MXPA02000426A - Una composicion antibacteriana para el control de bacterias gram positivas en aplicaciones de comida. - Google Patents

Abstract

Se describe una composicion antibacteriana que comprende: (a) un primer componente que incluye por lo menos un compuesto bacteriostatico o bactericida gram positivo seleccionado del grupo que consiste de: lantibioticos, pediocina, y bacteriocinas de la clase lacticina, y enzimas liticas; y (b) un segundo componente que incluye por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de acidos de lupulos o derivados de acidos de lupulos, resina de y derivados de resina de lupulos; y el metodo de aplicacion de la composicion a las superficies de la comida solida.

Description

UMA COMPOSICIÓN ANTIBACTERIANA PARA EL CONTROL DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS EN APLICACIONES DE COMIDA Antecedentes de la Invención 1 . Campo de la Invención La presente invención describe un proceso para inhibir o retardar ei crecimiento excesivo de bacterias sobre productos de comida, mediante tratamiento con una composición que incluye uno o más extractos de ácidos de lúpulos o extractos de ácidos de lúpulos modificados más una o más preparaciones bacteriostáticas o bactericidas gram positivas seguras y adecuadas de las categorías de lantibióticos, pediocina, bacteriocina de la clase lacticina y/o enzimas líticas. Más específicamente, el proceso comprende utilizar como un ingrediente o aplicar a una superficie de comida una composición que incluye nicina y/o lisozima y beta ácidos de lúpulos con el fin de reducir o eliminar las bacterias de deterioro o patogénicas gram positivas y, más especialmente, todas las cepas de la Listeria monocytogenes perjudicial, patogénica. Un problema de salud pública importante es la capacidad de las especies Lísteriales patogénicas, especialmente Listeria monocytogenes, para crecer o desarrollarse a las temperaturas de refrigeración comerciales a las cuales las comidas procesadas normalmente son almacenadas por largos periodos de tiempo. Esta capacidad para crecer bajo condiciones normales de distribución hace a la Listeria monocytogenes uno de los riesgos principales de salud pública asociados con comidas sin cocer y procesadas hoy en día. Cualquier nuevo sistema antimicrobiano debe ser efectivo en los sistemas de comida comerciales, con condiciones de formulación y de temperatura que contemplen las prácticas presentes. Las nuevas composiciones de esta patente son efectivas en una variedad de comidas, especialmente a las temperaturas de refrigeración de almacenamiento y manejo, comunes de comidas en riesgo por contaminación Listerial . 2. Descripción de la Tecnología El grado de infecciones e intoxicaciones producidas por comidas en los Estados Unidos se documentó cuantitativamente en el reporte CAST de 1994 (Foodborne Pathogens: Risks and Consequences . Task Forcé Report No.122, Council for Agricultural Science and Technology, Washington D.C.), así también son extensivamente caracterizadas en los últimos años debido a los mejores sistemas y programas de reporte (CDC. 1988c. 1997 Final FoodNet Surveillance report. U.S. Department of Health and Human Services, Octubre, 1998). Con el fin de reducir la prevalencia de la listeriosis y otras infecciones producidas por la comida, una amplia variedad de investigación se ha conducido para desarrollar composiciones que funcionen como ingredientes anti-bacterianos de grado alimenticio. Los compuestos individuales se han descrito en esta investigación, con poco beneficio o' uso comercial, si lo hay, debido principalmente a que los compuestos individuales comúnmente son faltos de eficacia o son demasiado costosos para utilizarse en el procesamiento y formulaciones de comidas. En la actualidad, existe una necesidad por mejor control de patógenos gram positivos tales como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, C. perfringens y los semejantes, los cuales presentan riesgos de salud significantes a los consumidores. Además, otras bacterias de deterioro gram positivas tales como las especies lactobacilli , streptococci , bacilli , enterococci y micrococci se saben que causan deterioro, aunque normalmente ninguna enfermedad, y frecuentemente son los agentes principales en reducir el tiempo de durabilidad en anaquel y la frescura de las comidas seleccionadas. Ambas bacterias patogénicas y de deterioro pueden presentarse en las materias primas de comida, pero el procesamiento térmico tiende a reducir las cargas bacterianas notablemente. Después del procesamiento, la mayoría de las comidas están en riesgo de recontaminación antes del empaquetamiento, distribución y consumo final, cuando se pueden exponer a patógenos en el medio ambiente de manejo de la comida. Aún en las instalaciones de procesamiento más limpias, patógenos seleccionados pueden contaminar las comidas ya procesadas, usualmente a muy bajos niveles. En el caso de patógenos tolerantes al frío, principalmente varias especies Listeriales, ellos luego pueden crecer sin percibirlo sobre la comida durante la distribución y almacenamiento hasta el consumo final. Entre más patógenos crezcan o se desarrollen en un producto de comida, más alto es el riesgo de infección entre los consumidores de ese producto de comida. Este es un problema especial para preparar carnes comestibles y productos lácteos, ya que tales alimentos no se calientan o se procesan nuevamente por el consumidor antes del consumo. En tales casos, el riesgo más probable ee de la especie de .Listeria que crecen excelentemente bajo refrigeración. El consumo de niveles elevados de cualquier patógeno se reconoce que incrementa el riesgo de infección, especialmente entre la población infantil, personas de edad avanzada, mujeres embarazadas y cualquier individuo inmunocomprometido. En 1998, se estima que hubieren aproximadamente 500 muertes en los Estados Unidos causadas por la listeriosis supuestamente contraída de comidas. Entre los principales patógenos de la comida, la listeriosis tiene la más alta mortalidad, excediendo 20% de acuerdo con Meade y colaboradores (Food-related illness and death in the United States, CDC 5:5, Sept-Oct 1999). En vista del riesgo y el gran costo social, se reconoce una necesidad urgente por sistemas que impidan el crecimiento listerial en las comidas mediante las agencias de salud pública estadounidenses, la Food and Drug Administration (FDA), y el United States Department of Agriculture (USDA) . El sujeto de esta invención es una composición novedosa, de grado alimenticio (Generalmente Reconocida como Segura) , de sabor neutro que se enfoca a la Lísteria en los sistemas de comida presentes, especialmente en productos de carne procesados, listos para comerse. El efecto deseado de una composición tal es exterminar o reducir los niveles de las bacterias Listeria en los alimentos que están en riesgo para la supervivencia después del procesamiento o la contaminación mediante tales especies. Además, los riesgos asociados con otras bacterias gram positivas, que incluyen los tipos de deterioro mencionados anteriormente, así como cepas menos comunes de los géneros Corynebacteria , Dipiccocci , Mycobacteria , Streptococci y Streptomyces también se han observado como problemas en los productos de comida y pueden beneficiarse de tal proceso o composición. En 1992 y 1993, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,096,718 y 5,260,061 describieron el uso de metabolitos de bacterias de ácido propionico en ciertas comidas para incrementar la durabilidad de vida en anaquel de los productos alimenticios tratados. Estos metabolitos derr..?estran iti. eficacia mejorada contra las bacterias gram negativas pero, desafortunadamente, no son efectivas contra las bacterias gram positivas. La Patente Norteamericana No. 5,217,950 sugirió el uso de composiciones de nicina como bactericidas. La nicina es un lantibiótico, más específicamente, un polipéptido con propiedades antimicrobianas que es producido en la naturaleza mediante varias cepas de la bacteria Lactococcus lactis . La nicina en realidad es principalmente efectiva contra las bacterias gram positivas; sin embargo, el patógeno gram positivo común Listeria monocytogenes es más resistente a la nicina que la mayoría de otras especies de bacterias gram positivas. La necesidad para mejorar la actividad de la nicina contra la Listeria monocytogenes es bien reconocida y se explica por el hecho de que la nicina por si misma no se utiliza como un agente antilisterial comercialmente. La Párente No. 5,217,950 por lo tanto sugiere la combinación de un agente quelante, tal como ácido etilendiaminatetraacético disódico (EDTA) u otras sales de acetato o sales de citrato con nicina para efectuar un rango más amplio de actividad contra ambas especies de Listeria así como las bacterias gram negativas seleccionadas. Las Patentes Norteamericanas Nos. 5,573,797; 5,593,800 y 5,573,801 describen composiciones antibacterianas que incluyen una combinación de una bacteriocina derivada de i ¿ iJ Streptococcus o Pediococcus o agente antibacteriano equivalente, sintético, en combinación con un agente quelante. La composición es aplicada a la superficie de la comida a ser tratada, ya sea mediante la aplicación directa o 5 mediante la incorporación de la composición sobre una envoltura de película flexible que es colocada en contacto íntimo con la superficie de la comida. El agente quelante enlaza los cationes divalentes libres en la membrana externa de las células gram negativas, mejorando la permeabilidad de los agentes antibacterianos. En el caso de la Patente 5,573,801, se describe la aplicación de nicina sola a la superficie de las carnes cocidas, pero la eficacia de este solo ingrediente es tan limitada que no se ha empleado comercialmente . 15 La Patente Norteamericana No. 5,458,876 sugiere la combinación de un lantibiótico (como nicina) con lisozima cono un antibacteriano. En este caso, la lisozira descompone la pared celular y debilita la integridad estructural de la célula objetivo, de modo que el agente antibacteriano puede ser más efectivo en dañar o exterminar la célula bacteriana. En particular, esta combinación se prueba que es efectiva en mejorar la eficacia antibacteriana de la n cina contra Listeria monocytogenes, produciendo una reducción significante, aunque no una eliminación completa de la Listeria a los niveles de uso seguros y adecuados.

Saaga^^^^^a^ifeas-» La Patente Europea Número 0 466 244 describe una composición que tiene propiedades antibacterianas mejoradas que comprende una mezcla de por lo menos uno de los siguientes grupos de compuestos: (I) una sustancia o una sal de la misma para lisar o destruir la pared celular, (II) un compuesto antibacteriano y (III) un adyuvante seleccionado de ácidos orgánicos aceptables para uso en productos de comida o preparaciones para uso cosmético o higiene personal o sales de estos ácidos, fosfatos y fosfatos condensados o los ácidos correspondientes y otros agentes secuestrantes. De preferencia (I) es lisozima, (II) puede ser una bacteriosina (por ejemplo nicina o pediocina) , y (III) puede ser ácido acético, diacetato de sodio, ácido láctico, ácido cítrico, ácido propiónico, ácido tartárico, ortofosfatos, hexametafosfatos, tripolifosfatos, orros polifosfatos o agentes secuestrantes que contienen grupos amino sustituidos o no sustituidos, por ejemplo el EDTA. La Patente Europea Número 0 453 860 sugiere la combinación de nicina con una solución reguladora de fosfato efectiva a un pH de entre 5.5 y 6.5 para erradicar las bacterias gram negativas de las superficies. El documento WO 97/23136 sugiere un método de descontaminación bacteriano que implica el tratamiento con una solución de ortofosfato de metal alcalino de baja concentración combinado con ya sea el choque osmótico y/o lisozima en solución y/o nicina en solución. Esta referencia probó la combinación de bajas concentraciones de ortofosfato de trisodio con lisozima contra ciertas bacterias en hojas de lechuga o cuero de pollo y la combinación de bajas concentraciones de ortofosfato de trisodio con nicina contra ciertas bacterias en el cuero de pollo. La solicitud de Patente Australiana publicada AU-A-18604/88 describe el uso de productos de enzima para lisar o destruir bacterias con N-acetilmuramidasa, por ejemplo lisozima, junto con conservadores no enzimáticos para conservar materiales alimenticios. Los conservadores no enzimáticos mencionados en esta publicación son agentes formadores de complejo tales como ácido cítrico y EDTA, aminoácidos, particularmente aminoácidos tales cono cisteína, alanina, tirosina y glicina, y nucleósidos y nucleótidos tales como inosina, 5'-inosina monofosfato o fosfatos tales como tetrasodiopirofosfato (difosfato) , tripolifosfato de sodio (trifosfato) y polifosfato o agentes para reñir de rojo tales como nitratos de metal alcalino. La Patente Norteamericana No. 5,286,506 describe el uso del extracto de beta ácidos soluble en agua de lúpulos por sus efectos bacteriostáticos contra la Listeria monocytogenes en comidas a 6 a 50 ppm en peso de la comida. Además, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,370,863 y 5,455,038 sugieren que ciertos derivados de acide de lúpulos que son químicamente hidrogenados pueden tener actividad antibacteriana contra las especies de Listeria . Sin embargo, estos extractos no son de grado alimenticio (GRAS) y no se permiten para el uso en comidas fuera de la fabricación de 5 cerveza. Finalmente, Johnson y colaboradores describen en el International Journal of Food Microbiology 33(1996) 195-207 que los ácidos de lúpulos y derivados de ácidos de lúpulos han limitado la eficacia contra las especies listeriales en comidas que contienen grasa tales como quesos, carnes, condimentos y aderezos, supuestamente debido a la migración o atrapamiento de los beta ácidos an la emulsión grasa y su indisponibilidad subsecuente para la inhibición del crecimiento bacteriano en la porción acuosa de la emulsión de comida. El problema de la falta de actividad de los beta ácidos de lúpulos en alimentos que contienen grasa les a impedido ser utilizados como agentes antimicrobianos naturales para el control de listeria u otros patógenos gram positivos . 20 Hasta el grado necesario para la terminación de esta solicitud de patente, todas las referencias citadas en lo anterior son expresamente incorporadas por referencia. En vista de las enseñanzas anteriores, aun existe una necesidad en la técnica por un método para tratar comidas con composiciones bactericidas que son efectivas a niveles de uso razonables en aplicaciones de comida comunes que están en riesgo por patógenos gram positivos. Más específicamente, todavía existe una necesidad para el tratamiento efectivo que pueda ser convenientemente integrado en los protocolos de procesamiento existentes para estos productos. Finalmente, aun existe una necesidad por la reducción más completa y efectiva, o aun la eliminación, de los patógenos gram positivos perjudiciales mediante el uso de niveles seguros, adecuados y efectivos en costo de ingredientes antimicrobianos de grado alimenticio tales como nicina, lisozima y ácidos de lúpulos.

Breve Descripción de la Invención Ahora se descubrió, muy sorprendentemente, que una composición que tiene un primer componente que incluye uno o más compuestos bacteriostáticos o bactericidas gram positivos de uno o más de las siguientes clases de materiales: lantibióticos, pediocina, y/o bacteriocinas de ia clase lacticina o enzimas líticas, y un segundo componente que incluye uno o más ácidos de lúpulos naturales o resinas de lúpulos o derivados de los mismos, proporciona excelentes propiedades antibacterianas, especialmente contra bacterias potencialmente perjudiciales del genero listepa , al sobrepasar notablemente la eficacia antibacteriana de cualquiera de los componentes individuales o de las composiciones previamente publicadas. Una modalidad de la presente invención comprende una composición antibacteriana que contiene como un primer componente: (a) uno o más compuestos bacteriostáticos o bactericidas gram positivos de una o más de las siguientes clases de materiales: lantibiótico, pediocina y bacteriocinas de la clase lacticina, y/o lisozima, una enzima natural de la clara de huevo; y como un segundo componente (b) uno o más ácidos de lúpulos o derivados de ácidos de lúpulos o resina de lúpulos o derivados de resina de lúpulos. Particularmente preferida, es una composición que contiene una bacteriocina lantibiótica, lisozima y extracto de beta ácido de lúpulos. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para retardar el crecimiento, reducir números viables o eliminar totalmente las bacterias gram positivas y especialmente la Listeria monocytogenes, en productos alimenticios, que comprenden la etapa de tratar la superficies del producto de comida con una cantidad efectiva ce una composición que comprende como un primer componente: (a) uno o más compuestos bacteriostáticos o bactericidas gram positivos de una o más de las siguientes clases de materiales: lantibióticos, pediocina y bacteriocinas de la clase iacticina o enzimas líticas; y como un segundo componente (b) uno o más ácidos de lúpulos o derivados de ácidos de lúpulos o resina de lúpulos o derivados de resina de lúpulos . Un objeto de la presente invención es proporcionar un proceso para tratar productos de comida con el fin de protegerlos contra las bacterias perjudiciales y con el fin de mantener la actividad antibacteriana de la composición regular sobre, o en una comida que contiene grasa. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición novedosa que tenga propiedades antibacterianas sustancialmente mayores que aquellas previamente observadas para los componentes individuales de la composición. Estos, y otros objetos, fácilmente serán evidentes para aquellas personas experimentadas en la técnica cuando se hace referencia a la descripción detallada de la modalidad preferida.

Descripción Detallada de la Modalidad Preferida En la descripción de la modalidad preferida, cierta terminología será utilizada por cuestión de claridad. Tal terminología se propone para abarcar la modalidad relatada, así también todas las técnicas equivalentes que funcionan de una manera similar para un propósito similar para lograr un resultado igual. La presente invención proporciona composición Mffpf fea antibacteriana novedosa y su uso en un proceso para reducir, retardar o eliminar totalmente las bacterias perjudiciales de las superficies de comida, aun en comidas que contienen grasa. La composición antibacteriana novedosa comprende: (a) uno o más compuestos bacteriostáticos o bactericidas gram positivos de una o más de las siguientes clases de materiales: lantibióticos, pediocina y bacteriocinas de la clase lacticina o enzimas líticas; y (b) uno o más extractos de ácido de lúpulos o derivados de ácido de lúpulos o resina de lúpulos o derivados de resina de lúpulos. El primer componente de la composición inventiva es uno o más compuestos que tienen actividad bacteriostática o bactericida contra las bacterias gram positivas. Tales compuestos, de preferencia incluyen, pero no están limitados al iantibiótico, pediocina y bacteriocinas de la clase lacticina y/o lisozima de la ciara de huevo, molusco u otras fuentes naturales. Las combinaciones de más de un compuesto que tiene actividad bacteriostática o bactericida contra las bacterias gram positivas (por ejemplo, nicina y lisozima) se contemplan específicamente que caen dentro del alcance más preferido del primer componente de la presente invención. Una primera clase de compuestos bacteriostáticos gram positivos comprende un lantibiótico. El término "lantibióticos" fue creado por Schnell y colaboradores (1988. , ftj^^^- .

Nature 333:276-278) para describir un grupo de bacteriocinas que incluye nicina que contiene el aminoácido lantionina y otros aminoácidos "no de proteínas". Las propiedades comunes de estas bacteriocinas son revisadas por Keller y colaboradores (1988. Eur. J. Biochem 177:53-59) en donde ellos mencionan que "...los antibióticos de polipéptido policíclicos poseen un alto contenido de aminoácidos insaturados (deshidroalanina, deshidrobutrina) y aminoácidos de tioéther (meso-lantionina, (2S, 3S, 6R) -3-metilantionina) . Además, se encuentran la lisinoalanina, ácido 3-hidroxiaspártico y S- (2-aminovinil) -D-cistina en algunos elementos". Los elementos de este grupo incluyen nicina, subtilina, pep 5, epidermina, galidermina, cinamicina, Ro09-0198, duramicina y ancovenina. Estos antibióticos de péptido ribosomalmente sintetizados contienen de 19 a 34 aminoácidos y se producen mediante varios microbios que incluyen las especies de Staphylococc s, bacterias de ácido láctico, especies de Bacill us y especies de Streptomyces . Además de su composición única de aminoácidos, no de proteína, se pueden distinguir de otros antibióticos de polipéptido en la base de su especificidad. Las bacteriocinas en general, y los lantibióticos en particular, se caracterizan por un espectro de acción muy reducido. Así, solamente unas cuantas especies de bacterias son sensibles a una bacteriocina particular a concentraciones prácticas, seguras y adecuadas. A niveles normales, legalmente permitidos de uso en comidas (por ejemplo hasta 12.5 ppm de nicina pura en un sistema de comida) , tales bacteriocinas tienden a tener solamente propiedades bacteriostáticas (es decir, inhibición del crecimiento) a lo mejor. Esto está en contraste con otros antibióticos de polipéptido de amplio espectro, tal como polymixyn Bl que son activamente bactericidas contra un amplio rango de bacterias, aún a niveles muy bajos de uso, así como los "péptidos líticos" discutidos por Jaynes y colaboradores en la solicitud internacional publicada WO 89/00194, que son activos contra la mayoría de bacterias, levaduras y aún células de mamíferos . La nicina es un péptido ribosomalmente codificado que ocasionalmente se presenta como un dímero con un peso molecular de aproximadamente 7000. Esta contiene varios aminoácidos no usuales que incluyen beta-metillantionina, deshidroalanina, y lantionina entre su total de 34 aminoácidos. Hay cinco enlaces de tio-éther no usuales en el péptido que contribuyen a su estabilidad en las soluciones de ácido. La nicina es una de las bacteriocinas más completamente caracterizadas, y comparte homología notable de estructura y acción con otros lantibióticos, por ejemplo Subtilina y epidermina [Buchman et al 1988. J. Bio. Chem. 263(31): 16260-16266]. Revisiones recientes de la nicina, sus propiedades físicas y usos incluyen "Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria"., T.R. Klaenha mer, 1988. Biochimie 70:337-349, "Nisin", A. Hurt, 1981. Avd. Appl. Microbiol. 27:85-121, y la Patente Norteamericana No. 4,740,593. La nicina es el nombre colectivo que describe varias sustancias estrechamente relacionadas que exhiben composiciones de aminoácidos similares y algún rango limitado de actividad antibiótica. Este fenómeno es discutido por E. Lipins a en "Antibiotics and Antibiosis in Agriculture" (M. Woodbine, Ed.) 1988, pp. 103-130. El uso de nicina para combatir L. monocytogenes ha sido reportado por M. Doyle; "Effect of Environmental and Processing Conditions J ? L s teria Monocytogenes" , Food Technology, 1988.42 (4) : 169-171. Esta referencia describe la inhibición inicial del crecimiento del organismo (durante aproximadamente 12 horas) y reporta que la L. Monocytogenes p-ede crecer a un nivel de pH tan bajo como 5.0 y es resistente al pH alcalino con la capacidad para crecer a un pH de 9.6. La nicina es comercialmente disponible de Rhodia Inc., en una preparación de 2.5% en peso normalizada bajo la irarca comercial NovasinMR. La proteína que contiene el lantibiótico también puede estar presente como un subproducto ce fermentación de bajo nivel en ciertas variedades de queso cneddar o americano y en el producto fermentado de leche descremada conocido como MICROGARDR MG300. En la práctica, el lantibiótico se agrega al producto de comida en cantidades entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 ppm (en peso de solución utilizada para tratamiento) de ingrediente activo (nicina), con niveles preferidos de 1 a 12.5 ppm., basado en la seguridad y conveniencia de uso en las comidas. Como alternativas al uso de lantibióticos en la combinación preferida, también se conoce que el uso de un metabolito bacteriano de Pediococcus, específicamente pediocina, como un sustituto puede producir resultados eficaces. Aunque las pediocinas aun no se han aprobado para el uso en comidas, se espera que puedan ser aceptadas para aplicación comercial en el futuro. Además, la nueva clase de bacteriocinas estreptococales llamadas lacticinas, especialmente Lacticin 3147 como es descrito en la solicitud de Patente Irlandesa No. 980500, debe producir actividad similar contra las bacterias gram positivas. Similar a los lantibióticos, tanto las pediocinas como las lacticinas se conocen que tienen una actividad bacteriostática principalmente contra un rango limitado de bacterias gram positivas. Una segunda clase de proteínas bactericidas gram positivas comprenden las enzimas líticas especialmente lisozima, más comúnmente derivadas de albúmina de huevo en un proceso de extracción de grado alimenticio, pero también disponible de las conchas árticas, leche humana, lágrimas y otras fuentes naturales. Cuando se utiliza lisozima como un antimicrobiano, ésta se agrega al producto de comida en cantidades dentro de aproximadamente 20 aproximadamente 500 ppm (en peso de la solución utilizada para el tratamiento) , más de preferencia entre aproximadamente 50 aproximadamente 200 ppm, principalmente para inhibir Clostridium tyrobutyricum en quesos sazonados. La lisozima no es un bactericida a estos niveles contra otras bacterias gram positivas, si no que se ha utilizado a niveles superiores (mayores que 1000 ppm, comúnmente 2000 ppm o mayores) para retirar la pared celular de un amplio rango de bacterias gram positivas. Las lisozimas (Muramidasa; mucopéptido N-acetilmucamoilhidrolasa; 1, -. eta. -N-acetilhexosaminodasa, E.C. 3.2.1.17) son enzimas mucolíticas que se han aislado de varias fuentes y son enzima., bien caracterizadas. La primera descubierta en 1922 por W. Fleming, la lisozima de clara de huevo estuvo entre las primeras proteínas secuenciadas, la primera para la cual se sugirió una estructura tridimensional utilizando cristalografía de rayos x y la primera para la cual se propuso un mecanismo detallado de acción. Su actividad antimicrobiana contra las bacterias gram positivas está bien documentada, por ejemplo, por V.N. Procter y colaboradores en CRC Crit. Reviews ín Food Science and Nutrition, 1988, 26 (4 ): 359-395. El peso molecular de la lisozima de clara de huevo es de aproximadamente 14,300 a 14,600, al punto isoeléctrico es el pH 10.5-10.7? Esta se compone de 129 aminoácidos que están interconectados por cuatro puentes de disulfuro. Enzimas similares se han aislado y caracterizado de otras fuentes que incluyen tales productores diversos como Escherichia coli bacteriophage T4 y lágrimas humanas. A pesar de las ligeras diferencias (por ejemplo, la lisozima humana tiene 130 aminoácidos) la capacidad para hidrólisis de polímeros de acetilhexosamina permanece esencialmente la misma. Por consiguiente, para propósitos de esta invención, el termino lisozima se propone para incluir aquellas enzimas degradantes de la pared celular o degradantes de peptidogiclano que tienen la capacidad para hidrolizar acetilhexosamina y los polí etros relacionados. La lisozima se conoce que extermina o inhibe el crecimiento de las bacterias y los hongos, y se utiliza en Europa para controlar el crecimiento del organismo de deterioro Clostridium tyrobutyricum en una amplia variedad de quesos. También se ha propuesto para el uso en una variedad de otras aplicaciones de conservación de comidas y se ha reportado que inhibe el crecimiento de (y en algunos casos extermina) la Listeria monocytogenes (Hughey y colaboradores, 1987, Appl. Environt. Microbiol 53:2165-2170). La lisozima derivada de albúmina de huevo con una actividad de 1 aproximadamente 20,000 unidades Shugar/mg es comercialmente disponible de Rhodia bajo la marca comercial NovaGARDMR En resumen, el primer componente de la composición novedosa de preferencia es la combinación previamente descrita de lantibióticos y enzimas líticas, especialmente la combinación más preferida de nicina y lisozima de clara de huevo. El segundo componente de la composición novedosa es uno o más extractos de ácidos de lúpulos o derivados de ácidos de lúpulos o resinas de lúpulos o derivados de resinas de lúpulos o combinaciones de algunos o todos de estos. Los componentes amargos de los lúpulos utilizados en la fabricación de cerveza, particularmente los beta-ácidos, ahora se han encontrado que son útiles como agentes bactericidas en productos de comida, particularmente en combinación con los componentes bacteriostáticos y/o bactericidas mencionados anteriormente. Los grupos más prevalentes de ácidos amargos contenidos en los lúpulos son los alfa-ácidos y los beta-ácidos, también referidos como humulonas y lupulonas, respectivamente. Ambos contribuyen al amargor de la cerveza, pero los alfa-ácidos son mucho más amargos que los beta-ácidos y no son deseables para el uso en la mayoría de productos de comida. Los productores de extractos de lúpulos aislan los alfa y beta-ácidos comercialmente mediante varios métodos cromatográficos y recientemente han desarrollado una técnica para separar las dos fracciones de ácido utilizando dióxido de carbono líquido bajo condiciones supercríticas. Un subproducto de la operación es un producto que contiene aproximadamente 61 por ciento en peso de beta-ácido, el resto que consiste esencialmente de resinas de lúpulos. Este sub-producto puede ser normalizado con malto dextrina u otro portador de grado alimenticio, secado por rocío y utilizado como un ingrediente alimenticio antibacteriano. Una composición de beta ácidos de lúpulos preferida está comercialmente disponible como un extracto de sabor natural que contiene 1 por ciento en peso de beta ácidos de lúpulos. Los alfa-ácidos contenidos en los lúpulos son comúnmente conocidos como humulona, cohurnulona y adhumulona mientras que los beta-ácidos contenidos en los lúpulos son comúnmente conocidos como lupulona, colupulcna y adlupulona. Los derivados químicamente modificados de los ácidos de lúpulos o resinas de lúpulos que han demostrado propiedades anticacterianas, tales como hexahidrocolupulona y tetranidroisohumulona, como es descrito en la Patente Norteamericana No. 5,455,038, se contemplan específicamente para el uso en asociación con la presente invención. También considerado, como específicamente contemplado, para el uso en asociación con la presente invención, está el uso de las formas de sal de ácido de los ácidos de lúpulos o res as de lúpulos. En la práctica, el ácido o resina de lúpulos o derivados de los mismos se agrega al producto de comida en cantidades entre aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 ppnr del ingrediente activo (en peso de solución utilizada para el tratamiento), más de preferencia entre aproximadamente 0.40 a aproximadamente 20 ppm. Otros aditivos que pueden estar presentes en la composición inventiva incluyen, pero no están limitados a los siguientes materiales: otros antibacterianos, tal como quitosan o sus derivados y/o agentes quelantes, sazonadores naturales o sintéticos, aceites esenciales y/o saborizantes, tintes y/o colorantes, vitaminas, minerales, nutrientes, enzimas, agentes aglutinantes tales como goma guar y goma de xantano y los semejantes. En modalidades particularmente preferidas, la goma guar esta presente en la composición inventiva para ayudar en el aglutinamier.ro de los componentes antimicrobianos a la superficie de la comida que es tratada. La adición de estos materiales no se considera crítica para el éxito de la presente invención y será considerada dentro de la habilidad de la persona experta. La composición antimicrobiana de la presente invención puede ser utilizada en relación con cualquier producto alimenticio que sea susceptible a la degradación microbiana. Estos incluyen, pero no están limitados a frutas y vegetales que incluyen productos derivados, grano y producto derivado de grano, alimentos lácteos, carne, aves y comida de mar. En las modalidades particularmente preferidas, la composición se utiliza en relación con la carne, las aves y/o la comida de mar, más particularmente con las carnes cocidas que contienen grasa tales como bocadillos de salchicha (hot dogs) , embutidos, carne de res asada, pavo, cecina y carnes delicatessen. Para reducir la cantidad de bacterias sobre una superficie de comida, la composición novedosa simplemente es aplicada a la superficie de comida ya sea antes o después del cocimiento. En la practica, la aplicación de la composición de materia a la superficie de la comida puede ser ya sea una aplicación directa o una aplicación indirecta. El uso del termino "superficie de comida" se define para incluir cualquiera y todas las superficies internas o externas del producto de comida que es tratado. La composición de acuerdo con la presente invención es más fácilmente utilizada al aplicarla sobre la superficie exterior de un producto de comida mezclado, tal como un bocadillo de salchicha o salchicha de bolonia, o de una comida sólida, tal como una pieza de carne de res asada, para minimizar la perdida de actividad en la fase grasa de la comida. La cor.posición alternativamente puede ser incluida en la emulsión o en los ingredientes crudos de una comida tales como condimentos o salsas, antes o después del cocimiento, o al interior de los productos sólidos, tales como jamones, mediante la inyección o rodamiento. Todavía en otras modalidades, la composición se puede aplicar como' un escabeche, empanizado, frotación con aderezo, glaseado, mezcla colorante y los semejantes, los criterios claves son que la composición antimicrobiana esté disponible a la superficie sometida a la degradación bacteriana. En una modalidad preferida, la composición puede ser colocada indirectamente en contacto con la superficie de la comida al aplicar la composición a los materiales de empaquetamiento de la comida o envolturas y después al aplicar la envoltura a la superficie de la comida. El uso de estrategias de tratamiento a la superficie, ya sea directo o indirecto, se beneficia de la minimización de perdida en la fase grasa del producto de comida que contiene grasa. La cantidad bacteriostática o bactericidamente óptima, efectiva, que es utilizada dependerá sobre la composición del producto de comida particular a ser tratado y el método utilizado para aplicar la composición a la superficie de la comida, pero puede ser determinado mediante la simple experimentación. En una modalidad preferida de esta invención, la composición antibacteriana comprende de aproximadamente 38.5 a 99.8 partes en peso del primer componente, que incluye por lo menos un compuesto bacteriostático o bactericida seleccionado al grupo que consiste de lantibióticos, pediocina, bacteriocinas de la clase lacticina y enzimas líticas; a aproximadamente 61.5 a 0.2 partes en peso del segundo componente, que incluye por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulos, derivados de ácidos de lúpulos, resinas de lúpulos y derivados de resinas de lúpulos; todas las partes en peso son basadas en el peso total del primero y el segundo componente de la composición. En una modalidad de composición más específicamente preferida de esta invención, en donde el primer componente comprende dos compuestos, se prefiere que la composición comprenda, como un primer componente, de aproximadamente 1.0 a 2.5 partes en peso del lantibiótico, y de aproximadamente 37.5 a 97.3 partes en peso de enzima lítica; y como un segundo componente, de aproximadamente 61.5 a 0.2 partes en peso de por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulos, derivados de ácidos de lúpulos, resinas de lúpulos y derivados de resinas de lúpulos; todas las partes en peso son basadas en el peso total del primero y del segundo componente de la composición. Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran las composiciones antimicrobianas de amplio rango que constituyen la presente invención.

Ejemplo 1 Como se muestra en la Tabla 1, dos cepas bacterianas gram positivas son probadas en caldo de soya Trypticase, pH 6.0 a 30° C durante 48 horas para mostrar el efecto inhibidor de la preparación de nism • a Novasm• MR, lisozima y beta ácidos de lúpulos ya sea solos o en combinación. La prueba demuestra el efecto sorprendentemente sinergístico del NovasinMR, lisozima, y beta ácidos de lúpulos (BHA) . La tabla 1 muestra que a la misma concentración, la combinación de Novasin^ , lisozima y BHA tiene una inhibición significativamente mejor que el uso de cada componente solo o en combinaciones de dos componentes. La combinación de tres componentes demuestra una reducción 5 log de ambas cepas, mientras que se observa solamente una reducción de 1 a 3 log para cualquier tratamiento de componente único o tratamiento de dos componentes.

Tabla 1 CFU/ ml Tratamiento L. Alimentarius L. monocytogenes Control 3.1 x 10e8 1.4 x 10e8 Novasin (NS)50 ppm 5.3 x 10e6 7.1 x 10e7 Lisozima (LY) 50 ppm 6.3 x 10e6 2.5 x 10e7 Beta ácidos de lúpulos (BHA) *5ppm 1.2 x 10e8 6.2 x 10e6 NS 50 ppm + LY 50 ppm 2.5 x 10e5 4.1 x 10e5 LY 50 ppm + BHA 5 ppm 5.6 x 10e6 6T3 x 10e6 NS 50 ppm + BHA 5 ppm 3.5 x 10e5 5.2 x 10e5 NS 50 ppm, LY 50 ppm, BHA 5 ppm 2.8 x 10e3 3.1 x 10e3 *En esta especificación, BHA significa beta ácidos de lúpulos.

Ejemplo 2 Para demostrar la eficacia in vivo de la composición inventiva, bocadillos de salchicha son inoculados con Listeria monocytogenes . Los bocadillos de salchicha son sumergidos en suspensiones que contienen ya sea (1) NovasinMR, lisozima y BHA; o (2) NovasinMR y BHA, y luego inoculados con L . monocytogenes sobre las superficies. Los bocadillos de salchichas luego son empaquetados en bolsas estériles y mantenidos a 10°C durante 13 días. En cada día de muestreo, los bocadillos de salchicha son enjuagados con solución salina estéril y las resinas son colocadas en placas sobre agar selectivo de Listeria para obtener un conteo de Listeria . El enriquecimiento es realizado para los bocadillos de salchicha al transferir 1 ml del enjuague al caldo de BHI y al incubar durante 24 horas seguido por la colocación en placas sobre agar selectivo de Listeria . Los tratamientos que tienen un conteo de 0 sobre el agar selectivo de Listeria después del enriquecimiento son considerados como negativos y reportados como una fracción del total de muestras tratadas. La Tabla 2 muestra que mientras que la inmersión en Novasin™ y BHA reduce significativamente los niveles iniciales de Listeria monocytogenes en los bocadillos de salchicha, la combinación de tres componentes reduce los niveles de Listeria monocytogenes a niveles prácticamente indetectables ya sea mediante la colocación en placas directa o mediante las técnicas de recuperación de enriquecimiento. En esta combinación de tres componentes no se observa sobrevivencia de Listeria monocytogenes viable, como es confirmado por los resultados negativos (3/3) después de las técnicas de enriquecimiento sensibles que son utilizadas para recuperar bajos niveles de células dañadas. El descubrimiento de que todas las muestras tratadas con la combinación novedosa de tres componentes fueron negativas para Listeria morccytcgenes aún después del enriquecimiento, es el descubrimiento más inesperado ae esta solicitud. No se ha reportado descubrimiento de esta clase previamente utilizando cualquiera de estos ingredientes antimicrobianos a los niveles de utilización seguros y adecuados descritos en la presente.

Tabla 2 CFU/ bocadillo de salchicha Negativo Tratamiento Dia-0 Dia-2 Dia-13 después del enriquecimiento Control 5xl0e4 I.lxl0e5 9.2xl0e6 NA BHA 5X10e4 30 25 1/3 5X10e4 <10 <10 3/3 Ejemplo 3 Como se muestra en la tabla 3, dos formadores de esporas gram positivos del genero Bacillus se probaron en caldo de soya de Trypticase, pH ß.O a 30° C por 48 horas para mostrar el efecto inhibidor de Novacin, lisozima y beta ácidos de lúpulos ya sea solos o en combinación. La prueba demuestra el efecto sorprendeprerrente sinergístico de la combinación de Novasin, lisozir^a y beta ácido de lúpulos contra formadores de esporas. La TaDla 3 muestra que a la misma concentración, la combinación de Novasin, lisozíma y BHA muestra inhicición significativamente mejor que cualquier ingrediente solo o con solo dos componentes aparte de los tres. La combinación de tres componentes da un exterminio completo de todas las esporas inoculadas, mientras que se observa significante, pero no eliminación completa, por los tratamientos con un solo componente con dos componentes. Así, en la presente se demuestra concluyentemente que una composición de Novasin, lisozima y BHA demuestra actividad bactericida sinergística contra las bacterias formadoras de esporas . Tabla 3 Tratamiento CFU/ mi B. subtilis B . cereus Control 2.5 x 10e8 1.1 x 10e8 50 ppm Novasin 3.2 x 10e4 6.4 x 10e6 1 ppm BHA 360 5 x 10e3 100 ppm Lisozima 1.2 x 10e8 1.1 x 10e8 50 ppm Novasin + 1 ppm BHA 40 50 ppm Novasin, 1 ppm BHA y 50 ppm Lisozima <10 <10 Ejemplo 4 La eficacia de la composición inventiva para jamones cocidos es demostrada en ia tabla 4. Los gamones cocidos se inocularon con Listeria monocytogenes score la superficie y luego se trataron tópicamente al rociar la superficie con una solución de ya sea Novasin™ , lisczima y BHA (tratamiento A) ; o lisozima y BHA (tratamiento b . Los jamones luego se envolvieron por contracción y se envasaron al vacío en bolsas estériles y se almacenaron a 4° C 40° F) t£ si£. por 60 días. En cada día de muestreo, los jamones se enjuagaron con solución reguladora estéril y la resina se colocaron sobre agar selectivo de Listeria para determinar el conteo de Listeria viable. Los métodos de enriquecimiento" se realizaron para las muestras con el conteo de Listeria por debajo de los niveles de conteo en placa detectable al transferir 1 ml del enjuague al caldo de infusión de cerebro corazón (BHI) y al incubar durante 24 horas seguido por la colocación sobre agar selectivo de Listeria . Los tratamientos que tuvieron un conteo negativo (menor que 1/ml) sobre agar selectivo de Listeria después del enriquecimiento son considerados como negativos y reportados como una fracción del total de muestras tratadas. La Tabla 4 muestra que la combinación de tres componentes redujo la Listeria monocytogenes inoculada a niveles indetectables, ya sea mediante la colocación en placas directa o mediante las técnicas ae recuperación de enriquecimiento, mientras que el grupo de control se incrementé 10,000 veces (4 logs) . La combinación de dos componentes "lisozima mas BHA" mostró inhibición pero no fue tan bactericida. En la combinación de tres componentes no se observó sobrevivencia de la Listeria monocytogenes viable, como es confirmado por los resultados negativos después del enriquecimiento. Una técnica que es utilizada para recuperar niveles muy bajos de células viables o dañadas. Por lo tanto, los datos demuestran que la aplicación tópica de la composición de tres componentes, preferida, puede eliminar completamente la Listeria monocytogenes en un alimento procesado de alto contenido de grasa, tal como jamón cocido.

Tabla 4 Conteos de Listeria CFU/ Paquete de jamón Día Control Tratamiento A Tratamiento B 1 250 0 50 7 280 0 200 15 290 0 160 30 6100 0 200 45 6600 0 4600 60 20000 0 5500 Ejemplo 5 La eficacia de la composición inventiva para proteger salchichas de Viena de la Listeria monocytogenes es demostrada en la Tabla 5. La composición del Novasin y BHA se suministró sobre la superficie de las salchichas Viena mediante la incorporación de la composición en la envoltura celulósica que contiene la emulsión para bocadillo de salchicha durante el cocimiento. Después del cocimiento, las envolturas se desprendieron y luego las salchichas Viena terminadas se inocularon en la superficie con Listeria monocytogenes y se empacaron al vacío en bolsas estériles. Las salchichas Viena inoculadas, empaquetadas se almacenaron a 4°C (40°F) durante aproximadamente 60 días, con los paquetes frescos abiertos para cada punto de muestreo. En cada muestreo, las salchichas Viena se enjuagaron junto con su paquete utilizando solución reguladora estéril y las soluciones reguladoras luego se colocaron en agar selectivo de Listeria para determinar el conteo de Listeria viable. La Tabla 5 muestra que la combinación de dos componentes inhibió el crecimiento de la Listeria monocytogenes por más de 61 días y dio por resultado al final de la incubación en una reducción de Li steria mayor que 4 log (10,000 veces) comparada a los controles. Los datos demuestran que la aplicación suministrada a la envoltura de la composición preferida de dos componentes previene el crecimiento excesivo de Listeria monocytogenes en las salchichas de Viena y puede ser una manera comercialmente práctica para suministrar la composición y de esta manera mejorar la seguridad de las salchichas de Viena y los embutidos. Más importantemente, el método de aplicación en la superficie permite que la actividad de los componentes sea completamente realizada, aún en el ambiente de alto contenido de grasa de una emulsión común de bocadillo de salchicha. En contraste, la actividad antimicrobiana notablemente es reducida cuando la composición se emplea como un ingrediente dentro de la emulsión de bocadillo de salchicha antes del cocimiento (datos no mostrados) , consistente con las observaciones por los autores anteriores que demuestran la pérdida de la actividad de nisina (Muriana, P.M. and Kanach, L, Use of Nisaplin to Inhibit Spoilage Bacteria in Buttermilk Ranch Dressing, J. Food Protection, Vol.58, No 10, 1995) y la actividad de los ácidos de lúpulos (Johnson y colaboradores, 1996) en comidas que contienen niveles de grasas significativos. Por lo tanto, el método descrito de aplicación en la superficie revela una manera sorprendente para maximizar la eficacia de la composición inventiva en comidas que contienen niveles elevados de grasas (mas del 4% p/p). Tabla 5 Conteos de Listeria log CFU/paquete Salchicha de Viena hecha Salchicha de Viena hecha Días con envoltura de control con envoltura tratada 0 2.72 2.72 7 2.51 1.8 27 3.66 1.92 33 4.3 1.84 40 4.34 2.23 54 5.48 3.43 61 6.83 2.08 Habiéndose descrito la invención en detalle y con referencia a las modalidades preferidas de la misma, será evidente que las modificaciones y variaciones son posibles sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición antibacteriana, caracterizada por que comprende: (a) un primer componente que incluye por lo menos un compuesto bacteriostático o bactericida gram positivo seleccionado del grupo que consiste de laritibióticos, pediocina y bacteriocinas de la clase lacticina y/o enzimas líticas; y (b) un segundo componente que incluye por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulos, derivados de ácidos de lúpulos, resinas de lúpulos y derivados de resinas de lúpulos.
2. 2. Una composición antibacteriana, caracterizada porque comprende: (a) un primer componente que incluye por lo menos un compuesto bacteriostático o bactericida gram positivo, seleccionado del grupo que consiste de lantibióticos y enzimas líticas; y (b) un segundo componente que incluye por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulos, derivados de ácidos de lúpulos, resinas de lúpulos y derivados de resinas de lúpulos.
3. 3. Una composición antibacteriana, caracterizada porque comprende: (a) nisina; (b) lisozima; y (c) beta ácidos de lúpulos o un derivado de beta ácido de lúpulos .
4. 4. La composición antibacteriana de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada por que el primer componente comprende de aproximadamente 38.5 a 99.8 partes en peso y el segundo componente comprende de aproximadamente 61.5 a 0.2 partes en peso; todas las partes en peso que están basadas en el peso total del primero y el segundo componente de la composición.
5. 5. La composición antibacteriana de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer componente comprende de aproximadamente 1.0 a 2.5 partes en peso de lantibiótico y de aproximadamente 37.5 a 97.3 partes en peso de enzima lítica y el segundo componente comprende de aproximadamente de 61.5 a 0.2 partes en peso de por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulos, derivados de ácidos de lúpulos; todas las partes en peso que están basadas sobre el peso total del primero y el segundo componente de la composición.
6. 6. Un método para reducir bacterias gran positivas en productos de comida, caracterizado porque comprende la etapa de tratar las superficies alimenticias del producto de comida con una cantidad bacteriostática o bactericidamente efectiva de una composición que comprende: (a) un primer componente que comprende por lo menos un compuesto bacteriostático o bactericida gram positivo seleccionado del grupo que consiste de lantibióticos, pediocina, bacteriocinas de la clase lacticina y enzimas líticas; y (b) un segundo componente que comprende por lo menos un compuesto" seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulos, derivados de ácidos de lúpulos, resinas de lúpulos y derivados de resinas de lúpulos.
7. 7. Un método para reducir bacterias gram positivas en productos de comida, caracterizado porque comprende la etapa de tratar las superficies alimenticias del producto de comida con una cantidad bacteriostática o bactericidamente efectiva de una composición que comprende: (a) un primer componente que incluye por lo menos un compuesto bacteriostático o bactericida gram positivo, seleccionado del grupo que consiste de lantibióticos y enzimas líticas; y (b) un segundo componente que incluye por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulos, derivados de ácidos de lúpulos, resinas de lúpulos y derivados de resinas de lúpulos.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la composición comprende a) nicina; b) lisozima; y c) beta ácidos de lúpulos o derivados de beta ácidos de lúpulos.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el primer componente comprende de aproximadamente 38.5 a 99.8 partes en peso y el segundo componente comprende de aproximadamente 61.5 a 0.2 partes en peso; todas las partes en peso que están basadas sobre el peso total del primero y segundo componente de la composición.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el primer componente comprende de aproximadamente 1.0 a 2.5 partes en peso del lantibiótico y de aproximadamente 37.5 a 97.3 partes en peso de enzima lítica y el segundo componente comprende de aproximadamente 61.5 a 0.2 partes en peso de por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulos, derivados de ácidos de lúpulos; todas las partes en peso que están basadas sobre el peso total del primero y segundo componente de la composición.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el producto de comida es un sólido que contiene niveles de grasa de mas de 4%.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado por que el producto de comida es carne procesada .
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa de tratamiento comprende: a) recubrir la composición sobre una superficie de ar.a envoltura, película o material de empaque, y b) subsecuentemente llevar la superficie recubierta con composición, en contacto íntimo con el producto de comida.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las bacterias gram positivas son del género Listeria .
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la Listeria es Listeria monocytogenes o Listeria inocua .
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las bacterias gram positivas son formadorás de esporas.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el formador de esporas es Bacillus spp.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el formador de esporas es Clostridia spp. • »*» **&-