MXPA01012293A - Prevencion y tratamiento de la enfermedad amiloidogenica. - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones y metodos farmaceuticos para prevenir o tratar varias enfermedades amiloides, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedades de prion, familias de neuropatias amiloides y lo similar. Las composiciones farmaceuticas incluyen cantidades inmunologicamente reactivas de componentes fibrilares amiloides, particularmente peptidos o proteinas formadoras de fibrillas. Tambien se describen composiciones y metodos terapeuticos que utilizan reactivos inmunes que reaccionan con tales componentes fibrilares.

Description

PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD AMILOIDOGENICA Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud Provisional de los E.U. 60/137,010, presentada el Io de Junio de 1999, la cual mediante la presente se incorpora en su totalidad en la misma. Campo de la Invención La invención se refiere a composiciones y métodos para el tratamiento de condiciones amiloide-relacionadas en humanos y otros vertebrados mamíferos. Antecedentes de la Invención La amiloidosis es un término general que describe varias enfermedades caracterizadas por la deposición extracelular de fibrillas de proteína, que forman numerosos "depósitos amiloides" , que puede ocurrir en sitios localizados o de manera sistémica. La composición fibrilar de estos depósitos es una característica de identificación para las diversas formas de enfermedad amiloide. Por ejemplo, los depósitos intracerebrales y cerebro-vasculares compuestos principalmente de fibrillas del péptido beta amiloide (ß-AP) son característicos de la enfermedad de Alzheimer (formas tanto familiar como esporádica) , el péptido de la proteína amiloide de isleta (IAPP; amilina) es característico de las fibrillas en depósitos amiloides de célula de isletas pancreáticas, asociados con la diabetes tipo II y la microglobulina ß2 es el componente principal de depósitos amiloides que se forman como consecuencia del tratamiento de hemodiálisis a largo plazo. Más recientemente, las enfermedades prion-asociadas, tales como la enfermedad de Creutzfeld-Jacob, han sido reconocidas también como enfermedades amiloides. Las diversas formas de la enfermedad se han dividido en clases, principalmente en base a si la amiloidosis está asociada o no con una enfermedad sistémica subyacente. De este modo, se considera que ciertos desórdenes son amiloidosis primaria, en la cual no existe evidencia de enfermedad preexistente o coexistente. En general, las amiloidosis primarias de la enfermedad se caracterizan por la presencia de fibrillas de proteína "tipo cadena amiloide ligera" (tipo AL) , llamadas así por la homología de la región N-terminal de las fibrillas AL al fragmento variable de cadena de inmunoglobulina ligera (cappa o lambda) . La amiloidosis secundaria o "reactiva" se caracteriza por la deposición de fibrillas tipo AA derivadas de la proteína A Amiloide en Suero (ApoSSA) . Estas formas de amiloidosis se caracterizan por un estado de enfermedad subyacente crónico inflamatorio o infeccioso (e.g., artritis reumatoide, osteomielitis, tuberculosis, lepra) . La amiloidosis familiares heredadas puede tener depósitos neuropáticos, renales o cardiovasculares asociados del tipo transtiretina ATTR . Otras amiloidosis familiares heredadas incluyen otros síndromes y pueden tener diferentes componentes amiloides (e.g., fiebre Mediterránea familiar que se caracteriza por las fibrillas AA) . Otras formas de amiloidosis incluyen formas locales, caracterizadas por depósitos focales, frecuentemente en forma de tumor que ocurren en órganos aislados. Otras amiloidosis se asocian con el envejecimiento y se caracterizan comúnmente por la formación de placas en el corazón o el cerebro. También son comunes los depósitos amiloides asociados con la hemodiálisis a largo plazo. Estas y otras formas de enfermedad amiloide se resumen en la Tabla 1. (Tan, S.Y. y Pepys, Histopathology 25:403-414, 1994; Harrison's Handbook of Infernal Medicine, 13a Ed., Isselbacher, K.J., et al, eds. McGraw-Hill, San Francisco, 1995) . aProteína exócrina de vesícula seminal Frecuentemente, las fibrillas que forman el grueso de un depósito amiloide se derivan de una o más proteínas precursoras primarias o péptidos y comúnmente se asocian con glicosaminoglicanos sulfatados. Además, los depósitos amiloides pueden incluir proteínas menores y péptidos de varios tipos, junto con otros componentes, tales como proteoglicanos, gangliósidos y otros azúcares, como se describe en mayor detalle en las secciones siguientes. Actualmente, no existen tratamientos específicos dirigidos a amiloides para ninguna de las enfermedades amiloides. Cuando existe un estado de enfermedad subyacente o asociado, la terapia se dirige hacia la reducción de la producción de la proteína amiloidogénica tratando la enfermedad subyacente. Esto se ejemplifica por el tratamiento de la tuberculosis con antibióticos, con lo cual se reduce la carga microbacterial , dando como resultado una reducción de la inflamación y la reducción asociada de la proteína SSA. En el caso del amiloide AL debida al mieloma múltiple, se administra quimioterapia a los pacientes, ocasionando una reducción en las células de plasma y una disminución de los niveles de inmunoglobulina del mieloma. A medida que estos niveles declinan, el amiloide AL puede despejarse. Las solicitudes de patente de los E.U. de los mismos propietarios, USSN 09/201,430, presentada el 30 de Noviembre de 1998 y USSN 09/322,289, presentada el 28 de Mayo de 1999, revelan que la carga de la placa amiloide asociada con la enfermedad de Alzheimer puede reducirse (y prevenirse) grandemente mediante la administración de agentes que producen o confieren una respuesta inmune dirigida al péptido ß-amiloide (Aß) y fragmentos del mismo. El descubrimiento de la presente invención es que la inducción de una respuesta inmune a varios componentes de placa amiloide es efectiva para tratar un amplio rango de enfermedades amiloides. Sumario de la Invención La presente invención se dirige a composiciones farmacéuticas y métodos para tratar varias enfermedades amiloides. De acuerdo a un aspecto, la invención incluye composiciones farmacéuticas que incluyen, como ingrediente activo, un agente que es efectivo para inducir una respuesta inmune contra un componente amiloide en un paciente. Tales composiciones incluirán también generalmente excipientes y en modalidades preferidas pueden incluir adyuvantes. En modalidades preferidas adicionales, los adyuvantes incluyen, por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, MPL™, QS-21 (Stimulon™) o adyuvante de Freund incompleto. De acuerdo a una modalidad relacionada, tales composiciones farmacéuticas pueden incluir una pluralidad de agentes efectivos para inducir una respuesta inmune contra más de un componente amiloide en el paciente. En una modalidad relacionada, el agente es efectivo para producir una respuesta inmune dirigida contra un péptido fibrilar o un componente amiloide de proteína. Preferentemente, tal péptido o proteína fibrilar se deriva de una proteína precursora fibrilar conocida por estar asociada con ciertas formas de enfermedades amiloides, como se describe en la presente. Tales proteínas precursoras incluyen, pero no se limitan a, proteína A Amiloide en Suero (ApoSSA) , cadena ligera de inmunoglobulina, cadena pesada de inmunoglobulina, ApoAI , transtiretina, lisozima, cadena fibrógena a, gelsolina, cistatina C, precursor de proteína ß amiloide (ß-APP) , microglobulina Beta2, proteína precursora de prion (PrP) , factor atrial natriurético, queratina, polipéptido amiloide de ísleta, una hormona de péptido y sinucleína. Tales precursores incluyen también proteínas mutantes, fragmentos de proteína y péptidos proteolíticos de tales precursores. En una modalidad preferida, el agente es efectivo para inducir una respuesta inmune dirigida contra un neoepítope formado por una proteína o péptido fibrilar, con respecto a una proteína precursora fibrilar. Esto es, como se describe en la presente en mayor detalle, muchos péptidos o proteínas formadores de fibrilla son fragmentos de tales proteínas precursoras, tales como las arriba listadas. Cuando se forman tales fragmentos, tal como por división proteolítica, pueden revelarse epítopes que no están presentes en el precursor y en consecuencia no se encuentran inmunológicamente disponibles al sistema inmune cuando el fragmento es parte de la proteína precursora. Los agentes dirigidos a tales epítopes pueden ser agentes terapéuticos preferidos, debido a que puede ser menos probable que induzcan una respuesta autoinmune en el paciente. De acuerdo a una modalidad relacionada, las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agentes dirigidos a componentes amiloides, tales como los seleccionados a partir del grupo que incluye, pero no se limita a los siguientes péptidos o proteínas fibrilares: AA, AL, ATTR, AapoAl, Alys, Agel, Acys, Aß, Aß2M, Ascr, Acal, AIAPP y el fragmento NAC de sinucleína. Los nombres completos y las composiciones de estos péptidos se describen en la presente. Tales péptidos pueden elaborarse de acuerdo a métodos bien conocidos en la técnica, como se describe en la presente. De acuerdo a una modalidad adicional relacionada, los agentes incluidos en tales composiciones farmacéuticas incluyen también a ciertos proteoglicanos sulfatados. En una modalidad relacionada, el proteoglicano es un glicosaminoglicano de sulfato de heparina, de preferencia perlecano, sulfato dermatano, sulfato de condroitina-4 opolisulfato de pentosana. De acuerdo a otro aspecto relacionado, la invención incluye un método para prevenir o tratar un trastorno caracterizado por la deposición amiloide en un sujeto mamífero. De acuerdo con este aspecto de la invención, se da al sujeto una dosis de un agente efectivo para producir una respuesta inmune contra un componente amiloide característico del trastorno amiloide del cual sufre el sujeto. Esencialmente, los métodos incluyen administrar composiciones farmacéuticas que contienen componentes amiloides inmunogénicos específicos para el trastorno, tales como los descritos anteriormente. Tales métodos se caracterizan además por su efectividad para inducir respuestas inmunogénicas en el sujeto. De acuerdo a una modalidad preferida, el método es efectivo para producir una respuesta inmunológica que se caracteriza por un título de suero de al menos 1:1000 con respecto al componente amiloide contra el cual se dirige el agente inmunogénico. Aún en una modalidad preferida adicional, el título de suero es de al menos 1:5000 con respecto al componente fibrilar. De acuerdo a una modalidad relacionada, la respuesta inmune se caracteriza por una cantidad de inmunorreactividad en suero correspondiente a más de aproximadamente cuatro veces mayor que el nivel de inmunorreactividad en suero medido en una muestra de suero control de pre-tratamiento. Esta última caracterización es particularmente apropiada cuando la inmunorreactividad del suero se mide mediante técnicas ELISA, pero puede aplicarse a cualquier medida relativa o absoluta de inmunorreactividad del suero. De acuerdo a una modalidad preferida, la inmunorreactividad se mide a una dilución de suero de aproximadamente 1:100. De acuerdo a todavía un aspecto adicional relacionado, la invención incluye un método para determinar la prognosis de un paciente que experimenta el tratamiento para un trastorno amiloide. Aquí, se mide la cantidad de inmunorreactividad en suero del paciente contra un componente amiloide característico del trastorno seleccionado y una cantidad de inmunorreactividad en suero del paciente de al menos cuatro veces el nivel de control de la línea base de inmunorreactividad en suero es indicativa de una prognosis de estado mejorado con respecto al trastorno amiloide particular. De acuerdo a las modalidades preferidas, la cantidad de inmunorreactividad contra el componente amiloide seleccionado presente en el suero del paciente se caracteriza por un título de suero de al menos aproximadamente 1:1000 o de al menos 1:5000, con respecto al componente amiloide. De acuerdo a todavía un aspecto relacionado, la invención incluye también métodos y composiciones farmacéuticas llamados de "inmunización pasiva" para prevenir o tratar enfermedades amiloides. De acuerdo a este aspecto de la invención, se da a los pacientes una dosis efectiva de un anticuerpo que se une específicamente a un componente amiloide seleccionado, de preferencia un componente fibrilar presente en depósitos amiloides característicos de la enfermedad que va a tratarse. En general, tales anticuerpos se seleccionan por sus capacidades para unirse específicamente a varias proteínas, péptidos y componentes descritos con respecto a las composiciones farmacéuticas y métodos descritos en los párrafos precedentes de esta sección. De acuerdo a una modalidad relacionada, tales métodos y composiciones pueden incluir combinaciones de anticuerpos que se unen a al menos dos componentes amiloides fibrilares. En general, las composiciones farmacéuticas se administran para proporcionar una cantidad de inmunorreactividad en suero contra el componente amiloide objetivo que es al menos aproximadamente cuatro veces más alta que el nivel de inmunorreactividad en suero contra el componente medido en una muestra de suero de control . Los anticuerpos pueden administrarse también con un vehículo, como aquí se describe. En general, de acuerdo con este aspecto de la invención, tales anticuerpos se administrarán (o se formularán para su administración) de manera peritoneal, oral, intranasal, subcutánea, intramuscular, tópica o intravenosa, pero pueden administrarse o formularse para su administración por cualquier ruta farmacéuticamente efectiva (i.e., efectiva para producir los niveles terapéuticos indicados, como se describió anteriormente y en la presente) . De acuerdo a una modalidad relacionada, los anticuerpos terapéuticos pueden administrarse al administrar un polinucleótido que codifica al menos una cadena de anticuerpos al paciente. De acuerdo a este aspecto de la invención, el polinucleótido se expresa en el paciente para producir la cadena de anticuerpos en una cantidad farmacéuticamente efectiva en el paciente. Tal polinucleótido puede codificar cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo, con lo cual se producen las cadenas pesadas y ligeras en el paciente. De acuerdo a las modalidades preferidas, los regímenes de inmunización antes descritos pueden incluir la administración de agentes, incluyendo anticuerpos, en dosis múltiples, tal como sobre un período de 6 meses, tal como la inmunización inicial seguida por inyecciones de refuerzo a intervalos de tiempo, tales como intervalos de 6 semanas, de acuerdo a métodos conocidos en la técnica o de acuerdo a las necesidades del paciente, según se valore mediante la respuesta inmunológica. Alternativamente o en adición, tales regímenes pueden incluir el uso de formulaciones de "liberación sostenida", tal como se conocen en la técnica. Estos y otros objetivos y características de la invención se volverán más completamente aparentes cuando la siguiente descripción detallada de la invención se lea en conjunto con los dibujos que la acompañan. Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Título del anticuerpo en ratones transgénicos después de la inyección con Aßl-42. Figura 2. Carga amiloide en el hipocampo. El porcentaje del área de la región hipocampal ocupada por placas amiloides, definida por la reactividad con el anticuerpo 3D6 monoclonal Aß-específico, se determinó mediante el análisis de imagen cuantitativa asistido por computadora de las secciones de cerebro inmunorreactivadas . Los valores para los ratones individuales se muestran clasificados por el grupo de tratamiento. La línea horizontal para cada agrupación indica el valor medio de la distribución . Figura 3. Distrofia neurítica en el hipocampo. El porcentaje del área de la región hipocampal ocupada por las neuritas distróficas, definida por su reactividad con el 8E5 monoclonal APP-específico de humano, se determinó mediante el análisis de imagen cuantitativa asistido por computadora de las secciones de cerebro inmunorreactivadas. Los valores para los ratones individuales se muestran para el grupo tratado con AN1792 y para el grupo de control tratado con PBS. La línea horizontal para cada agrupación indica el valor medio de la distribución. Figura 4. Astrocitosis en la corteza retrosplenial . El porcentaje del área de la región cortical ocupada por los astrocitos de proteína glial fibrilarmente acídica (GFAP) -positiva, se determinó mediante el análisis de imagen cuantitativa asistido por computadora de las secciones de cerebro inmunorreactivadas. Los valores para los ratones individuales se muestran clasificados por grupo de tratamiento y los valores medios de grupo se indican mediante líneas horizontales.

Figura 5. Títulos de anticuerpos de media geométrica para Aß42 seguidas de inmunización con un rango de ocho dosis de Aß42 ( "AN1792 " ) que contiene 0.14, 0.4, 1.2, 3.7, 11, 33, 100 o 300 µg . Figura 6. Cinéticas de respuesta del anticuerpo a la inmunización AN1792 . Los títulos se expresan como media geométrica de los valores para los 6 animales en cada grupo. Figura 7. Análisis de imagen cuantitativo de la carga amiloide cortical en ratones tratados con PBS y A?1792. Figura 8. Análisis de imagen cuantitativo de la carga de placa neurítica en ratones tratados con PBS y AN1792 . Figura 9. Análisis de imagen cuantitativo del porcentaje de la corteza retrosplenial ocupada por la astrocitosis en ratones tratados con PBS y A?1792. Figura 10. Análisis de Proliferación de Linfocitos sobre células de bazo a partir de ratones tratados con A?1792 (panel superior) o con PBS (panel inferior) . Figura 11. Niveles totales de Aß en la corteza cerebral . Un diagrama de dispersión de perfiles Aß individuales en ratones inmunizados con derivados de Aß o APP combinados con adyuvante de Freund. Figura 12. Carga amiloide en la corteza, determinada por el análisis de imagen cuantitativo de secciones de cerebro inmunorreactivadas para ratones inmunizados con los conjugados del péptido Aß, Aßl-5, Aßl-12 y Aßl3-28; los agregados Aß de longitud total Aß42 ("AN1792") y Aßl-40 ("AN1528") y el grupo de control tratado con PBS. Figura 13. Títulos de media geométrica del anticuerpo específico de Aß para grupos de ratones inmunizados con derivados de Aß o APP combinados con adyuvante de Freund. Figura 14. Títulos de media geométrica del anticuerpo específico de Aß para grupos de cobayos inmunizados con AN1792 o con un derivado palmitoilado del mismo, combinado con varios adyuvantes. Figura 15. (A-E) : Niveles de Aß en la corteza de ratones PDAPP de doce meses de edad tratados con AN1792 o AN1528 con diferentes adyuvantes. Figura 16. Título medio de ratones tratados con anticuerpo policlonal para Aß . Figura 17. Título medio de ratones tratados con anticuerpo monoclonal 10D5 para Aß . Figura 18. Título medio de ratones tratados con anticuerpo monoclonal 2F12 para Aß . Descripción Detallada de la Invención A. Definiciones A menos que se indique de otra manera, todos los términos aquí utilizados tienen el mismo significado que tendrían para el experto en la técnica de la presente invención. Los profesionales se remitirán particularmente a Sambrook, et al, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Segunda Edición) , Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. y Ausubel, F.M., et al. (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., para las definiciones, términos de la técnica y métodos estándar conocidos en la técnica de la bioquímica y la biología molecular. Se comprende que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, ya que éstos pueden variar para producir el mismo resultado. El término "adyuvante" se refiere a un compuesto que, cuando se administra en conjunto con un antígeno, aumenta la respuesta inmune al antígeno, pero al administrarse solo no genera una respuesta inmune al antígeno. Los adyuvantes pueden aumentar una respuesta inmune mediante varios mecanismos incluyendo el reclutamiento de linfocitos, la estimulación de células B y/o T y la estimulación de macrófagos. "Enfermedad amiloide" o "amiloidosis" se refiere a cualquiera de varios desórdenes que tienen como síntoma o como parte de su patología la acumulación o formación de placas amiloides. Una "placa amiloide" es un depósito extracelular compuesto principalmente de fibrillas proteináceas. En general, las fibrillas están compuestas de una proteína dominante o péptido; sin embargo, la placa puede incluir también componentes adicionales que son las moléculas de péptido o no péptido, como se describe en la presente. Un "componente amiloide" es cualquier entidad molecular que se encuentra presente en una placa amiloide incluyendo porciones antigénicas de tales moléculas. Los componentes amiloides incluyen pero no se limitan a proteínas, péptidos, proteoglicanos y carbohidratos. Un "componente amiloide específico" se refiere a una entidad molecular que se encuentra principal o exclusivamente en la placa amiloide de interés. Un "agente" es una molécula química de origen sintético o biológico. En el contexto de la presente invención, un agente es generalmente una molécula que puede utilizarse en una composición farmacéutica. Un "agente anti-amiloide" es un agente que es capaz de producir una respuesta inmune contra un componente de placa amiloide en un sujeto vertebrado, al administrarse mediante técnicas de inmunización activa o pasiva. Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" , como se utilizan en la presente de manera intercambiable se refieren a una molécula polimérica que tiene una estructura que soporta bases capaces de unir un hidrógeno a polinucleótidos típicos, donde la estructura del polímero presenta las bases de modo que permite que tal hidrógeno se una en una manera de secuencia específica entre la molécula polimérica y un polinucleótido típico (e.g., ADN de trenzado sencillo) . Tales bases son típicamente inosina, adenosina, guanosina, citosina, uracilo y timidina. Las moléculas poliméricas incluyen ARN y AD? de doble y sencillo trenzado y modificaciones de estructuras de los mismos, por ejemplo, enlaces de metilfosfonato. El término "polipéptido" como se utiliza en la presente se refiere a un compuesto elaborado de una cadena simple de residuos de aminoácido enlazados por enlaces polipéptidos. El término "proteína" puede ser sinónimo del término "polipéptido" o puede referirse a un complejo de dos o más polipéptidos. El término "péptido" se refiere también a un compuesto compuesto de residuos de aminoácido unidos por enlaces péptidos. Generalmente los péptidos se componen de 100 o menos aminoácidos, mientras que los polipéptidos o proteínas tienen más de 100 aminoácidos. Como aquí se utiliza, el término "fragmento de proteína" puede leerse también para significar un péptido. Un "péptido fibrilar" o "proteína fibrilar" se refiere a una forma monomérica o agregada de una proteína o péptido que forma fibrillas presentes en las placas amiloides. Se proporcionan en la presente ejemplos de tales péptidos y proteínas. Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición química o biológica adecuada para su administración a un individuo mamífero. Tales composiciones pueden formularse específicamente para su administración vía una o más de varias rutas, que incluyen pero no se limitan a, oral, parenteral, intravenosa, intra-arterial, subcutánea, mtranasal, sublingual, intra-espinal , intra-cerebroventricular y lo similar. Un "excipiente farmacéutico" o un "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un vehículo, comúnmente un líquido, en el cual se formula un agente terapéutico activo. El excipiente generalmente no proporciona ninguna actividad farmacológica a la formulación, aunque puede proporcionar estabilidad química y/o biológica, características de liberación y lo similar. Las formulaciones ejemplificativas pueden encontrarse, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Ed. , Grennaro, A.,Ed. 1995. Una "glicoproteína" es proteína a la cual se une de manera covalente al menos una cadena de carbohidratos (oligopolisacarido) . Un "proteoglicano" es una glicoproteína en donde al menos una de las cadenas de carbohidratos es un glicosaminoglicano, que es un polímero lineal largo de disacaridos de repetición en los cuales un miembro del par es comúnmente un ácido de azúcar (ácido urónico) y el otro es un azúcar amino. El término respuesta "inmunológica" o "inmune" o "inmunogénica" se refiere al desarrollo de una respuesta humoral (mediada por anticuerpos) y/o celular (mediada por células T antígeno-específicas o sus productos de secreción) dirigida contra un antígeno en un individuo vertebrado. Tal respuesta puede ser una respuesta activa inducida por la administración de antígeno o una respuesta pasiva inducida por la administración de anticuerpos o células T preparadas. Una respuesta celular inmune se obtiene mediante la presentación de epítopes de polipéptido en asociación con moléculas MHC de Clase I o de Clase II para activar células auxiliares T CD4+ antígeno-específicas y/o células T citotóxicas CD8+. La respuesta puede involucrar también la activación de monocitos, macrófagos, células NK, basófilos, células dendríticas, astrocitos, células microgliales, eosinófilos u otros componentes de inmunidad innata. La presencia de una respuesta inmunológica mediada por células puede determinarse mediante análisis estándar de proliferación (células T CD4+) o análisis CTL (linfocito T citotóxico) conocidos en la técnica. Las contribuciones relativas de respuestas humorales y celulares al efecto protector o terapéutico de un antígeno pueden distinguirse mediante el aislamiento por separado de inmunoglobulina (IgG) y fracciones de célula T a partir de un animal singeneico inmunizado y la medición del efecto protector o terapéutico en un segundo sujeto. Un "agente inmunogénico" o "inmunógen" o "antígeno" es una molécula que es capaz de inducir una respuesta inmunológica contra sí misma al administrarse a un paciente, ya sea en conjunto con o en ausencia de un adyuvante. Tales moléculas incluyen, por ejemplo, péptidos fibrilares amiloides o fragmentos de los mismos conjugados a una proteína portadora, tal como la hemocianina de lapa bocallave, Cd3 o la toxina del tétanos. Un "epítope" o "determinante antigénico" es la parte de un antígeno que se une a la región de unión de antígeno de un anticuerpo. El término "Aß" , "péptido Aß" y péptido "ß amiloide" son sinónimos y se refieren a una o más composiciones péptidas de aproximadamente 38-43 aminoácidos derivados a partir de la Proteína Precursora Beta Amiloide (ß-APP) , como se describe en la presente. "Aßxx" se refiere al péptido ß 1-xx, en donde xx es un número que indica el número de aminoácidos en el péptido; e.g., Aß42 es lo mismo que Aßl-42, al que también se refiere aquí como "AN1792" y Aß40 es lo mismo que Aßl-40, al cual también se refiere aquí como "AN1578". Aß desagregado o monomérico significa unidades péptidas solubles monoméricas de Aß . Un método para preparar Aß monomérico es disolver un péptido liofilizado en DMSO puro con sonicación. La solución resultante se centrifuga para remover cualquier partícula insoluble. El Aß agregado es una mezcla de oligómeros en los cuales se mantienen juntas las unidades monoméricas mediante enlaces no-covalentes . El término "polinucleótido puro" se refiere a un polinucleótido no compuesto con materiales coloidales. Algunas veces, los polinucleótidos desnudos se clonan en un vector de plásmido. El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento ya sea profiláctico o terapéutico. Los términos "significativamente diferente a," "estadísticamente significante" , "significativamente mayor (o menor) que," y frases similares se refieren a comparaciones entre datos u otras mediciones, en donde las diferencias entre dos individuos o grupos comparados son evidentemente o razonablemente diferentes para el observador entrenado o estadísticamente significativos (si la frase incluye el término "estadísticamente" o si existe alguna indicación de prueba estadística, tal como un valor p o si los datos, al analizarse, producen una diferencia estadística mediante pruebas estadísticas estándar conocidas en la técnica) . Las composiciones o métodos que "comprenden" uno o más de los elementos citados pueden incluir otros elementos no específicamente citados. Por ejemplo, una composición que comprende un péptido de componente fibrilar abarca tanto el péptidos aislado como el péptido como componente de una 5 secuencia polipéptida mayor. A modo de ejemplo adicional, una composición que comprende los elementos A y B abarca también una composición que consiste de A, B y C. B. Enfermedades Amiloides 1. Resumen y Patogénesis 10 Las enfermedades amiloides o amiloidosis incluyen varios estados de enfermedad que tienen una amplia variedad de síntomas externos. Estos trastornos tienen en común la presencia de depósitos extracelulares anormales de fibrillas de proteína, conocidos como "depósitos amiloides" o "placas 15 amiloides" que son comúnmente de aproximadamente 10-100 µm de diámetro y se localizan en órganos o regiones de tejido específicos. Tales placas se componen principalmente de una proteína o péptido soluble de origen natural. Estos depósitos insolubles se componen de agregados de fibrillas 20 generalmente laterales que son de aproximadamente 10-15 nm de diámetro. Las fibrillas amiloides producen una característica de birrefringencia verde manzana en la luz polarizada, al teñirse con tinte Rojo Congo. Los trastornos se clasifican en base a los principales componentes 25 fibrilares que forman los depósitos de placa, como se trata -~i— -* »* z"*>-im i a i -*- * -*»•*- * - •-más adelante. Los péptidos o proteínas que forman los depósitos de placa se producen frecuentemente a partir de una proteína precursora mayor. Más específicamente, la patogénesis de los depósitos amiloides fibrilares implica generalmente la división proteolítica de una proteína precursora "anormal" en fragmentos . Estos fragmentos se agregan generalmente en láminas plegadas ß anti-paralelas; sin embargo, ciertas formas no degradadas de la proteína precursora han reportado agregarse y formar fibrillas en la polineuropatía amiloide familiar (fibrillas variantes de transtiretina) y en la amiloidosis relacionada con diálisis (fibrillas de microglobulina ß2) (Tan, et al . ,1994, supra) . 2 . Síndromes Clínicos Esta sección proporciona descripciones de tipos principales de amiloidosis, incluyendo sus composiciones fibrilares de placa características. Es un descubrimiento general de la presente invención que las enfermedades amiloides pueden tratarse administrando agentes que sirven para estimular una respuesta inmune contra un componente o componentes de los diversos depósitos amiloides específicos de la enfermedad. Como se trata en mayor detalle en la Sección C más adelante, tales componentes son preferentemente constituyentes de las fibrillas que forman las placas. Las secciones siguientes sirven para ejemplificar formas principales de amiloidosis y no pretenden limitar la invención. a. Amiloidosis AA (reactiva) En general, la amiloidosis AA es una manifestación de varias enfermedades que provocan una respuesta sostenida de fase aguda. Tales enfermedades incluyen trastornos inflamatorios crónicos, infecciones microbiales locales o sistémicas crónicas y neoplasmas malignos. Las fibrillas AA se componen generalmente de fragmentos de 8000 dalton (péptido o proteína AA) formados mediante la división proteolítica de la proteína A Amiloide en Suero (apoSSA) , una apolipoproteína circulante que está presente en las partículas HDL y que se sintetiza en hepatocitos en respuesta a tales citocinas como IL-1, IL-6 y TNF. La deposición puede difundirse en el cuerpo, con una preferencia por los órganos parenquimales . El bazo es comúnmente un sitio de deposición y los ríñones también pueden afectarse. La deposición es común también en el corazón y el tracto gastrointestinal. Las enfermedades amiloides AA incluyen, pero no se limitan a enfermedades inflamatorias, tales como la artritis reumatoide, artritis juvenil crónica, espondilitis anquilosante, psoriasis, artropatía psoriática, síndrome de Reiter, enfermedad Still en adultos, síndrome de Behcet y enfermedad de Crohn. Los depósitos AA se producen también como resultado de infecciones microbiales crónicas, tales como la lepra, tuberculosis, bronquiectasis, úlceras decúbito, pielonefritis crónica, osteomielitis y la enfermedad de Whipple. Ciertos neoplasmas malignos pueden también dar como resultado depósitos amiloides fibrilares AA. Incluyen tales condiciones como el linfoma de Hodgkin, carcinoma renal, carcinomas de intestino, pulmón y tracto urogenital, carcinoma de célula basal y leucemia de célula pilosa. b. Amiloidosis AL La deposición amiloide AL se asocia generalmente con casi cualquier discracia del linaje del linfocito B, fluctuando desde la malignidad de las células de plasma (mieloma múltiple) hasta la gamopatía monoclonal benigna. A veces, la presencia de depósitos amiloides puede ser un indicador primario de la discracia subyacente. Las fibrillas de los depósitos amiloides AL se componen de cadenas ligeras de inmunoglobulina monoclonal o fragmentos de las mismas. Más específicamente, los fragmentos se derivan de la región N-terminal de la cadena ligera (cappa o lambda) y contienen todo o parte del dominio variable (Vi) de la misma. Los depósitos generalmente ocurren en los tejidos mesenquimales ocasionando neuropatía periférica y autónoma, síndrome carpal de túnel, macroglosia, cardiomiopatía restrictiva, artropatía de articulaciones grandes, discracias inmunes, mielomas, así como discrasias ocultas. Sin embargo, deberá notarse que casi cualquier tejido, en particular de órganos viscerales tal como el corazón, puede estar involucrado. c. Amiloidosis Sistémica Hereditaria Existen muchas formas de amiloidosis sistémica hereditaria. Aunque son condiciones relativamente raras, el inicio de síntomas en adultos y sus patrones de herencia (dominante comúnmente autosomal) conducen a la persistencia de tales trastornos en la población general. Generalmente, los síndromes se atribuyen a mutaciones de punto en la proteína precursora que conducen a la producción de péptidos o proteínas amiloidogénicas variantes. La Tabla 2 resume la composición fibrilar de formas ejemplificativas de estos trastornos. Tabla 2 Amiloidosis Hereditaria3 Fragmento N-terminal Arg26 , Tipo Ostertag, no-de la Arg50, neuropático Apolipoproteína Al Arg60, (predominantemente (AapoAI ) otras implicación visceral) Lisozima (Alys) Thr56, Tipo Ostertag, no- His67 neuropático (predominantemente implicación visceral] Fragmento fibrógeno Leu554, Tipo Ostertag, no-de cadena a Val526 neuropático (predominantemente implicación visceral) Fragmento de |Asnl87, Neuropatía craneal con Gelsolina (Agel) Tyrl87 distrofia corneal reticular Fragmento de Glu68 Hemorragia cerebral cistatina hereditaria (angiopatía amiloide cerebral) -Tipo Islándico Proteína ß-amiloide Gln93 Hemorragia cerebral (Aß) derivada de la hereditaria (angiopatía Proteína Precursora amiloide cerebral) -Tipo Amiloide (APP) Alemán Proteína ß-amiloide Ile717, Enfermedad de Alzheimer (Aß) derivada de la Phe717, Familiar Proteína Precursora Gly717 Amiloide (APP) Proteína ß-amiloide Asn670, Demencia Familiar-probable (Aß) derivada de la Leu671 enfermedad de Alzheimer Proteína Precursora Amiloide (APP) Proteína de Prion Leul02, Enfermedad de Creutzfeldt- (PrP) derivada de la Vall67, Jakob familiar; síndrome de proteína precursora Asnl78, Gerstmann-Stráussler-de PrP inserto 51-91 Lys200 Scheinker (encefalopatías espongiformes hereditarias, enfermedades de prion) AA derivada de la Fiebre Mediterránea proteína A amiloide familiar, implicación renal en suero (ApoSSA) predominante (recesiva autosomal) AA derivada de la Síndrome de Muckle-Well, proteína A amiloide nefropatía, sordera, en suero (ApoSSA) urticaria, dolor en extremidad aDatos derivados de Tan & Pepys, 1994, supra . Los datos proporcionados en la Tabla 2 son ejemplificativos y no pretenden limitar el alcance de la invención. Por ejemplo, se han descrito más de 40 mutaciones de punto separadas en el gen de transtiretina, todos los cuales dan origen a formas clínicamente similares de la polineuropatía amiloide familiar. La transtiretina (TTR) es una proteína de 14 kilodaltones la cual algunas veces también se refiere como prealbúmina . Se produce mediante el hígado y el plexo coroide y funciona para transportar hormonas tiroides y vitamina A. Al menos 50 formas variantes de la proteína, cada una caracterizada por un solo cambio aminoácido, son las responsables de las diversas formas de polineuropatía amiloide familiar. Por ejemplo, la sustitución de prolina por leucina en la posición 55 resulta en una forma particularmente progresiva de neuropatía; la sustitución de metionina por leucina en la posición 111 resultó en una severa cardiopatía en pacientes Daneses. Los depósitos amiloides aislados del tejido cardíaco de los pacientes con amiloidosis sistémica revelaron que los depósitos se componen de una mezcla heterogénea de TTR y fragmentos de la misma, referidos colectivamente como ATTR, cuyas secuencias de longitud total se han caracterizado. Los componentes fibrilares ATTR pueden extraerse de tales placas y determinar su estructura y secuencia de acuerdo a los métodos conocidos en la técnica (e.g., Gustavsson, A., et al , Laboratory Invest. 73: 703-708, 1995; Kametani, F., et al , Biochem. Biophys, Res. Commun. 125: 622-628, 1984; Pras, M. , et al . , PNAS 80: 539-42, 1983). Las personas que tienen mutaciones de punto en la molécula de apolipoproteína AI (e.g., Gly->Arg26; Trp->Arg50; Leu->Arg60) exhiben una forma de amiloidosis ("tipo Óstertag" ) caracterizada por depósitos de la proteína apolipoproteína AI o fragmentos de la misma (AapoAI) . Estos pacientes tienen bajos niveles de lipoproteína de alta densidad (HDL) y se presentan con una neuropatía periférica o falla renal. Una mutación en la cadena alfa de la enzima lisozima (e.g., Ile->Thr56 o Asp->His57) es la base de otra forma de amiloide hereditario de tipo Óstertag no-neuropático reportado en familias Inglesas. Aquí, se depositan las fibrillas de la proteína mutante lisozima (Alys) y los pacientes exhiben generalmente una función renal deteriorada. Esta proteína, a diferencia de la mayoría de las proteínas formadoras de fibrillas descritas en la presente , se encuentra comúnmente presente en forma completa (no-fragmentada) (Benson, M.D., et al . , CIBA Fdn. Symp. 199: 104- 131, 1996) . El péptido ß-amiloide (Aß) es un péptido de 39-43 aminoácidos derivado mediante proteólisis de una proteína grande conocida como proteína precursora beta amiloide (ßAPP) . Las mutaciones en la ßAPP dan como resultado formas familiares de la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down y/o demencia senil, caracterizadas por la deposición cerebral de placas compuestas de fibrillas Aß y otros componentes, que se describen en mayor detalle más adelante. Las mutaciones conocidas en la APP asociadas con la enfermedad de Alzheimer ocurren próximas a los sitios de división de ß o ? secretasa o dentro de Aß . Por ejemplo, la posición 717 se encuentra próxima al sitio de división ?-secretasa de la APP en su proceso para Aß y las posiciones 670/671 están próximas al sitio de división ß-secretasa. Las mutaciones en cualquiera de estos residuos pueden dar como resultado la enfermedad de Alzheimer, presumiblemente ocasionando un incremento en la cantidad de la forma del aminoácido 42/43 de Aß generado a partir de APP. La estructura y la secuencia de los péptidos Aß de varias longitudes son bien conocidas en la técnica. Tales péptidos pueden elaborarse de acuerdo a métodos conocidos en la técnica (e.g., Glenner y Wong, Biochem Biophys. Res. Comm. 129: 885-890, 1984; Glenner y Wong, Biochem Biophys. Res. Comm. 122: 1131-1135, 1984). Además, diversas formas de los péptidos se encuentran comercialmente disponibles . La sinucleína es una proteína sinapsa-asociada que se asemeja a una alipoproteína y es abundante en el citosol neuronal y en las terminales presinápticas . Un fragmento péptido derivado de -sinucleína, llamado NAC, es también un componente de placas amiloides de la enfermedad de Alzheimer, (Clayton, et al., 1998). Este componente sirve también como objetivo para los tratamientos inmunológicamente-basados de la presente invención, como se detalla más adelante. La gelsolina es una proteína que se une al calcio que se une y fragmenta, filamentos de actina. Las mutaciones en la posición 187 (e.g., Asp->Asn; Asp->Tyr) de la proteína dan como resultado una forma de amiloidosis hereditaria sistémica, comúnmente encontrada en pacientes Finlandeses, así como en personas de origen Alemán o Japonés. En individuos afectados, las fibrillas formadas a partir de fragmentos de gelsolina (Agel) , consisten comúnmente de 173-243 aminoácidos (fragmento carboxiterminal de 68 kDa) y se depositan en vasos sanguíneos y membranas base, dando como resultado distrofia corneal y neuropatía craneal que progresan a neuropatía periférica, cambios distróficos en la piel y deposición en otros órganos. (Kangas, H., et al., Human Mol. Genet. 5 (9) : 1237-1243 , 1996). Otras proteínas mutadas, tales como la cadena alfa mutante de cistatina C fibrinógena (AfibA) y mutante (Acys) forman también fibrillas y producen trastornos hereditarios característicos. Las fibrillas AfibA forman depósitos característicos de un amiloide no-neuropático hereditario con enfermedad renal; los depósitos Acys son característicos de una angiopatía amiloide cerebral hereditaria reportada en Islandia. (Isselbacher, et al., Harrison's Principies of Infernal Medicine, McGraw-Hill, San Francisco, 1995; Benson, et al . , supra) . Al menos en algunos casos, los pacientes con angiopatía amiloide cerebral (CAA) han mostrado tener fibrillas amiloides que contienen una forma no-mutante de cistatina C en conjunto con proteína beta. (Nagai, A., et al., Molec. Chem. Neuropathol . 33: 63-78, 1998). Se considera ahora que ciertas formas de enfermedad de prion son hereditarias, contando hasta 15% de casos, que previamente se pensó que eran predominantemente de naturaleza infecciosa. (Baldwin, et al., en Research Advances in Alzheimer' s Disease and Related Disorders, John Wiley and Sons, New York, 1995) . En tales trastornos de prion, los pacientes revelan placas compuestas de isoformas anormales de la proteína de prion normal (PrPc) . Una isoforma mutante predominante, PrPSc, que se refiere también como AScr, difiere de la proteína celular normal en su resistencia a la degradación de proteasa, la insolubilidad después de la extracción detergente, la deposición en lisosomas secundarios, la síntesis post-translacional y el alto - • - iyXím&aai^ym.... contenido de lámina ß-plegada. Se ha establecido la reticulación genética para al menos cinco mutaciones resultantes en la enfermedad de Creutzfeld-Jacob (CJD) , el síndrome de Gerstmann-Stráussler-Scheinker (GSS) y el insomnio familiar fatal (FFI) , (Baldwin) . Los métodos para extraer péptidos fibrilares de fibrillas fragmentadas, determinando secuencias y elaborando tales péptidos se conocen en la técnica (e.g., Beekes, M. , et al., J. Gen. Virol. 76: 2567-76, 1995) . Por ejemplo, una forma de GSS se ha enlazado a una mutación de PrP en el codon 102, mientras segrega el GSS telencefálico con una mutación en el codon 117. Las mutaciones en los codones 198 y 217 dan como resultado una forma de GSS en la cual las placas neuríticas características de la enfermedad de Alzheimer contienen PrP en vez del péptido Aß . Ciertas formas de CJD familiar se han asociado con mutaciones en los codones 200 y 210; las mutaciones en los codones 129 y 178 se han encontrado en CJD familiar y en FFI . (Baldwin, supra) . d. Amiloidosis Sistémica Senil La deposición amiloide, ya sea sistémica o focal, aumenta con la edad. Por ejemplo, las fibrillas de transtiretina tipo silvestre (TTR) se encuentran comúnmente en el tejido del corazón de individuos ancianos. Estas pueden ser asintomáticas, clínicamente silenciosas o pueden dar como resultado falla cardíaca. Los depósitos focales fibrilares asintomáticos pueden ocurrir también en el cerebro (Aß) , amilácea corporal de la próstata (microglobulina Aß2) , articulaciones y vesículas seminales. e. Amiloidosis Cerebral La deposición local de amiloide es común en el cerebro, particularmente en individuos ancianos. El tipo más frecuente de amiloide en el cerebro se compone principalmente de fibrillas péptido Aß, dando como resultado demencia o enfermedad de Alzheimer esporádica (no-hereditaria) . De hecho, la incidencia de la enfermedad de Alzheimer esporádica excede grandemente las formas mostradas como hereditarias. Los péptidos fibrilares que forman estas placas son muy similares a aquellos descritos anteriormente, con referencia a formas hereditarias de la enfermedad de Alzheimer (AD) . f . Amiloidosis Relacionada a la Diálisis Las placas compuestas de fibrillas de microglobulina ß2 (Aß2M) se desarrollan comúnmente en pacientes que reciben hemodiálisis o diálisis peritoneal a largo plazo. La microglobulina ß2 es un polipéptido de 11.8 kilodaltones y es la cadena ligera de antígenos MHC Clase I, que están presentes en todas las células nucleadas. Bajo circunstancias normales, se difunde continuamente desde las membranas celulares y se filtra normalmente mediante el riñon. La falla en la depuración, tal como en el caso de función renal deteriorada, conduce a la deposición en el riñon y en otros sitios (principalmente en los tejidos ricos en colágeno de las articulaciones) . A diferencia de otras proteínas fibrilares, las moléculas Aß2M se encuentran presentes generalmente en forma no-fragmentada en las fibrillas. (Benson, supra) . g. Amiloidosis Derivadas de Hormonas Los órganos endocrinos pueden albergar depósitos amiloides, particularmente en individuos ancianos. Los tumores que secretan hormonas pueden contener también placas amiloides derivadas de hormonas, cuyas fibrillas se componen de hormonas de polipéptido tales como calcitonina (carcinoma medular de la tiroides) , polipéptido amiloide de ísleta (amilina: que ocurre en la mayoría de los pacientes con diabetes Tipo II) y péptido atrial natriurético (amiloidosis atrial aislada) . Las secuencias y estructuras de estas proteínas son bien conocidas en la técnica. h. Amiloidosis Heterogéneas Existe una variedad de otras formas de enfermedad amiloide que se manifiestan normalmente como depósitos de amiloide localizados. En general, estas enfermedades son probablemente el resultado de la producción localizada y/o la falta de catabolismo de precursores fibrilares específicos o de una predisposición de un tejido en particular (tal como el de las articulaciones) para la deposición fibrilar. Los & a «a MÍ^^a^. ejemplos de tal deposición idiopática incluyen amiloide AL nodular, amiloide cutáneo, amiloide endocrino y amiloide relacionado con tumor. C. Composiciones Farmacéuticas El descubrimiento de la presente invención es que las composiciones capaces de producir o proporcionar una respuesta inmune dirigidas a ciertos componentes de placas amiloides son efectivas para tratar o prevenir el desarrollo de enfermedades amiloides. En particular, de acuerdo a la invención aquí proporcionada, es posible prevenir el progreso, aminorar los síntomas y/o reducir la carga de la placa amiloide en individuos afectados, cuando se administra al paciente una dosis inmunoestimulatoria de un agente anti-amiloide o del reactivo inmune anti-amiloide correspondiente. Esta sección describe de manera ejemplificativa a los agentes anti-amiloides que producen respuestas inmunes activas, así como pasivas, a las placas amiloides y proporciona datos ejemplificativos que muestran el efecto del tratamiento utilizando tales composiciones sobre la carga de la placa amiloide. En general, los agentes anti-amiloides de la invención se componen de un componente de placa específico, de preferencia un componente que forma fibrillas, que es comúnmente una proteína característica, un péptido o un fragmento de los mismos, como se describió en la sección previa y se ejemplifica más adelante. Más generalmente, los agentes terapéuticos para uso en la presente invención producen o inducen una respuesta inmune contra una placa o más específicamente, contra un componente fibrilar de la misma. Por lo tanto, tales agentes incluyen, pero no se limitan al componente en sí y sus variantes, análogos y miméticos del componente que inducen y/o reaccionan transversalmente con anticuerpos al componente, así como anticuerpos o células T que son específicamente reactivas con el componente amiloide. De acuerdo a una característica importante, las composiciones farmacéuticas no se seleccionan a partir de componentes no-específicos, esto es, a partir de aquellos componentes que circulan generalmente o que son ubicuos en todo el cuerpo. A modo de ejemplo, la Proteína Amiloide en Suero (SAP) es una glicoproteína de plasma circulante que se produce en el hígado y se une a la mayoría de las formas conocidas de depósitos amiloides. Las composiciones terapéuticas se dirigen preferentemente a este componente . La inducción de una respuesta inmune puede ser activa, como cuando se administra un antígeno para inducir anticuerpos o células T reactivas con el componente en un paciente o pasiva, como cuando se administra un anticuerpo que se une por sí mismo al componente amiloide en el paciente. Los agentes ejemplificativos para inducir o producir una respuesta inmune contra las placas amiloides se describen en las siguientes secciones. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir, además de el (los) agente (s) inmunogénico (s) , una cantidad efectiva de un adyuvante y/o excipiente. Los adyuvantes y excipientes farmacéuticamente efectivos y útiles son bien conocidos en la técnica y se describen en mayor detalle en las siguientes Secciones. 1. Agentes Inmunoestimulatorios (Respuesta Inmune Activa) a. Composiciones anti-fibrilares Una clase general de agentes anti-amiloides preferidos consiste de agentes que se derivan de proteínas fibrilares amiloides. Como se mencionó anteriormente, la marca distintiva de las enfermedades amiloides es la deposición en un órgano u órganos de placas amiloides que consisten principalmente de fibrillas, que a su vez, se componen de proteínas o péptidos fibrilares característicos. De acuerdo a la presente invención, tal componente de proteína o péptido fibrilar es un agente útil para inducir una respuesta inmune anti-amiloide . Las Tablas 1 y 2 resumen de manera ejemplificativa las proteínas formadoras de fibrillas que son características de varias enfermedades amiloides. De acuerdo con este aspecto de la presente invención, la administración a un individuo afectado o susceptible de una composición inmunoestimulatoria que incluye la proteína o el péptido de fibrilla apropiado, incluyendo homólogos y fragmentos de los mismos, proporciona terapia o profilaxis con respecto a la enfermedad amiloide. A modo de ejemplo, el Aß, también conocido como péptido ß-amiloide o péptido A4 (ver Patente de los E.U. 4,666,829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)), es un péptido de 39-43 aminoácidos, que es el componente principal de las placas características de la enfermedad de Alzheimer. El Aß se genera procesando una proteína mayor APP mediante dos enzimas, llamadas ß y gamma secretasas (ver Hardy, TINS 20, 154 (1997)). El Ejemplo 1 describe los resultados de experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención, en los cuales el péptido Aß42 se administró a ratones transgénicos heterocigotes que sobre-expresan la APP humana con una mutación en la posición 717. Estos ratones, conocidos como "ratones PDAPP" exhiben una patología similar a Alzheimer y se consideran como animales modelo para la enfermedad de Alzheimer (Games, et al . , Nature 373: 523-7, 1995) . Como se detalla en el Ejemplo, estos ratones exhiben neuropatología de placa Aß detectable en sus cerebros comenzando en aproximadamente 6 meses de edad, con progreso de deposición de placa a través del tiempo. En los experimentos aquí descritos, se administró Aß42 agregado (AN1792) a los ratones. La mayoría de los ratones tratados (7/9) no tuvo amiloide detectable en su cerebro a los 13 meses de edad, en contraste a los ratones de control (inyectados con solución salina o no-tratados) , todos los 5 cuales mostraron carga amiloide significativa en el cerebro a esta edad (Figura 2) . Estas diferencias fueron incluso más pronunciadas en el hipocampo (Figura 3) . Los ratones tratados exhibieron también títulos de anticuerpo en suero significativos contra Aß (todos mayores que 1:1000, 8/9 10 mayores que 1/10,000; Figura 1, Tabla 3A) . En general, los ratones tratados con solución salina exhibieron niveles de anticuerpos menores a 4-5 veces el antecedente contra Aß a una dilución de 1:100 en todas las veces que se probaron y por lo tanto no se consideró que tuvieran ninguna respuesta 15 significativa al control (Tabla 3B) . Estos estudios demostraron que la inyección con el péptido específico Aß formador de fibrillas proporciona protección contra la deposición de placas Aß amiloides. La Proteína Amiloide en Suero (SAP) , es una 20 glicoproteína de plasma circulante que se produce en el hígado y se une en una manera calcio-dependiente a todas las formas de fibrilla amiloide, incluyendo fibrillas de placas cerebrales amiloides en la enfermedad de Alzheimer. Como parte de los experimentos anteriores, un grupo de ratones 25 fueron inyectados con SAP; estos ratones desarrollaron ^^Mg^waiiÜi títulos significativos de suero al SAP (1:1000-1:30000), pero no desarrollaron títulos detectables en suero al péptido Aß y desarrollaron neuropatología de placa cerebral. (Figura 2) Experimentos adicionales, detallados en el Ejemplo II, demuestran dependencia a la dosis del efecto inmunogénico de las inyecciones Aß en ratones tratados de entre 5 semanas y aproximadamente 8 meses de edad. En estos ratones, los títulos promedio en suero de anticuerpos de anti-péptido Aß aumentaron con el número de inmunizaciones y con dosis aumentadas; sin embargo, después de cuatro inmunizaciones, los títulos de suero medidos cinco días después de la inmunización se desnivelaron sobre las dosis mayores (1-300 µg) a niveles de alrededor de 1:10000 (Figura 5). Los experimentos adicionales en apoyo de la presente invención se describen en el Ejemplo III, en el cual se trataron ratones modelo PDAPP con Aß42 comenzando en un punto de tiempo (aproximadamente 11 meses de edad) después de que las placas amiloides se encontraban ya presentes en sus cerebros. En estos estudios, los animales se inmunizaron con Aß42 o solución salina y se sacrificaron para la prueba de carga amiloide a la edad de 15 o 18 meses. Como se ilustró en la Figura 7, a los 18 meses de edad, los ratones tratados con Aß42 exhibieron una carga promedio de placa amiloide significativamente menor (carga de placa, 0.01%) que, ya sea los controles de 18 meses de edad tratados con PBS (carga de placa, 4.7%) o los animales de 12 meses no tratados (0.28%), en donde la carga de placa se mide mediante análisis de imagen, como se detalló en el Ejemplo XIII, parte 8. Estos experimentos demuestran la eficacia de los métodos de tratamiento de la presente invención para reducir la carga de placa existente y prevenir el progreso de la carga de placa en individuos enfermos . De acuerdo a este aspecto de la invención, los agentes terapéuticos se derivan de péptidos o proteínas fibrilares que comprenden las placas que son características de la enfermedad de interés. Alternativamente, tales agentes son suficientemente similares de manera antigénica a tales componentes para inducir una respuesta inmune que también reacciona transversalmente con el componente fibril. Las Tablas 1 y 2 proporcionan ejemplos de tales péptidos y proteínas fibrilares, cuyas composiciones y secuencias se conocen en la técnica y pueden determinarse fácilmente de acuerdo a métodos conocidos en la técnica. (Ver las referencias citadas más adelante y en la Sección B2 para las referencias que enseñan específicamente los métodos para la extracción y/o composiciones de varios componentes péptido fibrilares; se describen más adelante componentes fibrilares ejemplificativos adicionales) . De este modo, de acuerdo a la presente invención, cuando se hace un diagnóstico de una enfermedad amiloide, en Í..?.. base a determinaciones clínicas y/o de biopsia, el médico experto será capaz de determinar la composición fibrilar de los depósitos amiloides y proporcionar un agente que induce una respuesta inmune dirigida a los péptidos o proteínas fibrilares. A modo de ejemplo, como se describe arriba, el agente terapéutico utilizado para tratar la enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades amiloides caracterizadas por la deposición fibrilar de Aß puede ser cualquiera de las formas de origen natural del péptido Aß y en particular las formas humanas (i.e., Aß39, Aß40, Aß41, Aß42 o Aß43). Las secuencias de estos péptidos y su relación al precursor APP se conocen en la técnica y son bien conocidas en la técnica (e.g., Hardy, et al., TINS 20, 155-158 (1997)) . Por ejemplo, Aß42 tiene la secuencia: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH. (SEC ID NO:l) Aß41, Aß40 y Aß39 difieren de Aß42 por la omisión de Ala, Ala-He y Ala-Ile-Val respectivamente del extremo C-terminal del péptido. Aß43 difiere de Aß42 por la presencia de un residuo de treonina en la C-terminal. De acuerdo a una modalidad preferida de la invención, los agentes terapéuticos inducirán una respuesta inmune contra todo o una porción del componente fibrilar de la enfermedad de interés. Por ejemplo, una composición inmunogénica Aß preferida es un agente que induce un anticuerpo específico hacia el N- terminal libre de Aß . Tal composición tiene la ventaja de 5 que no reconocería a la proteína precursora, ß-APP, con lo cual le otorga menos probabilidad de producir auto- inmunidad. A modo de ejemplo adicional, se aprecia que los pacientes afectados con enfermedades caracterizadas por la deposición de fibrillas AA, por ejemplo, ciertos trastornos 10 inflamatorios crónicos, infecciones microbiales crónicas locales o sistémicas y neoplasmas malignos, como se describe arriba, pueden tratarse con el péptido AA, un fragmento conocido de 8 kilodaltones de proteína A Amiloide en Suero (ApoSSA) . De manera ejemplificativa, los trastornos 15 amiloides AA incluyen, pero no se limitan a enfermedades inflamatorias, tales como artritis reumatoide, artritis juvenil crónica, espondilitis anquilosante, psoriasis, artropatía psoriática, síndrome de Reiter, enfermedad de Still adulta, síndrome de Behcet, enfermedad de Crohn, 20 infecciones microbiales crónicas tales como lepra, tuberculosis, bronquiectasis, úlceras decúbito, pielonefritis crónica, osteomielitis y enfermedad de Whipple, así como neoplasmas malignos tales como linfoma de Hodgkin, carcinoma renal, carcinomas intestinales, pulmonares o del tracto 25 urogenital, carcinoma de célula basal y leucemia de célula - - ---~*'*tllÉál£? ß0tA?Ay*^y?.i?y?aá.. pilosa. El péptido AA se refiere a uno o más de un grupo heterogéneo de péptidos derivados de la N-terminal de amiloide A en suero de proteína precursora (ApoSSA) , que comienza en el residuo 1, 2 o 3 de la proteína precursora y termina en cualquier punto entre los residuos 58 y 84; comúnmente las fibrillas AA se componen de los residuos 1-76 de ApoSSA. Las estructuras y composiciones precisas pueden determinarse y sintetizarse los péptidos apropiados de acuerdo a métodos bien conocidos en la técnica (Liepnieks, J.J., et al . , Biochem. Biophys. Acta 1270: 81-86, 1995). A modo de ejemplo adicional, los fragmentos derivados de la región N-terminal que contienen todo o parte del dominio variable (Vi) de cadenas ligeras de inmunoglobulina (cadena cappa o lambda) comprenden generalmente depósitos amiloides en tejidos mesenquimales, ocasionando neuropatía periférica y autonómica, síndrome carpal de túnel, macroglosia, cardiomiopatía restrictiva, artropatía de articulaciones grandes, discracias inmunes, mielomas, así como discrasias ocultas. Las composiciones de la invención inducirán preferentemente una respuesta inmune contra una porción de la cadena ligera, de preferencia contra un "neoepítope" - un epítope que se forma como resultado de la fragmentación de la molécula de origen - para reducir posibles efectos auto- inmunes .

Varias enfermedades amiloides hereditarias son también susceptibles a los métodos de tratamiento de la presente invención. Tales enfermedades se describen en la Sección B2 anterior. Por ejemplo, diversas formas de polineuropatía amiloide familiar son el resultado de al menos cincuenta formas mutantes de transtiretina (TTR) , una proteína de 14 kilodatones producida por el hígado, cada una caracterizada por un solo cambio aminoácido. Mientras que muchas de estas formas de esta enfermedad se distinguen en base a sus patologías particulares y/u orígenes demográficos, se aprecia que las composiciones terapéuticas pueden componerse también de agentes que inducen una respuesta inmune contra más de una forma de TTR, tales como una mezcla de dos o más formas de ATTR, incluyendo TTR de tipo silvestre, para proporcionar una composición terapéutica generalmente útil. Las ApoAI que contienen depósitos amiloides se encuentran en personas que tienen mutaciones de punto en la molécula de apolipoproteína AI. Los pacientes con esta forma de enfermedad se presentan generalmente con neuropatía periférica o falla renal. De acuerdo a la presente invención, las composiciones terapéuticas se elaboran con una o más de las diversas formas de ApoAI descritas aquí o conocidas en la técnica. Ciertas formas familiares de la enfermedad de Alzheimer, así como del síndrome de Down, son el resultado de mutaciones en la proteína precursora beta amiloide, dando como resultado la deposición de placas que tienen fibrillas compuestas principalmente del péptido ß-amiloide (Aß) . El 5 uso del péptido Aß en las composiciones terapéuticas de la presente invención se describe arriba y aquí se ejemplifica. Otras formulaciones para tratar las formas hereditarias de amiloidosis, arriba tratadas, incluyen composiciones que producen respuestas inmunes contra los 10 fragmentos de gelsolina para el tratamiento de amiloidosis sistémica hereditaria, la proteína lisozima mutante (Alys) , para el tratamiento de una neuropatía hereditaria, la cadena mutante alfa de fibrinógeno (AfibA) para una forma no- neuropática de amiloidosis manifiesta como enfermedad renal, 15 la cistatina mutante C (Acys) para el tratamiento de una forma de angiopatía cerebral hereditaria reportada en Islandia. Además, ciertas formas hereditarias de enfermedad de prion (e.g., enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (CJD), síndrome de Gerstmann-Stráussler-Scheinker (GSS) e insomnio 20 familiar fatal (FFI) se caracterizan por una isoforma mutante de la proteína de prion, PrPSc. Esta proteína puede utilizarse en composiciones terapéuticas para el tratamiento y la prevención de la deposición de placas PrP, de acuerdo con la presente invención. 25 Como se trató anteriormente, la deposición ^^Bllri[a?>l. amiloide, ya sea sistémica o focal, se asocia también con el envejecimiento. Es un aspecto adicional de la presente invención que tal deposición puede prevenirse o tratarse administrando a individuos susceptibles composiciones que 5 consisten de una o más proteínas asociadas con tal envejecimiento. De este modo, las placas compuestas de ATTR derivadas a partir del tipo silvestre de TTR se encuentran frecuentemente en el tejido cardiaco de los ancianos. De manera similar, ciertos individuos ancianos pueden 10 desarrollar depósitos fibrilares focales asintomáticos de Aß en su cerebro; el tratamiento con péptido Aß, como aquí se detalla puede garantizarse en tales individuos. La microglobulina ß es un componente frecuente de amilácea corpórea de la próstata y es en consecuencia un agente 15 candidato adicional de acuerdo con la presente invención. A modo de ejemplo adicional, pero no como limitación, existe un número de formas adicionales, no- hereditarias de enfermedad amiloide que son candidatas para los métodos de tratamiento de la presente invención. Las 20 placas fibrilares de microglobulina ß2 se desarrollan comúnmente en pacientes que reciben hemodiálisis o diálisis peritoneal a largo plazo. Tales pacientes pueden tratarse mediante el tratamiento con composiciones terapéuticas dirigidas a la microglobulina ß2 o, más preferentemente, a 25 sus epítopes inmunogénicos, de acuerdo con la presente mvencion. Los tumores que secretan hormonas pueden contener también placas amiloides derivadas de hormonas, cuya composición es generalmente característica del órgano endocrino particular afectado. Así, tales fibrillas pueden producirse de hormonas polipéptidas tales como calcitonina (carcinoma medular de la tiroides) , polipéptido amiloide de isleta (que ocurre en la mayoría de los pacientes con diabetes Tipo II) y péptido atrial natriurético (amiloidosis atrial aislada) . Las composiciones dirigidas en depósitos amiloides que se forman en la intima aórtica en la arterosclerosis se contemplan también por la presente invención. Por ejemplo, Westermark, et al . , describen un fragmento de 69 aminoácidos N-terminal de la Apolipoproteína A que forma tales placas (Westermark, et al . , Am. J. Path. 147: 1186-92, 1995); las composiciones terapéuticas de la presente invención incluyen reactivos inmunológicos dirigidos a tal fragmento, así como el fragmento en sí. Lo tratado anteriormente se enfoca a componentes fibrilares amiloides que pueden utilizarse como agentes terapéuticos para tratar o prevenir diversas formas de enfermedad amiloide. El agente terapéutico puede ser también un fragmento activo o análogo de un péptido o proteína de fibrilla de origen natural o mutante que contiene un epítope que induce una respuesta inmune similar de protección o terapéutica al administrarse a un humano. Los fragmentos inmunogénicos tienen típicamente una secuencia de al menos 3, 5, 6, 10 o 20 aminoácidos contiguos a partir de un péptido natural. De manera ejemplar los fragmentos inmunogénicos del 5 péptido Aß incluyen Aßl-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3, 1-4, 1- 12, 13-28, 17-28, 1-28, 25-35, 35-40 y 35-42. Los fragmentos que carecen de al menos uno y a veces de al menos 5 o 10 aminoácidos C-terminal presentes en formas de origen natural del componente fibrilar se utilizan en algunos métodos. Por 10 ejemplo, un fragmento que carece de 5 aminoácidos del extremo C-terminal de Aß43 incluye los primeros 38 aminoácidos del extremo N-terminal de Aß . Los fragmentos de la mitad N- terminal de Aß se prefieren en algunos métodos. Los análogos incluyen alélicos, especies y variantes inducidas. Los 15 análogos típicamente difieren de los péptidos de origen natural en una o pocas posiciones, frecuentemente en virtud de substituciones conservativas. Los análogos típicamente exhiben al menos 80 o 90% de identidad de secuencia con los péptidos naturales. Algunos análogos incluyen también 20 aminoácidos no-naturales o modificaciones de aminoácidos N o C-terminales. Ejemplos de aminoácidos no-naturales son aminoácidos a, a disustituídos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico, 4-hidroxiprolina ?-carboxiglutamato, ?-N,N,N- trimetillisina, ?-N-acetillisina, O-fosfoserina, N- . 25 acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5- hidroxilisina, ?-N-metilarginina . Generalmente, las personas expertas en la técnica apreciarán que los fragmentos y análogos designados de acuerdo con este aspecto de la invención pueden seleccionarse para la reactividad cruzada con los componentes fibrilares de origen natural y/o para la eficacia profiláctica o terapéutica en modelos animales transgénicos como se describe más adelante. Tales fragmentos o análogos pueden utilizarse en las composiciones terapéuticas de la presente invención, si su inmunorreactividad y eficacia en el modelo animal es aproximadamente equivalente o mayor que los parámetros correspondientes medidos para los componentes fibrilares amiloides . Tales péptidos, proteínas o fragmentos, análogos y otros péptidos amiloidogénicos pueden sintetizarse mediante la síntesis de péptido de fase sólida o la expresión recombinante, de acuerdo a métodos estándares bien conocidos en la técnica o pueden obtenerse a partir de fuentes naturales. De manera ejemplificativa las composiciones fibrilares, métodos de extracción de fibrillas, secuencias de componentes de péptido o proteína fibrilares se proporcionan mediante muchas de las referencias citadas en conjunto con las descripciones de los componentes fibrilares específicos aquí proporcionados. Adicionalmente, otras composiciones, métodos de extracción y determinación de secuencias se conocen en la técnica disponible para las personas que deseen hacer uso de tales composiciones. Los sintetizadores automáticos de péptido pueden utilizarse para elaborar tales composiciones y se encuentran comercialmente disponibles de numerosos fabricantes, tales como Applied Biosystems (Perkin Elmer; Foster City, California) y los procedimientos para preparar péptidos sintéticos se conocen en la técnica. La expresión recombinante puede estar en una bacteria, tal como E. coli, levadura, células de insecto o células de mamífero; alternativamente, se pueden producir proteínas utilizando sistemas de translación libre celular in vi tro conocidos en la técnica. Los procedimientos para la expresión recombinante se describen en Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S. H.P. Press, NY 2a ed. , 1989) . Ciertos péptidos y proteínas se encuentran también disponibles comercialmente; por ejemplo, algunas formas del péptido Aß están disponibles de distribuidores tales como American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, California y California Peptide Research, Inc., Napa, California. Los agentes terapéuticos pueden componerse también de polipéptidos mayores que incluyen, por ejemplo, el fragmento activo de fibrilla de péptido o análogo, junto con otros aminoácidos. Por ejemplo, el péptido Aß puede estar presente como proteína APP intacta o un segmento de la misma, tal como el fragmento C-100 que comienza en la N-términal de Aß y continúa hacia el extremo de APP. Tales polipéptidos pueden seleccionarse para la eficacia profiláctica o terapéutica en modelos animales como se describe más adelante. El péptido Aß, análogo, fragmento activo u otro polipéptido puede administrarse en forma asociada (i.e., como un péptido amiloide) o en forma disociada. Los agentes terapéuticos pueden incluir también multímeros de agentes inmunogénicos monoméricos o conjugados o proteínas vehículo y/o, como se mencionó anteriormente, pueden agregarse a otros componentes fibrilares, a fin de proporcionar un rango más amplio de actividad de placa anti-amiloide . En una variación adicional, un péptido inmunogénico, tal como un fragmento de Aß, puede presentarse mediante un virus o una bacteria como parte de una composición inmunogénica. Un ácido nucleico que codifica al péptido inmunogénico se incorpora dentro de un genoma o episoma del virus o bacteria. Opcionalmente, el ácido nucleico se incorpora de tal manera que el péptido inmunogénico se expresa como una proteína secretada o como una proteína de fusión con una proteína de superficie externa de un virus o una proteína transmembrana de una bacteria de modo que se despliegue el péptido. Los virus o bacterias utilizados en tales métodos deben ser no-patogénicos o atenuados. Los virus adecuados incluyen adenovirus, HSV, virus Venezolano de encefalitis equina y otros virus alfa, virus de estomatitis vesicular y otros virus rhabdo, vaccinia y epitelioma contagioso. Las bacterias adecuadas incluyen Salmonela y Shigela. Es particularmente adecuada la fusión de un péptido inmunogénico a HbsAg de HBV. Los agentes terapéuticos incluyen también péptidos y otros compuestos que no necesariamente tienen una similitud de secuencia aminoácida significativa con Aß pero sin embargo, sirven como miméticos de Aß e inducen una respuesta inmune similar. Por ejemplo, cualquier péptido y proteína que forma láminas ß-plegadas puede seleccionarse por su adecuación. Pueden utilizarse también los anticuerpos anti-idiotípicos contra anticuerpos monoclonales para Aß u otros péptidos amiloidogénicos . Tales anticuerpos anti-Id imitan al antígeno y generan una respuesta inmune a él ( ver Essential Ipwciunology (Roit ed. , Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6a ed.), p. 181) . Otros agentes que no son péptidos Aß deben inducir una respuesta inmunogénica contra uno o más de los segmentos preferidos de Aß arriba listados (e.g., 1-10, 1-7, 1-3 y 3-7) . Preferentemente, tales agentes inducen una respuesta inmunogénica que se dirige específicamente a uno de estos segmentos sin dirigirse a otros segmentos de Aß . Los archivos aleatorios de péptidos u otros compuestos pueden seleccionarse también por su adecuación. Pueden producirse archivos combinatoriales para muchos tipos de compuestos que pueden sintetizarse paso-por-paso. Tales compuestos incluyen polipéptidos, miméticos de giro beta, polisacáridos, fosfolípidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, benzodiazepinas, glicinas oligoméricas N-sustituídas y oligocarbamatos . Pueden construirse grandes archivos combinatoriales de los compuestos mediante el método de archivos sintéticos codificados (ESL) descrito en Affymax, WO 95/12608, Affymax WO 93/06121, Universidad de Columbia, WO 94/08051, Pharmacopeia, WO 95/35503 y Scripps, WO 95/30642 (cada una de las cuales se incorpora para referencia para todo propósito) . Los archivos de péptido pueden generarse también mediante métodos de despliegue de fago. Ver, e.g., Devlin, WO 91/18980. Los archivos combinatoriales y otros compuestos se seleccionan inicialmente por su adecuación determinando su capacidad para unirse a anticuerpos o linfocitos (B o T) conocidos por ser específicos para Aß u otros péptidos amiloidogénicos tales como ATTR. Por ejemplo, las selecciones iniciales pueden llevarse a cabo con cualquier suero policlonal o anticuerpo monoclonal para Aß o a cualquier otro péptido amiloidogénico de interés. Los compuestos identificados mediante tales selecciones se analizan adicionalmente entonces por su capacidad para inducir anticuerpos o linfocitos reactivos para Aß u otro péptido amiloidogénico. Por ejemplo, las diluciones i^.ttA.^ múltiples de suero pueden probarse sobre placas de micro valoración que se han recubierto con péptido fibrilar y puede llevarse a cabo un ELISA estándar para el análisis de anticuerpos reactivos para Aß . Entonces, pueden analizarse los compuestos para su eficacia profiláctica y terapéutica en animales transgénicos predispuestos a una enfermedad amiloidogénica, como se describe en los Ejemplos. Tales animales incluyen, por ejemplo, ratones que cargados con una mutación 717 de APP descritos por Games et al ., supra y ratones cargados con una mutación 670/671 Sueca de APP tal como los descritos por McConlogue et al., US 5,612,486 y Hsiao et al., Science 274, 99 (1996); Staufenbiel et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 94, 13287-13292 (1997); Borchelt et al., Neuron 19, 939-945 (1997)). El mismo enfoque de selección puede utilizarse sobre otros agentes potenciales tales como los fragmentos de Aß, análogos de Aß y péptidos mayores incluyendo Aß, arriba descritos, b. Otros Componentes de Placa Se aprecia que las respuestas inmunológicas dirigidas en otros componentes de placa amiloide pueden ser también efectivas para prevenir, retardar o reducir la deposición de placa en enfermedades amiloides. Tales componentes pueden ser componentes menores de fibrillas o asociados con fibrillas o formación de fibrilla en las placas, con la advertencia de que los componentes que se encuentran ubicuos en todo el cuerpo o son relativamente no-específicos al depósito amiloide, son generalmente menos adecuados para su uso como objetivos terapéuticos. Por lo tanto, es un descubrimiento adicional de la presente invención que los agentes que inducen una respuesta inmune a componentes de placa específicos son útiles en el tratamiento o prevención de la progresión de enfermedades amiloides. Esta sección proporciona antecedentes de varias moléculas amiloides ejemplificativas asociadas a placas. La inducción de una respuesta inmune contra cualquiera de estas moléculas, sola o en combinación con composiciones terapéuticas inmunogénicas contra los componentes fibrilares arriba descritos o contra cualquiera de los otros componentes de formación no-fibrilar descritos más adelante, proporciona un régimen adicional de tratamiento anti -amiloide de acuerdo con la presente invención. Formando parte también de la presente invención se encuentran regímenes de inmunización pasiva basados en tales componentes de placa, como se describe en la presente. A modo de ejemplo, la sinucleína es una proteína que es estructuralmente similar a las apolipoproteínas pero se encuentra en el citosol neuronal, particularmente próximo a las terminales presinápticas . Existen al menos tres formas de la proteína, llamadas sinucleína a, ß y ?. Recientemente, se ha mostrado que las sinucleínas a y ß están implicadas en la nucleación de depósitos amiloides en ciertas enfermedades amiloides, particularmente en la enfermedad de Alzheimer. (Clayton, D.F., et al . , TINS 21 (6): 249-255, 1998). Más específicamente, se ha aislado un fragmento del dominio NAC de sinucleína a y ß (residuos 61-95) a partir de placas amiloides en pacientes de Alzheimer; de hecho estos fragmentos comprenden aproximadamente 10% de la placa que permanece insoluble después de la solubilización con sulfato de sodio dodecilo (SDS) . (George, J.M. , et al . , Neurosci. News 1: 12-17, 1995) . Además, se ha reportado que ambos, la sinucleína a de longitud total y su fragmento NAC, aceleran la agregación del péptido ß-amiloide dentro del amiloide insoluble in vi tro. (Clayton, supra) . Los componentes adicionales asociados con placas amiloides incluyen componentes no-péptidos. Por ejemplo, el perlecano y los glicosaminoglicanos derivados de perlecano son grandes proteoglicanos de sulfato heparina que están presentes en las placas amiloide que contienen Aß de la enfermedad de Alzheimer y otras CNS y amiloidosis sistémicas, incluyendo las placas amilin asociadas con diabetes. Se ha mostrado que estos compuestos aumentan la formación de fibrilla Aß . Ambas, la proteína de núcleo y las cadenas de glicosaminoglicano de perlecano han mostrado participar en la unión a Aß . Los glicosaminoglicanos adicionales, específicamente, sulfato dermatano, condroitin-4-sulfato y polisulfato de pentosana, se encuentran comúnmente en las placas amiloides de varios tipos y también han mostrado aumentar la formación fibrilar. El sulfato dextrano también tiene esta propiedad. Este aumento se reduce significativamente cuando se des-sulfan las moléculas. Los terapéuticos inmunogénicos dirigidos contra las formas sulfatadas de glicosaminoglicanos, incluyendo glicosaminoglicanos específicos en sí, forman una modalidad adicional de la presente invención, ya sea como tratamiento primario o secundario. La producción de tales moléculas, así como las composiciones terapéuticas apropiadas que contienen tales moléculas, se encuentra dentro de la capacidad del profesional ordinario en la técnica. 2. Agentes que Inducen Respuesta Inmune Pasiva Los agentes terapéuticos de la invención incluyen también reactivos inmunes, tales como los anticuerpos, que se unen específicamente a péptidos fibrilares u otros componentes de placas amiloides. Tales anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y tienen especificidades de unión que son consonantes con el tipo de enfermedad amiloide objetivo. Las composiciones terapéuticas y los regímenes de tratamiento pueden incluir anticuerpos dirigidos a un solo dominio de unión o epítope sobre un componente particular fibrilar o no-fibrilar de una placa o pueden incluir anticuerpos dirigidos a dos o más epítopes sobre el mismo componente o anticuerpos dirigidos a epítopes sobre componentes múltiples de la placa. Por ejemplo, en experimentos llevados a cabo en 5 apoyo de la presente invención, se aplicaron inyecciones intraperitoneales (i.p.) a ratones PDAPP de 8 V2 a 10 V meses de edad de anticuerpos policlonales anti-Aß42 o monoclonales anti-Aß preparados contra epítopes específicos del péptido Aß o solución salina, como se detalla en la presente en el 10 Ejemplo XI. En estos experimentos, las concentraciones de anticuerpo circulantes se monitorearon y se aplicaron las inyecciones de refuerzo necesarias para mantener una concentración de anticuerpo circulante mayor que 1:1000 con respecto al antígeno específico para el cual se elaboró el 15 anticuerpo. Se observaron reducciones en los niveles totales de Aß, comparadas al control, en las regiones cerebrales de corteza, hipocampo y cerebelo de los ratones tratados con anticuerpos; se exhibieron reducciones mayores en los ratones tratados con anticuerpos policlonales en estos estudios. 20 En experimentos adicionales llevados a cabo en apoyo de la invención, se utilizó un ensayo de predicción ex vivo (Ejemplo XIV) para analizar la purificación de un anticuerpo contra un fragmento de sinucleína referido como NAC. La sinucleína ha mostrado ser una proteína amiloide 25 asociada a la placa amiloide. Un anticuerpo para NAC se puso en contacto con una muestra de tejido cerebral que contiene placas amiloides y células microgliales . Se utilizó suero de conejo como control. El monitoreo subsecuente mostró una marcada reducción en el número y tamaño de las placas indicativas de la actividad de depuración del anticuerpo. A partir de estos datos, es aparente que la carga de placa amiloide asociada con la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades amiloides puede disminuir grandemente mediante la administración de reactivos inmunes dirigidos contra epítopes del péptido Aß o contra el fragmento NAC de sinucleína, que son efectivos para reducir la carga de placa amiloide. Se entiende además que puede utilizarse una gran variedad de anticuerpos en tales composiciones. Los anticuerpos que se unen específicamente a la forma agregada de Aß sin unirse a la forma disociada son adecuados para su uso en la invención, como lo son los anticuerpos que se unen específicamente a la forma disociada sin unirse a la forma agregada. Otros anticuerpos adecuados se unen a ambas formas agregada y disociada. Algunos de tales anticuerpos se unen a la forma corta de origen natural de Aß (i.e., Aß39, 40 o 41) sin unirse a una forma larga de origen natural de Aß (i.e., Aß42 y Aß43) . Algunos anticuerpos se unen a una forma larga sin unirse a una forma corta. Algunos anticuerpos se unen a Aß sin unirse a la proteína precursora amiloide de longitud total. Algunos anticuerpos se unen a Aß sin una afinidad de l*J*?.?Jt***i-l* * unión mayor o igual a aproximadamente 106, 107, 108, 109 o 1010 NT1. El suero policlonal típicamente contiene poblaciones mezcladas de anticuerpos que se unen a varios epítopes a lo largo de la longitud de Aß . Los anticuerpos monoclonales se unen a un epítope específico dentro de Aß que puede ser un epítope conformacional o no-conformacional . Algunos anticuerpos monoclonales se unen a un epítope dentro de los residuos 1-28 de Aß (con el primer residuo N-terminal de Aß natural designado como 1) . Otros anticuerpos monoclonales se unen a un epítope con los residuos 1-10 de Aß . Existen también anticuerpos monoclonales que se unen a un epítope con los residuos 1-16 de Aß . Otros anticuerpos monoclonales se unen a un epítope con los residuos 1-25 de Aß . Algunos anticuerpos monoclonales se unen a un epítope dentro de los aminoácidos 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 25-30, 10- 20, 20, 30 o 10-25 de Aß . La eficacia profiláctica y terapéutica de los anticuerpos pueden probarse utilizando los procedimientos para modelos animales transgénicos descritos en los Ejemplos. Más generalmente, a partir de las enseñanzas aquí proporcionadas, los profesionales pueden diseñar, producir y probar anticuerpos dirigidos a proteínas o péptidos fibrilares característicos de otras enfermedades amiloides, tales como las enfermedades descritas en la presente en la Sección 2, utilizando las composiciones descritas en la presente , así como los anticuerpos contra otros componentes amiloides . a. Características Generales de las Inmunoglobulinas Se sabe que la unidad estructural básica del anticuerpo comprende un tetrámero de sub-unidades. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticas de cadenas polipéptidos, cada par tiene una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa) . La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La porción carboxilo-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras se clasifican ya sea como cappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o epsilon y definen el isótopo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada incluyendo también una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. (Ver en general, Fundamental Immunology (Paul, W.,ed., 2a ed.

. ...~¡S.r ,..-..y.^,.^.. „ .. -y <r- - - f ^ÉMf^Jl«ifc Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7 (incorporada como referencia en su totalidad para todo propósito) . Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. De este modo, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son el mismo. Las cadenas exhiben todas la misma estructura general o conservan relativamente las regiones de estructura (FR) unidas por tres regiones hipervariables, llamadas también regiones complementariamente determinantes o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par se alinean mediante regiones de estructura, permitiendo la unión a un epítope específico. Desde la N-terminal hasta la C-terminal, ambas cadenas ligera y pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 y FR4. La asignación de los aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991) o Chotia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chotia et al., Nature 342:878-883 (1989). b. Producción de Anticuerpos No-humanos La producción de anticuerpos monoclonales no-humanos, e.g., murina, cobayos, conejo o rata, puede lograrse mediante, por ejemplo, la inmunización del animal con un componente de placa, tal como Aß u otros componentes A Aj-ff-f-5 ... ^y?-y.ytryt ...... . ,.„^, .... ^ ^ „^^,^ ^ ...Jfc ... .. „»,..,..., _ y^*. ? jj. | fibrilares. También puede utilizarse, un péptido más largo que comprende Aß o un fragmento inmunogénico de Aß o anticuerpos anti-idiotípicos para un anticuerpo de Aß . Ver, e.g., Harlow & Lañe, Anticuerpos, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (incorporada como referencia para todo propósito) . Tal antígeno puede obtenerse a partir de una fuente natural, mediante síntesis de péptido o mediante expresión recombinante. Opcionalmente, el antígeno puede administrarse fusionado o de otra manera haciendo un compuesto con una proteína portadora, como se describe más adelante. Opcionalmente, el antígeno puede administrarse con un adyuvante. Pueden utilizarse varios tipos de adyuvante como se describe más adelante. Se prefiere el adyuvante de Freund completo seguido por un adyuvante incompleto para la inmunización de animales de laboratorio. Se utilizan típicamente conejos o cobayos para fabricar anticuerpos policlonales. Los ratones se utilizan típicamente para fabricar anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se seleccionan para la unión específica al antígeno. Opcionalmente, los anticuerpos se seleccionan adicionalmente para unirse a una región específica del antígeno. Por ejemplo, en el caso del péptido Aß como antígeno, puede lograrse la selección determinando la unión de un anticuerpo a una colección de mutantes de supresión de un péptido Aß y determinando cual mutante de supresión se une al anticuerpo.

La unión puede valorarse, por ejemplo, mediante Western blot o ELISA. El fragmento más pequeño que muestra la unión al anticuerpo define al epítope del anticuerpo. Alternativamente, la especificidad del epítope puede determinarse mediante un ensayo de competencia en el cual una prueba y un anticuerpo de referencia compiten para unirse al componente. Si compite la prueba con los anticuerpos de referencia, entonces se unen al mismo epítope o epítopes suficientemente próximos de modo que la unión de un anticuerpo interfiere con la unión del otro. c. Anticuerpos Quiméricos y Humanizados Los anticuerpos quiméricos y humanizados tienen la misma o similar especificidad de unión y afinidad que un anticuerpo de ratón u otro no-humano que proporciona el material de inicio para la construcción de un anticuerpo quimérico o humanizado. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada se han construido típicamente mediante ingeniería genética, a partir de segmentos del gen de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden estar enlazados a segmentos constantes (C) humanos, tales como IgGl e IgG4. Un típico anticuerpo quimérico es entonces una proteína híbrida que consiste de V o dominio de unión de anticuerpo de un anticuerpo de ratón y C o dominio efector de un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados tienen residuos de estructura de región variable sustancialmente de un anticuerpo humano (llamado anticuerpo aceptor) y complementariamente regiones de determinación sustancialmente de un anticuerpo de ratón, (referido como la inmunoglobulina del donador) . Ver, Queen et al., Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 86:10029-10033 (1989) y WO 90/07861, US 5,693,762, US 5,693,761, US 5,585,0889, US 5,530,101 y Winter, US 5,225,539 (incorporadas como referencia en su totalidad para todo propósito). La(s) región(es) constante (s) , si se presentan, son también sustancial o completamente de una inmunoglobulina humana. Los dominios variables humanos se eligen comúnmente a partir de anticuerpos humanos cuyas secuencias de estructura exhiben un alto grado de identidad de secuencia con los dominios de región variable murina de los cuales se derivaron los CDRs. Los residuos de estructura de región variable de cadena ligera y pesada pueden derivarse de las mismas o diferentes secuencias de anticuerpo humanas. Las secuencias de anticuerpo humanas pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos de origen natural o pueden ser secuencias de consenso de varios anticuerpos humanos. Ver Cárter et al., WO 92/22653. Ciertos aminoácidos de los residuos de estructura humana de región variable se seleccionan para sustitución en base a su posible influencia sobre la conformación CDR y/o unión al antígeno. La investigación de tales posibles influencias es mediante el modelado y el examen de las características de los aminoácidos en ubicaciones particulares o la observación empírica de los efectos de sustitución o mutagénesis de aminoácidos particulares . Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre un residuo de estructura murina de región variable y un residuo de estructura humana de región variable, el aminoácido de estructura humana comúnmente deberá sustituirse por el aminoácido de estructura equivalente a partir del anticuerpo de ratón cuando se espera razonablemente que el aminoácido: (1) se fije al antígeno directamente de manera no- covalente, (2) esté adyacente a una región CDR, (3) interactúe de otra manera con una región CDR (e.g., dentro de aproximadamente 6 A de una región CDR) , o (4) participe en la interfase VL-VH. Otros candidatos para la sustitución son los aminoácidos aceptores de estructura humana que son inusuales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos pueden sustituirse con aminoácidos de la posición equivalente del anticuerpo de ratón donador o de las posiciones equivalentes de inmunoglobulinas humanas más típicas. Otros candidatos para la sustitución son los aminoácidos aceptores de estructura humana que son inusuales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Las estructuras de región variable de inmunoglobulinas 5 humanizadas muestran comúnmente al menos un 85% de identidad de secuencia a una secuencia de estructura humana de región variable o a un consenso de tales secuencias. d. Anticuerpos Humanos Los anticuerpos humanos contra Aß se proporcionan 10 mediante una variedad de técnicas descritas más adelante. Algunos anticuerpos humanos se seleccionan mediante experimentos competitivos de unión o de otra manera, por tener la misma especificidad de epítope que un anticuerpo particular de ratón, tal como uno de los monoclonales de 15 ratón descritos en el Ejemplo XI. Los anticuerpos humanos pueden también seleccionarse para una especificidad particular de epítope utilizando solo un fragmento de Aß como antígeno, y/o seleccionando anticuerpos contra una colección de mutantes de supresión de Aß . 20 (1) Metodología de Trioma El enfoque básico y un socio ejemplar de fusión celular, SPAZ-4, para su uso en este enfoque se han descrito por Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, Patente de los E.U. No. 4,634,664; y Engelman et al., Patente 25 de los E.U. 4,634,666 (cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad para todo propósito) . Las líneas celulares que producen anticuerpos mediante este método se llaman triomas, debido a que descienden de tres células, dos humanas y una de ratón. Inicialmente, se fusiona una línea de mieloma de ratón con un linfocito B humano para obtener una célula híbrida xenogeneica que no produce anticuerpos, tal como la línea celular SPAZ-4 descrita por Oestberg, supra . La célula xenogeneica se fusiona entonces con un linfocito B humano inmunizado para obtener una línea celular trioma que produce anticuerpos. Se ha encontrado que los triomas producen anticuerpos más establemente que los hibridomas ordinarios elaborados a partir de células humanas. Los linfocitos B inmunizados se obtienen a partir de la sangre, bazo, nodulos linfáticos o médula ósea de un donador humano. Si se desean anticuerpos contra un antígeno o epítope específico, es preferible utilizar el antígeno o epítope del mismo para la inmunización. La inmunización puede ser ya sea in vivo o in vitro. Para la inmunización in vivo, se aislan típicamente células B de un humano inmunizado con Aß, un fragmento del mismo, un polipéptido mayor que contiene Aß o su fragmento o un anticuerpo anti-idiotípico a un anticuerpo para Aß . En algunos métodos, las células B se aislan del mismo paciente a quien finalmente va a administrar la terapia de anticuerpos. Para la inmunización in vitro, se |ují9£i ?j§Í9sE^&=j exponen típicamente linfocitos B al antígeno durante un período de 7-14 días en un medio tal como RPMI-1640 (ver Engleman, supra) suplementado con 10% de plasma humano. Los linfocitos B inmunizados se fusionan a una célula híbrida xenogeneica tal como SPAZ-4 mediante métodos bien conocidos. Por ejemplo, las células se tratan con 40-50% de polietilenglicol de MW 1000-4000, a aproximadamente 37 grados C, durante aproximadamente 5-10 min. Las células se separan de la mezcla de fusión y se propagan en un medio selectivo para los híbridos deseados (e.g., HAT o AH) . Los clones que secretan anticuerpos que tienen la especificidad de unión requerida se identifican mediante la valoración del medio de cultivo del trioma para la capacidad para unirse a un Aß o a su fragmento. Los triomas que producen anticuerpos humanos que tienen la especificidad deseada se subclonan mediante la técnica limitante de dilución y se cultivan in vitro en un medio de cultivo. Las líneas celulares trioma obtenidas se prueban entonces para su capacidad de unirse a Aß o a un fragmento del mismo. Aunque los triomas son genéticamente estables no producen anticuerpos en niveles muy altos. Los niveles de expresión pueden incrementarse clonando genes de anticuerpo a partir del trioma en uno o más vectores de expresión y transformar el vector en líneas celulares de mamífero, bacteriales o de levadura estándar, de acuerdo a métodos bien conocidos en la técnica. (2) Mamíferos Transgénicos No-Humanos Los anticuerpos humanos contra Aß pueden producirse también a partir de mamíferos transgénicos no-humanos que tienen transgenes que codifican al menos a un segmento del sitio de inmunoglobulina humana. Comúnmente, el sitio endógeno de inmunoglobulina de tales mamíferos transgénicos se encuentra funcionalmente desactivado. Preferentemente, el segmento del sitio de inmunoglobulina humana incluye secuencias no-ordenadas de componentes de cadena pesada y ligera. La desactivación de genes endógenos de inmunoglobulina y la introducción de genes exógenos de inmunoglobulina pueden lograrse mediante recombinación homologa dirigida o mediante la introducción de cromosomas YAC. Los mamíferos transgénicos resultantes de este proceso son capaces de reordenar funcionalmente las secuencias de componente de inmunoglobulina y de expresar un repertorio de anticuerpos de varios isótopos codificados por genes de inmunoglobulina humana, sin expresar genes endógenos de inmunoglobulina. La producción y propiedades de mamíferos que tienen estas propiedades se describen en detalle por, e.g., Lonberg et al., W093/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati , WO 91/10741 (1991) (cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad para todo propósito) . Los ratones transgénicos son particularmente adecuados a este respecto. Los anticuerpos anti-Aß se obtienen mediante la inmunización de un mamífero transgénico no-humano, tal como se describe por Lonberg o Kucherlapati, supra, con Aß o un fragmento del mismo. Los anticuerpos monoclonales se preparan mediante, e.g., la fusión de células B de tales mamíferos para líneas celulares de mieloma adecuadas utilizando la tecnología convencional Kohler-Milstein. Los anticuerpos policlonales humanos pueden proporcionarse también en forma de suero de humanos inmunizados con un agente inmunogénico. Opcionalmente, tales anticuerpos policlonales pueden concentrarse mediante purificación de afinidad utilizando Aß u otro péptido amiloide de antígeno como reactivo de afinidad. (3) Métodos de Imagen de Fago Un enfoque adicional para obtener anticuerpos humanos anti-Aß es clasificar un archivo ADN a partir de células B humanas de acuerdo al protocolo general diseñado por Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989). Por ejemplo, como se describe para la metodología del trioma, tales células B pueden obtenerse a partir de humanos inmunizados con Aß, fragmentos, polipéptidos mayores que contienen Aß o fragmentos o anticuerpos anti-idiotípicos . Opcionalmente, tales células B se obtienen de un paciente que finalmente va a recibir el tratamiento de anticuerpos. Se seleccionan los anticuerpos que se unen a un epítope del componente amiloide de interés, tal como Aß o un fragmento del mismo. Las secuencias que codifican tales anticuerpos (o fragmentos de unión) se clonan entonces y se amplifican. El protocolo descrito por Huse se hace más eficiente en combinación con la tecnología de imagen fago. Ver, e.g., Dower et al., WO 91/17271 y McCafferty et al., WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 5,733,743 y US 5,565,332 (cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad para todo propósito) . En estos métodos, se producen las archivos de fago en las cuales los miembros despliegan anticuerpos diferentes sobre sus superficies. Los anticuerpos se despliegan comúnmente como fragmentos Fv o Fab. Los anticuerpos que despliegan fago con una especificidad deseada se seleccionan mediante enriquecimiento de afinidad para un péptido Aß o fragmento del mismo. En una variación del método de despliegue de fago, pueden producirse los anticuerpos humanos que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo murina seleccionado. Ver Winter, WO 92/20791. En este método, se utiliza la región variable ya sea de cadena pesada o ligera del anticuerpo murino seleccionado como material de inicio. Si, por ejemplo, se selecciona una región variable de cadena ligera como material de inicio, se construye un archivo fago en la cual los miembros despliegan la misma región variable de cadena ligera (i.e., el material de inicio de murino) y una región variable de cadena pesada diferente. Las regiones variables de cadena pesada se obtienen de un archivo de regiones variables humanas de cadena pesada reacomodadas . Se selecciona un fago que muestra una fuerte unión específica para el componente de interés (e.g., al menos 108 y de preferencia al menos 109 M"1) . La región variable humana de cadena pesada de este fago sirve entonces como material de inicio para estructurar un archivo fago adicional . En este archivo, cada fago despliega la misma región variable de cadena pesada (i.e., la región identificada a partir del primer archivo desplegado) y una región variable de cadena ligera diferente. Las regiones variables de cadena ligera se obtienen a partir de un archivo de regiones variables humanas de cadena ligera reordenadas. De nuevo, se selecciona el fago que muestran una fuerte unión específica para el componente péptido amiloide. Este fago despliega las regiones variables de anticuerpos de péptido anti -amiloide completamente humanos. Estos anticuerpos comúnmente tienen la misma o similar especificidad de epítope que el material de inicio murino. e. Selección de Región Constante Las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos pueden enlazarse a al menos una porción de una región constante humana. La elección de la región constante depende, en parte, de si se desea un complemento anticuerpo-dependiente y/o toxicidad celular media. Por ejemplo, los isótopos IgGl e IgG3 tienen actividad complementaria y los isótopos IgG2 e IgG4 no. La elección del isótopo puede afectar también el paso del anticuerpo al cerebro. Las regiones constantes de cadena ligera pueden ser lambda o cappa. Los anticuerpos pueden expresarse como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab' F(ab')2 y Fv o como anticuerpos de cadena única en los cuales los dominios variables de cadena pesada y ligera se enlazan a través de un espaciador. f . Expresión de Anticuerpos recombinantes Los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos se producen típicamente mediante expresión recombinante. Las construcciones polinucleótidas recombinantes incluyen típicamente una secuencia de control de expresión operablemente enlazada a las secuencias de codificación de cadenas de anticuerpos, que incluyen regiones promotoras naturalmente asociadas o heterólogas. Preferentemente, las secuencias de control de expresión son sistemas promotores f" -ft-^j"-***-tj— -eucarióticos en vectores capaces de transformar o transfectar células eucarióticas huésped. Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene bajo condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de las secuencias nucleótidas y la recolección y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada. Estos vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos del huésped ya sea como episomas o como parte integral del ADN cromosomal del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección, e.g., de resistencia a la ampicilina o de resistencia a la higromicina, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias ADN deseadas . E. coli es un huésped procariótico particularmente útil para clonar las secuencias ADN de la presente invención. Los microbios, tales como la levadura son también útiles para la expresión. Saccharomyces es un huésped de levadura preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresión, un origen de replicación, secuencias de terminación y lo similar como se desee. Los promotores típicos incluyen la 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicolíticas . Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores a partir de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Las células de mamífero son un huésped preferido para expresar segmentos nucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas. Ver Winnacker, 5 From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987) . Se han desarrollado en la técnica varias líneas celulares de huésped adecuadas capaces de secretar proteínas heterólogas intactas e incluyen líneas celulares CHO, varias líneas celulares COS, células HeLa, células L y líneas celulares de mieloma. Los 10 vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un amplificador (Queen et al., Inmuno 1 . Rev. 89: 49 (1986)) y los sitios de procesamiento de información necesarios, tales como los sitios de unión de 15 ribosoma, sitios de unión RNA, sitios de poliadenilación y secuencias transcripcionales de terminación. Las secuencias de control de expresión preferidas son promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, papillomavirus bovino y lo similar. Ver Co et al., J. 20 Immunol . 148: 1149 (1992). Alternativamente, las secuencias que codifican anticuerpos pueden incorporarse en transgenes para su introducción dentro del genoma de un animal transgénico y la expresión subsecuente en la leche del animal transgénico 25 (e.g., de acuerdo a los métodos descritos en la US 5,741,957, US 5,304,489, US 5,849,992, todas incorporadas aquí como referencia en su totalidad) . Los transgenes adecuados incluyen secuencias de codificación para cadenas ligeras y/o pesadas en unión operable con un promotor y un mejorador a 5 partir de un gen específico de glándula mamaria, tal como caseína o lactoglobulina beta. Los vectores que contienen los segmentos ADN de interés pueden transferirse dentro de la célula huésped mediante métodos bien conocidos, dependiendo del tipo del 10 huésped celular. Por ejemplo, la transfección de cloruro de calcio se utiliza comúnmente para las células procarióticas, mientras que el tratamiento de fosfato de calcio, electroporación, lipofección, biolística o transfección de base viral, pueden utilizarse para otros huéspedes celulares. 15 Otros métodos utilizados para transformar células de mamífero incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplasto, liposomas, electroporación y microinyección (ver en general, Sambrook et al . , supra) . Para la producción de animales transgénicos, los transgenes pueden microinyectarse en ocitos 20 fertilizados o pueden incorporarse en el genoma de células embriónicas de origen y transferir el núcleo de tales células dentro de oocitos enucleados. Una vez expresados, los anticuerpos pueden purificarse de acuerdo a procedimientos estándar de la 25 técnica, incluyendo purificación de HPLC, cromatografía de -8^¡**m* ?i iiitm^L?ii, ?r?y. í~?-i?ik¿. columna, electroforesis de gel y lo similar (ver en general, Scopes, Protein Purifícation (Springer-Verlag, NY, 1982) . 4. Otros Agentes Terapéuticos Los agentes terapéuticos para uso en los métodos 5 presentes incluyen también células T que se unen a un componente de placa, tal como el péptido Aß . Por ejemplo, las células T pueden activarse contra el péptido Aß expresando un gen MHC humano clase I y un gen humano de B-2- microglobulina a partir de una línea celular de insecto, con 10 lo cual se forma un complejo vacío sobre la superficie de las células y puede unirse al péptido Aß . Las células T contactadas con la línea celular se vuelven específicamente activadas contra el péptido. Ver Peterson et al., US 5,314,813. Las líneas celulares de insecto que expresan al 15 antígeno MHC clase II pueden utilizarse de manera similar para activar las células T CD4. 5. Proteínas Portadoras Algunos agentes para inducir una respuesta inmune contienen el epítope apropiado para inducir una respuesta 20 inmune contra depósitos amiloides pero son demasiado pequeños para ser inmunogénicos. En esta situación, un antígeno de péptido puede enlazarse a un portador adecuado para ayudar a emitir una respuesta inmune. Los portadores adecuados incluyen albúminas de suero, hemocianina de lapa de 25 cerradura, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina, toxoide de tétanos o un toxoide a partir de otra bacteria patogénica, tal como la difteria, E. coli , cólera o H. Pylori o un derivado atenuado de toxina. Otros portadores incluyen epítopes de célula T que se unen a alelos múltiples MHC, e.g., al menos al 75% de todos los alelos MHC humanos.

Tales portadores son a veces conocidos en la técnica como "epítopes universales de célula T" . Ejemplos de epítopes universales de célula T incluyen: Hemaglutinina de Influenza: HA307-3i9 PKYVKQNTLKLAT (SEC ID NO: 1) PADRE (residuos comunes en negrillas) AKXVAAWTLKAAA (SEC ID NO: 2) Malaria CS : Epítope T3 EKKIAKMEKASSVFNV (SEC ID NO: 3) Antígeno de superficie de hepatitis B: HbsAg?9_28 FFLLTRILTI (SEC ID NO: 4) Proteína de choque térmico 65 : hsp65?53-?7? DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEC ID NO: 5) Bacilo Calmette-Guerin QVHFQPLPPAWKL (SEC ID NO: 6) Toxoide de tétanos: TT830-844 QYIKANSKFIGITEL (SEC ID NO: 7) Toxoide de tétanos: TT947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEC ID NO: 8) HIV gpl20 TI: KQIINMWQEVGKAMYA. (SEC ID NO: 9) Otros portadores para estimular o mejorar una respuesta inmune incluyen citocinas tales como los péptidos IL-1, IL-1 a y ß, IL-2, ?lNF, IL-10, GM-CSF y quimiocinas, tAAl tales como MIP1 y ß y RANTES . Los agentes inmunogénicos pueden también enlazarse a péptidos que mejoran el transporte a través de los tejidos, como se describe en O'Mahony, WO 97/17613 y WO 97/17614. Los agentes inmunogénicos pueden enlazarse a los portadores mediante reticulación química. Las técnicas para enlazar un antígeno a un portador incluyen la formación de enlaces de disulfuro utilizando N-succinimidil-3- (2-piridil-tio) propionato (SPDP) y succinimidil4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) (si el péptido carece de un grupo sulfidrilo, éste puede proporcionarse mediante la adición de un residuo de cisteína) . Estos reactivos crean un enlace de disulfuro entre ellos mismos y los residuos péptidos de cisteína sobre una proteína y un enlace amida a través del e -amino sobre una lisina, u otro grupo amino libre en otros aminoácidos. Una variedad de tales agentes que forman disulfuro/amida se describen en Immun . Rev. 62, 185 (1982). Otros agentes de acoplamiento bifuncional forman un tioéter en vez de un enlace de disulfuro. Muchos de estos agentes que forman tioéter están disponibles comercialmente e incluyen esteres reactivos de ácido 6-maleimidocaproico, ácido 2 -bromoacético y ácido 2-yodoacético, ácido 4- (N-maleimido-metil) ciclohexano-1-carboxílico. Los grupos carboxilo pueden activarse combinándolos con succinimida o ácido 1 -hidroxil -2- - nitro-4-sulfónico, sal sódica. Los péptidos inmunogénicos pueden expresarse también como proteínas de fusión con portadores (i.e., péptidos heterólogos) . El péptido inmunogénico puede enlazarse en su terminal amino, su terminal carboxilo o en ambas a un portador. Opcionalmente, las repeticiones múltiples del péptido inmunogénico pueden estar presentes en la proteína de fusión. Opcionalmente, un péptido inmunogénico puede enlazarse a copias múltiples de un péptido heterólogo, por ejemplo, en ambas terminales N y C del péptido. Algunos péptidos portadores sirven para inducir una respuesta de célula T auxiliar contra el péptido portador. Las células T del auxiliar inducido a su vez inducen una respuesta de las células B contra el péptido inmunogénico enlazado al péptido portador. Algunos agentes de la invención comprenden una proteína de fusión en la cual se enlaza un fragmento N-terminal de Aß en su C-terminal a un péptido portador. En tales agentes, el residuo N-terminal del fragmento de Aß constituye el residuo N-terminal de la proteína de fusión. De acuerdo a esto, tales proteínas de fusión son efectivas para inducir anticuerpos que se unen a un epítope que requiere el residuo N-terminal de Aß para estar en forma libre. Algunos agentes de la invención comprenden una pluralidad de repeticiones de un segmento N-terminal de Aß enlazado en el C-terminal a una o más copias de un péptido portador. El fragmento N-terminal de Aß incorporado dentro de tales proteínas de fusión comienza algunas veces en Aßl-3 y termina en Aß7-ll. Aßl-7, Aßl-3, 1-4, 1-5 y 3-7 son 5 fragmentos N-terminal preferidos de Aß . Algunas proteínas de fusión comprenden diferentes segmentos N-terminal de Aß en serie. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender Aßl-7 seguido de Aßl-3 seguido por un péptido heterólogo. En algunas proteínas de fusión, se fusiona un 10 segmento N-terminal de Aß en su extremo N-terminal a un péptido portador heterólogo. La misma variedad de segmentos N-terminal de Aß puede utilizarse como con las fusiones de C- terminal . Algunas proteínas de fusión comprenden un péptido heterólogo enlazado al N-terminal de un segmento N-terminal 15 de Aß, que a su vez se enlaza a uno o más segmentos N- terminal adicionales de Aß en serie. Algunos ejemplos de proteínas de fusión adecuadas para el uso en la invención se muestran más adelante. Algunas de estas proteínas de fusión comprenden segmentos de 20 Aß enlazados a epítopes de toxoide de tétanos tal como se describe en la US 5,196,512, EP 378,881 y EP 427,347. Algunas proteínas de fusión comprenden segmentos de Aß enlazados a péptidos portadores descritos en la US 5,736,142. Algunos péptidos heterólogos son epítopes universales de 25 célula T. En algunos métodos, el agente para la *¿ im a * j.*.^A. - administración es simplemente una sola proteína de fusión con un segmento Aß enlazado a un segmento heterólogo en configuración lineal. En algunos métodos, el agente es multímero de proteínas de fusión representado por la fórmula 2X, en la cual x es un entero de 1-5. Preferentemente x es 1, 2 o 3, siendo el 2 el más preferido. Cuando x es dos, tal multímero tiene cuatro proteínas de fusión enlazadas a una configuración preferida referida como MAP4 (ver US 5,229,490). Los epítopes de Aß se encuentran subrayados. La configuración MAP4 se muestra abajo, en donde las estructuras ramificadas se producen iniciando la síntesis del péptido en ambas aminas N-terminal y de cadena lateral de lisina. Dependiendo del número de veces que se incorpora lisina dentro de la secuencia y se permite ramificar, la estructura resultante presentará N-terminales múltiples. En este ejemplo, se han producido cuatro N-terminales idénticas sobre el núcleo ramificado que contiene lisina. Tal multiplicidad mejora grandemente la respuesta de las células B de análogas.

Péptido Péptido Péptido Péptido AN90549 (Aß 1-7/Toxoide de tétanos 830-844 en una f it - if 11 T itopif jtiuA aJ—t t - - configuración MAP4) : DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL (SEC ID NO: 10) AN90550 (Aß 1-7/Toxoide de tétanos 947-967 en una configuración MAP4) : DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEC ID NO : 11) AN90542 (Aß 1-7/Toxoide de tétanos 830-844 + 947-967 en una configuración lineal) : DAEFRHDQYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEC ID NO: 12) AN90576: (Aß 3-9/Toxoide de tétanos 830-844 en una configuración MAP4) : EFRHDSGQYIKANSKFIGITEL (SEC ID NO: 13) Péptido descrito en la US 5,736,142 (todo en configuraciones lineales) : AN90562 (Aß 1-7/péptido) AKXVAAWTLKAAADAEFRHD (SEC ID NO: 14) AN90543 (Aßl-7 x 3/péptido) : DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKAAA (SEC ID NO: 15) Otros ejemplos de proteínas de fusión (epítope inmunogénico de Aß en negrillas) incluyen AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEC ID NO: 16) DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEC ID NO: 17) DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEC ID NO: 18) FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEC ID NO: 19) EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEC ID NO : 20) PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEC ID NO: 21) Í?Á?.?JÍ?t¡*ÍÍ*JM.jtjh^g...a^^toa».

DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (SEC ID NO: 22) DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEC ID NO: 23) DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEC ID NO: 24) DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL- 5 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD- QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVLKVSASHLE (SEC ID NO: 25) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKSASHLE (SEC ID NO: 26) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVLKVSASHLE-DAEFRHD 10 (SEC ID NO: 27) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEC ID NO: 28) sobre una resina ramificada 2 péptido — ^_^ Lys-Gly-Cys péptido EQVTNVGGAISQAVHAAHAEINEAGR (Proteína sinucleína de 15 fusión en configuración MAP-4; SEC ID NO: 29) Las mismas proteínas portadoras o similares y los métodos de enlace pueden utilizarse para generar antígenos para utilizarse en la generación de anticuerpos contra Aß para uso en la inmunización pasiva. Por ejemplo, puede 20 administrarse Aß o un fragmento enlazado a un portador a un animal de laboratorio en la producción de anticuerpos monoclonales para Aß . 6. Agentes Terapéuticos que Codifican Ácido Nucleico También pueden inducirse respuestas inmunes contra depósitos amiloides mediante la administración de ácidos nucleicos que codifican antígenos de péptido seleccionados o anticuerpos y sus cadenas de componentes utilizados para la 5 inmunización pasiva. Tales ácidos nucleicos pueden ser ADN o RNA. Un segmento de ácido nucleico que codifica un antígeno se une típicamente a elementos reguladores, tales como un promotor y mejorador, que permiten la expresión del segmento ADN en las células objetivo pretendidas de un paciente. Para 10 la expresión en células sanguíneas, como es deseable para la inducción de una respuesta inmune, los elementos promotores y mejoradores del gen de inmunoglobulina de cadena ligera o pesada o el promotor y mejorador anteriores del intermediario mayor CMV son adecuados para dirigir la expresión. Los 15 elementos reguladores enlazados y las secuencias codificadoras se clonan frecuentemente dentro de un vector. Para la administración de anticuerpos de cadena doble, las dos cadenas pueden clonarse en los mismos vectores o por separado . 20 Se encuentra disponible un número de sistemas virales de vector que incluyen sistemas retrovirales (ver, e.g., Lawrie y Tumin, Cur. Opin . Genet . Develop . 3, 102-109, 1993); vectores adenovirales (ver, e.g., Bett et al., J. Virol . 67, 5911, 1993); vectores de virus adeno-asociados 25 (ver, e.g., Zhou et al., J". Exp . Med. 179, 1867, 1994), ^^^HgÉMI vectores virales de la familia pox que incluyen virus vaccinia y los virus pox aviar, los vectores virales del género de virus alfa tales como los derivados de Sindbis y Semliki Forest Viruses (ver, e.g., Dubensky et al., J". Virol . 70, 508-519, 1996), virus Venezolano de encefalitis equina (ver US 5,643, 576) y rhabdovirus, tales como el virus de estomatitis vesicular (ver WO 96/34625) y papilomavirus (Ohe et al., Human Gene Therapy 6 , 325-333, 1995); Woo et al., WO 94/12629 y Xiao & Brandsma, Nucleic Acids, Res. 24, 2630-2622, 1996) . El ADN que codifica a un antígeno o a un vector que contiene al mismo, puede empacarse dentro de liposomas. Los lípidos adecuados y los análogos relacionados se describen por US 5,208,036, 5,264,618, 5,279,833 y 5,283,185. Los vectores y el ADN que codifican a un antígeno pueden también adsorberse o asociarse con portadores particulados, cuyos ejemplos incluyen polímeros metacrilato de polimetilo y poliláctidos y poli (láctidos-co-glicolidos) , ver, e.g., McGee et al., J. Micro Encap . (1996). Los vectores de terapia de genes o ADN puro pueden suministrarse in vivo mediante la administración a un paciente individual, típicamente mediante la administración sistémica (e.g., intravenosa, intraperitoneal, intranasal, gástrica, intradérmica, intramuscular, subdérmica o por infusión intracraneal) o aplicación tópica (ver, e.g., US tArtr to-Ér-r" -> a* ..*... 5,399,346). Tales vectores pueden incluir además agentes facilitadores tales como bupivacaina (US 5,593,970). El ADN puede administrarse también utilizando un inyector genético. Ver Xiao & Brandsma, supra . El ADN que codifica a un antígeno se precipita sobre la superficie de perlas metálicas microscópicas. Los microproyectiles se aceleran con una onda de choque o gas expansor de helio y penetran los tejidos a una profundidad de varias capas celulares. Por ejemplo, el Accel™ Gene Delivery Device fabricado por Agracetus, Inc., (Middleton, Wl) es adecuado. Alternativamente el ADN puro puede pasar a través de la piel dentro de la corriente sanguínea simplemente colocando el ADN sobre la piel con irritación química o mecánica (ver WO 95/05853) . En una variación adicional, los vectores que codifican antígenos pueden suministrarse a las células ex vivo, tales células explantadas de un paciente individual (e.g., linfocitos, aspiración de médula ósea, biopsia de tejido) o células germinales hematopoyéticas de donador universal, seguido por la reimplantación de las células en un paciente, comúnmente después de la selección de las células que se han incorporado el vector. 7. Selección de Anticuerpos para la Actividad de Depuración El Ejemplo XIV describe los métodos para seleccionar un anticuerpo para la actividad de depuración de "-'•-*-- 'i M -i t hÍMMriTm un depósito amiloide. Para seleccionar la actividad contra un depósito amiloide, una muestra de tejido de un paciente con amiloidosis, tal como el tejido cerebral en la enfermedad de Alzheimer o de un modelo animal que tiene la patología amiloide característica, se pone en contacto con células fagociticas que contienen el receptor Fc, tales como las células microgliales y el anticuerpo bajo análisis en un medio in vitro. Las células fagocíticas pueden ser de un cultivo primario o una línea celular, tal como BV-2, C8-B4 o THP-1. Estos componentes se combinan en una platina de microscopio para facilitar el monitoreo microscópico o pueden llevarse a cabo las reacciones múltiples en paralelo en las cavidades de un recipiente de micro titulación. En tal formato, puede montarse por separado una platina miniatura de microscopio en cavidades separadas o puede utilizarse un formato de detección no-microscópico, tal como la detección ELISA de Aß . Preferentemente, se lleva a cabo una serie de mediciones de la cantidad de depósito amiloide en la mezcla de reacción in vitro, comenzando desde un valor base antes de que haya procedido la reacción y uno o más valores de prueba durante la reacción. El antígeno puede detectarse mediante tinción, por ejemplo, con un anticuerpo etiquetado de modo fluorescente para Aß u otro componente de placas amiloides. El anticuerpo utilizado para el teñido puede o no ser el mismo que el anticuerpo que se analiza para la actividad de depuración. Una reducción relativa a la línea de base durante la reacción de los depósitos amiloides indica que el anticuerpo bajo prueba tiene actividad de depuración. Tales anticuerpos probablemente son útiles en la prevención o tratamiento de Alzheimer y otras enfermedades amiloidogénicas . Como se describió anteriormente, los experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención revelan, que utilizando tal análisis, los anticuerpos para el fragmento NAC de sinucleína son efectivos para depurar las placas amiloides características de la enfermedad de Alzheimer. D. Pacientes Susceptibles para los Regímenes de Tratamiento Anti -amiloide Los pacientes susceptibles al tratamiento incluyen individuos en riesgo de enfermedad pero que no muestran síntomas, así como los pacientes que actualmente presentan síntomas de amiloidosis. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, virtualmente todos están en riesgo de la enfermedad de Alzheimer si viven lo suficiente. En consecuencia, los métodos presentes pueden administrarse profilácticamente a la población en general sin la necesidad de ninguna valoración del riesgo del paciente sujeto. Los métodos presentes son específicamente útiles para individuos que tienen un riesgo genético conocido de la enfermedad de Alzheimer o de cualquier otra enfermedad amiloide hereditaria. Tales individuos incluyen aquellos que tienen parientes que han experimentado esta enfermedad y aquellos cuyo riesgo se determina mediante análisis de marcadores genéticos o bioquímicos. Los marcadores genéticos del riesgo hacia la enfermedad de Alzheimer incluyen mutaciones en el gen APP, particularmente las mutaciones en la posición 717 y las posiciones 670 y 671 referidas como las mutaciones Hardy y Swedish respectivamente (ver Hardy, TINS, supra) . Otros marcadores de riesgo son las mutaciones en los genes de presenilina, PS1 y PS2 y ApoE4 , la historia familiar del AD, la hipercolosterolemia o arterosclerosis . Los individuos que actualmente sufren de la enfermedad de Alzheimer pueden reconocerse a partir de la demencia característica, así como por la presencia de los factores de riesgo arriba descritos. Además, se encuentra disponible varias pruebas de diagnóstico para identificar a los individuos que tienen AD. Estos incluyen la medición de los niveles de CSF tau y Aß42. Los niveles elevados de tau y disminuidos de Aß42 significan la presencia de AD. Los individuos que sufren de la enfermedad de Alzheimer pueden diagnosticarse también mediante el criterio MMSE o ADRDA como se trata en la sección de Ejemplos . En pacientes asintomáticos, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (e.g., 10, 20, 30). Sin embargo, comúnmente no es necesario comenzar el tratamiento hasta que el paciente alcanza los 40, 50, 60 o 70. Típicamente el tratamiento ocasiona dosis múltiples sobre un período de tiempo. El tratamiento puede monitorearse valorando los anticuerpos o las respuestas de las células T activadas o las células B hacia el agente terapéutico (e.g., péptido Aß) durante un tiempo, a lo largo de las líneas descritas en la presente en los Ejemplos I y II. Si la respuesta cae, se indica una dosis de refuerzo. En el caso de pacientes potenciales de síndrome de Down, el tratamiento puede comenzar prenatalmente administrando el agente terapéutico a la madre o poco después del nacimiento. Otras formas de amiloidosis frecuentemente no se diagnostican, a menos que se sospeche de una predisposición particular para la enfermedad. Un síntoma primario es la presencia de enfermedad cardíaca o renal en un paciente de mediana edad o anciano que tiene también signos de implicaciones en otro órgano. El bajo voltaje o las desviaciones extremas de eje del electrocardiograma y tejido ventricular engrosado pueden ser indicativos de implicación cardíaca. La proteinuria es un síntoma de implicación renal. Puede sospecharse también la implicación hepática, si se detecta hepatomegalia mediante el examen físico del paciente. La neuropatía periférica es también una ocurrencia común en ciertas formas de amiloidosis; puede encontrarse también la neuropatía autonómica, caracterizada por hipotensión postural . La amiloidosis debe sospecharse en todos con una neuropatía progresiva de origen indeterminado. Puede hacerse un diagnóstico definitivo de la enfermedad utilizando métodos de biopsia de tejido, cuando el (los) órgano (s) afectado (s) se encuentra (n) disponible (s) . Para la amiloidosis sistémica, pueden utilizarse muestras aspiradas de capa grasa o de biopsia rectal. El material de biopsia se tiñe con rojo Congo, con las muestras positivas exhibiendo birrefrigencia verde manzana bajo el microscopio de luz polarizada. E. Métodos de Tratamiento En aplicaciones profilácticas, las composiciones o medicamentos farmacéuticos se administran a un paciente susceptible o de otra manera en riesgo de, una enfermedad particular en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo o demorar el inicio de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o medicamentos se administran a un paciente sospechoso o que ya sufre de tal enfermedad en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una dosis terapéuticamente o farmacéuticamente efectiva. En ambos regímenes profiláctico y terapéutico, los agentes se administran comúnmente en varias dosis hasta que se logra una respuesta inmune suficiente. Típicamente, la respuesta inmune se monitorea y se dan dosis repetidas si la .á¿t,.?- .A,.&.y A?¡A -i -*. respuesta inmune comienza a disminuir. Las dosis efectivas de las composiciones de la presente invención para el tratamiento de las condiciones anteriormente descritas, varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo el medio de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del paciente, si el paciente es animal o humano, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Comúnmente, el paciente es un humano, pero en algunas enfermedades, tales como la enfermedad de las vacas locas asociada a la proteína prion, el paciente puede ser un mamífero no-humano, tal como un bovino. Las dosis de tratamiento requieren valorarse para optimizar su seguridad y eficacia. La cantidad de antígeno depende de si se administra también un adyuvante, requiriendo generalmente dosis mayores en ausencia del adyuvante. Dependiendo de la inmunogenicidad de la formulación particular, la cantidad de un antígeno para administración puede variar desde 1 µg-500 µg por paciente y más comúnmente desde 5-500 µg por inyección para la administración a humanos. Ocasionalmente, se utiliza una dosis más alta de 0.5-5 mg por inyección. Típicamente se utilizan al menos 10, 20, 50 o 100 µg para cada inyección a humanos. Los intervalos de las inyecciones pueden variar significativamente de una al día, hasta una vez al año, hasta una en una década, con "refuerzos" sucesivos del imnunógeno de algún modo preferido. Generalmente, de acuerdo con las enseñanzas aquí proporcionadas, las dosis efectivas pueden monitorearse obteniendo una muestra de fluido del paciente, generalmente una muestra de suero sanguíneo y determinar el 5 valor del anticuerpo desarrollado contra el imnunógeno, utilizando métodos bien conocidos en la técnica y fácilmente adaptables al antígeno específico que va a medirse. Idealmente, se toma una muestra previa a la dosificación inicial; se toman muestras subsecuentes y se titulan después 10 de cada inmunización. Generalmente, es deseable una dosis o programa de dosificación que proporcione un título detectable al menos cuatro veces mayor que los niveles de control o de "antecedente" en una dilución de suero de 1:100, cuando el antecedente se define en relación al suero de control o en 15 relación al antecedente de placa en los análisis ELISA. Se prefieren los títulos de al menos 1:1000 o 1:5000 de acuerdo con la presente invención. En cualquier fecha dada en la que se administra una dosis de antígeno, la dosis es comúnmente mayor que 20 aproximadamente 1 µg/paciente y de preferencia mayor que 10 µg/paciente si se administra también un adyuvante y al menos mayor que 10 µg/paciente y comúnmente mayor que 100 µg/paciente en ausencia del adyuvante. Las dosis para antígenos individuales, seleccionados de acuerdo con la 25 presente invención, se determinan de acuerdo a una - - "TJI[\ t <¡f&'Z-*--t?-aL?í.i.i?ái?JA*. dosificación estándar y a métodos de titulación, tomados en conjunto con las enseñanzas aquí proporcionadas. Un régimen típico consiste de una inmunización seguida por inyecciones de refuerzo a intervalos de tiempo, tales como intervalos de 6 semanas. Otro método consiste de una inmunización seguida por inyecciones de refuerzo 1, 2 y 12 meses más tarde. Otro régimen da lugar a inyecciones cada dos meses de por vida. Alternativamente las inyecciones de refuerzo pueden ser sobre una base irregular como lo indica el monitoreo de la respuesta inmune. Para la inmunización pasiva con un anticuerpo, la dosis fluctúa desde aproximadamente 0.0001 hasta 100 mg/kg y más comúnmente de 0.01 a 5 mg/kg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 1 mg/kg del peso corporal o de lOmg/kg del peso corporal. Un régimen de tratamiento ejemplar da lugar a la administración de una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. En algunos regímenes, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado cae dentro de los rangos indicados. El anticuerpo se administra comúnmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser semanalmente, mensualmente o anularmente. Los intervalos pueden ser también irregulares como se indica mediante la medición en los niveles sanguíneos del anticuerpo para Aß en el paciente. Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la media de vida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la media de vida más larga, seguidos por los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no-humanos. La dosis y frecuencia de administración varían dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente no frecuentes sobre un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo el tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, se requiere a veces una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que el progreso de la enfermedad se reduce o termina y de preferencia hasta que el paciente muestra una disminución parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de esto, puede administrarse al paciente un régimen profiláctico. Las dosis para ácidos nucleicos que codifican antígenos fluctúan desde aproximadamente 10 ng hasta 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 µg a 10 mg o 30-300 µg de ADN por paciente. Las dosis para vectores infecciosos virales varían desde 10- &¿L. l¿?.y 2^|^^g^^¡^^ -— —""^ •*•*«.'-i -* .n+m? *, 100 o más, viriones por dosis. Los agentes para inducir una respuesta inmune pueden administrarse mediante medios parenterales, tópicos, intravenosos, orales, subcutáneos, intraperitoneales, intranasales o intramusculares para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Las rutas típicas de administración de un agente inmunogénico son intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.) o subcutánea (s.c.), aunque otras rutas pueden ser igualmente efectivas. La inyección intramuscular se lleva a cabo más típicamente en los músculos del brazo o pierna. En algunos métodos, los agentes se inyectan directamente dentro de un tejido en particular donde se han acumulado los depósitos, por ejemplo por inyección intracraneal . La inyección intramuscular o la infusión intravenosa se prefieren para la administración de anticuerpos. En algunos métodos, se inyectan anticuerpos particulares terapéuticos directamente dentro del cráneo. En algunos métodos, los anticuerpos se administran como una composición o dispositivo de liberación sostenida, tal como el dispositivo Medipad™. Los agentes de la invención pueden administrarse opcionalmente en combinación con otros agentes que son al menos parcialmente efectivos en el tratamiento de enfermedad amiloidogénica . En el caso de Alzheimer y síndrome de Down, en los cuales los depósitos amiloides ocurren en el cerebro, tt??¡4ááá?m¡áih,,t -*.Alrn,rM, . ....,,, ..^..,,. ... . .V.^..^..L,.. , <M?.,„ ^^....t^iaÉ^^^, los agentes de la invención pueden administrarse también en conjunto con otros agentes que mejoran el paso de los agentes de la invención a través de la barrera sangre-cerebro. Además, los cocteles terapéuticos que comprenden antígenos diseñados para provocar una respuesta inmune contra más de un componente amiloide se contemplan también por la presente invención, dado que son una combinación de un anticuerpo dirigido contra un componente de placa y un antígeno dirigido a un componente de placa diferente. Los agentes inmunogénicos de la invención, tales como péptidos, se administran a veces en combinación con un adyuvante. Puede utilizarse una variedad de adyuvantes en combinación con un péptido, tal como Aß, para emitir una respuesta inmune. Los adyuvantes preferidos aumentan la respuesta intrínseca a un antígeno sin ocasionar cambios en la conformación del antígeno que afectan la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes preferidos incluyen hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, lípido A monofosforilo 3 De-O-acilado (MPL™) (ver GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, ahora parte de Corixa) . Stimulon™ QS-21 es un triterpeno de glicosina o saponina aislado de la corteza del árbol Quillaja Saponaria Molina encontrado en Sudamérica (ver Kensil et al., en Vaccine Design : The Subuni t and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995) ; Patente US No. 5,057,540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA) . Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (tales como escualeno o aceite de cacahuate) , opcionalmente en combinación con estimulantes inmunes, tales como el lípido monofosforilo A (ver Stoute et al., N. Engl . J. Med. 336, 86-91 (1997)). Otro adyuvante es CpG (WO 98/40100). Alternativamente, el Aß puede acoplarse a un adyuvante. Sin embargo, tal acoplamiento no debe cambiar sustancialmente la conformación de Aß a modo de afectar la naturaleza de la respuesta inmune al mismo. Los adyuvantes pueden administrarse como un componente de una composición terapéutica con un agente activo o pueden administrarse por separado, antes, concurrentemente con o después de la administración del agente terapéutico. Una clase preferida de adyuvante son las sales de aluminio (alumbre) , tales como el hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio. Tales adyuvantes pueden utilizarse con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como MPL o 3-DMP, QS-21, aminoácidos poliméricos o monoméricos tales como el ácido poliglutámico o polilisina. Otra clase de adyuvante son las formulaciones de emulsión de aceite en agua. Tales adyuvantes pueden utilizarse con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos muramilo (e.g., ?.acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), ?-acetil- Í.LÍ . ,,í,¿ ¿?tá?jbÁJmlí^ normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) , N- acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1' - 2 ' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina (MTP-PE) , N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu- L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP) teramida™ u otros componentes de pared celular bacterial . Las emulsiones de aceite en agua incluyen (a) MF59 (WO 90/14837) , que contiene 5% de Escualeno, 0.5% Tween 80 y 0.5% Span 85 (conteniendo opcionalmente varias cantidades de MTP-PE) formulado en partículas de submicron utilizando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo HOY (Microfluidics, Newton, MA) , (b) SAF, que contiene 10% Escualeno, 0.4% Tween 80, 5% de polímero plurónico-bloqueado L121 y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión de submicron o agitado para generar una emulsión de partícula de mayor dimensión y (c) sistema adyuvante Ribi™ (RAS) , (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene 2% Escualeno, 0.2% Tween 80 y uno o más componentes de pared celular bacterial a partir del grupo que consiste de lípido monofosforilo A, dimicolato trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS) , de preferencia MPL + CWS (Detox™) . Otra clase de adyuvantes preferidos son los adyuvantes de saponina, tales como Stimulon™ (QS-21: Aquila, Framingham, MA) o partículas generadas a partir del mismo tales como ISOCOMs (compuestos inmunoestimulantes) e ISCOMATRIX. Otros adyuvantes incluyen Adyuvante Incompleto t . 1 ? ??. de Freund (IFA) , citocinas, tales como las interleucinas (IL- 1, IL-2 e IL-12) , factor de estimulación de colonia macrófaga (M-CSF) y factor de necrosis tumoral (TNF) . Tales adyuvantes se encuentran disponibles generalmente de fuentes comerciales. Puede administrarse un adyuvante con un antígeno como una composición única o puede administrarse antes, concurrentemente con o después de la administración del antígeno. El antígeno y el adyuvante pueden empacarse y suministrarse en el mismo vial o pueden empacarse en viales separados y mezclarse antes de su uso. El antígeno y el adyuvante se empacan típicamente con una etiqueta que indica la aplicación terapéutica propuesta. Si el antígeno y el adyuvante se empacan por separado, el empaque típicamente incluye instrucciones para mezclar antes de su uso. La elección de un adyuvante y/o vehículo depende de factores tales como la estabilidad de la formulación que contiene el adyuvante, la ruta de administración, el patrón de dosificación y la eficacia del adyuvante para las especies que van a vacunarse. En humanos, un adyuvante preferido farmacéuticamente aceptable es el aprobado para la administración humana por los cuerpos de regulación pertinentes. Ejemplos de tales adyuvantes preferidos para humanos incluyen alumbre, MPL y QS-21. Opcionalmente, pueden utilizarse simultáneamente dos o más adyuvantes diferentes.

Ll.t J.J a.¡L aifc Las combinaciones preferidas incluyen alumbre con MPL, alumbre con QS-21, MPL con QS-21 y alumbre, QS-21 y MPL juntos. También puede utilizarse el Adyuvante Incompleto de Freund (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998) ) , opcionalmente en combinación con cualquiera de alumbre, QS-21 y MPL y todas sus combinaciones. Los agentes de la invención se administran frecuentemente como composiciones farmacéuticas que comprenden un agente terapéuticamente activo y una variedad de otros componentes farmacéuticamente aceptables. Ver Remington ' s Pharmaceutical Science (19a ed.,1995) . La forma preferida depende del modo de administración que se pretende y de la aplicación terapéutica. Las composiciones pueden incluir también, dependiendo de la formulación deseada, vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, no-tóxicos, que se definen como vehículos comúnmente utilizados para formular composiciones farmacéuticas para la administración humana y animal . El diluyente se selecciona a fin de no afectar la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica amortiguada con fosfato, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica puede incluir también otros vehículos, adyuvantes o estabilizadores no-tóxicos, no-terapéuticos, no-inmunogénicos y lo similar.

I J*a .l^*¿ .^__.¿l fcA-J..

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir también macromoléculas largas, lentamente metabolizadas tales como las proteínas, polisacáridos tales como citosan, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (tales como látex, sefarosa funcionalizada, agarosa, celulosa y lo similar) , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido y agregados lípidos (tales como gotas de aceite o liposomas) . Adicionalmente, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes (i . e ., adyuvantes) . Para la administración parenteral, los agentes de la invención pueden administrarse como dosis inyectables de una solución o suspensión de la sustancia en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido estéril tal como agua, aceites, solución salina, glicerol o etanol. Adicionalmente, las sustancias auxiliares, tales como agentes humidificadores o emulsificantes, surfactantes, sustancias amortiguadoras de pH y lo similar pueden estar presentes en las composiciones. Otros componentes de las composiciones farmacéuticas son aquellos de petróleo de origen animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de soya y aceite mineral. En general, los glicoles tal como el propilen glicol o el polietilen glicol son vehículos líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables. Los anticuerpos pueden administrarse en forma de una inyección de depósito o una preparación de implante que puede formularse de tal manera que permite una liberación sostenida del ingrediente activo. Una composición ejemplar comprende el anticuerpo monoclonal a 5 mg/ml , formulado en amortiguador acuoso que consiste de L-histidina 50 mM, NaCl 150 mM, ajustado a un pH de 6.0 con HCl. Típicamente, las composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; pueden prepararse también las formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos previo a la inyección. La preparación puede estar también emulsificada o encapsulada en liposomas o micropartículas tales como polilactida, poliglicolida o copolímero para un efecto mejorado de adyuvante, como se trató anteriormente (ver Langer, Science 249, 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997) . Los agentes de esta invención pueden administrarse en forma de una inyección de depósito o de una preparación de implante que puede formularse de tal manera que permite una liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo. Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales, intranasales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas . Para los supositorios, los fijadores y vehículos incluyen, por ejemplo, polialquilen glicoles o triglicéridos; tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el rango de 0.5% a 10%, de preferencia l%-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes, tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos que contienen 10%-95% del ingrediente activo, de preferencia 25%- 70%. La aplicación tópica puede dar como resultado el suministro transdérmico o intradérmico. La administración tópica puede facilitarse mediante la co-administración del agente con toxina de cólera o derivados destoxificados o subunidades de la misma o de otras toxinas bacteriales similares (Ver Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). La coadministración puede lograrse utilizando los componentes como una mezcla o como moléculas enlazadas obtenidas por reticulación o expresión química como una proteína de fusión. Alternativamente, el suministro transdérmico puede lograrse utilizando un parche cutáneo o utilizando transferosomas (Paul et al., Eur. J. Immunol . 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem . Biophys . Acta 1368, 201-15 ( 1998 ) ) .

F. Métodos de Diagnóstico La invención proporciona métodos para detectar una respuesta inmune contra el péptido Aß en un paciente que sufre de o es susceptible a la enfermedad de Alzheimer. Los métodos son particularmente útiles para monitorear el curso de un tratamiento que se administra a un paciente. Los métodos pueden utilizarse para monitorear el tratamiento terapéutico en pacientes sintomáticos y el tratamiento profiláctico en pacientes asintomáticos. Los métodos son útiles para monitorear la inmunización activa (e.g., el anticuerpo producido en respuesta a la administración del inmunógen) y la inmunización pasiva (e.g., la medición del nivel del anticuerpo administrado) . 1. Inmunización Activa Algunos métodos dan lugar a determinar un valor de línea base de una respuesta inmune en un paciente antes de administrar una dosis del agente y comparar éste con un valor para la respuesta inmune después del tratamiento. Un aumento significativo (i.e., mayor que el margen típico de error experimental en mediciones repetidas de la misma muestra, expresado como una desviación estándar de la media de tales mediciones) en el valor de la respuesta inmune señala un resultado positivo del tratamiento (i.e., la administración del agente se ha logrado o se ha aumentado una respuesta inmune) . Si el valor de la respuesta inmune no cambia de manera significativa o disminuye, se indica un resultado negativo del tratamiento. En general, se espera que los pacientes que experimentan un curso inicial del tratamiento con un agente inmunogénico muestren un incremento en la respuesta inmune con dosis sucesivas, que eventualmente alcanzan un plano. La administración del agente continúa generalmente mientras aumenta la respuesta inmune. El logro del plano es un indicador de que la administración del tratamiento puede descontinuarse o reducirse en dosis o frecuencia. En otros métodos, se determina un valor de control (i.e., una media y una desviación estándar) de la respuesta inmune para una población de control. Típicamente, los individuos de la población de control no han recibido tratamiento previo. Los valores de medición de la respuesta inmune en un paciente después de administrarle un agente terapéutico se comparan entonces con el valor de control. Un incremento significativo con relación al valor de control (e.g., mayor que una desviación estándar de la media) señala un resultado positivo del tratamiento. La falta de un aumento significativo o una disminución señala un resultado negativo del tratamiento. La administración del agente generalmente continúa mientras aumenta la respuesta inmune con relación al valor de control. Como en lo anterior, el logro del plano relativo a los valores de control es un y ¿fr^,,^ indicador de que la administración del tratamiento puede descontinuarse o reducirse en dosis o frecuencia. En otros métodos, se determina un valor de control de respuesta inmune (e.g., una media y una desviación estándar) a partir de una población de control de individuos que han experimentado el tratamiento con un agente terapéutico y cuyas respuestas inmunes han alcanzado el plano en respuesta al tratamiento. Los valores de medición de la respuesta inmune en un paciente se comparan con el valor de control . Si el nivel medido en un paciente no es significativamente diferente (e.g., más que una desviación estándar) del valor de control, el tratamiento puede descontinuarse. Si el nivel en un paciente se encuentra significativamente por debajo del valor de control, se garantiza la administración continuada del agente. Si el nivel en el paciente persiste por debajo del valor de control, entonces puede indicarse un cambio en el régimen de tratamiento, por ejemplo, el uso de un adyuvante diferente. En otros métodos, un paciente que actualmente no recibe tratamiento pero ha experimentado un curso previo del tratamiento se monitorea para la respuesta inmune para determinar si requiere una reanudación del tratamiento. El valor medido de la respuesta inmune en el paciente puede compararse con un valor de respuesta inmune previamente logrado en el paciente después de un curso de tratamiento previo. Una disminución significativa relativa a la medición previa (i.e., mayor que un margen típico de error en mediciones repetidas de la misma muestra) es una indicación de que el tratamiento puede reanudarse. Alternativamente, el valor medido en un paciente puede compararse con un valor de control (media más desviación estándar) determinado en una población de pacientes después de experimentar un curso del tratamiento. Alternativamente, el valor medido en el paciente puede compararse con un valor de control en poblaciones de pacientes tratados profilácticamente quienes permanecen libres de los síntomas de la enfermedad o en poblaciones de pacientes tratados terapéuticamente quienes muestran disminución de las características de la enfermedad. En todos los casos, una disminución significativa relativa al nivel de control (i.e., más que una desviación estándar) es un indicador de que el tratamiento debe reanudarse en un paciente . La muestra de tejido para el análisis es típicamente sangre, plasma, suero, mucosa o fluido cerebroespinal del paciente. La muestra se analiza para la indicación de una respuesta inmune al componente amiloide de interés, tal como cualquier forma del péptido Aß . La respuesta inmune puede determinarse a partir de la presencia de, e.g., anticuerpos o células T que se unen específicamente al componente de interés, tal como el péptido Aß . Los métodos ELISA para detectar anticuerpos específicos para Aß se describen en la sección de Ejemplos y pueden aplicarse a otros antígenos del péptido. Los métodos para detectar células T reactivas son bien conocidos en la técnica. 2. Inmunización Pasiva En general, los procedimientos para monitorear la inmunización pasiva son similares a aquellos para monitorear la inmunización activa antes descrita. Sin embargo, el perfil del anticuerpo siguiente a la inmunización pasiva muestra típicamente un pico inmediato en la concentración del anticuerpo seguido por una caída exponencial . Sin una dosis adicional, la caída alcanza niveles de pre-tratamiento dentro de un período de días o meses dependiendo de la media de vida del anticuerpo administrado. Por ejemplo, la media de vida de algunos anticuerpos humanos se encuentra en el orden de 20 días . En algunos métodos, se realiza una medición de línea base del anticuerpo para Aß en el paciente antes de la administración, se hace una segunda medición poco después de ésta para determinar el nivel pico del anticuerpo y una o más mediciones se realizan a intervalos para monitorear la caída de los niveles del anticuerpo. Cuando el nivel de anticuerpo ha declinado a la línea base o a un porcentaje predeterminado del pico menos la línea base (e.g., 50%, 25% o 10%), se administra una dosis adicional del anticuerpo. En algunos tiL?d,Aj.* A A- - ^¿a^L, métodos, se compara el pico o los niveles de medición subsecuentes menos el antecedente, con niveles de referencia previamente determinados para constituir un método de tratamiento profiláctico o terapéutico benéfico en otros 5 pacientes. Si el nivel de medición del anticuerpo es significativamente menor que un nivel de referencia (e.g., menor que la media menos una desviación estándar del valor de referencia en una población de pacientes que se benefician del tratamiento) se indica la administración de una dosis del 10 anticuerpo. 3. Equipos de Diagnóstico La invención proporciona además equipos de diagnóstico para llevar a cabo los métodos de diagnóstico anteriormente descritos. Típicamente tales equipos contienen 15 un agente que se une específicamente a anticuerpos en un componente de placa amiloide, tal como Aß o reacciona con células T específicas para el componente. El equipo puede incluir también una etiqueta. Para la detección de anticuerpos para Aß, la etiqueta es típicamente en forma de 20 anticuerpos anti-idiotípicos etiquetados. Para la detección de anticuerpos, el agente puede suministrarse pre-unido a una fase sólida, tal como la cavidad de un recipiente de micro- titulación. Para la detección de células T reactivas, la etiqueta puede suministrarse como 3H-timidina para medir una 25 respuesta proliferativa. Los equipos contienen también típicamente instrucciones para proporcionar el etiquetado para el uso del equipo. El etiquetado puede incluir también una tabla u otros niveles de correlación del régimen de correspondencia de la etiqueta medida con niveles de anticuerpos para Aß o células T reactivas con Aß . El término etiquetado se refiere a cualquier material escrito o grabado que se adjunta o de otro modo acompaña al equipo en cualquier momento durante su fabricación, transporte, venta o uso. Por ejemplo, el término etiquetado abarca hojas y folletos, materiales de empaque, instrucciones, casetes de audio o video, discos de computadora, así como escritura impresa directamente en los equipos. EJEMPLOS I. EFICACIA PROFILÁCTICA DE Aß CONTRA LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (AD) Estos ejemplos describen la administración del péptido Aß42 a APP de sobre-expresión de ratón transgénico con una mutación en posición 717 (APP717V?F) que los predispone al desarrollo de neuropatología similar a Alzheimer. La producción y características de este ratón (ratón PDAPP) se describe en Games et al . , Nature supra .

Estos animales, en su forma de heterocigoto, empiezan a depositar Aß a partir de los seis meses de edad. A los quince meses de edad exhiben niveles de deposición de Aß equivalentes a los que se observan en la enfermedad de I ?.M ri_A..yíy&y&.ít,..y..JM ± y¿y.. ..

Alzheimer. El ratón PDAPP se inyectó con Aß42 agregado (Aß42 agregado) o solución salina amortiguada con fosfato. El Aß42 agregado se seleccionó por su capacidad para inducir anticuerpos a múltiples epítopes de Aß . A. MÉTODOS 1. Fuente de Ratón Treinta ratones hembra PDAPP heterogéneos se dividieron aleatoriamente en los siguientes grupos: 10 ratones para inyección con Aß42 agregado (uno muerto en la transición) , 5 ratones para inyectarse con PBS/adyuvante, o PBS y 10 controles sin inyección. Los cinco ratones se inyectaron con péptidos derivados de la secuencia de proteína amiloide se suero (SAP) 2. Preparación de antígenos Preparación de Aß42 agregados: se disolvieron dos miligramos de Aß42 (US Peptides Inc, lote K-42-12) en 0.9 ml de agua y se completó a 1 ml al agregar 0.1 ml 10 x PBS. Esto se agitó y se le permitió incubarse durante la noche a 37°C, condiciones bajo las cuales el péptido se agregó. Los Aß no utilizados se almacenaron como un polvo seco liofilizado a -20°C hasta la siguiente inyección. Debe notarse que cuando se utilizan tales péptidos comercialmente disponibles, los pesos secos pueden incluir los pesos de las sales; los pesos reportados en todos los Ejemplos de la presente, a menos que se indique de otra manera, incluyen los pesos de sales. Las masas exactas del péptido puede determinarse utilizando ensayos de la preparación estándar, tal como determinación de nitrógeno, junto con la composición conocida. 3. Preparación de Inyecciones Para cada inyección, 100 µg de Aß42 agregado en PBS por ratón se emulsificaron 1:1 con adyuvante de Freund Completo (CFA) en un volumen final de 400 µl emulsión para la primera inmunización, seguida por un refuerzo de la misma cantidad de antígeno en Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) a las 2 semanas. Se dieron dos dosis adicionales en IFA a intervalos mensuales. Las inmunizaciones subsecuentes se hicieron a intervalos mensuales en 500 µl de PBS. Las inyecciones se suministraron intraperitonealmente (i.p.) . Las inyecciones de PBS siguiendo el mismo programa y ratón se inyectaron con una mezcla 1:1 de PBS/Adyuvante a 400 µl por ratón, o 500 µl de PBS por ratón. Las inyecciones de SAP de igual modo siguieron el mismo programa utilizando una dosis de 100 µg por inyección. 4. Titulación de Mezclas de Ratones, Preparación de Tejido e Inmunohistoquímica Los métodos anteriores se describen infra en Materiales y Métodos Generales. B . RESULTADOS Los ratones PDAPP se inyectaron con cualquier Aß42 agregado (Aß42 agregado) , péptido SAP o solución salina regulada por fosfato. Un grupo de ratones PDAPP también se dejaron como controles positivos, sin inyectar. Los títulos de los ratones para el Aß42 agregado se monitorearon cada mes a partir del cuarto refuerzo hasta que los ratones tuvieron un año de edad. Los ratones se sacrificaron a los 13 meses. En todos los puntos de tiempo examinados, ocho de los nueve ratones Aß42 agregado desarrollaron un alto título de anticuerpos, que permaneció alto a través de las series de inyecciones (títulos mayores de 1/10000) . Los nueve ratones tuvieron un bajo, pero medible título de aproximadamente 1/1000 (Figura 1, Tabla 3) . Los ratones inyectados con SAPP tuvieron títulos de 1:1,000 a 1:30,000 para este inmunógeno con únicamente un ratón que excedió 1:10,0000.

TABLA 3A Títulos al 50% en O.D. Máximo i ,i?..A j. j ¿???y„i uk rf __,. AMMI«t - - .£t,-*. ? ^ TABLA 3B Títulos al 50% en O.D. Máximo Ratones Inyectados con PBS en ambos antígenos en 1/00 Los sueros de los ratones tratados con PBS se titularon contra Aß2 agregado a los seis, diez y doce meses. A una dilución de 1/100 los ratones PBS, cuando se titularon contra Aß42 agregado, solo excedió 4 veces el antecedente en un punto de datos, de otra manera, fueron menos de 4 veces el antecedente en todos los puntos de tiempo (Tabla 3) . La respuesta específica de SAP fue insignificante en esos puntos de tiempo con todos los títulos menos de 300. Siete fuera de los nueve ratones en el agregado Aßl-42 del grupo tratado no se les detectó amiloide en sus cerebros. En contraste, el tejido de cerebro de los ratones en los grupos SAP y PBS contuvo varios depósitos amiloides en el hipocampo así como en las cortezas frontal y cingulado. El patrón de deposición fue similar al de los controles no tratados, con características de inclusión de sub-regiones vulnerables, tal como la capa molecular externa de las Í Í..yk. ¡*,?.?±jlí.í, circunvoluciones dentadas hipocampales . Un ratón del grupo inyectado Aßl-42 tuvo una carga amiloide grandemente reducida, confinada al hipocampo. Se identificó una placa aislada en otro ratón tratado con Aßl-42. Los análisis cuantitativos de imagen de la carga amiloide en el hipocampo verificó la drástica reducción alcanzada en los animales tratados con Aß42(AN1792) (Figura 2) . Los valores medios de la carga amiloide para el grupo PBS (2.22%) y para el grupo control no tratado (2.65%) fueron significativamente mayores que para aquellos inmunizados con AN1792 (0.00%, p=0.0005). En contraste, el valor medio para el grupo inmunizado con péptidos SAP (SAPP) fue de 5.74%. El tejido de cerebro de los ratones control no tratados contenía numerosos depósitos amiloides Aß visualizados con el anticuerpo monoclonal específico de Aß (mAb) 3D6 en el hipocampo, así como en la corteza retroespinal . Un patrón similar de deposición amiloide se observó también en los ratones inmunizados con SAPP o PBS (Figura 2) . Además, en estos tres grupos existió una implicación de característica de subregiones vulnerables del cerebro, observadas clásicamente en AD, tal como la capa molecular externa de las circunvoluciones dentadas del hipocampo, en los tres grupos. Los cerebros que no contenían depósitos Aß también estuvieron exentos de placas neuríticas que se visualizan típicamente en ratones PDAPP con el anticuerpo APP humano Í ^. ? . ?. ^...L, ., 8E5. Todos los cerebros de los grupos restantes (ratones inyectados con SAP, PBS y no inyectados) tuvieron numerosas placas neuríticas típicas de los ratones PDAPP no tratados. Un pequeño número de placas neuríticas se presentaron en un ratón tratado con AN1792 y una sola aglomeración de neuritis distrófica se encontró en un segundo ratón tratado con A?1792. Los análisis de imagen de hipocampo y los mostrados en la Figura 3, demostraron la virtual eliminación de neuritis distrófica en ratones tratados con A?1792 (mediana 0.00%) comparado a los receptores de PBS (mediana 0.28%, p=0.0005) . Las características de astrocitocis de la inflamación asociada a placas también estuvo ausente en los cerebros del grupo inyectado con Aßl-42. Los cerebros de los ratones de los otros grupos contuvieron abundantes y astrocitos GFAP-positivos y aglomerados típicos de la gliosis asociada a placas Aß . Los astrocitos GFAP-positivos se asociaron con placas Aß en los SAP, PBS y controles no tratados . ?o se encontró tal asociación en los ratones tratados con Aßl-42 negativos a placas, mientras se identificó gliosis mínima asociada a placas en un ratón tratado con A?1792. Los análisis de imagen, mostrados en la Figura 4 para la corteza retroespinal, verificaron que la reducción en astrocitos fue significativa con un valor medio de 1.56% para í rÍ,A.? lí rÍy.í.l ±±Í.Í.L,.y.. ~.r-—*.r¿-y, .J. .. aquellos tratados con AN1792 contra los valores medios mayores de 6% para los grupos inmunizados con péptidos SAP, PBS o no tratados (p=0.0017) . La evidencia de un subconjunto de los ratones inyectados con Aßl-42 y PBS indicaron que las placas asociadas a inmunoreactividad MHCII estuvieron ausentes en los ratones inyectados con Aßl-42 consistente con la carencia de una respuesta inflamatoria relacionada a Aß . Las secciones de los cerebros de ratones también reaccionaron con un mAb específico con un anticuerpo monoclonal específico para MAC-1, una proteína de la superficie celular. MAC-1 (CDllb) es un miembro de la familia de integrina y existe como un heterodímero CD18. El complejo CDllb/CD18 se encuentra presente en monocitos, macrófagos, neutrófilos y células destructoras naturales (Mak y Simard) . El tipo de célula residente reactivo MAC-1 en el cerebro es probablemente de la microglia basada en la morfología fenotípica similar de las secciones inmunoreactivas a MAC-1. Las placas asociadas a MAC-1 etiquetadas fueron menores en los cerebros de ratón tratados con AN1792 comparadas a los grupos control de PBS, un hallazgo consistente con la carencia de una respuesta inflamatoria inducida por Aß . C . CONCLUSIÓN La carencia de placas Aß y los cambios reactivos neuronales y glióticos en los cerebros de los ratones inyectados con Aßl-42 indicaron que ninguno o amiloides extremadamente pequeños se depositaron en sus cerebros y estuvieron ausentes consecuencias patológicas, tales como patología de gliosis y neurítica. Los ratones PDAPP tratados con Aßl-42 mostraron esencialmente la misma carencia de patología como los ratones control no transgénicos. Por lo tanto, las inyecciones Aßl-42 fueron altamente efectivas en la prevención de la deposición o depuración de Aß humano a partir de tejido de cerebro y la eliminación de cambios degenerativos neuronales e inflamatorios subsecuentes. Así, la administración del péptido Aß puede ser tanto de beneficio preventivo como terapéutico en la prevención de AD. II. ESTUDIO DE LA RESPUESTA DE LA DOSIS Grupos de ratones hembras Swiss Webster, de cinco semanas de edad (N=6 por grupo) se inmunizaron con 300, 100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.4 o 0.13 µg de Aß formulado en CFA/IFA administrado intraperitonealmente. Se dieron tres dosis a intervalos de dos semana seguido por una cuarta dosis un mes después. La primera dosis se emulsifico con CFA y las dosis restantes se emulsificaron con IFA. Los animales se sangraron 4-7 días después de cada inmunización iniciando después de la segunda dosis para mediciones de títulos de anticuerpo. Los animales en un subconjunto de tres grupos, aquellos inmunizados con 11, 33 o 300 µg de antígeno, se sangraron adicionalmente a intervalos aproximadamente mensuales durante cuatro meses seguido por la cuarta inmunización para monitorear la declinación de la respuesta a anticuerpos a través de un rango de dosis de formulaciones inmunogénicas. Estos animales recibieron una quinta inmunización final a los siete meses después de iniciar el estudio. Se sacrificaron una semana después para medir las respuestas de anticuerpos a AN1792 y para realizar los análisis toxicológicos . Se observó una respuesta de dosis de declinación a partir de 300 a 3.7 µg sin respuesta en las dos dosis más bajas. Los títulos medios de anticuerpo fueron aproximadamente 1:1000 después de tres dosis y aproximadamente 1:10,000 después de cuatro dosis de 11-300 µg de antígeno (ver Figura 5) . Los títulos de anticuerpo se elevaron drásticamente para todos pero los grupos de dosis más bajas siguieron la tercera inmunización con incrementos de variación de GMTs a partir de 5 a 25 veces. Se detectaron después las respuestas bajas a anticuerpo para aún los receptores de 0.4 µg. Los grupos de 1.2 y 3.7 µg tuvieron títulos comparables con GMTs de aproximadamente 1000 y las cuatro dosis mayores se aglomeraron junto con GMTs de aproximadamente 25,000, con la excepción del grupo de dosis de 33 µg con un GMT inferior de 3000. Después de la cuarta inmunización, los títulos incrementados fueron más modestos para la mayoría de los grupos. Existió una clara respuesta de dosis a través de los grupos de menor dosis de antígeno de 0.14 µg a 11 µg que varió de anticuerpos no detectables para los receptores de 0.14 µg a un GMT de 36,000 para los receptores de 11 µg. De nuevo, los títulos para los grupos de dosis mayores de 11 a 300 µg se aglomeraron juntos. Así, después de dos inmunizaciones, el título de anticuerpos dependió de la dosis de antígeno a través del amplio rango de 0.4 a 300 µg . Para la tercera inmunización, los títulos de las cuatro dosis mayores todos fueron comparables y permanecieron niveladas después de una inmunización adicional. Un mes después de la cuarta inmunización, los títulos fueron de 2 a 3 veces mayor en el grupo de 300 µg que aquellos medidos de las extracciones de sangre cinco días después de la inmunización (Figura 6) . Esta observación sugiere que el pico de la respuesta de anticuerpos anamnésticos ocurrió después de cinco días posteriores a la inmunización. Un incremento más modesto (50%) se observó en este tiempo en el grupo de 33 µg. En el grupo de dosis de 33 µg a los dos meses después de la última dosis, GMTs declinó gradualmente por aproximadamente 70%. Después de otro mes, la declinación fue menos gradual a 45% (100 µg) y aproximadamente 14% para las dosis 33 y 11 µg. Así, la tasa de declinación en títulos de anticuerpos circulantes después de la terminación de la inmunización pareció ser bifásica con una etapa de declinación al primer mes siguiente a la respuesta pico seguida por una tasa mas modesta de disminución después de esto. Los títulos de anticuerpos y las cinéticas de la respuesta de los ratones Swiss Webster son similares a aquellos de los ratones transgénicos PDAPP jóvenes heterocigóticos inmunizados de manera paralela. Las dosis efectivas para inducir una respuesta inmune en humanos es típicamente similar a las dosis efectivas en ratones. III. SELECCÓN DE LA EFICACIA TERAPÉUTICA CONTRA AD ESTABLECIDA Este ensayo se diseñó para probar los agentes inmunogénicos para la actividad para detener o invertir las características neuropatológicas de la AD en animales maduros. Las inmunizaciones con Aß de 42 aminoácidos de longitud (A?1792) iniciaron en un punto de tiempo cuando las placas amiloides ya se encontraban presentes en los cerebros de los ratones PDAPP. A través del tiempo utilizado en este estudio, los ratones PDAPP no tratados desarrollaron varios cambios neurodegenerativos que se asemejan a aquellos encontrados en AD (Games et al . , supra y Johnson-Wood et al . ; Proc . Nati . Acad. Sci . USA 94, 1550-1555 (1997)). La deposición de Aß en las placas amiloides se asocia con una respuesta neuronal íy?- kh.ll á'..¿.t. degenerativa que consiste de elementos axonales y dendríticos aberrantes, llamados neuritis distróficas. Los depósitos amiloides que están rodeados por y contienen neuritis distrófica se llaman placas neuríticas. En ambos ratones AD y PDAPP, las neuritis distróficas tienen una distinta estructura globular, son inmunoreactivos con un panel de anticuerpos que reconoce los componentes APP y citoesqueletales y despliegan cambios complejos sub-celulares degenerativos a nivel ultra-estructural. Estas características permiten mediciones relevantes de la enfermedad, selectivas y reproducibles de formación de placa neurítica en los cerebros PDAPP. El componente neuronal distrófico de las placas neuríticas de PDAPP se visualiza fácilmente con un anticuerpo específico para APP humano (anticuerpo monoclonal 8E5) y se mide fácilmente por análisis de imagen asistido por computadora. Por lo tanto, además de medir los efectos de AN1792 en al formación de la placa amiloide, medimos el efecto de este tratamiento en el desarrollo de distrofia neurítica. Los astrocitos y la microglia son células no neuronales que responden y reflejan el grado de daño neuronal. Los astrocitos GFAP positivos y la microglia MHCII positiva se observa comúnmente en AD y su actividad se incrementa con la severidad de la enfermedad. Por lo tanto, también monitoreamos el desarrollo de astrocitocis y í A.l. Mj? microgliosis reactivas en los ratones tratados con AN1792. A. Materiales y Métodos Cuarenta y ocho, ratones PDAPP hembras heterocigóticas, de 11 a 11.5 meses de edad, obtenidas de Charles River, se dividieron aleatoriamente en dos grupos: 24 ratones para inmunizarse con 100 µg de AN1792 y 24 ratones para inmunizarse con PBS, cada uno combinado con adyuvante de Freund. Los grupos de AN1792 y PBS se dividirán de nuevo cuando alcanzaron -15 meses de edad. A los 15 meses de edad aproximadamente la mitad de cada grupo de los animales tratados con AN1792 y PBS se eutanizaron (n=10 y 9, respectivamente) , el resto continuó para recibir las inmunizaciones hasta la terminación a ~18 meses (n=9 y 12) , respectivamente) . Un total de ocho animales (5 AN1792, 3 PBS) murieron durante el estudio. Además de los animales inmunizados, se incluyeron ratones de un año de edad (n=10) , 15 meses de edad (n=10) y 18 meses de edad (n=10) sin tratar con PDAPP para la comparación en la medición de los niveles en cerebro de Aß y APP en ELISAS; los animales de un año de edad también se incluyeron en los análisis inmuno-histoquímicos . La metodología fue como en el Ejemplo I, a menos que se indique de otra manera. El lote 12 de péptidos US y el lote de Péptidos California ME0339 de AN1792 se utilizaron para preparar el antígeno para seis administraciones de inmunización antes del punto de tiempo 15 meses. Los lotes de Péptidos California ME0339 y ME0439 se utilizaron para las tres inmunizaciones adicionales administradas entre los 15 y 18 meses. Para las inmunizaciones, 100 µg de AN1792 en 200 µg de PBS o PBS solo se emulsificaron 1:1 (vol: vol) con Adyuvante de Freund Completo (CFA) o Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) o PBS en un volumen final de 400 µl . La primera inmunización se suministró con CFA como adyuvante, las siguientes cuatro dosis se dieron con IFA y las cuatro dosis finales con PBS solo sin agregar adyuvante. Se dieron un total de nueve inmunizaciones durante el periodo de siete meses en un programa de dos veces a la semana para las primeras tres dosis seguidas por un intervalo de cuatro veces por semana para las inyecciones restantes. El grupo tratado cuatro veces al mes se eutanizó a los 15 meses de edad, que recibieron únicamente las primeras 6 inmunizaciones. B. Resultados 1. Efectos del Tratamiento Aß42 (AN1792 ) en Carga Amiloide Los resultados del tratamiento A?1792 en carga amiloide cortical determinados por análisis de imagen cuantitativa se muestran en la Figura 7. El valor medio de la carga amiloide cortical fue 0.28% en un grupo de ratones PDAPP de 12 meses de edad no tratados, un valor representativo de la carga de placa en ratones al inicio del estudio. A los 18 meses, la carga amiloide se incrementó en 17 veces a 4.87% en ratones tratados con PBS, mientras los ratones tratados con AN1792 tuvieron una carga amiloide grandemente reducida de solo 0.01%, notablemente menor de los de 12 meses no tratados y los grupos de 15 y 18 meses tratados con PBS. La carga amiloide se redujo significativamente en los receptores AN1792 tanto en 15 (96% de reducción; p=0.003) y 18 meses (reducción >99%; p=0.0002). Típicamente, la deposición amiloide cortical en ratones PDAPP inicia en las cortezas frontal y retroespinal (RSC) y progresa en dirección lateral-ventral hasta involucrar las cortezas temporal y entorinal (EC) . Poco o ningún amiloide se encontró en la EC de ratones de 12 meses de edad, la edad aproximada a la que se administró primero AN1792. Después de 4 meses de tratamiento AN1792, la deposición amiloide disminuyó grandemente en el RSC y el involucramiento progresivo de la EC se eliminó completamente mediante el tratamiento AN1792. Esta ultima observación mostró que AN1792 detuvo completamente la progresión del amiloide que pudo invadir normalmente las cortezas temporal y ventral, así como detener o posiblemente invertir la deposición en la RSC. Los efectos profundos del tratamiento AN1792 en desarrollar carga amiloide cortical en los ratones PDAPP se la *?tAA (-*? *Ái?t.. ? ..^A. -.<>.- "-¿...¡tJ&J?.y, demostró adicionalmente por el grupo de 18 meses, que habían sido tratados durante siete meses. Una ausencia casi completa de amiloide cortical se encontró en los ratones tratados con AN1792, con una carencia total de placas difusas, así como una reducción en los depósitos compactados. 2. Cambios Celulares y Morfológicos Asociados al Tratamiento con Aß42 (AN1792) Se encontró una población de células positivas a Aß en regiones del cerebro que contenían típicamente depósitos amiloides. Remarcablemente, en varios cerebros de receptores AN1792, se encontró muy poca o ninguna placa amiloide cortica extracelular. La mayoría de la inmunoreactividad Aß pareció estar contenida dentro de las células con mayor soma lobular o aglomerado. Fenotípicamente, estas células se asemejan a microglia o monocitos activados. Estas fueron inmunoreactivas con anticuerpos que reconocen los ligandos expresados por monocitos y microglia activada (MHCII y CD llb) y se asociaron ocasionalmente con la pared o lumen de los vasos sanguíneos . La comparación de secciones adyacentes cercanas etiquetadas con anticuerpos específicos Aß y MHC II revelaron que patrones similares de estas células fueron reconocidos por ambas clases de anticuerpos. El examen detallado de los cerebros tratados con AN1792 revelaron que las células positivas a MHC II estuvieron restringidas a la vecindad del remanente amiloide limitado en estos animales.

J?Jí-*-fdtf *. - . ^^^¿á^^^&tf. ^^ g^ü^^ Bajo las condiciones de fijación empleadas, las células no fueron inmunoreactivas con anticuerpos que reconocieron los ligandos de las células T (CD3, CD3e) o células B (CD45RA, CD45RB) o antígenos comunes a leucocitos (CD45) , pero reaccionaron con un anticuerpo que reconoció la leucocialina (CD43) con reacciones cruzadas con monocitos. Ninguna de tales células se encontró en ninguno de los ratones tratados con PBS . Los ratones PDAPP desarrollaron invariablemente deposiciones amiloides pesadas en la capa molecular externa de las circunvoluciones dentadas del hipocampo. La deposición forma una línea distinta dentro de la trayectoria perforante, una sub-región que contiene clásicamente placas amiloides en AD. La apariencia característica de estos depósitos en ratones tratados con PBS se asemeja a las previamente caracterizadas en los ratones PDAPP no tratados. La deposición amiloide consiste tanto de placas difusas como compactas en una banda continua. En contraste, varios de los cerebros de ratones tratados con AN1792 se alteró drásticamente este patrón. La deposición amiloide en el hipocampo ya no contuvo amiloide difuso y los patrones en banda se rompieron completamente. En su lugar, varias de las estructuras punteadas inusuales estuvieron presentes al activar con anticuerpos anti-Aß, varios de los cuales parecen estar en células que contienen amiloide. >it? l8 ljffll |lMl I I ' ni r ?t?y j t .«...¿««aritos.

Las células positivas a MHC II se observaron frecuentemente en la vecindad del amiloide extracelular en loas animales tratados con AN1792. El patrón de asociación de las células positivas a Aß con el amiloide fue muy similar en varios cerebros de los ratones tratados con AN1792. La distribución de estas células monocíticas a la proximidad del amiloide depositado y estuvo totalmente ausente de las otras regiones del cerebro sin placas Aß . El análisis de imagen cuantitativo de las secciones etiquetadas con MHC II y MAC-I revelaron una tendencia hacia la inmunoreactividad incrementada en el RSC y el hipocampo de los ratones tratados conAN1792 comparado al grupo PBS que alcanzó significancia con la medición de la reactividad de MAC 1 en el hipocampo . Estos resultados son indicativos de la remoción mediada por células activas del amiloide en regiones del cerebro que llevan placas. 3. Efectos de A?1792 en Niveles Aß : Determinaciones con ELISA (a) Niveles corticales En ratones PDAPP no tratados, el nivel medio del total de Aß en la corteza a los 12 meses fue de 1,600 ng/g, el cual se incrementó hasta 8,700 ng/g a los 15 meses (Tabla 4) . A los 18 meses el valor fue de 22,000 ng/g, un incremento de más de 10 veces durante el curso de tiempo del Í^..?.?,?,??.l?M Ljti.a, .-. ^- -L-iHMifLifeii ci-A.ujjite.ifcA ... . . . . . ... ^»u ^.^j^I JM¿µj*— J-.jjtiiáji lfafai iij. experimento. Los animales tratados con PBS tuvieron 8,600 ng/g total de Aß a los 15 meses el cual se incrementó a 19,000 ng/g a los 18 meses. En contraste, los animales tratados con AN1792 tuvieron 81% menos Aß total a los 15 meses (1,600 ng/g) que el grupo inmunizado con PBS. Se encontró significativamente menos Aß total (p=0.0001) (5,200 ng/g) a los 18 meses cuando los grupos AN1792 y PBS se compararon (Tabla 4) , representando un 72% de reducción en el Aß que de otra manera estaría presente. Se obtuvieron resultados similares cuando los niveles corticales de Aß42 se compararon, es decir, que los grupos tratados con AN1792 contuvieron mucho menos Aß42, pero en este caso la diferencia entre los grupos Aß42 y PBS fue significativa tanto a los 15 meses (p=0.04) como a los 18 meses (p=0.0001, Tabla 4). Tabla 4: Niveles Medios de Aß (ng/g) en Corteza NO TRATADOS PBS AN1792 *p= 0.0412 **p= 0.0001 (b) Niveles en Hipocampo En los ratones PDAPP no tratados, los niveles medios en hipocampo del total de Aß a los doce meses de edad j..y. ?.^^^. fueron 15,000 ng/g lo cual se incrementó a 51,000 ng/g a los 15 meses y además a 81,000 ng/g a los 18 meses (Tabla 5). De manera similar, los ratones inmunizados con PBS mostraron valores de 40,000 ng/g y 65,000 ng/g a los 15 meses y 18 meses respectivamente. Los animales inmunizados con AN1792 exhibieron menos Aß total, específicamente 25,000 ng/g y 51,000 ng/g en los puntos de tiempo 15 meses y 18 meses respectivos. El valor del grupo tratado con AN1792 a los 18 meses fue significativamente inferior que aquel del grupo tratado con PBS (p=0.0105; Tabla 5). Las mediciones de Aß42 dieron el mismo patrón de resultados, es decir que los niveles en el grupo tratado con AN1792 fueron significativamente menores que en el grupo PBS (39,000 ng/g vs . 57,000 ng/g, respectivamente; p=0.002) en la evaluación a los 18 meses (Tabla 3) . Tabla 5 : Niveles Medios de Aß (ng/g) en Hipocampo NO TRATADOS PBS AN1792 *p= 0.0105 **p= 0.0022 (c) Niveles en Cerebelo En los ratones PDAPP no tratados de 12 meses, el ttfcJi LJ nivel cerebelar medio de Aß fue de 15 ng/g (Tabla 6) . A los 15 meses, esta median se incrementó a 28 ng/g y a los 18 meses se elevó a 35 ng/g. Los animales tratados con PBS mostraron un valor medio total de Aß de 21 ng/g a los 15 meses y 43 ng/g a los 18 meses. Los animales tratados con AN1792 se encontró que tenían 22 ng/g total de Aß a los 15 meses y significativamente menos (p=0.002) Aß total a los 18 meses (25 ng/g) que el grupo PBS correspondiente (Tabla 6) . Tabla 6 : Niveles Medios de Aß (ng/g) en Cerebelo NO TRATADOS PBS AN1792 *p= 0.0018 4. Efectos del Tratamiento con AN1792 en Niveles de APP APP-a y la molécula APP de longitud total ambas contenían todo o parte de la secuencia Aß y podían impactarse potencialmente por la generación de una respuesta inmune dirigida por AB1792. En los estudios hasta la fecha se ha notado un leve incremento en los niveles de APP a medida que se incrementó la neuropatología en los ratones PDAPP. En la corteza, los niveles de ya sea APP-a/FL (longitud total) o APP-a no cambiaron esencialmente por el tratamiento con la excepción de que APP-a se redujo por 19% en el punto de tiempo de 18 meses en el grupo tratado con AN1792 vs . el tratado con PBS . Los valores de APP en los tratados con AN1792 a los 18 meses no fueron significativamente diferentes de los valores de los grupos de 12 meses y 15 meses no tratados y los de 15 meses de PBS. En todos los casos los valores de APP permanecieron dentro de los rangos que se encuentran normalmente en los ratones PDAPP. 5. Efectos del Tratamiento con AN1792 en Patología Neurodegenerativa y Gliótica La carga de placa neurítica se redujo significativamente en la corteza frontal de los ratones tratados con AN1792 comparado al grupo PBS tanto a los 15 (84%; p=0.03) como a los 18 (55%; p=0.01) meses de edad (Figura 8) . El valor medio de la carga de placa neurítica se incrementó de 0.32% a 0.49% en el grupo PBS entre los 15 y 18 meses de edad. Esto contrastó con el desarrollo grandemente reducido de las placas neuríticas en el grupo AN1792, con valores de carga de placa neurítica media de 0.05% y 0.22% en los grupos de 15 y 18 meses, respectivamente. La inmunización con AN1792 pareció bien tolerada y la astrocitosis reactiva también se redujo significativamente en los RSC de los ratones tratados con AN1792 cuando se comparó al grupo PBS tanto a los 15 (56%; p=0.011) como a los 18 (39%; p=0.028) meses de edad (Figura 9). Los valores A medios del porcentaje de astrositos en el grupo PBS se incrementó entre los 15 y 18 meses desde 4.26%a 5.21%. El tratamiento con AN1792 suprimió el desarrollo de astrocitosis en ambos puntos de tiempo a 1.89% y 3.2%, respectivamente. Esto sugiere que los neutrófilos no se están dañando por el proceso de depuración. 6. Respuesta de Anticuerpos Como se describió anteriormente, a los once meses de edad, los ratones PDAPP heterocigóticos de once meses de edad (?=24) recibieron una serie de 5 inmunizaciones de lOOµg de A?1792 emulsificado con adyuvante de Freund y se administró intraperitonealmente en las semanas 0, 2, 4, 8 y 12 y una sexta inmunización con PBS solo (sin adyuvante de Freund) en la semana 16. Como un control negativo, un conjunto paralelo de 24 ratones transgénicos igualados en edad recibieron inmunizaciones de PBS emulsificado con los mismos adyuvantes y suministrados con el mismo programa. Los ratones se sangraron dentro de los tres a siete días después de cada inmunización iniciando después de la segunda dosis. Las respuestas de anticuerpos a A?1792 se midió por ELISA. Los títulos medios geométricos (GMT) para los animales que se inmunizaron con A?1792 fueron aproximadamente 1,900, 7,600 y 45,000 después de la segunda, tercera y última (sexta) dosis respectivamente. Ningún anticuerpo específico de Aß se midió en los animales control después de la sexta inmunización. llá .ái- íL* *.f- ...á... tti ^fc^feLJgfe ^¿^^^ í .St ..y . y.. . i .^.i k .l Aproximadamente la mitad de los animales se trataron durante tres meses adicionales, recibiendo inmunizaciones aproximadamente en la semanas 20, 24 y 27. Cada una de estas dosis se suministró solo con el vehículo de PBs sin el adyuvante de Freund. Los títulos medios de anticuerpos permanecieron sin cambio durante este periodo de tiempo. De hecho, los títulos de anticuerpos parecieron permanecer estables a partir del cuarto al octavo sangrado que corresponde a un periodo que cubre de la quinta a la novena inyecciones. Para determinar si los anticuerpos específicos de Aß producidos por la inmunización que se detectaron n el suero de los ratones tratados con AN1792 también estaban asociados con el amiloide de cerebro depositado, un subconjunto de secciones de los ratones tratados con AN1792 y PBS se hicieron reaccionar con un anticuerpo específico para IgG de ratón. En contraste al grupo PBS, las placas Aß en los cerebros tratados con AN1792 se cubrieron con IgG endógena. Esta diferencia entre los dos grupos se observó en ambos grupos de 15 y 18 meses. Particularmente impresionante fue la carencia de etiquetado en el grupo PBS, a pesar de la presencia de una carga amiloide pesada en estos ratones. Estos resultados muestran que la inmunización con una proteína Aß sintética genera anticuerpos que reconocen y se unen in vivo al Aß de las placas amiloides ¡fatAAa,?.,fct.a. ~-?»á?AlM.tué?&*L~llto&AlJÍSly . ..ytllÁr&lÁ?? lísA .yiy,_Í 7. Respuestas Inmunes Mediadas Celularmente Se recuperaron los bazos de nueve ratones PDAPP inmunizados con AN1792 e inmunizados con PBS de 18 meses de edad siete días después de la novena inmunización. Se aislaron las células del bazo y se cultivaron durante 72 horas en la presencia de Aß40, Aß42 o Aß40-1 (proteína de orden inverso) . El mitógeno Con A sirvió como un control positivo. La respuesta óptima se obtuvo con proteína >1.7 µM. Las células de todos los nueve animales tratados con AN1792 proliferaron en la respuesta a ya sea la proteína Aß- 40 o Aß-42, con iguales niveles de incorporación de ambas proteínas (Figura 10, Panel Superior). No hubo respuesta para la proteína inversa Aß40-1. Las células de los animales control no respondieron a ninguna de las proteínas Aß (Figura 10, Panel Inferior) . C. Conclusión Los resultados de este estudio muestran que la inmunización con AN1792 de los animales PDAPP que poseían depósitos amiloides existentes descendieron y previnieron la deposición amiloide progresiva y retardaron los cambios neuropatológicos consecuentes en los cerebros de ratón PDAPP maduros. Las inmunizaciones con AN1792 esencialmente desarrollaron amiloide detenida en estructuras que normalmente podrían sucumbir a la amiloidosis. Así, la administración del péptido Aß tiene beneficio terapéutico en el tratamiento de AD. IV. SELECCIÓN DE LOS FRAGMENTOS Aß 100 ratones PDAPP de 9-11 meses se inmunizaron con 9 regiones diferentes de APP y Aß para determinar que epítopes portaban la respuesta eficaz. Los 9 diferentes antígenos y un control se inyectaron i.p. como se describió anteriormente. Los antígenos incluían cuatro conjugados humanos de péptido Aß 1-12, 13-28, 32-42, 1-5 todos conjugados a IgG de oveja anti-ratón a través de un enlace de cisteína; un aminoácido de polipéptido APP 592-695, Aß 1-40 humano agregado y Aß 25-35 humano agregado y Aß42 de roedor agregado. El Aß42 agregado y PBS se utilizaron como controles positivo y negativo, respectivamente. Se utilizaron diez ratones por grupo tratado. Los títulos se monitorearon como anteriormente y los ratones se eutanizaron al final de 4 meses de inyecciones. La histoquímica, niveles de Aß y los análisis toxicológicos se determinaron post mortem. A. Materiales y Métodos 1. Preparación de Antígenos Preparaciones de péptidos Aß conjugados: Se prepararon cuatro conjugados de péptido Aß humano (residuos de aminoácido 1-5, 1-12, 13-28 y 33-42, cada uno se conjugó a IgG de oveja anti-ratón) mediante acoplamiento a través de una cisteína agregada al péptido Aß utilizando el reactivo de cruzamiento sulfo-EMCS. Los derivados del péptido Aß se sintetizaron con las siguientes secuencias finales de aminoácido. En cada caso, la ubicación del residuo de cisteína insertado se indica por subrayado. El derivado de 5 péptido Aßl3-28 también tuvo dos residuos de glicina agregados antes de la cisteína carboxilo terminal como se indica . Péptido Aßl-12 NH2-DAEFRHDSGYEVC-C00H (SEQ ID NO: 30) Péptido Aßl-5 NH2-DAEFRC-C00H (SEQ ID NO: 31) 10 Péptido Aß33-42 NH2-C-amino-ácido hepatnoico-GLMVGGWIA- COOH (SEQ ID NO: 32) Péptido Aßl3-28 Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH (SEQ ID NO: 33) Para preparar la reacción de conjugación, se 15 dializaron diez mg de IgG de oveja anti-ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratories) durante la noche contra amortiguado de borato de sodio 10 mM, pH 8.5. Los anticuerpos dializados se concentraron entonces a un volumen de 2 ml utilizando un tubo Amicon Centripep. Diez mg de 20 sulfo-EMCS. Se dializó [N(?-maleimidocuproiloxi) succinimida] (Molecular Sciences Co.) en un ml de agua desionizada. Se agregó gota a gota un excedente de sulfo-EMCS 40 veces molar con agitación a la IgG de oveja anti-ratón y después la 25 solución se agitó durante diez minutos adicionales. La IgG de oveja anti-ratón activada se purificó y se cambió de amortiguador al pasar por una columna de filtración de gel de 10 ml (Pierce Presto Column, obtenida de Pierce Chemical) equilibrada con NaP04 0.1 M, EDTA 5 mM, pH 6.5. Se extrajeron anticuerpos que contenían fracciones, identificadas por absorbencia a 280 nm y se diluyeron a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, utilizando 1.4 mg por OD según el coeficiente de extracción. Se disolvió un excedente del péptido Aß 40 veces molar en 20 ml de NaP04 10 mM, pH 8.0, con la excepción del péptido Aß33-42 para el cual se disolvieron primero 10 mg en o.5 ml de DMSO y después se diluyó en 20 ml con el amortiguador NaP04 10 mM. Las soluciones de péptido se agregaron cada una a 10 ml de IgG de oveja anti-ratón activada y se osciló a temperatura ambiente durante 4 horas. Los conjugados resultantes se concentraron a un volumen final de menos de 10 ml utilizando un tubo Amicon Centripep y se dializó entonces contra PBS para amortiguar el intercambio de amortiguador y retirar el péptido libre. El conjugado se pasó a través de filtros de tamaño de poro de 0.22 µm para la esterilización y después en alícuotas en fracciones de 1 mg y se almacenó congelado a - 20°C. Las concentraciones de los conjugados se determinaron utilizando el ensayo de proteína BCA (Pierce Chemicals) con IgG de caballo para la curva estándar. La conjugación se documentó mediante el incremento de peso molecular de los Ííir L,.á.il ?y .Í .. péptidos del conjugado con relación a la de la IgG de oveja anti-ratón activada. El conjugado de IgG de oveja anti-ratón Aß 1-5 fue un grupo de dos conjugaciones, el resto fue de una sola preparación. 2. Preparación de péptidos Aß agregados. Se solubilizaron en fresco péptidos humanos 1-40 (AN1528; California Peptides Inc., Lote ME0541) , humanos 1-42 (AB1792; California Peptides Inc. Lotes ME0339 y ME0439) , humanos 25-35 y de roedor 1-42 (California Peptides Inc., Lote ME0218) para la preparación de cada conjunto de inyecciones a partir de polvos liofilizados que se habían almacenado es parcialmente a -20°C. Para este propósito, se agregaron dos mg de péptido a 0.9 ml de agua desionizada y la mezcla se agitó para generar una solución o suspensión relativamente uniforme. De los cuatro, AN1528 fue el único péptido soluble en esta etapa. Una alícuota de 100 µl de PBS 10X (PBS IX: NaCl 0.15 M, fosfato de sodio 0.01 M, pH 7.5) se agregó entonces en cada punto AN1528 empezó a precipitarse. La suspensión se agitó de nuevo y se incubó durante la noche a 37°C para utilizarse al siguiente día. Preparación de la proteína pBx6 : Un plásmido de expresión que codifica a pBx6, una proteína de fusión que consiste de la secuencia líder polimerasa N-terminal del bacteriófago MS-2 de 100 aminoácidos seguida por los aminoácidos 592-695 de APP (ßAPP) se construyó como se - describe por Oltersdorf et al . , J. Biol. Chem. 265, 4492-4497 (1990). El plásmido se transfectó en E.coli y la proteína se expresó después de la inducción del promotor. La bacteria se lisó en urea 8M y el pBx6 se purificó parcialmente mediante SDS PAGE preparatorio. Las fracciones que contenían pBx6 se identificaron por Western blot utilizando un anticuerpo policlonal anti-pBx6 de conejo, se extrajo, se concentró utilizando tubo Amicon Centripep y se dializó contra PBS. La pureza de la preparación, estimada por SDS PAGE teñida con Coomassie azul, fue de aproximadamente 5 a 10%. B. Resultados y Discusión 1. Diseño del Estudio Se obtuvieron cien ratones transgénicos PDAPP heterocigóticos hembras y machos de nueve a once meses de edad de Charles River Laboratory y Taconic Laboratory. Los ratones se clasificaron en diez grupos para inmunizarse con regiones diferentes de Aß o APP combinados con adyuvante de Freund. Los animales se distribuyeron para acoplar el género, edad, origen y fuente de los animales dentro del grupo tan cercanamente como fue posible. Los antígenos incluyeron cuatro péptidos Aß derivados de la secuencia humana 1-5, 1-12, 13-28 y 33-42, cada uno conjugado a IgG de oveja anti-ratón; cuatro péptidos Aß agregados, humano 1-40 (AN1528) , humano 1-42 (AN1792) , humano 25-35 y de roedor 1-42; y un polipéptido de fusión, designado como pBx6 , que - lllÉiiLl* * l«-* - .*.... -yy^yy*. yjt ^anl ?ti^íj contenía residuos de aminoácido APP 592-695. Se inmunizó un décimo grupo con PBS combinado con adyuvante como control . Para cada inmunización, 100 µg de cada péptido Aß en 200 µl de PBS o 200 µg de la APP derivada de pBx6en el mismo volumen de PBS o PBS solo, se emulsificaron 1:1, (vol/vol) con Adyuvante Completo de Freund (CFA) en un volumen final de 400 µl para la primera inmunización, seguida por un refuerzo de la misma cantidad del inmunógeno en adyuvante Incompleto de Freund (IFA) por las subsecuentes cuatro dosis y con PBS para la dosis final . Las inmunizaciones se suministraron intraperitonealmente en un programa cada dos semana para las primeras tres dosis, después un programa mensual después de esto. Los animales se sangraron de cuatro a siete días después de cada inmunización iniciando después de la segunda dosis para la medición de títulos de anticuerpo. Los animales se eutanizaron aproximadamente una semana después de la dosis final . 2. Niveles de Aß y APP en el Cerebro Después de aproximadamente cuatro meses de inmunización con varios péptidos Aß o el derivado de APP, los cerebros se retiraron a partir de animales prefundidos en solución salina. Se preparó un hemisferio para análisis histoquímico y el segundo se utilizó para la cuantificación de los niveles de Aß y APP. Para medir las concentraciones de varias formas del péptido beta amiloide y la proteína precursora amiloide, el hemisferio se desecó y se prepararon homogenados de las regiones hipocampal, cortical y cerebelar en guanidina 5 M. Estas se diluyeron y se cuantificaron los niveles de amiloide y APP al compararlos a una serie de diluciones de estándares de péptido Aß o APP de concentraciones conocidas en un formato ELISA. La concentración media del Aß total para el grupo control inmunizado con PBS fue 5.8 mayor en el hipocampo que en la corteza (mediana del tejido hipocampal de 24,318 ng/g comparada a 4,221 ng/g de la corteza) . El nivel medio en el cerebelo del grupo control (tejido 23.4 ng/g) fue aproximadamente 1,000 veces inferior que en el hipocampo. Estos niveles son similares a aquellos que hemos reportado previamente para ratones transgénicos PDAPP heterocigóticos de esta edad (Johson- Woods et al . , 1997, supra) . Para la corteza, un subconjunto de grupos de tratamiento tuvieron niveles medios totales de Aß y Aßl-42 que difieren significativamente de aquellos del grupo control (p<0.05), esos animales recibieron conjugado de péptido Aßl-42 o el Aßl-5 de roedor AN1792, como se muestra en la Figura 11. Los niveles medios de Aß total se redujo por 75%, 79% y 61%, respectivamente, comparados al control para esos grupos de tratamiento. No hubo correlaciones discernibles entre los títulos de anticuerpo específico de Aß y los niveles de Aß en la región cortical del cerebro para ninguno de los grupos. ., .» *.*-?to??*A..i¡?Í En el hipocampo la reducción media del Aß asociada con el tratamiento de AN1792 (46%, p=0.0543) no fue mayor que la observada en la corteza (75%, p=0.0021). Sin embargo, la magnitud de la reducción fue mucho mayor en el hipocampo que en la corteza, una reducción neta de 11.186 ng/g de tejido en el hipocampo versus 3,171 ng/g de tejido en la corteza. Para los grupos de animales que recibieron Aßl-42 o Aßl-5 de roedor, los niveles medios totales de Aß se redujeron por 36% y 26%, respectivamente. Sin embargo, dado el tamaño pequeño del grupo y la elevada variabilidad de los niveles de péptido amiloide de animal a animal dentro de ambos grupos, estas reducciones no fueron significativas. Cuando se midieron los niveles de Aßl-42 en el hipocampo, ninguna de las reducciones inducidas por el tratamiento alcanzaron significancia. Así, debido a la carga de Aß más pequeña en la corteza, los cambios en esta región son un indicador más sensible de los efectos del tratamiento. Los cambios en los niveles de Aß medidos por ELISA en la corteza son similares, pero no idénticos, a los resultados del análisis inmunohistoquímico (ver más adelante) . También se midió el Aß total en el cerebelo, una región típicamente afectada de manera mínima con la patología de AD. Ninguna de las concentraciones medias de Aß de ninguno de los grupos inmunizados con los diferentes péptidos Aß o el derivado de APP difirieron de aquellos del grupo control en esta región del cerebro. Estos resultados sugieren que los niveles no patológicos de Aß no se afectan por el tratamiento. También se determinó la concentración de APP por ELISA en la corteza y cerebelo a partir de ratones tratados y de control. Se utilizaron dos diferentes ensayos de APP. El primero, designado APP-a/FL, reconoce tanto APP-alfa (a, la secretada a partir de APP que se había dividido dentro de la secuencia Aß) y las formas de longitud total (FL) de APP, mientras el segundo reconoce solo APP-a. En contraste a la disminución asociada al tratamiento de Aß en un subconjunto de grupos de tratamiento, los niveles de APP no cambiaron en todos de los tratados comparados a los animales de control. Estos resultados indican que las inmunizaciones con el péptido Aß no se agotan por APP; el efecto del tratamiento es específico de Aß . En resumen, los niveles totales de Aß y Aßl-42 se redujeron significativamente en la corteza por el tratamiento con los conjugados AN1792, Aßl-42 o Aßl-5 de roedor. En el hipocampo, el Aß total se redujo significativamente solo por el tratamiento con AN1792. Ningún otro cambio asociado con el tratamiento en los niveles de APP en las regiones del hipocampo, corteza o cerebelo fue significativo. 2. Análisis Histológico Los cerebros de un subconjunto de seis grupos se prepararon para análisis inmunohistoquímico, tres grupos inmunizados con los conjugados de péptido Aß, Aßl-5, Aßl-11 y Aßl3-28; dos grupos se inmunizaron con AN1792 y AN1528 agregados de Aß de longitud total y el grupo control tratado con PBS. Los resultados del análisis de imagen de la carga amiloide en las secciones de cerebro de estos grupos se muestran en la Figura 12. Existieron reducciones significativas de la carga amiloide en las regiones torticales de tres de los grupos de tratamiento versus los animales de control. La mayor reducción de la carga amiloide se observó en el grupo que recibió AN1792 en donde el valor medio se redujo por 97% (p=0.001) . También se observaron reducciones significativas para aquellos animales tratados con AN1528 (95%, p=0.005) y el conjugado de péptido Aßl-5 (67%, p=0.02) . Los resultados obtenidos por la cuantificación del Aß total o Aßl-42 por ELISA y la carga amiloide por análisis de imagen difieren en algún grado. El tratamiento con AN1528 tuvo un impacto significativo en el nivel de la carga amiloide cortical cuando se midió por análisis de imagen cuantitativo pero no en la concentración del Aß total en la misma región cuando se midió por ELISA. La diferencia entre estos dos resultados probablemente se debe a las especificidades del ensayo. El análisis de imagen únicamente mide el Aß insoluble agregado en las placas. En contraste, ELISA mide todas las formas de Aß, tanto la soluble como la insoluble, monomérica y agregada. Ya que la patología de la enfermedad se considera que se asocia con la forma insoluble de Aß asociada a la placa, la técnica de análisis de imagen puede tener más sensibilidad para revelar los efectos de tratamiento. Sin embargo ya que el ensayo ELISA es más rápido y más fácil, es muy útil para propósitos de selección. Además, puede revelar que la reducción asociada al tratamiento de Aß es mayor para la asociada a la placa que para Aß total . Para determinar si los anticuerpos específicos de Aß producidos por la inmunización en los animales tratados reaccionan con el amiloide depositado en el cerebro, un subconjunto de las secciones de los animales tratados y los ratones de control se hizo reaccionar con anticuerpo específico para IgG de ratón. En contraste al grupo PBS, las placas que contenían Aß se cubrieron con IgG endógena para los animales inmunizados con los conjugados de péptido Aß, Aßl-5, Aßl-12 y Aßl3-28; y para AN1792 y AN1528 agregados de Aß de longitud total . Los cerebros de los animales inmunizados con los otros péptidos Aß o el péptido de APP pBx6 no se analizaron por este ensayo. 3. Medición de los títulos de anticuerpo Los ratones se sangraron de 4 a 7 días después de cada inmunización iniciando después de la segunda inmunización, para un total de cinco sangrados. Se midieron los títulos de anticuerpo como anticuerpo unido a Aßl-42 utilizando un sandwich ELISA con placas de plástico de múltiples cavidades cubiertas con Aßl-42. Como se muestra en la Figura 13, el pico de los títulos de anticuerpo se produjo después de la cuarta dosis para aquellas cuatro formulaciones de inmunización que produjeron los mayores títulos de anticuerpos específicos de AN1792 : AN1792 (pico GMT:94,647), AN1528 (pico GMT:88231), conjugado Aßl-12 (pico GMT:47,216) y Aßl-42 de roedor (pico GMT:10,766). Los títulos para estos grupos declinaron algo después de la quinta y sexta dosis. Para los cinco antígenos restantes los títulos pico se alcanzaron después de la quinta o sexta dosis y estos fueron de mucho mayor magnitud que aquellos de los cuatro grupos más elevados: conjugado de Aßl-5 (pico GMT:2,356), pBx6 (pico GMT: 1,986), conjugado de Aßl3-28 (pico GMT: 1,183), conjugado de Aß33-42 (pico GMT:658), Aß25-35 (pico GMT:125). También se midieron los títulos de anticuerpo contra los péptidos homólogos utilizando el mismo formato de sandwich ELISA para un subconjunto de los antígenos, aquellos grupos inmunozados con Aßl-5, Aßl3-28, Aß25-35, Aß33-42 o Aßl.42 de roedor. Estos títulos fueron aproximadamente los mismos de aquellos medidos contra Aßl-42 excepto para el inmunógeno Aßl-42 de roedor en cuyo caso los títulos de anticuerpo contra el inmunógeno homólogo fueron aproximadamente dos veces mayor. La magnitud del título de anticuerpos específico de AN1792 de ...^¿at^avm r é?rtfAuáA-animales individuales o los valores medios de los grupos de tratamiento no se correlacionaron con la eficacia medida según la reducción de Aß en la corteza. 4. Respuestas linfoproliferativas Se midió la linfoproliferación dependiente Aß utilizando células de bazo cosechadas aproximadamente una semana después del final, sexta inmunización. Las células recién cosechadas, 105 por cavidad, se cultivaron por cinco días en la presencia de Aßl-40 a una concentración de 5 µM para estimulación las células de un subconjunto de siete de los diez grupos también se cultivaron en la presencia del péptido inverso, Aß40-1. Como un control positivo, se cultivaron células adicionales con el mitógeno de célula T, PHA y como un control negativo se cultivaron células aún agregar péptido. Los linfocitos de la mayoría de los animales proliferaron en respuesta a PHA. No existió respuesta significativa al péptido inverso Aß40-1. Las células de los animales inmunizados con los péptidos Aß agregados más grandes, AN1792, Aßl-42 DE ROEDOR Y AN1528 proliferaron fuertemente cuando se estimularon con Aßl-40 con el mayor cpm en los recipientes de AN1792. Un animal en cada uno de los grupos inmunizados con conjugado Aßl-12, conjugado Aßl3-28 y Aß25-35 proliferaron en respuesta a Aßl.40. Los grupos restantes que recibieron conjugado Aßl-5, pBx6 conjugado Aß33-42 o PBS no tuvieron animales con respuesta estimulada por Aß . Los resultados se resumen en la Tabla 7 siguiente.

Estos resultados muestran que AN1792 Y AN1528 estimulan fuertemente las respuestas de las células T, más probablemente del fenotipo CD4+. La ausencia de una respuesta de las células T específica para Aß en los animales inmunizados con Aßl-5 no es sorprendente ya que los epítopes 10 de péptido reconocidos por las células T CD4+ son normalmente de aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, aunque pueden funcionar algunas veces con péptidos más cortos con menos eficiencia. Así la mayoría de los epítopes de célula T auxiliares para los cuatro péptidos conjugados residen probablemente en el socio conjugado de la IgG no en la región Aß . Esta hipótesis se soporta por la muy baja incidencia de las respuestas proliferativas para los animales en cada uno de estos grupos de tratamiento. Ya que el conjugado Aßl-5 fue efectivo al reducir significativamente el nivel de Aß en el cerebro, en la aparente ausencia de las células T específicas de Aß, la respuesta inmune del efector clave inducida por la inmunización con este péptido parece ser el anticuerpo. La carencia de células T y la baja respuesta de anticuerpos del péptido de fusión pBx6 , que comprende los aminoácidos 592-695 de APP que incluyen todos los residuos de Aß puede deberse a la pobre inmunogenicidad de esta preparación particular. La pobre inmunogenicidad de Aß25-35 agregado probablemente se debe a que el péptido a sido demasiado pequeño al que similarmente contiene una buen epítope de célula T para ayudar en la inducción de una respuesta de anticuerpo. Se anticipa que el conjugado de este péptido a una proteína portadora rendiría en más inmunogenicidad . V. Preparación de Anticuerpos Policlonales para Protección Pasiva Se inmunizaron 125 ratones transgénicos con Aß, más adyuvante y se eutanizaron a los 4-5 meses. Se recolectó la sangre de los ratones inmunizados. Se separó la IgG de otros componentes sanguíneos. Puede purificarse parcialmente los anticuerpos específicos para el inmunógeno mediante cromatografía de afinidad. Se obtuvo un promedio de aproximadamente 0.5-1 mg de anticuerpos específicos del inmunógeno por ratón, dando un total de 60-120 mg. VI. Inmunización Pasiva con anticuerpos para Aß Los grupos de ratones PDAPP de 7-9 meses de edad se inyectaron con 0.5 mg en PBS de anti-Aß policlonal o anti-Aß específico monoclonales como se muestra a continuación. Todas las preparaciones de anticuerpos se purificaron para tener niveles bajos de endotoxina. Los monoclonales pueden preparase contra un fragmento al inyectar el fragmento o formas más grandes de Aß en un ratón, preparando hibridomas y seleccionando los hibridomas para un anticuerpo que se une específicamente a un fragmento deseado de Aß sin unirse a otros fragmentos sin sobreposición de Aß Tabla 8 li. i.utA. *y.á.Á . .. , .felfea.

Los ratones se inyectaron i.p. según fue necesario por un periodo de cuatro meses para mantener una concentración de anticuerpos circulantes medidos por el título de ELISA mayores de 1/1000 definidos por ELISA para Aß42 u otro inmunógeno. Los títulos se monitorearon como anteriormente y los ratones se eutanizaron al final del sexto mes de inyecciones. Se realizó la histoquímica, niveles Aß y toxicología postmortem. Se utilizaron diez ratones por grupo. Los estudios adicionales de la inmunización pasiva se describen en los Ejemplos XI y XII más adelante. VII. Comparación de Diferentes Adyuvantes Este ejemplo compara CFA, a una emulsión aceite en agua y MPL para la capacidad de estimular una respuesta inmune . A. Materiales y Métodos 1. Diseño del estudio Cien cobayos hembras de la cepa Hartley de seis semanas de edad se obtuvieron de Elm Hill Breeding Laboratories, Chelmsford, MA, se clasificaron en diez grupos para inmunizarse con AN1792 o un derivado palmitoilado del mismo combinado con varios adyuvantes. Seis grupos recibieron inyecciones de AN1792 (33 µg a menos que se especifique de otra manera) combinado con a) PBS, b) adyuvante de Freund c) MPL, d) escualeno, e) MPL/escualeno, f) dosis baja de alumbre o g) dosis elevada de alumbre (300 µg de AN1792) . Dos grupos recibieron inyecciones de un derivado palmitilatado de AN1792 (33 µg) combinado con a) PBS o b) escualeno. Un décimo grupo final recibió solo PBS sin 5 antígeno o adyuvante adicional . Para el grupo que recibió adyuvante de Freund, la primera dosis se emulsificó con CFA y las cuatro dosis restantes con IFA. El antígeno se administró a una dosis de 33 µg para todos los grupos excepto para el grupo de alumbre de dosis elevada, que recibió 300 µg 10 de AN1792. Las inyecciones se administraron intraperitonealmente para CFA/IFA e intramuscularmente en el segmento posterior del cuadríceps de manera alternada en el lado derecho e izquierdo para todos los otros grupos. Las primeras tres dosis se dieron en un programa de cada 2 15 semanas segundo por dos dosis a intervalos mensuales) . La sangre se extrajo seis o siete días después de cada inmunización, iniciando después de la segunda dosis, para la medición de títulos de anticuerpos. 2. Preparación de Antígenos 20 Se agregaron dos mg de Aß42 (California Peptide, Lote ME0339) a 0.9 ml de agua desionizada y la mezcla se agitó para generar una suspensión relativamente uniforme. Se agregó una alícuota de 100 µl de PBS 10X ( PBS IX, NaCl 0.15 M, fosfato de sodio 0.01 M, pH 7.5). La suspensión se agitó 25 de nuevo y se incubó durante la noche a 37 °C para utilizarse al día siguiente. Se almacenó Aß-42 no utilizado desecado como un polvo liofilizado a -20°C. Se preparó un derivado palmitilatado de AN1792 al acoplar anhídrido palmítico, disuelto en dimetil formamida, al residuo amino terminal de AN1792 antes de retirar el péptido naciente a partir de la resina por tratamiento con ácido hidrofluórico . Para preparar la dosis de formulación inmunogénica con adyuvante de Freund Completo (CFA) (grupo 2) , 33 µg de AN1792 en 200 µl de PBS se emulsificaron 1:1 (vol:vol) con CFA en un volumen final de 400 µl para la primera inmunización. Para las inmunizaciones subsecuentes, el antígeno se emulsificó de manera similar con adyuvante de Freund Incompleto (IFA) . Para preparar las dosis de formulación con MPL para los grupos 5 y 8, se agregó polvo liofilizado (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) a 0.2% de trietilamina acuosa a una concentración final de 1 mg/ml y se agitó. La mezcla se calentó de 65 a 70°C durante 30 segundos para crear una suspensión uniforme ligeramente opaca de micelas. La solución se preparó en fresco para cada conjunto de inyecciones. Para cada inyección en el grupo 5, se mezclaron 33 µg de AN1792 en 16.5 µl de PBS, 50 µg de MPL (50µl) y 162 µl de PBS en un tuvo de borosilicato inmediatamente antes de su uso.

^^^^ Para preparar dosis de formulación con la emulsión aceite en agua baja, se agregó AN1792 en PBS a 5% de escualeno, 0.5% de Tween 80, 0.5% Span 85 en PBS para alcanzar una concentración final de dosis única de 33 µg de AN1792 en 250 µl (grupo 6) . La mezcla se emulsificó al pasar a través un dispositivo manual de dos cámaras de a5 a 20 veces hasta que las gotas de la emulsión parecieron estar aproximadamente igual en diámetro a una perla de látex estándar de 1.0 µm de diámetro cuando se observó bajo el microscopio. La suspensión resultante fue blanca lechosa opalescente. Las emulsiones se prepararon en fresco para cada serie de inyecciones. Para el grupo 8, se agregó MPL en 0.2% de trietilamina a una concentración de 50 µg por dosis para el escualeno y mezcla detergente para la emulsificación como se mencionó anteriormente. Para el derivado de palmitoilo (grupo 7) , se agregaron 33 µg por dosis de palmitoil-NH-Aßl-42 al escualeno y se agitó. Se agregaron entonces Tween 80 y Span 85 con agitación. La mezcla se agregó al PBS hasta alcanzar una concentración final de 5% de escualeno, 0.5% de Tween 80 0.5% de Span 85 y la mezcla se emulsificó como se anotó anteriormente. Para preparar las dosis de formulación con alumbre (grupos 9 y 10) , se agregó AN1792 en PBS a Alhidrogel (gel de hidróxido de aluminio, Achúrate, Westbury, NY) hasta alcanzar las concentraciones de 33 µg (dosis baja, grupo 9) o 300 µg (dosis alta grupo 10) AN1792 por 5 µg de alumbre en un volumen de dosis final de 250 µl . La suspensión se agitó suavemente durante 4 horas a temperatura ambiente. 3. Medición de títulos de anticuerpos Los cobayos se sangraron de seis a siete días después de la inmunización iniciando después de la segunda inmunización para un total de cuatro sangrados. Los títulos de anticuerpos contra Aß42 se midieron por ELISA como se describió en Materiales y Métodos Generales. 4. Preparación de Tejido Después de aproximadamente 14 semanas, todos los cobayos se eutanizaron mediante la administración de C02. Se recolectó el fluido cerebroespinal y los cerebros se retiraron y se desecaron tres regiones de cerebro para medir la concentración de la proteína Aß total utilizando ELISA. B. Resultados 1. Respuestas de anticuerpos Existió un amplio rango en la potencia de los diversos adyuvantes cuando se midieron según la respuesta de anticuerpos a AN1792 después de la inmunización. Como se muestra en la Figura 14, cuando se administró Anl792 en PBS, ningún anticuerpo se detectó después de dos o tres inmunizaciones y se detectaron respuestas insignificantes después de la cuarta y quinta dosis con títulos medios geométricos (GMTs) de solo aproximadamente 45. La emulsión .¿ ¡j^ aceite/agua indujo títulos modestos después de la tercera dosis (GMT 255) que se mantuvieron después de la cuarta dosis (GMT 301) y cayeron con la dosis final (GMT54) . Existió una clara respuesta de dosis de antígeno para AN1792 unida al alumbre con 300 µg siendo más inmunogénico en todos los puntos de tiempo que 33 µg. En el pico de la respuesta de anticuerpos, después de la cuarta inmunización, la diferencia entre las dos dosis fue de 43% con GMTs de aproximadamente 1940 (33 µg) y 3400 (300 µg) . La respuesta de anticuerpos a 33 µg de AN1792 más MPL fue muy similar a la generada con una dosis casi diez veces mayor de antígeno (300 µg) unido al alumbre. La adición de MPL a una emulsión aceite/agua disminuyó la potencia de la formulación con relación a la de MPL únicamente con el adyuvante a lo más al 75%. Un derivado palmitilatado de AN1792 fue completamente no inmunogénico cuando se administró en PBS y dio títulos modestos cuando se presentó en una emulsión aceite/agua con GMTs de 340 y 105 para el tercero y cuarto sangrados. Los títulos de anticuerpos más altos se generaron con adyuvante de Freund con un pico GMT de aproximadamente 87,000, un valor casi 30 veces mayor que los GMTs de las siguientes dos formulaciones más potentes, MPL y dosis alta de AN1792/alumbre . Los adyuvantes mas prometedores identificados en este estudio son MPL y alumbre. De estos dos, MPL parece preferible debido a que requirió una dosis de antígeno 10 veces menor para generar la misma respuesta de anticuerpos que se obtuvo con el alumbre. La respuesta se puede incrementar al incrementar la dosis de antígeno y/o adyuvante y al optimizar el programa de inmunización. La emulsión aceite/agua fue un adyuvante muy débil para AN1792 y agregar una emulsión aceite/agua al adyuvante MPL disminuye la actividad adyuvante intrínseca del MPL solo. 2. Niveles de Aß en el cerebro A aproximadamente 14 semanas los cobayos se anestesiaron profundamente, se extrajo el fluido cerebroespinal (CSF) y los cerebros se extirparon de los animales en un subconjunto de los grupos, aquellos inmunizados con adyuvante de Freund (grupo 2), MPL (grupo 5), alumbre con dosis elevada, 300 µg, de AN1792 (grupo 10) y el grupo control inmunizado con PBS (grupo 3) . Para medir el nivel del péptido Aß, se disecó un hemisferio y se preparó homogenados de regiones hipocampal, cortical y cerebelar en guanidina 5 M. Estos se diluyeron y se cuantificaron por comparación a una serie de diluciones de proteína estándar Aß de concentraciones conocidas en un formato ELISA. Los niveles de proteína Aß en el hipocampo, la corteza y el cerebelo fueron muy similares para todos los cuatro grupos a pesar del amplio rango de respuesta de anticuerpos al Aß producida por esas formulaciones. Los niveles medios de Aß de aproximadamente 25 ng/g de tejido se midieron en el hipocampo, 21 ng/g en la corteza y 12 ng/g en el cerebelo. Así, la presencia de un elevado título de anticuerpos circulantes para Aß durante casi tres meses en algunos de estos animales no altera los niveles totales de Aß en sus cerebros. Los niveles de Aß en CFS fue también bastante similar entre los grupos. La falta de gran efecto de la inmunización con AN1792 en Aß endógena indica que la respuesta inmune se enfoca en formaciones patológicas de Aß . VIII. Respuesta Inmune de Diferentes Adyuvantes en Ratones Se utilizaron ratones Swiss Webster hembras de seis semanas de edad para este estudio con 10-13 animales por grupo. Las inmunizaciones se dieron en los días 0, 14, 28, 60, 90 y 120 administradas subsecuentemente en un volumen de dosis de 200 µl . Se agregó PBS como el amortiguador para todas las formulaciones. Los animales se sangraron siete días después de cada inmunización hincando después de la segunda dosis para el análisis de títulos de anticuerpos mediante ELISA. El régimen de tratamiento de cada grupo se resume en la Tabla 9. '"^'- - imtfWiM^rfflf Tabla 9 Notas de pié de página a Número de ratones en cada grupo al inicio del experimento, b Se nota el adyuvante. El amortiguador para todas estas formulaciones fue PBS. Para el grupo 8, no hubo adyuvante ni antígeno. Los títulos de ELISA de los anticuerpos contra Aß42 en cada grupo se muestran en la Tabla 10 siguiente. Tabla 10 La tabla muestra que los títulos más altos se obtuvieron para los grupos 4, 5 y 18 en los cuales los adyuvantes fueron 125 µg MPL, 50 µg MPL y QS-21 más MPL. IX. Eficiencia terapéutica de los diferentes adyuvantes Se condujo un estudio de eficacia terapéutica en ratones transgénicos PDAPP con un conjunto de adyuvantes adecuados para utilizarse en humanos para determinar su capacidad de potenciar sus respuestas inmunes a Aß y para inducir la eliminación inmune-mediada de los depósitos amiloides en el cerebro. Ciento ochenta ratones transgénicos PDAPP heterocigóticos machos y hembras, de 7.5 a 8.5 meses de edad se obtuvieron de Charles River Laboratories. Los ratones se clasificaron en nueve grupos que contenían de 15 a 23 animales por grupo a ser inmunizados con AN1792 o A?1528 combinados con varios adyuvantes . Los animales se distribuyeron para igualar el género, edad y origen de los animales dentro de los grupos tan cercanamente como fue posible. Los adyuvantes incluyeron alumbre, MPL y QS-21, cada uno combinado con ambos antígenos y el adyuvante de Freund (FA) combinado únicamente AN1792 . Se inmunizó un grupo adicional con AN1792 formulado en amortiguador PBS más el conservador timerosal sin adyuvante. Se inmunizó un noveno grupo con PBS solo como un control negativo. Preparación de péptidos Aß agregados: los péptidos Aßl-40 humano (AN1528; California Peptides Inc., Napa, CA; Lote ME0541) y Aßl-42 humano (AN1792; California Peptides Inc., Lote ME0439) se solubilizaron e fresco para la preparación de cada conjunto de inyecciones a partir polvos liofilizados que se habían almacenado específicamente a - 20°C. Para este propósito, se agregaron 2 mg de péptido a 0.9 ml de agua desionizada y la mezcla se agitó para generar una solución o suspensión relativamente uniforme. AN1528 fue soluble en esta etapa, en contraste a AN1792. Una alícuota de 100 µl de PBS 10X(PBS IX: NaCl 0.15 M, fosfato de sodio 0.01 M, pH 7.5) se agregó entonces en cada punto AN1528 iniciando la precipitación. La suspensión se agitó de nuevo y se incubó durante la noche a 37°C para utilizarse al día siguiente . Para preparar las dosis de formulación con alumbre (Grupos 1 y 5) , se agregó el péptido Aß en PBS a Alhydrogel (gel de hidróxido de aluminio dos por ciento acuoso, Sargeant , Inc., Clifton, NJ) hasta alcanzar concentraciones de 100 µg del péptido Aß por un mg de alumbre . Se agregó PBS 10X a un volumen de dosis final de 200 µl en PBS IX. La suspensión se mezcló suavemente durante aproximadamente 4 horas a temperatura ambiente antes de la inyección. Para preparar las dosis de formulación con MPL (Grupos 2 y 6) , se agregó polvo liofilizado (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; Lote 67039-E0896B) a trietilamina acuoso 0.2% a una concentración final de 1 mg/ml y se agitó. La mezcla se calentó de 65 a 70°C durante 30 segundos para crear una suspensión uniforme ligeramente opaca de micelas. La solución se almacenó a 4°C. Para cada conjunto de inyecciones se mezclaron 100 µg del péptido por dosis en 50 µl de PBS, 50 µg de MPL por dosis (50 µl) y 100 µl de PBS por dosis en un tubo de borosilicato inmediatamente antes de su uso. Para preparar dosis de formulación con QS-21 (Grupos 3 y 7) , se agregó polvo liofilizado (Aquila, Framingham, MA; Lote A7018R) a PBS, pH 6.6-6-7 a una concentración final de 1 mg/ml y se agitó. La solución se almacenó a -20°C. Para cada conjunto de inyecciones se mezclaron 100 µg del péptido por dosis en 50 µl de PBS, 25 µg de QS-21 por dosis en 25 µl de PBS y 125 µl de PBS por dosis en un tubo de borosilicato inmediatamente antes de su uso. Para preparar dosis de formulación con adyuvante de Freund (Grupo 4) , se emulsificaron 100 µg de AN1792 en 200 µl de PBS, 1:1 (vol:vol) con Adyuvante de Freund Completo (CFA) en un volumen final de 400 µl para la primera inmunización. Para las inmunizaciones subsecuentes, el antígeno se emulsificó de manera similar con Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) . Para las formulaciones que contenían los adyuvantes de alumbre, PML o QS-21, se combinaron lOOµ por dosis de AN1792 o A?1528 con alumbre (1 mg por dosis) o MPL [••rttiftlÉriJ - Hiitü- M ÉiMÉli?lilli iflTi yyá.^ tlAi?u^y^&?tl yiyyS'^-^^.nl dtíÉ? t 't - * (59 µg por dosis) o QS-21 (25 µg por dosis) en un volumen final de 200 µl de PBS y se suministró por inoculación subcutánea en la espalda entre las escápulas. Para el grupo que recibió FA, se emulsificaron 100 µg de AN1792, 1:1 (vol. vol) con adyuvante de Freund Completo (CFA) en un volumen final de 400 µl y se suministró intraperitonealmente para la primera inmunización, seguido por un refuerzo de la misma cantidad de inmunógeno en adyuvante de Freund Incompleto (IFA) para las cinco dosis subsecuentes. Para el grupo que recibió AN1792 sin adyuvante, se combinaron 10 µg de AN1792 con 5 µg de timerasal en un volumen final de 50 µl de PBS y se suministró subcutáneamente. El noveno grupo control recibió únicamente 200 µl de PBS suministrado subcutáneamente. Las inmunizaciones se dieron en un programa de cada dos semanas para las primeras tres dosis, después en un programa mensual después de lo cual en los días 0, 16, 28, 56, 85 y 112. Los animales se sangraron 6 a 7 días después de cada inmunización iniciando después de la segunda dosis para la medición de títulos de anticuerpos. Los animales se eutanizaron aproximadamente una semana después de la dosis final. Los resultados se midieron por el ensayo ELISA de los niveles de Aß y APP en cerebro y mediante evaluación inmunohistoquímica de la presencia de placas amiloides en secciones del cerebro. Además, se determinaron los títulos de anticuerpos específicos de Aß y las respuestas .¡ a$¿* ^gg^ . :Í.JÍ y .1 . i . proliferativa dependiente de Aß y de citocinas. La Tabla 10 muestra que los mayores títulos de anticuerpos para Aßl-42 se produjeron con FA y AN1792, los títulos que se elevaron después de la cuarta inmunización (pico GMT: 75,386) y después declinó por 59% después de la final sexta inmunización. El título medio de pico producido por MPL con AN1792 fue de 62% mas bajo que el generado con FA (pico GMT: 29,867) y también se elevó tempranamente en el esquema de inmunización después de tres dosis, seguida por una declinación a 28% del valor pico después de la sexta inmunización. El título medio de pico generado con QS-21 combinado con AN1792 (GMT: 1,511) fue aproximadamente 5 veces menor que el obtenido con MPL. Además, las cinéticas de la respuesta fueron lentas ya que se requirió inmunización adicional para alcanzar la respuesta pico. Los títulos generados por el alumbre unido s AN1792 fueron marginalmente mayores que aquellos obtenidos con QS-21 y la respuesta cinética fue más rápida. Para el suministro de AN1792 en PBs con timerasal la frecuencia y dimensión de los títulos fueron escasamente mayores que para PBS solo. Los títulos picos generados con MPL y A?1528 (pico GMT 3099) fueron aproximadamente nueve veces menores que aquellos con A?1792. El A?1528 unido al alumbre fue inmunogénicamente muy pobre con bajos títulos generados en sólo algunos de los animales. ?o se observó respuestas de anticuerpos en los animales atia áiJÜHa .*» s A*?Í.,.Mi&yití% *& .¿¡yJ rg^ - control inmunizados con PBS solo. Tabla 11 Notas de pié de página: a Títulos de anticuerpos medios geométricos medidos contra Aßl-42 b Número de respuestas por grupo Los resultados del tratamiento de AN1792 o AN1528 con varios adyuvantes o timerosal en la carga amiloide cortical en ratones de 12 meses de edad determinada por ELISA se muestra en la Figura 15. En los ratones PDAPP control con PBS, el nivel medio de Aß total en la corteza a los 12 meses fue 1,817 ng/g. Los niveles notablemente reducidos de Aß se observaron en ratones tratados con AN1792 más CFA/IFA, AN1792 más alumbre, AN1792 más MPL y QS-21 más AN1792. La reducción alcanzó significancia estadística en el nivel p<0.05 solo para AN1792 más CFA/IFA. Sin embargo, como se muestra en los Ejemplos I y II, los efectos de inmunización en la reducción de los niveles de Aß se vuelve substancialmente mayor en los ratones de 15 meses y 18 meses de edad. Así, se anticipa que las formulaciones adicionales, particularmente las composiciones AN172 más alumbre, AN1792 más MPL y AN1792 más QS-21 proporcionarán resultados más positivos en el tratamiento de ratones maduros. Por contraste, el AN1792 más el conservador timerosal mostró un nivel medio de Aß aproximadamente el mismo que en los ratones tratados con PBS. Se obtuvieron resultados similares cuando se compararon los niveles corticales de Aß42. El nivel medio de Aß42 en los controles PBS fue de 1624 ng/g. Se observaron niveles medios notablemente reducidos de 403, 1149, 620 y 714 en los ratones tratados con AN1792 más CFA/IFA, AN1792 más alumbre, AN1792 más MPL y AN1792 más QS-21 respectivamente, logrando la reducción estadísticamente significante (p=0.05) para el grupo de tratamiento AN1792 CFA/IFA. El nivel medio en los ratones tratados con timerosal AN1792 fue de 1619 ng/g en Aß42. X. Análisis de Toxicidad Se recolectaron tejidos para el examen histopatológico a la terminación de los estudios descritos en los Ejemplos II, III y VII. Además, se realizó hematología y química clínica en las muestras de sangre terminal de los Ejemplos II y VI. Se evaluó la mayoría de los órganos principales, incluyendo cerebro, pulmonar, linfoide, gastrointestinal, hígado, riñon, adrenal y gónadas . Aunque se observaron lesiones esporádicas en los animales estudiados, no hubo diferencias obvias ya sea en tejidos afectados o lesiones severas, entre animales tratados con AN1792 y no tratados. No existieron lesiones histopatológicas únicas observadas en los animales inmunizados con AN-1528 comparados a los animales tratados con PBS o no tratados. No existió tampoco diferencia entre el perfil de química clínica entre los grupos de adyuvante y los animales tratados con PBS en el Ejemplo VI. Aunque existieron incrementos significativos en varios de los parámetros hematológicos entre los animales tratados con AN1792 y adyuvante de Freund en el Ejemplo VI con relación a los animales tratados con PBS, este tipo de efectos se esperaba a partir del tratamiento con adyuvante de Freund y la peritonitis acompañante y no indica ningún efecto adverso a partir del tratamiento con AN1792. Aunque no es parte de la evaluación toxicológica, la patología del cerebro de ratón PDAPP se examinó extensivamente como parte de los puntos finales de eficacia. No se observó ninguna signo de tratamiento relacionado de efecto adverso en la morfología del cerebro, en ninguno de los estudios. Estos resultados indican que el tratamiento con AN1792 es bien tolerado y al menos substancialmente libre de efectos colaterales. XI Tratamiento Terapéutico con Anticuerpos Anti- Aß Los experimentos descritos en esta sección se llevaron a cabo a fin de probar las capacidades de varios anticuerpos monoclonales y policlonales contra Aß para inhibir la acumulación de Aß en el cerebro de ratones transgénicos heterocigóticos . A. Estudio 1 1. Diseño del Estudio Se obtuvieron sesenta ratones transgénicos PDAPP heterocigóticos machos y hembras, de 8.5 a 10.5 meses de edad a partir de Charles River Laboratory. Los ratones se clasificaron en seis grupos para tratarse con varios anticuerpos dirigidos a Aß . Los animales se distribuyeron para igualar el género, edad, origen y fuente de los animales dentro de los grupos tan cercanamente como fue posible. Como se muestra en la Tabla 12, los anticuerpos incluyeron cuatro anticuerpos monoclonales Aß específicos murinos, 2H3 (dirigido a los residuos 1-12 de Aß) , 10D5 (dirigido a los residuos 1-6 de Aß) , 266 (dirigido a los residuos 13-28 de Aß y unidos al monomérico pero no a AN1792 agregado) , 21F12 (dirigido a los residuos 33-42 de Aß) . Un quinto grupo se trató con una fracción de anticuerpo policlonal específico de Aß (logrado mediante inmunización con AN1792 agregado) . El grupo de control negativo recibió el diluyente, PBS, solo sin anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales se inyectaron a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg (suponiendo que el ratón pesó 50g) . Las inyecciones se administraron intraperitonealmente cada siete días en promedio para mantener los títulos anti- Aß arriba de 1000. Aunque se midieron títulos menores para mAb 266 ya que no se unió bien al AN1792 agregado utilizado como el antígeno de captura en el ensayo, el mismo programa de dosificación se mantuvo para este grupo. El grupo que recibió anticuerpo monoclonal 2H3 se descontinuó dentro de las primeras tres semanas ya que los anticuerpos se suprimieron demasiado rápidamente in vivo. Los animales se sangraron antes de cada dosificación para la medición de títulos de anticuerpo. El tratamiento se continuó durante un periodo de seis meses para un total de 196 días. Los animales se eutanizaron una semana después de ljá..i.^.,i. L {?t?t?*¡.* ,*? -ffiHrrt •j¡ÉLftt i -í la dosis final Tabla 12 Notas de pie de página a. Número de ratones en el grupo a la terminación del experimento. Todos los grupos se iniciaron con 10 animales por grupo. b. NA: no aplicable c. mAb: anticuerpo monoclonal 2. Materiales y Métodos a. Preparación de los Anticuerpos se prepararon los anticuerpos policlonales anti- Aß a partir de la sangre recolectada de dos de los grupos de animales. El primer grupo consistió de 100 ratones Swiss Webster hembras, de 6 a 8 semanas de edad. Se inmunizaron en los días 0, 15 y 29 con 100 µg de AN 1792 combinado con CFA/IFA. Se dio una cuarta inyección en el día 36 con la mitad de la dosis de AN1792. Los animales se desangraron después del sacrificio en el día 42, se preparó el suero y los sueros se extrajeron para crear un total de 64 ml . El segundo grupo consistió de 24 ratones hembra isogénicos con los ratones PDAPP pero no transgénico para el gen APP humano, de 6 a 9 semanas de edad. Se inmunizaron en los días 0, 14, 28 y 56 con 100 µg de AN1792 combinado con CFA/IFA. Estos animales también se desangraron después del sacrificio en el día 63, se preparó el suero y se extrajo para un total de 14 ml . Se extrajeron los dos lotes de suero. La fracción de anticuerpo se purificó utilizando dos rondas secuenciales de precipitación de sulfato de amonio saturado al 50%. El precipitado final se dializó contra PBS y se probó para endotoxinas. El nivel de endotoxinas fue menor que 1 EU/mg. Los anticuerpos monoclonales anti- Aß se prepararon a partir del fluido de ascitis. Al fluido se le eliminaron los lípidos mediante la adición de sulfato de dextran de sodio concentrado para fluido de ascitis enfriado en hielo mediante agitación en hielo hasta alcanzar una concentración final de 0.238%. El CaCl2 concentrado se agregó entonces con agitación hasta alcanzar una concentración final de 64 mM.

La solución se centrífugo a 10,000 x g y se descartaron los pellets. El sobrenadante se agitó en hielo con un volumen igual de sulfato de amonio saturado agregado gota a gota. La solución se centrífugo de nuevo a 10,000 x g y el sobrenadante se desechó. Los pellets se resuspendieron y se dializaron contra Tris-HCl 20 mM, NaCl 0.4 molar, pH 7.5. Esta fracción se aplicó a una Columna Q de Sefarosa de Farmacia FPLC y se eluyó con un gradiente inverso a partir de NaCl de 0.4 M hasta 0.275 M en Tris-HCl 20 mM, pH 7.5. El pico de anticuerpos se identificó mediante la absorbencia a 280 nm y se extrajeron las fracciones apropiadas. La preparación de anticuerpos purificados se caracterizó al medir la concentración de proteína utilizando el método BCA y la pureza utilizando SDS-PAGE. El grupo también se probó para endotoxinas. El nivel de endotoxinas fue menor de 1 EU/mg títulos, los títulos menores de 100 se les asignó arbitrariamente un valor de título de 25. 3. Niveles Aß y APP en el Cerebro: Siguiendo aproximadamente seis meses del tratamiento con varias preparaciones de anticuerpo anti-Aß, los cerebros se quitaron de los animales siguiendo perfusión salina. Un hemisferio se preparó para análisis inmunohistoquímico y el segundo se utilizó para la cuantificación de niveles Aß y APP. Para medir las concentraciones de varias formas de péptido amiloide beta y proteína precursora amiloide (APP) , el hemisferio se desecó y se prepararon homogenados de hipocampo, cortical y regiones cerebrales en guanidina 5M. Se diluyó de manera serial y el nivel de péptidos amiloides o APP se cuantificó mediante la comparación de una serie de diluciones de iniciadores de péptido Aß o APP de concentraciones conocidas en un formato de ELISA. Los niveles medidos de Aß total y Aß42 por ELISA en homogenados de la corteza y el hipocampo y el nivel de Aß total en el cerebelo se muestran en las Tablas 11, 12 y 13 respectivamente. La concentración media del total de Aß para el grupo control, inaculado con PBS, fue 3.6 veces mayor en el hipocampo que en la corteza (mediana de 63, 389 ng/g de tejido de hipocampo comparado a 17,818 ng/g para la corteza) . El nivel medio en el cerebelo del grupo control (30.6 ng/g de tejido) fue más de 2,000 veces menor que en el hipocampo. Estos niveles son similares a aquellos que hemos reportado previamente para ratones transgénicos PDAPP heterocigóticos de esta edad (Jonson-Woods et al . , 1997). Para la corteza, un grupo tratado tuvo una mediana de nivel Aß, medido como Aßl-42, que difirió significativamente del grupo control (p<0.05), estos animales recibieron el anticuerpo anti-Aß policlonal como se muestra en la Tabla 13. El nivel medio de Aßl-42 se redujo por 65%, comparado al control para este grupo de tratamiento. Los niveles medios de Aßl-42 también se redujeron significativamente por 55% comparado al control en un grupo de tratamiento adicional, estos animales se dosificaron con el mAb 10D5 (p=0.0433).

Notas del pie de página: a. Número de animales por grupo al final del experimento; b. ng/g de tejido; c. Análisis Mann Whitney; d. NA: no aplicable; e. Desviación estándar n el hipocampo, la reducción de porcentaje medio del Aß total asociado con el tratamiento con anticuerpo policlonal anti-Aß (50%, p=0.0055) no fue tan grande como aquel observado en la corteza (65%) (Tabla 14) . Sin embargo, la magnitud absoluta de la reducción fue casi tres veces mayor en el hipocampo que en la corteza, una reducción neta de 31,683 ng/g de tejido en el hipocampo versus 11,658 ng/g de tejido en la corteza. Cuando se midió como el nivel de la forma mas amiloidogénica de Aß, Aßl-42, más bien que como un Aß total, la reducción alcanzada fue significante con el anticuerpo policlonal (p=0.0025). Los niveles medios en los grupos tratados con los mAbs 10D5 y 266 se redujeron por 33% y 21% respectivamente.

Tabla 14 Notas de pié de página: a. Número de animales por grupo hasta el fin del experimento b. tejido ng/g c. Análisis Mann Whitney d. NA: no aplicable e. Desviación Estándar El Aß total también se midió en el cerebelo (Tabla 15) . Estos grupos se dosificaron con el anti-Aß policlonal y el anticuerpo 266 mostraron reducciones significantes de los niveles del Aß total (43% y 46%, p=0.0033 y p=0.0184, respectivamente) y aquel grupo tratado con 10D5 tuvo una reducción cercanamente significante (29%, p=0.0675). Tabla 15 Notas de pie de página: a. Número de animales por grupo al final del experimento b. ng/g de tejido c. Análisis Mann Whitney d. NA: no aplicable e. Desviación estándar .lí.,r * ,*. ,í tÍ .l Las concentraciones de APP también se determinaron por ELISA en la corteza y el cerebelo a partir de ratones tratados con anticuerpo y control tratado con PBS. Se utilizaron dos diferentes ensayos de APP. El primero, designado APP-a/FL, reconoció tanto APP-alfa (a, la forma secretada de APP que se ha dividido dentro de la secuencia Aß) como las formas de longitud completa (FL) de APP, mientras la segunda reconoce únicamente APP-a. En contraste a la disminución asociada al tratamiento de Aß en el subconjunto de los grupos de tratamiento, los niveles de APP estuvieron virtualmente sin cambio en todos los animales tratados comparados al control. Estos resultados indican que las inmunizaciones con anticuerpos Aß reducen Aß sin reducir APP. En resumen, los niveles Aß se redujeron significativamente en la corteza, hipocampo y cerebelo en animales tratados con el anticuerpo policlonal alcanzado contra AN1792. Para unos anticuerpos monoclonales menos extendidos para la región terminal amino de Aßl-42, específicamente ácidos amino 1-16 y 13-28 también muestran efectos significativos del tratamiento. 4. Análisis Histoquímico La morfología de las placas inmunoreactivas de Aß en subconjuntos de cerebro a partir de ratón en los grupos de tratamiento PBS, Aß42 policlonal, 21F12, 266 y 10D5 se compararon cualitativamente con aquellos estudios previos en los cuales se siguieron los procedimientos de inmunización estándar con Aß42. La alteración más grande tanto en el grado como en la apariencia de las placas amiloides ocurrió en los animales inmunizados con el anticuerpo policlonal Aß42. La reducción de la carga amiloide, la morfología de placa erosionada y la inmunoreactividad de Aß asociada a la célula asemejan los efectos producidos por el procedimiento de inmunización estándar. Estas observaciones soportan los resultados de ELISA en los cuales las reducciones significativas tanto en el Aß total como en el Aß42 se logran mediante la administración del anticuerpo Aß42 policlonal. En evaluaciones cualitativas similares, las placas amiloides en el grupo 10D5 también se redujeron en número y apariencia, con alguna evidencia de la inmunoreactividad de Aß asociada a la célula. No se observaron diferencias mayores cuando se compararon a los grupos 21F12 y 266 con los controles PBS. 5. Medición de Títulos de Anticuerpo: Se sangró un subconjunto de tres ratones aleatoriamente seleccionados de cada grupo justo antes de cada inoculación intraperitoneal, para un total de 30 sangrados. Se midieron los títulos de anticuerpos como anticuerpos unidos a Aßl-42 utilizando un ELISA sandwich con placas de plástico de múltiples cavidades cubiertas con Aßl-42 como se describió en detalle en Materiales y Métodos Generales. Los títulos medios para cada sangrado se muestran en las Figuras 16-18 para el anticuerpo policlonal y los monoclonales 10D5 y 21F12, respectivamente. Los títulos se promediaron a aproximadamente 1:1000 durante este periodo de tiempo para la preparación de anticuerpos policlonales y estuvieron ligeramente por arriba de este nivel para los animales tratados con 10D5 y 21F12. 6. Respuestas Linfoproliferativas Se midió la linfoproliferación dependiente de Aß utilizando células de bazo cosechadas ocho días después de la infusión final de anticuerpos. Las células recién cosechadas 105 por cavidad, se cultivaron durante 5 días en la presencia de Aßl-40 a una concentración de 5 µM para estimulación. Como un control positivo, las células adicionales se cultivaron con el mitógeno de célula T, PHA y como un control negativo, las células se cultivaron sin agregar péptido. Las células del bazo provenientes de ratones PDAPP maduros previamente inmunizados con varios anticuerpos anti-Aß se estimularon in vitro con AN1792 y se midieron las respuestas proliferativa y de citosina. El propósito de este ensayo fue determinar si la inmunización pasiva facilita la presentación del antígeno e inicia así las respuestas de las células T específicas para AN1792. No se observaron ¡ ^ÉdfcaisjL=^^^aijMÉ-. respuestas proliferativa específica de AN1792 o de citosina en ratones previamente inmunizados con los anticuerpos anti- Aß. B. Estudio 2 En un segundo estudio, el tratamiento con el anticuerpo 10D5 se repitió y se probó dos veces adicionales con anticuerpos anti-Aß, anticuerpos monoclonales 3D6 (Aß1-5) y 16C11 (Aß33- 2) . Los grupos control recibieron ya sea PBS o un anticuerpo irrelevante acoplado al isotipo (TM2a) . Los ratones fueron de más edad (11.5-12 meses de edad heterocigotos) que en el estudio previo; por otra parte, el diseño experimental fue el mismo. Una vez más, después de seis meses de tratamiento, 10D5 redujo la carga de placa por más del 80% con relación a ya sea el PBS o los controles de anticuerpo acoplado al isotipo (p=0.003). Uno de los otros anticuerpos contra Aß, 3D6, fue igualmente efectivo, produciendo una reducción de 86% (p=0.003) . En contraste, el tercer anticuerpo contra el péptido, 16C11, falló para tener cualquier efecto en la carga de placa. Se obtuvieron hallazgos similares con las mediciones de ELISA en Aß42. Estos resultados demuestran que una respuesta de anticuerpo contra el péptido Aß, en la ausencia de inmunidad de células T, es suficiente para disminuir la deposición amiloide en ratones PDAPP, pero no todos los anticuerpos anti-Aß son eficaces. Los anticuerpos dirigidos a los epítopes que comprenden aminoácidosl-5 o 3-7 de Aß son particularmente eficaces . Estos estudios demuestran que los anticuerpos administrados de manera pasiva contra Aß reducen el grado de deposición de placa en un modelo de ratón de enfermedad de Alzheimer. Cuando se mantiene a concentraciones modestas de suero (25-70 µ/ml) , los anticuerpos ganan acceso para el CNS a niveles suficientes para decorar las placas ß amiloides. La entrada del anticuerpo en el CNS no se debe a la carencia anormal de la barrera sangre-cerebro ya que no se incrementa en permeabilidad vascular según se midió por Evans Blue en ratones PDAPP. Además, la concentración de anticuerpos en el parénquima cerebral de ratones PDAPP maduros fue la misma que en los ratones no transgénicos, que representaron 0.1% de la concentración de anticuerpos en suero (con respecto al isotipo) . C. Estudio 3: Monitoreo de Enlace de Anticuerpos Para determinar si los anticuerpos contra Aß pueden actuar directamente dentro de SNC, los cerebros tomados de los ratones prefundidos en salina al final del Ejemplo XII, se examinaron para la presencia de anticuerpos administrados peritonealmente . Las secciones de cerebro crioestatizadas no fijas se expusieron a un reactivo fluorescente contra inmonoglubina de ratón (IgG-Cy3 de cabra anti-ratón) . Las placas dentro del cerebro de los grupos 10D5 y 3D6 se decoraron fuertemente con anticuerpos, en tanto que no se tiñeron en el grupo 16C11. Para revelar el grado total de deposición de placa, las secciones en serie de cada cerebro inmunoreaccionaron primero con un anticuerpo anti-Aß y después con el reactivo secundario. 10D5 y 3D6, después de la administración periférica, ganaron acceso a la mayoría de las placas dentro del SNC. La carga de placas se redujo grandemente en aquellos grupos de tratamiento comparados al grupo 16C11. Estos datos indican que los anticuerpos administrados de manera periférica pueden entrar al SNC en donde pueden disparar directamente el despej amiento amiloide. Probablemente es que 16C11 también tiene acceso a las placas pero no fue capaz de unirse a las placas. XII Prevención y Tratamiento de Sujetos Humanos Se realizó la prueba de fase I de dosis única para determinar la seguridad en humanos. Se administró un agente terapéutico en dosis incrementadas a diferentes pacientes iniciando a partir de aproximadamente 0.01, el nivel de eficacia presumido e incrementando mediante un factor de tres hasta alcanzar un nivel de aproximadamente 10 veces la dosis efectiva de ratón. Se realizó la prueba de fase II para determinar la eficacia terapéutica. Se seleccionaron pacientes con Enfermedad de Alzheimer temprana a media utilizando el criterio de Enfermedad de Alzheimer y Asociación de Trastornos Relacionados (ADRDA) para probable AD. Puntuación de los pacientes adecuados en el rango 12-26 en el Examen de Estado Mini -Mental (MMSE) . Otro criterio de selección son los pacientes que son probables para sobrevivir la duración del estudio y carecen de misiones que complican tal uso de medicaciones concomitantes que pueden interferir. Las evaluaciones de línea basal de la función del paciente se elaboran utilizando mediciones psicométricas clásicas tales como el MMSE y el ADAS, que es una escala comprensiva para evaluar a los pacientes con estado y función de Enfermedad de Alzheimer. Estas escalas psicométricas proporcionan una medida de la progresión de la condición de Alzheimer. Tales escalas cuantitativas de vida también pueden utilizarse para monitorear el tratamiento. También puede monitorearse la progresión de la enfermedad mediante MRI . Los perfiles sanguíneos de los pacientes también pueden monitorearse incluyendo ensayos de anticuerpos específicos del inmunogen y respuestas de las células T. Siguiendo las mediciones de la línea base, los pacientes inician recibiendo el tratamiento. Se aleatorizan y se tratan con cualquier agente terapéutico o placebo en una forma unida. Los pacientes se monitorean al menos cada seis meses. La eficacia se determina mediante una reducción significativa en la progresión de un grupo de tratamiento con relación a un grupo placebo.

Ita &ty tt?Jft* *********** i ?Sa?L.

Se realizó un segundo examen de fase II para evaluar la conversión de los pacientes a partir de pérdida de memoria temprana sin Enfermedad de Alzheimer, algunas veces referida como deterioro de memoria asociado a la edad (AAMI) o deterioro cognoscitivo ligero (MCI) , para probables enfermedades de Alzheimer como se define por el criterio ADRDA. Los pacientes con elevado riesgo de conversión a Enfermedad de Alzheimer se seleccionaron de una población no clínica mediante de referencia de selección para signos tempranos de pérdida de memoria u otras dificultades asociadas con la sintomatología pre-Alzheimer, una historia familiar de enfermedad de Alzheimer, factores de riesgo genético, edad, sexo y otras características encontradas para predecir el alto riesgo para la Enfermedad de Alzheimer. Se recolectaron puntuaciones de línea base en las métricas adecuadas que incluyen el MMSE y el ADAS junto con otras métricas diseñadas para evaluar una población más normal . Estas poblaciones de pacientes se dividieron en grupos adecuados con comparación de placebo contra dosis alternadas con el agente. Estas poblaciones de pacientes se siguieron a intervalos de aproximadamente seis meses y el punto final para cada paciente es si o no el o ella se convierte a probable Enfermedad de Alzheimer como se define por el criterio ADRDA al final de la observación. XIII. Materiales y Métodos Generales Í?.^fÜM ^Í?y.kM,.,. 1. Medición de Títulos de Anticuerpos Los ratones se sangraron al hacer una pequeña muesca en la vena de la cola y recolectar aproximadamente 200 µl de sangre en un tubo de microfuga. Los cobayos se sangraron al afeitar primero el área del corbejón posterior y entonces utilizando una aguja de calibre 18 para la muesca de la vena matatarsal y recolectar la sangre en un tubo de microfuga. Se le permitió a la sangre coagularse por una hora a temperatura ambiente (RT) , se agitó, después de centrífugo a 14,000 x g durante 10 minutos para separar el coágulo del suero. El suero se transfirió entonces a un tubo de microfuga limpio y se almacenó a 4°C hasta la titulación. Los títulos de anticuerpo se midieron por ELISA. Las placas de 96 cavidades de microtitulación (placas Costar EIA) se cubrieron con 100 µl de una solución que contenía ya sea lOµg/ml ya sea Aß42 o SAPP u otro antígeno según se anotó en cada uno de los reportes individuales en Amortiguador Well Coating (fosfato de sodio 0.1M, pH 8.5, azida de sodio 0.1%) y se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente. Las cavidades se aspiraron y se agregó suero a las cavidades iniciando a una dilución 1/100 en Diluyente de Espécimen (fosfato de sodio 0.014 M, pH 7.4, NaCl 0.15 M, albúmina de suero bovino 0.6%, timerasal 0.05%). Se hicieron siete diluciones en serie de las muestras directamente en las placas en etapas de tres veces hasta alcanzar una dilución S?*t*a??*.*u.?.?**J..y*r. final de 1/218,700. Las diluciones se incubaron en las cavidades de placa cubierta durante una hora a RT. Las placas se lavaron entonces cuatro veces con PBS que contenía 0.05% de Tween 20. El segundo anticuerpo, se agregó una Ig de cabra anti-ratón conjugada a peroxidasa de rábano (obtenida de Boehringer Mannheim) a las cavidades como 100 µl de una dilución 1/3000 en diluyente de espécimen y se incubó durante una hora a RT. Las placas se lavaron de nuevo cuatro veces en PBS, Tween 20. Para desarrollar el cromógeno, se agregaron 100 µl de Slow TMB (3,3', 5 , 5' -tetrametil benzidina obtenida de Pierce Chemicals) a cada cavidad y se incubó durante 15 minutos a RT. La reacción se detuvo por la adición de 25 µl de H2S04 2M. La intensidad del color fue leía en un Dispositivo Molecular Vmax a (450 nm - 650 nm) . Los títulos se definieron a medida que las diluciones recíprocas del suero dieron la mitad del OD máximo. El OD máximo se tomó en general de una dilución inicial 1/100, excepto en el caso con cada título alto, en cuyo caso fue necesaria una dilución inicial mayor para establecer el OD máximo. Si el punto de 50% cayó entre dos diluciones, la extrapolación lineal se hizo calculando el título final. Para calcular los títulos de anticuerpo medios geométricos, los títulos de menos de 100 se les asignó arbitrariamente un valor de título de 25. 2. Ensayo de proliferación de linfocitos Los ratones se anestesiaron con isoflurano. Los bazos se retiraron y se enjuagaron dos veces con 5 ml de PBS que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (PBS-FBS) y después de homogenizó en una unidad Centricón a 50° (Dako A/S, Dinamarca) en 1.5 ml de PBS-FBS durante 10 segundos a 100 rpm en una Medimachine (Dako) seguida por filtración a través de una malla de nylon de 100 mieras de tamaño de poro. Las células del bazo se lavaron una vez con 15 ml de PBS-FBS, después se peletizaron por centrifugación a 200 x g durante 15 minutos. Las células rojas sanguíneas se lisaron al resuspender el pelet en 5 ml de amortiguador que contenía NH4C1 0.15 M, KHC03 1 M, NaEDTA 0.1 M, pH 7.4 durante cinco minutos a RT. Los leucocitos se lavaron entonces como anteriormente. Las células de bazo recientemente aisladas (105 células por cavidad) se cultivaron en conjuntos por triplicado en placas de microtitulación de 96 cavidades de fondo en U tratadas con cultivo de tejido (Corning Cambridge, MA) en medio RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) suplementadas con glutamina 2.05 mM, 1% Penicilina/Estreptomicina y 10% de FBS inactivado por calor, durante 96 horas a 37°C. Varios péptidos Aß, Aßl- 16, Aßl-40, Aßl-42 o la proteína de secuencia inversa Aß40-1 también se agregaron a dosis que varían de 5 a 0.18 micromolar en cuatro etapas. Las células en las cavidades de control se cultivaron con Concavalina A (Con A) (Sigma, cat # C-5275, en 1 microgramo/ml) sin agregar proteína. Las células se pulsaron para el final 24 horas con 3H-timidina (1 µCi/cavidad obtenido de Amersham Corp., Arlington Heights IL) . Las células se cosecharon entonces en placas UniFilter y se contabilizaron en un Top Count Microplate Scintillation Counter (Packard Instrument, Downers Grove, IL) . Los resultados se expresan como cuentas por minuto (cpm) de la radioactividad incorporada en macromoléculas insolubles. 4. Preparación de Tejido de Cerebro Después de la eutanasia, los cerebros se retiraron y se preparó un hemisferio para análisis inmunohistoquímico, en tanto tres regiones del cerebro (hipocampo, corteza y cerebelo) se desecaron a partir del otro hemisferio y se utilizaron para medir la concentración de varias proteínas Aß y formas de APP utilizando ELISAs específicas (Jonson-Wood et al . , supra) . Los tejidos destinados para los ELISAS se homogenizaron en 10 volúmenes de amortiguador de guanidina enfriado en hielo (guanidina-HCL 5.0 M, Tris- HCl 50 mM, pH 8.0) . Los homogenados se mezclaron por agitación suave utilizando un Adams Nutator (Fisher) de tres a cuatro horas a RT, después se almacenaron a menos 20°C antes de la cuantificación de Aß y APP. Los experimentos previos han mostrado que los analitos fueron estables bajo estas condiciones de almacenamiento y que la proteína Aß sintética z, jrií.,.t.a¡it,?*lti (Bachem) puede recuperarse cuantitativamente cuando se descartan en los homogenados de tej ido de cerebro control de cachorros de ratón (Jonson-Wood et al . , . supra) 5. Medición de los niveles de Aß Los homogenados de cerebro se diluyeron 1:10 con Diluyente de Caseína enfriado en hielo (caseína 0.25%, PBS, azida de sodio 0.05%, aprotina 20 µg/ml, EDTA 5 mM pH 8.0, leupeptina 10 µg/ml) y después se centrífugo a 16,000 x g durante 20 minutos a 4°C. Los estándares de proteína Aß sintética (aminoácidos 1-42) y los estándares de APP se prepararon para incluir guanidina 0.5 M y 1% de albúmina de suero de bovino (BSA) en la composición final. El ELISA de sandwich de Aß "total" utiliza el anticuerpo monoclonal 266, específico para los aminoácidos 12-28 de Aß (Seubert et al . ) , como el anticuerpo de captura y el anticuerpo 3D6 monoclonal biotinilado específico para los aminoácidos 1-5 de Aß (Jonson-Wood, et al . ) , como el anticuerpo informador. El anticuerpo monoclonal 3D6 no reconoce el APP secretado o el APP de longitud total, sino detecta sólo las especies Aß con un ácido aspártico amino-terminal . Este ensayo tiene un límite inferior de sensibilidad de ~50 mg/ml (11 mM) y no muestra reactividad cruzada a la proteína Aß murina endógena a concentraciones de hasta 1 ng/ml (Johson-Wood et al . , supra) . El ELISA de sandwich Aßl-42 específico emplea mAß 21F12, específico para los aminoácidos 33-42 de Aß (Jonson- Wood et al . ) , como el anticuerpo de captura. El mAß 3D6 biotinilado también es el anticuerpo informador en este ensayo el cual tiene un límite inferior de sensibilidad de aproximadamente 125 µg/ml (28 µM, Jonson-Wood et al . ) . Para los ELISAs de Aß se cubrió 100 µl se ya sea mAß 266 (a 10 µg/ml) o mAß 21F12 a (5 µg/ml) en las cavidades de las placas de inmunoensayo de 96 cavidades (Costar) mediante incubación durante la noche a RT. La solución se retiró por aspiración y las cavidades se bloquearon mediante la adición de 200 µl de 0.25% de albúmina de suero humano en amortiguador de PBS por al menos 1 hora a RT. La solución de bloqueo se retiró y las placas se almacenaron desecadas a 4°C hasta su uso. Las placas se rehidrataron con Amortiguador de Lavado [Tris- salina amortiguada (NaCl 0.15 M, Tris-HCl 0.01 M, pH 7.5), más 0.05% de Tween 20] antes de su uso. Las muestras y estándares se agregaron en alícuotas por triplicado de 100 µl por cavidad y después se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron al menos tres veces con Amortiguador de Lavado entre cada etapa del ensayo. Se agregó mAß 3D6 biotinilado, diluido a 0.5 µg/ml en Amortiguador de Ensayo de Caseína (caseína 0.25%, PBS, 0.05% Tween 20, pH 7.4) y se incubó en las cavidades durante 1 hora a RT. Un conjugado de peroxidasa avidina-rábano, (Avidina-HRP obtenido de Vector, Burlingame, CA) , diluido 1:4000 en Amortiguador de Ensayo de ' Caseína, se agregó a las cavidades durante 1 hora a RT. El substrato colorimétrico, Slow TMB-ELISA (Pierce) , se agregó y se le permitió reaccionar durante 15 minutos a RT, después de lo cual la reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 25 µl de H2S04 2 N. El producto de reacción se cuantificó utilizando el Dispositivo Molecular Vmax que mide la diferencia en absorbencia a 450 nm y 650 nm. 6. Medición de los Niveles de APP Se utilizaron dos diferentes ensayos de APP: El primero, designado APP-a/FL, reconoce tanto las formas APP- alfa (a) como las de longitud total (FL) de APP. El segundo ensayo es específico para APP-a. La APP-a/FL reconoce la APP secretada incluyendo los primeros 12 aminoácidos de Aß . Ya que el anticuerpo informador (2H3) no es específico para el sitio-clip-a, que ocurre entre los aminoácidos 612-613 de la APP695 (Esch et al . , Science 248, 1122-1124 (1990)); este ensayo también reconoce la longitud total de APP (APP-FL9. Los experimentos preliminares que utilizan anticuerpos APP inmovilizados para la cola citoplasmática de APP-FL para los homogenados de cerebro agotados de APP-FL sugieren que aproximadamente 30-40% del APP de APP-/FL es FL (datos no mostrados) . Los anticuerpos de captura para ambos ensayos el APP-a/FL y APP-a es mAß 8E5, agrupados contra los aminoácidos 444 a 592 de la forma APP695 (Games et al . , supra). El mAß informador para el ensayo APP-a/FL es mAß 2H3, específico para los aminoácidos 597-608 de APP695 (Jonson-Wood et al . , supra) y el anticuerpo ^informador para el ensayo de APP-a es un derivado biotinilado de mAß 16H9, agrupado a los aminoácidos 605 a 611 de APP. El límite inferior de sensibilidad del ensayo APP-aFL es aproximadamente 11 ng/ml (150 pM) (Jonson-Wood et al . ) y el del ensayo específico de APP-a es 22 ng/ml (0.3 nM) . Para ambos ensayos de APP, mAß se cubrió en las cavidades de las placas EIA de 96 cavidades como se describió anteriormente para mAß 266. El APP-a secretado recombinante, purificado se utilizó como el estándar de referencia para el ensayo de APP-a y el ensayo APP-/FL (Esch et al . , supra). Las muestras de homogenado de cerebro se diluyeron en guanidina 5 M 1:10 en Diluyente de Espécimen para ELISA (amortiguador de fosfato?.014 M, pH 7.4, 0.6% de albúmina de suero bovino, 0.05% de timerosal, NaCl 0.5 M, 0.1% NP40) . Se diluyeron después en Diluyente de Espécimen que contenía guanidina 0.5 M. Los homogenados diluidos se centrifugaron entonces q 16,000 x g durante 15 segundos a RT. Los estándares y las muestras de APP se agregaron a la placa en alícuotas duplicadas y se incubaron durante 1.5 horas a RT. El anticuerpo informador biotinilado 2H3 o 16H9 se incubó con las muestras durante 1 hora a RT. Se diluyó fosfato de estraptividina alcalina (Boehringer Mannheim), 1:100 en diluyente de espécimen, se incubó en las cavidades durante 1 hora a RT. Se agregó el substrato fluorescente -metil -umberiferil- fosfato para una incubación de 30 minutos a RT y las placas se leyeron en un fluorímetro Cytofluor tm 2350 (Millipore) a 365 nm de excitación y 450 nm de emisión. 7. Inmunohistoquímica Los cerebros se fijaron durante tres días a 40C en paraformaldehído al 4% en PBS y después se almacenaron de uno a siete días a 4°C para formaldehído al 1%, PBS hasta seccionarse. Se cortaron secciones coronales de cuarenta mieras de grosor en un vibratomo a RT y se almacenaron en crioprotector (30% glicerol, 30% etilen glicol en amortiguador de fosfato) a -20°C antes del procesamiento inmunohistoquímico. Para cada cerebro se incubaron seis secciones en el nivel del hipocampo dorsal, cada una separada por intervalos de 240 µm consecutivos, durante la noche con uno de los siguientes anticuerpos: (1) anti-Aß biotinilado (mAb, 3D6, Aß específico para humano) diluido a una concentración de 2 µg/ml en PBS y suero de caballo al 1%; o (2) un mAb biotinilado específico para APP humana, 8E5, diluido a una concentración de 3 µg/ml en PBS y suero de caballo al 1%; o (3) un mAb específico para proteína acídica fibrilar glial (GFAP; Sigma Chemical Co.) diluido 1:500 con 0.25% Tritón X-100 y suero de caballo al 1%, en solución salina Tris-amortiguada, pH 7.4 (TBS); o (4) un mAb específico para el antígeno CDllb, MAC-1, (Chemicon ¡jJk ktn? ., y K r , International) diluido 1:100 con 0.25% Tritón X-100 y suero de conejo al 1% en *8BS; o (5) un tnAb específico para el antígeno MHC II, (Pharmlfegen) diluido 1:100 con 0.25% Tritón X-100 y suero de conejo al 1% en TBS,- o (6) un mAb de rata específico para CD 43 (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS; o (8) Aß monoclonal de rata específico para CD 45RB (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS; o (9) un Aß monoclonal de rata específico para CD 45 (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de rata al 1% en PBS; o (10) un Aß de hámster policlonal biotinilado específico para CD3e (Pharmingen) diluido 1:100 con suero de conejo al 1% en PBS; u (11) un mAb de rata específico para CD3 (Serotec) dilucido 1:200 con suero de conejo al 1% en PBS; o con (12) una solución de PBS que carece de un anticuerpo primario que contiene suero normal de caballo al 1%. Se pretrataron secciones que reaccionaron con las soluciones de anticuerpo listadas en 1,2 y 6-12 anteriores con 1.0% Tritón X-100, peróxido de hidrógeno al 0.4% en PBS durante 20 minutos a RT para bloquear la peroxidasa endógena. Se incubaron a continuación durante la noche a 4°C con el anticuerpo primario. Las secciones que reaccionaron con 3D6 u 8E5 o CD3e mAbs reaccionaron entonces por una hora a RT con un complejo de peroxidasa de rábano-avidina-biotina con componentes de los equipos "A" y "B" diluidos 1:75 en PBS sMffeetor Élite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA) . Las secciones que reaccionaron con los anticuerpos específicos para CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 y la solución de PBS excentas del anticuerpo primario se incubaron durante 1 hora a RT con IgG anti-rata biotinilada (Vector) diluida 1:75 en PBS o IgG anti-ratón biotinilada (Vector) diluida 1:75 en PBS respectivamente. Las secciones reaccionaron entonces durante una hora a RT con un complejo de peroxidasa de rábano-avidina-biotina con componentes de los equipos "A" y "B" diluidos 1:75 en PBS (Vector Élite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA) . Las secciones se desarrollaron en peróxido de hidrógeno al 0.01%, 3 , 3 ' -diaminobencidina al 0.05% (DAB) a RT. Las secciones destinadas para la incubación con anticuerpos específicos de GFAP, MAC-1 AND MHC II se pretrataron con peróxido de hidrógeno al 0.6% a RT para bloquear la peroxidasa endógena después de incubarlos durante la noche con el anticuerpo primarios 4°C. Las secciones que reaccionaron con el anticuerpo GFAP se incubaron durante 1 hora a RT con IgG anti-ratón biotinilada elaborada en caballo (Vector Laboratories; Vectastain Élite ABC Kit) diluida 1:200 con TBS. Las secciones reaccionaron a continuación por una hora con un complejo de avidina-biotina peroxidasa (Vector Laboratories, Vectastain Élite ABC Kit) diluidas 1:1000 con TBS. Las secciones incubadas con el anticuerpo monoclonal jA fi'***'ife**,, ~* ^-^y tt_ específico de MAC-1 o MHC II como el anticuerpo primario reaccionaron subsecuentemente durante 1 hora a RT con IgG anti-rata biotinilada elaborada en conejo diluida 1:200 con TBS, seguida por incubación durante una hora con complejo avidina-biotina-peroxidasa diluida 1:1000 con TBS. Las secciones incubadas con los anticuerpos específicos de GFAP, MAC-1 y MHC II se visualizaron entonces para el tratamiento a RT con DAB al 0.05%, peróxido de hidrógeno al 0.01%, cloruro de níquel al 0.04%, TBS durante 4 y 11 minutos respectivamente. Las secciones mmunoetiquetadas se montaron en portaobjetos (VWR, Superfrost slides) , se secaron con aire durante la noche, se sumergieron en Propar (Anatech) y se cubrieron con cubreobjetos utilizando Permount (Fisher) con un medio de montaje. Para las placas Aß con colorante de contraste, se montó un subgrupo de secciones positivas GFAP en los portaobjetos Superfrost y se incubaron en Tioflavina S al 1% (Sigma) durante 7 minutos siguiendo el procesamiento inmunohistoquímico. Las secciones se deshidrataron entonces y se clarificaron en Propar, sobrepuestos entonces con cubreobjetos instalados con Permount. 8. Análisis de Imagen Un Sistema de Análisis de Imagen Videométrico 150 (Oncor, Inc. Gaithersburg, MD) unido a un microscopio Nikon Microphot-FX a través de una cámara de video CCD y un monitor Sony Trinitron se utilizó para la cuantificación de los cortes inmunoreactivos . La imagen de la sección se almacenó en la memoria intermedia de video y se determinó un umbral en base a la saturación y el color para seleccionar y calcular el área total de píxeles ocupara por las estructuras inmunoetíquetas . Para esta sección, el hipocampo se delineó manualmente y se calculó el área total de píxeles ocupada por el hipocampo. El porcentaje de carga amiloide se midió como: (la fracción del área del hipocampo que contenía depósitos Aß inmunoreactivos con mAb 3D6) x 100. De manera similar, la carga de porcentaje neurítico se midió como: (la fracción del área del hipocampo que contenía neuritis distrófica reactiva con el anticuerpo monoclonal 8E5) x 100. El Sistema de Imagen C (Compix, Inc., Cranberry Township, PA) que opera el programa de Aplicación de Software de 32 Muestras se une a un microscopio Nikon Microphot-FX a través de una cámara Optronics y se utiliza para cuantificar el porcentaje de corteza retroespinal ocupada por los astrositos GFAP-positivos y la microglia MAC-1- y MHC2 -positiva. La imagen de la sección inmunoreactiva se almacenó en una memoria intermedia de video y se determinó el umbral de base monocrómica para seleccionar y calcular el área total de píxeles ocupada por las células inmunoetiquetadas . Para cada sección, la corteza retroespinal (RSC) se delineó y se i f ÜtÉHlHir-' •»-^^*..^ffm^i^m^l*¡l m^ «AAf J» calculó el área tot bA e pixeles ocupada por la RSC. El porcentaje de astrositsftfee definió como : (la fracción de RSC ocupada por los astrositos GFAP-reactivos) X 100. De manera similar el porcentaje de microgliosis se definió como (la fracción) de la RSC ocupada por la microglia MAC-1- o MHC II-reactiva) X 100. Para todos loa análisis de imagen, se cuantificaron seis secciones en el nivel del hipocampo dorsal, cada una separada por intervalos de 240 µm consecutivos, para cada animal. En todos los casos el status de tratamiento de los animales fue desconocido al observador. XIV: Ensayo de Clasificación Ex vivo para la Actividad de un Anticuerpo contra Depósitos Amiloides Se estableció un ensayo ex vivo en el cual se cual se cultivaron células de microglia primarias, con secciones crioestáticas sin fijar de ya sea cerebros de ratón PDAPP o humano AD, a fin de examinar los efectos de los anticuerpos en la depuración de la placa. Las células de la microglia se obtuvieron a partir de las cortezas cerebrales de ratones DBA/2N neonatos (1-3 días) . Las cortezas se disociaron mecánicamente en HBSS" (Hanks' Balanced Saltt Solution, Sigma) con 50 µg/ml de DNasa I (Sigma) . Las células disociadas se filtraron con 100 µm de pigmento celular (Falcon) y se centrífugo a 1000 rpm durante 4 minutos. El pelet se resuspendió en medio de crecimiento (DMEM elevado en glucosa, 10% FBS, 25 ng/ml rmGM-CSF) y las células se ^ É máá á it colocaron en placas a una densidad de dos cerebros por matraz de cultivo de plástico T-75. Después de 7-9 días, los matraces se rotaron en un agitador orbital a 200 rpm durante 2 horas a 37°C. La suspensión celular se centrífugo a 1000 rpm y se resuspendió en el medio de ensayo. Secciones crioestáticas de 10-µm de cerebros de ratón PDAPP o humano AD (intervalo post mortem <3 horas) se descongelaron se montaron en cubreobjetos de vidrio redondos cubiertos con pol-lisina y se colocaron en placas de cultivo de tejido de 24 cavidades. Los cubreobjetos se lavaron dos veces con medio de ensayo que contenía H-SFM (Medio libre de suero de Hubridoma, Gibco BRL) con FBS al 1%, glutamina, penicilina/estreptomicina y 5 ng/ml rnGM-CSF (R&D) . Los anticuerpos control o anti-Aß se agregaron a una concentración de 2x (5 µg/ml final) durante 1 hora. Las células de microglia se sembraron entonces a una densidad de 0.8x 106 células/ml del medio de ensayo. Los cultivos se mantuvieron en un incubador humidificado (37°C, 5% C02) por 24 horas o más. Al final de la incubación, los cultivos se fijaron con paraformaldehido y se permeabilizaron con Triton- X100 al 0.1%. Las secciones se tiñeron con 3D6 biotinilado seguido por un conjugado de estreptavidina/Cy3 (Jackson ImmunoResearch) . Las células de microglia exógena se visualizaron mediante tinción nuclear (DAPI) . Los cultivos se observaron con un microscopio fluorescente invertido (Nikon, TE300) y se tomaron fotomicrografías con una cámara digital SPOT utili^jtado software SPOT (Instrumentos diagnósticos) . Para el análisis Western blot, se extrajeron los cultivos en urea 8M diluidos 1:1 en amortiguador de muestra de tricina reducido y se cargaron en un gel de tricina al 16% (Novex) . Después que se transfirieron en el inmobilon, los blots se expusieron a 5 µg/ml del pabAß42 seguido por un anticuerpo anti-ratón HRP-conjugado y se desarrolló con ECL (Amersham) . Cuando se realizó el ensayo con secciones de cerebro PDAPP en la presencia del anticuerpo 16C11 (uno de los anticuerpos contra Aß que no fueron eficaces in vivo) las placas ß-amiloides permanecieron intactas y no se observó fagocitosis. En contraste, cuando se cultivaron las secciones adyacentes en la presencia de 10D5, los depósitos amiloides pasaron grandemente y las células de la microglia mostraron numerosas vesículas fagocíticas que contenían Aß . Se obtuvieron resultados idénticos con secciones de cerebro AD; 10D5 indujo fagocitrosis de las placas de AD, mientras 16C11 fue inefectiva. Además, el ensayo proporcionó resultados comparables cuando se realizó con células de microgliales ya sea de ratón o humanas y con anticuerpos de ratón, conejo o primate contra Aß. La tabla 16 muestra los resultados obtenidos con varios anticuerpos contra Aß, que comprenden sus capacidades ...LA^^^. para inducir fagocitosis en el ensayo ex vivo y para reducir la carga de placa in vivo en estudios de transferencia pasiva. Aunque 16C11 y 21F12 se unen al péptido Aß sintético agregado con alta afinidad, estos anticuerpos que no fueron capaces de reaccionar con las placas ß-amiloides en las secciones de cerebro sin fijar, no podrían dirigir la fagocitosis en el ensayo ex vivo y no fueron eficaces in vivo. 10D5, 3D6 y el anticuerpo policlonal contra Aß estuvo activo en todas las tres mediciones. El anticuerpo 22C8 se une más fuertemente a una forma análoga de Aß natural en la cual el ácido aspar tico en las posiciones 1 y 7 se reemplaza con ácido aspar tico. Estos resultados muestran que la eficacia in vivo se debe a los anticuerpos dirigidos mediados por la depuración de las placas dentro del SNC y que el ensayo ex vivo predice la eficiencia in vivo. Se ha utilizado el mismo ensayo para probar la depuración de un anticuerpo contra un fragmento de sinucleina referido como NAC. La sinucleina a mostrado ser una proteína asociada a la placa amiloide. Un anticuerpo de NAC se puso en contacto con una muestra de tejido de cerebro que contenía placas amiloides, de una célula microglial, como anteriormente. Se utilizó suero de conejo como un control. El subsecuente monitoreo mostró una marcada reducción en el número y tamaño de las placas que es indicativa de la actividad depuradora del anticuerpo.

Tabla 16 El ensayo ex vivo como predictor de eficacia in vivo Anticuerpo Isotipo Actividad Unión a Eficacia Eficacia monoclonal para Aß placas ß- e vivo in vivo agregado amiloide (pM) 3D6 IgG2b 470 + + + 10D5 IgGl 43 + + + 16C11 IgGl 90 21F12 IgG2a 500 TM2a IgGl - Liclonal i _ ? mezcla 600 Se utilizó microscopía confocal para confirmar que se internalizó Aß durante el curso del ensayo ex vivo. En la presencia de anticuerpos de control, las células microgliales exógenas permanecieron en un plano confocal por encima del tejido, no hubo vesículas fagocíticas que contenían Aß y las placas permanecieron intactas dentro de la sección. En la presencia de 10D5 casi todo el material de las placas estuvo contenido en las vesículas dentro de las células microgliales exógenas. Para determinar el destino del péptido internalizado, se extrajeron los cultivos tratados con 10D5 con urea 8M en diferentes puntos de tiempo y se examinaron mediante análisis Western blot. A una hora de este tiempo, cuando ya no ocurría la fagocitosis, la reacción con una anticuerpo policlonal contra Aß reveló una fuerte banda de 4 kD (que corresponde al péptido Aß. La inmunoreactividad de Aß disminuyó a 1 día y estuvo ausente durante 3 días. Así, la fagocitosis de Aß mediada por el anticuerpo condujo a su degradación. Para determinar si la fagocitosis en el ensayo ex vivo estuvo mediada por Fc, se prepararon fragmentos F(ab')2 del anticuerpo 3D6 anti-Aß. Aunque los fragmento F(ab')2 permanecieron con su capacidad total para reaccionar con las placas no fueron capaces de dirigir la fagocitosis mediante las células microgliales. Además, la fagocitosis con el anticuerpo completo se pudo bloquear mediante un reactivo contra los receptores Fc murinos (anti-CD 16/32) . Estos datos indican que la depuración in vivo de Aß ocurre a través de la fagocitosis mediada por el receptor Fc . XV: Paso de Anticuerpos a través de la Barrera Sangre-Cerebro Estos experimentos descritos en la presente se realizaron a fin de proporcionar información en la capacidad de los anticuerpos para pasas hacia el cerebro después de la inyección intravenosa y proporcionar los medios para medir la concentración de anticuerpos suministrados al cerebro después de la inyección intravenosa en un tejido periférico de ya sea ratón normal o PDAPP. Tales mediciones son útiles en la predicción y determinación de las dosis efectivas. Los ratones PDAPP o control normales se , «. prefundieron con NaCl al 0.9%. Se desecaron regiones del cerebro (hipocampo cJji^erteza) y se congelaron rápidamente. + inhibidores de la proteasa. Se detectó la inmunoglobulina en estos extractos por medio de ELISA. La IgG Fab' 2 de cabra antiratón se cubrió en una placa RÍA como reactivo de captura. El suero o los extractos de cerebro se incubaron durante 1 hora. Se detectaron los isotipos con IgGl-HRP o IgG2a-HRP o IgG2b-HRP anti ratón (Caltag) . Los anticuerpos, con respecto al isotipo estuvieron presentes en el SNC a una concentración que es de 1:1000 que se encontró en la sangre. Por ejemplo, cuando la concentración de IgGl fue tres veces aquella de la IgG2a en la sangre, también la IgG2a estuvo tres veces en el cerebro, estando presentes a 0.1% ambos de sus niveles respectivos en sangre. Este resultado se observó tanto en ratones transgénicos como no transgénicos así los PDAPP no tienen una permeabilidad única. Aunque la invención anterior se ha descrito en detalle para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertas modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Todos los documentos de publicaciones y patentes citados en la presente se incorporan en la presente en su totalidad para todos los propósitos hasta el mismo grado como si cada una se denotara así individualmente.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición farmacéutica, que comprende un agente efectivo para inducir una respuesta inmune contra un componente amiloide en un paciente y un excipiente farmacéutico. 2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el componente amiloide es un péptido o proteína fibrilar. 3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en donde el componente amiloide se deriva de una proteína precursora fibrilar seleccionada del grupo que consiste de proteínas o péptidos que consisten de proteína A de Suero Amiloide (ApoSSA) , cadena ligera de inmunoglobulina, cadena pesada de inmunoglobulina, ApoAI, transtiretina, lisosima, cadena a de fibrógeno, gelsolina, cisteína C, Precursor de proteína ß amiloide (ß-APP) , microglobulina Beta2, proteína precursora del prion (PrP) , factor natriurético atrial, queratina, polipéptido amiloide de isleta, una hormona péptida y sinucleína; incluyendo proteínas mutantes, fragmentos de proteína y péptidos proteolíticos de los mismos. 4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, en donde dicho agente induce una respuesta inmune dirigida contra un neoepítope formado por dicha proteína o péptido fibrilar, con respecto a una proteína -fr?r-t i aft¿« JJ»fe¿)k.i precursora fibrilar. 5. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, en donde dicho componente amiloide se selecciona del grupo que consiste de AA, AL, ATTR, AApoAl, Alys, Agel, Acys, Aß, AB2M, AScr, Acal, AIAPP y fragmentos de sinucleína-NAC . 6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste de AA, AL, ATTR, AApoAl , Agel, Acys, Aß, AB2M, AScr, Acal, AIAPP y fragmentos de sinucleína-NAC. 7. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende un agente efectivo para inducir una respuesta inmunogénica contra al menos dos diferentes componentes amiloides. 8. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde dicho agente es un péptido enlazado a una proteína portadora. 9. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la composición incluye un adyuvante . 10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en donde dicho adyuvante se selecciona del grupo que consiste de QS21, lípido monofosforilo, alumbre y adyuvante de Freund. 11. Un método para prevenir o tratar un trastorno „ ,a.¿¿lyíyy .¡liÍiy¡:¡yM¡ caracterizado por la deposición amiloide en un sujeto mamífero, que comprende administrar al sujeto una dosis de un agente efectivo para producir una respuesta inmune contra un componente amiloide característico de dicho trastorno. 12. El método de la reivindicación 11, en donde dicho componente amiloide es una próteína o péptido fibrilar. 13. El método de la reivindicación 12, en donde dicha respuesta inmune se dirige al componente fibrilar derivado de la proteína precursora seleccionada del grupo que consiste de proteína A de Suero Amiloide (ApoSSA) , cadena ligera de inmunoglobulma, cadena pesada de inmunoglobulina, ApoAI , transtiretina, lisosima, cadena a de fibrógeno, gelsolina, cisteína C, Precursor de proteína ß amiloide (ß- APP) , microglobulina Beta2, proteína precursora del prion (PrP), factor natriurético atrial, queratina, polipéptido amiloide de isleta, una hormona péptida y sinucleína; incluyendo proteínas mutantes, fragmentos de proteína o péptidos de los mismos. 14. El método de la reivindicación 13, en donde dicho agente induce una respuesta inmune dirigida contra un neoepítope formado por dicho componente amiloide, con respecto a dicha proteína precursora. 15. El método de la reivindicación 13, en donde dicho componente amiloide se selecciona del grupo que consiste de AA, AL, ATTR, AapoAl, Alys, Agel, Acys, Aß, AB2M, AScr, Acal, AIAPP y fragmentos de sinucleína-NAC. 16. El métofo de la reivindicación 15, en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste de AA, AL, ATTR, AapoAl, Agel, Acys, Aß, AB2M, AScr, Acal, AIAPP y fragmentos de sinucleína-NAC. 17. El método de la reivindicación 11, en donde dicho agente es efectivo para inducir una respuesta inmunogénica contra al menos dos diferentes componentes amiloides . 18. El método de la reivindicación 17, en donde dicha administración incluye administrar al menos dos componentes fibrilares amiloides. 19. El método de la reivindicación 11, en donde dicho agente es un péptido enlazado a una proteína portadora. 20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11-19, en donde dicha administración incluye además un adyuvante. 21. El método de la reivindicación 20, en donde dicho adyuvante se selecciona del grupo que consiste de QS21, lípido monofosforilo, alumbre y adyuvante de Freund. 22. El método de la reivindicación 11, en donde dicha respuesta inmunológica se caracteriza por un título de suero de al menos 1:1000 con respecto a dicho componente amiloide . 23. El método de la reivindicación 22, en donde dicho título de suero es al menos 1:1500 con respecto a dicho componente fibrilar. 24. El método de la reivindicación 11, en donde dicha respuesta inmunológica se caracteriza por una cantidad de suero de inmunoreactividad que corresponde a más de aproximadamente cuatro veces mayor que un nivel de suero de inmunoreactividad medido en una muestra de suero control de pre-tratamiento. 25. El método de la reivindicación 24, en donde dicha cantidad de suero de inmunoreactividad se mide en una dilución de suero de aproximadamente 1:100. 26. El método para determinar la prognosis de un paciente que experimenta un tratamiento para un trastorno amiloide, que comprende medir una cantidad de inmunoreactividad del suero del paciente contra un componente amiloide seleccionado, en donde la cantidad de inmunoreactividad del suero del paciente de al menos cuatro veces un nivel control de línea basal de inmunoreactividad del suero es indicativa de la prognosis del estado mejorado con respecto a dicho trastorno. 27. El método de la reivindicación 26, en donde dicha cantidad de inmunoreactividad del suero del paciente contra dicho componente amiloide seleccionado se caracteriza por el título de suero de al menos aproximadamente 1:1000. 28. El método de la reivindicación 27, en donde ii¿«Í*tfe.j a^*^?««irtAfc?«u^ dicha cantidad de inmunoreactividad en suero de un paciente contra dicho componente amiloide seleccionado se caracteriza por un título de suero de al menos 1:5000. 29. Un método ptra prevenir o tratar una enfermedad caracterizada por un depósito amiloide en un paciente, que comprende administrar a dicho paciente una dosis efectiva de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un componente amiloide presente en dicho depósito. 30. El método de la reivindicación 29, en donde dicho componente amiloide es un componente fibrilar. 31. El método de la reivindicación 30, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a un epítope de dicho componente fibrilar. 32. El método de la reivindicación 31, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une específicamente a dicho componente fibrilar sin unirse a un precursor de dicho componente fibrilar. 33. El método de la reivindicación 30, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano en dicho componente fibrilar preparado a partir de células B de un humano inmunizado con un epítope de un componente fibrilar. 34. El método de la reivindicación 30, en donde dicho componente fibrilar amiloide se deriva de una proteína precursora seleccionada del grupo que consiste de proteína A Amiloide de Suero (ApoSSA) , cadena ligera de inmunoglobulina, cadena pesada de i munoglobulma, ApoAI , transtiretina, lisosima, cadena a de fibrógeno, gelsolina, cisteína C, Precursor de proteína ß amiloide (ß-APP) , microglobulina Beta2, proteína precursora del prion (PrP) , factor natriurético atrial, queratina, polipéptido amiloide de isleta, una hormona péptida y sinucleína; incluyendo proteínas mutantes, fragmentos de proteína o péptidos de los mismos . 35. El método de la reivindicación 34 en donde dicho componente fibrilar amiloide se selecciona del grupo que consiste de AA, AL, ATTR, AapoAl, Alys, Agel, Acys, Aß, AB2M, AScr, Acal, AIAPP y fragmentos de sinucleína-NAC. 36. El método de la reivindicación 29, en donde dicha administración incluye administrar anticuerpos que se unen a al menos dos componentes fibrilares amiloides. 37. El método de la reivindicación 29 en donde dicha dosis efectiva se caracteriza por un nivel en el paciente de una cantidad de suero de inmunoreactividad contra dicho componente amiloide que es al menos cuatro veces mayor que un nivel de suero de inmunoreactividad contra dicho componente medido en la muestra de suero control de pretratamiento. 38. El método de la reivindicación 29, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra con un t.a-fc Laá, .?u M~*?t*** ' - '--"--- rH* Af?-i,. «y»„........ < vehículo como una composición farmacéutica. 39. El método de la reivindicación 29, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra intraperitonealmente, oralmente, subcutáneamente, intramuscularmente, intranasalmente, tópicamente o intravenosamente . 40. El método de la reivindicación 29, en donde el anticuerpo se administra al administrar un polinucleótido que codifica al menos una cadena de anticuerpos a un paciente y en donde el polinucleótido se expresa para producir la cadena de anticuerpos en el paciente. 41. El método de la reivindicación 40, en donde el polinucleótido codifica las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, cuyo polinucleótido se expresa para producir las cadenas pesada y ligera en el paciente. 42. El método de la reivindicación 29, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra en múltiples dosis durante un periodo de al menos seis meses. 43. El método de la reivindicación 29, en donde el anticuerpo se administra como una composición de liberación sostenida. 44. Una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad caracterizada por un depósito amiloide en un paciente, que comprende una dosis efectiva de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une áttÉ ü üiüittteiiÉ f^'a»"t-s-* "Mj específicamente a un componente amiloide presente en dicho depósito. 45. La composición farmacéutica de la reivindicación 44, en donde dicho componente amiloide es un componente fibrilar. 46. La composición farmacéutica de la reivindicación 45, en donde dicho anticuerpo se une a un epítope de dicho componente fibrilar. 47. La composición farmacéutica de la reivindicación 46, en donde el anticuerpo se une específicamente a dicho componente fibrilar sin unirse a un precursor de dicho componente fibrilar. 48. La composición farmacéutica de la reivindicación 46, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano para dicho componente fibrilar preparado a partir de células B de un humano inmunizado con un epítope del componente fibrilar. 49. La composición farmacéutica de la reivindicación 45, en donde dicho componente fibrilar amiloide se deriva de una proteína precursora seleccionada del grupo que consiste de proteína A Amiloide de Suero (ApoSSA) , cadena ligera de inmunoglobulina, cadena pesada de inmunoglobulina, ApoAI, transtiretina, lisosima, cadena a de fibrógeno, gelsolina, cisteína C, Precursor de proteína ß amiloide (ß-APP) , microglobulina Beta2, proteína precursora del prion (PrP), factor natriurético atrial, queratina, polipéptido amiloide de isleta, una hormona péptida y sinucleína; incluyendo proteínas mutantes, fragmentos de proteína o péptidos de los mismos. 50. La composición farmacéutica de la reivindicación 49 en donde dicho componente fibrilar amiloide se selecciona del grupo que consiste de AA, AL, ATTR, AapoAl, Alys, Agel, Acys, Aß, ABM, AScr, Acal, AIAPP y fragmentos de sinucleína-NAC . 51. La composición farmacéutica de la reivindicación 44, en donde dicha composición incluye anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unan a al menos dos componentes fibrilares amiloides. 52. La composición farmacéutica de la reivindicación 44 en donde dicha dosis efectiva se caracteriza por una cantidad de anticuerpo o fragmento de anticuerpo efectiva para producir un nivel en el suero del paciente de inmunoreactividad contra dicho componente amiloide que es al menos aproximadamente cuatro veces mayor que un nivel de suero de inmunoreactividad contra dicho componente medido en una muestra de suero control de pretratamiento. 53. La composición farmacéutica de la reivindicación 44, en donde la composición farmacéutica incluye un vehículo t i^jmá MÉM áimi 54 La composición farmacéutica de la reivindicación 44, en donde la composición farmacéutica se formula para la administración intraperitonealmente, oralmente, subcutáneamente, intramuscularmente, intranasalmente, tópicamente o intravenosamente. 55. La composición farmacéutica de la reivindicación 44, en donde la composición farmacéutica incluye un polinucleótido que codifica al menos una cadena de anticuerpos efectiva para expresar la cadena de anticuerpos en el paciente. 56. La composición farmacéutica de la reivindicación 55, en donde el polinucleótido codifica las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, cuyo polinucleótido es capaz de la expresión para producir las cadenas pesada y ligera en el paciente. 57. La composición farmacéutica de la reivindicación 44, en donde dicha composición farmacéutica se formula como una composición de liberación sostenida. iM** t~ *Í? *&¡? y*A ?*?«^? - Se y métodos farmacéuticos para prevenir o tratar varias enfermedades amiloides, incluyendo la enfermedad de l^eim r, enfermedades de prion, familias de neuropatías amiloides y lo similar. Las composiciones farpwpéuticas incluyen cantidades inmunológicamente reactivas de componentes fibrilares amiloides, particularmente péptidos o proteínas formadoras de fibrillas. También se deádéíben composiciones y métodos terapéuticos que utilizan reactivos inmunes que reaccionan con tales componentes fibrilares. ?[ HW ««attiáhifcaW tfc ft^Aai