TRAF humano se ha resuelto recientemente (Park, Y.C. y otros 1999). La estructura revela una propia asociación trimérica del dominio de TRAF, que provee una explicación basada en avidez para la dependencia del reclutamiento de TRAF en la oligomerización de los receptores por sus ligandos extracelulares triméricos. Consecuentemente, con respecto a la activación de NF-?B y su importancia para mantener la viabilidad de células, las diferentes rutas intracelulares implicadas en esta activación por lo tanto no se ha elucidado claramente, por ejemplo, la forma en que las diferentes proteínas de TRAF, están implicadas directa o indirectamente. Además, ahora se sabe con referencia a varios miembros de la familia receptora de TNF/NGF y sus rutas de señalamiento intracelulares asociadas inclusive de varias proteínas de adaptadoras, mediadoras/moduladoras (véase revisiones breves y referencias en, por ejemplo, las solicitudes de patentes de Israel copendientes y de copropiedad _?'Á ?._t..?___..i___aa_. - . . - ~¿ü- . ¿______l—^— i-,.<«^"- "- ^?^s¡!&_____t¿__í__Íí___ Í& Nos. 114615, 114986, 115319, 116588), TNF y el ligando de FAS/AP01 , por ejemplo, pueden tener efectos benéficos y perjudiciales sobre las células. Por ejemplo, TNF contribuye a la defensa del organismo contra tumores y agentes infecciosos y contribuye a la recuperación del daño e induciendo la muerte de las células tumorales y células infectadas con virus, aumentando las actividades aptibacterianas de granulocitos, y por lo tanto en estos casos es conveniente la muerte de células inducidas por TNF. Sin embargo, TNF en exceso puede ser perjudicial y por lo tanto, se sabe que TNF juega un papel patogénico principal en un número de enfermedades tales como choque séptico, anorexia, enfermedades reumáticas, inflamación y reacciones de injerto contra huésped. En tales casos, la muerte de células inducida por TNF no es conveniente. El ligando de FAS/AP01 , por ejemplo, también tiene efectos deseables y perjudiciales. Este ligando de FAS-APO1 induce vía su receptor la muerte de células T autoreactivas durante la maduración de células T, es decir, la muerte de las células T que reconocen los propios antígenos, durante su desarrollo y evitando así las enfermedades autoinmunes. Además, varias células malignas y células infectadas por VIH portan el receptor de FAS/AP01 sobre su superficie y por lo tanto pueden destruirse por la activación de su receptor por su ligando o por anticuerpos específicos para los mismos y por lo tanto la activación de las rutas intracelulares (apoptosis) de muerte celular mediada por este receptor. Sin embargo, el receptor de FAS/AP01 puede mediar los efectos perjudiciales, por ejemplo, la muerte no controlada del tejido que se observa en ciertas •_J_,?_. _i -i- . ¿~ i enfermedades tales como hepatitis aguda que se acompaña por la destrucción de células del hígado. En vista de lo anterior, es decir, que los receptores de la familia de TNF/NGF puede inducir rutas de muerte de células por un lado y puede inducir las rutas de sobrevivencia de células (vía la inducción por NF-?B) por el otro lado, evidentemente existe un balance fino, intracelularmente entre estas dos rutas opuestas. Por ejemplo, cuando se desea lograr la destrucción máxima de células de cáncer de otras células infectadas o enfermas, podría ser conveniente tener TNF y/o ligando de FAS/AP01 que induce únicamente la ruta de muerte de células sin inducir NF-?B. Al contrario, cuando se desea proteger células tal como en, por ejemplo, inflamación, reacciones de injerto contra huésped, hepatitis aguda, podría se conveniente bloquear la inducción de muerte de células de TNF y/o ligando de FAS/AP01 y en su lugar, aumentar su inducción de NF-?B. Así mismo, en ciertas circunstancias patológicas podría ser conveniente bloquear las rutas de señalamiento ¡ntracelular mediado por el receptor de TNF p75 y el receptor IL-1 , mientras en otros podría ser conveniente aumentar estas rutas intracelulares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención proveer una proteína biológicamente activa, isoformas, análogos, fragmentos o derivados de los mismos capaces de unirse a las proteínas de factor asociado con el receptor del factor de necrosis tumoral (TRAF, por sus siglas en inglés). Dado que las proteínas de unión de TRAF están implicadas en la modulación o mediación de la activación del factor de transcripción NF-?B, que se inicia por algunos receptores de TNF/NGF, así como otros como se observó antes, la proteína de cuerdo con la presente invención uniéndose alas proteínas de TRAF por lo tanto, puede ser capaz de modular o mediar los procesos de señalamiento intracelulares iniciados por varios ligandos uniéndose a sus receptores. Dichos ligandos son, por ejemplo, TNF, ligando de CD40, ligando FAS y otros y modulación/mediación puede ser por ejemplo, la activación NF-?B, vía la interacción directa o indirectamente con la proteína de TRAF (v gr., inducción de activación de NF-?B por TRAF2 y TRAF6 e inhibición de activación de NF-KB, por TRAF3). La proteína biológicamente activa de la invención y sus isoformas, análogos, fragmentos o derivados así mismo pueden ser moduladores/mediadores indirectos de la actividad biológica intracelular de una variedad de otras proteínas que son capaces de interactuar con las proteínas de TRAF directa o indirectamente (v.gr., receptor de FAS/AP01 , receptor de TNF p55, receptor de TNF p75, receptor de IL-1 y sus proteínas asociadas, tales como, por ejemplo, MORT-1 , TRADD, RIP). Otro objeto de la invención es proveer antagonistas (v.gr., anticuerpos, péptidos, compuestos orgánicos, o aún algunas isoformas) a la proteína de unión de TRAF novedosa, anterior, isoformas, análogos, fragmentos y derivados de los mismos, que se pueden usar para inhibir el ÍA..?,?¡ Á .inliiliín. __%_______ _ .._ _.. proceso de señalamiento, o, más específicamente, para inhibir la activación de NF-?B y su implicación asociada en procedimientos de sobrevivencia celular, cuando se desea. Así mismo, cuando la proteína de unión de TRAF de la invención o la proteína de TRAF a la cual se unen (v.gr., TRAF3) son inhibidores por sí mismos para la activación de NF-?B (ya sea directamente, o mediante la modulación de tráfico o estabilidad de las proteínas a las cuales se unen), entonces es un objeto proveer antagonistas a la proteína de unión de TRAF para activar el proceso de señalamiento o más específicamente, para bloquear la inhibición de la activación de NF-?B y por lo tanto realizando la activación de NF-?B mejorada, cuando se desea. Un objeto adicional de la invención es utilizar la proteína de unión de TRAF novedosas anteriores, isoformas, análogos, fragmentos y derivados de los mismos, para aislar y caracterizar proteínas o factores adicionales, que se pueden implicar en la regulación de la actividad de proteína de TRAF y/o la actividad del receptor observado antes, v.gr., otras proteínas que pueden unirse a las proteínas de TRAF e influencian su actividad, y/o aislar e identificar otros receptores y otras proteínas celulares corriente arriba o corriente abajo en el (los) proceso(s) de señalamiento a las cuales se unen estas proteínas, análogos, fragmentos y derivados novedosos, y por lo tanto, en cuya función también están implicados. Un objeto más adicional de la invención es proveer inhibidores que pueden introducirse en células para unirse o interactuar con la proteína de unión de TRAF novedosa e isoformas posibles de la misma, cuyos i^?? ? ___.__. t¡l_______._. « ae___t__.__ . j.. .._ . , . „.,. . . ., . ... _i __t._.^___tt___. ^ A-^aAi . -^^ - *fe ÁÁ¿ inhibidores pueden actuar para inhibir la actividad asociada con la proteína de TRAF, en, por ejemplo, la activación de NF-?B y por lo tanto, cuando se desea, para inhibir la activación de NF- B; o que puede actuar para inhibir la actividad asociada con TRAF inhibidora (v.gr., TRAF3) en la activación de NF-?B y por lo tanto, cuando se desea, aumentar la activación de NF- B. Además, es un objeto de la presente invención utilizar la proteína de unión de TRAF mencionada antes, isoformas y análogos, fragmentos y derivados como antígenos para la preparación de anticuerpos policlonales y/o monoclonales a los mismos. Los anticuerpos, a su vez, se pueden usar, por ejemplo, para la purificación de las nuevas proteínas de diferentes fuentes, tales como extractos celulares o líneas celulares transformadas. Todavía más, estos anticuerpos pueden usarse para fines de diagnósticos, v.gr., para identificar trastornos relacionados con el funcionamiento anormal de efectos celulares mediados directamente por proteínas de TAF o mediados por el receptor de TNF p55, receptor de FAS/AP01 , u otros receptores relacionados y sus proteínas celulares asociadas (v.gr., MORT-1 , TRADD, RIP), que actúan directa o indirectamente para modular/mediar procesos intracelulares vá la interacción con proteínas TRAF. Un objeto adicional de la invención es proveer composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína IREN novedosa, isoformas, o análogos, fragmentos o derivados, así como composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpo observados antes u otros antagonistas. La presente invención proveen entonces una proteína IREN novedosa uniéndose a por lo menos TRAF2 y que tiene una especificidad alta 5 de unión para TRAF2. Por lo tanto, es un modulador o mediador de actividad intracelular de TRAF2. TRAF2 está implicada en la modulación o mediación de por lo menos una ruta de señalamiento intracelular siendo la ruta relacionada con sobrevivencia o viabilidad de las células en la cual TRAF2 está implicada directamente en la activación de NF-?B que juega un papel 10 central en la sobrevivencia de sellas. De hecho, esta proteína, designada IREN (por sus siglas en inglés (para Regulador de l?B) se une a TRAF2 y aparentemente actúa en la ruta de señalamiento de NF-?B corriente abajo para NIK pero corriente arriba para NEMO e IKK1 y aumenta la fosforilación de IKK1 de l?B. Además, 15 TRAF2 siendo capaz de la interacción directa o indirectamente con el receptor de TNF p55 observado, receptor de TNF p75, receptores de FAS/AP01 y sus proteínas asociadas MORT-1 , TRADD y RIP, también es un mediador o modulador de la inducción de NF-?B o la actividad de activación atribuida a estos receptores. TRAF2 es por lo tanto un modulador/mediador 20 de las rutas de sobrevivencia celular (opuesto a las rutas de muerte de células) mediadas por estos receptores y sus proteínas asociadas así como el grado de interacción entre estos receptores y/o proteínas con TRAF2 es un factor importante en el resultado de la actividad de estos receptores (una vez activado por sus ligandos), a saber, si las células sobrevivirán o morirán. Consecuentemente, las proteínas de la invención, juegan un papel clave en esta interacción entre TRAF2 y las otras proteínas/receptores con las cuales interactúa TRAF2, dado que las proteínas tales como IREN uniéndose específicamente a TRAF2 modularán su actividad y/o tendrán su actividad modulada por interacción con TRAF2. Como se utilizará en la presente, la actividad de proteína de TRAF, por ejemplo actividad de TRAF2, se entiende que incluye su actividad en la modulación/mediación en la ruta de sobrevivencia celular, tal como inducción/activación de NF-?B. Así mismo, como se usa en la presente en la proteína de unión de TRAF, en particular, la proteína de unión de TRAF2, se entiende que la actividad incluye modulación/mediación de TRAF, en particular, actividad de TRAF en virtud de la unión específica a TRAF, especialmente proteínas de TRAF2, esta modulación/mediación incluyendo modulación/mediación de rutas de sobrevivencia de células, en particular, aquellas que se refieren a la activación/inducción de NF-?B en las cuales están implicadas las proteínas de TRAF, especialmente TRAF2, directa o indirectamente. Por lo tanto, se puede considerar quieren es un modulador/mediador indirecto de todas las proteínas mencionadas antes y posiblemente un número de otras que están implicadas en la sobrevivencia de sellas, tales como la activación/inducción de NF-?B y a la cual se une TRAF2 (u otras proteínas de TRAF), o con la cual interactúa TRAF2 (u otras proteínas de TRAF) en una forma directa o indirecta. Así mismo, TRAF2 está i .A ? -alj .. . aam.,.. .. ^_j*_^ „.. __ __.__. ^_^__.__ __ _ .___. ^.i.'ri .iAMhA «ta.-A Bttt^^Jto.tAj- jfaÉilJab implicada en la regulación de factor de transcripción de AP1 a través de la activación de la cascada de cinasa Jun y por lo tanto IREN puede tener un papel en la ruta de activación de cinasa Jun o en el control de otras rutas de activación de genes, v.gr., la ruta de cinasa p38. Por lo tanto puede tener un papel importante en el control de inflamación y otros efectos no apoptósicos de TNF así como en el control de apoptosis. Más específicamente, la presente invención provee una secuencia de ADN que codifica una proteína capaz de unirse a TRAF seleccionado de: (a) una secuencia de ADNc de la IREN designada en la presente, que comprende la secuencia de nucleótidos descrita en la Figura 3; (b) una secuencia de ADNc de la isoforma designada en la presente, IREN-10B comprendiendo la secuencia de nucleótidos descrita en la figura 4; (c) una secuencia de ADNc de la isoforma designada en la presente IREN-E comprendiendo la secuencia de nucleótidos descrita en la figura 5; (d) un fragmento de una secuencia (a)-(c) que codifica una proteína biológicamente activa capaz de unirse a por lo menos los residuos 225-501 de la secuencia de aminoácidos de TRAF2; (e) una secuencia de ADN capaz de hibridizarse a una secuencia de (a)-(d) bajo condiciones moderadamente estrictas y que codifica ArA:-*,__ -Í_. ...._.. ..Í-_.*.. '.A.^^. una proteína biológicamente activa capaz de unirse a por lo menos los residuos 225-501 de la secuencia de aminoácidos de TRAF2; (e) Una secuencia de ADN capaz de hibridizarse a una secuencia de (a)-(d) bajo condiciones moderadamente estrictas y que codifica una proteína biológicamente activa capaz de unirse por lo menos a los residuos 225-501 de la secuencia de aminoácido de TRAF2; (f) Una secuencia de ADN, que se degenera como resultado del código genético a las secuencias de ADN, definidas en (a)-(e) y que codifica una proteína biológicamente activa capaz de unirse por lo menos a los residuos 225-501 de la secuencia de aminoácidos de TRAF2. Las modalidades de la secuencia de ADN anterior de la invención que codifica la proteína codificada por IREN incluyen: (i) Una secuencia de ADN que codifica la proteína IREN, sus ¡soformas biológicamente activas, fragmentos o análogos de las mismas, capaces de unirse a TRAF2 y capaces de modular la actividad de NF-?B e isoformas IREN, fragmentos o análogos de los mismos: (¡i) Una secuencia de ADN como en (i) anterior, seleccionada del grupo que consiste de: (a) Una secuencia de ADNc derivada de la región de codificación de una proteína IREN nativa; b) Secuencias de ADN capaces de hibpdización a una secuencia de (a) bajo condiciones moderadamente estrictas y que codifican una IREN biológicamente activa, y c) Secuencias de ADN. que se degeneran como resultado del código genético a las secuencias, definidas en (a) y (b) y que codifican una proteína IREN biológicamente activa; (¡ii) Una secuencia de ADN está en (i) o (¡i) anterior comprendiendo por lo menos parte de la secuencia descrita en la figura 3 y que codifica por lo menos una proteína IREN activa, isoforma, análogo o fragmento; (iv) Una secuencia de ADN como en (ii) anterior que codifica una proteína IREN, isoforma, análogo, o fragmento que tienen por lo menos parte de la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 3. En otro aspecto, la invención provee proteínas o polipéptidos codificados por el ADN observado antes, siempre y cuando sean capaces de unirse a TRAF2, preferiblemente a por lo menos la secuencia de los aminoácidos 225-501 de TRAF2 y las isoformas, análogos, fragmentos y derivados de dicha proteína y polipéptidos. Las modalidades de estas proteínas/polipéptidos, de acuerdo con la invención incluyen: (a) Una proteína, siendo la proteína de la presente designada IREN; (b) Isoformas, fragmentos, análogos y derivados de la misma; y (c) Una proteína IREN, isoformas, análogos, fragmentos y derivados de la misma que tienen por lo menos pare de la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 6. ?d' -?,^-¿._i-.l___¿ __-¡. í__.3i;¿!-r- __ ...... . ._ .___i.¿. _tí__—. '.-^*- En aún otro aspecto, la invención provee un vector que comprende cualquiera de las secuencias de ADN anteriores de acuerdo con la invención que son capaces de expresarse en células huésped seleccionadas de células procarióticas y eucarióticas; así como células procarióticas y eucarióticas transformadas que contienen dicho vector. La invención también provee un método para producir una proteína, isoforma análogo, fragmento o derivado codificado por cualquiera de las secuencias de ADN anteriores de acuerdo con la invención que comprenden desarrollar las células huésped transformadas mencionadas antes bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína, isoformas, análogos, fragmentos o derivados, efectuando modificación post-traslacional, según sea necesario, para obtener dicha proteína, isoforma, análogos, fragmentos o derivados y aislar dicha proteína expresada, ¡soformas, análogos, fragmentos o derivados. En un aspecto adicional, la invención provee anticuerpos o fragmentos activos o derivados de los mismos, específicos para las proteínas de unión de TRAF anteriores, análogos, ¡soformas, fragmentos o derivados de los mismos, o específicos para la proteína IREN, isoforma, análogo, fragmento o derivado de los mismos observados antes. En un aspecto diferente, la invención provee los siguientes métodos de tamizado: (i) Un método para tamizar un ligando capaz de unirse a una proteína de acuerdo con la invención, como se observó antes, incluyendo .*M.iá ?.?._, - _í___. t- jj¿,.. .. .. , i„„?.. .. . .. ... ... j_ _, .. , — _ , ._.^__mt.í__._.___._¿ -...í. ,j ...^ ^_í.^.. ^j_1__ t__ ______._£ _&j£í_t_i___á_A isoformas, análogos, fragmentos o derivados de los mismos, comprendiendo poner en contacto una matriz de cromatografía de afinidad a la cual dicha proteína, ¡soforma, análogo, fragmento o derivado del mismo se une con un extracto celular por lo que el ligando se une a dicha matriz, y eluyendo, aislando y analizando dicho ligando. (ii) Un método para tamizar una secuencia de ADN que codifica un ligando capaz de unirse a una proteína, isoforma, análogo, fragmento derivado de acuerdo con la invención como se observó antes, comprendiendo aplicar el procedimiento de dos híbridos de levadura en el cual una secuencia que codifica dicha proteína, isoforma, análogo, derivado o fragmento se porta por un vector híbrido y secuencias de un ADNc o de banco de ADN genómico se portan por el segundo vector híbrido, transformando las células huésped de levadura con dichos vectores, aislando las células transformadas positivamente y extrayendo el segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica dicho ligando. Similarmente, también se provee un método para aislar e identificar proteínas, isoformas, análogos, fragmentos de acuerdo con la invención observada antes, capaces de unirse directamente a TRAF2, comprendiendo aplicar el procedimiento de dos híbridos de levadura en el cual una secuencia que codifica TRAF2 se porta por un vector híbrido y secuencia de un ADNc o banco de ADN genómico se pota por el segundo vector híbrido, los vectores siendo usados para transformar células huésped de levadura y las células transformadas positivamente siendo aisladas, seguido por extracción de dicho segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica una proteína que se une a dicho TRAF2. En aún otro aspecto de la invención se provee un método para la modulación o mediación en células de la actividad de NF-?B o cualquier otra actividad de señalamiento intracelular modulada o mediada por TRAF2 por otras moléculas como una proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivados de las mismas de la invención como se observó antes, dicho método comprendiendo tratar dichas células introduciendo en dichas células una o más de dichas proteínas, isoforma, análogo, fragmento o derivado de las mismas en una forma adecuada para la introducción intracelular de las mismos, o introduciendo en dichas células una secuencia de ADN que codifica dicha una o más proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivados de los mismos en la forma de un vector adecuado que porta la secuencia, dicho vector siendo capaz de efectuar la inserción de dicha secuencia en las células en una matera tal que la secuencia se expresa en las células. Las modalidades de este método anterior para modulación/mediación en células de la actividad de NF-?B o cualquier otra actividad de señalamiento intracelular modulada o mediada por TRAF2 u otras moléculas incluye: (i) Un método como el anterior, en donde el tratamiento de células comprende introducir en las células una secuencia de ADN que codifica la proteína de IREN, isoforma, fragmento, análogo o derivado en la forma de un vector adecuado que porta dicha secuencia, el vector siendo capaz de efectuar la inserción de la secuencia en las células en una manera tal que dicha secuencia se expresa en dichas células. (ii) Un método como antes en donde dicho tratamiento de las células es mediante transfección de las células con un vector viral animal recombinante que comprende los pasos de: (a) construir un vector viral animal recombinante que porta una secuencia que codifica una proteína de superficie viral (ligando) que es capaz de unirse a un receptor de superficie celular específica sobre la superficie de dichas células que será tratado y una segunda secuencia que codifica dichas isoformas de proteína IREN, análogos, fragmentos y derivados de acuerdo con la invención, que cuando se expresan en dichas células es capaz de modular/mediar la actividad de NF-?B o cualquier actividad de señalamiento iptracelular modulada/mediada por TRAF2 u otras de dichas moléculas; y (b) infectar dichas células con dicho vector de (a). Así mismo, la presente invención también provee un método para modular el efecto modulado/mediado por TRAF2 en células que comprende tratar dichas células con los anticuerpos o fragmentos activos o derivados de los mismos, de acuerdo con la invención como se observó antes, dicho tratamiento siendo mediante la aplicación de una composición adecuada que contiene dichos anticuerpos, fragmentos activos o derivados de los mismos a dichas células, en donde cuando la proteína IREN o porciones de los mismos de las células se exponen en la superficie extracelular, dicha composición se formula para aplicación extracelular, y i ...» -i ot.. a *_i ...HÁ..*., .,,,., . M cuando la proteína IREN es ¡ntracelular, la composición se formula para aplicación intracelular. Otros métodos de la invención para modular el efecto modulado/mediado por TRAF2 incluye: (i) Un método que comprende tratar las células con una secuencia de oligonucleótidos que codifican una secuencia de contrasentido por lo menos para parte de la secuencia de ADN que codifica la proteína de IREN, esta secuencia de ADN siendo cualquiera de las mencionadas antes de la invención, dicha secuencia de oligonucleótidos siendo capaz de bloquear la expresión de la proteína IREN. (ii) Un método como en (i) anterior en donde dicha secuencia de oligonucleótidos se introduce en las células vía un virus recombínate como se observó antes, en donde la segunda secuencia del virus codifica la secuencia de oligonucleótidos. (iii) Un método que comprende aplicar el procedimiento de ribozima en el cual un vector que codifica una secuencia de ribozima capaz de interactuar con una secuencia de ARNm celular que codifica la proteína IREN, ¡soforma, análogo, fragmento o derivado de la invención observado antes, se introduce en dichas células en una forma que permite la expresión de la secuencia de ribozima en las células y en donde la secuencia de ribozima se expresa en las células ipteractúa con la secuencia de ARNm celular y separa la secuencia de ARNm que resulta de la inhibición de la expresión de la proteína IREN en dichas células.

"Vr— jrtT-fttfrtÉri En los métodos y modalidades anteriores de los mismos de la invención, se incluye también un método para la prevención o tratamiento de una condición patológica asociada con la inducción de NF-?B o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las cuales se une proteína, ¡soforma, análogo, fragmento o derivado, de acuerdo con la invención, dicho método comprendiendo administrar a un paciente que necesita de una cantidad efectiva de una proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado, de acuerdo con la invención, o una molécula de ADN que codifica las mismas, o una molécula capaz de alterar la interacción de la proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado, con TRAF2 o cualquier otra molécula a la cual se une dicha proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado. En este método de la invención, dicha proteína de la invención administrada al paciente que la necesita, puede ser específicamente la proteína codificada por IREN, o una molécula de ADN que codifica para los mismos. En la presente se piensa que la proteína codificada por IREN en la presente modula la inducción de NF-?B por IKK-1 y NIK. En un aspecto adicional de la invención se provee una composición farmacéutica para la modulación del efecto modulado/mediado por TRAF2 en células que comprenden, como ingrediente activo IREN, sus fragmentos biológicamente activos, análogos, derivados o mezclas de los mismos. Otras composiciones farmacéuticas o modalidades de las mismas de acuerdo con la invención incluyen: 9 (i) Una composición farmacéutica para modular el efecto modulado/mediado de TRAF2 en células que comprenden, como ingrediente activo, un vector viral animal recombinante que codifica una proteína capaz de unirse a un receptor de superficie celular e IREN, sus isoformas biológicamente activas, fragmentos o análogos activos, de acuerdo con la invención. (¡i) Una composición farmacéutica para modular el efecto modulado/mediado TRAF2 en células que comprende como ingrediente activo, una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia de contrasentido de la secuencia de ARNm IREN de acuerdo con la invención. Una modalidad adicional de la composición farmacéutica es específicamente una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de una condición patológica asociada con inducción de NF-?B o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las cuales se une una proteína, análogo, isoforma, fragmento o derivado, de acuerdo con la invención, dicha composición que comprende una cantidad efectiva de una proteína, análogo, isoforma, fragmento o derivado, de acuerdo con la invención o una molécula de ADN que codifica para lo mismo, o una molécula capaz de alterar la interacción de la proteína, análogo, ¡soforma, fragmento o derivado, con TRAF2 o cualquier otra molécula a la cual se une dicha proteína, análogo, isoforma, fragmento o derivado. En una modalidad específica adicional dicha composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de la proteína codificada por IREN, una isoforma, análogo, derivado o fragmento de IREN o una molécula de ADN que codifica la misma. En aún otra modalidad específica, la invención provee una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de una condición patológica asociada con inducción NF-?B o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2 o mediante otras moléculas a las cuales se une la proteína IREN, dicha composición comprendiendo una molécula capaz de interferir con la actividad de IREN En esta composición, la molécula de interferencia puede ser una cantidad efectiva de IREN mutada en residuos de sitios activos, esta IREN mutada sirve para interferir con IREN nativa. Una condición conocida asociada con inducción de NF-?B (anormal) es SIDA, otras son, v.gr., enfermedades autoinmunes, así como tumores. Aspectos y modalidades aún adicionales de la invención son: (i) Un método para identificar y producir un ligando capaz de modular la actividad celular modulada/mediada por una proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado, de acuerdo con la invención, comprendiendo: a) Tamizar un ligando capaz de unirse a un polipéptido comprendiendo por lo menos una porción de la secuencia de IREN descrita en la figura 6. b) identificar y caracterizar un ligando, diferente a TRAF2 o porciones de un receptor de la familia de receptores de TNF/NGF, encontrado por el paso de tamizado que es capaz de dicha unión; y _u____Jt___t____ c) producir el ligando en forma sustancialmente aislada y purificada. (ii) Un método para identificar y producir un ligando capaz de modular la actividad celular modulada/mediada por IREN comprendiendo: a) Tamizar un ligando capaz de unirse a un polipéptido comprendiendo por lo menos una porción de la secuencia de IREN descrita en la figura 6. b) Identificar y caracterizar dicha molécula; y c) Producir dicha molécula en forma sustanclalmente aislada y purificada. (iv) Un método para identificar y producir una molécula capaz de modular directa o indirectamente la actividad celular modulada/mediada por una proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado de la invención, comprendiendo: a) Tamizar una molécula capaz de modular actividades modulada/mediada por una proteína IREN, isoforma, análogo, fragmento o derivado de acuerdo con la invención; b) Identificar y caracterizar dicha molécula; y c) Producir la molécula en forma sustancialmente aislada o purificada Otros aspectos y modalidades de la presente invención también se proveen porque surgen de la siguiente descripción detallada de la invención. Í?_??.??_J_______M__Í??- ±?k t* - «á.A.f ?> L Se deberá observar que, cuando se usan los siguientes términos: "efecto de modulación/mediación de TRAF (o TRAF2) sobre las células" y cualquier otro como "modulación/mediación" mencionado en la especificación se entiende que abarca tratamiento in vitro así como in vivo y, además, también abarca la inhibición o incremento/aumento.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 : muestra una ilustración diagramática de la estructura de la molécula de TRAF2. La Figura 2: muestra un diagrama esquemático que ilustra algunas de las proteínas implicadas en la activación de NF-?B. La Figura 3A: muestra la secuencia de oligonucleótidos de UTR 5 prima de IREN (desde el inicio de la secuencia hasta ATG con la secuencia de Kozak) que es idéntica en las tres isoformas de separación de IREN (SEC ID NO:3). La Figura 3B: muestra la secuencia de nucleótidos de IREN (SEC ID NO:4). La Figura 4: muestra la secuencia de nucleótidos de IREN-10B (SEC ID NO:5). La Figura 5: muestra la secuencia de nucleótidos de IREN-E (SEC ID NO:6).

La Figura 6. muestra la secuencia de nucleótidos de IREN (SEC ID NO:7) La Figura 7- muestra la secuencia de nucleótidos de IREN 10B (SEC ID NO:8). La Figura 8: muestra la secuencia de nucleótidos de IREN-E (SEC ID NO:9). La Figura 9: muestra una comparación de la secuencia de IREN y sus isoformas IREN-10B e IREN-E. La Figura 10: muestra en una forma diagramática los resultados de inducción de activación de NF-?B por IKK-1 , por IREN tipo silvestre, NIK y NEMO y mutantes de los mismos. La Figura 11 : muestra un autorradiograma de FLAG-IKK1 , GST-IkappaB y NEMO, obtenida después de la transfección de 293 células con pcFLAG CHUK (que codifica IKK1 de murinos) y pc20.4 (que codifica la proteína NEMO), junto con pcHIS-IREN?N (pcHIS-IREN198-54i, línea izquierda), pcHIS-IREN ( línea de en medio), o el vector de pcADN3 vacío (línea derecha) como control. La inmunoprecipitación y análisis de cinasas se llevaron a cabo como se describió en el Ejemplo 3. Los tamaños de las bandas visibles corresponden a los pesos moleculares determinados por FLAG-IKK1 , GST-lkappaB y NEMO. La Figura 12: muestra un autoradiograma (izquierda) e inmunotinción (derecha) del análisis SDS-PAGE de IREN 10B e IREN que se inmunoprecipitador a partir de células transfectadas y luego se sometieron a .-. ^._r___& ?bí± Lt . una prueba de cinasa in vitro. La figura demuestra que IREN 10B se asocia en células con una proteína cinasa que pueden fosforilar esta variante de división de IREN. La Figura 13: presenta los resultados de análisis de banco de datos de genes que sugieren que los genes se relacionan estrechamente con IREN existen en varios de los cromosomas humanos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una secuencia de ADNc en la designada en la presente IREN, (descrita en la Figura 3), que codifica una proteína capaz de unirse a TRAF2, y las proteínas codificadas por estas secuencias de ADN. La invención también se refiere a secuencias de ADNc de isoformas de IREN, IREN-10B e IREN-E (descritas en las figuras 4 y 5, respectivamente). El ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas mencionadas antes no parecen en los bancos de datos de 'BANCO DE GENES' o 'BANCO DE PROTEINA' de ADN o secuencias de aminoácidos, representan así las secuencias desconocidas de las mismas. Dentro del alcance de la presente invención también hay fragmentos de las secuencias de ADN mencionado y secuencias de ADN capaces de hibpdizarse a aquellas secuencias o parte de ellas, bajo condiciones moderadamente estrictas, siempre que codifiquen una proteína biológicamente activa o polipéptido capaz de unirse a por lo menos la secuencia de aminoácidos de 225-501 de TRAF2. La presente invención también se refiere a una secuencia de ADN que se degenera como resultado del código genético a las secuencias de ADN mencionadas antes y que codifican una proteína o polipéptido biológicamente activo capaz de unirse a por lo menos la secuencia de aminoácidos 225-501 de TRAF2. Con respecto a TRAF2, se deberá observar que varios miembros de la familia del receptor de TNF/NGF activan el factor de transcripción NF-?B mediante asociación directa o indirecta con TRAF2, que por lo tanto es una proteína de adaptación para estos receptores y por lo tanto también se puede considerar como un modulador/mediador de la inducción de la actividad de activación de NF-?B de estos receptores de TNF/NGF (véase el esquema en la figura 2). Otro receptor, el receptor IL-1 activa NF-?B independientemente de TRAF2. Los análogos o muteínas de IREN producidos de acuerdo con la presente invención(véase Ejemplos) modulan de alguna manera la activación de NF-?B, cuando estos análogos/muteínas se expresan en células. Por lo tanto, la presente invención se refiere a la proteína IREN, así como a las isoformas, análogos, fragmentos y derivados biológicamente activos de los mismos y las isoformas, análogos, fragmentos y derivados de las proteínas codificadas por los mismos. La preparación de dichos análogos, fragmentos y derivados es mediante procedimientos normales (véase por _í_.__-±ií?.m -».. st_.?_-__^i_d ejemplo, Sambrook y otros, 1989) en los cuales en las secuencias de codificación de ADN, uno o más codones pueden suprimirse, agregarse o substituirse por otros, para dar análogos codificados que tienen por lo menos un cambio de residuos de aminoácidos con respecto a la proteína nativa. Los análogos aceptables son aquellos que retienen por lo menos la capacidad de unirse a TRAF2 con o sin mediar cualquier otra unión o actividad enzimática, v.gr., análogos que se unen a TRAF2 pero no lo señalan, es decir, no se unen a una proteína corriente abajo u otro factor, o no catalizan una reacción que depende de las señales. En tal forma, pueden producirse análogos que tienen un efecto dominante-negativo así llamado, a saber, un análogo, el cual es defectuoso tanto en la unión a TRAF2 o en el señalamiento subsecuente después de dicha unión, como se observó antes. Dichos análogos pueden usarse, por ejemplo, para inhibir CD40, TNF p55 y TNF p75 (FAS/AP01 y otros efectos del receptor relacionado, así como efectuado mediante varias proteínas asociadas con el receptor (adaptadores) como se observó antes, compitiendo con las proteínas IREN naturales. Así mismo, pueden producirse los análogos positivos-dominantes así llamados, lo cual podría servir para mejorar el efecto de TRAF2. Estos podrían tener las mismas o mejores propiedades de unión de TRAF2. En una forma análoga, los fragmentos biológicamente activos de los clones de la invención pueden prepararse como se observó antes con respecto a la preparación de los análogos. Los fragmentos adecuados de las secuencias de ADN de la invención son aquellos que codifican una proteína o polipéptido que retienen la capacidad Í?~Á____-JÍt¿.?..i_Í_;_Á... - .í.-¿..¿,. de unión de TRAF2 o que puede mediar cualquier otra unión o actividad enzimática como se observó antes. Consecuentemente, pueden prepararse los fragmentos de las proteínas codificadas de la invención, los cuales tienen un efecto negativo dominante o positivo dominante como se observó antes con respecto a los análogos. Similarmente, los derivados pueden prepararse mediante modificaciones normales de los grupos laterales de uno o más residuos de aminoácidos de las proteínas, sus análogos o fragmentos o por conjugación de las proteínas, sus análogos o fragmentos, a otras moléculas, v.gr., un anticuerpo, enzima, receptor, etc. , dado que son bien conocidos en la materia. De las secuencias de ADN anteriores de la invención que codifican la proteína IREN que se une a TRAF2, ¡soformas, análogos, fragmentos o derivados biológicamente activos, también se incluyen como una modalidad de la invención, las secuencias de ADN capaces de hibridizarse con una secuencia de ADNc derivada de la región de codificación de una proteína de unión a TRAF nativa en la cual dicha hibridización se realiza bajo condiciones moderadamente restringida y que las secuencias de ADN hibridizables codifican una proteína de unión a TRAF biológicamente activa. Por lo tanto, estas secuencias de ADN hibridizables incluyen secuencias de ADN que tienen una homología relativamente alta a la secuencia de ADNc de IREN nativa y como tal representa secuencias similares a la proteína de unión de TRAF que pueden ser, por ejemplo, secuencias derivadas naturalmente que codifican las diferentes isoformas de ,tej-am,MlM ..... ......^M,,.,.. *_ _ .__*_. ._. _. rtüfc.,.^JÜMtriiM«J-.^mai^ IREN, o secuencias presentes en la naturaleza que codifican proteínas que pertenecen a un grupo de las secuencias similares a proteínas de unión a TRAF que codifican IREN. Además, estas secuencias también pueden, por ejemplo, incluir secuencias producidas sintéticamente, no presentes en la naturaleza, que son similares a la secuencia de ADNc IREN nativa peor que incorpora un número de modificaciones deseadas. Dichas secuencias sintéticas incluyen por lo tanto todas las secuencias posibles que codifican análogos, fragmentos y derivados de IREN, todos los cuales tienen la actividad de proteínas de unión de TRAF. Como se usa en la presente, las condiciones estrictas son una función de la temperatura usada en el experimento de hibridización, la molaridad de los cationes monovalentes y el porcentaje de formamida en la solución de hibridización. Para determinar el grado de restricción implicado con cualquier conjunto de condiciones dadas, primero se usa la ecuación de Meinkoth yo otros, (1984) para determinar la estabilidad de híbridos de identidad al 100% expresado como temperatura de fusión TM del híbrido ADN-ADN: Tm= 81.5° C + 16.6 (LogM) + 0.41 (%GC) + 0.61 (% forma) + 500/L en donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de G y C en el ADN, % forma es el porcentaje de formamida en la solución de hibridización, y L es la longitud del híbrido en pares de base. Para cada 1 °C que se reduce la Tm de la calculada para un híbrido con identidad del 100%, la cantidad de desigualdad permitida se illlrfÉáifl'liÉ-l'-**"''- a*» -3- -~ »^... t.->.^-..- ., ,. ^.^^^^.a^^^^.^¿?fe,^.^,>.a¿^.Mfe^. , incrementó por aproximadamente 1 %. Por lo tanto, si la Tm usada para cualquier experimento de hibridización dado en la sal especificada y concentraciones de formamida es 10°C debajo de la Tm calculada para un híbrido al 100% de acuerdo con la ecuación de Meinkoth, la hibridización ocurrirá aún si hay una desigualdad de hasta el 10%. Por lo tanto, las "condiciones altamente restrictivas" son aquellas que proveen una Tm que no es mayor a 10°C por debajo de la TM que podría existir un dúplex perfecto con la secuencia blanco, ya sea calculado por la fórmula anterior o como se mide realmente. Las "condiciones moderadamente restrictivas" son aquellas que proveen una Tm que no es mayor a 20°C debajo de la Tm que podría existir para un dúplex perfecto con la secuencia blanco, ya sea calculada por la fórmula anterior o como se midió actualmente. Sin limitación, ejemplos de condiciones altamente restrictivas (5-10°C debajo de la Tm calculada o medida del híbrido) y moderadamente restrictivas (15-20°C debajo de la Tm calculada o medida del híbrido) usan una solución de lavado de 2xSSC (citrato de solución salina normal) y 0.5% SDS (dodeciisulfato de sodio) a la temperatura apropiada debajo de la Tm calculada del híbrido. La restricción final de las condiciones se deber principalmente a las condiciones de lavado, particularmente si las condiciones de hibridización usadas son aquellas que permiten que se formen híbridos menos estables con híbridos estables. Las condiciones de lavado a restricción superior remueven entonces los híbridos menos estables. Una condición de hibpdización común que se puede usar con las condiciones de lavado altamente y moderadamente restrictivas descritas antes es la hibpdización en una solución de 6 x SSC (o 6X SSPE (solución salina normal- fosfato-EDTA)), reactivo de Denhardt 5x, 0.5% SDS, 100 µg/ml (desnaturalizado, ADN de esperma de salmón fragmentado a una temperatura de aproximadamente 20 a 25°C debajo de la Tm. Si se utilizan sondas mezcladas, se prefiere usar cloruro de tetrametilamonio (TMAC, por sus siglas en inglés) en lugar de SSC (Ausubel, 1987, 1999). Para obtener las secuencias similares a IREN presentes en la naturaleza, los procedimientos normales de tamizado y aislamiento de muestras de ADN o ARN derivados naturalmente de varios tejidos pueden emplearse usando ADNc de IREN natural o porción de los mismos como sonda (ver por ejemplo procedimientos normales exhibidos en Sambrook y otros, 1989). Asimismo, para preparar las secuencias similares a proteínas de unión de TRAF sintéticas que codifican análogos, fragmentos o derivados de IREN, un número de procedimientos normales pueden usarse como se detalla en la presente más adelante con referencia a la preparación de dichos análogos, fragmentos y derivados. Un polipéptido o proteína "que corresponde sustancialmente" a IREN incluye no solamente el propio IREN sino también polipéptidos o proteínas que son análogos de IREN. Los análogos que corresponden sustancialmente a IREN son aquellos polipéptidos en los cuales una o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de IREN se han reemplazado con otro aminoácidos, suprimido y/o insertados, siempre y cuando la proteína resultante exhibe sustanclalmente la misma actividad biológica o superior, como IREN. Con el fin de corresponder sustancialmente a IREN, los cambios en la secuencia de las proteínas, tales como isoformas, generalmente son relativamente menores. Aunque el número de cambios puede ser mayor a diez, preferiblemente no hay más que diez cambios, más preferiblemente no más de cinco, y aún más preferiblemente no más de tres cambios. Mientras que se puede utilizar cualquier técnica para encontrar proteínas potencial y biológicamente activas, que corresponden sustancialmente a IREN, una de dichas técnicas es el uso de técnica de mutagénesis convencionales en el ADN que codifica la proteína, dando como resultado unas cuantas modificaciones. Las proteínas expresadas por dichos clones pueden tamizarse entonces para su capacidad de unirse a las proteínas de TRAF (v.gr., TRAF2) y para modular la actividad de proteína de TRAF (v.gr., TRAF2) en la modulación/mediación de las rutas intracelulares observadas antes. Los cambios "conservadores" son aquellos cambios que no podría esperarse que cambien la actividad de la proteína y son usualmente los primeros para ser tamizados dado que no podría esperarse que cambie sustanclalmente el tamaño, carga o configuración de la proteína y por lo tanto no podría esperarse cambiar las propiedades biológicas de los mismos. .?__i «*•-*- -aatem. . ...________&_ ___*&.&&. .?á Las sustituciones conservadoras de IREN incluyen un análogo en donde por lo menos un resido de aminoácidos en el polipéptido se han reemplazado conservativamente por un aminoácido diferente Dichas sustituciones preferiblemente se hacen de acuerdo con la siguiente lista como se presenta en el Cuadro 1A, cuyas sustituciones peden determinarse por experimentación de rutina para proveer propiedades estructurales y funcionales modificadas de una molécula de polipéptidos sintetizada mientras que mantiene la característica de actividad biológica de IREN CUADRO IA Residuo Sustitución Original Ilustrativa Ala Gly; Ser Arg Lys Asn Gln; His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Ala; Por His Asn; Gln lie Leu; Val Leu Me; Val Lys Arg; Gln; Glu Met Leu; Tyr; He Phe Met; Leu; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp; Phe Val He; Leu Alternativamente, otro grupo de sustituciones de IREN son aquellos en los cuales por lo menos un residuo de aminoácidos en el polipéptido se ha removido y un residuo diferente se ha insertado en su lugar de acuerdo con el siguiente Cuadro IB. Los tipos de sustituciones que pueden hacerse en el polipéptido pueden asarse en el análisis de las frecuencias de cambios de aminoácidos entre una proteína homologa de diferente especie, tales como aquellas presentadas en el Cuadro 1 -2 de Schulz y otros, G R., Principies of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1798, y figuras 3-9 de Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. fci.K '____iAu.iL_i.isA ti t f -j itttlir Freeman & Co., San Francisco, CA 1983. Con base en dichos análisis, las sustituciones conservadoras alternativas se definen en la presente como intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos: CUADRO IB 1. Residuos alifáticos, no polares o ligeramente polares pequeños: Ala, Ser, Thr (Por, Gly); 2. Residuos polares cargados negativamente y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln; 3. Residuos polares cargados positivamente: His, Arg, Lys; 4. Residuos alifáticos no polares grandes: Met, Leu, He, Val (Cys); y 5. Residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp. Los tres residuos de aminoácidos en paréntesis anteriores tienen papeles especiales en la arquitectura de la proteína. Gly es el único residuo que carece de cualquier cadena lateral y por lo tanto imparte flexibilidad a la cadena. Sin embargo, tiende a promover la formación de estructuras secundarias diferentes a la a-helicoidal. Pro, debido a su geometría inusual, restringe estrechamente la cadena y generalmente tiende a promover estructuras similares a vueltas de ß, aunque en algunos casos Cys puede ser capaz de participar en formación de unión de disulfuro, que es importante en el doblez de proteínas. Obsérvese que Schulz y otros, supra, podría fusionar los Grupos 1 y 2 anteriores. Obsérvese también que Tyr, debido a su potencial de unión a hidrógeno, tiene afinidad importante con Ser, y Thr, etc. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos de acuerdo con la presente invención, v.gr., como se presentó antes, se conocen en la materia y podría esperarse que mantengan propiedades biológicas y estructurales del polipéptido después de la sustitución de los aminoácidos. La mayoría de las supresiones y sustituciones de acuerdo con la presente invención son aquellas que no producen cambios radiales en las características de la proteína o molécula de polipéptidos. "Características" se define en una forma no inclusive para definir tanto cambios en la estructura secundaria, v.gr., a-hélice o ß-lámina, así como cambios en la actividad biológica, v.gr., la unión a proteínas TRAF y/o mediación del efecto de las proteínas TRAF en la muerte celular. Ejemplos de producción de sustituciones de aminoácidos en proteínas que pueden usarse para obtener análogos de IREN para usarse en la presente invención incluyen cualesquiera métodos conocidos, tales como los presentados en la patente de E.U.A. RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585 y 4,737,462, de Mark y otros; 5,116,943 de Koths y otros, 4,965,195, de Ñamen y otros; 4,879,111 a Chong y otros; y 5,017,691 de Lee y otros; y proteínas sustituidas con lisina presentadas en la patente de E.U.A. No. 4,904,584 (Shaw y otros). Además de las sustituciones conservadoras tratadas antes, las cuales podrían no cambiar significativamente la actividad de IREN, ya sea sustituciones conservadoras o menos conservadoras y cambios más aleatorios, que conducen a un incremento en la actividad biológica de los análogos de IREN, se pretende que estén dentro del alcance de la invención. Cuando se tiene que confirmar el efecto exacto de la sustitución o supresión, alguien experto en la materia apreciará que el efecto de la(s) sustitución(es), supresión(es), etc., se evaluarán por análisis de rutina de unión y muerte celular. El tamizado usando dicha prueba normal no implica experimentación indebida. A nivel genético, los análogos se preparan generalmente por mutagénesis dirigida a sitio de nucleótidos en el ADN que codifica la IREN, produciendo así ADN que codifica el análogo, y sintetizando después el ADN y expresando el polipéptido en el cultivo celular recombinante. Los análogos normalmente exhiben la misma actividad biológica cualitativa incrementada dado como la proteína presente en la naturaleza, Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. La preparación de la muteína IREN de acuerdo con la presente, o una secuencia de nucleótidos alternativa que codifica el mismo polipéptido pero que difiere de la secuencia natural debido a los cambios permitidos por la degeneración conocida del código genético, puede lograrse por mutagénesis específica de sitios de ADN que codifica un análogo preparado antes o una versión nativa de un IREN. La mutagénesis específica de sitio permite la producción de análogos mediante el uso de secuencias de oligonucleótidos específicos que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proveer una secuencia de iniciador de tamaño suficiente y complejidad de secuencia para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de supresión que se está atravesando, Normalmente, se prefiere un iniciador de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos de longitud, con aproximadamente 5 a 10 nucleótidos complementarios en cada lado de la secuencia que se está alterando. En general, la técnica de mutagénesis específica de. sitio de la secuencia que está siendo alterada. En general, la técnica de mutagénesis específica de sitio es bien conocida en la materia, como se ejemplifica por las publicaciones tales como Adelman y otros, ADN 2: 183 (1983), la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia. Como podrá apreciarse, la técnica de mutagénesis específica de sitio normalmente emplea un vector de fagos que existe en forma de un solo hilo y de doble hilo. Los vectores normales útiles en mutagénesis dirigida a sitio incluyen vectores tales como el fago M13, por ejemplo, como se describió por Messing y otros, Tirad Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor A. Walton, Elsevier, Ámsterdam (1981 ), la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia. Estos fagos están fácilmente disponibles comercialmente y su uso generalmente es bien conocido por aquellos expertos en la materia.

Alternativamente, los vectores de plásmidos que contienen un origen de fago de un solo hilo de replicación (Veira y otros, Meth Enzymol. 153:3, 1987) pueden emplearse para obtener ADN de un solo hilo. En general, la mutagénesis dirigida a sitio de acuerdo con la presente, se lleva a cabo obteniendo primero un vector de un solo hilo que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica el polipéptido relevante. Un iniciador de oligonucleótidos que porta la secuencia mutada deseada, se preparó singénicamente por síntesis automática de ADN/oligonucleótico. Este iniciador se recoce luego con el vector que contiene la secuencia de proteína de un solo hilo, y se somete a enzimas de polimerización de ADN tal como fragmento de Klenow de polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis del hilo que contiene la mutación. Por lo tanto, una secuencia mutada y el segundo hilo tiene la mutación deseada. Este vector heteroduplex se usa entonces para transformar células apropiadas, tales como células JM101 de E. coli, y se seleccionan los clones que incluyen los vectores recombinantes que contiene la disposición de secuencias mutada. Después de que se selecciona dicho clon, la secuencia de IREN mutada puede removerse y colocarse en un vector apropiado, generalmente un vector de transferencia o expresión del tipo que puede emplearse por transfección de un huésped apropiado. Consecuentemente, un gen o ácido nucleico que codifica una proteína de IREN también puede detectarse, obtenerse y/o modificarse, in ,. As _L^ .l.J<t>?... - — . .. .. ___^._... . __- ^ Sa-l?^-W.aL.rf¿'i. -a-afa^.^aai-^hía .--¿lAll vitro, in situ y/o in vivo, mediante el uso de técnicas de amplificación de ADN o ARN conocidas, tales como RCP y síntesis química de oligonucleótidos. La RCP permite la amplificación (incrementa en número) de secuencias de ADN específicas por reacciones de polimerasa de ADN repetidas. Esta reacción puede usarse como un reemplazo para clonación; todo lo que se requiere es el conocimiento de la secuencia de ácidos nucleicos. Con el fin de llevar a cabo la RCP, se diseñan los iniciadores que son complementarios para la secuencia de interés. Los iniciadores se generan luego por síntesis automática de ADN. Debido a que los iniciadores puede diseñarse para hibridizarse a cualquier parte del gen, se pueden crear condiciones de tal manera que pueden tolerarse desigualdades en la paridad de bases complementarias. La amplificación de estas regiones desiguales puede conducir a la síntesis de un producto mutagenizado dando como resultado la generación de un péptido con nuevas propiedades (es decir, mutagénesis dirigida a sitio). Ver también, v.gr., Ausubel, supra, C. 16. También, acoplando síntesis de ADN complementario (ADNc), utilizando transcriptasa inversa con RCP, se puede usar ARN como el material de partida para la síntesis del dominio extracelular de un receptor de prolactina sin clonación. Además, los iniciadores de RCP pueden designarse para incorporar nuevos sitios de restricción u otras características tales como los codones de terminación en los extremos el segmento de genes que serán amplificados. Esta colocación de sitios de restricción en los extremos 5' y 3' de la secuencia de genes amplificadas permite que los segmentos de genes Ü¿A¿i.Í.A«tf .iA¿?. que codifican una proteína IREN o un fragmento de los mismos sean designados comúnmente para ligar otras secuencias y/o sitios de clonación en vectores. RCP y otros métodos de amplificación de ARN y/o ADN son bien conocido en la técnica y se pueden usar de acuerdo con la presente invención sin la experimentación indebida, con base en la enseñanza y guía presentada en la presente. Los métodos conocidos de amplificación de ADN o ARN incluyen, pero no están limitados a reacción en cadena de polimerasa (RCP) y proceso de amplificación relacionados (véase, v.gr., patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965, 188, de Mullís y otros; 4,795,699 y 4,921 ,794 de Tabor y otros; 5,142,033 de Innis; 5,122,464 de Wilson y otros; 5,091 ,310 de Innis; 5,066,584 de Gyllensten y otros; 4,889,818 de Gelfand y otros; 4,994,370 de Silver y otros; 4,766,067 de Biswas; 4,656,134 de Ringold; e Innis y otros, eds., PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) y amplificación mediada por aRN que utiliza ARN de contrasentido a la secuencia blanco como un patrón para la síntesis de ADN de doble hilo (patente de E.U.A. No. 5,130,238 de Malek y otros, con el nombre comercial NASBA); y inmuno-RCP que combina el uso de amplificación de ADN con la marcación de anticuerpos (Ruzicka y otros, Science 260:487 (1993); Sano y otros, Science 258:120 (1992); Sano y otros, Biotechniques 9:1378 (1991 )), el contenido de dichas patentes y referencia se incorporan completamente aquí por referencia. í¡¿tA?,_ilí¿A_____.A:__-. - e"-¿"- - En una forma análoga, los fragmentos biológicamente activos de IREN o sus ¡soformas pueden prepararse como se observó antes con respecto a los análogos de proteínas de unión de TRAF Los fragmentos adecuados de las proteínas de unión de TRAF son aquellas que retienen la capacidad de la proteína de unión de TRAF y que pueden mediar la actividad biológica de proteínas de TRAF u otras proteínas asociadas con proteínas de TRAF directa o indirectamente. Consecuentemente, pueden prepararse los fragmentos de IREN que tienen un efecto negativo dominante o positivo dominante como se observó antes con respecto a los análogos. Se deberá observar que estos fragmentos representan una clase especial de los análogos de la invención, a saber, son porciones definidas de IREN derivadas de la secuencia completa de IREN o sus isoformas, cada porción o fragmento teniendo cualquiera de las actividades deseadas observadas antes. Dicho fragmento puede ser, v.gr., un péptido Similarmente, los derivados pueden prepararse por modificaciones normales de los grupos laterales de uno o más residuos de aminoácidos de IREN, sus análogos o fragmentos, o por conjugación de IREN, sus análogos o fragmentos, a otra molécula, v.gr., un anticuerpo, enzima, receptor, etc., como se sabe bien en la materia. Consecuentemente, "derivados" como se usa en la presente cubre derivados que pueden prepararse a partir de grupos funcionales que se presentan como cadenas laterales en los residuos de los grupos N o C terminales, por medios conocidos en la materia y se incluyen en la invención. Los derivados pueden tener porciones químicas tales como residuos de carbohidratos o fosfatos, siempre y cuando dicha reacción tenga la misma actividad biológica o superior que las proteínas IREN. Por ejemplo, los derivados pueden incluir esteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de grupos carboxilos por reacción con amoníaco o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo o grupos amino libres de los residuos de aminoácidos formados con porciones acilo (v.gr., grupos alcanoilo o aroilo carboxíclico) o derivados de O-ac?lo del grupo hidroxilo libre (por ejemplo el de residuos de serilo o treonilo) formados con porciones acilo. El término "derivados" se pretende que incluya únicamente los derivados que no cambian un aminoácido a otro de los veinte aminoácidos comúnmente presentes en la naturaleza. Una proteína IREN es una proteína o polipéptido, es decir, una secuencia de residuos de aminoácidos. Un polipéptido que consiste de una secuencia más grande que incluye toda la secuencia de una proteína IREN, de acuerdo con las definiciones presentes, se pretende que se incluyan dentro del alcance de dicho polipéptido mientras las adiciones no afecten las características básicas y novedosas de la invención, es decir, si retienen o incrementan la actividad biológica de IREN o pueden separarse para salir de una proteína o polipéptido que tiene la actividad biológica de IREN. Por lo tanto, por ejemplo, la presente invención se pretende que incluye proteínas de fusión de IREN con otros aminoácidos o péptidos.

Como se mencionó antes, deberá entenderse que las IREN, isoformas, fragmentos, derivados, muteínas, etc, anteriores de la invención, son cualesquiera proteínas que pueden unirse y/o median/modulan la actividad de cualquier proteína de TRAF intracelularmente. En particular, los ejemplos de las proteínas que pueden modular o mediar la actividad de señalamiento intracelular asociada con TRAF2, como se mencionó antes, especialmente en cuanto se refiere a la implicación de TRAF2 para modular la actividad de NF-?B, en particular, siguiendo la interacción entre TRAF2 y varios miembros de la familia del receptor de TNF/NGF y/o sus proteínas de adaptación asociadas como se detalla antes y en seguida. IREN de acuerdo con la invención y sus diferentes ¡soformas, análogos, fragmentos, etc. (ver Ejemplos) que parecen unirse a TRAF2 muy específicamente y para tener una acción para modular actividad de NF-?B, con análogos/muteínas negativas dominantes de IREN que modulan esta actividad para hacerlo. Todas las modificaciones mencionadas antes están en el alcance de la invención siempre y cuando conserven la capacidad de las proteínas o polipéptidos codificados o sus análogos o derivados de los mismos, para unirse por lo menos a la secuencia de los aminoácidos 225-501 de TRAF2. Todas las proteínas y polipéptidos de la invención en virtud de su capacidad de unirse a TRAF2, se consideran como mediadores o moduladores de señalamiento de TRAF2. Como tal, dichas moléculas de la invención tienen un papel en, por ejemplo, el proceso de señalamiento en el -J.*^ A.A ..*^* A.JbBfc^| i|ípn(|ttyte^.,> ,. »..... a^.. cual la unión del ligando de TRAF2 a CD30, CD40, receptor de linfotoxina beta (LT-ß), receptores de TNF p55 o p75, así como los otros receptores y proteínas adaptadoras observadas antes, conduce a la activación del factor de transcripción NF-?B. Particularmente es interesante la proteína Ir-EN y sus isoformas de la invención. Lo nuevos clones, proteínas, sus análogos, fragmentos y derivados tienen un número de uso posibles, por ejemplo: (i) Pueden usarse para modular la actividad de NF-?B, la función de TRAF2 y los receptores a los cuales se unen, en situaciones en donde se desea una modulación de función tal como en las aplicaciones antitumorales o inmunoestimuladoras en donde se desean los efectos inducidos por TRAF2. En este caso, las proteínas de la invención, sus análogos, fragmentos o derivados, que modulan TRAF2 o efectos receptores, pueden introducirse a las células mediante procedimientos normales conocidos por sí mismo. Por ejemplo, dado que las proteínas codificadas por los clones de ADN de la invención son intracelulares y deberán introducirse únicamente en las células en donde se desea el efecto de TRAF2, es necesario un sistema para la introducción específica de estas proteínas en las células. Una forma de hacer esto es creando un virus animal recombinante, v.gr., uno derivado de Vaccinia, al ADN del cual se introducirán los dos siguientes genes: el gen que codifica un ligando que se unen a proteínas de superficie celular expresadas específicamente por las células, v.gr, tales como la proteína de gp120 del virus del SIDA (VIH) que se unen específicamente a algunas células (linfocitos de CD4 y leucemias relacionadas) o cualquier otro ligando que se une específicamente a células que portan un receptor que une TRAF2, de manera que el vector del virus recombinante será capaz de unir dichas sellas; y el gen que codifica las proteínas de la invención. Por lo tanto, expresión de la proteína de unión a la superficie celular en la superficie del virus dirigirá al virus específicamente a la célula tumoral u otra célula portadora del receptor, después de lo cual las proteínas que codifican secuencias se introducirán en las células vía el virus, y una vez expresado en las células dará como resultado la mejora del receptor o efecto de TRAF2 que conduce a un efecto inmunoestimulador deseado en estas células. La construcción de dicho virus animal recombinante es mediante procedimientos normales (ver por ejemplo, Sambrook y otros, 1989). Otra posibilidad es introducir las secuencias de las proteínas codificadas den la forma de oligopucleótidos, que pueden absorberse por las células y se expresa en la presente. (ii) Pueden usarse para modular la actividad de NF-?B, los efectos de TRAF2 o del receptor que se une a él, v.gr., en casos en los que el daño en el tejido es SIDA, choque séptico o rechazo de injerto contra huésped, en la cual se desea que bloquear el señalamiento intracelular inducido. En esta situación es posible, por ejemplo, introducirse en las células, mediante procedimientos normales, los oligonucleótidos teniendo la secuencia de codificación de contrasentido para las proteínas de la invención, lo cual podría bloquear efectivamente la traducción de ARNm que codifican las proteínas y por lo tanto bloquear su expresión y conducen a la inhibición ***-**» 'ftllÉltll j^^- * ~m*-. ..- . ..... ,>,.-?M<t,jA?iÉ«arfíaM w., fea>*^ ^mAA ?¿l del efecto indeseado. Alternativamente, se pueden usar otros oligonucleótidos; los oligonucleótidos que conservaros su capacidad para unirse a TRAF2 en una forma que interfiere con la unión de otras moléculas a esta proteína, mientras que al mismo tiempo no median ninguna activación o modulación de esta molécula. Teniendo estas características, dichas moléculas pueden alterar la interacción de TRAF2 con su ligando natural, actuando sí como inhibidores capaces de abolir los efectos mediados por TRAF2, por ejemplo, tales como activación de NF-?B. Dichos oligonucleótidos pueden introducirse en las células usando el enfoque del virus recombinante anterior, la segunda secuencia portada por el virus, siendo la secuencia de oligonucleótidos. Otra posibilidad es utilizar anticuerpos específicos para las proteínas de la invención para inhibir su actividad de señalamiento intracelular. Aún otra forma de inhibir el efecto no deseado es mediante el enfoque de ribozima recién desarrollado. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas que separan específicamente los ARN. Las ribozimas pueden tratarse para separar los ARN blanco de elección, v.gr., los ARNm que codifican las proteínas de la invención. Dichas ribozimas podrían tener una secuencia específica para el ARNm de las proteínas y podían se capaces de interactuar con los mismos (unión complementaria) seguido por la separación del ARNm, dando como resultado una disminución (o pérdida completa) en la expresión de las proteínas, el nivel de expresión disminuida dependiendo del d_A?,I á?irm???á?._.,?3??li^...?,...,..^^ ....... ..^.. ..... ^.?. _^_^_. ^ ??^l? ^...ít V^.^^^^.___...r_.,.....^ nivel de la expresión de ribozima en la célula blanco. Para introducir ribozimas en las células de elección (v.gr., las que portan las proteínas IREN) se puede utilizar cualquier vector adecuado, v.gr., plásmido, vectores de virus animal (retrovirus), que usualmente se usan para este propósito (ver también (i) anterior, en donde el virus tiene, una segunda secuencia, un ADNc que codifica la secuencia de ribozima de elección). (Para revisiones, métodos, etc, que se refieren a ribozimas, véase Chen y otros, 1992; Zhao y dia, 1993). (¡ii) Pueden usarse para aislar, identificar y clonar otras proteínas que son capaces de unirse a ellas, v.gr., otras proteínas implicadas en el procesos de señalamiento intracelular que están corriente abajo del TRAF2. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican las proteínas de la invención se pueden usar en el sistema de dos híbridos de levadura en el cual se utilizarán las proteínas codificadas como "cebo" para aislar, clonar e identificar otras secuencias de ADNc o bancos de ADN genómico ("presas") que codifican proteínas que pueden unirse a las proteínas clonadas. De la misma forma, también se puede determinar si las proteínas de la presente invención pueden unirse o no a otras proteínas celulares, v.gr., otros receptores de la superfamilia de TNF/NGF de receptores. (iv) Las proteínas codificadas, sus análogos, fragmentos o derivados también pueden usarse para aislar, identificar y clonar otras proteínas de la misma clase, es decir, aquellos que se unen a TRAF2 o a proteínas funcionalmente relacionadas, y se implicaron en el proceso de señalamiento intracelular. En esta solicitud, puede usarse el sistema de dos híbridos de levadura observado antes, o puede usarse un sistema desarrollado recientemente empleando hibridización Southern no estricta seguido por la clonación de RCP (Wilks y otros, 1989). (v) Aún otro enfoque para utilizar las proteínas codificadas de la invención, sus isoformas, análogos, fragmentos o derivados para usarlas en métodos de cromatografía de afinidad para aislar e identificar otras proteínas o factores para los cuales son capaces de unirse, v.gr., proteínas relacionadas con TRAF2 u otras proteínas o factores implicados en el proceso de señalamiento intracelular. En esta solicitud, la proteína, sus análogos de isoformas, fragmentos o derivados de la presente invención, pueden unirse individualmente a las matrices de cromatografía de afinidad y luego se llevan en contacto con extractos celulares o proteínas asiladas o factores que se sospecha que están implicados en el proceso de señalamiento intracelular. Después del procedimiento de cromatografía de afinidad, las otras proteínas o factores que se unen a las proteínas, sus análogos, fragmentos o derivados de la invención, pueden eluirse, aislare y caracterizarse. (vi) Como se observó antes, las proteínas, sus análogos, fragmentos o derivados de la invención también se pueden usar como inmunógenos (antígenos) para producir anticuerpos específicos a los mismos. Estos anticuerpos también pueden usarse para los fines de purificación de la proteína de la invención ya sea de extractos de células o de líneas celulares transformadas que los producen, sus análogos o fragmentos. Además, estos' anticuerpos se pueden usar para fines de diagnóstico para identificar trastornos relacionados con el funcionamiento anormal del sistema receptor en el cual funcionan, v.gr., efectos celulares inducidos por TRAF2 sobre- 5 activos o sub-activos. Por lo tanto, si dichos trastornos están relacionados con un sistema de señalamiento intracelular que está funcionando mal que implica las proteínas de la invención, dichos anticuerpos podrían servir como una herramienta de diagnóstico importante. El término "anticuerpo" significa incluir anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), 10 anticuerpos quiméricos, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) a anticuerpos que pueden marcarse en forma soluble o unida, así como fragmentos de los mismos, tales como, por ejemplo, Fab y F(ab')2 - fragmentos que carecen del fragmento de Fe de anticuerpo intacto, que son capaces de unir antígenos. (vii) Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, 15 útiles en la presente invención pueden usarse para detectar cuantitativa o cualitativamente los clones de la invención en una muestra, o para detectar la presencia de células que expresa los clones de la presente invención. Esto se puede lograr por técnicas de inmunofluorescencia empleando un anticuerpo marcado fluorescentemente acoplado con detección de luz microscópica, de 0 flujo citométrico o fluorométrica. Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención se pueden emplear histológicamente, como en microscopía de inmunofluorescencia o inmunoelectrónica, para la detección in situ de los clones de la presente invención. La detección in situ puede lograrse removiendo un espécimen histológico de un paciente, y proveyendo el anticuerpo marcado de la presente invención para dicho espécimen. El anticuerpo (o fragmento) preferiblemente se provee aplicando o colocando el anticuerpo marcado (o fragmento) en una muestra biológica. Mediante el uso de dicho procedimiento, es posible determinar no solamente la presencia de los clones, sino también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente invención, aquellos con experiencia ordinaria percibirán fácilmente que cualquier variedad amplia de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) se pueden modificar con el fin de lograr dicha detección in situ. Dichos análisis para los clones de la presente invención comprenden típicamente la incubación de una muestra biológica, tal como un fluido biológico, un extracto de tejidos, células recién recopiladas tales como linfocitos o leucocitos, o células que se han incubado en cultivo de tejidos, en presencia de un anticuerpo marcado capaz de identificar las proteínas codificadas y detectar el anticuerpo por cualquiera de un número de técnicas bien conocidas en la técnica. (viii) Las proteínas codificadas de la invención también pueden usarse como moduladores indirectos de cierto número de otras proteínas en virtud de su capacidad de unirse a otras proteínas intracelulares, ías cuales unen directamente otras proteínas intracelulares a otras proteínas intracelulares o un dominio ¡ntracelular de una proteína transmembrana. t¿jt * iAlAto .*j *.i*.

Con el fin de modular estas otras proteínas intracelulares o los dominios intracelulares de proteínas transmembrana, las proteínas de la invención pueden introducirse en células en cierto número de formas como se mencionó antes en (ii). También se deberá observar que el aislamiento, identificación y caracterización de las proteínas de la invención pueden llevarse a cabo usando cualquiera de los procedimientos de tamizado normales bien conocidos. Por ejemplo, uno de estos procedimientos de tamizado, el procedimiento de dos híbridos de levadura que se usó para identificar las proteínas de la invención. Asimismo, se pueden emplear otros procedimientos tales como cromatografía de afinidad, procedimientos de hibridización de ADN, etc. Dado que son bien conocidos en la materia, para aislar, identificar y caracterizar las proteínas de la invención o para aislar, identificar y caracterizar proteínas, factores, receptores, etc, adicionales que son capaces de unirse a las proteínas de la invención. Además, se encontró que las proteínas que se unen en las proteínas de la invención se pueden emplear por sí mismas, en una forma análoga a la manera en la cual se usan las proteínas de la invención como se observó antes y más adelante, para aislar, identificar y caracterizar otras proteínas, factores, etc. Que son capaces de unirse a las proteínas de la invención-proteínas de unión y que pueden representar factores implicados además corriente abajo en el proceso de señalamiento asociado, o que puede tener actividades de señalamiento de las mismas y por lo tanto podría representar proteínas implicadas en un proceso de señalamiento distinto. Las secuencias de ADN y las proteínas codificadas de la invención pueden producirse mediante cualquier procedimiento de ADN recombinante normal (ver por ejemplo, Sambrook, y otros, 1989) en el cual las células huésped eucarióticos o procarióticas adecuadas se transforman por vectores eucarióticos o procarióticos apropiados que contienen las secuencias que codifican las proteínas. Consecuentemente, la presente invención también se refiere a dichos vectores de expresión y huéspedes transformados para la producción de las proteínas de la invención. Como se mencionó antes, estas proteínas también incluyen sus análogos, fragmentos y derivados biológicamente activos, y por lo tanto los vectores que los codifican también incluyen vectores que codifican análogos y fragmentos de estas proteínas, y los huéspedes transformados incluyen aquellos que producen dichos análogos y fragmentos. Los derivados de estas proteínas son los derivados producidos por la modificación normal de las proteínas o sus análogos o fragmentos, producidos por los huéspedes transformados. La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas para la modulación de los efectos mediados por TRAF2. Las composiciones farmacéuticas que comprenden, como un ingrediente activo, cualquiera de uno o más de los siguientes: (i) una o más de las secuencias de ADN de la invención, o partes de ellos, subclonados en un vector de expresión apropiado; (ii) una proteína de acuerdo con la invención, sus fragmentos, análogos, derivados biológicamente activos o una mezcla de los mismos; (iii) un vector viral animal recombinante que codifica una proteína de acuerdo con la invención, sus fragmentos, análogos o derivados biológicamente activos. Las composiciones farmacéuticas se aplican de acuerdo con la enfermedad que será tratada y en cantidades benéficas para la patente, dependiendo en el peso corporal y otras consideraciones, como se determina por el médico. Como se observó antes, una de las modalidades específicas de las proteínas de unión de TRAF de la presente invención es la proteína de unión a TRAF2 IREN. Con base en los hallazgos de acuerdo con la presente invención de que IREN se unen específicamente a TRAF2 y como tal es un mediador/modulador de TRAF2 y o por lo tanto puede mediar/modular la actividad de TRAF2 en la activación de NF-?B y por lo tanto su posible papel en las rutas de sobrevivencia celular de la forma en que las funciones de TRAF2 independientemente o en conjunto con otras proteínas (v.gr., receptores de TNF p55 y TNF p75, receptor de FAS/AP01 , MORT-1 , RIP y TRADD) es importante para diseñar fármacos que pueden mejorar o inhibir la interacción de TRAF2-IREN, según se desee. Por ejemplo, cuando se desea modular la citotoxicidad de células inducidas por TNF podría ser deseable modular la citotoxicidad de células inducidas por TNF podría ser deseable modular la inducción de NF-?B modulando la interacción de TRAF2-IREN o modulando la modulación de NF-?B específica para TRAF2 y/o IREN. Hay muchas enfermedades en las cuales dichos fármacos pueden ser de mayor ayuda. Entre otros, (véase también la discusión anterior) la hepatitis aguda en la cual el daño agudo al hígado parece reflejar la muerte mediada por el receptor de FAS/AP01 de las células hepáticas siguiendo la inducción por el ligando de Fas; la muerte de células mediada inducida-autoinmune tales como la muerte de las células ß de Langerhans del páncreas, que da como resultado la diabetes; la muerte de células en el rechazo de injerto (v.gr., riñon, corazón e hígado); la muerte de o godendrocitos en el cerebro en esclerosis múltiple; y suicidio de células T inhibidas por SIDA lo que ocasiona la proliferación del virus del SIDA y por lo tanto la enfermedad del SIDA. Es posible que IREN o una o más de sus isoformas, análogos o fragmentos biológicamente activas posibles, pueden servir como inhibidores "naturales" de las propias IREN o de la interacción de IREN-TRAF2, y como tal sirven como moduladores de la activación de NF-?B. Dichos moduladores pueden emplearse así como los moduladores específicos observados antes, por ejemplo, aquellos moduladores que serán usados cuando se desee modular los efectos citotóxicos de células de TNF. De hecho, como se ejemplifica más adelante, se han aislado varios análogos de IREN y muteínas de acuerdo con la presente invención, que son capaces de modular la inducción de la activación de NF-?B mediada por NIK, NEMO, IKK-1 o fragmentos de los mismos. Y también como es mediado por la endotoxma bacteriana (LPS), acetato de forbol miristato y TAX de proteína HTLV-1. Así mismo, otras sustancias tales como pépticos, compuestos orgánicos, anticuerpos, etc, también se pueden tamizar para obtener fármacos específicos que son capaces de inhibir la interacción de TRAF2-IREN o la actividad de IREN. En una forma similar, cuando se desea modular la activación de NF-?B en varias situaciones como se observó antes es posible, por ejemplo, modular la cantidad de IREN y/o TRAF2 en células mediante varios métodos normales observados en la presente (v.gr., introducción de ADN que codifica IREN y/o TRAF2 en células para modular la expresión, o preparar formulaciones adecuadas que contienen IREN y/o TRAF2 para la introducción directa en células, o cualquier otra manera conocida para los expertos en la materia). Así mismo, también se pueden tamizar otras sustancias tales como péptidos, compuestos orgánicos, etc., para obtener fármacos específicos que son capaces de mejorar la actividad de IREN o para mejorar la interacción de TRAF2-IREN. Un ejemplo no limitante de cómo podrían designarse y tamizarse los moduladores de péptidos de la interacción de IREN-TRAF2, se basan en estudios previos en inhibidores de péptidos de ICE o proteasas similares a ICE, la especificidad de sustratos de ICE y estrategias para análisis de epítopes usando síntesis de péptidos. Se encontró que el requerimiento mínimo para la separación eficiente de un péptido por ICE implica cuatro aminoácidos a la izquierda del sitio de separación con una fuerte preferencia para ácido aspártico en la posición PT (Sleath y otros, 1990; Howard y otros, 1991 ; Thornberry y otros, 1992). Además, el péptido del substrato irf li á iiii?Éáii- H iítitfii tn i n ~i*«~ -*-- ~~-.-~^^~«* -..***»*- -.*.»t» —=**»* ^*-. _.*__*..__. _«. *.á tA fluorogénico (un tetrapéptido), acetil-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-metil-cumaril-7-amida) abreviada Ac-DEVD-AMC, corresponde a una secuencia en poli (ADP-pbosa)polimerasa (PARP) que se encontró que se separa en células brevemente después de la estimulación de FAS-R, a 'si como otros procesos apoptópicos (Kaufmann, 1989; Kaufmann y otros, 1993; Lazebnik y otros, 1994) y se separa efectivamente por CPP32 (un miembro de la familia de proteasa de CED3/ICE) y proteasas de MACH. Como Asp en la posición de PT del sustrato parece ser importante, los tetrapéptidos que tiene Asp como el cuarto residuo de aminoácidos y varias combinaciones de aminoácidos en las primeras posiciones de tres residuos pueden tamizarse rápidamente para unirse al sitio activo de las proteasas que usan, por ejemplo, el método desarrollado por Geysen (Geysen, 1985; Geysen y otros, 1987) en donde un gran número de péptidos en soportes sólidos se tamizaron para interacciones espe'cificas con anticuerpos. La unión de proteasa MACH a péptidos específicos puede detectarse por una variedad de métodos de detección bien conocidos por los expertos en la materia, tal como el radiomarcado, etc. Se mostró que este método de Geysen es capaz de probar por lo menos 4000 péptidos cada día laboral. En una forma similar la región de unión exacta o región de homología que determina la interacción entre TRAF2 e IREN (o cualquier ora proteína de TRAF y proteína de unión de TRAF) puede elucidarse y luego los péptidos pueden tamizarse, los cuales pueden servir para bloquear esta interacción, v.gr., péptidos sintetizados teniendo una secuencia similar a la de la región de unión o complementarios a las misma que puede competir con IREN natural (o proteína de unión de TRAF) para unirse a TRAF2 (o TRAF). Dado que puede ser ventajoso designar inhibidores de péptidos que inhiben selectivamente interacciones de TRAF2-IREN (o proteína de unión de TRAF-TRAF) sin interferir con procesos de muerte celular fisiológica en los cuales están implicados otros miembros de la ruta de señalamiento intracelular, v.gr., proteasas MACH de la ruta de muerte celular, que son miembros de la familia CED3/ICE de proteasas, la combinación de péptidos que se unen a TRAF2 (o TRAF) o IREN (o proteínas de unión de TRAF) en un análisis tal como el descrito antes pueden sintetizarse además como un péptido de sustratos fluorogénicos para probar la unión selectiva para dichas otras proteínas para seleccionar son aquellas específicas para TRAF2/IREN (o TRAF/proteína de unión a TRAF). Los péptidos, que se determinan para ser específicos para, por ejemplo, TRAF2/IREN, pueden modificarse entonces para aumentar la permeabilidad celular e inhibir la actividad de TRAF2 y/o IREN ya sea reversiblemente o irreversiblemente. Thornberry y otros (1994) reportaron que un tetrapéptido (aciloxi) metilcetona Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH2OC (O)-[2,6-(CF3)2] Ph fue un inactivador potente de ICE. Similarmente, Milligan y otros (1995) reportó que los inhibidores de tetrapéptidos que tiene una clorometilcetona (irreversibilidad) o grupos aldehido (reversibilidad) inhibieron ICE. Además, se mostró que benciloxicarboxil-Asp-CH2OC (O)-2,6-diclorobenceno (DCB) inhibe ICE (Mashima y otros, 1995). ^a^a^bta^=&a^fca^ria^^i^iA^a^^ ..._-_¿¿ .,.^_í¿.

Consecuentemente, en una forma análoga, se pueden modificar los v tetrapéptidos que se unen selectivamente a, por ejemplo, TRAF2 o IREN, con, por ejemplo, un grupo aldehido, clorometilcetona, (aciloxi)metilcetona o un grupo CH2OC(O)-DCB para crear un inhibidor de péptidos de actividad de TRAF2/IREN. Además, para mejorar la permeabilidad, por ejemplo, los péptidos pueden ser modificados químicamente o derivatizados para aumentar su permeabilidad a través de la membrana celular y facilitar el transporte de dichos péptidos a través de la membrana y en el citoplasma. Muranishi y oros (1991 ) reportaron la derivatización de la hormona de liberación de tirotropina con ácido láurico para formar un derivado lauroil lipofílico con buenas características de penetración a través de las membranas celulares. Zacharia y otros 81991 ) también reportaron la oxidación de metionina a sulfóxido y el reemplazo de la unión de péptidos con su isoéster de cetometileno (COCH2) para facilitar el transporte de péptidos a través de la membrana celular. Estos son sólo algunas de las modificaciones conocidas y derivados que están dentro de la experiencia de aquellos en la materia. Además, los inhibidores de fármacos o péptidos, que son capaces de inhibir la actividad de, por ejemplo, IREN inhibiendo la interacción de IREN-TRAF2 y similar, la interacción ente las proteínas de TRAF y proteínas de unión de TRAF pueden conjugarse o acomplejarse con moléculas que facilitan la entrada en la célula.

La patente de E.U.A. 5,149,782, describe la conjugación de una molécula para transportarse a través de la membrana celular con un agente de mezclado de membranas tal como polipéptidos fusogénicos, polipéptidos de formación de canales de ¡ones, otros polipéptidos de membranas, y ácidos grasos de cadena larga, v.gr, ácido miristico, ácido palmítico. Estos agentes de mezclado de membranas insertan los conjugados moleculares en la bicapa de lípidos de membranas celulares y facilitan su entrada en el citoplasma. Low y otros, la patente de E.U.A. 5,108,921 , revisa métodos disponibles para el suministro de transmembrana de moléculas tales como, pero no limitado a, proteínas y ácidos nucleicos por el mecanismo de actividad endocitotica mediada por el receptor. Estos sistemas receptores incluyen aquellos que reconocen galactosa, mañosa, mañosa 6-fosfato, transferina, asialoglicoproteína, transcobalamina (vitamina B?2), a-2 macroglobulinas, insulina y otros actores de crecimiento de péptidos tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés). Low y otros, enseña que los receptores de nutrientes, tales como receptores para biotina y folato, pueden usarse ventajosamente para mejorar el transporte a través de la membrana celular debido a la ubicación y multiplicidad receptores de biotina y folato en las superficies de membranas de la mayoría de las células y los proceso de transporte transmembrana mediado por el receptor asociado. Por lo tanto, un complejo formado entre un compuesto que será suministrado en el citoplasma y un ligando, tal como biotina o folato, se pone en contacto con una membrana celular que porta receptores de biotina o folato para iniciar el mecanismo de transporte transmembrana mediado por el receptor y así permite la entrada del compuesto deseado en la célula. Se sabe que ICE tiene la capacidad de tolerar sustituciones liberales en la posición P2 y su tolerancia a sustituciones liberales se explotó para desarrollar una etiqueta de afinidad potente y altamente selectiva conteniendo una bandera de biotina (Thornberry y otros, 1994). Consecuentemente, la posición P2 así como posiblemente la terminación N del inhibidor de tetrapéptido puede modificarse o derivatizarse, de manera que con la adición de una molécula de biotina, para aumentar la permeabilidad de estos inhibidores de péptidos a través de la membrana celular. Además, se sabe en la materia que la fusión de una secuencia de péptidos deseada con una secuencia de péptidos líder/de señal para crear un "péptido quimérico" permitirá que dicho "péptido quimérico" se transporte a través de la membrana celular en el citoplasma. Como se apreciará por aquellos con experiencia en la materia de péptidos, los inhibidores de péptidos de la interacción de proteína de unión de TRAF-TRAF, por ejemplo, la interacción de TRAF2-IREN de acuerdo con la presente invenciones entiende que incluye fármacos o inhibidores peptidomiméticos, que también se pueden tamizar rápidamente para unirse a, por ejemplo TRAF2/IREN para designar inhibidores tal vez más estables. 1&_AÍÉ,A -?..?»¿Í¿. . {-p ?tttrtr?it-».. __,_* -*-•*¥-•*'_.__________.. .^¿^ t-^ta ^..^i---Majifc--¿y~''^-^*-^-.'t .^«mA= áA?i También se apreciará que significa igual para facilitar o mejorar el transporte de los inhibidores de péptidos a través de membranas celulares como se trató antes también se pueden aplicar a las proteínas de unión de TRAF, por ejemplo, IREN, sus análogos, fragmentos o sus isoformas propias así como otros péptidos y proteínas que ejercen sus efectos intracelularmente. Con respecto a los anticuerpos mencionados en la presente, el término "anticuerpo" se entiende que incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos quiméricos, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) a anticuerpos que pueden marcarse en una forma soluble o unida, así como fragmentos de los mismos provistos por cualquier técnica conocida, tal como, pero no limitado a separación enzimática, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de sueros de animales inmunizadas con un antígeno. Un anticuerpo monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos para antígenos, dichas poblaciones contienen sitios de unión de epítopes sustancialmente similares. Mabs puede obtenerse mediante métodos conocidos por los expertos en la materia Véase, por ejemplo Kohier y Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); patente de E.U.A. No. 4,376,110; Ausubel y otros, eds., Halrlow y Lañe ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbofr Laboratory (1988); y Coliingan y otros, eds., Current Protocols in Immunology, kúJklh_á_ *¿*^^i^*--^^* .^_i_~,_.z___í__¿_____.____ . ___.. „ ... , WM. . ^?^^iai<*^«»^»¿to»-----A~-fc«--ag-^^^??j a-?&a---t -.--fa i-í Greene Publishing Assoc. Y Wiley Interscience N.Y., (1992-1996), el contenido de sus referencias se incorpora compeltamene en la presente por referencia. Dichos anticuerpos puede ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de los mismos. Un hibridoma que produce un mAb de la presente invención puede cultivarse in vitro, in situ o in vivo. La producción de altas titulaciones de mAbs in vivo o in situ vuelve a éste el método preferido de producción. Los anticuerpos quiméricos son moléculas de las cuales se derivan diferentes porciones de diferentes especies animales, tales como aquellas que tiene la región variable derivada de un mAb de murinos y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos se utilizan principalmente para reducir la inmunogenicidad en aplicación y para incrementar rendimientos en producción, por ejemplo, en donde el mAbs de murinos tiene rendimientos superiores de hibridomas pero inmunogenicidad superior en humanos, de manera que se usan mAbs quiméricos de humanos/murinos. Los anticuerpos quiméricos y métodos para su producción se conocen en la materia (Cabilly y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :3273-3277 (1984); Morrison y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :6851 -6855 (1984); Boulianne y otros, Nature 312:643-646 (1984); Neuberger y otros, Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi y otros, Solicitud de patente europea 171496 (publicada el 19 de febrero de 1985); Morrison y otros, solicitud de patente europea 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Neuberger y otros, solicitud de PCT WO 8601533 (publicada el 13 de marzo de 1986); Kudo y otros, solicitud de patente europea 184187 (publicada el 11 de junio, 1986); Sahagan y otros, J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson y otros, International Patent Application No. WO8702671 (publicada el 7 de mayo de 1987); Liu y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3433 (1987); Sn y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1988); y Harlow y Lañe, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra. Estas referencias se incorporan completamente aquí por referencia Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-ld) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicas asociadas generalmente con el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id puede prepararse inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (v.gr., cepa de ratón) dado que la fuente de mAb para la cual se está preparando un anti-ld. El animal inmunizado reconocerá y responderá alas determinantes idiotípicas del anticuerpo de inmunización produciendo un anticuerpo para estas determinantes idiotípicas (el anticuerpo anti-ld). Véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 4,699,880, que se incorpora aquí en su totalidad por referencia. El anticuerpo anti-ld también se puede usar como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en aún otro animal, produciendo un anticuerpo anti-anti-ld así llamado. El anti-anti-ld puede ser epitópicamente idéntico a mAb original, que indujo el anti-ld. Por lo tanto, usando anticuerpos para las determinantes idiotípicas de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica.

Consecuentemente. mAbs generado contra IREN, sus isoformas, análogos, fragmentos o derivados de la presente invención pueden usarse para inducir anticuerpos anti-ld en animales adecuados, tales como ratones BALB/c. Las células del baso de los ratones inmunizados se utilizan para producir hibridomas anti-ld secretando mAbs anti-ld. Además, los mAbs anti-ld pueden acoplarse a un vehículo tal como hemocianina de limpeto del principio y se utiliza para inmunizar ratones BALB/c adicionales. El suero de estos ratones contendrá anticuerpos anti-anti-ld que tienen las propiedades de unión del mAb original específico para un epítope de la proteína IREN anterior, o análogos, fragmentos, y derivados de los mismos. El mAbs anti-ld tienen así sus propios epítopes idiotípicos, o "idiotopos" estructuralmente similares al epítope que se está evaluando, tal como proteína a de GRB. El término "anticuerpo" también se entiende que incluye tanto las moléculas intactas así como fragmentos de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab y F(ab')2, que son capaces de unirse al antígeno. Los fragmentos de Fab y F(ab')2 carecen del fragmento de Fe del anticuerpo intacto, se libera más rápidamente de la circulación y puede tener menos unión al tejido no específico que un anticuerpo intacto (Wahl y otros, J. Nucí. Med. 24:316-325 (1983)). Se apreciará que Fab y F(ab')2 y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención se pueden usar para la detección y cuantificación de la proteína IREN de acuerdo con los métodos descritos en I?.__?.¿ I_±?_*¿ .- . I kk*.,**.* .... ..k*^l _ la presente para las moléculas den anticuerpo intacto. Dichos fragmentos normalmente se producen por la separación proteolítica, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos de Fab) o pepsina (para producir fragmentos de F(ab')2). Un anticuerpo es tal que es "capaz de unirse" a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para unir así la molécula al anticuerpo. Se entiende que el "epítope" se refiere a esa porción de cualquier molécula capaz de unirse a un anticuerpo, que también se puede reconoces por ese anticuerpo. Los epítopes o "determinantes antigénicas" consisten usualmente de agrupaciones de superficie químicamente activa de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específica. Un "aptígeno" es una molécula o una porción de una molécula capaz de unirse por un anticuerpo, que es adicionalmente capaz de inducir un animal para producir anticuerpo capaz de unirse a un epítope de dicho antígeno. Un antígeno puede tener uno o más de un epítope. La reacción específica a la que se hace referencia antes se entiende que indica que el antígeno reaccionará, en una forma altamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden evocarse por otros antígenos. Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, útiles en la presente invención se pueden usar para detectar cuantitativa o cualitativamente las proteínas de IREN en una muestra para detectar presencia de células que expresa las proteínas IREN de la presente invención. Esto puede lograrse por técnicas de inmunofluorescencia que emplean un anticuerpo marcado fluorescentemente (véase en seguida) acoplado con detección de luz microscópica, citométria de flujo o fluorométpca. Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención se pueden emplear histológicamente, como en microscopía de inmunofluorescencia o inmunoelectrónica, para la detección in situ de las proteínas de IREN de la presente invención. La detección in situ puede lograse removiendo un espécimen histológico de un paciente y proveyendo el anticuerpo marcado de la presente invención para dicho espécimen. El anticuerpo (o fragmento) preferiblemente se provee aplicando o colocando el anticuerpo marcado (o fragmento) a una muestra biológica. Mediante el uso de dicho procedimiento, es posible determinar no solamente la presencia de las proteínas IREN sino también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente invención, los expertos percibirán fácilmente que cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) pueden modificarse con el fin de lograr dicha detección in situ. Dichos análisis para las proteínas IREN de la presente invención comprende típicamente la incubación de una muestra biológica, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recién recopiladas tales como l- J.ifcAü *.__^í_?tA_í_i,___j, linfocitos o leucocitos, o células que se han incubado en cultivo de tejido, en presencia de una anticuerpo marcado capaz de identificar las proteínas de IREN y detectar el anticuerpo mediante cualquiera de un número de técnicas bien conocidas en la técnica La muestra biológica puede tratarse con un soporte de fase sólida o vehículo tal como nitrocelulosa, u otro soporte o vehículo líquido que es capaz de inmovilizar células, partículas de células o proteínas solubles. El soporte o portador puede lavarse con soluciones reguladoras adecuadas seguido por tratamiento con un anticuerpo marcado de acuerdo con la presente invención, como se observó antes. El soporte o portador de fase sólida entonces puede lavarse con la solución reguladora una segunda vez para remover anticuerpo no unido. La cantidad de marcador unido en dicho soporte o portador sólido puede detectarse entonces por medios convencionales. Por "soporte de fase sólida", "vehículo de fase sólida", "soporte sólido", "vehículo sólido", "soporte" o "vehículo" se entiende cualquier soporte o portador capaz de unirse al antígeno o anticuerpos. Los soportes o portadores bien conocidos, incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacplamidas, garbos y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble a algún grado o insoluble para los fines de la presente invención El material de soporte tiene tener virtualmente cualquier configuración estructural posible mientras la molécula acoplada es capaz de unirse a un IÍt Íá?¡t? lÉJÍ?iÍ¿aí-*->- --J - *a°*-fe*.-' .... -.^~. >- — . - --*<-«• - ^.^.^«..ia^^ate antígeno o anticuerpo. Por lo tanto, la configuración de soporte o portador puede ser esférica, como en una perla, cilindrica, como en la superficie interna de un tuvo de ensayo, o la superficie externa de una barra. Alternativamente, la superficie puede ser plana tal como una hoja, tira de 5 prueba, etc. Los soportes o portadores preferidos incluyen perlas de poliestireno. Los expertos en la materia pueden conocer otros portadores adecuados para unirse al anticuerpo o antígeno, o serán capaces de asegurar los mismos mediante el uso de experimentación de rutina. La actividad de unión de un lote dado de anticuerpo, de la 0 invención como se observó antes, puede determinarse de acuerdo con métodos bien conocidos. Los expertos en la materia serán capaces de determinar las condiciones del análisis operativo y óptimo para cada determinación empleando experimentación de rutina. Otro de dichos pasos como el lavado, agitación, batido, filtrado y 5 similares se pueden agregar a los análisis según sea acostumbrado o necesario para la situación particular Una de dichas formas en las cuales un anticuerpo de acuerdo la presente invención puede marcarse, es mediante la unión de la misma a una enzima y usarse en un inmunoanálisis de enzimas (EIA, por sus siglas en 0 inglés). Esta enzima, a su vez, cuando se expone después a un sustrato apropiado, reaccionará con el sustrato de tal forma que produzca una porción química que puede detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que se pueden usar para marcar de manera detectable el anticuerpo incluyen, pero no están limitadas a, malato deshidrogenasa, nucleasa estafilococal, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerol fosfato deshidrogenasa, triosa fosfato o-isomerasa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, asparagipasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-e-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinaesterasa. La detección puede lograrse mediante métodos colorimétpcos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también se puede lograr por comparación visual del grado de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con normas preparadas similarmente. La detección puede lograrse usando cualquiera de una variedad de otros inmunoanálisis. Por ejemplo, marcando radiactivamente los anticuerpos fragmentos de anticuerpos, es posible detectar R-PTPasa mediante el uso de un radioinmunoanálisis (RÍA). Una buena descripción de RÍA se puede encontrar en Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biololgy, por Work, T.S. y otros, North Holland Publishing Company, NY (1978) con referencia particular al capítulo titulado "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" por Chard, T., incorporada aquí por referencia. El isótopo radioactivo puede detectarse debido a tales medios como el uso de un contador g o un contador de centelleo o por autoradiografía. También es posible marcar un anticuerpo de acuerdo con la presente invención con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo _..,_.. ^. _..__**_*-_!_-.>_. . *_, _&&& marcado fluorescentemente se expone a la luz de la longitud de onda apropiada, su presencia puede detectarse entonces debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcado fluorescente más comúnmente utilizados están isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, picocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina. El anticuerpo también puede marcarse de manera detectables usando metales emisores de fluorescencia tales como 152E, u otras de las series de lantánidos. Estos metales pueden unirse al anticuerpo usando dichos grupos quelantes de metales como ácido dietilentriamina pentacético (ETPA). El anticuerpo también puede marcarse detectabíemente acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo etiquetado quimioluminiscentemente se determina entonces detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos marcados quimioluminiscentemente son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato. Así mismo, se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biológicos en los cuales una proteína catalítica incrementa la eficiencia de la reacción quimioluminiscepte. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes importantes para los fines de marcado son luciferina, luciferasa y ecuorina. Una molécula de anticuerpos de la presente invención puede adaptarse para usarse en un análisis inmunométrico, también conocido como un análisis de "dos sitios" o de "emparedado". En un análisis inmunométrico normal, se une una cantidad de anticuerpo no marcado (o fragmento de anticuerpo) a un soporte o portador sólido y una cantidad del anticuerpo soluble marcado detectablemente se agrega para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo de fase sólida, antígeno y anticuerpo marcado. De manera normal y preferida, el análisis inmunométrico incluye análisis "de seguimiento" en los cuales el anticuerpo unido a la fase sólida primero se pone en contacto con la muestra que se está probando para extraer el antígeno de la muestra mediante la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno de fase sólida binaria. Después de un período de incubación adecuado, el soporte o portador sólido se lava para remover el residuo de la muestra de fluido, incluyendo antígeno sin reaccionar, si hay algo, y después poniendo en contacto con la solución que contiene una cantidad desconocida de anticuerpo marcado (que funciona como una "molécula reportera"). Después de un segundo período de incubación para permitir que el anticuerpo marcado forme complejo con el antígeno unido al soporte o portador sólido a través del anticuerpo no marcado, el soporte o portador sólido se lava una segunda vez para remover el anticuerpo marcado sin reaccionar. En otro tipo de análisis de "emparedado", que también puede ser útil con los antígenos de la presente invención, se utilizan el análisis "simultáneo" e "inverso" así llamados. Un análisis simultáneo implica un solo paso de incubación en el que el anticuerpo unido al soporte o portador sólido y el anticuerpo marcado, se agregan al mismo tiempo a la muestra que se está probando. Después de que se completa la incubación, el soporte o portador sólido se lava para remover el residuo de la muestra de fluido y un anticuerpo marcado que no forma complejo. La presencia de anticuerpo marcado asociado con el soporte o portador sólido se determina entonces, como sería en un análisis de emparedado de "seguimiento". En el análisis "inverso", se agrega por pasos primero una solución de un anticuerpo marcado a la muestra de fluido seguido por la adición del anticuerpo no marcado unido a un soporte o portador sólido después de que se utiliza un período de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, la fase sólida se lava en forma convencional para liberarla del residuo de la muestra que se está probando y la solución del anticuerpo marcado sin reaccionar. La determinación del anticuerpo marcado asociado con un soporte o portador sólido, se determinó entonces como en el análisis "simultáneo" y de "seguimiento". Como se mencionó antes, la presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden vectores de virus ti fÉlÍ l?tlH*iu>ül**"->-tAj-<J,ib'" '--' * - >-~> '^-~ -~J^^*..«-?~^ AMJ l animal recombinantes que codifican la proteína IREN, dicho vector también codifica una proteína de superficie de virus capaz de unirse a las proteínas superficiales de células blanco específica de unión (v.gr., células cancerígenas) para dirigir la inserción de las secuencias de proteínas IREN en las células. Las composiciones farmacéuticas adicionales de la invención comprenden como el ingrediente activo (a) una secuencia de oligonucleótidos que codifican una secuencia de contrasentido de la secuencia de proteínas IREN, o (b) fármacos que bloquean la interacción de proteína IREN-TRAF. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención incluyen una cantidad suficiente del ingrediente activo para lograr su propósito. Además, las composiciones farmacéuticas pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente y que pueden estabilizar dichas preparaciones para la administración al sujeto que necesita de las mismas dado que son bien conocidas por los expertos en la materia. La proteína IREN y sus isoformas o isótopos, se piensa que se expresan en diferentes tejidos a niveles notoriamente diferentes y aparentemente también con diferentes patrones de isótopos en una forma análoga a la expresión de otras varias proteínas implicadas en las rutas de señalamiento intracelulares como se indica en las solicitudes de patentes copendientes de copropiedad listadas antes. Estas diferencias, posiblemente Mflfh tiiiiiiií *±. z .U____MA___¿.. » . * ~_.. ..... £i|g¡f.f^ . pueden contribuir a las características específicas para tejidos de respuesta al Fas/AP01 -ligando y TNF. Como en el caso de otros homólogos de CED3/ICE (Wang y otros, 1994; Alnemri y otros, 1995), los inventores de la presente han mostrado previamente (de las solicitudes de patentes mencionadas antes) encontraron que las isoformas MACH que contienen regiones incompletas de CED3/ICE (v.gr., MACHa3) tienen un efecto inhibidor sobre la actividad de las moléculas MACHal o MACHa2; también se encontró que bloquean la inducción de muerte por Fas/APO1 y p55-R. La expresión de dichas ¡soformas inhibidoras en células, puede constituir un mecanismo de autoprotección celular contra citotoxicidad mediada por Fas/APOI y TNF. La amplia heterogeneidad de ¡soformas de MACH, que exceden en gran parte a las observadas para cualquiera de las otras proteasas de la familia de CED3/ICE, deberán permitir una sintonización particularmente fina de la función de las isoformas MACH activas. De acuerdo con la presente invención, también se han aislado análogos/muteínas de la proteína IREN de unión de TRAF2. Algunos de estos análogos/muteínas IREN (véase antes y véase los siguientes Ejemplos), tales como muteínas de supresión de IREN modulan la activación de NF-?B. Por lo tanto, como se observó antes, las proteínas IREN o isoformas posibles pueden tener efectos variables en diferentes tejidos con respecto a su interacción con proteínas TRAF y su influencia sobre la actividad de las proteínas TRAF, o señalamiento intracelular mediado por las proteínas TRAF.

También es posible que algunas de las isoformas IREN posibles sirven para otras funciones. Por ejemplo, IREN o algunos análogos de IREN, o isoformas también pueden actual como sitios de acoplamiento para moléculas que están implicadas en otros efectos no citotóxicos de, por ejemplo, receptores Fas/APO1 y TNF vía la interacción con TRAF2 o aún independientemente de TRAF2. Debido a la única capacidad de los receptores de Fas/APO1 y TNF de ocasionar muerte celular, así como la capacidad délos receptores de TNF de accionar otras actividades que daña los tejidos, las aberraciones en la función de estos receptores podrían perjudicar particularmente al organismo. Además, el funcionamiento tanto excesivo como deficiente de estos receptores se ha mostrado que contribuye a manifestaciones patológicas de varias enfermedades (Vassalli, 1992; Nagata y Glostein, 1995). La identificación de las moléculas que participan en la actividad de señalamiento de los receptores, y encontrando formas para modular la actividad de estas moléculas, podría dirigirse a nuevos enfoques terapéuticos. En vista del importante papel esperado de las proteínas TRAF, v.gr., TRAF2 y por lo tanto la interacción de TRAF2-IREN en la modulación de la activación NF-?B, parece ser particularmente importante para diseñar fármacos que puedan modular la interacción de TRAF2-IREN cuando se desea matar células (inhibiendo la activación de NF-?B), y al contrario, cuando se desea conservar células (mediante el aumento de la activación de NF- B) » La presente invención también se refiere a proteínas u otros* ligandos que pueden unirse a las proteínas IREN de la invención y así modular/mediar la actividad de las proteínas IREN. Dichas proteínas o ligandos pueden tamizarse, aislarse y producirse por cualquiera de los métodos mencionados antes. Por ejemplo, pueden aislarse cierto número de nuevos ligandos, incluyendo proteínas, capaces de unirse a las proteínas IREN de la invención (dichas nuevas proteínas/ligandos que excluyen TRAF2 y TRAF conocidas). Como se detalló antes, dichas proteínas/ligandos de unión de proteínas IREN novedosos, v.gr., proteínas de unión a IREN, pueden servir como, por ejemplo, inhibidores o mejoradores de la actividad mediada por IREN o la actividad mediada, por ejemplo, por la interacción de TRAF2-IREN, y como tal tendrán papeles importantes en varias situaciones patológicas y otras como se detalla antes. Otra función de dichas proteínas/ligandos de unión a las proteínas IREN podrían servir como agentes específicos para la purificación de las proteínas IREN, por ejemplo, por cromatografía de afinidad, estas nuevas proteínas/ligandos de unión uniéndose a las matrices de cromatografía adecuadas para formar el soporte/matriz sólido o de afinidad a través de la cual se pasará una solución, extracto o similares, que contienen v gr., IREN, y en esta forma facilitar la purificación de los mismos. Dichos métodos de cromatografía de afinidad son procedimientos bien conocidos y generalmente normales en la materia. iti-Aj-na.jA.AA-üjfaiÉai A— "iilr Hi ii - > ? ___.. .... . .... tjatt *..____________. .i,aa_«.?n , A. _,.....,._. . --'^-'-^•-.i_____^____^^_____h___aa¡tm A** * Así mismo, todas las proteínas IREN, análogos, fragmentos, isoformas y derivados mencionadas antes, de la presente invención, se pueden usar para purificar por cromatografía de afinidad las diferentes proteínas TRAF a las cuales se unen. Por ejemplo, IREN, y análogos, fragmentos y muteínas de IREN (véase ejemplos siguientes) se pueden usar para la purificación de cromatografía de afinidad de TRAF2. La invención ahora se describirá en mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y los dibujos anexos. Se deberá observar también que los procedimientos de: (i) prueba de tamizado de dos híbridos y expresión de ß- galactosidasa de dos híbridos; (ii) expresión inducida, marcado metabólico e inmunoprecipitación de proteínas; (iii) unión in vitro; (iv) valoración de citotoxicidad; y (v) análisis de Northern y de secuencia, así como otros procedimientos usados en los siguientes Ejemplos se han detallado en publicaciones previas por los inventores presentes con respecto a otras proteínas de señalamiento intracelular y las rutas (véase, por ejemplo, Boldin y otros, 1995a, 1995b, y Boldin y otros, 1996). Estos procedimientos también aparecen en detalle en las solicitudes de Israel copendientes de copropiedad Nos. 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 y 120367 así como la solicitud de PCT correspondiente No. PCT/US96/10521 ). consecuentemente, las descripciones completas de estas publicaciones y solicitudes de patentes se incluyen aquí en su totalidad y por lo menos en cuanto a los que se refiere a los procedimientos experimentales detallados.

EJEMPLOS Materiales y Métodos i) Bancos de ADNc a) Banco de ADNc de células B Se usó un banco iniciado con oligo dT de células B humanas (Durfee y otros, 1993). Los ADNc del banco se insertaron en el sitio de Chol del vector basado en pACT pSE1107 en fusión con el dominio de activación GAL4. b) Banco de ADNc de testículos ?gt10 Se utilizó un banco de ADNc de testículos humanos. El banco es un banco iniciado con hexanucleótido aleatorio con un inserto promedio de tamaño de 200 a 400 pb. ii) Cepas de levadura Se utilizaron dos cepas de levadura como cepas huésped para transformación y tamizado: la cepa de HF7c que se uso en el tamiz de dos híbridos y la cepa SFY526 que se uso en los análisis de ß-galactosidasa. Ambas cepas portan los marcadores auxotróficos trpl y Ieu2, a saber, dichas cepas de levadura no pueden crecer en medio sintético mínimo que carece de triptofano y leucina, a menos que se transformen por un plásmido que porta las versiones de tipo silvestre de estos genes (TRP1 , Leu2). Las dos cepas de levadura portan mutaciones de supresión en sus genes GAL4 y GAL80 (mutaciones de gal4-542 y gal80-538, respectivamente). Las cepas de SFY526 y HF7c portan el reportero lacZ en sus genotipos; en la cepa SFY526 fusionada a la porción UAS y TATA del promotor GAL1 , y en tres copias de HF7c de la secuencia consensual de GAL4 17-mer y la porción TATA del promotor CYC1 se fusionan a lacZ. Ambas GAL1 UAS y GAL4 17-mers responden al activador transcripcional GAL4. Además, la cepa HF7c porta el reportero HIS3 fusionado a las porciones UAS y TATA del promotor GAL1. iii) Clonación de TRAF2 humano El TRAF2 humano se clonó por RCP a partir de un banco de ADNc HL60 (para la secuencia TRAF2 y otros detalles, véase Rothe y otros, 1994; Rothe y otros, 1995a; Cheng y otros, 1996; Hsu y otros, 1996; y Wallach, 1996). Los iniciadores utilizados fueron: a) iniciador frontal 30-mer CAGGATCCTCATGGCTGCAGCTAGCGTGAC (SEC ID NO:1 ) que corresponde a la secuencia de codificación de hTRAF2 partiendo del codón para la primera metionina (subrayada) e incluyendo un entrelazador con el sitio BamHl. b) iniciador inverso 32-mer GGTCGACTTAGAGCCCTGTCAGGTCCACAATG (SEC ID NO:2) que incluye el codón de detención de genes de hTRAF2 (subrayado) y un sitio de A__L+ ? AÍ_U__*_ ._+_*_ *. restricción Salí en su entrelazador. El programa de RCP comprendido de un paso de desnaturalización inicial de 2 minutos a 94°C seguido por 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 64°C, 1 min y 40 seg. A 72°C. El TRAF2 humano amplificado se insertó luego en los sitios BamHI-Sall del vector pGBT9 junto con el dominio de unión de ADN GAL4. iv) Tamiz de dos híbridos del banco células B El tamiz de dos híbridos es una técnica (véase detalles en las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas antes) usadas con el fin de identificar factores que están asociados con una molécula particular que sirve como una "carnada". En la presente invención TRAF2 que se clonó en el vector pGBT9, sirvió como la carnada. TRAF2 se co-expresó junto con el banco de ADNc de células B tamizados en la cepa de levadura HF7c. El TRAF2 clonado por RCP fue una fusión recombinante con el dominio de unión al ADN de CAL4 y el banco de ADNc tamizado se fusionó al dominio de activación GAL4 en el vector pSE1107. El gen reportero en HF7c se fusionó al HIS3 a la secuencia de activación corriente arriba (UAS, por sus siglas en inglés) del promotor GAL1 que responde al activador transcripcional GAL4. Los transformantes que contuvieron ambos plásmidos pGBT9 y pSEI107 se seleccionaron para el crecimiento en placas sin triptofano y leucina. En un segundo paso lo los clones positivos que expresaron dos proteínas de híbridos que interactúan entre ellos, y por lo tanto GAL1-HIS3 activado, se seleccionaron de placas libres de triptofano, leucina e histidina y contuvieron* ? ?r 50 mM de 3-aminotriazol (3AT). v) Análisis de 3-qalactosidasa Los clones positivos elegidos en el tamiz de dos híbridos se sometieron a la prueba de color de lacZ en células de levadura SFY526, siguiendo el manual de Clontech Laboratories (para detalles véase las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas antes). En resumen, los transformantes se dejaron desarrollar a 30°C durante 2-4 días hasta alcanzar aproximadamente 2 mm de diámetro, luego se transfirieron en filtros Whatman. Los filtros se sometieron a tratamiento de congelación/descongelación con el fin de permeabilizar las células, luego se remojaron en una solución reguladora (16.1 mg/ml de Na2HPO 7H2O; 5.5 mg/ml de NaH2PO4 H2O; 0.75 mg/ml KCl; 0.75 mg/ml de MgSO4 7H2O, pH=7) conteniendo 0.33 mg/ml X-gal y 0.35 mM ß-mercaptoetanol. Las colonias se monitorearon para el desarrollo de color azul que es un indicio de inducción de ß-galactosidasa. vi) Expresión de ADNc clonado Se construyeron dos clases de vectores de expresión: a) Vectores basados en pUHD10-3 conteniendo el marco de lectura abierto (ORF) de IREN en fusión con el epítope de hemaglutinina (HA). b) Un vector con base en pUHD10-3 en el cual se introdujo la secuencia de octapéptido de FLAG justo en frente de TRAF2 clonado, nombrado FLAG/B6/TRAF2. Las construcciones que contienen un ORF o IREN se 5 transfectaron en el clon HtTAI de las células HeLa (para estas células ver Gosen, M. y Bujard, M. (1992)) ya sea solos o cotransfectados con FLAG/B6/TRAF2 usando un método de calcio-fosfato normal (Método en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel, F.M y otros). 10 vii) Análisis de Luciferasa Células transfectadas normalmente 5x105 se recopilaron lavando tres veces con PBS frío y resuspendiendo en 400 µl de solución reguladora de pH de extracción (0.1 M K2HP?4/KH2PO4 pH+7.8, 1 mM DTT). La lisis de las células se logró congelando tres veces en nitrógeno líquido y 15 descongelando. Se retiraron desechos celulares por la centrifugación (5 minutos a 10,000 x g). Para el análisis de luciferasa, se agregaron a la solución 200 µl de solución reguladora de luciferasa (25 mM de glicilglicina, 15 mM de K2HP?4 KH2PO4 pH=7.8, 15 mM de MgSO4, 4 mM EGTA, 2 mM D- luciferina, 25 mM glicilglicina, 1 mM DTT. La actividad de luciferasa se 20 determinó leyendo la emisión de luz usando un luminómetro Lumitron fijado en integración de 10 segundos (ver publicaciones anteriores y solicitudes de patentes para detalles adicionales). _m- & EJEMPLO 1 : Clonación de IREN y prueba de dos híbridos Un banco de ADNc preparado de células B se tamizó para proteínas que se asocian con TRAF2, usando la técnica de dos híbridos como se describió en Materiales y Métodos (iv). Solamente en transformantes que expresaron TRAF2 y una proteína capaz de interactuar con el mismo, el dominio de unión a ADN de GAL4 y el dominio de activación transcripcional se unieron. El resultado fue la activación y expresión del gen reportero, en este caso HIS3 fusionado a UAS y la porción TATA del promotor GAL1. El tamiz dio aproximadamente 2000 clones, que fueron capaces de crecer en placas de Trp-, Leu-, His-3AT. El ADN preparado de 165 clones positivos seleccionados aleatoriamente sirvieron para cotransfección temporal de cepa de levadura SFY526 junto con TRAF2 clonado en vector pGBT9. El análisis para la actividad de ß-galactosidasa se llevó a cabo en las colonias de levadura SFY526 transformadas como se describió en Materiales y Métodos (v). El color azul que se desarrolló fue una indicación para colonias de levadura que contienen ADNc que codifica una proteína o polipéptido que se une a TRAF2. Se identificaron 6 clones independientes los cuales codificaron la proteína novedosa IREN por su capacidad de desarrollarse en placas de 3AT y de inducir LacZ medido en la prueba de color. De todos los clones positivos revisados, dos fueron ADNc que codifica para proteínas conocidas; j Í S,.¿ ^lA¿fei.t . . =^| | | r| 1. -[r |rr..,^ ,, ,¿ „ „ . . ^,. ..1_. _,.._ .^,.__._^.^^ a. _^_,í__ el propio TRAF2 que es capaz de autoasociarse y formar homodímeros y el receptor beta linfotoxina cuyos dominios intracelulares mostraron que se unen a TRAF2. Los clones positivo se analizaron además en una prueba de especificidad de unión, a saber,, se analizaron para su interacción con carnadas irrelevantes. Como se muestra en el Cuadro II, IREN reacciono solo con TRAF2 y TRAF1 y no se unió a uno de un número de proteínas irrelevantes analizadas tales como lamina, y Cyclin D. IREN no se unió al dominio ¡ntracelular de los receptores de TNF p55 y p75, MORT, NIK, mutante NIK L400, ni A20. Con el fin de estrechar la región en la molécula TRAF2 que interactúa con IREN, se hicieron dos construcciones adicionales. Una construcción comprendiendo la parte N-terminal de la molécula TRAF2, aminoácidos 1 a 224 designados RING ?_2 comprendiendo los motivos del dedo de anillo y el dedo de zinc. La segunda construcción incluyó solamente la parte C-terminal de TRAF2, aminoácidos 225-501 , cubriendo el "dominio de TRAF" así como 42 aminoácidos adicionales. Estas dos construcciones se usaron como carnadas en pruebas de son híbridos. Los resultados muestran claramente que IREN no interactúa con la construcción que comprende los aminoácidos 1 a 224 de la molécula TRAF2, sin embargo, se unieron a la construcción C-terminal que comprende el "dominio de TRAF" con la misma eficiencia con la que se unen a la longitud completa de TRAF2 (Cuadro II). El análisis de supresión demostró que la región de unión de TRAF2 en IREN y sus isoformas se confinó a la región entre los aminoácidos 198 y 388 de los mismos (Cuadro II).

CUADRO II.

El marco de lectura abierto de ADNc de IREN codifica una proteína de 541 aminoácidos. El ADNc también contiene un UTR'3 corto así como un poli(A) (Fig. 3A y 3B).

Se encontró que el dominio 5' del marco de lectura abierto de IREN (ORF) contiene una región que es homologa a otra proteína conocida (ID: U73941 , clonado en un tamiz de 2 híbridos para proteínas de unión de Rap2 (Janoueix-Lerosey 1 y otros 1988) así como a proteínas desconocidas adicionales encontradas en las bases de datos: dos genes humanos (K1AA0871 , K1AA0842) y un gen de C. elegans (ID CAA21666). Se encontró que la secuencia de IREN contiene una secuencia de péptidos [IDSLSL 326-331] que también está presente dentro del dominio de 51 aminoácidos que se extiende de 769 a 820 aminoácidos de NIK que es esencial para la unión de IKK-1 con NIK en un análisis de 2 híbridos y la activación de NF-?B por la sobreexpresión de NIK (datos no mostrados).

EJEMPLO 2: Estudios adicionales y características funcionales de IREN El ADNc de IREN fusionado con un epítope de HA se expresó en 293 líneas celulares de embrión humano usando un vector con base en pcADN3 que contienen el ORF de IREN en fusión con el epítope de hemaglutinina (HA). Luego se inmunoprecipitó IREN con anticuerpos anti HA. Las células se transfectaron con la proteína de fusión de IREN-HA usando un método de calcio-fosfato normal (Método en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel. F.M y otros). Después se desarrollaron células durante 24 horas en Medio de Eagle Modificado con Dulbecco (DMEM, por su siglas en inglés) más 10% de suero de becerro. Al final del tiempo de incubación, se usaron células en solución reguladora de pH de precipitación radioinmune (10 mM Tps-HCI, pH 7 5, 150 mM NaCI, 1 % Nonident P-40, 1 % desoxicolato, 0.1 % SDS y 1 mM EDTA; 1 ml/5x105 células), y el lisato se aclaró previamente por incubación con antisuero de conejo irrelevante y perlas de G-Sepharose de Proteína (Pharmacia, Sweden). La inmunoprecipitación se llevó a cabo por incubación de 1 hora de alícuotas a 4°C del lisato con anticuerpos monoclonales apti-HA (clon 12CA5 (Field, J. y otros, 1988)). La proteína codificada por IREN aparece así como una banda de aproximadamente 60kDa. Se realizaron estudios del efecto de IREN sobre activación de NF-?B usando el análisis del gen reportero. 293 células de EBNA se co-transfectaron con el vector pcADN-3 conteniendo IH LTR ligado al gen reportero de luciferasa, junto con el plásmido de pcADN3 que contienen ADNc de IREN solo, o con un plásmido de pcADN3 que contiene el ADNc que codifica las siguientes proteínas; IKK-1 , NEMO de longitud completa, supresión C-terminal de NEMO, NIK, mutante deficiente en cinasa de NIK (NIKmut), una mutante de supresión C terminal de IREN (IRENM97) O una mutante de supresión N-terminal de IREN La transfección se realizó usando un método de calcio-fosfato normal (Método en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel, F.M. y otros) como se describió en Materiales y Métodos (vii) anteriores tJ AJJ.Ll>fai,t. JM^?..> m ______________ß___________________ . ^UH________ á???__ .. :.,. - ^.. ...__.?_^_. ,I._.

En co-transfección con IKK-1 de munnos, un sustrato conocido para la actividad enzimática de NIK (Regnier CH, y otros 1997), se encontró que IREN humano induce eficientemente NF-?B en 293 células como se determinó por el análisis de luciferasa (véase Fig.10) La co-transfección de una mutante de supresión C-terminal de NEMO (aminoácidos de C?NEMO 1-309) que es capaz de bloquear la actividad enzimática de IKK (Rothwarf DM y otros 1998), se encontró que inhibe NF-?B inducido por la cotransfección por IREN e IKK1 (Fig. 10). La actividad de NF-?B inducida por la co-transfección de IREN e IKK1 fue comparable con la inducida por la co-expresión de NEMO e IKK1 de tamaño completo, NEMO no fue capaz de potenciar más NF-?B inducida por IREN e lKKI (Figura 10). A diferencia de C?NEMO, la cotransfección por una mutante deficiente de cinasa de NIK (NIKmut, aminoácidos (véase solicitud de patente copendiente de copropiedad WO 97/37016, Malinin y otros, 1996) no fue capaz de bloquear la inducción de NF-?B por cotransfección de IREN e IKK (Fig. 10). El IREN co-expresado a una relación de 2:1 veces con ADN de NIK potencia efectivamente la inducción de NF-?B. La co-expresión de NEMO de tamaño completo con NIK bloquea NF-?B inducido por lo último. Esta inhibición podría invertirse por la expresión de IREN (Fig. 10). Como se mostró antes (véase la solicitud de patente copepdiente de copropiedad WO 7/37016, Malinin y otros 1996) NIKmut bloquea efectivamente NF-?B inducido por la sobre-expresión de CD120a. Este efecto no se alteró por la co-expresión de IREN (Fig. 10). Tomados juntos, los datos mencionados antes conducen a la sugerencia de que IREN actúa dentro de la ruta de señalamiento de NF-?B, actuando corriente abajo de NIK pero corriente arriba para NEMO y IKK1 y podría ser un modulador de la interacción entre NIK e IKK1. Por lo tanto se hipotetizó que alguna mutante de supresión de IREN puede interferir con el flujo de señal de la cinasa de NIK al complejo de NEMO-IKK. La mutante de supresión C terminal IRENM97 no tuvo ningún efecto sobre la activación de NF-?B inducida por NIK (datos no mostrados). Sin embargo se inhibió profundamente una mutante de supresión N-terminal de IREN (IREN?N; IREN?94-s ?) inhibió profundamente NF-?B inducido por NIK, al grado comprable con el de NEMO (Fig. 10).

EJEMPLO 3: Análisis de Cinasa Se transfectaron 293 células T (2x106) con CHUK pcFLAG (que codifica IKK1 de mupnos) solo o en combinación con pcNIK, pc20.4 (que codifica la proteína NEMO) o pcHIS-IREN (que codifica IREN marcado con His), o pcHIS-IREN?N (pcpiS-IREN^.^ que codifica mutante de supresión N terminal marcada con His de IREN que actúa como una negativa dominante). Se recogieron células 24 horas después de transfección, se lisaron en ¡t i I M iii iiilíitili ¡ílüilfiiii ni • • **'"• ••-- » •--- - . ^ +.-..**** ^**»* H* ?____v_ _^ solución reguladora de hsis conteniendo 1 % NP-40, 50 mM Hepes pH -7.5, 100 mM NaCI, 10% de glicerol, 1 mM EDTA, 20 mM de b-glicerofosfato, 20 mM PNPP, 1 mM Na3VaO4, 1 mM NaF, 1 mM Na-metabisulfito, 1 mM bezamidina, 1 mM DTT, inhibidores de proteasa "completos" (Boehringer). Después se removieron los desechos celulares por centrifugación. Después de la adición de NaCI hasta 250 mM, se inmunoprecipitaron proteínas con anticuerpos anti-FLAG monoclonales, se lavaron vigorosamente en solución reguladora de pH de lavado conteniendo solución reguladora de lisis con 0.1 % de NP-40 y 250 mM de NaCI, y se eluyeron con 30 µl de solución reguladora de lavado que contienen 1 mg/ml de péptido de FLAG. Las alícuotas de los eluatos se usaron para las reacciones de cinasa in vitro con GST-l?B producido de E. coli como sustrato, en presencia de 32P-gamma ATP en solución reguladora de pH de cinasa conteniendo 50 mM de ß-glicerofosfato, 2 mM de DDT, 20 mM de MgCI2, 1 mM de Na3VaO , 1 mM de EDTA/EGTA. Las reacciones se separaron pos SDS-PAGE y se detectó la fosforilación de proteínas después de la exposición a película de rayos X. Como control, se determinó la cantidad de proteína en el lisato por el análisis de manchas Western con anticuerpo anti FLAG. La sobre-expresión de IKK1 y NEMO, pero no de IKK1 solo, induce la actividad de cinasa robusta de IKK1 (como se evaluó por autofosfori lación y fosforilación de la proteína de fusión GST-lkappaB producida por E. coli). La coexpresión de con IKK1 y NEMO da ?Á- k t-AA l. como resultado una disminución importante en la actividad (Fig. 11 ) sin afectar el nivel de expresión de IKK1 y NEMO. IREN de tamaño completo no tiene dicho efecto (Fig. 11 línea media).

EJEMPLO 4: Clonación y secuenciación de IREN-10B v IREN-E Con el fin de identificar variantes divididas de IREN, un banco de ADNc de fagos derivado de la línea celular MCF7 mencionada antes se tamizó con las primera 600 pb de IREN como sonda. Dos clones independientes se identificaron, los cuales parecen ser dos variantes diferentes de IREN. Estos dos clones son idénticos a IREN en sus primeros 1595 pb 5' y tienen secuencias de codificación adicionales en el extremo 3 prima. Esta región contiene un dominio PX - un dominio conservador de función desconocida (presumiblemente un dominio de interacción de proteína-proteína) que también se encuentra en algunas moléculas de señalamiento, incluyendo P13-cinasa. En el clon 10B y el clon E, el dominio PX se flanquea por dos regiones idénticas cortas. La región corriente abajo de estas regiones es diferente en los dos clones. Para comparación de las dos variantes de separación a IREN ver Fig. 9. La secuenciación provisional de UTR 5-prima (del inicio de la secuencia hacia el primer ATG con secuencia Kozak) indicó que estas secuencias fueron idénticas en IREN y en IREN-10B e isoformas IREN-E. _____?A___?. ___*^^ . »? ^. ....^_^______^M .* , ..«n.«„ ..«*^ La región de unión de TRAF2 se mapeo a IREN?98-388, que es idéntica en las tres isoformas de separación mostradas (Fig. 9). Consecuentemente, IREN 10B también interactuó con TRAF2 en el análisis de dos híbridos Aunque no se observó una auto-asociación de IREN, IREN 10B se autoasoció en la prueba de dos híbridos, mientras que no interactuó con IREN (Cuadro II). Una mutante de supresión de IREN 1-B que carece del dominio PX, pero incluyendo un motivo de espiral enrollado no presente en IREN, también fue capaz de auto-asociarse. Esto indica que este dominio de serpentín enrollado es responsable de la auto-interacción de IREN 10B.

EJEMPLO 5: Proteínas que interactúan con IREN 10B e IREN Un banco de células B se tamizó con IREN 10B usando el sistema de dos híbridos de levadura como se describió antes para identificar proteínas adicionales que interactúan con IREN 10B. Tres de dichas proteínas se identificaron, las cuales interactuaron fuerte y específicamente con IREN 10B: 1 ) La subunidad mu 1 de la proteína de ensamble clathna 2 *ÁP50, CLAPM1 , números de acceso al banco de genes U36188), que interactuó fuertemente con IREN 10B, pero solo débilmente con IREN 2) El gen de FB1 o Amida, que interactuó fuerte y específicamente con IREN 10B y con IREN. Este gen inicialmente se identificó como una secuencia fusionada el gen E2A en células de leucemia pre-B de la niñez (Brambillasca y otros, Leukemia 13(3), 369-375, 1999). Recientemente se mostró que induce la apoptosis por la sobre-expresión. Se localiza en el núcleo y está implicado en la traslocación nuclear de un gen temprano inmediato específico para neuronas llamado Are (Irie y otros, J. Biol. Chem 275, (2000) 2647-2653). 3) El gen TRAX, que interactuó fuertemente con IREN 10B, pero solo muy débilmente con IREN. Este gen es altamente homólogo a la proteína Translin de unión de ADN y puede estar implicada en la localización nuclear de Translin (Aoki y otros, FEBS Lett 401 , 109-112, 1997). En vista del hecho de que IREN 10B ¡nteractúa fuerte y específicamente con las proteínas anteriores, IREN por lo tanto puede ser activa para controlar el trafico de proteínas señaladores, v.gr., TRAF-2.

EJEMPLO 6: IREN 10B interactúa fuertemente con una cinasa no identificada que fosforila IREN 10B IREN 10B así como IREN, fusionada con la etiqueta 6-His N- terminal se expresó en 293 células T por transfección temporal. Las proteínas se purificaron 24 horas después de la transfección por ipmunoprecipitación.

Los inmunoprecipitados se sometieron a PAGE y se inmunotiñeron con anticuerpos anti-His mostrando que ambas proteínas se expresaron a un grado similar. Las reacciones de cinasa se realizaron con ambos inmunoprecipitados. La proteína IREN 10B sufrió fosforilación fuerte mostrando que esta proteína se asoció con cinasa no identificada cuyo sustrato es IREN 10B. La propia IREN solamente se fosforiló débilmente, posiblemente por cinasas unidas no específicamente. Esto indica que la cinasa anterior interactúa con las secuencias C-terminales de IREN 10B, posiblemente su domino PX (Figura 12).

EJEMPLO 7: IREN parece ser un miembro de una familia de genes La investigación de BLAST del banco de genes disponible recientemente que contienen la mayoría de la secuencia del genoma humano recién completado revelo que por lo menos copias parciales del gen IREN así como una isoforma muy estrechamente relacionada con 97-98% de identidad en el nivel de nucleótidos ocurre en vario lugares en 5 cromosomas, con estructura de exones conservada. Los exones 4-7 de las dos isoformas, que codifican los aminoácidos 113-406 (corresponden a los nucleótidos 559-759 de las secuencias en la figura 3B, 4, y 5 [SEC ID NO:4, SEC ID NO: 5, y SEC ID NO:6, respectivamente}) y por lo tanto los dominios de unión de TRAF2, se encontró que se conservaron en 4 cromosomas diferentes, mientras que se detectaron exones adicionales en solo uno o dos de los cromosomas Estos datos podrían indicar que las variantes de IREN se expresaron en varios tamaños con diferentes extensiones N y C terminales como molécula que regulan las rutas de señalamiento que dependen de TRAF1 o TRAF2 (Figura 13A) El examen del banco de datos EST por BLAST reveló que por lo menos partes de IREN se expresan en una forma altamente conservada en ratones y carne de res. Los EST que corresponden a ambas isoformas del gen IREN, una descrita en esta patente así como la encontrada en otros lugares cromosomales mencionados antes se encuentran en el banco de genes EST, demostrando que ambas ¡soformas estrechamente relacionadas son genes activos (Figura 13B).

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Ltd wallach, David Mal i ni n, Nikolay Sinha, Indranil Leu, Stefan <120> PROTEINA IREN, SU PREPARACIÓN Y SU USO <130> 399 <150> 131719 <151> 1999-09-02 <160> 9 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Secuencia de ADN Sintética < <440000>> 11 3Q caggatcctc atggctgcag ctagcgtgac <210> 2 <211> 32 <212> ADN <¿ 15> Secuencia Artificial <400> 2 32 ggtcgactta gagccctgtc aggtccacaa tg <210> 3 <211> 143 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 ggtaccgagc tcggatccac tagtaacggc cgccagtgtg ctggaattct gcggatgtac 60 ccatacgatg ttccagatac gctgaatttc gaggccacga aggccggcgg cgcggcgcag 120 gcaccggccc ggggagaggc acc 143 <210> 4 <211> 1782 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 atgagcggat cacagaacaa tgacaaaaga caatttctgc tggagcgact gctggatgca 60 gtgaaacagt gccagatccg ctttggaggg agaaaggaga ttgcctcgga ttccgacagc 120 agggtcacct gtctgtgtgc ccagtttgaa gccgtcctgc agcatggctt gaagaggagt 180 cgaggattgg cactcacagc ggcagcgatc aagcaggcag cgggctttgc cagcaaaacc 240 gaaacagagc ccgtgttctg gtactacgtg aaggaggtcc tcaacaagca cgagctgcag 300 cgcttctact ccctgcgcca catcgcctca gacgtgggcc ggggtcgcgc ctggctgcgc 360 tgtgccctca acgaacactc cctggagcgc tacctgcaca tgctcctggc cgaccgctgc 420 aggctgagca ctttttatga agactggtct tttgtgatgg atgaagaaag gtccagtatg 480 cttcctacca tggcagcagg tctgaactcc atactctttg cgattaacat cgacaacaag 540 gatttgaacg ggcagagtaa gtttgctccc accgtttcag acctcttaaa ggagtcaacg 600 cagaacgtga cctccttgct gaaggagtcc acgcaaggag tgagcagcct gttcagggag 660 atcacagcct cctctgccgt ctccatcctc atcaaacctg aacaggagac cgaccccttg 720 cctgtcgtgt ccaggaatgt cagtgctgat gccaaatgca aaaaggagcg gaagaagaaa 780 aagaaagtga ccaacataat ctcatttgat gatgaggaag atgagcagaa ctctggggac 840 gtgtttaaaa agacacctgg ggcaggggag agctcagagg acaactccga ccgctcctct 900 gtcaatatca tgtccgcctt tgaaagcccc ttcgggccta actccaatgg aagtcagagc 960 agcaactcat ggaaaattga ttccctgtct ttgaacgggg agtttgggta ccagaagctt 1020 gatgtgaaaa gcatcgatga tgaagatgtg gatgaaaacg aagatgacgt gtatggaaac 1080 tcatcaggaa ggaagcacag gggccactcg gagtcgcccg agaagccact ggaagggaac 1140 Í ÁÍL? 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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una secuencia de ADN que codifica una proteína capaz de unirse a TRAF seleccionado del grupo que consiste de: (a) una secuencia de ADNc de la IREN designada en la presente, que comprende la secuencia de nucleótidos descrita en la Figura 3; (b) una secuencia de ADNc de la isoforma designada en la presente, IREN-10B comprendiendo la secuencia de nucleótidos descrita en la figura 4; (c) una secuencia de ADNc de la isoforma designada en la presente IREN-E comprendiendo la secuencia de nucleótidos descrita en la figura 5; (d) un fragmento de una secuencia (a)-(c) que codifica una proteína biológicamente activa capaz de unirse a por lo menos los residuos 225-501 de la secuencia de aminoácidos de TRAF2; (e) una secuencia de ADN capaz de hibridizarse a una secuencia de (a)-(d) bajo condiciones moderadamente estrictas y que codifica una proteína biológicamente activa capaz de unirse a por lo menos los residuos 225-501 de la secuencia de aminoácidos de TRAF2; (e) Una secuencia de ADN capaz de hibridizarse a una secuencia de (a)-(d) bajo condiciones moderadamente estrictas y que codifica una proteína biológicamente activa capaz de unirse por lo menos a los residuos 225-501 de la secuencia de aminoácido de TRAF2; (f) Una secuencia de ADN, que se degenera como resultado del código genético a las secuencias de ADN, definidas en (a)-(e) y que codifica úMb^±M?iik . i , - Miüllf ti tr -r ttíürt i una proteína biológicamente activa capaz de unirse por lo menos a los residuos 225-501 de la secuencia de aminoácidos de TRAF2.

2. Una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque las secuencias de ADNc designadas en la presente IREN e IREN-1 OB e IREN-E.

3. Una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada además porque codifica una proteína que modula la actividad de NF-?B.

4. Una secuencia de ADN' de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque se selecciona de las secuencias ontenidas en IREN de ADNc designada en la presente.

5. Una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende la secuencia de ADN que codifica la proteína IREN (como se definió en la presente).

6. Una secuencia de ADN de conformidad con la proteína IREN, isoformas fragmentos o análogos de la misma, la IREN, isoformas, fragmentos o análogos de la misma siendo capaces de unirse a TRAF2 y de modular la actividad de NF-?B.

7. Una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque se selecciona del grupo que consiste de: a) una secuencia de ADNc derivada de la región de codificación de una proteína IREN nativa; b) Secuencias de ADN capaces de hibridización a una secuencia de (a) bajo condiciones moderadamente estrictas y que codifican una IREN biológicamente activa; y c) Secuencias de ADN, que se degeneran como resultado del código genético a las secuencias, definidas en (a) y (b) y que codifican una proteína IREN biológicamente activa.

8. Una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizada porque comprende por lo menos parte de la secuencia descrita en la figura 3 y que codifica por lo menos una proteína IREN activa, isoforma, análogo o fragmento.

9. Una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque codifica una proteína IREN, isoforma, análogo o fragmento que tiene por lo menos parte de la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 6.

10. Un vector caracterizado porque comprende una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -9.

11. Un vector de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque es capaz de expresarse en una célula huésped eucariótica.

12. Un vector de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque es capaz de expresarse en una célula huésped procariótica.

13. Las células huésped eucariótica o procariótica transformadas que contienen un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12. liUAAl<.4^ÉLfamiálMlu....J.^a^...-.t^ .. _ ..í.... ...... .. -1^^T^ttto^»^M^jiJJa-^aJ^a»J--^-a*-lJ. atA.Í.,1 ,

14. Una proteína IREN, isoformas, fragmentos, análogos o derivados de la misma, codificada por una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, dicha proteína, isoformas, fragmentos, análogos y derivados de la misma siendo capaz de unirse a por lo menos la porción de la proteína TRAF2 entre los aminoácidos 225-501 o TRAF2.

15. Una proteína de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la proteína codificada por el clon 10B designado en la presente.

16. Una proteína, isoformas, fragmentos, análogos y derivados de los mismos de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque la proteína IREN, isoformas, análogos, fragmentos y derivados de la misma codificada por la secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -9.

17. Una proteína IREN, isoformas, análogos, fragmentos y derivaos de la misma de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la proteína, isoformas, fragmentos y derivados tienen por lo menos parte de la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 6.

18. Un método para producir una proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-16, caracterizado porque comprende desarrollar una células huésped transformada de acuerdo con la reivindicación 16 bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma efectuando modificación post-traslacional, según sea necesario, para obtener la proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, aislando dicha proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado expresada

19. Anticuerpos o fragmentos activos o derivados de los mismos, específicos para la proteína IREN, ¡soforma, análogo, fragmento o derivado de los mismos de conformidad con la reivindicación 14 ó 15; o específico para la proteína IREN, ¡soforma, análogo, fragmento o derivado déla misma de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17.

20. Un método in vitro para la modulación o mediación en células de la actividad de NF-?B o cualquier otra actividad de señalamiento intracelular modulada o mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las cuales una proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 se une, dicho método comprendiendo tratar las células introduciendo dichas células a una o más de la proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma en una forma adecuada para la introducción intracelular de la misma, o introduciendo en las sellas una secuencia de ADN que codifica una o más proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma en forma de un vector adecuado que porta la secuencia, el vector siendo capaz de efectuar la inserción de la secuencia en las células en una forma tal que la secuencia se expresa en las células. ÍÁA?A?¡ásL ,¿L?Íá

21. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el tratamiento de células comprende introducir en las células una secuencia de ADN que codifica la proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado en forma de un vector adecuado que porta la secuencia, el vector siendo capaz de efectuar la inserción de la secuencia en las células en una forma que la secuencia se expresa en las células. 22. Un método de conformidad con la reivindicación 20 ó 21 , caracterizado además porque el tratamiento de las células es medíante transfección de las células con un vector de virus animal recombinante comprendiendo los pasos de: (a) construir un vector viral animal recombinante que porta una secuencia que codifica una proteína de superficie viral (ligando) que es capaz de unirse a un receptor de superficie celular específica sobre la superficie de dichas células que será tratado y una segunda secuencia que codifica dichas isoformas de proteína IREN, análogos, fragmentos y derivados de acuerdo con la invención, que cuando se expresan en dichas células es capaz de modular/mediar la actividad de NF-?B o cualquier actividad de señalamiento intracelular modulada/mediada por TRAF2 u otras de dichas moléculas; y (b) infectar dichas células con dicho vector de (a). 23. Un método para modular el efecto modulado/mediado por

TRAF2 en células que comprende tratar dichas células con los anticuerpos o fragmentos activos o derivados de los mismos, de conformidad con la reivindicación 19, el tratamiento siendo mediante la aplicación de una

JLiAjia A.m , [| [ Mait-" --'-"— - — - - - »••-- -- .. ,^,^&^.^^ .^A.^^..-, .*. - .- *Ai composición adecuada que contiene dichos anticuerpos, fragmentos activos o derivados de los mismos a dichas células, en donde cuando la proteína IREN o porciones de los mismos de las células se exponen en la superficie extracelular, dicha composición se formula para aplicación extracelular, y cuando la proteína IREN es intracelular, la composición se formula para aplicación intracelular.

24. Un método para modular el efecto modulado/mediado por TRAF2 en células que comprenden tratar a las células con una secuencia de oligonucleótidos que codifican una secuencia de contrasentido por lo menos para parte de la secuencia de ADN que codifica la proteína de IREN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, esta secuencia de oligonucleótidos siendo capaz de bloquear la expresión de la proteína IREN.

25. Un método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha secuencia de oligonucleótidos se introduce en las células vía un virus de conformidad con la reivindicación 22, en donde la segunda secuencia del virus codifica dicha secuencia de oligonucleótidos

26. Un método para modular el efecto modulado/mediado por TRAF2 en células que comprende la aplicación del procedimiento de ribozima en la cual un vector que codifica una secuencia de ribozimas capaz de interactuar con una secuencia de ARNm que codifica la proteína IREN, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, se introduce en dichas células en una forma que permite la expresión de la secuencia de ribozima en las células y en donde la secuencia de ribozima se expresa en las células interactúa con la secuencia de ARNm celular y separa la secuencia de ARNm que resulta de la inhibición de la expresión de la proteína IREN en dichas células.

27. Un método para aislar e identificar proteínas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, capaces de unirse directamente a TRAF2, comprendiendo aplicar el procedimiento de dos híbridos de levadura en el cual una secuencia que codifica TRAF2 se porta por un vector híbrido y secuencia de un ADNc o banco de ADN genómico se pota por el segundo vector híbrido, los vectores siendo usados para transformar células huésped de levadura y las células transformadas positivamente siendo aisladas, seguido por extracción de dicho segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica una proteína que se une a dicho TRAF2.

28. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, caracterizado además oque la proteína es IREN o por lo menos una de las isoformas de IREN, análogos, fragmentos y derivados de la misma.

29. Una composición farmacéutica para la modulación del efecto modulado/mediado por TRAF2 sobre las células comprendiendo, como ingrediente activo, por lo menos una proteína IREN, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, sus fragmentos, análogos, derivados biológicamente activos o mezclas de los mismos. il -J? í?ilÜiiTl ii nlüjii "• ' TG r ^^ ¿¿¿ Á lid- - eí tt'rr'*t'-tj-"ffí '"? •** afa*i-> '

30. Una composición farmacéutica para la modulación del efecto modulado/mediado por TRAF2 sobre las células comprendiendo, como ingrediente activo, un vector de virus animal recombinante que codifica una proteína capaz de unirse a un receptor de superficie celular y que codifica por lo menos una proteína IREN, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17.

31. Una composición farmacéutica para modular el efecto modulado/mediado sobre las células comprendiendo como ingrediente activo, una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia de contrasentido de la secuencia de ARNm de la proteína IREN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

32. Una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de una condición patológica asociada con la inducción de NF-?B o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las cuales se une una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, dicha composición comprendiendo una cantidad efectiva de una proteína codificada por IREN-10B o una molécula de ADN que codifica para lo mismo, o una molécula capaz de alterar la interacción de la proteína codificada por IREN-10B con TRAF2 o cualquier otra molécula a la cual se une una proteína codificada por IREN-10B.

33. Una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de una condición patológica asociada con la inducción de NF-?B o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las cuales se une una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, dicha composición comprendiendo una cantidad efectiva de una proteína IREN, isoforma, fragmento análogo o derivado de la misma, o una molécula capaz de alterar la interacción de la proteína IREN, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma con TRAF2 o cualquier otra molécula a la cual se une una proteína IREN, isoforma, fragmento, análogo o derivado.

34. Una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de una condición patológica asociada con la inducción de NF-?B o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las cuales se une una proteína IREN, la composición comprendiendo una molécula capaz de interferir con la actividad de la proteína IREN.

35. Una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de una condición patológica asociada con la inducción de NF-?B o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las cuales se une una proteína codificada por IREN-10B de acuerdo con la reivindicación 15, dicha composición comprendiendo una cantidad efectiva de una proteína codificada por IREN-10B o una molécula de ADN que codifica la misma, o cualquier molécula a la cual se une la proteína codificada por IREN-10B.

36. Una composición farmacéutica par ala prevención o tratamiento de una condición patológica asociada con la inducción de NF-?B o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las Í?_.ÍA. ?^ ., ... ^ , . «E-JÜi cuales se une una proteína IREN, isoforma, fragmento, análogo o derivado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, dicha composición comprendiendo una cantidad efectiva de una proteína IREN, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, o una molécula de ADN que codifica a la misma, o una molécula capaz de alterar la interacción de la proteína IREN, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma con TRAF2 o cualquier otra molécula a la cual se une dicha proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado.

37. El uso de una proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, o una molécula de ADN que codifica las mismas, o una molécula capaz de alterar la interacción de la proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado, con TRAF2 o cualquier otra molécula a la cual se une dicha proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma o una mezcla de cualquiera de las mismas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 para la elaboración de un medicamento para la prevención o tratamiento de una condición patológica asociada con la inducción de NF-?B o con cualquier otra actividad mediada por TRAF2 o por otras moléculas a las cuales se une proteína, isoforma, análogo, fragmento o derivado, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17.

38. El uso como se reclama en la reivindicación 37, en donde dicha proteína se codifica por IREN. LSÉij jÍ^i^ - --- ^fe=--^Ai-Í--É?ife &ft^-*^t ..^-^^».^^-&i. .._, _. ..._._^ __ &_.__&. ^.. _. _..___^_^__¿..*__ _____ _ .*'.^-^- ^___^_^^ a'liA.Itlil-Ilfrl

39. El uso como se reclama en la reivindicación 37, en donde dicha proteína es IREN.

40. Un método para tamizar un ligando capaz de unirse a una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado además porque comprende poner en contacto una matriz de cromatografía de afinidad a la cual se une dicha proteína con un extracto celular por lo que el ligando se une a dicha matriz, y eluyendo, aislando y analizando dicho ligando.

41. Un método para tamizar una secuencia de ADN que codifica un ligando capaz de unirse a una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 comprendiendo aplicar el procedimiento de dos híbridos de levadura en el cual una secuencia que codifica la proteína se pota por un vector híbrido y se portan secuencias de un ADNc o banco de ADN genómico por el segundo vector híbrido, transformando las células de huésped de levadura con los vectores, aislando las células transformadas positivamente, y extrayendo el segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica dicho ligando.

42. Un método para identificar y producir un ligando capaz de modular la actividad celular modulada/mediada por TRAF2 caracterizado porque comprende: a) Tamizar un ligando capaz de unirse a un polipéptido comprendiendo por lo menos una porción de TRAF2 que tiene los residuos de aminoácidos 225-501 de TRAF2; b) identificar y caracterizar un ligando, diferente a TRAF2 o porciones de un receptor de la familia de receptores de TNF/NGF, encontrado por el paso de tamizado que es capaz de dicha unión; y c) producir el ligando en forma sustanclalmente aislada y purificada.

43. Un método para identificar y producir un ligando capaz de modular la actividad celular modulada o mediada por una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-20, caracterizado porque comprende: a) Tamizar un ligando capaz de unirse a un polipéptido comprendiendo por lo menos una porción de la secuencia de IREN descrita en la figura 6; b) identificar y caracterizar un ligando, diferente a TRAF2 o porciones de un receptor de la familia de receptores de TNF/NGF, encontrado por el paso de tamizado que es capaz de dicha unión; y c) producir el ligando en forma sustancialmente aislada y purificada.

44. Un método para identificar y producir un ligando capaz de modular la actividad celular modulada o mediada por una proteína IREN caracterizado porque comprende: a) Tamizar un ligando capaz de unirse a por lo menos una porción de la secuencia de IREN descrita en la figura 6; b) identificar y caracterizar un ligando, diferente a TRAF2 o porciones de un receptor de la familia del receptor TNF/NGF, que en dicho paso de tamizado se encuentra que es capaz de unirse; y c) producir el ligando en una forma sustancialmente aislada y purificada.

45. Un método para identificar y producir una molécula capaz de modular directa o indirectamente la actividad celular modulada/mediada por la proteína IREN, caracterizado porque comprende: a) tamizar una molécula capaz de modular actividades moduladas/mediadas por la proteína IREN; b) ?Úsá.á. á£á¿&¡Áiá._A_*. i*®*. tlí& á Identificar y caracterizar dicha molécula; y c) producir dicha molécula en forma sustancialmente aislada y purificada 46 Un método capaz de identificar y producir una molécula capaz de modular directa o indirectamente la actividad celular modulada/mediada por una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque comprende: a) tamizar una molécula capaz de modular actividades modulada/mediada por una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17; b) identificar y caracterizar dicha molécula; y c) producir la molécula en forma sustanclalmente aislada o purificada. t«án,ijti¿*.i-.iijla*a I..«.,**