MXPA01011078A

MXPA01011078A - Polimeros solubles de ramas de glucosa y su procedimiento de obtencion.

Info

Publication number: MXPA01011078A
Application number: MXPA01011078A
Authority: MX
Inventors: Jean-Jacques Caboche
Original assignee: Roquette Freres
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2002-07-22
Also published as: NO20015224D0; CN1197878C; CN1349544A; DE60013271T2; AU777378B2; KR100803833B1; KR20020010622A; DK1177216T3; JP4823421B2; EP1177216A1; WO2000066633A1; ATE274525T1; CA2371185A1; FR2792941A1; CA2371185C; AU4305200A; NO20015224L; JP2002543248A; PT1177216E; NO330330B1

Abstract

La invencion tiene por objeto los polimeros solubles de glucosa ramificados que no contienen sustancialmente ligaduras 3 glucosidicas, caracterizados por el hecho de que presentan entre 2.5 y 10 por ciento de ligaduras glucosidicas a-1, 6, una tendencia muy debil o nula a la retrogradacion en solucion acuosa, determinada segun una prueba A, un Mp determinado segun una prueba C con un valor centrado del perfil de distribucion de masas moleculares comprendido entre 10(4 subindice) y 10(8 subindice) daltons y un contenido en azucares reductores cuando mas igual a 9 por ciento.

Description

POLÍMEROS SOLUBLES DE RAMAS DE GLUCOSA Y SU PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN La invención tiene por objeto polímeros solubles de 5 glucosa ramificados que no contienen sustancialmente ligaduras ß glucosidicas, que presentan contenidos particulares en ligaduras glucosidicas a-1, 6, una excelente estabilidad en solución experimentada por su poca tendencia a la retrogradación y una notable distribución de los pesos 10 moleculares en un intervalo comprendido entre 104 y 108 daltons . Estos polímeros solubles de glucosa ramificada presentan por otro lado un bajo contenido de azúcares reductores y una poca viscosidad. 15 La invención se refiere igualmente a un procedimiento de fabricación de dichos polímeros solubles de glucosa ramificados. Considera además las composiciones que comprenden estos polímeros solubles de glucosa ramificados que es posible utilizar en numerosas aplicaciones 20 industriales y especialmente en las industrias alimentarias. En el sentido de la invención, los polímeros solubles de glucosa ramificados que no contienen sustancialmente ligaduras ß glucosidicas son los polímeros de glucosa enlazada en a-1, y que presentan numerosos puntos de 25 ramificación (también denominados puntos de derivación) en a- M¡a¡^ÉagÉi>¿ 1,6, y menos del 5 por ciento de ramificación en ß, es decir en ß-1,2, ß-1,3, ß-1,4 ó ß-1,6. Los polímeros de glucosas clásicamente accesibles industrialmente están especialmente provistos de almidones naturales o híbridos de sus derivados. Generalmente el almidón está constituido por dos polímeros, la amilosa y la amilopectina . La amilosa es la fracción que encierra los homopolimeros lineales de glucosa enlazados en a-1, 4 y algunos puntos de ramificación en a-1, 6. La amilopectina es en si la fracción ramificada, constituida de cadenas lineales de glucosa a-1, 4 enlazadas a otras cadenas lineales de glucosa en a-1, 4 mediante los puntos de ramificación en a-1, 6. La asociación de estos dos homopolimeros, empaquetados bajo la forma de granulos de almidón muy bien estructurados, constituye la reserva de fuente carbonada de la planta. El almidón producido en cada planta está constituido por un porcentaje variable de cada uno de sus constituyentes amilosa y amilopectina, incluso también una distribución particular de los pesos moleculares de cada uno de dichos homopolimeros de glucosa. Lo que explica la razón por la cual los diversos almidones y sus derivados habitualmente se clasifican en función de su origen botánico. Las propiedades funcionales de los almidones y de sus derivados además están directamente en función de su contenido de amilosa y amilopectina. De este modo, cuando se calienta una suspensión de almidón más allá de la temperatura de gelatinización, el granulo de almidón inflado, y la amilosa se solubilizan preferencialmente . Sin embargo, cuando se enfria la suspensión, los homopolimeros de glucosa se retrogradan, rápidamente para la amilosa (algunas horas), y de manera más lenta para la amilopectina (algunos dias). Ahora bien, los especialistas del dominio de utilización de los almidones y los derivados del almidón en la industria alimentaria están de acuerdo en decir que este fenómeno de retrogradación afecta la textura de los alimentos, y disminuye la duración de su vida. Se conoce cómo volver más aceptables estos productos, y los preparan a partir de productos amilazados ricos en amilopectina, y donde por ejemplo a partir de variedades cerosas. Sin embargo, la estabilidad de los gels y enlazadores obtenidos a partir de dichos productos amilazados ricos en amilopectina no es suficiente para las necesidades de las industrias alimentarias, donde es necesario tener una duración de almacenamiento de varios meses . Una primera solución consiste en estabilizar los homopolimeros de glucosa, y esto gracias a los agentes químicos. Esta operación parte del tiempo se efectúa por el empleo de reacciones de esterificación o de eterificación. Puede tratarse especialmente de reacciones de acetilación o de hidroxipropilación. Además, para obtener las propiedades de textura y de viscosidad deseadas, estas reacciones 5 frecuentemente se asocian a una reacción de reticulación. Estas modificaciones confieren entonces las propiedades reológicas notables a los almidones, los vuelven más resistentes a los tratamientos mecánicos como el cizallamiento, o a los medios ácidos. La acetilación o la 10 hidroxipropilación confieren además una buena estabilidad al almacenamiento después de la cocción, especialmente a baja temperatura . Sin embargo, los productos asi obtenidos presentan el inconveniente de ser tratados químicamente, lo que 15 frecuentemente es percibido mal por los consumidores. Una segunda solución consiste en aislar el almidón a partir de las plantas en donde ciertos genes implicados en la biosintesis del almidón fueron alterados, lo que confiere a los almidones asi modificados propiedades particulares. 20 Puede tratarse de variedades mutantes o híbridas, afectadas a nivel de genes cerosos (waxi) (wx) , extensores de amilosa (ae) , dull (du) , opaco (o) encogido (shrunken) (sh), frágil (brittle) (bt) , o sucaroso (su) . La patente 4.767.849 describe asi el almidón 25 extraído de una variedad de maiz homocigoto para el genotipo B||gM|flgaaar|iíttfi aflk wx/sh-1, lo que confiere a los almidones granulados asi obtenidos propiedades de estabilidad a la retrogradación en ciclos de congelación/descongelación (clásicamente llamados ciclos de cong/descong) equivalentes a los almidones modificados químicamente. Sin embargo, estas variedades obtenidas por cruza entre dos variedades de genotipo wx y sh no presentan más que un contenido de almidón compuesto entre 1 y 20 por ciento del contenido de almidón normalmente sintetizado por las variedades llamadas de tipo silvestre. Se puede tratar igualmente de plantas genéticamente modificadas, obtenidas mediante la modificación dirigida de un gen o de un conjunto de genes que codifican para las enzimas que intervienen en la biosintesis del almidón. Las estrategias de extinción o de amplificación génica en la planta, de los genes que codifican por ejemplo para las enzimas de desramificación o de ramificación del almidón adecuados a la planta, o de origen exógeno, tales como genes de biosintesis de glicógeno de las bacterias, se han descrito abundantemente . Sin embargo, es forzoso constatar, como en el caso de las plantas mutantes o híbridas, que si los almidones asi modificados presentan propiedades equivalentes a los almidones modificados químicamente, los contenidos de almidón de las plantas asi obtenidos están lejos de ser industrialmente satisfactorios.

Una primera alternativa a estos procedimientos consiste en utilizar las enzimas de tipo a-amilasa, a-amilasa, pululanasa, iso-amilasa para modificar in vi tro los almidones originales con el fin de conferirles ciertas de las propiedades de los almidones modificados químicamente. Normalmente hay más problemas relacionados a las cantidades empleadas . La solicitud de patente europea EP 539.910 describe asi un procedimiento de preparación de granulos de almidón modificados por un tratamiento de a-amilasa, para obtener productos de menos viscosidad. Sin embargo, este procedimiento no considera más que alterar la estructura del granulo de almidón, sin modificar profundamente los constituyentes . La patente europea EP 574.721 describe la preparación de un producto amilazado con alto contenido de amilopectina estable, que no utiliza tratamiento químico propiamente dicho, sino que efectúa una reacción de hidrólisis controlada con la ß-amilasa sobre un almidón granular original. El producto asi preparado presenta entonces una ausencia de sineresa y de modificación de viscosidad en el tiempo y es estable en la congelación/descongelación. Sin embargo, este procedimiento necesita una etapa de tratamiento térmico previo, a una temperatura comprendida entre 65 y 75°C, para gelatinizar el almidón antes de realizar la hidrólisis enzimática propiamente dicha. Además, sobre todo es necesario controlar el régimen de hidrólisis para limitarla a un valor comprendido entre 5 y 20 por ciento. Otra alternativa a los procedimientos considerados para modificar químicamente los almidones originales, o para extraer almidones originales que poseen propiedades de almidones modificados a partir de plantas mutantes, híbridas o genéticamente modificadas, consiste en introducir in vi tro 10 nuevos puntos de ramificación en el almidón. Se trata entonces de conducir un remanente de las cadenas de amilopectina o de amilosa, además de emplear reacciones de estabilización y/o de reticulación como se indica anteriormente. 15 Se emplean dos técnicas habitualmente. La primera utiliza medios térmicos, la segunda enzimas purificadas de biosintesis de glicógeno y/o de almidón, tales como las enzimas de ramificación de glicógeno o de almidón, responsables respectivamente de la síntesis de los puntos de 0 ramificación en a-1, 6 de glicógeno, o los puntos de | ramificación de a-1, 6 de la amilopectina y de algunos puntos de ramificación de la amilosa. La solicitud de patente internacional WO 95/22562 describe por ejemplo dextrinas de tipo almidón, 25 caracterizadas por su peso molecular comprendido entre 15xl03 MHbttb y 107 daltons, y un grado de ramificación comprendido entre 2 y 8 por ciento, obtenidos mediante el tratamiento, en condiciones acidas (ácido ortofosfórico a 0.17 por ciento en peso de almidón) y con una temperatura comprendida entre 110 a 140°C durante 1 a 15 horas, de almidón granular nativo, especialmente de la fécula de papa. La composición asi obtenida se destina a los deportistas como aporte energético después de un esfuerzo físico. Sin embargo, este tratamiento es largo y muy pesado de emplear, y conduce a polímeros de glucosa que encierran, además un contenido elevado de ligaduras a-1, 6 (de preferencia comprendida entre 3 y 7 por ciento) , de nuevos tipos de ligaduras que no existen normalmente en el almidón original. Los análisis por resonancia magnética nuclear (RMN) revelan en efecto ligaduras del tipo ß-1,4, ß-1,6, y ligaduras alfa distintas de a-1, y en a-1, 6. De todo lo que precede, resulta que hay una necesidad no satisfecha de disponer, por un lado, de polímeros de glucosa que presenten propiedades notables, especialmente en términos de estabilidad, de solubilidad y eventualmente de viscosidad y confieran también a los productos que los contienen las capacidades mayores de duración de vida y de digestibilidad, y por otro lado, de obtenerlos sin utilizar técnicas químicas o físicas, ni de recurrir a las extracciones a partir de plantas mutantes o genéticamente modificadas. La compañía Solicitante tuvo el mérito de conciliar todos estos objetivos hasta ahora con reputación de ser difícilmente conciliables imaginando y elaborando, al precio 5 de numerosas investigaciones, tipos novedosos de productos, a saber, nuevos polímeros solubles de glucosa ramificados que no contienen sustancialmente ligaduras ß glucosidicas. Los polímeros solubles de glucosa ramificados no contienen sustancialmente relaciones ß glucosidicas conforme 10 a la invención se caracterizan asi por el hecho de que poseen entre 2.5 y 10 por ciento de relaciones glucosidicas a-1, 6, una tendencia más débil o nula a la retrogradación en solución acuosa, determinada según una prueba A y un peso molecular determinado según una prueba C con un valor 15 centrado del perfil de distribución de las masas moleculares comprendido entre 104 y 108 daltons. Los polímeros de glucosa ramificados conforme a la información presentan por otro lado un contenido bajo de azúcares reductores, cuando más igual a 9 por ciento y una 20 viscosidad determinada según una prueba B, para 3 gramos de producto seco, cuando menos igual a 5.000 centipoises. El contenido de ligaduras glucosidicas a-1, 6 de los polímeros solubles de glucosa ramificados conforme a la invención determinado por el análisis de resonancia magnética 25 nuclear de protón, es de 2.5 a 10 por ciento, expresado en «áMlalÍa«Ía«aaaMaa«IÍM número de relaciones a-1, 6 con respecto al número total de relaciones glucosidicas a-1, y a-1, 6 de dichos polímeros de glucosa ramificados. Este contenido de relaciones glucosidicas a-1, 6, confiere a todo polímero de glucosa conforme a la invención una estructura particular, en términos de grado de ramificación y/o de longitudes de las cadenas ramificadas con respecto al almidón o del derivado de almidón de donde fue obtenido. Los polímeros solubles de glucosa ramificados conforme a la invención presentan igualmente una débil tendencia a la retrogradación en solución acuosa, determinada según una prueba A. Esta prueba consiste en establecer la aptitud a la retrogradación de un producto dado en el curso de ciclos repetidos de congelación/descongelación. La retrogradación observada del producto, y de la entalpia de desestructuración del producto que ha podido retrogradarse, determinado por el Análisis Calorimétrico Diferencial re-enseñan asi la estabilidad del producto considerado. La prueba A consiste más precisamente en efectuar una preparación acuosa del producto a probar a 40 por ciento de materia seca. Se efectúan diferentes tomas de muestra en crisoles herméticamente cerrados. El conjunto de los crisoles se lleva durante 15 minutos a una temperatura de 100°C para realizar la gelatinización o la puesta en solución, y se someten luego esos crisoles a un tratamiento de ciclos de congelación/descongelación, cada uno de los ciclos que consiste en llegar a mantener dicha preparación durante 15 minutos a una temperatura de -20°C, luego a una temperatura de 20°C y mantenerla luego durante 1 hora y media a esta temperatura. Se realiza después un análisis calorimétrico diferencial a cada ciclo, con el equipo PERKIN ELMER, para la determinación de la entalpia de desestructuración del producto que ha podido entonces retrogradarse. La estabilidad de los ciclos de congelación/ descongelación se aprecia asi en primer lugar por el número de ciclos de congelación/descongelación más allá del cual se puede realizar esta medición del valor de entalpia requerida para desestructurar el gel de almidón que ya se ha retrogradado. Los polímeros de glucosa según la invención sometidos a estos ciclos repetidos de congelación/ descongelación presentan, de manera sorprendente e inesperada, una "débil tendencia a la retrogradación", es decir aquí una ausencia parcial, incluso total de retrogradación según la prueba A en función de su contenido de ligaduras glucosidicas a-1, 6.

Es asi que los polímeros de glucosa según la invención que presentan un contenido en ligaduras glucosidicas a-1, 6 comprenden entre 2.5 y 5 por ciento, no comienzan a retrogradarse significativamente más allá del octavo ciclo de congelación/descongelación, presentando un bajo valor de entalpia de retrogradación, como se ejemplificará más adelante en la presente. Se califican los polímeros de glucosa ramificados que presentan una "tendencia muy débil a la retrogradación". En cuanto a los polímeros de glucosa según la invención que presentan un contenido de ligaduras glucosidicas a-1, 6 comprendida entre 5 y 10 por ciento, ninguna retrogradación de la solución se constata después de 12 ciclos de congelación/descongelación, lo que explica por qué ninguna entalpia de desestructuración puede ser establecida . Es particularmente sorprendente que los polímeros de glucosa según la invención, pueden presentar esta estabilidad. En efecto, las mediciones efectuadas, en la prueba A, sobre los almidones waxy y los almidones waxy reticulados y acetilados (tales como los preparados siguiendo las enseñanzas de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 2,928,828) se retrogradan entre el cuarto y el sexto ciclo de congelación/descongelación, como se desmotrará en el ejemplo 2.

No existen asi, según el conocimiento de la compañía solicitante, polímeros de glucosa que presentan esta estabilidad. Esta propiedad destinada naturalmente a los polímeros de glucosa ramificados según la invención con composiciones utilizables en la industria alimentaria, que presenta entonces estabilidades elevadas al almacenamiento. Otra ventaja de la invención es permitir la obtención de un producto terminado, utilizable por ejemplo como ligadura instantánea en los productos refrigerados o sobre-refrigerados . La determinación del valor centrado del perfil de distribución de las masas moleculares de los polímeros solubles de glucosa ramificados según la invención se realiza mediante la medición de la distribución de las masas moleculares medias en peso (Mp) . En la práctica los valores de las masas moleculares promedio en peso no se calculan, sino se miden mediante diferentes técnicas. Se utiliza por ejemplo un método de medición adaptado a los polímeros de glucosa, que descansa en la cromatografía de permeación en gel sobre las columnas de cromatografía escalonadas con pululantes de masas moleculares conocidas . La prueba C, elaborada por la compañía Solicitante para determinar el valor central del perfil de distribución de las masas moleculares características de los polímeros solubles de glucosa ramificados conforme a la invención consiste en: - establecer el perfil de distribución molar de las fracciones cromatográficas de dichos polímeros solubles de glucosa ramificados, - determinar el valor llamado "valor central del perfil de distribución de las masas moleculares" que corresponde al valor del pico medio de distribución de los pesos moleculares de la población que representan más del 90 por ciento de las fracciones cromatográficas emitidas de dicha cromatografía separativa de permeación de gel. Los polímeros de glucosa ramificados según la invención presentan entonces un valor central Mp del perfil de distribución de masas moleculares comprendido entre 104 y 109 daltons. De manera ventajosa, los polímeros solubles de glucosa según la invención se pueden clasificar en dos familias, la primera familia que presenta un valor de Mp central del perfil de distribución de masas moleculares comprendido entre 105 y 106 daltons, y la segunda familia presenta un valor Mp centrado del perfil de distribución de masas moleculares comprendido entre 107 y 108 daltons. Los polímeros solubles de glucosa ramificados según la invención presentan por otro lado un bajo contenido de azúcares reductores. La determinación del poder reductor de los polímeros de glucosa ramificados según la invención, mediante cualquier método conocido por el experto en la técnica, 5 conduce a los valores cuando más igual a 9 por ciento. De manera ventajosa, los polímeros de glucosa ramificados se pueden clasificar en dos subfamilias en función de su contenido en azúcares reductoras. La primera subfamilia presenta un contenido en 10 azúcares reductores cuando más igual a 1 por ciento. La segunda subfamilia presenta un contenido en azúcares reductores comprendido entre 5.5 y cuando más 9 por ciento. La compañía Solicitante además ha encontrado que 15 los polímeros de glucosa ramificados según la invención presentan perfiles reológicos particulares. El análisis de viscosidad de los polímeros de glucosa ramificados según la invención se realiza gracias a una prueba B elaborada por la compañía Solicitante para esta 20 gama particular de productos. No se trata en efecto aquí de productos granulares como habitualmente se describen y analizan en el estado de la técnica, sino de polímeros de glucosa ramificados que presentan de manera sorprendente e inesperada una solubilidad 25 notable en el agua fría. _aa_dla-_-a?É__ La prueba B consiste en preparar primero el producto a analizar mediante la precipitación con etanol, secado al vacio luego molido en mortero, y finalmente tamizado en tamiz de malla de 125 mieras. Una masa comprendida entre 3 y 15 gramos del producto seco para analizar asi obtenido se introduce entonces, con 6.75 gramos de glicerol con 98 por ciento de pureza, en el tazón de un analizador Rapid Visco Analyser (RVA - NewPort Scientific) , y el ensamble se homogeniza cuidadosamente con ayuda de una microespátula . Una cantidad de agua desmineralizada se añade entonces, con el fin de obtener una masa final de 28 gramos. El ensamble inmediatamente se agita. El perfil de análisis tiempo/temperatura y velocidad en el RVA se realiza entonces como sigue. La muestra se agita a 100 rpm a una temperatura de 25°C durante 5 segundos, luego a 500 rpm durante 25 segundos. La agitación se mantiene a 160 rpm durante el resto del perfil. La temperatura inicial de 25°C se mantiene durante 10 minutos, luego se aumenta a 90°C en 8 minutos. Esta temperatura de 90°C se mantiene luego 3 minutos, disminuida a 30°C en 8 minutos, luego se mantiene a este valor de 30°C durante 5 minutos. La viscosidad retenida es la viscosidad medida en centiposes (cP) al final del perfil de análisis, a 34 minutos.

Los polímeros de glucosa ramificados según la invención presentan entonces una viscosidad cuando más igual a 5,000 centipoises por 3 gramos secos del producto. La compañía Solicitante igualmente encontró que estos valores de viscosidad de los polímeros de glucosa ramificados según la invención son del mismo orden de tamaño que los valores de viscosidad, determinados después de la misma prueba B, de los almidones waxi fluidificados mediante tratamiento ácido. Sin embargo, los análisis complementarios de medición de viscosidad efectuados después de 7 dias de almacenamiento a 4°C, permitieron poner en evidencia, de manera sorprendente e inesperada, una notable estabilidad de la viscosidad de los polímeros de glucosa ramificados, en oposición a dichos almidones waxi fluidificados de la misma viscosidad, como se ejemplificará más adelante en la presente . Estos productos pueden asi ventajosamente ser utilizados para la fabricación de preparaciones alimentarias liquidas instantáneas, y sobre todo pueden permitir asegurar el almacenamiento de larga duración a baja temperatura. Los polímeros solubles de glucosa ramificados según la invención se adaptan particularmente bien a las composiciones destinadas a ser utilizadas en las industrias especialmente del papel-cartón, de textiles, de farmacias, cosméticos, y en particular de la alimentaria. Para preparar los polímeros solubles de glucosa ramificados según la invención, se realiza la sucesión de las etapas siguientes que consiste en que: a) se somete una suspensión glucosa de almidón o de derivado de almidón de una materia seca cuando menos igual a 1 por ciento en peso, de preferencia de 2 a 50 por ciento en peso, a una temperatura superior a 130°C, de preferencia comprendida entre 140 y 150°C, bajo una presión de más de 3.5 bars, de preferencia comprendida entre 4 a 5 bars durante cuando menos 2 minutos, de preferencia durante 2 a 5 minutos, b) se trata el almidón asi obtenido con 50 a 2,000 unidades de enzima de ramificación purificada a una temperatura comprendida entre 25 y 50°C, de preferencia a una temperatura de 30°C durante una duración de 10 minutos a 24 horas, c) se recuperan los polímeros de glucosa ramificados asi obtenidos. El almidón se introduce en solución acuosa a un material seco cuando menos igual a 1 por ciento en peso, de preferencia de 2 a 50 por ciento en peso. La elección de un origen, o de una calidad de almidón o de sus derivados particulares, no tiene más que una importancia relativa. La compañía Solicitante encontró que los polímeros de glucosa ramificados según la invención son fácilmente sintetizables a partir de almidones o de sus derivados, que presentan ya una tasa de ramificación cuando menos igual a 1 por ciento. Esta suspensión de almidón o de los derivados de almidón se somete luego a un tratamiento por cocción particular, que consiste en tratar a una temperatura superior a 130°C, de preferencia comprendida entre 140 y 150°C, bajo una presión de más de 3.5 bars, de preferencia comprendida entre 4 a 5 bars durante cuando menos 2 minutos, de preferencia durante 2 a 5 minutos. Este tratamiento se realiza ventajosamente en una caldera tubular de doble envoltura calentada por fluido térmico, equipo que es fácil conseguir para un técnico con experiencia. La segunda etapa del procedimiento según la invención consiste en tratar el almidón asi obtenido con de 50 a 2,000 unidades de enzima de ramificación purificada a una temperatura comprendida entre 25 y 50°C, de preferencia a una temperatura de 30°C por una duración de 10 minutos a 24 horas. Las enzimas de ramificación se eligen en el grupo constituido de las enzimas de ramificación de glicógeno y de enzimas de ramificación del almidón. Más preferencialmente, se elige la enzima de ramificación de glicógeno de Escherichia coli , y las enzimas de ramificación del almidón, y más preferencialmente todavía las enzimas de ramificación del almidón de tipo I y del tipo II del maíz, o también del almidón de alga unicelular, por ejemplo las del alga verde Chlamydomonas reinhardtii . El aislamiento de dichas enzimas de ramificación del glicógeno o del almidón se puede efectuar por cualquier medio conocido en si por el experto en la técnica. Con referencia a las enzimas de ramificación de alga unicelular, la compañía Solicitante recomienda sin embargo emplear el procedimiento de preparación descrito en la solicitud de patente francesa presentada bajo el número 98/12051, de la cual ésta es titular. El acceso a las enzimas purificadas se puede realizar a partir de la mezcla de enzima de alga asi obtenida, empleando directamente técnicas de separación cromatográfica conocidas por si mismas, o mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante . Puede ser en efecto ventajoso preferir aislar y experimentar los genes que codifican las enzimas de ramificación del almidón de alga unicelular en un microorganismo más fácilmente manipulable que las algas unicelulares . La técnica, conocida en si por el técnico en la materia, consiste entonces por ejemplo en: - producir anticuerpos policlonales específicos de cada una de las enzimas de ramificación del almidón del alga previamente purificada, - cribar, con dichos anticuerpos específicos, un banco de expresión de ADN genómica del alga unicelular considerada, - aislar los fragmentos del ADN a partir de las clonas de dicho banco de expresión de ADN genómico que reaccionaron con uno/el otro de los anticuerpos policlonales específicos, - introducir dichos fragmentos de ADN correspondientes a los genes que codifican las enzimas de ramificación del almidón de alga unicelular en las bacterias que permiten su expresión. Las enzimas de ramificación del almidón de alga producidas por este procedimiento se llaman enzimas de ramificación recombinantes, ya que provienen de un alga unicelular, luego se transfieren genéticamente y se expresan en un micro-organismo de otra especie, en esta ocurrencia en una bacteria. Para preparar los polímeros solubles de glucosa ramificados según la invención, se puede tratar ventajosamente una enzima de ramificación del almidón de alga purificada recombinante sobre una cola de almidón de maiz waxi preparada según la etapa (a) de dicho procedimiento. La última etapa del procedimiento según la invención consiste asi en recolectar los polímeros de glucosa ramificados asi obtenidos. Los productos se precipitan por tres volúmenes de etanol, purificados y se secan al vacio durante 24 horas, o todavía se atomizan, mediante cualquier técnica conocida por el técnico en la materia. Otras características y ventajas de la invención aparecerán con la lectura de los ejemplos no limitantes descritos más adelante en la presente. EJEMPLO 1 La preparación de polímeros de glucosa ramificados se efectúa como sigue. Se prepara una suspensión de almidón de maiz waxi con un contenido de material seco de 2.5 por ciento en peso. Se trata enseguida esta suspensión en una caldera tubular de doble envoltura calentada por fluido térmico de laboratorio, a una temperatura de 145°C, bajo una presión de 4 bars. El régimen de alimentación es de 40 mililitros/minuto, por un tiempo de permanencia en dicha caldera de 3 minutos. 1.5 litros de esta preparación se enfria a temperatura ambiente y se colocan en un medio regulado con pH 7 mediante el regulador Tris HC1 0.1 M final para un volumen total de 3.750 litros. Se añaden 19 mililitros (de una solución enzimática a 1.8 miligramos/mililitro de proteínas, que presentan además una actividad especifica de 1.100 U/miligramos, actividad medida mediante el método de dosificación mediante la fosforilasa A conocida por los expertos en la técnica) de una solución de enzimas de ramificación de almidón recombinantes del alga Chlamydomonas reinhardtii previamente purificadas, y se dejan agitar a 30°C durante 30 minutos para obtener los polímeros de glucosa ramificados según la invención que presentan un contenido en ligaduras glucosidicas a-1, 6 de 4.3 por ciento (producto A), y durante dos horas para obtener polímeros de glucosa ramificados, según la invención, que presentan un contenido en ligaduras glucosidicas a-1, 6 de 6 por ciento (producto B) . Cada uno de los productos se precipita enseguida con etanol, se filtra, enjuaga y seca al vacio durante 24 horas. Los valores respectivos de los Mp centrados del perfil de distribución de las masas moleculares de los productos A y B son respectivamente de 1.5 x 107 daltons y 2.2 x 107 daltons. Sus contenidos en azúcares reductores es respectivamente de 0.05 por ciento y de 0.07 por ciento. EJEMPLO 2 La determinación de la estabilidad de los polímeros de glucosa ramificados conforme a la invención se realiza mediante la medición de la entalpia de desestructuración del producto retrogradado, si el producto retrogradado tiene, mediante Análisis Calorimétrico Diferencial, en el curso de ciclos repetidos de congelación/descongelación.

Dos polímeros de glucosa ramificados según la invención, que presentan respectivamente un contenido de ligaduras glucosidicas a-1, 6 del orden de 4.3 por ciento (producto A) y del orden de 6 por ciento (producto B) se preparan como se indica en el ejemplo 1. El análisis se efectúa igualmente sobre otras dos muestras: del almidón de maíz waxi (producto C) y un almidón waxi reticulado y acetilado, que presenta un Índice de acetilo de 1.8 (producto D) . Como se indica en la prueba A, se constituye una preparación acuosa de cada una de las 4 muestras a 40 por ciento de materia seca colocadas en un conjunto de crisoles herméticamente cerrados, y se calienta durante 15 minutos a 100°C en un horno DSC4 de PERKIN ELMER. Se realiza para cada crisol de 2, 4, 6, 8, 10 ó 12 ciclos sucesivos de congelación/descongelación siguiendo el protocolo siguiente: 15 minutos a -22°C, luego 1 hora 30 minutos a 20°C. Una medición de la entalpia de retrogradación se efectúa sobre cada crisol colocándolo en el calorímetro diferencial PERKIN ELMER. La Tabla I siguiente presenta las mediciones de entalpia de retrogradación determinadas para cada uno de los 4 productos probados durante los 12 ciclos sucesivos de congelación/descongelación. Tabla I. Determinación de las entalpias de retrogradación durante los 12 ciclos de congelación/descongelación experimentados en J/g de preparación.

Los polímeros de glucosa ramificados presentan entonces una estabilidad notable, igual después de 12 ciclos de congelación/descongelación. Si el almidón waxi (producto C) y el almidón waxi reticulado y acetilado (producto D) comienzan a retrogradarse a partir del cuarto ciclo de congelación/descongelación, no es por alguno de los polímeros de glucosa ramificados según la invención preparados a partir de dicho almidón waxi. El procedimiento enzimático empleado para modificar los almidones y derivados de almidón permite asi asegurar una excelente estabilidad, muy superior en el estado a los almidones waxi estabilizados y/o reticulados. EJEMPLO 3 La caracterización reológica de los polímeros de glucosa ramificados se realiza con la ayuda de un analizador Rapid Visco Analyser (RVA) . Los productos según la invención presentan una notable solubilidad en agua fría. Fue necesario poner un método de determinación de viscosidad adecuado a cada tipo de producto. Como se indica en la prueba B, 4.5 gramos del producto seco para probar se mezclaron con glicerol y con agua para alcanzar una masa final de 28 gramos. Los productos analizados son por un lado, los productos A, B y C descritos en el ejemplo 2 y otros dos productos E y F, correspondientes a almidones de maiz waxi fluidificados a dos niveles de fluidificación (valor apreciado por la medición clásica de la fluidez en el agua, es decir, el Índice de "water fluidity" o F) , obtenidos mediante el tratamiento en condiciones acidas conocidas por el técnico experto, el producto E que presenta una fluidez de agua de 50, y el producto F, una fluidez de agua de 65. El perfil de análisis tiempo/temperatura y velocidad en el RVA se realiza entonces como sigue. La muestra se agita a 100 rpm a una temperatura de 25°C durante 5 segundos, luego a 500 rpm durante 25 segundos. La agitación se mantiene entonces a 160 rpm durante el resto del perfil . La temperatura inicial de 25°C se mantiene durante 10 minutos, luego se aumenta a 90°C en 8 minutos. Esta temperatura de 90°C se mantiene luego 3 minutos, se disminuye a 30°C en 8 minutos, luego se mantiene a este valor a 30°C durante 5 minutos. La tabla II que sigue presenta los resultados de viscosidad para los productos A, B, C, E y F, expresados en centipoises . Tabla II. Determinación de las viscosidades al final del perfil tiempo/temperatura y velocidad en RVA de los productos A, B, C, E y F, expresados en centipoises (cP) . 10 Los polímeros de glucosa ramificados según la invención presentan todavía cierta viscosidad, pero notablemente más débil que la del control de almidón waxi (C) . Se hace notar que estos valores de viscosidad son 15 del mismo orden de magnitud que los almidones waxi fluidificados . Un estudio complementario se realiza mediante la medición de la viscosidad después del almacenamiento durante 7 dias a 4°C. 20 Este estudio permite caracterizar la estabilidad de las colas asi fabricadas en el tiempo y determinar cómo los polímeros de glucosa conformes a la invención ramificados difieren de los almidones waxi fluidificados. Se realiza el almacenamiento de tazones de RVA que 25 contiene cada uno cinco productos a 4°C. ~ bj* ~.~* ~~*.

La viscosidad de nuevo se determina mediante el RVA. El perfil de análisis tiempo/temperatura y velocidad se caracteriza entonces por una velocidad y una temperatura mantenidos respectivamente a 160 y 30°C durante 20 minutos. La viscosidad retenida es la viscosidad media medida en centipoises entre 15 y 20 minutos. La tabla III que sigue presenta los resultados de viscosidad obtenidos después de 7 dias de almacenamiento a 4°C de los productos A, B, C, E y F. Tabla III. Determinación de las viscosidades de los productos después del almacenamiento durante 7 dias a 4°C, expresados en centipoises. *: viscosidad no medióle. Los resultados muestran claramente que los polímeros de glucosa ramificados según la invención presentan una viscosidad notablemente estable también después de un almacenamiento a 4°C. Esta poca viscosidad puede aprovecharse ventajosamente para las preparaciones alimentarias que necesitan el ingrediente amilazado que los compone sea de viscosidad débil (tales como las preparaciones liquidas e instantáneas) y que deben ser almacenados durante un largo periodo de tiempo a bajas temperaturas. EJEMPLO 4 Se preparan polímeros solubles de glucosa ramificados conforme a la invención, haciendo actuar una enzima de ramificación de glicógeno aislado de E. coli sobre diversas soluciones de almidones y derivados de almidón, durante 21 horas de reacción a 30°C y conforme otras condiciones descritas en el ejemplo 1. Se trata de la ocurrencia aquí de suspensiones de almidón estándar de maiz (G) , de almidón de maiz waxi (I), de almidón rico en amilosa comercializado por la compañía Solicitante bajo el nombre de EURYLON® 7 (K) y de una maltodextrina comercializada por la compañía Solicitante con el nombre de GLUCIDEX® 2 (M) . La tabla IV que sigue presenta los resultados obtenidos en términos de contenidos en ligaduras glucosidicas a-1, 6, con valores de Mp centrados del perfil de distribución de los pesos moleculares, con contenido en azúcares reductores y que tienen retrogradación después de 10 ciclos de congelación/descongelación. Tabla IV. Determinación de las características fisico-quimicas y funcionales de los polímeros solubles de glucosa según la invención H, J, L y N obtenidos mediante la acción de la enzima de ramificación de glicógeno de E. coli respectivamente sobre los sustratos G, I, K y M a una materia &^g¡ut^ seca dada.

Los polímeros solubles de glucosa ramificados según la invención presentan entonces un notable contenido de congelación/descongelación y una distribución de los pesos moleculares centrados sobre un intervalo último de valores comprendido entre 1.4 y 5.8 x 105 daltons, cuando los sustratos de inicio presentan por el contrario una fuerte tendencia a la retrogradación y los perfiles de distribución de los pesos moleculares escalonados de 103 a 108 daltons.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Polímeros solubles de glucosa ramificados que no contienen sustancialmente ligaduras ß glucosidicas, 5 caracterizados por el hecho de que presentan: entre 2.5 y 10 por ciento de ligaduras glucosidicas a-1, 6, una tendencia muy débil o nula a la retrogradación en solución acuosa, determinada según una 10 prueba A, - un peso molecular determinado según una prueba C con un valor central del perfil de distribución de las masas moleculares comprendido entre 104 y 108 daltons, - un contenido en azúcares reductores cuando más 15 igual a 9 por ciento.

2. Polímeros solubles de glucosa ramificados según la reivindicación 1, caracterizados por el hecho que presentan una viscosidad determinada según una prueba B, cuando más igual a 5.000 centipoises. 20

3. Polímeros de glucosa ramificados según una u otra de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizados por el hecho de que presentan: entre 2.5 y 5 por ciento de ligaduras glucosidicas a-1, 6, 25 - un Mp determinado según una prueba C con un valor **M*ÍI**Ma*M*'-''-í ''" - ' ' . ......... - - ...» . - . MJU central del perfil de distribución de las masas moleculares comprendiendo entre 105 y 106 daltons, - un contenido en azúcares reductores cuando más igual a 1 por ciento.

4. Polímeros de glucosa ramificados según una u otra de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizados por el hecho de que presentan: - entre 5 y 10 por ciento de ligaduras glucosidicas a-1, 6, - un Mp determinado según una prueba C con un valor central del perfil de distribución de las masas moleculares comprendiendo entre 107 y 108 daltons, - un contenido en azúcares reductores comprendido entre 5.5 cuando más 9 por ciento.

5. Procedimiento de fabricación de polímeros de glucosa ramificados que no contienen sustancialmente ligaduras ß glucosidicas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que: a) se somete una suspensión acuosa de almidón o de derivado de almidón de un material seco cuando menos igual a 1 por ciento en peso, de preferencia de 1 a 50 por ciento en peso, a una temperatura superior de 130°C, de preferencia comprendida entre 140 y 150°C, bajo una presión de más de 3.5 bars, de preferencia comprendida entre 4 y 5 bars durante cuando menos 2 minutos, de preferencia durante 2 a 5 minutos, *-—*•*- b) tratar el almidón o el derivado de almidón asi obtenido con 50 a 2,000 unidades de enzima de ramificación purificada a una temperatura comprendida entre 25 y 50°C, de preferencia a una temperatura de 30°C, por una duración de 10 5 minutos a 24 horas, c) recolectar los polímeros de glucosa ramificados asi obtenidos.

6. Procedimiento de fabricación de polímeros solubles de glucosa ramificados según la reivindicación 5, 10 caracterizado por el hecho de que la enzima de ramificación se elige en el grupo constituido por las enzimas de ramificación de glicógeno, las enzimas de ramificación de almidón y las mezclas de cualquiera de estas enzimas.

7. Procedimiento de fabricación de polímeros 15 solubles de glucosa ramificados según una o la otra de las reivindicaciones 5 y 6, caracterizado por el hecho de que la enzima de ramificación se extrae de organismos y/o microorganismos elegidos en el grupo constituido por las plantas superiores, levaduras, bacterias y algas unicelulares, y de 20 preferencia se extrae de algas unicelulares.

8. Procedimiento de fabricación de polímeros solubles de glucosa ramificados según la reivindicación 7, caracterizado por el hecho de que la enzima de ramificación extraída de algas se obtiene por aislamiento a partir de un 25 organismo genéticamente modificado capaz de expresar dicha enzima .

9. Composiciones destinadas a ser utilizadas en las industrias especialmente del papel-cartón, textil, farmacéutica, cosmética, y en particular alimentaria, caracterizadas porque encierran los polímeros de glucosa ramificados según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o susceptibles de ser obtenidas según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8. *an,,- Mi'~-**~--~~ -* *•'*-' " -