MXPA02000536A - Vacuna inactivada contra la enfermedad provocada por el calicivirus de los felinos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a preparaciones inmunogenicas y vacunas, en particular inactivadas, eficientes contra la enfermedad provocada por el calicivirus de los felinos, basado en la cepa 431 del virus de FCV como se presento en la CNCM bajo el numero de acceso CNCM 1-2166, o uno de sus equivalentes, en un portador o excipiente aceptable en medicina veterinaria, preferentemente asociado con el virus de FCV derivado de otra cepa de FCV, en particular la cepa G1 como se presento en la CNCM bajo el numero de acceso MCM 1-2167. La invencion tambien se refiere al hibridoma presentado bajo el numero de acceso CNCM I-2282, y el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma.

Description

VACUNA INACTIVADA CONTRA IA ENFERMEDAD PROVOCADA POR EL CALICIVIRUS DE LOS FELINOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a la utilización de cepas particulares del calicivirus de los felinos para obtener preparaciones inmunogénicas y de vacunas, especialmente inactivadas o de subunidades, contra la calicivirosis de los felinos. Estas preparaciones inmunogénicas y estas vacunas pueden ser combinadas igualmente con preparaciones inmunogénicas o vacunas preparadas con base en otros agentes patógenos de los felinos, para obtener preparaciones inmunogénicas y de vacunas multivalentes .

Antecedentes de la Invención Los calicivirus de los felinos (en inglés Feline Calicivirus o FVC) han sido descritos por primera vez en 1957 (Fastier L. B. Am. J. Vet. Res. 1957. 18. 382-389). Los calicivirus de los felinos son, con los virus del herpes de los felinos, las dos fuentes principales de afecciones virales del tracto respiratorio superior en los gatos. El virus FCV afecta a un gran número de animales, con tasas de portación del FCV del orden de 15 a 25 %, y una Ref.135447 seroprevalencia anti-FCV del 70 al 100% (Coutts et al., Vet.

Rec. 1994. 135. 555-556; Ellis T. M. Australian Vet. J. 1981. 57. 115-118; Harbour et al. Vet. Rec. 1991. 128. 77-80; Reubel et al. Feline Desdistry 1992. 22 1347-1360). Después de una fase inicial de hipotermia, estas afecciones respiratorias se acompañan generalmente de ulceraciones bucales (paladar, lengua, labios, nariz) , rinitis, conjuntivitis, eventualmente anorexia y astenia. Los virus FCV puede provocar igualmente neumonías, enteritis, y dolores articulares (síndrome de cojera). La transmisión del virus FCV no se hace más que horizontalmente, y no es de transmisión vertical de la madre a su hijo en el momento de la gestación (Johnson R. P. Res.

Vet. Sci. 1984. 31. 114-119). La transmisión del FCV se hace por contacto entre los animales infectados y los animales sanos o por la vía aérea en el momento de los estornudos (Wardley RC. Arch. Virol. 1976. 52. 243-249). Los calicivirus de los felinos son los virus desnudos de la familia de los Caliciviridae, ellos están provistos de un ARN positivo de una sola hebra, de un tamaño de aproximadamente 7.7 kilo pares de bases (kpb) (Radford et al. Proc. lst Int. Sy p. Caliciviruses ESW 1997. 93-99) . Como numerosos virus tienen el ARN, existe una gran heterogeneidad en el seno de la población viral del FCV. Las variaciones antigénicas, puestas en evidencia al inicio de los años 70 por las experiencias de las seroneutralizaciones cruzadas, permiten clasificar a los FCV en varias cepas virales o casi-especies (Radford et al. Proc. l?t Int. Symp. Caliciviruses ESW 1997. 93-99). Varias cepas del FCV han sido identificadas y aisladas, especialmente la cepa F9 (depositada ante la American Type Culture Collection o ATCC bajo el número de acceso VR-782), la cepa 2280 (ATCC VR-2057), la cepa KCD (ATCC VR-651), y la cepa CFI (ATCC VR-654). La vacunación contra el FCV ha sido llevada a cabo después del final de los años 70 a partir de las cepas de FCV atenuadas, principalmente la cepa F9 aislada en los EUA en 1958 por Bittle (Bittle et al. Am. J. vet. Res. 1960. 21. 547-550) o de las cepas derivadas de F9 por el paso in vi tro o in vivo ("semejantes a F9"). Las vacunas inactivadas también están disponibles. Utilizando principalmente la cepa 255, aislada en los EUA en 1970 de un gato que presenta una neumonía (Kahn y Gillepsie. Cornell Vet. 1970. 60. 669-683; Povey et al. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1980. 177. 347-350), la cepa 2280 aislada en los EUA en 1983 de un gato aquejado de cojera (Pedersen et al. Fel. Prac. 1983. 13. 26-35; Pedersen N. C. y Hawkins K. F. Vet. Microbiol. 1995. 47. 141-156). l&áriAaa ,¿ ¿a M. T^* JL s- A á .

Debido al derivado antigénico en el tiempo, los antisueros producidos contra las cepas de las vacunas aisladas en los años 60-70, tales como las cepas F9, 255, o 2280, no neutralizan más que un poco los aislados de los años 90. Por ejemplo, el suero anti-F9 neutraliza 43% de los aislados americanos del período de 1990-96, contra el 56 % para el período 1980-89 y 86 % para el período de 1958-79, y solamente 10 % de los aislados ingleses del período 1990-96 (Lauritzen et al. Vet. Microbiol. 1997. 56. 55-63). Es por esto que las vacunas atenuadas e inactivadas elaboradas a partir de las cepas antiguas de FCV no ofrecen más en el presente una protección suficiente contra las cepas de FCV recientes .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención tiene por objeto la puesta en evidencia de nuevas cepas de FCV que induzcan en el gato los anticuerpos que tienen un gran espectro de neutralización cruzada. Otro objeto de la invención es la elaboración de preparaciones inmunogénicas y de vacunas contra la calicivirosis de los felinos a partir de estas cepas de FCV. Todavía otro objeto de la invención es la elaboración de las preparaciones inmunogénicas multivalentes y de las vacunas multivalentes contra la calicivirosis de los felinos y contra al menos otro patógeno de los felinos. La solicitante ha seleccionado cuatro cepas de FCV obtenidas por limpiezas faríngeas practicadas en Francia, en la Royau e-Uni y en los EUA sobre gatos que presentan señales de infección por el calicivirus de los felinos. Se trata respectivamente de la cepa Gl (depositada en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (o CNCM) del Instituto Pasteur, París, Francia, bajo el número de acceso 1-2167) y de la cepa 431 (depositada en la CNCM bajo el número de acceso 1-2166) , la totalidad de las dos depositadas el 12 de marzo de 1999. Las dos últimas cepas son americanas y son designadas RMI6 y RMI9. La cepa de FCV Gl aislada en Francia no corresponde a la cepa FCV aislada en la Royaume- Uní en 1978 por Tohya Y. (Tohya Y. et al., Jpn. J. Sci., 1990, 52, 955-961) y denominada igualmente Gl) . La selección de las cepas de FCV 431, Gl, RMI6 y RMI9 ha sido realizada por pruebas de seroneutralización cruzadas frente a los aislados de FCV de un panel de referencia. Este panel de referencia está compuesto de 18 aislados actuales de FCV tomados sobre los gatos que presentan señales de infección por el calicivirus de los felinos y que provienen de tres zonas geográficas distintas. 7 Aislados son americanos, estos aislados son identificados como RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 y RMI9. 7 Aislados son franceses, ellos son designados como A2, Fl, Gl, G3, F3031, H3-2 y Hl-4. Los 4 últimos aislados son ingleses, los mismos son designados como 431, 388b, 337 y J5. Las cepas del panel y las cepas RMI6 y RMI9 son accesibles para la solicitante a simple petición. Las mismas también han sido publicadas en un artículo de la revista "Archives of Virology" (Poulet et al. Arch. Virol. febrero del 2000. 145(2). 243-261), disponible en línea en Internet en la fecha del depósito del editor. En el momento de las pruebas de seroneutralizaciones cruzadas entre los 18 aislados del FCV del panel de referencia, se ha encontrado de manera sorprendente que el anti-suero del aislado 431 neutraliza 14 de los 17 aislados heterólogos del panel de referencia (la concentración del homólogo de seroneutralización no ha sido tomado en cuenta) . En comparación con los anti-sueros de las cepas de las vacunas "históricas" 255 y F9 no neutralizan cada una más que 2 de los 18 aislados del panel. De manera inesperada, la solicitante ha encontrado así con la cepa FCV 431 una cepa dominante que puede ser utilizada para la protección de los félidos y en particular de los gatos contra la mayor parte de las cepas de FCV. Gracias al panel de cepas de FCV divulgadas aquí, es posible ííé Í.A«-kA _. i, **á,» para el experto en el arte seleccionar otras cepas de FCV dominantes. Por equivalencia, la invención cubre también a través de la cepa FCV 431 las cepas de FCV equivalentes para esta última, que tienen anticuerpos de gran espectro de neutralización cruzada. Existe una equivalencia cuando el anti-suero de una cepa de FCV seroneutraliza al menos 13 de los 18 aislados heterólogos del panel de referencia (es decir incluyendo el FCV 431), preferentemente cuando el mismo seroneutraliza al menos 14 de los 18 aislados heterólogos del panel de referencia, de manera aún más preferida cuando neutraliza al menos 15 de los 18 aislados heterólogos del panel de referencia . Se considera generalmente que una cepa de FCV seroneutraliza otra cepa de FCV cuando la concentración heteróloga de seroneutralización es superior o igual a 1.2 logio VN5C (Povey C. e Ingersoll J., Infection and Immunity, 1975, 11, 877-885) . La solicitante ha tomado este valor como el umbral de positividad. Sin embargo, los resultados de la seroneutralización cruzada obtenidos por un aislado de FCV que tiene una concentración homologa de seroneutralización inferior o igual a 2 logio VN50 no pueden ser interpretados. Un segundo método para establecer la equivalencia de una cepa de FCV frente a la cepa FCV 431 es utilizar los anticuerpos monoclonales específicos de la cepa FCV 431 y la de probar por inmunofluorescencia indirecta (IFI) la cepa de FCV candidata. La solicitante también ha tenido éxito en producir varios anticuerpos monoclonales que son comprobados específicos de la cepa 431. Uno de ellos ha sido denominado 44. El mismo tiene una equivalencia y una reactividad en la inmunofluorescencia con los anticuerpos monoclonales específicos del 431, por ejemplo con los anticuerpos monoclonales de 44. Estos anticuerpos monoclonales y el hibridoma correspondiente están disponibles para la - solicitante a petición simple y son divulgados en el artículo de Poulet et al. Arch. Virol. 2000. 145. 1-19. El hibridoma correspondiente ha sido depositado igualmente el 11 de agosto de 1999 en la CNCM bajo el número de acceso 1-2282. Vale decir sin embargo que el experto en el arte es aún capaz perfectamente de producir anticuerpos monoclonales por las técnicas clásicas y de seleccionar, con respecto al panel, aquellos que son específicos para la cepa 431. La presente invención tiene así como primer objeto las preparaciones inmunogénicas y las vacunas preparadas a partir del calicivirus de los felinos cepa 431, lo que incluye sus equivalentes tales como los definidos anteriormente, de preferencia bajo una forma inactiva o de subunidades, en un vehículo o excipiente aceptable desde el *^®, , . punto de vista veterinario, y de preferencia en la presencia de un auxiliar. La noción de la preparación del inmunógeno cubre así cualquier preparación susceptible, una vez administrada al gato, de inducir una respuesta inmunitaria dirigida contra el patógeno de felino considerado. Por vacuna, se entiende una preparación capaz de inducir una protección eficaz. Las otras cepas de FCV Gl, RMI6 y RMI9 han sido elegidas para su complementariedad frente a la cepa FCV 431, a saber que la combinación de los anti-sueros de 431 y de uno de estos tres FCV seuroneutralizan 100% de los aislados del panel de referencia, es decir que estas tres cepas de FCV tienen una concentración homologa de seroneutralización superior o igual a 2 logio VN50 y concentraciones de seroneutralización heterólogas superiores o iguales a 1.2 logio VN50 frente a los aislados de FCV del panel de referencia contra los cuales el anti-suero 431 no se seroneutraliza o lo hace débilmente (valor inferior a 1.2 logio VN50) . La invención cubre igualmente las cepas FCV equivalentes que tienen la misma complementariedad frente a la cepa FCV 431. Se pueden producir y seleccionar así los anticuerpos monoclonales específicos de estas cepas, en particular de Gl, lo que permite en seguida determinar los equivalentes sobre otra base.

La invención tiene así por segundo objeto las preparaciones inmunogénicas y las vacunas que comprenden, además de los antígenos de la cepa FCV 431 o uno de estos equivalentes según la invención, los antígenos de al menos otra cepa de FCV, especialmente una cepa complementaria, en particular elegida entre el grupo que comprende Gl, RMI6, RMI9, lo que incluye sus equivalentes, en un vehículo o excipiente aceptable sobre el plano veterinario, y eventualmente un auxiliar. De preferencia, los antígenos que provienen de la o de otras cepas de FCV comprenden el virus inactivado o de subunidades. La invención tiene particularmente por objeto la asociación de las dos cepas de FCV 431 y Gl para la obtención de las preparaciones inmunogénicas o de las vacunas inactivadas o de subunidades . De manera sorprendente, la combinación de las dos cepas de FCV Gl y 431 provoca ventajosamente un efecto sinérgico. En el momento de los estudios sobre la complementariedad de las cepas de FCV Gl y 431, las respuestas inmunitarias inducidas por el Gl solo, el 431 solo o la asociación de los dos (Gl + 431) han sido comparadas. El grupo de animales que han sido inmunizados por la combinación de las dos cepas de FCV Gl y 431 tendrán el beneficio de una mejor protección clínica.

Ia¿ ? ?¿ .* St.á -fcá El cultivo y la propagación del virus de FCV se hace de preferencia sobre las células de los felinos, más particularmente sobre las células renales de los felinos de Crandell-Reese (en inglés Crandell-Reese Feline Kidney o CRFK 5 accesible de la American Type Culture Collection bajo el número CCL-94) con una multiplicidad de infecciones (moi) de 2 a 0.01 dosis infectantes del 50 % en el cultivo de las células (DICC50) por célula, de preferencia 0.5 DICC50/célula. Después de la cosecha y clarificación, los virus de FCV destinados a producir una preparación inmunogénica inactivada o una vacuna inactivada, son inactivados por un tratamiento químico (por ejemplo formol o formaldehído, ß- propiolactona, etilenimina, etilenimina binaria (BEI)) y/o térmica. De preferencia, los virus según la invención son inactivados por la acción de la etilenimina formada extemporáneamente a partir de la bro oetilamina (BEA) . Las partículas virales pueden ser concentradas por las técnicas clásicas de concentración, especialmente por ultrafiltración y, eventualmente purificadas en seguida por los medios de purificación clásicos, especialmente las técnicas de filtración en gel o de precipitaciones selectivas en particular en la presencia de polietilenglicol (PEG) . Una purificación también puede ser realizada, sin concentración previa .

Para la elaboración de una preparación inmunogénica o de una vacuna inactivada o de subunidades, las partículas virales son tomadas en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario, y eventualmente adicionadas con un auxiliar. La cantidad del antígeno equivale especialmente a una concentración antes de la inactivación de aproximadamente 105 a aproximadamente 1010 DICC50 por dosis, de preferencia de aproximadamente 108 a aproximadamente 109 DICC50 por dosis. Para ayudar a las preparaciones inmunogénicas y las vacunas según la invención, se puede utilizar una concentración del auxiliar (1) del hidróxido de aluminio, (2) un polímero del ácido acrílico o metacrílico, un polímero del anhídrido maléico y del derivado de alquenilo, o (3) formular la preparación inmunogénica o vacuna bajo la forma de una emulsión de aceite en agua en particular la emulsión de SPT descrita en p - 147 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editado por M. Powell, M. New an, Plenum Press 1995, y la emulsión de MF59 descrita como pl83 de la misma obra. La emulsión de aceite en agua puede ser especialmente a base de aceite de parafina líquina ligera (tipo Farmacopea europea) , de aceite isoprenoide tal como el escualano, el escualeno; el aceite resultante de la fc«t«-fc«*.<* -*-- -*"jf*-*--^?^tíh* oligomerización de los alquenos, en particular del isobuteno o del deceno; de los esteres de ácidos o de alcoholes del grupo de alquilo lineal, más particularmente los aceites vegetales, el oleato de etilo, el di (caprilato/caprato) de propilenglicol, el tri (caprilato/caprato) de glicerol, el dioleato de propilenglicol; los esteres de los ácidos o de los alcoholes grasos ramificados, en particular de los esteres del ácido isosteárico. El aceite es utilizado en asociación con los emulsificantes para formar la emulsión. Los emulsificantes son de preferencia agentes tensioactivos no iónicos en particular los esteres de sorbitan, _manita, glicerol, poliglicerol, propilenglicol y ácido oléico, isosteárico, ricinoléico, hidroxiesteárico, eventualmente etoxilados, los bloques de copolímeros de polioxipropileno-polioxietileno en particular los Pluronics®, especialmente L121. Los polímeros del ácido acrílico o metacrílico son reticulados especialmente por los esteres polialquenílicos de los azúcares o de los polialcoholes. Estos compuestos son conocidos bajo el término carbómero (Pharmeuropa vol. 8, No. 2, junio de 1996) . El experto en el arte también se puede referir a US-A-2 909 462 (incorporado para referencia) que describe tales polímeros acrílicos reticulados por un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidróxilo, de preferencia cuando mucho de 8, los átomos de hidrógeno de al menos tres hidróxilos son reemplazados por los radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener por sí mismos otros substituyentes, tales como el metilo. Los productos vendidos bajo la denominación Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, EUA) son particularmente apropiados. Los mismos son reticulados por una alilo sacarosa o por el alilpentaeritritol. Entre ellos, se pueden citar los Carbopol® 974P, 934P y 971P. Entre los copolímeros del anhídrido maléico y el derivado de alquenilo, se prefieren los EMA® (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maléico y de etileno, lineales o reticulados, por ejemplo reticulados por el diviniléter. Se puede hacer referencia a J. Fields et al., Nature, 186: 778-780, 4 de junio de 1960 (incorporado para referencia) . Sobre el plano de su estructura, los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los EMA® son formados de preferencia de las porciones de base de la siguiente fórmula: ,i,¡k *& «i 2-, &z?k? . , s. .

R1 R2 en la cual: Ri y R2, idénticos o diferentes, representan H o CH3 - x = 0 o 1, de preferencia x = 1 y = 1 o 2, con x + y = 2 Para los EMA®, x = 0 e y = 2. Para los carbómeros, x = y = 1. La concentración del polímero en la composición de la vacuna final será de 0.01 % a 1.5 % P/V, más particularmente de 0.05 a 1 % P/V, de preferencia de 0.1 a 0.4 % P/V. Por supuesto, también se puede combinar el virus inactivado y de las subunidades de una misma cepa de FCV conforme a la invención y/o de diferentes cepas de FCV conforme a la invención. La invención también tiene por objeto una vacuna multivalente que comprende una valencia inactivada del calicivirus de los felinos, que comprende al menos la cepa ^^^^ í ht&t.&t?ken.,* ... -j afai. üiiM FCV 431, aquella que incluye estos equivalentes, y eventualmente al menos otra cepa de FCV, especialmente una cepa complementaria en el sentido de la invención, en particular la elegida entre Gl, RMI6 y RMI9, y al menos una valencia para otro patógeno de felino, en un vehículo o excipiente aceptable sobre el plano veterinario y de preferencia con un auxiliar, especial uno de aquellos descritos precedentemente. De la misma manera se pueden obtener vacunas multivalentes a base de subunidades. Dichos patógenos de los felinos son elegidos especialmente entre el grupo que comprende el virus de la rinotraqueitis de los felinos o el virus del herpes de los felinos (FHV), el virus de la leucemia de los felinos (Feline Leukemia Virus o FeLV) , el virus de la panleucopenia de los felinos o parvovirus de los felinos (FPV) , el virus de la peritonitis infecciosa de los felinos (FIPV) , el virus de la inmunodeficiencia de los felinos (FIV) , el virus de la rabia, Chlamydia . Las vacunas de FCV según la invención pueden ser mezcladas extemporáneamente con la o las otras valencias de los felinos que pueden estar bajo la forma de vacunas vivas atenuadas, inactivadas, subunitarias, recombmadas o polinucleotídicas .

I t? J.--J» ?.?.? mA?? ? * -.. .éAx*?+**^ ? ~. *m?tmi?lpr^.3*, La invención tiene así igualmente por objeto un conjunto o juego de vacunación multivalente que comprende, acondicionadas separadamente, una valencia de FCV según la invención en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario, y de preferencia con un auxiliar, y al menos una valencia de otro patógeno de felino. La valencia de FCV puede servir de solvente para otra valencia de los felinos, especialmente de valencia atenuada, recombinada o polinucleotídica que se presenta bajo la forma liofilizada. Conforme a una modalidad de la invención, se pueden producir preparaciones inmunogénicas o de vacunas de subunidades, por la extracción de la capsida a partir del virus, eventualmente con la inactivación antes o después de la extracción. Estas preparaciones y vacunas comprenden como principio activo único o no, uno de tales productos de extracción que contienen mayoritariamente la proteína de la capsida y eventualmente subfragmentos, eventualmente inactivados, producidos a partir de las cepas según la invención, en particular la cepa 431, lo que incluye sus equivalentes, eventualmente también a partir de otra cepa de FCV, especialmente Gl o sus equivalentes. Estas preparaciones y vacunas subunitarias son provistas de auxiliares ventajosamente, por ejemplo como se describió anteriormente. £j?¡^^¡j^. i ..i^.í i- ..í - ..

También se puede mezclar la preparación o vacuna inactivada entera y la preparación o vacuna subunitaria. La invención también tiene por objeto una preparación inmunogénica o una vacuna basada en la cepa Gl, especialmente inactivada o subunitaria de extracción. La invención tiene igualmente por objeto un método de inmunización de los gatos, contra las enfermedades debidas al calicivuris de los felinos. Este método de inmunización comprende la administración de una vacuna de FCV inactivada, subunitaria o multivalente asociada según la invención, a los gatos. La administración de dicha vacuna se puede hacer especialmente por la vía parenteral, de preferencia por la vía subcutánea o intramuscular . El experto en el arte posee la capacidad necesaria para definir de manera precisa el número de inyecciones y las dosis de cada vacuna que se va a utilizar para cada protocolo de vacunación. Los volúmenes de la dosis pueden estar comprendidas igualmente entre 0.2 y 2 ml, de preferencia del orden de 1 ml . La invención va a ser descrita ahora con mayor detalle con la ayuda de los modos de realización tomados como ejemplos no limitativos y que se refieren a la . :í .^r,.., i^., í áí^i ,.,. ^.,~?¿i^M.,<^^^ , . . . i_ . -. « t * »^..mm?íSm Figura única, dando una tabla de las concentraciones de seroneutralización cruzada.

Ejemplos : Ejemplo 1: Aislados virales e hibridomas Los virus de calicivirus de los felinos (FCV) han sido obtenidos por limpiezas faríngeas practicadas sobre los gatos que presentan signos de infección por el calicivirus de los felinos. Estos FCV tienen diferentes orígenes geográficos. Las cepas de FCV 431, 337, J5, 388b, 220 y 393 han sido aisladas en la Royaume-Uni y provistas por el Profesor O. Jarrett de la Universidad de Glasgow, UK. Las cepas FCV A2, Gl, G3, F3031, Fl, H3-2 y Hl-4 han sido aisladas en Francia por la solicitante. Las cepas de FCV RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 y RMI9 han sido aisladas en los EUA por la solicitante. Las limpiezas faríngeas son colectadas en 2 ml del medio mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco BRL) , suplementado con 5 % de suero de bovino fetal (Bayer Diagnostic) , antibióticos, más particularmente de 50 mg/l de gentamicina. Cada aislado es congelado a -70 °C en espera de ser probado. El anticuerpo monoclonal 44, que proviene del hibridoma identificado como 431 2 0 17 E9 T, es específico de la cepa FCV 431.

Ejemplo 2: Amplificación de los aislados virales Las células de la descendencia del riñon del gato (Crandell-Reese Feline Kidney o CRFK No. ATCC CCL-94, Crandell et al. In vitro 1973. 9. 176-185) son puestas en cultivo en una placa de 96 cavidades o en Falcon de 25 cm2 (Falcon) con el medio DMEM suplementado con 5 % de suero de bovino fetal, que contiene aproximadamente 100 000 células por ml. Las células son cultivadas a +37 °C en una atmósfera que contiene 5 % de C02. Después de 3 días la capa celular llega a la confluencia. El medio de cultivo es reemplazado ' entonces por el medio de DMEM sin el suero pero adicionado de 50 mg/ml de gentamicina y las alícuotas descongeladas de los aislados virales de FCV (ejemplo 1) son agregadas a razón de un volumen de 100 µl de las diluciones seriadas de cuarto en cuarto por cada cavidad para la clonación en las diluciones limitadas del virus de FCV o de 1 ml por Falcon. Cuando el efecto citopático (ECP) está completo (24-48 horas después del inicio de la puesta en cultivo) , las suspensiones virales son recolectadas y congeladas a -70 °C. 3 a 4 pasos sucesivos son necesarios generalmente para la producción de un lote viral. El lote viral es almacenado a -70 °C.

Ejemplo 3: Producción del suero Para cada virus de FCV, un antisuero es producido por la inoculación de los gatos por la vía oronasal con 10 DICC50 del virus de FCV relacionado. Los gatos exentos de patógenos específicos (EOPS) tienen de 10 a 14 semanas. El suero obtenido para cada animal es colectado un mes después de la infección. Los sueros son inactivados por medio de calor (30 minutos a 56 °C) , repartidos, se toman alícuotas y se almacenan a -20 °C.

Ejemplo 4: Seroneutralización cruzada in vitro Las pruebas de seroneutralización cruzada han sido efectuadas entre 18 aislados del campo obtenidos por limpiezas faríngeas practicadas sobre los gatos que presentan signos de calicivirosis felina. 7 Tienen por origen geográfico Francia, se trata de los aislados identificados como A2, F3031, Gl, G3, Fl, H3-2 y Hl-4. 4 tienen por origen geográfico la Gran Bretaña, se trata de los aislados identificados como J5, 337, 388b y 431. Por último, 7 tienen por origen geográfico EUA, se trata de los aislados identificados como RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 y RMI9. El suero obtenido para cada aislado (ejemplo 3) es probado para verificar su aptitud para neutralizar los 18 aislados. Los sueros son diluidos en cascada por tercios con el medio - é -S?^s.

DMEM en las placas de 96 cavidades para el cultivo celular. A 0.05 ml del suero diluido son agregados 0.05 ml del medio de cultivo que contiene aproximadamente 100 DICC5o de la cepa viral seleccionada producida como en el ejemplo 2. Esta mezcla es incubada durante 2 horas a 37 °C en una estufa en una atmósfera que contiene 5 % de C02. 0.15 ml de una suspensión de células de CRFK que contienen aproximadamente 100 000 células por ml son agregados en seguida a cada mezcla. El efecto citopático es observado por microscopía de contraste de la fase después de 4 días de cultivo a 37 °C en una atmósfera que contiene 5 % de C02. Las concentraciones neutralizantes de cada suero son calculadas después por el método de Kárber. Las concentraciones son dadas bajo la forma de dilución más importante que inhibe el efecto citopático para el 50 % de las cúpulas. Las concentraciones son expresadas en logio- La concentración mínima así encontrada es de 0.7 logio VN50. Cada suero es concentrado al menos dos veces, de preferencia tres veces. La Figura 1 proporciona el conjunto de las concentraciones neutralizantes obtenidas en el momento de las seroneutralizaciones cruzadas efectuadas entre estas 18 cepas de FCV y estos 18 sueros.

Ejemplo 5: Pruebas de inmunofluorescencia indirecta (IFI) Las pruebas IFI son efectuadas sobre las placas de 96 cavidades que contienen las células de CRFK cultivadas en monocapas e infectadas por el virus de FCV que se va a probar. 200 µl por cúpula de una suspensión de las células de CRFK con 90 000 células/ml en el medio F15 (Gibco BRL, Cat. # 045-1075) que contienen 5 % de suero de bovino fetal son puestos en cultivo en la placa de 96 cúpulas. En la confluencia, 320 DICC50 de FCV son inoculados bajo 100 µl del 10 medio F15. Cuando los primeros focos de ECP aparecen, las células son enjuagadas entonces con el PBS sin calcio ni magnesio (PBS", Sigma) frío, luego fijadas a -20 °C durante 30 minutos por acetona fría que contiene 5 % v/v de agua. Después del secado, las células infectadas y fijadas son puestas en contacto durante 30 minutos a 37 °C con 100 µl por cúpula del líquido de ascitos que corresponde al anticuerpo monoclonal 44 anti-FCV 431 (hibridoma 431 2 0 17 E9 T) , diluido al 1/5000/a. aproximadamente en el amortiguador TRIS- HC1 50 mM pH7.6. Después de dos enjuagues en PBS", la fijación de los anticuerpos es revelada por la incubación en las mismas condiciones de un anticuerpo de cabra anti-lgG de ratón conjugado con isotianato de fluoresceína (Biosys, conjugado con FITC a 2 mg/ml) y diluido a 1/150 en el ^M já ^ gí amortiguador TRIS-HC1 50 mM pH7.6. La lectura se hace bajo un microscopio óptico con luz UV. Estos anticuerpos monoclonales han sido probados frente a cada uno de los aislados del panel. Los mismos son fijados exclusivamente sobre las células de CRFK infectadas por el FCV 431. Esta prueba puede ser utilizada para determinar los equivalentes de la cepa FCV 431. Estos equivalentes son aquellos sobre los cuales se fija el anticuerpo monoclonal 44.

Ejemplo 6: Sinergia 32 gatos EOPS no vacunados de 9 semanas aproximadamente son repartidos al azar en 4 grupos (identificados de A a D) de 8 gatos cada uno, cada grupo es alojado en una caja aislada. Después de la descongelación de las suspensiones virales (ejemplo 2) y dilución en PBS de manera que se obtenga la concentración deseada, los gatos son vacunados por inyección subcutánea de 1 ml del inoculo de FCV Gl a 103'3 DICCso/ml para el grupo B, 1 ml del inoculo de FCV 431 a 103'5 DICC50/ml para el grupo C, 0.5 ml del inoculo de FCV 431 a 103-3 DICCso/ml y 0.5 ml del inoculo de FCV 431 a 103'5 DICC50/ml i^. i-.i, t .. t, .í -« , . «.«!«« *..— —- ^g^^^^ - - -*"»-''•* '*"*" (en un punto de inyección diferente) para el grupo D. El grupo A sirvió de grupo testigo. La mitad de cada grupo A a D es repartido al azar en dos grupos 1 y 2 y alojados en cajas separadas. Los animales son probados el 31 día después de la vacunación (J31) . Los animales del grupo 1 son probados por la administración de 1 ml de la cepa viral de prueba de FCV 220 a una concentración de 107'2 DICC50/ml por la vía oronasal (0.5 ml por la vía oral y 0.25 ml en cada ventana de la nariz) . Los animales del grupo 2 son probados por la administración de 1 ml de la cepa viral de prueba de FCV 393 a una concentración de 106"8 DICC50/ml por la vía oronasal (0.5 ml por la vía oral y 0.25 ml en cada ventana de la nariz) . Las cepas virulentas de FCV 220 y 393 han sido elegidas porque las mismas son apartadas en la seroneutralización cruzada de las cepas virales de FCV Gl y 431. Cualquier contaminación cruzada entre las dos cajas es evitada cuidadosamente. El seguimiento clínico de los animales de dos grupos se hace por las tomas de la temperatura rectal y los exámenes clínicos de los animales (estado general, presencia de úlceras de la lengua y del paladar, presencia de gingivitis, presencia de rinitis, i i. i i -« i> *. « i ^. -^fr^^a presencia de conjuntivitis, presencia de cojera, muerte del animal) . La evaluación clínica total de cada animal fue calculada adicionando los valores obtenidos para cada grupo a los signos clínicos según la tabla siguiente: temperatura rectal: 0 - inferior a 39 °C 1 - superior o igual a 39 °C e inferior a 39.5 °C 2 - superior o igual a 39.5 °C e inferior a 40 °C 3 - superior o igual a 40 °C • - estado general: 0 - comportamiento normal 1 - abatimiento úlceras de la lengua y del paladar (algunos de los diámetros de todas las úlceras, si es que existen varias) : 0 - ausencia de úlceras 1 - diámetro de 1 a 5 mm 2 - diámetro de 6 a 10 mm 3 - diámetro superior a 10 mm - gingivitis: 0 - ausencia de gingivitis 1 - gingivitis rinitis: 0 - ausencia de rinitis ^ S^Í .. ti. 1 - rinitis con flujo nasal seroso 2 - rinitis con flujo nasal mucoso a mucopurulento conjuntivitis : 0 - ausencia de conjuntivitis 1 - conjuntivitis con flujo seroso 2 - conjuntivitis con flujo mucopurulento cojera: 0 - ausencia de cojera 1 - cojera - deceso: 0 - sobrevivió 5 - deceso.

Los valores clínicos promedios obtenidos son los siguientes: Los resultados así obtenidos muestran una sinergia entre las cepas FCV Gl y FCV 431 para una diferencia » *. * * « jr»~-A fc significativa entre el valor promedio obtenido para la mejor de las cepas y aquella obtenida para la asociación de dos cepas prueba de Kruskal-Wallis) .

Ejemplo 7: Producción de la vacuna inactivada Las células de CRFK son cultivadas a 37 °C en frascos giratorios de 2 litros (850 cm2) en el medio de Eagle modificado (MEM, Gibco BRL) suplementado con 2.5 % de hidrolizado de lactalbúmina (Gibco BRL) y de 5 % de suero de bovino fetal (Gibco BRL) . Se agregan por frasco giratorio 300 ml de una suspensión celular en el medio MEM a aproximadamente 100 000 células/ml. Después de tres días la capa celular es confluente. El medio del cultivo celular es reemplazado entonces por el medio MEM sin el suero y el virus de FCV agregado a una multiplicidad de infecciones (moi) de 0.5 DICC50/célula. El cultivo viral es mantenido a 37 °C durante 24 a 48 horas hasta la obtención de un efecto citopático para el conjunto de tapices celulares. La suspensión viral es recolectada luego aclarada sobre un filtro de cartucho de porosidad de 1.5 µm. La concentración del virus de FCV en la recolección es de 8.5 +/- 0.3 loglO DICC50/ml. El virus es inactivado por la etilenimina a la concentración de aproximadamente 8 mM a 22 °C durante 18 horas. La etilenimina es preparada extemporáneamente ^, k a a * ?^ÍU?Í»» «. ^»a..^>.^>-|-i || 7*f <gtf!f*t'* * ~—- ...^ .-? .» ... ^ - - — ¿ -» «*. í . tj- disolviendo 28 g de sosa en pastillas en 200 ml de agua destilada y agregando 68.1 g de bromoetilamina (BEA) que corresponde a una solución 1.2 M aproximadamente (H. Bahne ann, Arch. Virol., 1975, 47, 47-56). La suspensión viral inactivada es concentrada 100 veces sobre el cásete de ultrafiltración del tipo Ultrasette con un umbral de corte de 100 kDa (Filtron) luego se congela a -70 °C. La suspensión viral inactivada después de la descongelación es diluida a l/33/o. en el amortiguador PBS (NaCl 8 g/l; KCl 0.2 g/l; KH2P04 0.2 g/l; Na2HP04, 2 H20 1.44 g/l) . La vacuna es preparada de la siguiente manera: 167 ml de la fase acuosa constituida de la dilución del virus inactivado son emulsionados en 83 ml de la fase aceitosa que contiene 7 % p/v del oleato de anhidro anitol, 8 % p/v del ácido oléico etoxilado con 11 moléculas del óxido de etileno (OE) en promedio y 85 % v/v de aceite de parafina líquido ligero (tipo Farmacopea europea) con la ayuda de un emulsificador de turbina Silverson a 32 °C durante 2 minutos.

La vacuna es almacenada en seguida a 5 °C. Un método alternativo para preparar la vacuna consiste en poner en emulsión por medio de tres pasadas a través de un homogeneizador de alta presión modelo Y110 (Microfluidics Corp.) a una presión de 611.82 kg/cm2 600 bares y a una temperatura comprendida entre 30 y 40 °C la mezcla de 5 % p/v de escualeno, 2.5 % p/v de Pluronic® L121, 0.2 % p/v de Tween 80, 92.3 % v/v de la suspensión viral inactivada diluida a 1/46 en el amortiguador PBS después de la descongelación. La vacuna es almacenada en seguida a 5 °C. Otro método alternativo consiste en obtener una solución al 0.4% p/v de Carbopol® 974P en agua fisiológica (NaCl 9 g/l) . El pH es ajustado a 7.3-7.4 con la sosa. Esta solución de Carbopol es mezclada en seguida con una parte igual a la suspensión del virus de FCV inactivado, diluida a 1/25 después de la descongelación. La vacuna es conservada en seguida a 5 °C. La fase acuosa de las emulsiones o la fase acuosa mezclada con Carbopol® está constituida de una dilución en PBS de la suspensión viral inactivada concentrada correspondiente ya sea a la cepa FCV 431 o a la cepa FCV Gl o una mezcla de una parte igual de las cepas de FCV 431 y Gl .

Ejemplo 8: Control de la inmunogenicidad del FCV 431 inactivado 19 Gatos EOPS no vacunados de 9 semanas aproximadamente son repartidos al azar en 2 grupos (identificados como A y B) , el primero de 12 gatos y el segundo de 7 gatos, cada grupo es alojado en una caja aislada. La vacuna es preparada con un auxiliar compuesto del ^^^¡^^* oleato de anhidro anitol, el ácido oléico etoxilado y aceite de parafina líquido ligero tal como el descrito en el ejemplo 7. Los gatos son vacunados en dos ocasiones (JO y J28) por la inyección subcutánea de 1 ml del inoculo de FCV 431 a 107 DICC50/ml para el grupo A. El grupo B sirvió de grupo testigo . Los animales son probados el día 42 después de la pri ovacunación (J42) por la administración de 1 ml de la cepa viral de prueba de FCV 431 a una concentración de 10d DICC5o/ml por la vía oronasal (0.5 ml por la vía oral y 0.25 ml en cada ventana de la nariz) . La tasa de anticuerpos neutralizantes anti-FCV 431 y la evaluación clínica han sido seguidos. La evaluación clínica total de cada animal ha sido calculada agregando las evaluaciones obtenidas para cada grupo de signos clínicos según la tabla dada en el ejemplo 6. Los resultados obtenidos son los siguientes. i t namafe^fa^» Concentraciones de los anticuerpos neutralizantes anti-FCV 431 expresadas en logio VN5o/ml : Las evaluaciones clínicas promedio sobre el período J42 a J56: Estos resultados muestran una excelente protección clínica contra la prueba homologa y una buena seroconversión. Se debe haber comprendido bien que la invención definida por las reivindicaciones anexas no está limitada a los modos de realización particulares indicados en la ld^^ . -J.. i- ¿. .* • ^*-.. «...^«. a descripción anterior, sino que engloba las variantes que no se salgan del marco ni del espíritu de la presente invención.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere . --«fefc.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una preparación inmunogénica o vacuna contra la calicivirosis de los felinos, caracterizada porque se prepara a base del virus FCV que tiene la particularidad de ser reconocido por el anticuerpo monoclonal 44 depositado en la CNCM bajo el número de acceso 1-2282, y que comprende un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario .
2. 2. Una preparación inmunogénica o vacuna contra la calicivirosis de los felinos, caracterizada porque se prepara a base del virus de FCV que tiene la particularidad de inducir en los felinos, en particular en los gatos, un antisuero capaz de neutralizar al menos 13, 14 o 15 de los aislados de FCV de un panel constituido de las cepas de FCV identificadas como RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7, RMI9, A2, Fl, Gl, G3, F3031, H3-2, Hl-4, 431, 388b, 337 y J5, y que comprende un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario.
3. 3. La preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque se prepara a base del virus FCV de la cepa 431 tal — Aa* como la depositada en la CNCM bajo el número de acceso CNCM 1-2166, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista veterinario.
4. 4. La preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque comprende además el antígeno que proviene de otra cepa de FCV.
5. 5. La preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la otra cepa de FCV es la cepa Gl tal como la depositada en la CNCM bajo el número de acceso CNCM 1-2167.
6. 6. La preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque comprende además al menos una valencia contra al menos otro patógeno de los felinos.
7. 7. La preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque dicho otro patógeno de los felinos es elegido entre el grupo constituido de los virus del herpes de los felinos (FHV), el virus de la leucemia de los felinos (FeLV) , el virus de la panleucopenia de los felinos (FPV), el virus de la peritonitis infecciosa de los felinos (FIPV), el virus de la mmunodeficiencia de los felinos (FIV), el virus de la rabia, Chlamydia . fc&¿ „i .-A .-i í ^ ^a. - » i¿j tFm¿& ± ^B^ „ » , .« , *,~.» ?+ *. . ^ *»* * 1 1..
8. 8. La preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque comprende además un auxiliar.
9. 9. La preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el auxiliar es el hidróxido de alúmina.
10. 10. La preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el auxiliar es un polímero del ácido acrílico o metacrílico o un polímero de anhídrido maléico y del derivado de alquenilo, de preferencia un carbómero.
11. 11. La preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la preparación inmunogénica o vacuna está bajo la forma de una emulsión de aceite en agua.
12. 12. La preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque comprende el virus de FCV inactivado.
13. 13. La preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque la misma comprende las subunidades que provienen de la y/o las cepas de FCV, estas subunidades comprenden las proteínas de la capsida de extracción. l ? * ? ? * ta-A>«....—^.t^.^
14. 14. Un equipo o conjunto de vacunación multivalente, caracterizado porque comprende, acondicionadas separadamente, una preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 12 a 13, de preferencia con un auxiliar, y al menos una valencia de al menos otro patógeno de los felinos.
15. 15. Un hibridoma, caracterizado porque es uno tal como se depositó en la CNCM bajo el número de acceso CNCM 1-2282.
16. 16. Un anticuerpo monoclonal, caracterizado porque es susceptible de ser producido a partir del hibridoma de conformidad con la reivindicación 15. .. .. .. ^a-^T|1 a- * * &