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MXPA01013114A - Conjugados y metodos para la produccion de los mismos, y su uso poara transportar moleculas a traves de membranas biologicas. - Google Patents

Conjugados y metodos para la produccion de los mismos, y su uso poara transportar moleculas a traves de membranas biologicas.

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MXPA01013114A
MXPA01013114A MXPA01013114A MXPA01013114A MXPA01013114A MX PA01013114 A MXPA01013114 A MX PA01013114A MX PA01013114 A MXPA01013114 A MX PA01013114A MX PA01013114 A MXPA01013114 A MX PA01013114A MX PA01013114 A MXPA01013114 A MX PA01013114A
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MX
Mexico
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oligonucleotide
molecule
conjugate
transported
group
Prior art date
Application number
MXPA01013114A
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English (en)
Inventor
Uhlmann Eugen
Original Assignee
Aventis Pharma Gmbh
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Publication date
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Abstract

La invencion se refiere a conjugados, metodos para su produccion, y al uso de estos conjugados para transportar compuestos de bajo peso molecular y macromoleculas a traves de membranas biologicas, particularmente, para transportar moleculas en celulas. La invencion se refiere tambien a farmacos, agentes de diagnostico y conjuntos de elementos de prueba en donde estos conjugados estan presentes o introducidos.

Description

CONJUGADOS Y MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN DE LOS MISMOS, Y SU USO PARA TRANSPORTAR MOLÉCULAS A TRAVÉS DE MEMBRANAS BIOLÓGICAS La presente invención ofrece conjugados, procesos para su preparación y el uso de estos conjugados para transportar compuestos de bajo peso molecular y macromoléculas a través de membranas biológicas, en particular para transportar moléculas en células. La presente invención ofrece también fármacos y auxiliares para diagnóstico asi como conjuntos de elementos para pruebas en donde dichos conjugados están presentes o introducidos. Frecuentemente, un factor limitante para la utilización terapéutica de moléculas cuyo blanco se encuentra dentro de la célula es su absorción celular insatisfactoria y distribución intracelular desfavorable. Ejemplos típicos son macromoléculas tales como ácidos nucleicos que se unen de forma especifica para secuencias a ADN o ARN celular, inhibiendo por consiguiente la expresión génica. Oligonucleótidos de antisentido son ácidos nucleicos de cadena única cortos que se unen a través de pares de bases de Watson-Crick a ARNm complementario, cuya traslación en la proteina correspondiente debe ser inhibida. Oligonucleótidos que forman triplex se unen a través de lo que se conoce como "apareamiento de bases de Hoogsteen" a la ranura profunda de la doble hélice de AD? formando una hélice triple, inhibiendo por consiguiente la transcripción de los genes en forma especifica para secuencia. Otros oligonucleótidos que actúan de manera intracelular son, por ejemplo, los que se conocen como oligonucleótidos de "señuelo" que imitan las regiones de enlace para factores de transcripción. Mediante el tratamiento con oligonucleótidos de señuelo, ciertos factores de transcripción pueden ser interceptados de manera especifica para secuencia, inhibiendo asi la activación de la transcripción. Un grupo adicional de oligonucleótidos que actúan de manera intracelular, los quimeraplastos, se emplean para corrección génica enfocada (Cole-Strauss et al., Science 273 (1996) 1386-1389) . Para esta corrección de genes, también, la absorción del oligonucleótido de qui eraplasto en la célula es esencial. Ejemplos de ácidos nucleicos que actúan intracelularmente adicionales son los ácidos nucleicos que interactúan con enzimas celulares, particularmente con telomerasas (Norton et al. Nat. Biotechn. (1996) 14, 615) . Una clase adicional de ácidos nucleicos, de preferencia ADN de cadena doble, puede codificar ciertas proteínas que son expresadas de manera intracelular en el sentido de terapia génica. Por ejemplo, la absorción de un oligonucleótido in vitro en una célula, por ejemplo mediante adición simple del oligonucleótido al medio de cultivo celular, es un proceso relativamente ineficiente, puesto que solamente una pequeña fracción del oligonucleótido agregado es de hecho absorbida en la célula. El proceso de absorción lleva muchas horas, y en la mayoria de los casos, se alcanza una fase de meseta solamente después de 8 a 16 horas. Se considera que los oligonucleótidos son absorbidos en un proceso de tipo endocitosis. Sin embargo, un problema general con la absorción a través de la endocitosis es que una gran proporción de los oligonucleótidos están presentes no de manera libre en el citoplasma si no encerrados en ciertas estructuras celulares, es decir, los lisosomas y endosomas. En el caso de oligonucleótidos marcados de manera fluorescente, esta distribución localizada puede ser observada de hecho por microscopia de fluorescencia. Debido a esta ubicación vesicular, la concentración de oligonucleótido libre que se encuentra de hecho disponible para hibridación con el ARNm es considerablemente reducida. Además, según el tipo de células y las condiciones presentes, solamente una cierta fracción de las células absorben el nucleótido. Por consiguiente, para el uso eficiente de oligonucleótidos de antisentido, se emplean generalmente mezclas con incrementadores de penetración, como por ejemplo lipidos catiónicos (Bennett et al. Mol. Pharmacol. 41 (1992) 1023). Es un objeto de la presente invención mejorar la absorción celular de moléculas, particularmente de macromoléculas, como por ejemplo oligonucleótidos.
El examen de la absorción celular de oligonucleótidos se efectúa generalmente ya sea empleando oligonucleótidos marcados de manera radioactiva o marcados de manera fluorescente. El marcado con fluorescencia de un oligonucleótido se efectúa, por ejemplo, mediante la reacción de la función amino de un oligonucleótido con isotiocianato de fluoresceína (FITC) . La fluoresceina puede ser introducida, por ejemplo, en el extremo 3' del oligonucleótido a través de un soporte de fase sólida derivado de fluoresceína disponible comercialmente, o bien en el extremo 5' a través de un reactivo de fosfitilación de flaoresceina disponible en el comercio. En todos los casos, la fluoresceína unida a los oligonucleótidos, debido a la función de ácido carboxílico, se encuentra presente como un elemento estructural cargado negativamente fuertemente fluorescente. radical FDA (F3) radical fluoresceina (FO) En contraste con la fluoresceína, el diacetato de fluoresceína (FDA) es un colorante vital neutral que es transformado en la fluoresceina fluorescente solamente después de la remoción de los dos grupos esteres y después de la abertura del anillo de lactona, pero que no es fluorescente en forma de lactona. Se sabe que el FDA (se conoce a continuación también como "F3"), como molécula no fluorescente neutral,' es absorbido por células vivas a través de difusión pasiva y es disociado intracelularmente por esterasas para proporcionar la fluoresceína fluorescente (Breeuwer et al. Appl. Environ. Microbiol. (1995) 61, 1614; Maeda et al. Cell Struct. Funct . (1982) 7, 177) . A la fecha, los únicos derivados de FDA descritos han sido los que contienen un grupo reactivo con amina como por ejemplo isotiocianato; estos derivados de FDA se emplean para teñir proteinas intracelulares o bien componentes celulares. Conjugados de FDA con otras moléculas no han sido descritos a la fecha; de manera correspondiente, oligonucleótidos marcados con FDA (conjugados de FDA y oligonucleótidos) tampoco han sido descritos a la fecha. En el citoplasma, el FDA es disociado por esterasas; por consiguiente, es posible determinar, por marcado con FDA de un oligonucleótido, la proporción de oligonucleótido "libre", es decir, la proporción de oligonucleótido presente en el citoplasma - y disponible para hibridación - con relación a la proporción de oligonucleótido presente en vesícula (oligonucleótido "capturado") - y por consiguiente no disponible para hibridación. Debido al número total elevado de cargas negativas en un oligonucleótido y debido al hecho que oligonucleótidos marcados con FDA y oligonucleótidos marcados con fluoresceína (en el caso en el cual el oligonucleótido es idéntico) difieren solamente por una carga neta, se esperaba que oligonucíeótidos marcados con FDA y oligonucleótidos marcados con fluoresceína presentarían absorción y distribución celulares muy similares. Sin embargo, de manera sorprendente, se ha encontrado que oligonucleótidos marcados con fluoresceína y oligonucleótidos marcados con FDA difieren considerablemente en cuanto a su absorción en células es decir, en ambos casos con relación a la duración y la eficiencia de la absorción de los oligonucleótidos y además también con relación a la ubicación celular de los oligonucleótidos que han sido absorbidos. Un oligonucleótido marcado con FDA es absorbido de manera mucho más rápida por células que el oligonucleótido marcado con fluoresceína correspondiente. Mientras la absorción de oligonucleótidos marcados con fluoresceína y marcados de manera radioactiva requiere de varias horas, los oligonucleótidos marcados con FDA pueden ser detectados de manera intracelular después de solamente cinco minutos después de incubación simple, por ejemplo, con células humanas. Fue también sorprendente que los oligonucleótidos marcados con FDA fueron absorbidos virtualmente en cualquier célula (> 90% de las células) , mientras que el régimen de absorción en los métodos descritos a la fecha para la transferencia de oligonucleótidos o polinucleótidos en células es generalmente mucho menor; en el último caso, frecuentemente solamente aproximadamente 30 a 60% de las células están cargadas con oligonucleótidos. Además, la distribución intracelular de los oligonucleótidos marcados con FDA es mucho más uniforme, lo que es provechoso. Esta distribución más uniforme indica que los oligonucleótidos no están - como descrito arriba - encerrados principalmente en vesículas (por ejemplo endosomas, lisosomas), sino distribuidos en toda la célula - es decir, en el citosol y en el núcleo; es una indicación que una parte importante de oligonucleótido "libre" está presente. Solamente estos oligonucleótidos "libres" están disponibles para unión sobre el blanco (molécula blanco, ácido nucleico blanco) o bien como compuesto activo. Otra ventaja es el hecho que no se observó ningún daño a las células cuando se emplearon oligonucleótidos marcados con FDA; en contraste, el uso de realzadores de penetración lipocatiónicos resulta frecuentemente en daño de la membrana celular. Como consecuencia de estas propiedades inesperadas, los oligonucleótidos marcados con FDA, en comparación con los métodos descritos hasta la fecha para introducir oligonucleótidos o polinucleótidos en. -células, tienen la ventaja decisiva que pueden ser introducidos en las células de manera más efectiva, en donde presentan una mejor disponibilidad. Debido a estas ventajas, los oligonucleótidos marcados con FDA tienen una actividad biológicamente considerablemente mejorada. Debido a la actividad biológica mejorada, se debe de emplear una cantidad menor de oligonucleótidos . Debido a esto y debido al hecho que un oligonucleótido marcado con FDA es absorbido de manera más efectiva - ambas cosas con relación a la cantidad y al tiempo - en una célula, se reducen los efectos colaterales (tóxicos) . Sorprendentemente, se ha descubierto que las propiedades provechosas no se limitan a oligonucleótidos marcados con FDA, sino que virtualmente cualquier molécula puede ser introducida de manera efectiva en una célula o transportada a través de una membrana biológica con la ayuda de marcado con FDA - es decir, mediante el acoplamiento de una molécula a transportar, al FDA o bien conjugándola ("conjugado de FDA") . Además, se ha encontrado que este principio no se limita a conjugados de FDA sino que se aplica también a todos los conjugados de éster arílico de una cierta estructura química. Asi, la presente invención es un principio novedoso para transportar moléculas a través de membranas biológicas.
Puesto que estos compuestos a la fecha no han sido descritos, excepto en un caso, en la técnica anterior, los conjugados correspondientes - una molécula a transportar acoplada o conjugada con un éster arílico de una cierta estructura química - forman también parte de la materia de la presente invención. Estos conjugados no pueden ser preparados por procesos conocidos; la presente invención ofrece también un proceso para la preparación de los conjugados. Conjugados de O-acilarilo bioreversibles, que han sido propuestos como profármacos de oligonucleótidos (Iyer et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 7 (1997) 871-876), son conocidos. La estructura química de estos compuestos es - en el caso, en el cual el radical arilo es un anillo aromático de 6 miembros - similar a la estructura química de los conjugados de conformidad con la invención. Sin embargo, en los conjugados de O-acilarilo bioreversibles, la hidrólisis del éster resulta en una desestabilización del enlace entre el radical arilo y el fosfotriéster del oligonucleótido, de tal manera que el radical O-acilarilo bioreversible es disociado en sus componentes, es decir, el oligonucleótido libre y el radical O-acilarilo. Este concepto de profármaco sirve para enmascarar la carga negativa del puente de fosfato internucleótidos y por consiguiente facilitar la absorción del oligonucleótido en la célula. Sin embargo, en contraste con los conjugados de conformidad con la invención, no se ha encontrado para estos fármacos una absorción acelerada de los oligonucleótidos en las células y de la misma manera no se encontró ninguna distribución intracelular cambiada de los oligonucleótidos. Además, no se ha reportado ninguna absorción de los oligonucleótidos en otros organismos. En contraste, en los conjugados de conformidad con la invención, el enlace covalente entre el radical arilo y el oligonucleótido es conservado durante la absorción en la célula; la preservación del enlace covalente entre el radical arilo y el oligonucleótido puede ser determinada fácilmente por microscopía de fluorescencia si la unidad aromática es solamente fluorescente después de la disociación del éster, como por ejemplo en el caso de FDA. La presente invención ofrece un conjugado que comprende por lo menos una molécula a ser transportada y por lo menos un radical arilo de la fórmula I, 0) en donde arilo es un grupo que contiene por lo menos un anillo que tiene un carácter aromático; X es 0 o N; de preferencia X = 0; Y es 0, S o bien NH-R~; de preferencia Y = O; R1 es un radical alquilo C:-C23 sustituido o insustituido que puede ser de cadena recta o ramificada y puede contener enlaces dobles y/o enlaces triples; por ejemplo un radical arilalquilo; R2 es un radical alquilo -Cis sustituido o insustituido que puede ser de cadena recta o ramificado y puede contener enlaces dobles y/o enlaces triples; y n es un número entero mayor que 1 o igual 1, en donde el radical arilo está unido a la molécula a ser transportada ya sea directamente a través de un enlace químico o bien indirectamente a través de un grupo químico, en donde el grupo químico no es un grupo CH:-S si la unión es a través de un enlace de fosfodiéster entre nucleótidos de la molécula a transportar. La molécula a transportar puede ser cualquier molécula. La molécula a transportar tiene de preferencia un peso molecular de > 350 daltones. Una modalidad de la presente invención se refiere a conjugados en donde la molécula a transportar es una macromolécula, por ejemplo una molécula que tiene un peso molecular > 500 daltones, de preferencia > 1000 daltones, y de manera especialmente preferida > 2000 daltones o más.
La molécula a transportar puede también ser un compuesto de bajo peso molecular, por ejemplo un compuesto que tiene un peso molecular < 500 daltones, de preferencia que tiene un peso molecular de 350 a 500 daltones. El compuesto de bajo peso molecular puede ser un mononucleótido . La molécula a transportar puede pertenecer a varias clases de sustancias químicas; por ejemplo, puede ser un biopolímero como por ejemplo un polinucleótido, de preferencia un oligonucleótido, un polipéptido, de preferencia un péptido o una proteina, un péptido-ácido nucleico (PNA) o una poliamida que comprende los tres anillos aromáticos imidazol, pirrol e hidroxipirrol (Kielkopf et al. Science 282, 111-115 (1998)) o bien un polisacárido, de preferencia un oligosacárido, o bien un derivado de los compuestos mencionados. La molécula a transportar puede ser un péptido mi ético. Polinucleótidos, oligonucleótidos y mononucleótidos son ácidos nucleicos que ocurren naturalmente o bien derivados conocidos de los mismos. El término derivado debe entenderse significando, inter alia, las sales derivadas del conjugado o de la molécula a transportar, en particular sales fisiológicamente aceptables del mismo, y también, por ejemplo, ácidos nucleicos modificados o estabilizados. La molécula a transportar puede ser un inhibidor de factores de transcripción como por ejemplo NF-KB, c-fos o c-jun, proteínas de ciclo celular, como por ejemplo ciclina D, quinasas, como por ejemplo c-Src-, tirosina o bien MAP quinasas, canales de iones intracelulares, inmunofilinas, como por ejemplo, proteína de enlace FK506, prolil-4-hidroxilasa, topoisomerasas, proteasas virales, proteínas de resistencia a fármacos múltiples, fosfatasas como por ejemplo proteína tirosina fosfatasa. La molécula a transportar puede estar conjugada con uno o varios radicales arilo como por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince, veinte o más radicales arilo. El radical arilo ("el arilo" es en particular un radical arilo de la fórmula I y/o un radical arilo de la fórmula II) puede estar unido de la manera única o bien más que una vez a la molécula a transportar, en donde los enlaces pueden estar ubicados en posiciones diferentes del radical arilo. Varios radicales arilo están unidos a la molécula a transportar, estos radicales pueden ser idénticos o diferentes. El radical arilo contiene un grupo arilo (conocido como "arilo" en las fórmulas I y II) ; el grupo arilo puede comprender uno o varios anillos, en donde por lo menos uno de los anillos tiene un carácter aromático. El grupo arilo puede contener también anillos heterocíclicos que pueden o no tener un carácter aromático. El grupo arilo contiene, por ejemplo, de 1 a 8 o más anillos (también "sistema de anillo"), de preferencia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o bien 8 anillos. Los anillos individuales tienen un tamaño de 3 a 7 átomos de anillo, de preferencia de 5 a 6 átomos de anillo. Ejemplos de sistemas de anillo son anillos fenilo, anillos piridinilo, anillos pirimidinilo, anillos pirrolilo, anillos furanilo, anillos tiofenilo, lactonas de 5 miembros, lactonas de 6 miembros, espirolactonas, benzoquinonas, anillos ciclohexadienilo y anillos ciciohexenilo. Estos sistemas de anillo, el grupo arilo o anillos individuales del grupo arilo pueden estar monosustituidos o polisustituidos . De preferencia por lo menos uno de los anillos del grupo arilo lleva un radical acilo . El grupo arilo puede tener, por ejemplo, una de las fórmulas Fl', F2', F3', F4', F6' , FT , F8', F9' , FIO', FU'. Estas fórmulas se presentan en la figura 1. El radical arilo puede estar unido directamente sobre la molécula a transportar, o bien a través de un grupo químico. La invención ofrece un conjugado en donde el grupo químico junto con el radical arilo tiene la fórmula II (ll) en donde arilo, X, Y y R- son de conformidad con lo definido arriba, RJ es un grupo químico, RJ es, por ejemplo, un grupo -C(=0) o un grupo -NH-C(=S) . Ejemplos de radicales arilo de la fórmula II son los radicales arilo de las fórmulas Fl, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, FIO y Fll; estas fórmulas se muestran en la figura 2a y en la figura 2b. En una modalidad particular, la molécula a transportar es un oligonucleótido. Un oligonucleótido puede construirse, por ejemplo, totalmente de los nucleótidos fosfato de adenosina, fosfato de guanosina, fosfato de inosina, fosfato de citidina, fosfato de uridina, y fosfato de timidina. En otras modalidades de la invención, un oligonucleótido puede contener, en caso apropiado, una o varias modificaciones, por ejemplo modificaciones químicas. Un oligonucleótido puede tener varias modificaciones idénticas y/o diferentes. Modificaciones son conocidas del experto en la materia y se presentan por ejemplo en E. Uhlmann y A. Peyman, Chemical Re^iews 90 (1990) 543 y "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993 y J. Hunziker y C. Leumann "Nucleic Acid Analogs: Synthesis and Properties" en Modem Synthetic Methods (Ed. Beat Ernst y C- Leumann) Verlag Helvética Chimica Acata, Basilia, páginas 331-417. La modificación química de un oligonucleótido puede incluir, por ejemplo a) el cambio total o parcial de los puentes de diéster de ácido fosfórico, por ejemplo a través de puentes de fosforotioato-, fosforoditioato-, NR-R'-fosforoamidato-, boranofosfato-, fosfato- (C:-C;?) -O-alquiléster, fosfato- [ (C:-CX2) -arilo- (C?-C2?) -0-alquil] éster, (C3-C9) alquilfosfonato y/o (Ce-Cu) -arilfosfonato, en donde R1 y R1', independientemente entre ellos, son hidrógeno, alquilo (C?-C?8) , arilo (C8-C;-J , arilo (C6-C? ) -alquilo (C1-C5) , de preferencia hidrógeno, alquilo (C1-C5) y/o metoxietilo, de manera especialmente preferida hidrógeno, alquilo (C1-C4) y/o metoxietilo o bien R1 y R1' juntos con el átomo de nitrógeno que los lleva forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros, que puede contener además un heteroátomo adicional seleccionado entre 0, S, N; b) el reemplazo total o parcial de puentes de diéster de ácido fosfórico en el extremo 3' y/o 5' por medio de puentes "defosfo" (descritos por ejemplo en Uhlmann E. y Peyman, A. en "Methods in Molecular Biology" vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Toto a 1993, capítulo 16, página 355 y siguientes) , por ejemplo, a través de formacetal, 3-tioformacetal, etilhidroxilamina, oxima, metilendimetilhidrazo, dimetilsulfona y/o grupos sililo; c) el reemplazo total o parcial de la estructura de fosfato de azúcar por ejemplo a través de oligómeros "morfolino" (de conformidad con lo descrito, por ejemplo en E.P. Stirchak et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129 y en J. Summerton y D. Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 7 (1997) 187-195) y/o a través de ácidos nucleicos de poliamida ("PNAs") (descritos por ejemplo en P.E. Nielsen et al. Bloconj . Chem. 5 (1994) 3) y/o ácidos nucleicos de esteres de ácido fosfórico ("PHONAs") (descritos por ejemplo en Peyman et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (1996) 2632-2638); d) el reemplazo completo y/o parcial de unidades de ß-D-2'-desoxiribosa, por ejemplo a través de a-D-2' -desoxiribosa, L-2 ' -desoxiribosa, 2' -F-2' -desoxiribosa, 2' -O- (alquilo C?-C6) -ribosa, 2' -O- (alquenilo C;-C6) -ribosa, 2' - [O-alquilo (C?-C6)-O-alquilo (C?-C6) ] -ribosa, 2' -NH2-2' -desoxiribosa, ß-D-xilofuranosa, a-arabinofuranosa, 2, 4-didesoxi-ß-D-eritro-hexo-piranosa, análogos de azúcar con limitación de conformación como por ejemplo LNA (Locked nucleic acids; Singh et al., Chem. Commun. 4 (1998) 455; Singh et al. Chem.
Commun. 12 (1998) 1247) y análogos de azúcar carbocíclicos (descritos por ejemplo en Froehler, J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 8320) y/o de cadena abierta (descritos por ejemplo en Vandendriessche et al., Tetrahedron 49 (1993) 7223) y/o análogos de azúcar bicíclicos (descritos, por ejemplo, en M. Tarkov et al., Helv. Chim. Acta 76 (1993) 481); e) la modificación o bien el reemplazo total o parcial de las bases de nucleósidos naturales, por ejemplo a través de 5- (hidroximetil) uracilo, 5-aminouracilo, seudouracilo, seudoisocitosina, dihidrouracilo, 5-alquilo (C1-C6) -uracilo, 5-alquenilo (C2-C6) -uracilo, 5-alquinilo (C;-C6) -uracilo, 5-alquilo (Ci-Ce) -citocina, 5-alquenilo (C:~C¿) -citocina, 5-alquinilo (C2-C3) -citocina, 5-fluoruracilo, 5-fluorcitocina, 5-cloruradlo, 5-clorcitocina, 5-bromuracilo, 5-bromcitocina o bien purina sustituida con 7-deaza-7. La modificación química de un oligonucleótido abarca además la unión de un oligonucleótido con una o varias moléculas adicionales que influencian de manera positiva propiedades particulares del oligonucleótido, como por ejemplo estabilidad con relación a las nucleasas, afinidad con la secuencia blanco y características farmacocinéticas, que ocurren por ejemplo mediante la hibridación del oligonucleótido modificado con la secuencia blanco con unión y/o reticulación. Ejemplos de estas moléculas adicionales son poli-lisina, intercaladores tales como pireno, acridina, fenazina y fenantridina, compuestos fluorescentes tales como fluoresceina, reticuladores tales como psorales y azidoproflavina, moléculas lipofilicas como por ejemplo grupos alquilo (C?2-C2o) i de preferencia grupos alquilo (C?2-C2o) , lípidos tales como 1, 2-di-hexadecil-rac-glicerina, esteroides tales como colesterina o testosterona, vitaminas como por ejemplo vitamina E, poli-etilenglicol o bien oligoetilenglicol, diésteres de alquilo (C?2-Ci8) -fosfato, de preferencia diésteres de alquilo (C14-C13) -fosfato y grupos -0-CH2-CH (OH) -O-alquilo (Ci?-Cia) , de preferencia grupos -O-CH;-CH (OH) -O-alquilo (C?2-Ci6) . Estas moléculas adicionales pueden estar conjugadas en un extremo 5' y/o extremo 3' y/o dentro de la secuencia, por ejemplo en una base. Los procedimientos para la elaboración de oligonucleótidos modificados de esta manera son conocidos del experto en la materia y se describen por ejemplo en Uhlmann, E. & Peyman, A., Chem. Rev. 90 (1990) 543 y/o M. Manoharan en "Antisense Research and Applications", Crooke y Lebleu, Eds., CRC press, Boca Ratón, 1993, Capítulo 17, página 303 y siguientes, y/o EP-A 0 552 766. En modalidades específicas adicionales de la invención, el oligonucleótido puede tener inversiones 3' -3' y /o 5' -5' en el extremo 3' y/o en el extremo 5' . Este tipo de modificación química es conocido de un experto en la materia y se describe, por ejemplo, en M. Koga et al., J. Org. Chem. 56(1991) 3757. En un conjugado de consiste de uno o varios oligonucleótidos y uno o varios radicales arilo, de preferencia de la fórmula I o II, la conjugación de radicales arilo con un oligonucleótido puede efectuarse, por ejemplo, en el extremo 5' (A), en el extremo 3' (F) , en la base heterocíclica (E y G) , en el azúcar (C) o bien en el puente entre nucleósidos (B) del oligonucleótido. Sin embargo, la conjugación puede efectuarse también, por ejemplo, a través de bloques de construcción no núcleotídicos, por ejemplo, en el caso (D) . Estos ejemplos aparecen en la figura 3. Las modificaciones mencionadas pueden aplicarse evidentemente también de manera correspondientes a polinucleótidos relativamente largos y, en caso adecuado, a mono- o dinucleótidos o mono- o dinucleósidos . Los oligonucleótidos tienen, por ejemplo, una longitud de 8 a 50 nucleótidos, de preferencia de 10 a 20 nucleótidos. Sin embargo, oligonucleótidos que tienen oligonucleótidos polinucleótidos más largos, por ejemplo, de una longitud de 50 a 10,000 nucleótidos, de preferencia de 100 a 1000 nacleótidos, que pueden en caso apropiado estar presentes también como cadena doble, están también adecuados. Los oligonucleótidos pueden tener cualquier secuencia. La secuencia del oligonucleótido se selecciona o se diseña según el blanco seleccionado, es decir, si el blanco es un ácido nucleico, según su secuencia, o bien si el blanco es una proteína, según la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína blanco. Por ejemplo, si el blanco es un virus, por ejemplo CMV, VIH, HSV-1, HSV-2, influenza, VSV, hepatitis B o bien virus de papiloma, el oligonucleótido puede, por ejemplo, tener una de las secuencias siguientes: a) contra CMV SEQ ID NO: 12 5f -GCGTTTGCTCTTCTTCTTCTTGCG b) contra VIH, por ejemplo SEQ ID NO. 13 5' -ACACCCAATTCTGAAAATGG-3 ' o SEQ ID NO. 14 5 ' -AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3 ' O c) contra HSV-1, por ejemplo SEQ ID NO. 15 5' -GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3 ' El blanco puede ser, por ejemplo, una proteina involucrada en la formación de cáncer o responsable de crecimientos de cáncer. Ejemplos de tales blancos son: 1) oncoproteínas nucleares, por ejemplo c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, pl20; 2) oncoproteínas citoplásmicas/asociadas con membranas como por ejemplo EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl, c-ets; 3) receptores celulares, como por ejemplo receptor EGF, Her-2, c-erbA, receptor VEGF (KDR-1) , receptores de retinoides, la subunidad reguladora de proteinquinasa, c-fms, Tie-2, c-raf-1 quinasa, PKC-alfa, proteinquinasa A (Rl alfa) ; 4) citocinas, factores de crecimiento, matrices extracelulares como por ejemplo CSF-1, IL-6, IL-la, IL-lb, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, mieloblastina, fibronectina.
Oligonucleótidos dirigidos contra tales blancos pueden tener, por ejemplo, la siguiente secuencia de bases: a) contra c-Ha-ras, por ejemplo SEQ ID NO. 16 5 ' -CAGCTGCAACCCAGC -3' o SEQ ID NO. 17 5 ' -TATTCCGTCAT-3'o SEQ ID NO. 18 5 ' -TTCCGTCATCGCTCCTCAGGGG-3 ' b) bFGF, por ejemplo SEQ ID NO. 19 5' -GGCTGCCATGGTCCC-3 ' c) c-myc, por ejemplo SEQ ID NO. 20 5 t -GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC-3 ' SEQ ID NO. 21 5 ' -AACGTTGAGGGGCAT-3 ' d) c-myb, por ejemplo SEQ ID NO. 22 5 ' -GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3 ' e) c-fos, por ejemplo SEQ ID NO. 23 5 ' -CGAGAACATCATCGTGG -3f SEQ ID NO. 24 5 ' -GGAGAACATCATGGTCGAAAG-3 t SEQ ID NO. 25 5 ' -CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3 ' SEQ ID NO. 26 5 » -GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3 ' f) pl20, por ejemplo SEQ ID NO. 27 5' CACCCGCCTTGGCCTCCCAC-3 ' g) receptor de EGF, por ejemplo SEQ ID NO. 28 5' -GGGACTCCGGCGCAGCGC-3' SEQ ID NO. 29 5 ' -GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-3 ' h) supresor de tumor p53, por ejemplo SEQ ID NO. 30 5 ' -GGGAAGGAGGAGGATGAGG-3 ' SEQ ID NO. 31 5' -GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG-3 ' 1) bcl-2 SEQ ID NO. 32 5 ' -TCTCCCAGCGTGCGCCAT k) VEGF SEQ ID NO. 33 5'- GCGCTGATAGACATCCATG SEQ ID NO. 34 3'- CCAGCCCGGAGG -5', 5' -GGAGGCCCGACC-3 t SEQ ID NO. 35 3'- CGGAGGCTTTGG -5', 5' -GGUTCGGAGGC-3' ; SEQ ID NO. 36 3'- GATGGAGGTGGT -5', 5' -TGGTGGAGGTAG-3' SEQ ID NO. 37 3'- GGAGGTGGTACG -5', 5» -GCATGGTGGAGG-3 * SEQ ID NO. 38 3'- GGTGGTACGGTT -5', 5' -TTGGCATGGTGG-3' SEQ ID NO. 39 3'- CACCAGGGTCCG -5', 5' -GCCTGGGACCAC-3 ' SEQ ID NO. 40 3'- CCAGGGTCCGAC -5', 5' -CAGCCTGGGACC-3 ' SEQ ID NO. 41 3f- AGGGTCCGACGT -5', 5' -TGCAGCCTGGGA-3 ' SEQ ID NO. 42 3'- GGGTCCGACGTG -5', 5' -GTGCAGCCTGGG-31 SEQ ID NO. 43 3'- GGTCCGACGTGG -5', 5' -GGTGCAGCCTGG-3 • SEQ ID NO. 44 3'- CCGACGTGGGTA -5', 5' -ATGGGTGCAGCC-3 ' SEQ ID NO. 45 3*- GTAGAAGTTCGG -5', 5' -GGCTTGAAGATG-3 ' SEQ ID NO. 46 3'- ACGCCCCCGACG -5', 5' -GCAGCCCCCGCA-3 ' o bien SEQ ID NO. 47 3'- CCCCCGACGACG -5', 5 ' -GCAGCAGCCCCC-3 ' 1) c-raf quinasa SEQ ID NO. 48 5 ' - TCCCGCCTGTGACATGCATT m) PKC-alfa SEQ ID NO. 49 5 * -GUCTCGCTGGTGAGTTTCA n) proteinquinasa A SEQ ID NO. 50 5 ' -GCGTGCCTCCTCACTGGC Si el blanco es una integrina o un receptor de adhesión célula-célula, como por ejemplo VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM o E AM/ el oligonucleótido puede tener por ejemplo una de las secuencias siguientes: a) VLA-4, por ejemplo SEQ ID NO. 51 5 ' -GCAGTAAGCATCCATATC-3 ' o b) ICAM-1, por ejemplo SEQ ID NO. 52 5 ' -GCCCAAGCTGGCATCCGTCA SEQ ID NO. 53 5' -CCCCCACCACTTCCCCTCTC-3 ' 3EQ ID NO. 54 5 ' -CTCCCCCACCACTTCCCCTC-3 ' SEQ ID NO. 55 5 ' -GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3 ' c) ELAM-1, por ejemplo SEQ ID NO. 56 5 ' -ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-3 ' SEQ ID NO. 57 5 ' -CAATCAATGACTTCAAGAGTTC-3 ' d) integrina alfa (V) SEQ ID NO. 58 5 ' -GCGGCGGAAAAGCCATCG Si el blanco es una proteína responsable de la proliferación o migración o involucrada en este proceso/estos procesos, como por ejemplo: 1) proteínas de transactivador nuclear y ciclinas, como por ejemplo c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, ciclinas y cdc2 quinasa; 2) mitógenos o factores de crecimiento, como por ejemplo PDGF, bFGF, VEGF, EGF, HB-EGF y TGF-ß; 3) receptores celulares, como por ejemplo receptor bFGF, receptor EGF, y receptor PDGF; el oligonucleótido puede tener, por ejemplo una de las siguientes secuencias de bases: a) c-myb SEQ ID NO. 59 5' -GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3 ' ) c-myc SEQ ID NO. 60 5' -CACGTTGAGGGGCAT-3 ' c) cdc2 quinasa SEQ ID NO. 61 5' -GTCTTCCATAGTTACTCA-3 ' d) PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes de ratas) SEQ ID NO. 62 5 ' -GATCAGGCGTGCCTCAAA-3 ' . Si el blanco es, por ejemplo un receptor de adenosina Al, receptor de adenosina A3, receptor de bradiquinina o IL-13, la secuencia de bases SEQ ID NO. 63 5 ' -GATGGAGGGCGGCATGGCGGG Es posible, por ejemplo Los siguientes oligonucleótidos (5' —>3' ) fueron preparados: ON1: 5'-d(G*C G A C*G C~C A T*G A C*G*G) SEQ ID NO. 1 ON2: 5'-d(C*G A C*G C-C A T*G*A*C) SEQ ID NO. 2 ON3: 5t-d(A*T*G A C*G G A A*T*T*C) SEQ ID NO. 3 ON4 : 5 * -d (TATTCCGTCAT) SEQ ID NO. 4 ON5: 5*-(dA)20 SEQ ID NO. 5 ON6: 5'-(dA)50 SEQ ID NO. 6 ON7: 5'-(dA)80 SEQ ID NO. 7 0N8: 5'-T*T*C C*A T*G G*T G*G*C SEQ ID NO. 8 0N9: 5'-T*T*C A*C T*G T*G G*G*C SEQ ID NO. 9 0N10: 5'-T*G*G C*G C*C G*G G*C*C SEQ ID NO. 10 ONU: 5'-T*G*C C*G G*C C*G G*G*C SEQ ID NO. 11 En donde * indica las posiciones en las cuales un puente fosfodiéster ha sido reemplazado por un puente de internucleósido de fosforotioato Estas secuencias fueron convertidas en los siguientes conjugados (CO) : CO_l: F3-LÍ1-ON1 C0_2: FO-Lil-ONl CO_3: F3-LÍ1-0N2 CO_4 : FO-LÍ1-0N2 C0_5: F3-LÍ1-0N3 CO_6: F9-LÍ1-0N3 C0_7: F2-LÜ-0N3 C0_8: FO-LÍ1-0N3 CO_9: F3-LÍ1-0N3--rodamina CO_10 F9-LÜ-0N3--rodamina CO__ll F6-LÜ-0N3--rodamina CO_12 FO-LÍ1-0N3--rodamina CO_13 F3-LÜ-0N4 C0_14 F3-LÍ1-0N5 CO_15 F3-LÜ-0N6 CO 16 : F3-LÍ1-0N7 C0_17: F3-LÍ1-0N8 C0_18: F3-L11-0N9 C0_19: F3-LÍ1-ON10 Q0_20 : F3-LÜ-0N11 C0_21 : F7-LÍ1-0N3 en donde *F1 a Fll" son radicales arilo de las formulas Fl a Fll (por ejemplo, figura 2) ; *Lil" es un radical fosfato de 6-aminohexilo unido al extremo 5' del oligonucleótido (por ejemplo, véase figura 4) ; *0N1 a ONU" son los oligonucleótidos descritos de las secuencias SEQ ID NO. l a SEQ ID NO. 11; y "rodamina" es un marcador de rodamina en el extremo 3' del oligonucleótido, que puede ser detectado además de la fluoresceína. La invención ofrece también procesos para preparar los conjugados de conformidad con la invención. La invención se refiere a procesos para la preparación de un conjugado que comprende una molécula a transportar y por lo menos un radical arilo, de preferencia de la fórmula I o II, en donde a) se prepara una molécula a transportar la cual contiene una función reactiva en la posición en la cual el radical arilo debe ser unido; y b) se prepara un radical arilo y c} la molécula a transportar reacciona con el radical arilo para proporcionar el conjugado. La función reactiva es de preferencia un grupo amino, un grupo mercapto, un grupo cloroacetilo, un grupo isocianato, un grupo isotiocianato, un grupo ácido carboxilico, un grupo N-hidroxisuccinimida o un grupo cloruro de carbonilo. La reacción de la molécula a transportar con el radical arilo es efectuada a un pH < 7.5; de preferencia un pH < 7.3, y de manera especialmente preferida a un pH de 7.0 o a un pH menor, por ejemplo, un pH < 7, de preferencia un pH < 6.5. En estas reacciones de acoplamiento, todos los demás grupos reactivos tienen que ser protegidos antes de la reacción empleando grupos de protección conocidos del experto en la materia. En una modalidad particular de los procesos, la molécula a transportar es un polinucleótido, oligonucleótido, o moaonucleótido. Los procesos de preparación comprenden, en una primera etapa, la preparación de la molécula a transportar. En este contexto, la invención se refiere también a procesos para preparar oligonucleótidos. Los oligonucleótidos pueden prepararse con la ayuda de varios procesos químicos conocidos, por ejemplo de conformidad con lo descrito en Eckstein, F. (1991) "Oligonucleotides and 7?nalogues, A Practical Approach" (Oligonucleótidos y Análogos, Un Enfoque Práctico), IRL Press, Oxford. Los oligonucleótidos pueden también ser preparados a través de procesos que, en caso apropiado, comprenden uno o varios pasos enzimáticos. La preparación de conjugados de oligonucleótidos se describe, en principio en la literatura (J. Goodchild, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 165; S. Beaucage y R. lyer, Tetrahedron 49 (1993) 1925; S. Agrawal Methods in Molecular Biology (Métodos en Biología Molecular) Vol. 26 "Protocols for oligonucleotide conjugates" (Protocolos para conjugados de oligonucleótidos) (1994) Humana Press) . Sin embargo, cuando se sintetizan los conjugados de oligonucleótidos de conformidad con la fórmula I, se debe prestar atención al hecho que pueden descomponerse en un medio alcalino. Por consiguiente no es posible, por ejemplo, sintetizar oligonucleótidos marcados con FDA en un sintetizador de oligonucleótido empleando los métodos habituales puesto que los grupos éster del grupo FDA se hidrolizarían durante el tratamiento con amoniaco requerido para la disociación del oligonucleótido del soporte y para disociar los grupos de protección amino de las bases heterocíclicas. Así, el oligonucleótido es inicialmente preparado como precursor en forma desprotegida y fusionado con el grupo de la fórmula I en la última etapa (figura 5) . El precursor de oligonucleótidos tiene una función reactiva o activable, que es subsecuentemente derivada por métodos conocidos del experto en la materia con un reactivo que contiene el grupo de la fórmula I de conformidad con la invención. Funciones reactivas o activables adecuadas son, por ejemplo funciones amino, mercapto, cloroacetilo, iso (tio) cianato y ácido carboxílico. Es particularmente fácil introducir lo que se conoce como amino-enlazadores con la ayuda de reactivos comercialmente disponibles en oligonucleótidos. Los amino-enlazador-oligonucleótidos reaccionan después, por ejemplo con reactivos que contienen un grupo de la fórmula I. Tales reactivos son, por ejemplo, los isotiocianatos correspondientes. El grupo de la fórmula I en este caso está unido a través de una función tiourea (Anexo 4) . Otros reactivos son, por ejemplo, los cloruros de carbonilo. Reactivos leves son, por ejemplo, las N-hidroxisuccinimidas de los ácidos carboxílicos correspondientes. Reactivos activables son, por ejemplo, los ácidos carboxílicos correspondientes que pueden estar acoplados con reactivos de acoplamiento de péptido tales como HBTU, TBTU o TOTU. En este caso, el grupo de la fórmula I está unido a través de una función amida. En principio, los grupos de la fórmula I de conformidad con la presente invención pueden ser introducidos en cualquier posición del oligonucleótido. Se da preferencia a las posiciones ilustradas en la figura 3. Los oligonucleótidos modificaos fueron sintetizados mediante la construcción de la cadena de oligonucleótidos por métodos estándares, como por ejemplo síntesis en fase sólida a través del método de fosforamidita, y derivación del extremo 5' con 5* -amino-modif icador C6 disponibles en el comercio (por ejemplo en Eurogentec, Seraing, Bélgica) . 5' -amino-modificador C6 (Mmt = 4-monometoxitritilo) Después de la disociación del derivado de oligonucleótido del soporte y desprotección de todos los grupos protectores lábiles para bases por medio de tratamiento con amoniaco, el grupo monometoxitritilo ..es removido por tratamiento con ácido acético al 80% a temperatura ambiente. Esto proporciona un oligonucleótido modificado con 5' -a inohexil-fosfato. La función amino de este derivado de oligonucleótido reacciona después con FDA-ísotiocianato en un amortiguador de bicarbonato de trietilamonio 0.2 M (amortiguador TBK) , pH 7/DMF. Solamente después de 2 a 3 horas, el amino-enlazador-oligonucleótido - ha sido convertido totalmente en el derivado de FDA deseado (figura 4) . Reacciones con isotiocianato de fluoresceína se efectúan habitualmente a pH 8. Sin embargo, en este pH, el diacetato del grupo FDA es hidrolizado.
Evidentemente es también posible utilizar otros reactivos de a ino-enlazador como por ejemplo el 5' -amino-modificador C3, 5' -amino-modificador C12, 5' -amino-modificador 5 o bien 5'-tiol-modificador C6 (todos de Eurogentec) . Mediante la utilización de fases sólidas de 3'-amino-modificador como por ejemplo 3' -amino-modificador C3 CPG (de Eurogentec.)., es posible preparar derivados de oligonucleótidos que tienen un grupo aminoalquilo 3' que reaccionan subsecuentemente con FDA-isotiocianato. Esto proporciona un derivado de oligonucleótidos PG 3' -amino-modificador C3 CPG (Fmoc = fluorenilmetoxicarbonilo) que contiene el grupo de la fórmula I de conformidad con la presente invención unido en le extremo 3' . Para introducir el conjugado en la base heterocíclica del nucleósido, es posible utilizar en la síntesis en lugar del bloque de construcción de fosforamidita normal un a ino- odificador correspondiente C6 dT (de Eurogentec) derivado de timidina. En el extremo de la síntesis de oligonucleótido, el grupo de protección de trifluoroacetilo es removido por tratamiento con amoniaco, y la función de amino libre es reaccionada en solución con FDA-isotiocianato.
Amino-modificador C6 dT De manera similar, es posible introducir los grupos de la fórmula I de conformidad con la invención en cualquier posición de los oligonucleótidos . Se puede observar fácilmente que aun una introducción múltiple de grupos idénticos o diferentes es posible . En procesos para la preparación de conjugados en donde la molécula a transportar es un ácido nucleico de péptido (PNAs) , es posible, por ejemplo, hacer reaccionar la función amino primaria del grupo aminoetilo con FDA-isotiocianato . En procesos para preparar conjugados en los cuales la molécula a transportar es un polipéptido, es posible utilizar, por ejemplo, la terminal amino del polipéptido o las funciones amino de las cadenas laterales de lisina para una reacción con FDA-isotioacianato. La presente invención ofrece también el uso de conjugados, en usos particulares con base en las propiedades provechosas descritas arriba de los conjugados. Una modalidad particular dte la invención se refiere al uso de los conjugados para transportar una molécula a través de una membrana biológica. ta invención se refiere también al uso de radicales arilo, de preferencia de la fórmula I o II, para transportar una molécula a la cual dicho radical arilo está unido, para transportar esta molécula a través de una membrana biológica.
La membrana biológica es de preferencia un componente de una célula, una vesícula o un organelo. La presente invención ofrece también métodos para transportar una molécula a través de una membrana, en donde a) se prepara un conjugado en el cual la molécula a transportar es unida sobre por lo menos un radical arilo de la fórmula I o II, y b) el conjugado es incubado con la membrana. En particular, métodos para transportar una molécula en una célula, en donde a) se prepara un conjugado en el cual la " molécula a transportar es unida con por lo menos un radical arilo de la fórmula I o II, y b) el conjugado es incubado con la célula, después de lo cual c) el conjugado es transportado en la célula sin disociación del radical arilo. Esto se refiere particularmente a métodos en el cual la célula es una célula eucariótica o procariótica, por ejemplo, célula bacteriana, una célula de levadura o una célula de mamífero, de preferencia una célula de ser humano. En modalidades particulares, la célula es una célula patológicamente modificada, por ejemplo una célula tumoral. La absorción celular mejorada de los conjugados no fue observada solamente en el caso de células de mamíferos, sino que ha sido demostrada también en otros eucariotas y hasta procariotas. Los conjugados de conformidad con la presente invención fueron examinados microscópicamente para absorción en células vivas. Inicialmente, los oligonucleótidos marcados con FDA fueron examinados para determinar la capacidad de CO_l Y CO_3 para penetrar en las células. Los oligonucleótidos marcados con fluoresceína correspondientes CO_2 y CO_4 fueron utilizados como compuestos conocidos a partir de la técnica anterior. Todos los cultivos de células animales vitales estudiados absorbieron C0_1 y CO_3 (FDA-conjugados) dentro de 5 a 10 minutos, mientras que no era posible detectar CO_2 y CO__4 (conjugados con fluoresceína) después de este período de tiempo en células vitales (Tabla 1) . Aun cuando la absorción en bacterias y lavadura es considerablemente más lenta que en células de mamíferos, algunas de las células habían absorbido los oligonucleótidos de conformidad con la invención después de un período de 2 horas, mientras que los oligonucleótidos marcados con fluoresceína normales no fueron absorbidos en estas condiciones. Es sorprendente que, en principio, todos los organismos que han sido estudiados hasta ahora han absorbido los oligonucleótidos de conformidad con la invención mejor que los derivados de oligonucleótidos conocidos. Estos organismos incluyen, inter alia, células de animales, flagelados, levaduras, hongos y bacterias (Tabla 3) . Además, se ha encontrado que células de cáncer absorbieron los oligonucleótidos de manera particularmente efectiva. El uso de los oligonucleótidos de conformidad con la invención es por consiguiente particularmente adecuado para terapia de tumor. El oligonucleótido de antisentido marcador con FDA COP_l, dirigido contra eg5, inhibió la proliferación de células A549 simplemente cuando fue agregado al medio, mientras que el oligonucleótido de antisentido no modificado correspondiente 0N1 y el oligonucleótido marcado con fluoresceína CO__2 inhibió la proliferación de las células cancerosas solamente después de formulación con incrementadores de penetración tales como CellFectin. La invenció se refiere al uso de conjugados en los cuales la molécula debe ser transportada en un oligonucleótido para hibridación con ácidos nucleicos de cadena única y/o de cadena doble, por ejemplo ADN (por ejemplo, genes ADNc) y/o ARN (por ejemplo, pre-ARNm ARNm) . Estos conjugados pueden también unirse de manera específica para secuencias con proteínas intracelulares, como por ejemplo enzimas, por ejemplo polimerasas o telomerasas, o bien con factores de transcripción. La invenció se refiere además al uso de tales conjugados para la modulación o para la inhibición completa o parcial de la expresión de ciertos genes blanco, por ejemplo para la inhibición total o parcial de transcripción y/o traslación. La invención se refiere también al uso de tales conjugados como oligonucleótidos de antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de sentido, oligonucleótidos de formación de triple hélice, quimeraplastos y/u oligonucleótidos de señuelo. Además, estos conjugados pueden emplearse como auxiliares en biología molecular. La invenció se refiere además al uso de los oligonucleótidos como fármacos y/u auxiliares para diagnóstico y al uso de los oligonucleótidos para preparar fármacos y/u auxiliares para diagnóstico. En particular, los oligonucleótidos pueden ser empelados en fármacos para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con la expresión o sobreexpresión de ciertos genes. Además, los oligonucleótidos pueden ser utilizados para diagnosticar enfermedades de este tipo, para detectarlas de manera temprana. Puesto que la capacidad de los oligonucleótidos de conformidad con la invención para penetrar células es muy buena, pueden ser utilizados para diagnóstico in vivo, por ejemplo, para la hibridación in situ en órganos enteros o en el organismo intacto. La invenció ofrece también fármacos que comprenden uno o varios conjugados de conformidad con la presente invención. La invención ofrece también un auxiliar de diagnóstico que comprende uno o varios conjugados de conformidad con la invención. La invención ofrece también un conjunto de elementos de prueba que comprende uno o varios conjugados de conformidad con la invención. La invención se refiere también al uso de los oligonucleótidos para la detección, separación y amplificación de ácidos nucleicos y análogos de los mismos. Los conjugados son especialmente adecuados para detectar ácidos nucleicos en células, particularmente en células vivas. Estas células pueden ser de origen humano o animal. Los conjugados son también particularmente adecuados para los organismos listados en la Tabla 3, en particular para la detección de organismos patogénicos. Los oligonucleótidos de conformidad con la presente invención pueden ser utilizados en variaciones técnicas conocidas de la ampliación de ácidos nucleicos, en particular en LMPCR (reacción en cadena de polimerasa mediada por ligación) en el "Invader Assay" (Marca comercial, Third Wave Technologies, Inc., Wisconsin), en el TaqMan System (marca registrada) y en el genotipado últiplex. Es también provechoso utilizar los oligonucleótidos para la amplificación de ácidos nucleicos con la ayuda de ciclador de luz, lo que permite la determinación de amplificación en tiempo real. La detección por el principio "balizas" moleculares en donde el colorante fluorescente no emite fluorescencia cuando no esta unido, puesto que apagado por un segundo grupo en el oligómero, es una posibilidad adicional de utilizar los oligonucleótidos de conformidad con la invención. Es posible, por ejemplo, combinar un derivado de FDA (por ejemplo en el extremo 5' del oligonucleótido) con un radical Dabcyl (por ejemplo, conjugado en el extremo 3' ) que apaga la señal de fluorescencia en el estado no unido aun después de la conversión del derivado de FDA en el derivado de fluoresceína. Estas balizas modificadas con FDA podrían emitir una señal de fluorescencia solamente después de su absorción en la célula e hibridación con el ARNm blanco. La invención se refiere también al uso de los oligonucleótidos o de fármacos que comprenden estos oligonucleótidos para el tratamiento de enfermedades provocadas o asociadas con la sobreexpresión de genes definidos. Los fármacos de la presente invención pueden ser utilizados, por ejemplo, para tratar trastornos causados por virus, por ejemplo, por CMV, VIH, HSV-1, HSV-2, influenza, VSV, hepatitis B o virus de papiloma. Los fármacos de la presente invención son también adecuados, por ejemplo, para tratar cáncer. Los fármacos de la presente invención son también adecuados, por ejemplo, para el tratamiento de trastornos afectados por integrinas o receptores de adhesión célula - célula, por ejemplo por VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM o ELAM. Los fármacos de la presente invenció son también adecuados, por ejemplo, para prevenir la restenosis, para el tratamiento de vitiligo y otras enfermedades de despigmentación o trastorno de despigmentación (por ejemplo de la piel, cabello, ojos) , por ejemplo albinismo y soriasis, y del asma. Los fármacos se refieren, por ejemplo, a preparaciones farmacéuticas que pueden ser administradas a) oralmente, por ejemplo en forma de tabletas, tabletas revestidas con azúcar, cápsulas de gelatina dura o blanda, soluciones, emulsiones o suspensiones, b) rectalmente, por ejemplo, en forma de supositorios o c) parenteralmente, por ejemplo en forma de soluciones para inyección. Para la preparación de fármacos, los conjugados pueden ser procesados, por ejemplo, en vehículos orgánicos y/o inorgánicos terapéuticamente inertes; vehículos adecuados para tabletas, tabletas revestidas con azúcar, y cápsulas de gelatina dura son, por ejemplo, lactosa, almidón de maíz o derivados de los mismos, sebo y ácido estérico o sales de los mismos. Vehículos adecuados para soluciones son agua, polioles, sucrosa, azúcar invertido, y glucosa, para soluciones para inyección son agua, alcoholes, polioles, glicerol y aceites vegetales, para supositorios, dichos vehículos adecuados son aceites vegetales y hidrogenados, ceras, grasas así como polioles semilíquidos . Los fármacos pueden comprender además conservadores, solventes, estabilizadores, agentes de humedecimientos, emulsificantes, endulzantes, colorantes, saborizantes, sales para alterar la presión osmótica, amortiguadores, agentes de revestimiento, antioxidantes y, en caso apropiado, otros compuestos terapéuticamente activos. Los fármacos se aplican de preferencia de manera tópica o local, como por ejemplo con la ayuda de un catéter, o bien son inhalados o administrados por inyecciones o infusiones. En el caso de inyecciones, el conjugado es formulado en una solución líquida, de preferencia un amortiguador fisiológicamente aceptable como por ejemplo una solución Hank o bien una solución de Ringer. Sin embargo, el conjugado puede también ser formulado en forma sólida y después disuelto suspendido antes del uso. Las dosificaciones que se prefieren para administración sistémica son de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal por día. Los conjugados y/o sus sales fisiológicamente aceptables pueden ser administrados como fármacos a animales, de preferencia mamíferos y en particular seres humanos, solos, en mezclas entre ellos o bien en forma de preparaciones farmacéuticas que permiten el uso tópico, percutáneo, parenteral o enteral y que comprenden, como componente activo una dosis efectiva de por lo menos un conjugado, además de vehículos y aditivos farmacéuticamente aceptables habituales . Las preparaciones comprenden habitualmente aproximadamente 0.1 a 90% en peso de un compuesto terapéuticamente activo. Para el tratamiento de enfermedades cutáneas como por ejemplo soriasis o vitíligo, se emplea de preferencia el uso tópico, por ejemplo, en forma de ungüentos, lociones o tinturas, emulsiones, suspensiones. Los fármacos son preparados de manera conocida per se (por ejemplo Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ . Co . , Easton, PA) , utilizando vehículos orgánicos y/o inorgánicos farmacéuticamente inertes. Para la preparación de pildoras, tabletas, tabletas revestidas con azúcar, así como cápsulas de gelatina dura, es posible utilizar, por ejemplo, lactosa, almidón de maíz y/o derivados de los mismos, talco, ácido esteárico y/o sales de los mismos, etc. Vehículos adecuados para cápsulas de gelatina blanda y/o supositorios son, por ejemplo, grasas, ceras, polioles líquidos y semisólidos, aceites naturales y/o hidrogenados, etc. Vehículos adecuados para la preparación de soluciones y/o jarabes son, por ejemplo agua, sucrosa, azúcar invertida, glucosa, polioles, etc. Vehículos adecuados para la preparación de inyecciones para soluciones son agua, alcoholes, glicerol, polioles, aceites vegetales, etc. Vehículos adecuados para microcápsulas, implantes y/o varillas son polímeros mixtos de ácido glicólico y ácido láctico. Son también adecuadas formulaciones de liposoma conocidas del experto en la materia (N. Weiner, Drug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523; "Liposome Dermatics, Springer Verlag 1992), por ejemplo HVJ liposomes (Hayashi, Gene Therapy 3 (1996) 878) . Además de los compuestos activos y vehículos, un fármaco puede comprender aditivos como por ejemplo rellenadores extendedores, desintegrantes, agentes de unión, lubricantes, agentes de humedecimiento, estabilizadores, emulsificantes, conservadores, endulzantes, colorantes, saborizantes a aromatizantes, agentes de espesamiento, diluyentes, sustancias amortiguadoras, solventes adicionales y solubilizantes y/o agentes para lograr un efecto de depósito, y sales para cambiar la presión osmótica, agentes de revestimiento y/o antioxidantes. Pueden comprender también dos o más oligonucleótidos diferentes y/o sus sales fisiológicamente aceptables y además, a parte de por lo menos un oligonucleótido, una o varias sustancias terapéuticamente activas. La dosis puede variar dentro de límites amplios y tiene, en cada caso, que ser ajustada a las circunstancias individuales . Figuras Figura 1 : La figura muestra ej emplos de radicales arilo de la fórmula (I ) . Figuras 2a y 2b: Las figuras muestran ejemplos de radicales arilo de la fórmula (I) . Figura 3: La figura 3 muestra ejemplos deferentes (A, B, C, D, E, F, G) de una conjugación entre una molécula a transportar (aquí un oligonucleótido) y radicales arilo de la fórmula (I) " R" es un radical de la fórmula (I) ; "B" es un {laguna] en la base heterocíclica. Figura 4: La figura 4 muestra una posibilidad de preparación de un conjugado de conformidad con la invención (que consiste aquí de FDA-isotiocianato y oligonucleótidos) . Figura 5: La figura 5 muestra la absorción del conjugado CO_5 en células REH a partir del medio con el paso del tiempo, en donde en un caso se utiliza medio si suero (-^-) y en otro caso se utiliza medio con suero (B) . La absorción en la célula fue determinada con la ayuda de FACS. Figura 6: Diagrama de la determinación de la absorción de C0_1 (FDA conjugado; <F>) y C0_2 (FITC oligómero; A) en la célula por medición FACS. La concentración inicial de conjugado de oligonucleótido extracelular fue IµM; O y D son controles . Figura 7: La transfección de poliA-nucleótidos conjugados con FDA en células REH en función del tiempo . Figura 8: Comparación de la absorción de conjugados de oligonucleótidos diacetato de fluoresceína y dipivalato de fluoresceína en la célula K39: diacetato de carboxifluoresceína (F3 igual FDS) a partir del Ejemplo 15 K41: dipivalato de carboxifluoresceína (F2) del Ejemplo 10. Figura 9: Examen de la absorción en la célula de conjugado F3 de oligonucleótido Cy3 doblemente marcado [lµM] durante la incubación con células REH por microscopía de fluorescencia. Absorción después de 4 horas. Izquierda: marcado de fluorescencia; centro: colorante de cianina; derecha: imagen de contraste de fase; parte superior oligonucleótido K33; fondo: oligonucleótidos K34. Ejemplos Ejemplo 1: Síntesis de oligonucleótidos Oligonucleótidos fueron sintetizados en un sintetizador automático de ADN (Applied Biosystems Modelo 380B o 394) empleando la química de fosforamidita estándar y oxidación con yodo (Eckstein, F. (1991) "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach" (Oligonucleótidos y Análogos, Un Enfoque Práctico), IRL Press, Oxford, 1991). Para la introducción de puentes de fosforitioato en oligonucleótidos de fosfodiéster y fosforotioatos mixtos, la oxidación fue efectuada empleando TETD (disulfuro de tetraetiltiourano) o reactivo de Beaucage en vez de yodo. Después de la disociación del vehículo sólido (CPG o Tentagel) y después de la remoción de los grupos protectores con NH3 concentrado a una temperatura de 55° durante un período de 18 horas, los oligonucleótidos fueron inicialmente purificados por precipitación con butanol (Sawadogo, Van Dyke, Nucí. Acids Res. 19 (1991) 674). Los oligonucleótidos fueron purificados por electroforesis en gel de preparación o FPLC. La sal sódica fue después obtenida por precipitación a partir de una solución de NaCl 0.5 M empleando 2.5 partes en volumen de etanol. Los oligonucleótidos fueron analizados por a) electroforesis en gel analítica en acrilamida al 20%, urea 8 M, amortiguador de Tris-borato 454 M, pH 7.0 y/o b) análisis HPLC: Waters GenPak FAX, gradiente CH5C? (400 ml), H20 (1.6 1), ?aHrP04 (3.1 g) , ?aCl (11.7 g) , pH 6.8 (0.1 M de ?aCl) a CH3C? (400 ml) , H-0 (1.6 1), ?aH;P04 (3.1 g) , ?aCl (175.3 g) , pH 6.8 (1.5 M de ?aCl) y/o c) electroforesis en gel capilar Beckmann capilar eCAP™, columna de gel U100P, longitud 65 cm, I.D. 100 mm, ventana 15 cm de un extremo, amortiguador 140 µM Tris, ácido bórico 360 mM, urea 7 M y/o d) espectroscopia de masa por electrorociado El análisis del oligonucleótido mostró que esté último estaba presente en cada caso en una pureza mayor que 90% y en la mayoría de los casos mayor que 95%. Ejemplo 2: Introducción de 5' -amino-enlazador en un oligonucleótido El oligonucleótido fue sintetizado de conformidad con lo descrito en el Ejemplo 1. Después del acoplamiento del último nucleótido, el grupo dimetoxitritilo en el extremo 5' fue disociado. El grupo hidroxilo libre fue reaccionado con el 5' -amino-modificador C6, comercialmente disponible (en Eurogentic, Seraing, Bélgica) bajo catálisis de tetrazol y oxidado con agua con yodo. El oligonucleótido fue después disociado del vehículo por tratamiento con amoniaco concentrado a 50° C durante la noche, y todos los grupos protectores lábiles para bases en los grupos entre nucleósidos y las funciones aminio de las bases heterocíclicas fuero disociadas. En le último paso, el grupo protector de monometoxitritilo fue disociado por tratamiento con ácido acético al 80% a temperatura ambiente durante 3 horas. El oligonucleótido resultante fue analizado de conformidad con lo descrito en el Ejemplo 1. Ejemplo 3: Conjugación del amino-enlazador oligonucleótido con FDA isotiocianato 10 OD (260) del 5' -amino-enlazador oligonucleótido del Ejemplo 2 fueron disueltos en 16 µl de amortiguador de bicarbonato de trietilamonio 0.2 M (TBK) y mezclados con 125 µl de dimetilformamida (DMF) . Se agregaron 1.5 mg de FDA isotiocianato a esta mezcla, y la mezcla fue después agitada durante 3 horas con exclusión de luz. El resultado de la reacción fue revisado por HPLC. Se agregaron después 2 µl de ácido acético concentrado, y la mezcla fue concentrada bajo presión reducida. El producto fue después purificado por precipitación con butanol. El peso correcto fue determinado por espectroscopia de masa ESI. Con el objeto de evitar la hidrólisis del éster aromático, las muestras fueron mantenidas siempre a un pH menor que 7. Ejemplo 4: Síntesis de C0_1 (5' -F3-G*-CGAC*GC*CAT*GAC*G*G-3' ; F3 = FDA) El oligonucleótido fue sintetizado de conformidad con lo descrito en el Ejemplo 1 empezando a partir de un vehículo CPG que tenía un 1 µmol de desoxiguanosina unido a través del extremo 3' . Las posiciones marcadas con * fueron oxidasa con reactivo de Beaucage para introducir un puente de fosforotioato. El acoplamiento con C6 modificado con 5' -amino fue después efectuado de conformidad con lo descrito en el Ejemplo 2. La desprotección con amoniaco concentrado y ácido acético al 80% proporcionó 96 OD (260) del 5' -a ino-enlazador-G*-CGAC*GC*CAT*GAC*G*G-3' . 10 OD (260) 5' -amino-enlazador oligonucleótido reaccionaron después con FDA isotiocianato de conformidad con lo descrito en el Ejemplo 3. La precipitación con butanol proporcionó 8.4 OD (260) del oligonucleótido marcado con FDA deseado. ESI-MS para la sal de di-Na: 5395.93 (calculado para di-Na: 5395.09) .
Ejemplo 5: Síntesis de C0_13 (5' -F3-TATTCCGTCAT-3' ) El oligonucleótido fue sintetizado de conformidad con lo descrito en el Ejemplo 1 empezando a partir de un vehículo CPG que tenía 1 µmol de timidina unido a través del extremo 3' . Todas las oxidaciones fueron efectuadas empleando agua con yodo. El acoplamiento con el 5' -amino-modif icador C6 fue después efectuado de conformidad con lo descrito en el ejemplo 2. La desprotección con amoniaco concentrado y ácido acético al 80% proporcionó 72 OD (260) del 5' -a ino-enlazador-TATTCCGTCAT-3' . La purificación en un gel de poliacrilamida de preparación proporcionó 43 OD (260) . 10 OD (260) del 5' -amino-enlazador oligonucleótido reaccionaron después con FDA isotiocianato de conformidad con lo descrito en el ejemplo 3. La precipitación con butanol proporcionó 9.1 OD (260) del oligonucleótido deseado marcado con FDA. ESI-MS: 3934.1 (peso molecular calculado 3933.8). Ejemplo 6: Síntesis de CO_21 (5'-F7-A*T*G A C*G G A A*T*T*C) El oligonucleótido fue sintetizado de conformidad con lo descrito en el ejemplo 1 empezando a partir de vehículo CPG que tenía 1 µmol de N6-benzoilcitidina unido a través del extremo 3' . Todas las oxidaciones fueron efectuadas empleando agua con yodo. El acoplamiento con el 5' -amino-modificador C6 fue después efectuado de conformidad con lo descrito en el ejemplo 2. La desprotección con amoniaco concentrado y ácido acético al 80% proporcionó 145 de OD (260) del 5' -amino-enlazador-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3' . 10 OD (260) del 5' -amino-enlazador oligonucleótido fueron disueltos en 16 µl de amortiguador TBK 0.2 M y 95 µl de DMF, y la mezcla fue reaccionada con 30 µl del éster activado de ácido p-acetoxibenzoico, que había sido preparado de antemano. El éster activado fue preparado mediante la mezcla de 50 µl de ácido p-acetoxibenzoico 0.2 M con 50 µl de TBTU 0.3 M, en cada caso en DMF, seguido por una reacción de una hora a temperatura ambiente. Después de una reacción de 4 horas del amino-enlazador-oligonucleótido con el éster activado, se agregaron 2 µl del ácido acético semiconcentrado y la mezcla fue concentrada bajo presión reducida. Se removió el reactivo en exceso mediante precipitación con butanol. De esta manera se obtuvo 10.7 OD (260) del conjugado de oligonucleótido deseado. ESI-MS: 4109.2 (peso molecular calculado 4108.2) . Ejemplo 7: examen de la absorción celular de los conjugados de oligonucleótidos Para examinar la absorción celular, 1 ml de suspensión de células fue agregada en una cámara Bachofer en medio de cultivo (o bien después de enjuague en PBS en el caso de medio con fluorescencia inherente) bajo control microscópico con 1 ml de una solución 1 µmolar del conjugado de oligonucleótido, la mezcla efectuándose utilizando la pipeta, y mediante agitación de la cámara. La microscopía fue efectuada con la ayuda del aparato Zeiss Axiovert 135 TV apparatus (100 x Plan-Neofluar) en el modo de contraste de fase. Los filtros de fluorescencia utilizados fueron filtros 09 (450-490/FT 510/LP 520) / HBO 59W. La referencia utilizada fue una solución 2.4 µM de FDA (Aldrich Chem. Co., FW.416.39) en acetona/amortiguador de PBS 1:1000; v:v) . En el caso de conjugados de FDA, la fluorescencia inherente del ligando de fluoresceína formado por la disociación éster puede ser monitoreada después de la absorción. En el caso de ligandos no fluorescentes tales como ácido acetoxinaftalencarboxílico, un marcador de fluorescencia adecuado (FITC, rodamina, colorante de cianina Dy3 o Dy5) fue agregado adicionalmente al oligonucleótido. Un doble marcador como en CO_9 sirvió para demostrar que FDA no era disociado del oligonucleótido. Las muestras individuales fueron evaluadas de 2 a 120 minutos después de adición del conjugado de oligonucleótido. En el caso de células Reh, la fluorescencia fue claramente evidente después de 5 a 10 minutos, en el caso de K562 y células adherentes y también células de insecto, se observó un cierto incremento hasta 60 minutos después de la adición. En el caso de protozoarios libres, la absorción tardó hasta 1 hora. En el caso de levaduras, la absorción ocurrió solamente después de un período prolongado de tiempo y no fue homogénea en todas las células. La absorción de conjugados de FDA ollgonucleótido en esporas fúngales fue mejor que en células hifales. Los resultados aparecen resumidos en las tablas 1 a 3. Ejemplo 8: examen de la acción antiproliferativa de los conjugados de oligonucleótido Las células REH (células de leucemia pre-B de ser humano, DSM ACC 22) o células tumorales A549 fueron cultivadas en OptiMEM con suero fetal de becerro al 10% (FCS: GIBCO-BRL) a una temperatura de 37° C bajo C02 al 5%. El día previo al experimento, las células fueron subcultivadas de tal manera que se logró una concentración de células de aproximadamente 1 x loVml después de 24 horas. Los oligonucleótidos o sus conjugados fueron disueltos en agua destilada para proporcionar soluciones madres 1 M y almacenados en un refrigerador a una temperatura de -20° C. Las células fueron sembradas en placas de 24 pozos (1 x 10° células/ml en OptiMEM con FCS al 10%) . Para el examen, los derivados de oligonucleótidos fueron diluidos a 2 µM (en OptiMEM sin FCS) . Por pozo, se mezclaron 100 µl de una solución de oligonucleótidos y 100 µl de una suspensión de células (volumen total: 200 µl/pozo; concentración de oligo 1 µM, concentración sérica FCS al 5%, concentración celular 0.5 x 106 células/ml) . Después de 4 horas de incubación a una temperatura de 37° C y C02 al 5%, se agregaron 800 µl de OptiMEM con FCS al 11% por pozo (concentración celular ahora lxl06 células/ml, concentración sérica ahora FCS al 10%) y la incubación prosiguió. Después de 96 horas a una temperatura de 37° C y CO; al 5%, la concentración celular fue medida empleando Casy 1 (de Schárfe) . Para este propósito, las células en cada pozo fueron mezcladas mediante succión en una pipeta de 1000 µl y sopladas otra vez, en cada caso 10 veces, y diluidas inmediatamente 1:100 (en el caso de crecimiento celular más fuerte 1:200) con Casyton. El valor medio de la densidad celular fue determinado en cada caso a partir de 3 muestras idénticas de un lote. Ejemplo 9: síntesis de 5'-F4' (CO-NH) -A*T*G A C*G G A A*T*T*C El oligonucleótido fue sintetizado de conformidad con lo descrito en el ejemplo 1 empezando a partir de un vehículo CPG que tenía 1 µmol de N-benzoilcitidina unida a través del extremo 3' . Para introducir un radical fosforotioato (si * está presente en la secuencia) , las oxidaciones fueron efectuadas utilizando agua con yodo o bien reactivo de Beaucage. El acoplamiento con el 5' -amino-modificador C6 fue efectuado de conformidad con lo descrito en el ejemplo 2. Se llevó a cabo una desprotección con amoniaco concentrado y ácido acético al 80% lo que proporcionó 145 OD (260) de 5'-amino-enlazador-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3' . 10 OD (260) del 5-amino-enlazador-oligonucleótido fueron disueltos en 16 µl de amortiguador TBK 0.2 M y 95 µl de DMF, y la mezcla fue reaccionada con 12.5 µl de hidroxisuccinimida de diacetato de diclorofluoresceína (peso molecular: 626.36) .
Después de una reacción de 3 horas del amino-enlazador-oligonucleótido con la hidroxisuccinimida, se agregaron 2 µl de ácido acético semiconcentrado, y la mezcla es concentrada bajo presión reducida. Después de remover la sal en una columna NAP® (Pharmacia) , se efectuó precipitación con butanol. De esta forma se obtuvieron 2.8 OD (260) del conjugado deseado de oligonucleótido diacetato de diclorofluoresceína. ESI-MS: 4403.3 (peso molecular calculado 4403.2) . Ejemplo 10: Síntesis de 5' -F2' - (CO-NH) -A*T*G A C*G G A A*T*T*C El oligómero 5' -amino-enlazador-A*T*G A C*G G A A*T*C-3' fue preparado de conformidad con lo descrito en el ejemplo 9. 10 OD (260) del 5' -amino-enlazador-oligonucleótido fueron disueltos en 16 µl de amortiguador TBK 0.2 M y 95 µl de DMF, y la mezcla fue reaccionada con 12.5 µl de hidroxisuccinimida de dipivalato de carboxifluoresceína (peso molecular: 641.64). Después de una reacción de 2 horas del amino-enlazador-oligonucleótido con la hidroxisuccinimida, se agregaron 12.5 µl adicionales de hidroxisuccinimida, y la reacción prosiguió durante 2 horas adicionales. 2 µl de ácido acético semiconcentrado son después agregados y la mezcla es concentrada bajo presión reducida. La remoción de sal en una columna NAP® (Pharmacia) fue seguida por precipitación con butanol. Esto proporcionó 8.1 OD (260) del conjugado deseado de oligonucleótido dipivalato de fluoresceína. ESI-MS: 4472.9 (peso molecular calculado 4471.6). Ejemplo 11: Síntesis de 5'-F9-A*T*G A C*G G A A*T*T*C El oligómero 5' -amino-enlazador-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3' fue preparado de conformidad con lo descrito en el ejemplo 9. 10 OD (260) del 5' -amino-enlazador-oligonucleótido fueron disueltos en 16 µl de amortiguador TBK 0.2 M y 95 µl de DMF, y la mezcla fue reaccionada con 25 µl del éster activado de ácido acetoxinaftilcarboxílico. El éster activado fue preparado mediante la mezcla de 12.5 µl de ácido acetoxinaftilcarboxílico 0.2 M (2.5 mg en 50 µl de DMF) con 12.5 µl de TBTU (4 mg en 50 µl de DMF), seguido por una reacción de una hora a temperatura ambiente. Después de una reacción de 17 horas del amino-enlazador-oligonucleótido con el éster activado, se agregaron 2 µl de ácido acético semiconcentrado y la mezcla fue concentrada bajo presión reducida- La remoción de sal en una columna NAP® (Pharmacia) fue seguida por precipitación con butanol. De esta forma se obtuvieron 8.5 OD (260) del conjugado oligonucleótido acetoxinaftilo deseado. ESI-MS: 4158.2 (peso molecular calculado 4157.2) . Ejemplo 12: Síntesis de 5'-F8-A*T*G A C*G G A A*T*T*C El oligómero 5' -amino-enlazador-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3' fue preparado de conformidad con lo descrito en el ejemplo 9. 10 OD (260) del 5' -amino-enlazador-oligonucleótido fueron disueltos en 16 µl de amortiguador TBK 0.2 M y 95 µl de DMF, y la mezcla fue reaccionada con 25 µl de éster activado de ácido acetoxicoumarincarboxílico. El éster activado fue preparado por medio de la mezcla de 12.5 µl de ácido acetoxicoumarincarboxílico 0.2 M (2.7 mg en 50 µl de DMF) con 12.5 µl de TBTU (4 mg en 50 µl de DMF), seguido por una reacción de una. hora a temperatura ambiente. Después de una reacción de 17 horas del amino-enlazador-oligonucleótido con el éster activado, se agregaron 2 µl del ácido acético semiconcentrado y la mezcla es concentrada bajo presión reducida. La remoción de sal en una columna NAP® (Pharmacia) fue seguida por precipitación con butanol. De esta forma se obtuvieron 8.0 OD (260) del conjugado deseado de oligonucleótido acetoxicoumarina. ESI-MS: 4178.5 (peso molecular calculado 4175.2) . Ejemplo 13: Síntesis de 5' -F3- (dA) ndA*dA*dA (n = 17, 47 y 77; F3 = FDA) Los oligonucleótidos fueron sintetizados de conformidad con lo descrito en el ejemplo 1 empezando a partir de un vehículo CPG que fue derivado con N6-benzoil-2' -desoxiadenosina a través del extremo 3' . Las oxidaciones después de los dos primeros acoplamientos fueron efectuadas empleando un reactivo Beaucage para introducir los radicales de fosforotioato (marcados en la secuencia por *), todas las demás oxidaciones fueron efectuadas empleando agua con yodo.
El acoplamiento con el 5' -amino-modificador C6 fue después efectuado de conformidad con lo descrito en el ejemplo 2. La remoción de la protección con amoniaco concentrado y ácido acético al 80% y purificación en un gel de poliacrilamida de preparación proporcionaron 2.95 OD (260) del 5' -amino-enlazador (dA) 47dA*dA*dA, 4.9 OD (260) del 5' -amino-enlazador-(dA) 4-dA*dA*dA y 5 OD (260) del 5' -amino-enlazador-(dA) 77dA*dA*dA. En cada caso, los 5' -amino-enlazador-oligonucleótidos fueron disueltos en 8 µl de amortiguador TBK 0.2 M y 62 µl de DMF, y la mezcla fue reaccionada con 1.6 µl de FDA isotiocianato. Después de una reacción de 3 horas, se agregó FDA isotiocianato adicional y la reacción prosiguió durante 2 horas. 2 µl de ácido acético semiconcentrado se agregan después y la mezcla es concentrada bajo presión reducida. La remoción de sal en columna NAP© (Pharmacia) fue seguida por precipitación con butanol. De esta forma se obtuvieron 1.5 OD (260) de 5' -F3- (dA) 77dA*dA*dA, 2.2 OD (260) de 5'-F3-(dA)47dA*dA*dA y 0.9 OD (260) de 5'-F3- Ejemplo 14: Síntesis del oligonucleótido doblemente marcado 5'-Cy3-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-C6-F3; F3=FDA El oligonucleótido fue sintetizado de conformidad con lo descrito en el ejemplo 1 empezando a partir de un vehículo CPG que permite la introducción de un C6-amino-enlazador en el extremo 3' (Petrie et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3, 85-87) . Las oxidaciones fueron efectuadas empleando agua de yodo o reactivo de Beaucage para introducir un radical fosforotioato (si * está presente en la secuencia) . Después de la disociación del último grupo protector de di etoxitritilo, el extremo 5' del oligonucleótido fue reaccionado con Cy3-CE fosforamidita (de Glen Research, Sterlin, VA; Número de Catálogo 10-5913-xx) y oxidado con agua de yodo. La desprotección con amoniaco concentrado (2 horas a 70° C) proporcionó 64 OD (260) del producto crudo. La purificación en gel de poliacrilamida de preparación proporcionó 3.8 OD del 5'-Cy3-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-C6-asino-enlace-3' , 3.5 OD (260) de lo cual se disuelven en 8 µl de amortiguador TBK 0.2 M y 62 µl de DMF, y reacciona con 1.6 µaol de FDA isotiocianato. Después de una reacción de 3.5 horas del amino-enlazador-oligonucleótido con la hidroxisuccinimida, se agrega 1 µl de ácido acético s€ffliconcentrado y la mezcla es concentrada bajo presión reducida. La remoción de sal en columna NAP© (Pharmacia) fue seguida por precipitación con butanol. De esta forma se obtuvieron 3.5 OD (260) del oligonucleótido doblemente marcado deseado 5'-Cy3-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-C6-F3. ESI-MS: 4926-2 (peso molecular calculado 4927.1). Ejemplo 15: Síntesis de 5'-F3-A*T*G A C*G G A A*T*T*C; F3 = FDA El oligómero 5' -amino-enlazador-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3' fue preparado de conformidad con lo descrito en el ejemplo 9. 10 OD (260) del 5' -amino-enlazador-oligonucleótido fueron disueltos en 16 µl de amortiguador TBK 0.2 M y 95 µl de DMF, y la mezcla fue reaccionada con 25 µl de FDA isotiocianato (5 mg en 100 µl de DMF) . Después de una reacción de 3 horas del amino-enlazador-oligonucleótido con el isotiocianato, se agregaron 3 µl adicionales del isotiocianato, y se permitió que la reacción prosiguiera durante 2 horas adicionales. Se agregó después 2 µl de ácido acético semiconcentrado y la mezcla fue concentrada bajo presión resultante. La remoción de sal en una columna NAP® (Pharmacia) fue seguida por precipitación con butanol. De esta forma se obtuvieron 8.5 OD (260) del conjugado deseado de oligonucleótido diacetato de fluoresceína. ESI-MS: 4418.4 (peso molecular calculado 4418.5). Ejemplo 16: Comparación de la absorción celular de conjugados de oligonucleótidos de longitudes diferentes 5'-F3- (dA)ndA*dA*dA (n = 17, 47 y 77; F3 = FDA) La absorción celular de los conjugados de longitudes y pesos moleculares diferentes del ejemplo 12 fue efectuada en principio de conformidad con lo descrito en el ejemplo 7, empleando células REH. La cuantificación fue efectuada con la ayuda de citómetro de flujo. Después de 60 minutos, la señal de fluorescencia relativa para 5' -F3- (dA) :-dA*dA*dA ("A20") es 49, y para 5' -F3- (dA) 47dA*dA*dA ("A 50") es 34, y para 5'-F3- (dA) -7dA*dAJdA ("A 80") es 91. De manera sorprendente, la absorción del conjugado de FDA con la mayor porción de oligonucleótido, que comprende un total de 80 nucleótidos, fue absorbido más efectivamente por las células REH. Ejemplo 17: Comparación de la absorción celular de conjugados de oligonucleótidos con derivación diferente El dipivalato de fluoresceína es un compuesto relacionado con el diacetato de fluoresceína (FDA) que tiene una estabilidad incrementada de los grupos éster. Los conjugados de oligonucleótidos correspondientes fueron examinados para determinar la absorción empleando un citómetro de flujo. La estabilidad incrementada del pivalato a los alcanilos y esterasas resulta en una absorción reducida del conjugado de oligonucleótido correspondiente. Así, la fluorescencia relativa medida para el conjugado de diacetato de fluoresceína después de 60 minutos es 195, mientras que es solamente 55 para el conjugado de dipivalato de fluoresceína correspondiente . Ejemplo 18: Examen de la absorción celular del conjugado de oligonucleótido doblemente marcado 5'-Cy3-A*T*G A C*G A A*T*T*C-C6-FDA a partir del ejemplo 13 El FACScan mostró que el conjugado Cy3 oligonucleótido F3 es rápidamente absorbido por células REH. El tratamiento de las células con un complejo conjugado de oligonucleótido/Cellfectin proporciona una absorción similar pero considerablemente menos uniforme. El efecto del FDA conjugado interfiere considerablemente con el efecto del complejo de Cellfectin oligonucleótido. Se examinó también la co-ubicación de los dos grupos de marcadores diferentes en el oligonucleótido en la incubación con células, con el objeto de excluir la posibilidad que la fluorescencia medida fuese basada solamente en el FDA disociado o fluoresceína. El conjugado Cy3 oligonucleótido F3 tenía el colorante cianina covalentemente unido en el extremo 5' y FDA covalentemente unido en el extremo 3' . La figura 9 muestra la fluorescencia verde y roja después de una incubación de 4 horas de las células de REH con el conjugado C?3 oligonucleótido F3. Puesto que la co-ubicación de los dos marcadores en las células puede ser observada, se puede considerar que el oligonucleótido es absorbido en forma intacta. Solamente los grupos acetilo de la porción FDA fueron hidrolizados, probablemente por esterasas, puesto que el radical FDA no fluorescente fue evidentemente convertido en el radical de fluoresceína fluorescente. La absorción del conjugado Cy3/FDA fue muy rápida puesto que los dos marcadores pudieron ser detectados después de solamente 7 minutos posteriores a la adición. Cuatro concentraciones del conjugado oligonucleótido FDA CO_l del ejemplo 4 fueron examinadas para determinar la actividad antiproliferativa en células tumorales A549. El conjugado inhibió la proliferación sin adición de un realzador de penetración. El oligonucleótido correspondiente sin conjugado F3 (0N1) inhibe la proliferación solamente después de la formación de complejos con un realzador de penetración (CellFectin de Gibco-BRL) . Los resultados aparecen en la tabla 4. Tabla 1: Examen por microscopía de fluorescencia de la absorción de oligonucleótidos marcados con FDA (conjugado oligonucleótido-FDA) en células de mamíferos, células de fluorescencia fluorescencia fluorescencia mamífero de: después de después de después de nombre de la 5 minutos 20 minutos 60 minutos linea de células A B A B A B REH + + ++ K562 (+) + Lu 18 ( + ) KB3-1 + Ptk 2 ( + ) células de mamífero de: fluorescencia después nombre de la línea de de 120 minutos células A B REH ++ * K562 + Lu 18 + KB3-1 Ptk 2 + A: Incubación con oligonucleótidos marcados con FDA C0_1 y C0_3 B: Incubación con oligonucleótidos marcados con fluoresceína C0_2 y C0_4 (+) absorción débil + absorción moderada ++ absorción muy fuerte ninguna absorción * absorción solamente en células dañadas Tabla 2: Examen por microscopía de fluorescencia de la absorción de oligonucleótidos marcados con FDA en células de insecto (para la leyenda, véase tabla 1) células de insecto fluorescencia después de después de después de 20 60 minutos 120 minutos minutos A B A B A B células SF9 + ++ ++ Tabla 3: Examen por microscopía de fluorescencia de la absorción de oligonucleótidos marcados con FDA en varios organismos . Organismo fluorescencia fluorescencia fluorescencia después de después de después de 20 minutos 60 minutos 120 minutos A B A B A B Bac. subtilis (6633)# L. bulgaricus E. coli (K12)# Yarrowia lipolytica* (forma silvestre H 222) Saccaromyces cerevisiae' Esporas de Fusarium (+) culmorum (JP 15, hongo) quistes de reticulomy- - ++ en ++ xa filosa (amiba de agua particular dulce) núcleos Haematococcus pluvia- - - + - + -lis (alga verde, flagelado) Chlorogonium sp . - + - + (alga verde, flagelado) Dunaliella salina - + - + - (véase diatoma) A: Incubación con oligonucleótidos marcados con FDA CO_l y C0_3 B: Incubación con oligonucleótidos marcados con fluoresceína CO_2 y CO_i (para la leyenda para la evaluación, véase tabla 1) fue absorbido solamente en algunas de las células de estos organismos que se dividen rápidamente.
Tabla 4: Resultados del ejemplo 8 Sustancia densidad de células % de inhibición ninguna 5.96 FDA 6.05 - 1.5 100 nM CO_l 5.65 5.2 200 nM CO_l 5.3 11.1 500 nM CO_l 5.03 15.6 1000 nM CO 1 4.16 30.2 Tabla 5: Transfección de conjugados de FDA (A20, A50, A80 del ejemplo 15) en función de la duración tiempo [min] fluoresceina fluorescencia fluorescencia A20 ASO A80 0 0.0103 0.0103 0.0103 10 11.71 8.9 43.31 20 39.68 28.06 88.36 30 48.59 34.38 91.28 40 54.7 38.75 92.35 50 58.66 41.64 93.19 60 62.13 44.33 93.62 Tabla 6: Comparación de la absorción celular de conjugados de oligonucleótido con diacetato de fluoresceína y dipivalato d fluoresceína (ejemplo 16, figura 8) . tiempo [min] fluorescencia fluorescencia K39 K41 0 2.66 2.75 10 72.37 8.49 20 112.34 18.17 30 142.97 28.67 40 164.64 38.34 50 184.96 46.62 60 195.57 55.26 70 80 218.12 68.02 90 10 100 231.04 83.7 110 120 253.84 97 15 20 25 LISTA DE SECUENCIAS <110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> Conjugados y métodos para la producción de los mismos, y su uso para transportar moléculas a través de membranas biológicas <130> 1999/L045 <140> <141> <150> 19935302.6 <151> 1999-07-28 <160> 63 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido modificado <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (16) <400> 1 dgcgacgcca tgacgg 16 <212> 2 <211> 13 <212> ADN <213> secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido modificado <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (13) <400> 2 dcgacgccat gac 13 <210> 3 <211> 13 <212> ADN <213> secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (13) <400> 3 datgacggaa ttc 13 <210> 4 <211> 12 <212> ADN <213> secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (12) <400> 4 dtattccgtc at 12 <210> 5 <211> 2 <212> ADN <213> secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (2) <400> 5 da 2 <210> 6 <211> 2 <212> ADN <213> secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido <220> <221> misc_feature <222> (1) .. 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(20) <400> 26 ggggaaagcc cggcaagggg 20 <210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (20) <400> 27 cacccgcctt ggcctcccac 20 <210> 28 <211> 18 <212> ADN <213> secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (18) <400> 28 gggactccgg cgcagcgc 18 <210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (20) <400> 29 ggcaaacttt cttttcctcc 20 <210> 30 <211> 19 <212> ADN <2I3> secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (19) <€00> 30 gggaaggagg aggatgagg 19

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES n conjugado que comprende una molécula a transportar y or lo menos n (I) o un radical arilo de la fórmula I, en donde arilo es un grupo que contiene por lo menos un anillo que tiene un carácter aromático ; X es O o N; Y es O, S o bien NH-R:; R1 es un radical alquilo C;-C;3 sustituido o insustituido que puede ser de cadena recta o ramificada y puede contener enlaces dobles y/o enlaces triples; R: es un radical alquilo C-C;5 sustituido o insustituido que puede ser de cadena recta o ramificado y puede contener enlaces dobles y/o enlaces triples; y n es un número entero mayor que 1 o igual 1, en donde el radical arilo está unido a la molécula a transportar ya sea directamente a través de un enlace químico o bien indirectamente a través de un grupo químico, en donde el grupo químico no es un grupo CH2-S si la unión es a través de un enlace fosfodiéster entre nucleótidos de la molécula a transportar. Un conjugado de conformidad con la reivindicación 1, en donde la molécula a transportar es una macromolécula que tiene un peso molecular mayor que 500 daltones. Un conjugado de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la molécula a transportar es un polinucleótido, un polipéptido o un polisacárido . Un conjugado de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la molécula a transportar es un oligonucleótido. Un conjugado de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 4, en donde el oligonucleótido es modificado. Un conjugado de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, en donde la molécula a transportar es un compuesto de bajo peso molecular que tiene u? peso molecular menor que 500 daltones. Un conjugado de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 6, en donde el compuesto de bajo peso molecular es un mononucleótido. Un conjugado de conformidad con una o varias de las reivindicaciones l a l , en donde el grupo químico junto con el radical arilo tiene la fórmula II Y R3-arilo- .A "R1 (ll) en donde arilo, X, Y y R~ son de conformidad con lo definido arriba y R3 es el grupo químico en donde R" es de preferencia un grupo -C(=0) o un grupo -NH-C(=S) . Un conjugado de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el grupo químico y el radical arilo juntos tienen una de las fórmulas Fl a Fll, con (F5) 25 (F7) (F6) (F9) (F8) (F11) conjugado que comprende a) un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido y b) uno o varios radicales arilo de la fórmula I, en donde el radical arilo o los radicales arilo esté (n) unido (s) ya sea directamente a través de un enlace químico o bien indirectamente a través de un grupo químico al extremo 5' y/o extremo 3' y/o una o varias nucleobases y/o uno o varios radicales azúcar y/o uno o varios enlaces entre nucleósidos, en donde el grupo químico no es un grupo CH2-S si la unión es a través de un enlace fosfodiéster entre nucleótidos . Un proceso para preparar un conjugado que comprende una molécula a transportar y por lo menos un radical arilo, en donde a) se prepara una molécula a transportar que tiene una función reactiva en la posición en la cual debe unirse el radical arilo; y b) se prepara un radical arilo y c) la molécula a transportar reacciona con el radical arilo para proporcionar el conjugado. El proceso de conformidad con la reivindicación 11, en donde la función reactiva es un grupo amino, grupo mercapto, grupo cloroacetilo, grupo isocianato, grupo isotiocianato, grupo ácido carboxílico, grupo N- hidroxisuccini ida o bien grupo cloruro de carbonilo. 13. El proceso de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 11 y 12, en donde la reacción de la molécula a transportar con el radical arilo se efectúa a un pH < 7.5. 14. El proceso de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 11 a 132, en donde la reacción de la molécula a transportar con el radical arilo se efectúa a un pH de 7.0. 15. El proceso de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 11 a 14, en donde la molécula a transportar es un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido . 16. El uso de un radical arilo de la fórmula I o II que es unido a una molécula a transportar para el transporte de esta molécula a través de una membrana biológica. 17. Un método para transportar una molécula a través de una membrana, que comprende a) preparar un conjugado en el cual la molécula a transportar está unida con por lo menos un radical arilo de la fórmula I o II, y b) incubar el conjugado con la membrana. 18. Un método para transportar una molécula en una célula, que comprende a) preparar un conjugado en el cual la molécula a transportar está unida con por lo menos un radical arilo de la fórmula 1 o II, y b) incubar el conjugado con la célula, después de lo cual c) el conjugado es transportado en la célula sin disociación del radical arilo. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde la célula es una célula eucariótica o una célula procariótica. 20. El método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 18 y 19, en donde la célula es una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula de mamífero. 21. El método de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 18 a 20, en donde la célula es una célula humana. 22. El proceso de conformidad con una o varias de las reivindicaciones 18 a 21, en donde la célula es una célula tumoral . 23. Un proceso para preparar un fármaco, que comprende a) la preparación de un compuesto farmacéuticamente activo o un derivado del mismo, donde dicho compuesto farmacéuticamente activo o dicho derivado contiene por lo menos una función reactiva en una posición en la cual se debe de fijar un radical arilo, b) preparar un radical arilo de la fórmula I o II, c) hacer reaccionar el compuesto farmacéuticamente activo o su derivado con su radical arilo para proporcionar el conjugado y mezclar el conjugado, d) en caso apropiado, con aditivos y/o excipientes adicionales . 24. Un fármaco, que comprende un conjugado de conformidad con lo reclamado en una o varias de las reivindicaciones 1 a 10. 25. Un auxiliar de diagnóstico, que comprende un conjugado de conformidad con lo reclamado en una o varias de las reivindicaciones 1 a 10. 26. Un conjunto de elementos para prueba, que comprende un conjugado de conformidad con lo reclamado en una o varias de las reivindicaciones 1 a 10.
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