MXPA00011017A - Anticuerpos para el dominio ed-b de la fibronectina, conjugados que los contienen y uso de los mismos para diagnosis y terapia de tumores y enfermedades asociadas con angiogenesis - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a los anticuerpos con afinidad subnanomolar específica para un epítope característico del dominio ED-B de la fibronectina, un marcador de la angiogenésis. Ademásésta se refiere al uso de los anticuerpos anti-ED-B de alta afinidad, radiomarcados para detectar vasos sanguíneos recién formados in vivo, y un equipo de diagnóstico que comprende dicho anticuerpo. Además,ésta se refiere a los conjugados que comprenden dichos anticuerpos y las moléculas fotoactivas adecuadas (por ejemplo, un fotosensibilizador juiciosamente elegido), y su uso para la oclusión selectiva mediada por luz de nuevos vasos sanguíneos.

Description

ANTICUERPOS PARA EL DOMINIO ED-B DE LA FIBRONECTINA, CONJUGADOS QUE LOS CONTIENEN Y USO DE LOS MISMOS PARA DIAGNOSIS Y TERAPIA DE TUMORES Y ENFERMEDADES ASOCIADAS CON ANGIOGENESIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los anticuerpos con afinidad sub-nanomolar específicos para un epítope característico del dominio ED-B de la fibronectina, un marcador de la angiogé esis . Ésta se refiere al uso de los anticuerpos ED-B de alta afinidad, radiomarcados, para detectar vasos sanguíneos recién formados i n vi vo y un equipo de diagnóstico que comprende dicho anticuerpo. Además, la invención se refiere a los conjugados que comprenden los anticuerpos anteriormente mencionados y una molécula fotoactiva adecuada (por ejemplo, un fotosensibilizador) y a su uso en la detección y/o coagulación de nuevos vasos sanguíneos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los tumores no pueden desarrollarse más allá de una cierta masa sin la formación de nuevos vasos Ref: 124363 sanguíneos (angiogénesis), y una correlación entre la densidad de los microvasos y la invasividad tumoral ha sido reportada para un número de tumores (Folkman (1995). Nature Med., 1, 27-31). Además, la angiogénesis es subyacente a la mayoría de los desórdenes oculares que dan como resultado pérdida de la visión [Lee et al., Surv. Oph thalmol .. 43, 245-269 (1998); Friedlander, M. et al., Proc . Na ti . Aca d .

Sci . U. S . A . 93, 9764-9769 (1996)]. Las moléculas capaces de dirigir selectivamente los marcadores de la angiogénesis podrían crear oportunidcides clínicas para el diagnóstico y terapia de tumores y otras enfermedades caracterizadas por proliferación vascular, tales como la retinotapía diabética y la degeneración macular relacionada a la edad. Los marcadores de la angiogénesis son expresados en al mayoría de los tumores sólidos agresivos y deberían ser fácilmente accesibles a los enlazadores específicos inyectados intravenosamente (Pasqualini et al. (1997). Nature Biotechnol., 15, 542-546; Neri et al. (1997), Nature Biotechnol., 15 1271-1275). La oclusión dirigida de la neovasculatura puede dar como resultado infarto y colapso tumorales (O'Reilly et al. (1996). Nature Med., 2, 689-692; Huang et al. (1997) . Science, 275, 547-550) .

El dominio ED-B de la fibronectina, una secuencia de 91 aminoácidos idénticos en el ratón, la rata y el humano, que es insertado mediante empalme alternativo en la molécula de fibronectina, se acumula específicamente alrededor de las estructuras neovasculares (Castellani et al. (1994). Int. J. Cáncer 59, 612-618) y podría representar un objetivo para la intervención molecular. Por supuesto, se ha mostrado recientemente con técnicas fluorescentes que los fragmentos de anticuerpo Fv anti-cadena simple ED-B (scFv) se acumulan selectivamente en vasos sanguíneos tumorales de ratones que poseen tumores, y que la afinidad del anticuerpo parece dictar el funcionamiento de dirección al objetivo (Neri et al. (1997). Nature Biotechnol., 15 1271-1275; Solicitud de Patente Internacional No. PCT/GB97/01412 , basada en la Patente Británica GB96/10967.3 ) . La dirección al objetivo tumoral fue evaluada 24 horas después de la inyección, o a puntos de tiempo posteriores. Son conocidos diversos intentos en la técnica para producir anticuerpos contra el dominio ED-B con el fin de utilizarlos para dirección al objetivo tumoral. Peters et al. (Cell Adhesión and Communication 1995, 3: 67-89) describen los anticuerpos policlonales producidos para antígenos que no contienen la secuencia FN diferente del dominio ED-B intactos, y muestran que éstos se enlazan específicamente y de manera directa a este dominio. No obstante, los reactivos de Peters et al. sufren de una serie de inconvenientes: los anticuerpos de Peters et al. reconocen a ED-B(+)-FN únicamente después del tratamiento con N-glicanasa. Esto hace a estos reactivos inadecuados para las aplicaciones tales como la dirección al objetivo tumoral, la formación de imagen y la terapia, ya que la desglucosilación no puede ser realizada in vi vo . Los autores reconocen que sus anticuerpos no reconocen el ED-B(+)-FN de longitud completa producido por células de mamífero. Ellos también reconocen que había sido imposible producir anticuerpos monoclonales específicos para el dominio de ED-B de la fibronectina, aun cuando los anticuerpos contra otros dominios de la fibronectina (tales como ED-A) habían sido producidos. Es bien sabido en la técnica que los antisueros policlonales son inaceptables para las aplicaciones anteriormente mencionadas .

Incluso después de años de investigación intensa en este campo, los anticuerpos monoclonales que reconocen el dominio de ED-B de la fibronectina sin el tratamiento con la N-glicanasa podrían ser producidos únicamente utilizando técnicas de representación visual del fago como son aplicadas en la presente invención. Zang et al. (Matrix Biology 1994, 14: 623-633) describen un antisuero policlonal producido contra el dominio ED-B canino. Los autores sí esperan una reactividad cruzada para el ED-B(+)-FN humano, aunque esto no fue probado. No obstante, los autores reconocen la dificultad para producir anticuerpos monoclonales que reconocen directamente el dominio ED-B de la fibronectina (página 631) . El antisuero reconoce ED-B(+)-FN en manchado o transferencia de Western, después del tratamiento con la N-glicanasa. Como se mencionó anteriormente, el tratamiento con glicanasa hace a estos reactivos inadecuados para aplicaciones de acuerdo a la presente invención. El reconocimiento de ED-B(+)-FN en ELISA procede sin la necesidad de la desglucosilación, pero únicamente sobre el cartílago extraído con un agente de desnaturalización (Urea 4M) y capturado sobre plástico utilizando gelatina. Los autores comentan que "el enlace de la molécula FN a la gelatina enlazada sobre la superficie de plástico de la placa de ELISA puede exponer algo los epítopes 5 suficientemente para el reconocimiento por el antisuero". Ya que para aplicaciones in vi vo FN no puede ser desnaturalizado y enlazado a la gelatina, los enlazadores monoclonales de la presente invención ofrecen ventajas distintas. 10 Las Patentes Japonesas JP02076598 y JP04169195 se refieren a los anticuerpos ED-B. No es claro a partir de estos documentos si se describen los anticuerpos monoclonales anti-ED-B. Además, parece imposible que un anticuerpo simple (tal como el anticuerpo descrito en la Patente Japonesa JP02076598) tenga "un determinante antigénico en secuencia de aminoácidos de las fórmulas (1), (2) ó (3) : (1) EGIPIFEDFVDSSVGY 20 - (2) YTVTGLEPGIDYDIS (3) NGGESAPTTLTQQT con base en la siguiente evidencia: i) Un anticuerpo monoclonal debe reconocer un epítope bien definido. *,**m***-*tí***--^--*****-- * . ii) La estructura tridimensional del dominio ED-B de la fibronectina ha sido determinado mediante espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) . Los segmentos (1), (2) y (3) yacen sobre caras opuestas de la estructura ED-B, y no pueden ser enlazados simultáneamente por un anticuerpo monoclonal . Además, con el fin de demostrar la utilidad de los anticuerpos, debe ser demostrada la localización en tumores, así como la evidencia de la tinción de las estructuras de ED-B(+)-FN en muestras biológicas sin tratamiento con reactivos que deterioran la estructura. El anticuerpo BCl descrito por Carnemolla et al. 1992, J. Biol. Chem. 267, 24689-24692, reconoce un epítope en el dominio 7 de FN, pero no en el dominio ED-B, el cual es críptico en presencia del dominio ED-B de la fibronectina. Éste es estrictamente específico de humanos. Por lo tanto, el anticuerpo BCl y los anticuerpos de la presente invención muestran reactividad diferente. Además, el anticuerpo BCl reconoce el dominio 7 solo, y el dominio 7-8 de la fibronectina en ausencia del dominio ED-B (Carnemolla et al. 1992, J. Biol. Chem. 267, 24689-24692) . Tales epítopes podrían ser producidos i n vi vo mediante degradación proteolítica de las moléculas de FN. La ventaja de los reactivos de acuerdo a la presente invención es que éstos pueden localizarse sobre moléculas o fragmentos de FN únicamente si éstos contienen el dominio de ED-B. Para el diagnóstico del cáncer, y más específicamente para la formación de imagen primaria y secundaria de lesiones tumorales, la inmunocintigrafí a es una de las técnicas de elección. En esta metodología, se forman imágenes de los pacientes con un dispositivo adecuado (por ejemplo, una cámara de rayos gamma), después de haber sido inyectados con el compuesto radiomarcado (por ejemplo, un radionúclido enlazado a un vehículo adecuado) . Para aplicaciones cintigráficas, los emisores de radiación gamma de vida corta tales como el tecnecio 99m, el yodo 123 o el indio 111 son típicamente utilizados, con el fin de minimizar la exposición del paciente a las radiaciones ionizantes. El radionúclido más frecuentemente utilizado en los Departamentos de Medicina Nuclear es el tecnecio 99m (99mTc), un emisor gamma con vida media de seis horas. Los pacientes inyectados con productos radiofarmacéuticos basados en 99mTc pueden típicamente ser representados en imagen hasta 12-24 horas después de las inyecciones; no obstante, la acumulación del núclido sobre la lesión de interés en los puntos de tiempo más tempranos, es deseable. Además, si los anticuerpos capaces de realizar la localización rápida y selectiva sobre vasos sanguíneos recién formados fueran disponibles, los investigadores estarían estimulados a buscar otras moléculas adecuadas para conjugarse a los anticuerpos, con el fin de lograr el beneficio de diagnóstico y/o terapéutico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Considerando la necesidad de la medicina nuclear para productos farmacéuticos capaces de localizar lesiones tumorales pocas horas después de la inyección, y la información de que la afinidad del anticuerpo parece influenciar su funcionamiento en la dirección al objetivo de la angiogénesis, un objetivo de la presente invención es producir anticuerpos específicos para el dominio ED-B de la fibronectina con constante de disociación sub-nanomolar (para una revisión sobre las definiciones y las mediciones de la afinidad antígeno-anticuerpo, ver Neri et al. (1996). Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar los anticuerpos radio arcados en formato adecuado, dirigido contra el dominio ED-B de la fibronectina, que detectan lesiones tumorales ya pocas horas después de la inyección. En un aspecto de la invención, estos objetivos son logrados por un anticuerpo con afinidad específica para un epítope característico del dominio ED-B de la fibronectina y con afinidad mejorada para el epítope ED-B. En un aspecto adicional de la presente invención, se utiliza el anticuerpo descrito para dirigir rápidamente marcadores de la angiogénesis. Otro aspecto de la presente invención es un equipo de diagnóstico que comprende el anticuerpo y uno o más reactivos para detectar la angiogénesis. Un aspecto adicional de la presente invención es el uso del anticuerpo para el diagnóstico y terapia de tumores y enfermedades que están caracterizados por proliferación vascular. Finalmente, un aspecto importante de la invención es representado por los conjugados que comprenden los anticuerpos y moléculas fotoactivas adecuadas (por ejemplo, un fotosensibilizador juiciosamente elegido) , y su uso para la oclusión selectiva mediada por luz de los nuevos vasos sanguíneos .

Terminología A todo lo largo de la solicitud se utilizan varías expresiones técnicas para las cuales aplican las siguientes definiciones.

- Anticuerpo Éste describe una inmunoglobuíina ya sea natural o parcial o totalmente producida de manera sintética. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que tenga un dominio de enlace el cual sea, o sea homólogo a, un dominio de enlace del anticuerpo. Éste puede ser derivado de fuentes naturales, o puede ser parcial o totalmente producido de manera sintética. Los ejemplos de anticuerpos son los isotipos de inmunoglobulina y sus subclases isotípicas; los fragmentos que comprenden un dominio de enlace al antígeno tales como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; y diacuerpos. Es posible tomar anticuerpos monoclonales y de otro tipo y utilizar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que conservan la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas pueden involucrar la introducción de ADN que codifica para la región variable de inmunoglobulina, o las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs), de un anticuerpo a las regiones constantes, o las regiones constantes más las regiones estructurales, de una inmunoglobulina diferente. Ver, por ejemplo, la Patente Europea EP-A-184187, GB-2188638A o la Patente Europea EP-A-239400. Un hibridoma u otra célula que produzca un anticuerpo puede ser sujeto a mutación genética o a otros cambios, que pueden o no alterar la especificidad de enlace de anticuerpos producidos. Ya que los anticuerpos pueden ser modificados en un número de formas, el término "anticuerpo" debe ser considerado como que cubre cualquier miembro de enlace específico o sustancia que tenga un dominio de enlace con la especificidad requerida. De este modo, este término cubre los fragmentos de anticuerpo, los derivados, los equivalentes funcionales, y los homólogos de anticuerpos, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un dominio de enlace a la inmunoglobulina, ya sea natural o completa o parcialmente sintético. Las moléculas quiméricas que comprenden un dominio de enlace de inmunoglobulina, o equivalente, fusionadas a otro polipéptido son por lo tanto incluidas. La clonación y la expresión de los anticuerpos quiméricos se describen en las Patentes Europeas EP-A-0120694 y EP-A-0125023. Se ha mostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de antígenos de enlace. Los ejemplos de fragmentos de enlace son (I) el fragmento Fab que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un anticuerpo simle; (iv) el fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature, 9, 341, 544-546) el cual consiste de un dominio VH; (v) las regiones CDR aisladas; (vi) los fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados; (vii) las moléculas Fv de cadena simple (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL están enlazados por un enlazador polipeptídico el cual permite que los dos dominios se disocien para formar un sitio de enlace al antígeno (Bird et al. (1988) Science, 242, 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-83); (viii) dímeros FV de cadena simple biespecí fieos (PCT/US92/09965) y ix) " iacuerpos" , fragmentos multivalentes o multiespecí fieos construidos mediante fusión de genes (WO94/13804; Holliger et al. (1993) Proc. Nati. Acad. U.S.A., 90, 6444-6448). Los diacuerpos son multímeros de polipéptidos, comprendiendo cada polipéptido un primer dominio que comprende una región de enlace de una cadena ligera de inmunoglobulina, y un segundo dominio que comprende una región de enlace de una cadena pesada de inmunoglobulina, estando enlazados los dos dominios (por ejemplo por un enlazador peptídico) pero incapaces de asociarse uno con el otro para formar un sitio de enlace al antígeno: los sitios de enlace al antígeno son formados mediante la asociación del primer dominio de un polipéptido dentro del multímero con el segundo dojpinio de otro polipéptido en el multímero (W094/ 13804 ) . Donde van a ser utilizados anticuerpos biespecí fieos, éstos pueden ser anticuerpos biespecí fieos convencionales, los cuales pueden ser fabricados en una variedad de formas (Holliger y Winter (1993), Curr. Opin. Biotech., 4, 446-449), por ejemplo preparados químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o pueden ser cualquiera de los anticuerpos biespecí fieos mencionados anteriormente. Puede ser preferible utilizar los dímeros de scFv o diacuerpos en vez de los anticuerpos completos. Los diacuerpos y scFv pueden ser construidos sin una región Fc, utilizando únicamente dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de la reacción anti-idiotípica. Otras formas de anticuerpos biespecífieos incluyen los CRAbs de cadena simple descritos por Neri et al. ((1995) J. Mol. Biol., 246, 367-373) .

- Regiones de Determinación de la Complementariedad Tradicionalmente, las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) de los dominios variables del anticuerpo han sido identificadas como aquellas secuencias de anticuerpo hipervariables, que contienen residuos esenciales para el reconocimiento del antígeno específico. En este documento, se hace referencia a la definición de CDR y a la numeración de Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917.

- Forma variante funcionalmente equivalente Ésta se refiere a una molécula (la variante) que aunque tiene diferencias estructurales a otra molécula (la progenitora) conserva alguna homología significativa y también al menos algo de la función biológica de la molécula progenitora, por ejemplo la habilidad para enlazarse a un antigeno o epítope particular. Las variantes pueden estar en la forma de fragmentos, derivados o mutantes. Una variante, derivado o mutante puede ser obtenido mediante modificación de la molécula progenitora mediante la adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos, o mediante el enlace de otra molécula más. Estos cambios pueden ser realizados al nivel del nucleótido o de las proteínas. Por ejemplo, el polipéptido codificado puede ser un fragmento Fab que es luego enlazado a una cola Fc proveniente de otra fuente. Alternativamente, un marcador tal como una enzima, fluoresceína, etc. Por ejemplo, una forma variante funcionalmente equivalente de un anticuerpo "A" contra un epítope característico del dominio ED-B de la fibronectina, podría ser un anticuerpo "B" con diferente secuencia de las regiones de determinación de la complementariedad, pero que reconoce el mismo epítope del anticuerpo "A". Se han aislados anticuerpos recombinantes en el formato scFv a partir de una genoteca de fagos de anticuerpo, específica para el dominio ED-B de la fibronectina, y que reconoce ED-B (+) -fibronectina en secciones tisulares. Uno de estos anticuerpos, El, ha sido madurado por afinidad para producir anticuerpos H10 y L19, con afinidad mejorada. El anticuerpo L19 tiene una constante de disociación para el dominio ED-B de la fibronectina en el intervalo de concentración sub-nanomolar. El anticuerpo L19 y DI .3 de alta afinidad (un anticuerpo específico para un antígeno irrelevante, la lisozi a de huevo de gallina) fueron radiomarcados e inyectados en ratones que poseían tumores. Se obtuvieron biodistribuciones del tumor, de la sangre y de los órganos a diferentes puntos de tiempo, y se expresaron como el porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g) . 3 horas después de la inyección, el %ID/g (tumor) fue mejor que el %ID/g (sangre) para L19, pero no para el control negativo DI .3. Las proporciones tumor ¡sangre se incrementaron a puntos de tiempo más prolongados. Esto sugiere que el anticuerpo L19 de alta afinidad puede ser un agente de dirección al tumor, útil, por ejemplo para la detección inmunocintigráfica de la angiogénesis .

- Fotosensibilizador Un fotosensibilizador podría estar definido como una molécula la cual, después de la irradiación y en presencia de agua y/o oxígeno, generará especies moleculares tóxicas (por ejemplo, oxígeno singulete) capaces de reaccionar con las biomoléculas, provocando por lo tanto potencialmente daño a los objetivos biológicos tales como las células, los tejidos y los fluidos corporales. Los fotosensibilizadores son particularmente útiles cuando éstos absorben a las longitudes de onda por arriba de 600 nanómetros. De hecho, la penetración de la luz en tejidos y en fluidos corporales es máxima en el intervalo de 600 a 900 nm [Wan et al. (1981) Photochem. Photobiol. 3_, 679-681) . La administración o distribución dirigida de los fotosensibilizadores, seguida por la irradiación, es una ruta atractiva para la terapia de enfermedades relacionadas a la angiogénesis [Yar ush, M.L. et al. Antibody targeted photolysis. Cri t . Rev. Therap . Drug Carri er Sys t ems 10, 197-252 (1993); Rowe, P.M. Lan ce t 351, 1496 (1998); Levy, J. Trends Bi o t echnol . 13, 14-18 (1995)), particularmente para la ablación selectiva de la neovasculatura ocular. Las modalidades terapéuticas disponibles tales como la fotocoagulación con láser, ya sea directamente o después de la administración de agentes de fotosensibilización, están limitadas por una falta de selectividad y típicamente dan como resultado el daño de los tejidos y vasos saludables [Macular Photocoagulation Study Group, Arch . Oph talm . 112, 480-488 (1994); Hai ovici, R. et al., Curr . Eye Res . 16, 83-90 (1997); Schmidt-Erf rth, U. et al.; Gra efes Arch . Cl i n . Exp . Oph thalmol . 236, 365-374 (1998)]. Con base en los argumentos presentados anteriormente, se puede observar que sería extremadamente importante descubrir formas para mejorar la selectividad y especificidad de los fotosensibilizadores , por ejemplo para conjugarlos a una molécula portadora adecuada. Es probable que el desarrollo de moléculas portadoras de buena calidad no sea una tarea trivial. Además, es probable que no todos los fotosensibilizadores conducirán por sí mismos a ser "transportados" i n vi vo al sitio de interés. Los factores tales como la estructura química de los fotosensibili zadores , la solubilidad, la lipofilicidad, la adherencia y la potencia es probable que influyan crucial ente en la "capacidad de dirección al objetivo" y la eficacia de los conjugados de los fotosensibilizadores . Aquí se muestra que el anticuerpo L19 de alta afinidad, específico para el dominio ED-B de la 5 fibronectina se localiza selectivamente hacia los vasos sanguíneos recién formados en un modelo de conejo de angiogénesis ocular después de la administración sistémica. El anticuerpo L19, químicamente acoplado al agente de fotosensibilización estaño- ( IV) -cloro-e,; e irradiado con luz roja, fue mediador de la oclusión selectiva de la neovasculatura ocular y promovió la apoptosis de las células endoteliales correspondientes. Estos resultados demuestran que los nuevos vasos sanguíneos oculares pueden ser distinguidos inmunoquímicamente de los pre-existentes in vi vo, y sugieren fuertemente que la distribución dirigida al objetivo de los fotosensibilizadores, seguida por irradiación puede ser efectiva en el tratamiento de enfermedades de ceguera y posiblemente otras patologías asociadas con la angiogénesis. *,.*?* *r*.r M-, :*.-** * BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las modalidades de la presente invención son ilustradas por las siguientes figuras, en donde: La Figura 1 muestra una genoteca de fagos de anticuerpos diseñados. La Figura 2 muestra los geles 2D y el manchado o transferencia de Western de un lisado de las células de melanoma humano COLO-38. Las Figuras 3A, 3B, y 3C muestran experimentos in unohistoquímicos de glioblasto a multiforme . La Figura 4 muestra un análisis de la estabilidad de los complejos de anticuerpo- (ED-B) . La figura 5 muestra la biodis tribución de ratones que poseen tumores, inyectados con fragmentos de anticuerpo radiomarcado. La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de L19. Las Figuras 7A y 7B muestran ojos de conejo con la pella implantada. La Figura 8 muestra la inmunohistoquímica de secciones de córnea de conejo. La Figura 9 muestra la inmunohistoquímica de las secciones de estructuras oculares de conejo (cornea, iris y conjuntiva) utilizando un sustrato de fosfatasa alcalina roja y hematoxilina. La Figura 10 muestra la localización de los anticuerpos marcados fluorescentemente en la neovasculatura ocular. La Figura 11 muestra la apariencia macroscópica de los ojos de conejos inyectados con proteínas acopladas a fotosensibilizadores, antes y después de la irradiación. La Figura 12 muestra el análisis microscópico de secciones de estructuras oculares de conejos inyectados con proteínas acopladas a fotosensibilizadores e irradiados con luz roja.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra: La genoteca de fagos de anticuerpos diseñados. (a) Los fragmentos de anticuerpo son mostrados visualmente sobre el fago como la fusión pIII, como se describe esquemáticamente. En el sitio de enlace al anticuerpo (desde el punto de vista del antígeno) , la columna vertebral de los CDRs de Vk está en amarillo, la columna vertebral CDR de VH está en azul. Los residuos sujetos a mutación aleatoria son las posiciones 91, 93, 94 y 96 del CDR3 de Vk (amarillo) y las posiciones 95, 96, 97 y 98 de CDR3 de VH (azul). Los átomos de Cb de estas cadenas laterales se muestran en colores oscuros. También se muestran (en gris) los residuos de CDR1 y CDR2, los cuales pueden ser mutados para mejorar la afinidad del anticuerpo. Utilizando el projrama RasMol (http: //www. chemistry.ucsc.edu/wipke/teaching/rasmol.html) , la estructura del scFv fue modelada a partir de pdb archivo ligm (Brookhaven Protein Data Bank; http://www2.ebi.ac.uk/pcserv/pdbdb.htm). (b) la amplificación por PCR y la estrategia de clonación de genoteca. Las plantillas de línea germinal DP47 y DPK22 fueron modificadas (ver texto) para generar mutaciones en las regiones CDR3. Los genes son indicados como rectángulos, y los CDRs como cajas numeradas dentro del rectángulo. Los segmentos VH y VL fueron luego ensamblados y clonados en el vector fagémido pDN332. Los cebadores (provenientes de SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 18) utilizados en la amplificación y en el ensamble se listan al fondo.

La Figura 2 muestra: Geles bidimensionales y manchado o transferencia de Western (a) Tinción con plata del ^^^^^^^^^^^^*^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^.^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^?»^^g^ 2D-PAGE de un lisado de células de melanoma humano COLO-38, a las cuales había sido agregado el 7B89 que contiene ED-B recombinante. Las dos manchas 7B89 (círculo) son debidas a la proteólisis parcial de la etiqueta His utilizada para la purificación de proteína. (b) Inmunomanchado de un gel, idéntico a uno de la Figura 2A, utilizando los anticuerpos anti- ED-B El (Tabla 1) y M2 anti-FLAG como reactivo de detección. Únicamente se detectan las manchas 7B89, confirmando la especificidad del anticuerpo recombinante aislado de una mancha de ge L .

Las Figuras 3A-3C muestran: Experimentos inmunohistoquímicos sobre las secciones en serie de glioblastoma multiforme que muestran las estructuras vasculares en forma de glo érulos típicas teñidas utilizando scFvs El (A) , A2 (B) y G4 (C) . Barras a escala: 20 µm.

La Figura 4 muestra: La estabilidad de los complejos anticuerpo- (ED-B) . Análisis del enlace de scFvs El, H10 y L19 al dominio ED-B de la fibronectina. (a) Sensogramas BIAcore que muestran los perfiles de disociación mejorados obtenidos después de la afinidad-maduración del anticuerpo. (b) Análisis electroforético de gel nativo de complejos scFv- (ED-B) . Únicamente el anticuerpo de alta afinidad L19 puede formar un complejo estable con el antígeno fluorescentemente marcado. La detección de fluorescencia fue realizada como se describe (Neri et al. (1996) BioTechniques, 20, 708-712) . (c) Compentencia del complejo scFv- (ED-B-biotina) , con un exceso molar de 100 veces del ED-B no biotinilado, verificado periódicamente mediante electroquimioluminiscencia utilizando un aparato Origen. Se puede observar una vida media larga para el complejo L19-(ED-B). Cuadros negros: L19; Triángulos blancos: H10.

La Figura 5 muestra: Biodistribuciones de los ratones que poseen tumor inyectados con fragmentos de anticuerpo radiomarcado . Las biodistribuciones t?morales y sanguíneas, expresadas como el por ciento de la dosis indicada por gramo, se grafican versus el tiempo. Se reportan también las biodistribuciones de los órganos relevantes .

La Figura 6 muestra: La secuencia de aminoácidos del anticuerpo L19 que comprende la cadena pesada (VH) , el enlazador y la cadena ligera (VL) .

Las Figuras 7A y 7B muestran: Los ojos de conejo con pellas de polímero implantadas, remojadas con sustancias angiogénicas.

La Figura 8 muestra: La inmunohistoquímica de secciones de córnea de conejo con vasos sanguíneos recién formados, teñidos con el anticuerpo L19.

La Figura 9 muestra: Los estudios inmunohistoquímicos de las estructuras oculares utilizando el anticuerpo L19. Se observa una tinción roja específica alrededor de las estructuras neovasculares en la córnea (a) , pero no alrededor de los vasos sanguíneos en el iris (b) y en la conjuntiva (c). Flechas pequeñas: epitelio corneal. Los vasos sanguíneos relevantes se indican con flechas grandes. Escala de las barras. 50 µm.

La Figura 10 muestra: La inmunofotodeteción de los anticuerpos fluorescentemente marcados que se dirigen a la angiogénesis ocular. Una neovascularización corneal fuertemente fluorescente (indicada por una flecha) es observada en conejos inyectados con el conjugado de anticuerpo L19-Cy5 (a) , específico para el dominio ED-B de FN, pero no con el anticuerpo HyHEL-10-Cy5 (b) . La microscopía de inmunofluorescencia sobre secciones de córnea confirmó que L19-Cy5 (c) , pero no HyHEL-10-Cy5 (d) se localiza alrededor de estructuras neovasculares en la córnea. Las i ájenes (a, b) fueron adquiridas 8 horas después de la inyección del anticuerpo; (c, d) fueron obtenidas utilizando secciones de córnea aisladas de conejos 24 horas después de la inyección de anticuerpo. P, pella.

La Figura 11 muestra: Las imágenes macroscópicas de ojos de conejos tratados con conjugados fotosensibilizadores . El ojo del conejo inyectado con L19-PS antes de (a) y 16 horas después de la irradiación con luz roja (b) . La flecha indica la neovasculatura coagulada, la cual es confirmada como un área hipofluores cente en el fluoroangiograma Cy5 de panel (c) 16 horas después de la irradiación. Nótese que no se observa coagulación en las otras estructuras vasculares, por ejemplo en los vasos conjuntivos dilatados. Para comparación, un fluoroangiograma Cy5 con hiperfluorescencia de los vasos con fuga, y la fotografía de color correspondiente del ojo de conejo no tratado, se muestran en (d) y (h) . Las imágenes (e,f,g) son análogas a (a,b,c), pero corresponden a un conejo inyectado con ovoalbúmina PS e irradiado con luz roja. No se puede observar coagulación, y el angiogra a revela hiperfluorescencia de los vasos con fuga. Los ojos de conejos con angiogénesis en etapa temprana e inyectados con L19-PS se muestran en (i-1) . Imágenes antes de (i) y 16 horas después de la irradiación con luz roja (j) revelan coagulación intravascular extensiva y selectiva inducida por luz (flecha) . La oclusión de los vasos (flecha) es particularmente evidente en el ojo irradiado (1) de un conejo inmediatamente después de la eutanasia, pero no puede ser detectada en el ojo no irradiado (k) del mismo conejo. P, pella. Las cabezas de flecha indican la unión corneo-escleral (limbo). En todas las figuras, los vasos conjuntivos dilatados pre-existentes son visibles por arriba del limbo, mientras que el desarrollo de la neovascularización corneal puede ser observada a partir del limbo hacia la pella (P) .

La Figura 12 muestra: El análisis microscópico de la oclusión selectiva del vaso sanguíneo. Las secciones H/E de las córneas (a,e,b,f: no fijadas; i,j: fijadas con paraformaldehído) de conejos inyectados con ovoalbúmina-PS (a,e,i) o L19-PS (b,f,j) e irradiados. Las flechas grandes indican vasos sanguíneos representativos no dañados (e,i) o completamente ocluidos (f,j). En contraste a la oclusión selectiva de la neovasculatura corneal y al daño perivascular restringido (eosinofilia) mediado por L19-PS después de la irradiación (b,f,j), los vasos en la conjuntiva (k) y el iris (1) no muestran signo de daño en el mismo conejo. El ensayo de TÚNEL fluorescente indica el número diferente de células apoptóticas en secciones de conejos irradiados inyectados con L19-PS (c,g) o con ovoalbú ina PS (d,h) . Las flechas indican algunas estructuras vasculares relevantes. Las flechas pequeñas indican el epitelio corneal. Escala de las barras: 100 µm (a-d) y 25 µm (e-1). La invención es más estrechamente descrita por los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Aislamiento de los fragmentos de anticuerpo scFv humanos específicos para el dominio ED-B de la fibronectina a partir de una genoteca de representación visual de fago de anticuerpo Una genoteca de anticuerpos humanos fue clonada utilizando los genes de línea germinal VH (DP47; Tomlinson et al. (1992). J. Mol. Biol., 227, 776-798) y Vk (DPK22; Cox et al. (1994). Eur. J. Im unol., 24, 827-836) (ver Figura 1 para la estrategia de clonación y de amplificación) . El componente VH de la genoteca fue creado utilizando los cebadores parcialmente degenerados (Figura 1) (a partir de la SEQ ID NO: 11 a la SEQ ID NO: 18) en un método basado en PCR para introducir mutaciones aleatorias en las posiciones 95-98 en CDR3. El componente VL de la genoteca fue generado de la misma manera, mediante la introducción de mutaciones aleatorias en las posiciones 91, 93, 94 y 96 de CDR3. Las reacciones de PCR fueron realizadas como se describe (Marks et al. (1991). J. Mol. Biol., 222, 581-597) . Los fragmentos scFv de VH-VL fueron construidos mediante ensamble de PCR (figura 1; Claxon et al. (1991). Nature, 352, 624-628), a partir de segmentos VH y VL purificados en gel. 30 µg de los fragmentos scFv de VH-VL purificados fueron digeridos doblemente con 300 unidades cada una de Ncol y Notl, luego ligados en el vector fagé ido pDN332 digerido con 15 µg de Notl/Ncol. pDN332 es un derivado de fagémido pHENl (Hoogenboom et al". (1991) . Nucí. Acids. Res., 19, 4133-4137), en el cual la secuencia entre el sitio Notl y el codón ámbar precedente al gen III ha sido reemplazada por la siguiente secuencia, que codifica para la etiqueta D3SD3-FLAG-His6 (Neri et al. (1996). Nature Biotechnology, 14, 385-390) : Notl D D D S D D D Y K D D 5' -GCG GCC GCA GAT GAC GAT TCC GAC GAT GAC TAC AAG GAC GAC D D K H H H H H H ámbar GAC GAC AAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT TAG- 3' Las transformaciones dentro de la cepa TGl de E. coli fueron realizadas de acuerdo a Marks et al. (1991. J. Mol. Biol., 222, 581-597) y fagos fueron preparados de acuerdo a los protocolos estándares (Nissim et al. (1991). J. Mol. Biol.., 222, 581-597). Se selecionaron cinco clones aleatoriamente y se secuenciaron para verificar la ausencia de la contaminación penetrante. Los fragmentos de fibronectina recombinante ED-B y 7B89 que contienen una y cuatro repeticiones de homología tipo III respectivamente, fueron expresados a partir de los vectores de expresión basados en pQE12 (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) como se describe (Carnemolla et al. (1996) . Int. J. Cáncer, 68, 397-405) . Las selecciones contra el dominio ED-B recombinante de la fibronectina (Carnemolla et al. (1996). Int. J. Cáncer, 68, 397-405, Zardi et al. (1987). EMBO J., 6, 2337-2342) se realizaron a una concentración de 10 nM utilizando el antígeno biotinilado con el éster de N-hidroxisuccinimida del disulfuro de biotina (reactivo B-4531; Sigma, Buchs, Suiza; 10) y eluyó a partir de un gel bidimensional, y fue capturado sobre Dynabeads recubiertas con estreptavidina (Dynal, Oslo, Noruega). Se utilizaron 1013 fagos para cada ronda de toma panorámica en reacción de 1 mi. Los fagos fueron incubados con antígeno en 2% de leche/PBS (MPBS) por 10 minutos. A esta solución se agregaron 100 µl de Dynabeads (10 mg/ml; Dynal, Oslo, Noruega), prebloqueadas en MPBS.

^^^^^^^ Después de 5 minutos de mezcla, las esferas se separaron magnéticamente de la solución y se lavaron siete veces con PBS-01% de Tween 20 (PBST) y tres veces con PBS. La elución se llevó a cabo mediante incubación por 2 minutos con 500 µl de ditiotreitol 50 mM (DTT) , para reducir el puente disulfuro entre el antígeno y la biotina. Las esferas fueron capturadas nuevamente, y la solución resultante se utilizó para infectar células de E. coli TGl en crecimiento exponencial. Después de tres rondas de toma panorámica, el fago eluido fue utilizado para infectar las células de E. coli HB2151 que crecen exponencialmente y se sembraron en placas sobre placas (2xTY + 1% de glucosa + 100 µg/ml de ampicilina) - 1.5% de agar. Las colonias simples fueron desarrolladas en 2xTY + 0.1% de glucosa + 100 µg/ml de ampicilina, y se indujeron toda la noche a 30 grados con IPTG 1 mM para lograr la expresión del anticuerpo. Los sobrenadantes resultantes fueron seleccionados mediante ELISA utilizando las placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina tratadas con ED-B-biotinilado 10 nM, y anticuerpo M2 anti-FLAG (IBI Kodak, New Haven, CT) como reactivo de detección. 32% de los clones seleccionados fueron positivos en este ensayo y tres de ellos que dieron la más fuerte señal de ELISA (El, A2 y G4 ) fueron secuenciados y caracterizados adicionalmente. Los ensayos de ELISA fueron realizados utilizando el ED-B biotinilado recuperado a partir de una mancha de gel, el ED-B biotinilado que no había sido desnaturalizado, ED-B enlazado a los dominios de fibronectina adyacentes (proteína recombinante que contiene los dominios 7B89) , y un número de antígenos irrelevantes. Los anticuerpos El, A2 y G4 reaccionaron fuertemente y de manera específica con las tres proteínas que contenían ED-B. Esto, junto con el hecho de que los tres anticuerpos recombinantes pudieron ser purificados a partir de sobrenadantes bacterianos utilizando una columna de afinidad ED-B, sugiere fuertemente que éstos reconocen un epítope presente en la conformación nativa de ED-B. No se detectó reacción con los fragmentos de fibronectina que no contenían el dominio ED-B (datos no mostrados). Con el fin de probar si los anticuerpos aislados contra una mancha de gel tenían una buena afinidad hacia el antígeno nativo, se realizó análisis de interacción en tiempo real utilizando la resonancia de plasmón. superficial sobre un instrumento BIAcore como se describe (Neri et al. (1997) Nature Biotechnol., 15, 1271-1275).

Las fracciones monoméricas de El, A2 y G4 de los fragmentos de scFv se enlazaron a ED-B con afinidad en el intervalo de 107-108 M"1 (Tabla 1) . Como una prueba adicional de la especificidad del anticuerpo y la utilidad del mismo, se realizó un inmunomanchado de 2D-PAGE, corriendo sobre gel un lisado de la línea de células de melanoma humano COLO-38, a la cual habían sido agregadas cantidades diminutas de la proteína 7B89 recombinante que contenía ED-B (Figura 2). ScFv(El) tiñó fuertemente y de manera específica sólo la mancha de 7B89. Los anticuerpos El, A2 y G4 fueron utilizados para inmunolocalizar la fibronectina que contenía ED-B (B-FN) en secciones de criostato de glioblastoma multiforme, un tumor cerebral humano agresivo con procesos angiogenéticos prominentes. La Figura 3 muestra secciones en serie de glioblastoma multiforme, con las estructuras vasculares típicas similares al glomérulo teñidas con rojo por los tres anticuerpos. La in unotinción de las secciones de muestras multiformes de glioblastoma congeladas en nitrógeno líquido inmediatamente después de la eliminación mediante procedimientos quirúrgicos, se realizó como se describe (Carnemolla et al. (1996) .

Int. J. Cáncer, 68, 397-405, Casteílani et al. (1994) . Int. J. Cáncer, 59, 612-618) . En resumen, la inmunotinción se realizó utilizando el anticuerpo M2-anti-FLAG (IBI Kodak), los anticuerpos policlonales biotinilados anti-ratón (Sigma), un equipo de tinción del complejo de fosfatasa alcalina de estreptavidina-biotina (BioSpa, Milán, Italia) y naftol-AS-MX-fosfato y TR de rojo rápido Sigma) . Se utilizó hematoxilina de Gill como una contra-tinción, seguido por el montaje en glicergel (Dako, Carpenteria, CA) como se reportó previamente (Castellani et al. (1994) . Int. J. Cáncer, 59, 612-618) . Utilizando técnicas similares y el anticuerpo L19 (ver siguiente ejemplo) se pueden también teñir específicamente los vasos sanguíneos recién formados inducidos mediante la implantación en la córnea de conejo, de pellas poliméricas humectadas con sustancias angiogénicas, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular o esteres de forbol.

^^^^^^ Ejemplo 2 Aislamiento de un fragmento de anticuerpo scFv humano que se enlaza al ED-B con afinidad sub-nanomolar ScFv(El) fue seleccionado para probar la posibilidad de mejorar su afinidad con un número limitado de mutaciones de residuos de CDR localizados en la periferia del sitio de enlace al antígeno (Figura ÍA) . Se mutaron combinatoriamente los residuos 31-33, 50, 52 y 54 del anticuerpo VH, y se representó visualmente el repertorio correspondiente sobre el fago filamentoso. Se encuentra que estos residuos frecuentemente hacen contacto con el antígeno en las estructuras tridimensionales conocidas de los complejos anticuerpo-antigeno . El repertorio resultante de 4 x 108 clones fue seleccionado para el enlace al dominio ED-B de la fibronectina. Después de dos rondas de toma panorámica, y selección de 96 clones individuales, un anticuerpo con afinidad mejorada 27 veces fue aislado (H10; Tablas 1 y 2) . Similarmente a lo que otros han observado con anticuerpos madurados por afinidad, la afinidad mejorada fue debida a la disociación más lenta a partir del antígeno, en vez de por los valores kon mejorados (Schier et al. (L996). Gene, 169, 147-155, Ito (1995). J. Mol. Biol., 248, 729-732). La cadena ligera del anticuerpo se piensa frecuentemente que contribuye menos a la afinidad de enlace al antígeno como es apoyado por el hecho de que los anticuerpos naturales y artificiales desprovistos de la cadena ligera pueden todavía enlazarse al antígeno (Ward et al. (1989) Nature, 341, 544-546, Hamers-Casterman et al. (1993). Nature, 363, 446-448). Por esta razón se eligió aleatorizar únicamente dos residuos (32 y 50) del dominio VL, los cuales están centralmente localizados en el sitio de enlace al antígeno (Figura la) y f ecuentemente encontrados en estructuras tridimensionales para ponerse en contacto con el antígeno. La genoteca resultante, que contiene 400 clones, fue desplegada sobre el fago y seleccionada para el enlace al antígeno. A partir del análisis de los perfiles de disociación utilizando análisis de interacción en tiempo real con un instrumento BIAcore (Jonsson et al. (1991). BioTechniques, 11, 620-627) y mediciones de koff mediante experimentos de competencia con la detección electroquimioluminiscente se identificó un clon (L19) , que se enlazó al dominio ED-B de la fibronectina con un Kd = 54 pM (Tablas 1 y 2) . Los experimentos de maduración de afinidad fueron realizados como sigue. El gen de scFv(El) fue amplificado por PCR con los cebadores LMBlbis (5' -GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG-3') (SEQ ID NO: 1) y DP47CDRlfor (5'-GA GCC TGG CGG ACC CAG CTC ATM NNM NNM NNGCTA AAG GTG AAT CCA GAG GCT G-3') (SEQ ID NO: 2) para introducir las mutaciones aleatorias en las posiciones 31-33 en el CDR1 del VH (para la numeración: 28), y con los cebadores DP47CDRlback (5' -ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CC-3') (SEQ ID NO: 3) y DP47CDR2for (5' -GTC TGC GTA GTA TGT GGT ACC MNN ACT ACC MNN AAT MNN TGA GAC CCA CTC CAG CCC CTT-3') (SEQ ID NO: 4) para mutar aleatoriamente las posiciones 50, 52, 54 en CDR2 del VH . El fragmento remanente del gen de scFv, que cubre la porción 3' del gen VH, el ligador peptídico y el gen VL, fue amplificado con los cebadores DP47CDR2back (5' -ACÁ TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG-3') (SEQ ID NO: 5) y JforNot (5'-TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC TTG GCC GAA CG-3') (SEQ ID NO: 6) (94°C 1 minuto, 60°C 1 minuto, 72°C 1 minuto) . Los tres productos de PCR resultantes fueron purificados en gel y ensamblados mediante PCR (21) con los cebadores LMBlbis y JforNot (94°C 1 minuto, 60°C 1 minuto, 72°C 1 minuto) . El producto de PCR simple resultante fue purificado a partir de la mezcla de PCR, digerido doblemente con a?s * . . -** * *. . * *. . * * * - *** *^. * *_ *1 *^- *1 -^ *^ * . .. — *^?__ *_!_í_ ttg¡í. *****.*.

Notl/Ncol y ligado dentro del vector pDN332 digerido con Notl/Ncol. Aproximadamente 9 µg del vector y 3 µg del inserto fueron utilizados en la mezcla de ligadura, que se purificó mediante fenolización y precipitación con etanol, se resuspendió en 50 µl de agua estéril y se sometió a electroporesis en células de E. coli TGl electrocompetentes . La genoteca de maduración por afinidad resultante contenía 4 x 108 clones. Las partículas de anticuerpo-fago, producidas como se describe (Nissi et al. (1994) . EMBO J., 13, 692-698) fueron utilizadas para una primera ronda de selección sobre el inmunotubo recubierto con 7B89 (Carnemolla et al. (1996) . Int. J. Cáncer, 68, 397-405). Los fagos seleccionados fueron utilizados para una segunda ronda de toma panorámica realizada con el ED-B biotinilado, seguido por captura con esferas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynal, Oslo, Noruega; ver párrafo previo) . Después de la selección, aproximadamente 25% de los clones fueron positivos en ELISA soluble (ver capítulo previo para el protocolo experimental).

A partir de los candidatos positivos en ELISA, se identificó adicionalmente uno (H10; Tabla 1) con el más bajo koff mediante análisis de BIAcore (Jonsson et al. (1991), BioTechniques, 11, 620-627).

El gen de scFv(HlO) fue amplificado por PCR con los cebadores LMBlbis y DPKCDRlfor (5'-G TTT CTG CTG GTA CCA GGC TAA MNN GCT GCT GCT AAC ACT CTG ACT G) (SEQ ID NO: 7) para introducir una mutación aleatoria en la posición 32 en CDR1 del VL (para la numeración: Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917), y con los cebadores DPKCDRlback (5' -TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CC-5') (SEQ ID NO: 8) y DPKCDR2for (5' -GCC AGT GGC CCT GCT GGA TGC MNN ATA GAT GAG GAG CCT GGG AGC C-3') (SEQ ID NO: 9) para introducir una mutación aleatoria en la posición 50 en CDR2 del VL . La porción remanente del gen scFv fue amplificada con los ligos DPKCDR2back (5' -GCA TCC AGC AGG GCC ACT GGC-3') (SEQ ID NO: 10) y JforNo.t (94°C 1 minuto, 60°C 1 minuto, 72°C 1 minuto) . Los tres productos resultantes fueron ensamblados, digeridos y clonados dentro de pDN332 como se describe anteriormente para la mutagénesis de la cadena pesada. La genoteca resultante fue incubada con ED-B biotinilado en 3% de BSA por 30 minutos, seguido por captura sobre una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina (Boehringer Mannheim GMBH, Alemania) por 10 minutos.

Los fagos fueron eluidos con solución de DTT 20 mM (1 , -ditio-DL-treitol, Fluka) y utiLizados para infectar las células TGl en desarrollo exponencial. El análisis del enlace ED-B de los sobrenadantes provenientes de 96 colonias mediante ELISA y mediante BIAcore, permitió la identificación del clon L19. Los fragmentos de anticuerpo de scFv anti-ED-B El, G4, A2, H10 y L19 tiñen selectivamente los vasos sanguíneos en recién formación en secciones de tumores agresivos (Figura 3) . Los fragmentos de anticuerpo anti-ED-B anteriormente mencionados fueron luego producidos inoculando una colonia fresca simple en 1 litro de 2xTY como se describe previamente en Pini et al. (1997), J. Immunol. Meth., 206, 171-182) y purificados por afinidad sobre una columna de sefarosa activada con CNBr (Pharmacia, Uppsala, Suiza), que había sido acoplada con 10 mg de ED-B que contenía la proteína recombinante 7B89 (Carnemolla et al. (1996). Int. J. Cáncer, 68, 397-405). Después de la carga, la columna se lavó con 50 mi de amortiguador de equilibrio (PBS, EDTA 1 M, cloruro de sodio 0.5 M) . Los fragmentos de anticuerpo fueron luego eluidos con trietilamina 100 mM, inmediatamente neutralizados con Hepes 1 M, pH 7, y dializados contra PBS. Las mediciones de afinidad mediante BIAcore fueron realizadas con anticuerpos purificados como se describe (Neri et al. (1997). Nature Biotechnol., 15 1271-1275) [Figura 4]. El análisis de desplazamiento de banda fue realizado como se describe (Neri et al. (1996). Nature Biotechnology, 14, 385-390), utilizando ED-B recombinante fluorescentemente marcado en el extremo N-terminal (Carnemolla et al. (1996). Int. J. Cáncer, 68, 397-405, Neri et al. (1997). Nature Biotechnol., 15 1271-1275) con el fluoróforo infrarrojo Cy5 (Amersham) [Figura 4], El análisis BIAcore no siempre permite la determinación correcta de los parámetros cinéticos para las reacciones de disociación lenta debidas a los posibles efectos de reenlace, inestabilidad de línea base y los tiempos de medición prolongados necesarios para constatar que la fase de disociación sigue un perfil exponencial simple. Se realizaron por lo tanto mediciones de la constante de disociación cinética koff mediante experimentos de competencia (Neri et al. (1996), Trends in Biotechnol., 14, 465-470) [Figura 4]. En resumen, los anticuerpos anti-ED-B (30 nM) fueron incubados con ED-B biotinilado (10 nM) por 10 minutos, en presencia de anticuerpo M2 anti-FLAG (0.5 µg/ml) e IgG policlonal anti-ratón (Sigma) que había sido previamente marcado con un complejo de rutenio como se describe (Deaver, D.R. (1995) . Nature, 377, 758-760). A esta solución, en reacciones paralelas, se agregó ED-B no biotinilado (1 µM) a diferentes tiempos. Las dinaesferas (dynabeads) recubiertas con estreptavidina, diluidas en Amortiguador de Ensayo de Origen (Deaver, D.R. (1995) . Nature, 377, 758-760) fueron luego agregadas (20 µl, 1 mg/ml), y las mezclas resultantes se analizaron con un Analizador ORIGEN (IGEN Inc. Gaithersburg, MD USA) . Este instrumento detecta una señal electroquimioluminiscente (ECL) que correlaciona con la cantidad del fragmento scFv todavía enlazado al ED-B biotinilado al final de la reacción de competencia. La gráfica de la señal de ECL versus el tiempo de competencia produce un perfil, el cual puede ser ajustado con un exponencial simple con constante koff característica [Figura 4; Tabla 2].

Ejemplo 3 Dirección de los tumores con un scFv radiomarcado de alta afinidad específico para el dominio ED-B de la fibronectina El scFv(L19) o scFv(D1.3) radioyodado (un anticuerpo irrelevante específico para la lisozima de huevo de gallina) fueron inyectados intravenosamente en ratones con el teratocarcino a murino F9 subcutáneamente implantado, un tumor agresivo de crecimiento rápido. Las biodistribuciones del anticuerpo fueron obtenidas a diferentes puntos de tiempo (Figura 4). ScFv(L19) y scFv(D1.3) fueron purificados por afinidad sobre una columna de antígeno (Neri et al. (1997, Nature Biotechnol. 15, 1271-1273) y radiomarcado con yodo 125 utilizando el método de lodogen (Pierce, Rockford, IL, USA) . Los fragmentos de anticuerpo radiomarcados conservaron más de 80% de inmunorreactividad, como fue evaluado mediante la carga del anticuerpo radiojnarcado sobre una columna de antígeno, seguido por el conteo radioactivo del flujo de lado a lado y las fracciones eluidas. Ratones desnudos (machos desnudos Swiss de 12 semanas de edad) con teratocarcinoma murino F9 implantado subcutáneamente (Neri et al. (1997) Nature Biotechnol. 15, 1271-1273) fueron inyectados con 3 µg (3-4 µCi) de scFv en 100 µl de solución salina. El tamaño del tumor fue de 50-250 mg, ya que los tumores más grandes tienden a tener un centro necrótico. No obstante, los experimentos en dirección al objetivo realizados con tumores más grandes (300-600 mg) dieron esencialmente los mismos resultados. Se A » * . •** **, * , ,.****• -- *. ** ,. . *• * * 1 a » ¡_* . a. ** *- S , *, t a i *l*** £*_* l utilizaron tres animales para cada punto de tiempo. Los ratones fueron sacrificados con métodos humanos, y los órganos pesados y contados radioactivamente. Los resultados en dirección al objetivo de órganos representativos son expresados como el porcentaje de la dosis inyectada del anticuerpo por gramo de tejido (% ID/g) . El scFv(L19) es rápidamente eliminado de la sangre a través de los ríñones; de manera contraria a los anticuerpos convencionales, éste no se acumula en el hígado o en otros órganos. Ocho por ciento de la dosis inyectada por gramo de tejido se localiza sobre el tumor tres horas después de la inyección; la disminución subsiguiente de este valor es debida al hecho de que el tumor duplica su tamaño en 24-48 horas. Las proporciones tumor ¡sangre a las 3, 5 y 24 horas después de la inyección fueron de 1.9, 3.9 y 11.8 respectivamente para L19, pero siempre por debajo de 1.0 para el anticuerpo control negativo . El scFv(L19) radiomarcado se localiza preferentemente sobre tumores ya unas pocas horas después de la inyección, sugiriendo su utilidad para la detección inmuocintigráfica de la angiogénesis en pacientes .

Ejemplo 4 Anticuerpos anti-ED-B tiñen selectivamente los vasos sanguíneos oculares recién formados La angiogénesis, la formación de los nuevos vasos sanguíneos a partir de unos pre-existentes, es un proceso característico que es subyacente a muchas enfermedades, incluyendo el cáncer y la mayoría de los desórdenes oculares que dan como resultado la pérdida de la visión. La habilidad para dirigirse al objetivo selectivamente y ocluir la neovasculatura abrirán las oportunidades de diagnóstico y terapéuticas . Se investigó si B-FN es un marcador específico de la angiogénesis ocular y si los anticuerpos que reconocen B-FN podrían dirigirse selectivamente a las estructuras neovasculares oculares in vi vo después de la administración sistémica. Para este objetivo se estimuló la angiogénesis en la córnea de conejo, lo que permite la observación directa de los vasos sanguíneos nuevos, mediante implante quirúrgico de pellas que contienen el factor de crecimiento endotelial, vascular o el éster de forbol (Figura 7) . Pellas de sucralfato (amable donación de Merck, Darmstadt, Alemania) /hydron que contenían ya sea 800 ng de factor de crecimiento endotelial vascular (Sigma) o 400 ng de 12-miristato-13-acetato de forbol ("PMA"; Sigma) fueron implantadas en la córnea de conejos hembra blancos New Zealand, como se describe [D'Amato, R.J., et al., Proc . Na ti . Aca d . Sci . USA 91, 4082-4085 (1994)]. La angiogénesis fue inducida mediante ambos factores. Los conejos fueron verificados diariamente. Con ambos inductores, los vasos sanguíneos recién formados fueron fuertemente positivos a ED-B en inmunohistoquímica. Para todos los experimentos adicionales, se utilizaron pellas de PMA. Los estudios inmunohistoquímicos mostraron que L19 tiñe fuertemente la neovasculatura inducida en la córnea de conejo (Figura 8; 9a), pero no los vasos sanguíneos pre-existentes del ojo (Figura 9b, c) y de otros tejidos (datos no mostrados). La inmunohistoquímica fue realizada como se describe [Carnemolla, B. et al., Int. J. Cán cer 68, 397-405 (1996) ] .

Ejemplo 5 El fragmento L19 de anticuerpo humano que se enlaza al ED-B con afinidad sub-nanomolar, se dirige a la angiogénesis ocular in vi vo Utilizando el modelo de córnea de conejo de angiogénesis descrito en el ejemplo previo, y una metodología de inmunofotodetección [Neri, D. Et al., Na t ure Bi toechnol . 15, 1271-1275 (1997)], se demostró que L19, químicamente acoplado al fluoróforo rojo Cy5, pero no al fragmento de anticuerpo (HyHEL-10)-Cy5 dirigido contra un antígeno irrelevante (Figura 10a, b) , se dirige selectivamente a la angiogénesis ocular después de la inyección intravenosa. La tinción fluorescente de los vasos oculares en desarrollo fue claramente detectable con L19 inmediatamente después de la inyección, y persistió por al menos dos días análoga a observaciones previas con angiogénesis tumoral. El análisis microscópico inmunofluorescente ex vi vo, subsiguiente sobre secciones de córnea confirmó la localización de L19, pero no de HyHEL-10, alrededor de las estructuras vasculares (Figura 10c, d) . La demostración de la dirección selectiva al objetivo, basada en el anticuerpo, de la neovascularización ocular junto con la reactividad de los anticuerpos anti-B-FN en diferentes especies, garantiza las investigaciones clínicas futuras. La formación de imagen de inmunofluorescencia podría ser útil para la detección temprana de angiogénesis ocular en pacientes en riesgo, antes de que las lesiones se lleguen a manifestar en la fluoroangiografía .

Algunos detalles metodológicos: Para la inmunofluorescencia ex vi vo y para algunas tinciones H/E, se fijaron córneas en 4% de paraformaldehído en PBS antes de la incrustación. Los experimentos de fotodetección por fluorescencia fueron realizados con conejos sedados utilizando 5 mg/kg de Acepro azin. Para los experimentos de dirección al objetivo, 3.5 mg de scFv (L19) ?-Cy50.66 Y 2.8 mg de scFv (HyHEL-10) ?-Cy50.83 se inyectaron intravenosamente en cada conejo (tiempo de inyección = 15 minutos). Una fluorescencia fuerte en la neovasculatura corneal fue observada inmediatamente después de la inyección de L19, pero no de HyHEL-10, y persistió por varias horas. Como una prueba adicional de especificidad, los conejos inyectados el día previo con scFv(HyHEL- 10)-Cy5 y negativos en la fotodetección de fluorescencia, fueron inyectados al siguiente día con scFv (L19) -Cy5, y mostraron una fuerte tinción fluorescente de la angiogénesis corneal. Para la detección de la fluorescencia, el ojo se iluminó con una lámpara de tungsteno-halógeno (modelo Schott KL1500; Zeiss, Jena, Alemania) equipada con un filtro de excitación Cy5 (Chroma, Brattleboro, VT, U.S.A.) y con. dos guías de luz cuyos extremos fueron colocados aproximadamente a 2 cm de distancia del ojo. La fluorescencia se detectó con una cámara CCD monocromática C-5985 enfriada (Hamamatsu, Hamamatsu-City, Japón) , equipada con una Lente de Acercamiento Canon de montaje C (V6xl6; 16-100 mm; 1: 1.9) y un filtro de emisión Cy5 de 50 mm de diámetro (Chroma) , colocada a 3-4 cm de distancia del ojo irradiado. Los tiempos de adquisición fueron de 0.4 segundos . Se realizaron experimentos de fluoroangiografía Cy5 con el mismo equipo experimental, pero inyectando intravenosamente 0.25 mg de Cy5-Tris (el producto de reacción entre Cy5-NHS y tris [hidroximetil ] aminometano; tiempo de inyección = 5 segundos) . Los tiempos de adquisición fueron 0.2 segundos.

Los fragmentos de anticuerpo estuvieron en formato scFv. La purificación de scFv(L19) y scFv (HyHEL-10) y su marcación con los esteres de N-hidroxisuccinimida (NHS)de tinciones con indocianina han sido descritos en otros sitios [Neri, D. et al., Na t ure Bi o t echnol . 15, 1271-1275 (1997); Fattorusso, R., et al. (1999) Struc t ure, 1_, 381-390]. Las proporciones de marcación del anticuerpo : Cy5 para los dos anticuerpos fueron de 1.5:1 y 1.2:1, respectivamente. Cy5-NHS fue adquirido de Amersham Pharmacia Biotech (Zurich, Suiza), la ovoalbúmina de Sigma (Buchs, Suiza) . Después de la reacción de marcación, los conjugados de anticuerpo fueron separados del fluoróforo no incorporado o del fotosensibilizador utilizando las columnas PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrado en fosfato 50 mM, pH 7.4, cloruro de sodio 100 M (PBS). La inmunorreactividad de los conjugados de anticuerpo se midió mediante cromatografía de afinidad sobre columnas de antígeno [Neri, D. Et al., Na t ure Bi o t echn ol . 15, 1271-1275 (1997)] y fue en todos los casos >78%. Los inmunoconjugados fueron analizados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de <|^ *****^m.. - - -i-dodecilsulfato de sodio y igraron como una banda de peso = 30,000 Daltones (pureza 3 90%).

Ejemplo 6 El fragmento L19 de anticuerpo humano, químicamente conjugado al fotosensibilizador Sn (IV) cloro e6, se dirige seilectivamente a la ang:iogénesis ocular y es mediador de su oclusión despues de la ir iradiación con luz roja Para probar si la ablación selectiva de los vasos podría ser lograda en virtud de la dirección al objetivo mediada por el anticuerpo, se inyectaron conejos con el fragmento de anticuerpo L19 o una proteína irrelevante que no se localiza en los vasos sanguíneos recién formados (ovoalbúmina) acoplada al fotosensibilizador estaño (IV) -cloro ee (de aquí en adelante llamado "PS") . Los ojos de los animales inyectados fueron irradiados con luz roja (dosis de luz = 78 J/cm2) . Los resultados representativos se describen en la Figura 11. Se observó una diferencia macroscópica sorprendente 16 horas después de la irradiación en conejos tratados con L19-PS (Figuras lia, b) , con coagulación de la neovasculatura corneal pero no de los vasos en la conjuntiva o en las otras estructuras oculares. La fluoroangiografía con fluoróforo de indocianina Cy5 (figura 11c) confirmó la oclusión del vaso como un área hipofluorescente característica. Por el contrario, las áreas hiperfluorescentes fueron observadas en la neovasculatura con fugas de los ojos no irradiados (Figuras lid, h) . No fue detectable alteración macroscópica en los vasos irradiados de conejos tratados con ovoalbú ina PS (figuras lle-g) , ya sea oftalmoscópicamente, o mediante fluoroangiografía Cy5. El efecto de la irradiación del conjugado L19-PS dirigido al objetivo, en etapas tempranas de la angiogénesis corneal, se muestra en las Figuras lli-1. Los vasos sanguíneos selectivamente coagulados fueron macroscópicamente visibles en animales vivos (Figuras lli, j) y aún más evidentes en animales inmediatamente después de la eutanasia (Figuras llk, 1) . El daño fotodinámico fue además investigado utilizando técnicas microscópicas. Después de la irradiación, la oclusión de los vasos pudo ser detectada mediante técnicas estándares de tinción con hematoxilina/eosina (H/E) en secciones de córnea no fijada y fijada con parafomaldehído de animales tratados con L19-PS (Figuras 11b, f, j), pero no de aquellos tratados con ovoalbúmina PS (Figuras lia, e, i) . La apoptosis en la porción de la córnea tomada como objetivo por el conjugado fotosensibilizador, fue claramente visible en el ensayo de TÚNEL fluorescente (Figuras 11c, g) , pero difícilmente detectable en controles negativos (figuras lid, h) . Una vista de mayor amplificación mostró apoptosis de las células endoteliales en estructuras vasculares (Figura llg) . No pudo ser observado ningún daño a los vasos sanguíneos del iris, la esclerótica y la conjuntiva de los animales tratados ya sea por el ensayo de TÚNEL (no mostrado) o mediante la tinción H/E (Figura llk, 1) . La ablación fotodinámica selectiva de la neovasculatura promete ser benéfica para el tratamiento de desórdenes oculares y de otras patologías relacionadas a la angiogénesis que son accesibles a la irradiación utilizando difusores de luz o técnicas de fibra óptica. Los resultados de este estudio demuestran claramente que la neovasculatura ocular puede ser selectivamente ocluida sin dañar los vasos sanguíneos pre-existentes y los tejidos normales.

Algunos detalles metodológicos: Se seleccionó el estaño (IV) -cloro e6 a partir de un panel de fotosensibilizadores, con base en su potencia, solubilidad y especificidad, después del acoplamiento a un anticuerpo policlonal de conejo anti-ratón (Sigma). Estos inmunoconj ugados fueron seleccionados mediante fotolisis dirigida al objetivo de células sanguíneas rojas recubiertas con un anticuerpo monoclonal específico para CD47 humano (#31344A; Pharmingen, San Diego, CA, U.S.A.). El estaño (IV) -cloro e6 fue preparado como se describe [Lu, X.M. et al., J. Immun ol . Meth ods 156, 85-99 (1992)]. Para el acoplamiento a las proteínas, el estaño (IV) -cloro e6 (2 mg/ml) se mezcló por 30 minutos a temperatura ambiente en dimetilformamida con un exceso de diez veces molar de EDC (clorhidrato de N' -3-dimetilaminopropil-N-etilcarbodiimida, Sigma) y NHS (N-hidroxisuccinimida, Sigma) . La mezcla activada resultante fue luego agregada a un volumen ocho veces mayor de la solución de proteína (1 mg/ml) e incubada a temperatura ambiente por 1 hora. Después de la reacción de marcación, los conjugados de anticuerpo fueron separados del fluoróforo no incorporado o fotosensibilizador utilizando columnas PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech) equilibradas en fosfato 50 M, pH 7.4, cloruro de sodio 100 mM (PBS) . La inmunorreactividad de los conjugados de anticuerpo fue medida como se describe en el Ejemplo previo. Para los experimentos de muerte fotoinducida, los conejos fueron inyectados intravenosamente con 12 mg de scFv (L19) i-estaño (IV)-cloro eßo.ß o 38 mg de ovoalbú inai-estaño (IV) -cloro e60.3e/ y se mantuvieron en la oscuridad por la duración del experimento. Ocho horas después de la inyección, los conejos fueron anestesiados con cetamina (35 mg/kg) /xilazina (5 mg/kg) /acepromazina (1 mg/kg), y uno de los dos ojos fue irradiado por 13 minutos con una lámpara de tungsteno-halógeno de Schott KL1500 equipada con un filtro Cy5 (Chroma) y con dos guías de luz cuyos extremos fueron colocados a 1 cm de distancia del ojo. El área iluminada fue de aproximadamente 1 cm2, con una densidad de poder de irradiación de 100 mW/cm2, medida utilizando un fotodetector SL818 (Newport Corp., Irvine, CA, U.S.A.) . No se observó ningún signo de incomodidad del animal después de la irradiación. Como una medida preventiva, los conejos recibieron analgésicos después de la irradiación (buprenorfina 0.03 mg/Kg).

Para verificar periódicamente la muerte fotoinducida, los ojos fueron investigados con un oftalmoscopio y fotografiados utilizando una cámara de fondo KOWA SL-14 (GMP SA, Rennens, Lausanne, Suiza) . Cinco conejos fueron tratados con cada uno de los conjugados de estaño (IV) -cloro e6 e irradiados en un ojo únicamente, sirviendo el otro ojo como un control negativo interno. Como control adicional, dos conejos fueron irradiados únicamente, pero no recibieron conjugado fotosensibilizador. Inmediatamente después de la eutanasia de los conejos con una sobredosis de anestésico, los ojos fueron enucleados, las córneas fueron retiradas y luego incrustadas en Tissue Tek (Sakura Finetechnical, Tokio, Japón) y congelados. Para inmunofluorescencia ex vi vo y para algunas tinciones de H/E, las córneas fueron fijadas en 4% de paraformaldehído en PBS antes de la incrustación. Las secciones de criostato de 5 µm fueron utilizadas para el análisis microscópico adicional. Los ensayos de TÚNEL fluorescente fueron realizados de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostic, Rotkreuz, Suiza) .

Tabla 1: Secuencias de clones de anticuerpo seleccionado anti-ED-B Cadena VH Cadena VL Clon 31-33* 50-54* 95-98* 32* 50* 91-96* A2 SYA AISGSG GLSI Y G NGWYPW G4 SYA AISGSG SFSF Y G GGWLPY El SYA AISGSG FPFY Y G TGRIPP H10 SFS SIRGSS FPFY Y G TGRIPP L19 SFS SIRGSS FPFY Y Y TGRIPP Las posiciones de aminoácidos relevantes (*: numeración de acuerdo a Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 1_4, 4628-4638) de los clones de anticuerpo aislado de genotecas sintéticas diseñadas. Se utilizan los códigos de aminoácido simple de acuerdo a la nomenclatura estándar de la IUPAC.

Tabla 2 Afinidades de los fragmentos de scFv anti-ED-B Clon kon (s-'NT) ?off(sr ?off(sly Kd(M)' A2 1.5 x 105 2.8 x 10~3 - 1.9 x 10"8 G4 4.0 x 104 3.5 x 10"3 - 8.7 x 10~8 El 1.6 x 105 6.5 x 10'3 - 4.1 x 10"8 H10 6.7 x 104 5.6 x 10-4 9 .9 x 10"5 1.5 x 10"9 L19 1.1 x 105 9.6 x 10"5 6 .0 x 10"6 5.4 x 10"11 * ) Kd = koff/kon. Para los enlazadores de alta afinidad H10 y L19, los valores de koff a partir de experimentos de BIAcore no son su icientemente confiables debido a los efectos de la matriz de dextrano sólida carboxilada, cargada negativamente; los valores de Kd son por lo tanto calculados a partir de las mediciones de kQff obtenidos mediante experimentos de competencia (Procedimientos Experimentales). koff, constante de disociación cinética; kon, constante de asociación cinética; kd, constante de disociación. B = medido en el BIAcore; C = medido mediante competencia con detección electroquimioluminiscente . Los valores tienen una exactitud de +/- 50%, con base en la precisión de las determinaciones de la concentración.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención . >. . * . -... ******* LISTADO DE SECUENCIAS <110> EIDGENOESSISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE ZURICH <120> Moléculas de enlace específico para cintigrafía, conjugados que las contienen y método terapéutico para el tratamiento de la angiogénesis <130> 1900PTEP <140> <141> <150> US 09/075,338 <151> 1998-05-11 <150> US <151> 1999-04-28 <160> 21 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador PCR: LMBlbis <400> 1 gcggcccagc cggccatggc cgag 24 <210> 2 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: DP47CDRlfor <400> 2 gagcctggcg gacccagctc atmnnmnnmn ngctaaaggt gaatccagag gctg 54 <210> 3 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: DP47CDRlback <400> 3 atgagctggg tccgccaggc tec 23 <210> 4 <211> 60 <212> ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: DP47CDR2for <400> 4 gtctgcgtag tatgtggtac cmnnactacc mnnaatmnnt gagacccact ccagcccctt 60 <210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: DP47CDR2back <400> 5 acatactacg cagactccgt gaag 24 <210> 6 <211> 53 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: JforNot <400> 6 tcattctcga cttgcggccg ctttgatttc caccttggtc ccttggccga acg 53 <210> 7 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: DPKCDRlfor <400> 7 gtttctgctg gtaccaggct aamnngctgc tgctaacact ctgactg 47 <210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: DPKCDRlback <400> 8 ttagcctggt accagcagaa acc 23 <210> 9 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: DPKCDR2for <400> 9 gccagtggcc ctgctggatg cmnnatagat gaggagcctg ggagcc 46 <210> 10 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: DPKCDR2back <400> 10 gcatccagca gggccactgg c 21 <210> 11 <211> 45 <213> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: DP47baNco <400> 11 gcggcccagc atgccatggc cgaggtgcag ctgttggagt ctggg 45 <210> 12 <211> 55 <213> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: CDR3for <400> 12 ggttccctgg ccccagtagt caaamnnmnn mnnmnntttc gcacagtaat atacg 55 <210> 13 <211> 24 <213> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: VHpullth <400> 13 gcggcccagc atgccatggc cgag 24 <210> 14 <211> 66 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: Jassm <400> 14 cccgctaccg ccactggacc catcgccact cgagacggtg accagggttc 50 cctggcccca gtagtc 66 <210> 15 <211> 62 <213> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: DPK22assm <400> 15 gatgggtcca gtggcggtag cgggggcgcg tcgactggcg aaattgtgtt 50 gacgcagtct ce 62 <210> 16 <211> 63 <213> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: ^^^^j^^ 10 DPK3for <400> 16 caccttggtc ccttggccga acgtmnncgg mnnmnnaccm nnctgctgac 50 agtaatacac tgc 63 <210> 17 <211> 56 <213> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: Jfornot <400> 17 gagtcattct cgacttgcgg ccgctttgat ttccaccttg gtcccttggc 50 cgaacg 56 <210> 18 <211> 24 <213> ADN <213> Secuencia Artificial _t_^_* _ J_& 11 <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador de PCR: VLpullth <400> 18 gatgggtcca gtggcggtag cggg 24 <210> 19 <211> 116 <213> PRT <213> anticuerpo VH específico para el dominio ED-B de la fibronectina <400> 19 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 12 Ser Ser lie Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 5 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 15 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> ligador de anticuerpo 20 <400> 2 Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly 1 5 10 <210> 21 13 <211> 108 <212> PRT <213> anticuerpo VL específico para el dominio ED-B de la fibronectina <400> 21 Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg lie Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105

Claims (24)

62 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en 5 las siguientes reivindicaciones:

1. Un anticuerpo con afinidad específica para un epítope característico del dominio ED-B de la fibronectina, caracterizado el anticuerpo porque 10 tiene una afinidad al epítope ED-B en el intervalo subnanomolar .

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo 15 reconoce la fibronectina ED-B(+) .

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo está en el formato scFv. 20

4. el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo recombinante. *is* *tA******-***¡** - * « - - .. . , «. . . *. * * . < « * . > *** _ $$>&->--* 63

5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la afinidad es mejorada por la introducción de un número limitado de mutaciones en sus residuos de CDR.

6. el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque los residuos son los residuos 31-33, 50, 52 y 54 de VH y dos residuos 32 y 50 de su dominio VL que han sido mutados.

7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza al dominio ED-B de la fibronectina con un Kd de 54 pM .

8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos: VH EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF PYFDYWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 19) 64 ligador GDGSSGGSGGASTG (SEQ ID NO: 20) VL EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY YASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QTGRIPPTFG QGTKVEIK (SEQ ID NO: 21) .

9. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es una forma variante funcionalmente equivalente de L19.

10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el anticuerpo está radiomarcado.

11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo está radioyodado.

12. El uso de un anticuerpo con afinidad específica para un epítope característico del dominio 65 ED-B de la fibronectina, el anticuerpo tiene afinidad mejorada para dicho dominio ED-B, para la dirección al objetivo rápida de marcadores de angiogénesis.

13. El uso de conformidad con la reivindicación 12, para la detección inmunocintigráfica de la angiogénesis.

14. El uso de conformidad con la reivindicación 13, para detectar enfermedades caracterizadas por proliferación vascular tales como retinopatía diabética, degeneración macular relacionada a la edad o tumores.

15. El uso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo localiza el tejido respectivo de tres a cuatro horas, más preferentemente 3 horas después de su inyección.

16. Un equipo de diagnóstico, caracterizado porque comprende un anticuerpo con afinidad específica para un epítope característico del dominio ED-B de la fibronectina, el anticuerpo tiene afinidad mejorada para el dominio ED-B y uno o más reactivos necesarios para la detección de la angio?rénesis . 66

17. El uso de un anticuerpo con afinidad específica para un epítope característico del dominio ED-B de la fibronectina, el anticuerpo tiene afinidad mejorada para el dominio ED-B para el diagnóstico y terapia de tumores y enfermedades caracterizadas por proliferación vascular.

18. Conjugados, caracterizados porque comprenden un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 y una molécula capaz de inducir la coagulación de la sangre y la oclusión de los vasos sanguíneos .

19. Los conjugados de conformidad con la reivindicación 18, caracterizados porque la molécula capaz de inducir la coagulación sanguínea y la oclusión de los vasos sanguíneos es una molécula fotoactiva .

20. Los conjugados de conformidad con la reivindicación 19 caracterizados porque la molécula fotoactiva es un fotosensibilizador.

21. Los conjugados de conformidad con la reivindicación 20, caracterizados porque el fotosensibilizador absorbe en una longitud de onda por arriba de 600 nm .

22. Los conjugados de conformidad con la 5 reivindicación 21, caracterizados porque el fotosensibilizador es un derivado de estaño (IV)- cloro e6.

23. El uso de un conjugado de conformidad 10 con la reivindicación 18, para la preparación de una composición inyectable para el tratamiento de las patologías relacionadas a la angiogénesis.

24. El uso de conformidad con la 15 reivindicación 23, en donde la patología relacionada a la angiogénesis es provocada por o asociada con angiogénesis ocular. *********. * U*t*f ***