MXPA98009732A

MXPA98009732A - Anticuerpos para el dominio ed-b de fibronectina, su construcción y usos

Info

Publication number: MXPA98009732A
Application number: MXPA/A/1998/009732A
Authority: MX
Inventors: Neri Dario; Carnemolla Barbara; Balza Enrica; Castellani Patrizia; Pini Alessandro; Zardi Luciano; Paul Winter Gregory; Neri Giovanni; Borsi Laura; Siri Annalisa
Original assignee: Cambridge Antibody Technology Limited
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1998-11-19
Publication date: 1999-06-01

Abstract

La presente invención se refiere a un fragmento de anticuerpo o anticuerpo aislado que es específico para y se une directamente al dominio oncofetal ED-B de fibronectina (FN), caracterizado porque tiene una constante de disociación (kd) de 6 x 10-8M, para ED-B FN cuando es medido como un monómero purificado.

Description

ANTICUERPOS PARA EL DOMINIO ED-B DE FIBRONECTINA, SU CONSTRUCCIÓN Y USOS ANTECEDENTES Esta invención se relaciona con miembros de unión específicos para una isoforma fetal de fibronectina, ED-B, la cual también se expresa en la neovasculatura en desarrollo de tumores, como se demuestra tanto por inmunocitoquímica como por marcado de tumores in vivo . También se relaciona con materiales y métodos que se relacionan con tales miembros de unión específicos. El objetivo principal de la mayor parte de las formas existentes de terapia tumoral es destruir tantas células constitutivas del tumor como sea posible. El éxito limitado que se ha experimentado con la quimioterapia y radioterapia se relaciona con la relativa carencia de especificidad del tratamiento y la tendencia a los efectos colaterales tóxicos sobre tejidos normales. Una manera en que se puede mejorar la selectividad de la terapia contra el tumor es suministrar un agente para el tumor a través de una proteína de unión, que habitualmente comprende un dominio de unión de un anticuerpo, con especificidad por un antígeno marcador expresado en la superficie del tumor, pero ausente de células normales. Esta forma de terapia dirigida, denominada libremente como "balas REF: 28797 mágicas", ha sido ejemplificada principalmente por anticuerpos monoclonales (mAb) de roedores los cuales son específicos para lo que se denominan antígenos asociados a tumor que se expresan sobre la superficie celular. Tales mAb pueden estar conjugados químicamente a la porción citotóxica (por ejemplo una toxina o un medicamento) o se puede producir como una proteína de fusión recombinante, en donde los genes que codifican para el mAb y la toxina se unen juntos y se expresan en batería. El enfoque de la "bala mágica" ha tenido un efecto limitado, aunque el significativo en el tratamiento del cáncer humano, de manera más notable en el marcado de tumores de origen linfoide, en donde las células malignas tienen un acceso más libre a la dosis terapéutica en circulación. Sin embargo, del tratamiento de tumores sólidos, permanece como un problema clínico grave, en donde sólo una porción minúscula de la masa celular total, predominantemente las células en la periferia más exterior del tumor, son expuestas a inmunoconjugados terapéuticos en la circulación; estos objetivos periféricos forman lo que se denomina "barrera de sitio de unión" hacia el interior del tumor (Juweid et al, 1992, Cáncer Res . 52 5144-5153). Dentro del tumor, la arquitectura del tejido generalmente es demasiado densa, con estroma fibroso y células tumorales empacadas estrechamente para que se permita la penetración de moléculas en el intervalo de tamaño de anticuerpos. Además, se sabe que los tumores tienen una presión intersticial elevada debido a la carencia de drenaje linfático, lo cual también impide el flujo de entrada de moléculas exógenas. Para una revisión reciente de los factores que afectan la captación de agentes terapéuticos dentro de tumores véase Jain, R (1994), Sci , Am. 271 58-65. Aunque existen limitaciones obvias al tratamiento de tumores sólidos a través del marcado de antígenos asociados con tumores, estos tumores tienen una característica en común la cual proporciona un objetivo antigénico alternativo para la terapia con anticuerpos . Una vez que han crecido más allá de cierto tamaño, los tumores son dependientes universalmente de un suministro sanguíneo independiente para adecuar el oxígeno y nutrientes para sostener el crecimiento. Si se puede interferir en este suministro de sangre o si se puede oprimir, existe un potencial realista de matar por falta de suministro a miles de células tumorales en el proceso. Conforme se desarrolla el tumor, experimenta un cambio a un fenotipo angiogénico, que produce un arreglo diverso de factores angiogénicos los cuales actúan sobre las células endoteliales capilares vecinas induciéndolas a proliferar y migrar. La estructura de estos vasos sanguíneos recién formados es altamente desorganizada, con terminaciones ciegas y fenestraciones que llevan a fugas aumentadas, en marcado contraste con la estructura ordenada de los capilares en tejido normal. La inducción de angiogénesis está acompañada por la regulación ascendente de la expresión de ciertos antígenos de superficie celular, muchos de los cuales son comunes a la vasculatura de los tejidos normales. La identificación de antígenos los cuales son únicos para la neovasculatura de tumores ha sido el factor limitante principal en el desarrollo de un tratamiento genérico para tumores sólidos a través del marcado vascular. El antígeno el cual es el objetivo de la presente invención resuelve este problema directamente. Durante el progreso del tumor, la matriz extracelular del tejido circundante se remodela a través de dos procesos principales: (1) la degradación proteolítica de componentes de matriz extracelular de tejido normal, y (2) la síntesis de novo de componentes de matriz extracelular tanto por células tumorales como por células de estroma activadas por citosinas inducidas por tumores. Estos dos procesos, en estado estable, generan una "matriz extracelular tumoral", la cual proporciona un ambiente más adecuado para el progreso del tumor y su diferenciación cualitativa y cuantitativa en comparación con los tejidos normales. Entre los componentes de esta matriz están las isoformas grandes de tenacina y fibronectina (FN) ; la descripción de estas proteínas como isoformas reconoce su heterogeneidad estructural extensa la cual se lleva a nivel transcripcional, post-transcripcional y post-traduccional (véase abajo) . Es una de las isoformas de la fibronectina, la denominada isoforma B+ (B-FN) , que es el sujeto de la presente invención. Las fibronectinas (FN) son glicoproteínas de peso molecular elevado, multifuncionales, constituyentes tanto de la matriz extracelular como de los fluidos corporales. Están involucradas en muchos procesos biológicos diferentes tales como el establecimiento y mantenimiento de la morfología celular normal, la migración celular, la hemostasis y trombosis, el sanado de heridas y la transformación oncogénica (para revisiones véanse Alitalo et al., 1982; Yamada, 1983; Hynes, 1985; Ruoslahti et al., 1988; Hynes, 1990; Owens et al., 1.986) . La diversis estructural en las FN se lleva a cabo alrededor de un empalme alternativo de tres regiones (ED-A, ED-B e IIICS) del transcrito de FN primario (Hynes, 1985; Zardi et al., 1987) para generar por lo menos 20 isoformas diferentes, algunas de las cuales se expresan diferencialmente en tumores y tejido tumoral. De la misma manera que es regulada de una manera específica en tejido y en el desarrollo, se sabe que el patrón de empalme de FN-pre-ARNm es desrregulado en células transformadas y en cánceres malignos (Castellani et al., 1986; Borsi et al, 1987; Vartio et al., 1987, Zardi et al, 1987; Barone et al, 1989;' Carnemolla et al, 1989; Oyama et al, 1989, 1990; Borsi et al, 1992b) . De hecho, las isoformas de FN que contienen las secuencias ED-A, ED-B e IIICS se expresan en mayor grado en células transformadas y tumores malignos en comparación con células normales. En particular, la isoforma que contiene la secuencia ED-B (isoforma B+) , se expresa altamente en tejido fetal y tumoral así como durante el sanado de heridas, pero se restringe su expresión en tejido adulto normal (Norton et al, 1987; Schwazbauer et al, 1987; Gutman y Kornblihtt, 1987; Carnemolla et al, 1989; ffrench-Constant et al, 1989; ffrench-Constant y Hynes, 1989; Laitinen et al, 1991.) Las moléculas B+ FN son indetectables en vasos maduros, pero están reguladas de manera ascendente en vasos sanguíneos angiogénicos en el desarrollo normal (por ejemplo en el desarrollo del endometrio) , patológico (por ejemplo en retinopatía diabética) y en el desarrollo de tumores (Castellani et al, 1994) . La secuencia ED-B es un repetido homología tipo III completo codificado por un sólo exón y que comprende 91 aminoácidos. En contraste con la isoforma IIICS empalmada alternativa, la cual contiene un sitio de unión específico para el tipo de célula, la función biológica de las isoformas A+ y B+ aún es tema de investigación (Humphries et al, 1986) . La presencia de la isoforma B+ en sí misma constituye un neoantígeno inducido por tumor, pero, además, la expresión de ED-B expone un antígeno normalmente crítico dentro de la sección repetida 7 tipo III (que precede ED-B) ; puesto que este epitopo no se expone en moléculas FN que carese de ED-B, se sigue que la expresión de ED-B induce la expresión de neoantígenos tanto directa como indirectamente. Este sitio antigénico crítico forma el objetivo de anticuerpo monoclonal (mAb) denominado BC-1 (Carnemolla et al, 1992) . La especificidad y propiedades biológicas de este mAb se han descrito en el documento EP 0 344 134 Bl y se puede obtener a partir del hibridoma depositado en el European Collection of Animal Cell Cultures, Portón Down, Salisbury, Reino Unido, bajo el número 88042101. El mAb ha sido utilizado con éxito para localizar los vasos sanguíneos angiogénicos de tumores sin reactividad cruzada a endotelio vascular maduro, lo que ilustra el potencial de las isoformas FN para el marcado vascular utilizando anticuerpos. Sin embargo, existen ciertas advertencias a la especificidad del mAb BC-1. El hecho de que BC-1 no reconozca directamente la isoforma B+ ha hecho surgir la cuestión de si en algunos tejidos, el epitopo reconocido por BC-1 puede ser desenmascarado sin la presencia de ED-B y por lo tanto llevar indirectamente a reactividad cruzada no deseada de BC-1. Además, BC-1 es estrictamente específico para la isoforma B+ humana, lo que significa que no es posible los estudios en animales respecto a la biodistribución y localización de tumores de BC-1. Aunque se han producido anticuerpos policlonales para las proteínas de fusión recombinantes que contengan la isoforma B+ (Peters et al, 1995), únicamente son reactivos con FN el cual ha sido tratado con N-glicanasa para desenmascarar al epitopo . Un problema general adicional con el uso de anticuerpos monoclonales de ratón es la respuesta humana contra anticuerpos de ratón (HAMA) (Schroff et al, 1985; Dejager et al, 1988) . Las respuestas HAMA tienen una variedad de efecto, desde neutralización del anticuerpo administrado lo que lleva a una dosis terapéutica reducida, hasta respuestas alérgicas, tales como malestar y daño renal . Aunque se han identificado antisueros policlonales reactivos con ED-B recombinante (véase antes) , el aislamiento de los mAb la misma especificidad que BC-1 posterior a inmunización de ratones generalmente ha demostrado ser difícil debido a que las proteínas humanas y de ratón ED-B son virtualmente 100% homologas en secuencia. Por lo tanto, la proteína humana tiene una apariencia similar a un autoantígeno para el ratón el cual después no monta una resistencia inmune al mismo. De hecho, en más de 10 años de investigación intensa en este campo, únicamente se ha identificado un sólo mAb con reactividad indirecta a la isoforma de FN B+ (BC-1) , y no hay ninguno que reconozca directamente a ED-B. Es casi igual de significativo que la especifisidad BC-1 es para un epitopo srítico expuesto como una sonsecuencia de ED-B, en vez de ser parte de ED-B mismo, lo cual es probable que esté ausente de FN de ratón y por lo tanto no se considere como "propio" por el sistema inmune de ratón. La realización de la presente invención se ha llevado a cabo utilizando una estrategia alternativa a la utilizada previamente y en donde no se requiere la inmunización previa con fibronectina o ED-B: se han obtenido anticuerpos con especificidad por la isoforma ED-B como Fvs de cadena única (scFvs) a partir de bibliotecas . de regiones variables de anticuerpo humano exhibidas en la superficie de bacteriófagos filamentosos (Nissim et al., 1994; véase también O92/01047, O92/20791, WO93/06213, 093/11236, W093/19172) . Hemos encontrado que al utilizar una biblioteca de fago de anticuerpo que es específica, se puede aislar scFvs tanto por selección directa en fragmentos de FN recombinantes que contienen el dominio ED-B como por ED-B recombinante mismo cuando estos antígenos están recubiertos sobre una superficie sólida ("técnica de toma panorámica") . Estas mismas fuentes de antígeno también han sido utilizadas con éxito para producir scFvs de "segunda generación" con propiedades mejoradas en relación a las clonas originales en un proceso de "maduración de afinidad" . Hemos encontrado que los scFvs aislados reaccionan fuertemente y de manera específica con la isoforma B+ de FN humano sin el tratamiento previo con N-glicanasa. En aplicasiones antitumorales, los dominios de unión de antígeno del anticuerpo humano proporcionados por la presente invención tienen la ventaja de no estar sujetos a la respuesta HAMA. Además, como se ejemplifica en la presente, son útiles en análisis inmunohistoquímico de tejido tumoral, tanto in vi tro como in vivo . Estos y otros usos se discuten adicionalmente en la presente y son evidentes por una persona habitualmente familiarizada con la técnica.

TERMINOLOGÍA Miembro de unión específico Esto describe un miembro de un par de moléculas las cuales tienen especificidad de unión entre sí. Los miembros de un par de unión específico pueden ser derivados naturalmente o bien pueden ser producidos sintéticamente total o parcialmente. Un miembro del par de moléculas tiene un área en su superficie, o una cavidad, la cual se une específicamente y por lo tanto es complementaria a una organización espacial y polar particular del otro miembro del par de moléculas . Por lo tanto, los miembros del par tienen la propiedad de unirse específicamente entre sí. Los ejemplos de tipos de pares de unión específicos son antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor de un ligando, enzima-sustrato.

Anticuerpo Este describe una inmunoglobulina, ya sea natural o producida parcial o completamente de manera sintética. El término también abarca cualquier polipéptido o proteína que tenga un dominio de unión el cual es, o sea homólogo a, un dominio de unión de anticuerpo. Este se puede derivar de fuentes naturales, o se puede producir sintéticamente parcial o completamente. Los ejemplos de anticuerpos son los isotipos de inmunoglobulina y sus subclases isotípicas; fragmentos los cuales comprenden un dominio de unión de antígeno tal como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; y diacuerpos (diabodies) . Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y utilizar técnicas de tecnología ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas las cuales retengan la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas pueden involucrar introducir ADN que codifique para la región variable de la inmunoglobulina o las regiones de determinación de complementariedad (CDR) , de un anticuerpo a las regiones constantes, o regiones constantes más regiones de armazón, de una inmunoglobulina diferente. Véanse, por ejemplo, EP-A-184187, GB 2188638A' o EP-A-239400. Un hibridoma u otra célula que produzca un anticuerpo se puede someter a mutación genética u otros cambios, los cuales pueden o no alterar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos. Puesto que los anticuerpos pueden ser modificados de numerosas maneras, el término "anticuerpo" se debe considerar que abarca cualquier miembro de unión específico o sustrato que tenga un dominio de unión con la especificidad requerida. Por lo tanto, este término abarca los fragmentos de anticuerpo, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpo, que incluyen a cualquier polipéptido constituido de un dominio de unión de inmunoglobulina, ya sea natural o sintético, completa o parcialmente. Por lo tanto se incluyen moléculas quiméricas constituidas de un dominio de unión de inmunoglobulina equivalente, fusionado a otro polipéptido. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describe en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023. Se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo puede realizar la función de antígenos de unión. Los ejemplos de fragmentos de unión son: (i) el fragmento Fab que consiste de los dominios de VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un sólo anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward et al., 1989) el cual consiste de un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende los fragmentos Fab unidos; (vii) moléculas Fv de cadena única (scFv) , en donde un dominio VH y un dominio VL están unidos por un enlazador peptídico lo cual permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión de antígeno (Bird et al, 1988; Huston et al, 1988) (viii) dímeros de Fv de cadena única biespecíficos (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos" , fragmentos multivalentes o multiespecíficos sonstruidos por fusión de genes (WO94/13804; Holliger et al, 1993) . Los diasuerpos son multímeros o polipéptidos, cada polipéptido comprende un primer dominio que está constituido de una región de unión de una cadena ligera de inmunoglobulina y un segundo dominio constituido de una región de unión de una cadena pesada de inmunoglobulina, los dos dominios están unidos (por ejemplo mediante un enlazador peptídico) pero son incapaces de asociarse entre sí para formar un sitio de unión de antígeno: los sitios de unión de antígeno se forman por la asociación del primer dominio de un polipéptido dentro del multímero, con el segundo dominio del otro polipéptido dentro del multímero (WO94/13804) . Cuando se van a utilizar anticuerpos biespecíficos, estos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales, los cuales se pueden fabricar de muchas maneras (Holliger and Winter, 1993) , por ejemplo se pueden preparar químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o pueden ser de cualquiera de los fragmentos biespecíficos mencionados antes. Puede ser preferible utilizar dímeros scFv o diacuerpos en vez de anticuerpos completos. Los diacuerpos y scFv se pueden construir sin una región Fc, utilizando únicamente dominios variables, lo que reduce potencialmente los efectos de reacción anti-idiotípica. Otras formas de anticuerpos biespecíficos incluyen las "Janusinas" ("Janusins") de cadena única descritas en Traunec er et al, (1991) . Los diacuerpos biespecíficos, en oposición con los anticuerpos completos bioespecífieos, también pueden ser particularmente útiles debido a que se pueden construir fácilmente y se expresan en E. coli . Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos tales como fragmentos de anticuerpo) de especificidades de unión apropiadas se pueden seleccionar fácilmente utilizando la exhibición de fagos (WO94/13804) a partir de bibliotecas. Si un brazo del diacuerpo debe mantenerse constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el antígeno X, entonces la biblioteca se puede fabricar en donde el otro brazo se hace variar y se selecciona un anticuerpo de especificidad apropiada.

Dominio de unión de antígeno Esto describe la parte de un anticuerpo la cual comprende el área la cual se une específicamente a, y es complementaria a parte o' la totalidad de un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo únicamente se puede unir a una parte definida del antígeno, parte la cual se denomina un epitopo. Se puede proporcionar un dominio de unión de antígeno por uno o más dominios variables de anticuerpo. Preferiblemente, un dominio de unión de antígeno comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) .

Especí f i co Esto se refiere a la situación en la cual un miembro de un par de unión específico no muestra ninguna unión significativa con moléculas diferentes a su asociado de unión específico. El término también es aplicable cuando, por ejemplo, un dominio de unión de antígeno es específico para un epitopo particular el cual es transportado por numerosos antigenos, en cuyo caso el miembro de unión específico que presenta el dominio de unión de antígeno será capaz de unirse a los diversos antígenos que presentan el epitopo.

Forma variante funcionalmente equivalente Esto se refiere a una molécula (la variante) la cual, aunque tiene diferentes estructurales con otra molécula (el original) retiene cierta homología importante y también por lo menos parte de la función biológica de la molécula original, por ejemplo, la capacidad de unirse a un antígeno particular o epitopo. Las variantes pueden estar en forma de fragmentos, derivados o mutantes. Una variante, derivado o mutante se puede obtener por modificación de la molécula original por la adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos, o por la unión a otra molécula. Estos cambios se pueden realizar en el nucleótido o a nivel de proteína. Por ejemplo, el polipéptido codificado puede ser un fragmento Fab el cual después se une a una cola Fc de otra fuente. Alternativamente, se puede unir un marcador tal como una enzima, fluoresceína, etc.

Descripción breve de la presente invención De acuerdo con la presente invención, se proporciona un miembro de unión específico el cual es específico para el dominio oncofetal ED-B de fibronectina (FN) . Los miembros de unión específicos de acuerdo con la invención se unen al dominio ED-B directamente. En una modalidad, un miembro de unión específico se une, después de tratamiento de FN con la proteasa termolisina a uno o a la totalidad de FN que contiene ED-B. En una modalidad adicional, un miembro de unión específico se une a cualquiera o la totalidad de FN que contenga secciones repetidas de tipo III las cuales incluyen al dominio ED-B. Las FN conocidas se identifican en dos documentos por Carnemolla et al., 1989; 1992) . La referencia a "todas las FN que contienen ED-B" se puede considerar como una referencia a todas las FN identificadas en estos documentos que contienen ED-B. Preferiblemente, el miembro de unión específico se une a ED-B humano y preferiblemente B+FN de por lo menos otra especie adicional, tal como ratón, rata y/o pollo. Preferiblemente, el miembro de par de unión específico es capaz de unirse tanto a ED-B de fibronectina humana como a ED-B de fibronectina no humana, tal como la de ratón, lo que permite realizar pruebas y análisis del miembro ED-B en un modelo animal . Los miembros de par de unión específica de acuerdo con la presente invención se unen a ED-B de fibronectina sin competir con el anticuerpo BC-1 depositado, disponible públicamente, discutido en otra parte en este documento. BC-1 es estrictamente específico para la isoforma B+ humana. Los miembros de par de unión específicos de acuerdo con la presente invención no se unen al mismo epitopo que BC-1. La unión de un miembro de unión específico de acuerdo con la presente invención a B+FN se puede inhibir por el dominio ED-B. En un aspecto de la presente invención, el dominio de unión tiene, cuando se mide como un monómero purificado, la constante de disociación (Kd) de 6 x 10"8 M o menor para ED-B FN.

En un aspecto de la presente invención, el dominio de unión es reactivo con, es decir, es capaz de unirse a ED-B de fibronectina sin el tratamiento de ED-B de fibronectina con N-glicanasa. Los miembros de par de unión específicos de acuerdo con la presente invención se pueden proporcionar como aislados o en forma purificada, es decir, en una preparación o formulación libre de otros miembros de par de unión específicos, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, o libres de otros miembros de par de unión específicos susceptibles de unirse a ED-B de fibronectina. Preferiblemente, los miembros de unión específicos de acuerdo con la presente invención se proporcionan en forma sustancialmente pura. Pueden ser "monoclonales" en el sentido de provenir de una sola clona, en vez de estar restringidos a anticuerpos obtenidos utilizando tecnología de hibridoma tradicional. Como se discute, los miembros de par de unión específicos de acuerdo con la presente invención se pueden obtener utilizando la tecnología de exhibición de bacteriófago y/o la expresión en células huésped recombinantes, por ejemplo bacterianas . No existe una descripción previa de un miembro de par de unión específico monoclonal el cual se una directamente a ED-B de fibronectina. Preferiblemente, el miembro de unión específico comprende un anticuerpo. El miembro de unión específico puede comprender una secuencia polipeptídica en forma de un fragmento de anticuerpo tal como una cadena única Fv (scFv) . También se pueden utilizar otros tipos de fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb o un diacuerpo (Winter y Milstein, 1991; W094/13804) . El miembro de unión específico puede estar en forma de un anticuerpo completo. El anticuerpo completo puede estar en cualquiera de las formas de los isotipos de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgD, igE e IgM y cualguiera de las formas de las subclases de isotipo, por ejemplo, IgGl o IgG4. El anticuerpo puede ser de cualquier origen, por ejemplo, humano, de ratón, ovino o de borrego. Otras derivaciones serán claras para aquéllos familiarizados en la técnica. Preferiblemente, el anticuerpo es de origen humano. Por "humano" se quiere significar un anticuerpo que ha sido derivado parcial o completamente de una biblioteca de ADNc, proteína o péptido humanos . El término incluye péptidos humanizados y proteínas de origen no humano que han sido modificadas con el fin de impartir características humanas a la molécula de anticuerpo y de esta manera permitir que la molécula sobrepase las defensas del sistema inmune humano. El miembro de unión específica también puede estar en forma de un anticuerpo sometido a ingeniería genética, por ejemplo, una molécula de anticuerpo biespecífica (o un fragmento tal como F(ab')2) el cual tiene un brazo de unión a antígeno (es decir, un dominio específico) contra ED-B de fibronectina como se describe, y otro brazo contra una especificidad diferente, o una molécula bivalente o multivalente . Además de las secuencias de anticuerpo, el miembro de unión específico puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo, que forman un péptido o polipéptido, o para impartir a la molécula otra característica funcional además de- la capacidad de unir antígeno. Por ejemplo, el miembro de unión específico puede comprender una etiqueta, una enzima o un fragmento del mismo, y así sucesivamente. El dominio de unión puede comprender parte o la totalidad de un dominio VH codificado por un segmento de línea germinal o un segmento de gen rearreglado. El dominio de unión puede comprender parte o la totalidad del dominio kappa VL o un dominio la bda VL . El dominio de unión puede comprender una secuencia de gen de línea germinal VHl, VH3 o VH4 , o una forma rearreglada del mismo. Un miembro de unión específico de acuerdo con la presente invención puede comprender una región variable de cadena pesada (dominio "VH") derivado de la línea germinal humana DP47, la secuencia de la cual se muestra en la figura l(a), residuos 1 a 98. La nomenclatura "DP" se describe en Tomlinson et al, (1992) . La secuencia de aminoácidos de CDR3 puede ser Ser Leu Pro Lys. La secuencia de aminoácidos de CDR3 puede ser Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu. Por lo tanto, el dominio de unión de un miembro de unión específico de acuerdo con la presente invención puede incluir un dominio VH que comprenda las secuencias de aminoácidos mostradas en la figura Ka) para CGS-1 y CGS-2. El dominio de unión puede comprender una región variable de cadena ligera (dominio "VL") derivado de la línea germinal humana DPL16, la secuencia de la cual se muestra en la figura 1 (b) como codones 1-90. El dominio VL puede comprender una secuencia CDR3 Asn Ser Ser Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val . El dominio VL puede comprender una secuencia CDR 3 Asn Ser Ser Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val. Los miembros de unión específicos de la invención pueden comprender variantes funcionalmente equivalentes de las secuencias mostradas en la figura 1, por ejemplo, uno o más aminoácidos se han insertado, suprimido, sustituido o agregado, con la condición de que se retenga una propiedad como se establece en la presente. Por ejemplo, la secuencia CDR3 puede ser alterada, o se pueden realizar uno o más cambios a las regiones de armazón, o la región de armazón puede ser sustituida con otra región de armazón o una forma modificada, con la condición de que el miembro de unión específico se una a ED-B.

Se pueden utilizar uno o más CDR a partir del dominio VL o VH de un dominio de unión de antígeno o un anticuerpo descrito en la presente en lo que se denomina "injerto CDR" en el cual una o más secuencias de CDR de un primer anticuerpo se colocan dentro de un armazón de secuencias que no es del anticuerpo, por ejemplo, como se describe en EP-B-0239400. Las secuencias CDR para CGS-l y CGS-2 se muestran en la figura l(a) y Kb) . Un miembro de unión específico de acuerdo con la invención puede ser uno el cual compite con un anticuerpo o scFv descrito en la presente por su unión a ED-B de fibronectina. La competencia entre miembros de unión se puede determinar fácilmente in vi tro, por ejemplo al marcar una molécula indicadora específica a un miembro de unión el cual puede ser detectado en presencia de otro miembro o miembros de unión no marcados, para permitir la identificación de miembros de unión específicos los cuales se unen al mismo epitopo o a un epitopo superpuesto. Se puede utilizar un miembro de unión específico de acuerdo con la presente invención en un método que comprende provocar o permitir que la unión del miembro de unión específico a su epitopo. La unión puede ser posterior a la administración del miembro de unión de específica a un mamífero, por ejemplo, un humano o roedor tal como un ratón.

La presente invención proporciona el uso de un miembro de unión específico como el anterior para uso como un reactivo diagnóstico para tumores . La evidencia experimental en modelos animales descrita posteriormente muestra que los miembros de unión de acuerdo con la presente invención son útiles para localización in vivo de tumores. Los miembros de unión específicos preferidos de acuerdo con la presente invención incluyen aquéllos los cuales se unen a tumores humanos, por ejemplo, en una sección cortada por crióstato, la cual muestra un fenotipo invasivo y angiogénico, y aquéllos los cuales se unen a tejidos embriónicos, por ejemplo en una sección cortada con crióstato. La unión se puede demostrar por tinción inmunocitoquímica. En una modalidad preferida, el miembro de unión específico no se une, o no se une significativamente a tenacina, una proteína de matriz extracelular. En otra modalidad preferida, el miembro de unión específica no se une, o no se une significativamente a piel humana normal, por ejemplo, en una sección de crióstato y/o como se demuestra utilizando tinción inmunocitoquímica. Las modalidades adicionales de los miembros de unión específicos de acuerdo con la presente invención no se unen, o no se unen significativamente a uno o más tejidos normales (por ejemplo, en sección de crióstato y/o como se demuestra utilizando tinción inmunocitoquímica) que se seleccionan de hígado, vaso, riñon, estómago, intestino delgado, intestino grueso, ovarios, útero, vejiga, páncreas, glándulas suprarrenales, músculo esquelético, corazón, pulmón, tiroides y cerebro. Un miembro de unión específico para ED-B puede ser utilizado como un agente marcador in vivo el cual puede ser utilizado para demostrar específicamente la presencia y localización de tumores que expresan o que están asociados con ED-B de fibronectina. Se puede utilizar como un agente formador de imagen. La presente invención proporciona un método para determinar la presencia de una célula o tumor que expresa o que está asociado con la expresión de ED-B de fibronectina, el método comprende poner en contacto células con un miembro de unión específiso como se proporciona y determinar la unión del miembro de unión específico a las células . El método se puede llevar a cabo in vivo o in vi tro en una muestra de prueba de células removidas del cuerpo . Se pueden determinar las reactividades de anticuerpos en una muestra de células mediante cualquier medio apropiado. Una posibilidad es el marcado con moléculas indicadoras individuales. Las moléculas indicadoras pueden generar, directa o indirectamente, señales detectables y, preferiblemente, mensurables . La unión de moléculas indicadoras puede ser covalentemente, directa o indirectamente, por ejemplo, vía un enlace peptídico, o bien de manera no covalente. La unión via un enlace peptídico puede ser resultado de la expresión recombinante de un gen de fusión que codifica para el anticuerpo y una molécula indicadora. Un modo favorecido es mediante la unión covalente de cada anticuerpo con un fluorocromo individual, un colorante de fósforo o láser con características de absorción o emisión aisladas espectralmente. Los fluorocromos adecuados incluyen fluorosceína, rodamina, ficoertrina y rojo Texas. Los colorantes cromogénicos adecuados incluyen diaminobencidina . Otros indicadores incluyen partículas coloidales macromoleculares o material particulado tal como esfera de látex que tienen color, agentes magnéticos o paramagnéticos y biológica o químicamente activos que pueden provocar, directa o indirectamente, señales detectables para ser observadas visualmente, detectadas electrónicamente o registradas de alguna otra manera. Estas moléculas pueden ser enzimas las cuales catalicen reacciones que desarrollen o cambien colores o que provoquen cambios en propiedades eléctricas, por ejemplo. Pueden ser molecularmente excitables tales como las transiciones electrónicas entre estados de energía que resultan en absorciones o emisiones espectrales características. Pueden incluir entidades químicas utilizadas junto con biosensores. Se pueden utilizar sistemas de detección de biotina/avidina o biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina.

El modo para determinar la unión no es una característica de la presente invención y aquéllos familiarizados con la técnica son capaces de elegir un modo adecuado de acuerdo a su preferencia y conocimiento general . Las señales generadas por conjugados individuales de anticuerpo-indicador pueden ser indicadas para derivar datos absolutos o relativos cuantificables de la unión de anticuerpo relevante en muestras de células (normales y de prueba) . Además, se puede utilizar una tinción nuclear general tal como yoduro de propidio para enumerar la población celular total en una muestra, lo que permite proporcionar relaciones cuantitativas de poblaciones celulares individuales en relación a las células totales . Cuando se unen a un anticuerpo radionucleótidos tales como 12SI, 1:L1In o 99mTc, si este anticuerpo se localiza preferencialmente en un tumor en vez de en tejidos normales, se puede detectar y cuantificar la presencia de radiomarca en el tejido tumoral utilizando una cámara gamma. La calidad de la imagen de tumor obtenida se correlaciona directamente con la proporción señal : ruido . Se pueden utilizar los anticuerpos como agentes de diagnóstico para trazar tumores recién vascularizados y también se pueden utilizar, por ejemplo, en forma modificada, para suministrar agentes citotóxicos o para activar la coagulación dentro de vasos nuevos, y de esta manera matar por falta de suministro el tumor en desarrollo suprimiendo el oxígeno y nutrientes y constituyendo una forma indirecta de terapia contra tumores . La presente invención también proporciona el uso de un miembro de unión específico como en lo anterior para utilizarse como un reactivo terapéutico, por ejemplo, cuando se acopla, se une o se somete a ingeniería genética como una proteína de fusión para poseer una función efectora. Un miembro de unión específico de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para marcar una toxina, radioactividad, células T, células asesinas (killer) u otras moléculas a un tumor que exprese o que esté asociado con el antígeno de interés . En consecuencia, aspectos adicionales de la invención proporcionan métodos de tratamiento que comprenden la administración de un miembro de unión específico según se proporciona, composiciones farmacéuticas que comprenden tal miembro de unión específico, y el uso de tal miembro de unión específico en la fabricación de un medicamento para administración, por ejemplo en un método para elaborar un medicamento o composición farmacéutica que comprende formular el miembro de unión específico con un excipiente farmacéutisamente aceptable . De acuerdo con la presente invención, se pueden administrar a individuos las composiciones proporcionadas. Preferiblemente, la administración es en una "cantidad terapéuticamente efectiva", esta es suficiente para mostrar beneficio al paciente. Tal beneficio puede ser por lo menos disminución de por lo menos un síntoma. La cantidad real administrada y el régimen y curso en el tiempo de administración dependerán de la naturaleza y gravedad de la enfermedad que esté siendo tratada. La prescripción de tratamiento, por ejemplo decisiones en cuanto a dosificación, etc., está dentro de la responsabilidad de los médicos generales y otros doctores en medicina. Las dosis apropiadas de anticuerpo son bien conocidas en la técnica; véase Ledermann et: al., (1991); Bagshawe K. D. et al. (1991). La composición se puede administrar sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultáneamente o secuencialmente en base en la condición que esté siendo tratada. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, y para uso de acuerdo con la presente invención pueden comprender además del ingrediente activo, un excipiente, portador, amortiguador, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por aquéllos familiarizados con la técnica. Tales materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro portador dependerá de la vía de administración, la cual puede ser oral, o por inyección, por ejemplo intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en forma de tableta, cápsula, polvo o líquido. Una tableta puede estar constituida de un portador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Se pueden incluir la solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio de absorción, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa aceptable parenteralmente la cual esté libre de pirógenos y tenga pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquéllos familiarizados con la técnica pertinente son capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactada. Se pueden incluir según se requieran conservadores, estabilizantes, amortiguadores, antioxidantes y/u otros aditivos. Un miembro de unión específico de acuerdo con la » presente invención se puede elaborar por la expresión de ácido nucleico codificante. El ácido nucleico que codifica para cualquier miembro de unión específico como se proporciona en sí mismo forma un aspecto de la presente invención, así como un método de producción del miembro de unión específico, método el cual comprende la expresión del ácido nucleico codificante para el mismo. La expresión se puede llevar a cabo convenientemente al cultivar bajo condiciones apropiadas células huésped recombinantes que contienen el ácido nucleico. El ácido nucleico puede codificar para cualquiera de las secuencias de aminoácidos de los dominios de unión de antígeno de anticuerpo descritos en la presente o cualquier forma funcionalmente equivalente. Se pueden realizar cambios a nivel de nucleótidos mediante adición, sustitución, supresión o inserción de uno o más nucleótidos, cambios los cuales pueden o no verse reflejados a nivel de aminoácidos, en base en la degeneración del código genético. Son bien conocidos los sistemas para clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero, sistemas de levadura y de baculovirus. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñon de hámster de bebé y muchas otras . Un huésped bacteriano preferido, común, es E. coli . La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en células procarióticas tales como E. coli está bien establecido en la técnica. Para una revisión, véase, por ejemplo, Plückthun, (1991) . La expresión en células eucarióticas en cultivo también está disponible para aquéllos familiarizados en la técnica como una opción para la producción de un miembro de unión específico, véase para revisiones recientes, por ejemplo, Reff, (1993); Trill et al. (1995). Los vectores adecuados se pueden elegir o construir para que contengan las secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias alargadoras, genes marcadores y otras secuencias según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, virales por ejemplo, fago o fagémido, según sea apropiado. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual : 2a edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas conocidas y protocolos para manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciado, introducción de ADN en células y expresión de genes, y el análisis de proteínas, se describen con detalle en Short Protocols in Molecular Biology, segunda edición, Ausubel et al . eds . , John Wiley & Sons, 1992. Las descripciones de Sambrook et al. y Ausubel et al. se incorporan en la presente como referencia.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención proporciona una célula huésped que contiene ácido nucleico como se describe en la presente. Un aspecto adicional proporciona un método que comprende introducir tal ácido nucleico en una célula huésped. La introducción puede utilizar cualquier técnica disponible. Para células eucarióticas, las técnicas adesuadas pueden incluir transfección por fosfato de calcio, DEAE-Dextran, electroporación, transfección mediada por liposoma y transducción utilizando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o para células de insecto, baculovirus. Para células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación en cloruro de calcio, electroporación y transfección utilizando bacteriófago. La introducción puede ser seguida al provocar o permitir la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, al cultivar células huésped bajo condiciones para expresión del gen. En una modalidad, el ácido nucleico de la invención se integra en el genoma (por ejemplo cromosoma) de la célula huésped. La integración puede ser promovida por inclusión de secuencias las cuales promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con las técnicas estándar. La producsión continua de un miembro de unión específico puede ser utilizada, por ejemplo, en cualquiera de las maneras descritas en la presente, por ejemplo en la formulación de un producto farmacéutico o de diagnóstico, tal como un equipo que comprende, además del miembro de unión específico, uno o más reactivos para determinar la unión del miembro a las células, como se ha descrito. Los aspectos adicionales de la invención y las modalidades serán evidentes para aquéllos familiarizados en la técnica. Con el fin de que la presente invención sea comprendida completamente, se proporcionan los siguientes ejemplos a modo de ejemplificación únicamente y no de manera limitante. Se hace referencia a las siguientes figuras: la figura 1 muestra secuencias alineadas de aminoácidos de VH y VL de scFvs CGS-1 y CGS-2. La figura Ka) muestra las secuencias VH; la figura 1 (b) muestra las secuencia VL. Se indican los CDR (1, 2 y 3) . La mayor parte de la línea germinal humana homologa VH para ambos scFvs es el segmento DP47 de la familia VH3; el segmento VL de ambas clonas es DPL16, la cadena ligera utilizada para construir la biblioteca scFv original (Nissim et al, 1994) , Los residuos que diferencian las dos clonas entre sí están subrayados. Figura 2: la figura 2A muestra un modelo de la estructura de dominio de la subunidad FN humana. Se indican las regiones IIICS, ED-A y ED-B de variabilidad, debido a la alineación alternativa de pre-ARNm FN. La figura también indica las homologías internas así como los productos principales de digestión de termolisina contenidos en ED-B (Zardi et al, 1987) . La figura 2B muestra la prueba SDS-PAGE de 4-18% de plasma y WI38VA FN y sus digeridos de termolisina teñidos con azul de Coomassie e inmunotransferencias sondeadas con BC-1, IST-6, CGS-1 y CGS-2. El FN plasmático no digerido (carril 1) y se digiere en FN plasmático utilizando termolisina a 1 µg/mg de FN (carril 3) y 10 µg/mg de FN (carril 4) . El FN WI38VA no digerido (carril 2) y digerido utilizando termolisina a 1 µg/mg (carril 5) , 5 µg/mg (carril 6) y 10 µg/mg (carril 7) de FN. Los números en el lado derecho indican los productos principales de digestión por termolisina mostrados en la figura 2A. Los valores a la izquierda indican los marcadores de peso molecular en unidades kilodalton (kD) . Figura 3 : la figura 3A muestra las secuencias repetidas de FN tipo III contenidas en las proteínas de fusión y recombinantes expresadas en E. coli , y la reactividad de estas proteínas con CGS-1 y CGS-2 y con los mAb BC-1 e IST-6. La figura 3B muestra el gel teñido con azul de Coomassie y a lo largo de las inmunotransferencias sondeadas con CGS-1, CGS-2, BC-1, IST-6. La numeración de los carriles corresponde a la de los constructos peptídicos en la parte superior de la figura. Los valores a la izquierda indican los marcadores de peso molecular en kD. Figura 4: Formador de imagen Mouse infrarrojo; el formador de imagen mouse utilizado para experimentos de marcado consiste de una caja no fluorescente negra equipada con una lámpara de halógeno y tungsteno con filtros de excitación y emisión específicos para el fluoróforo infrarrojo CY7 y una cámara CCD monocromática de 8 bitios controlada por computadora . Figura 5 : marcado de fragmentos de anticuerpo marcados fluorescentemente para el teratocarcino a de ratón F9 utilizando scFv (CGS-1) monomérico y scFv (CGS-1) 2 dimérico dirigido para B-FN. El scFv (DI.3) 2 dimérico con una especificidad de unión a la isozima se utilizó como un control negativo. Figura 6: Establecimiento como objetivo de fragmentos de anticuerpo marcados fluorescentemente para el teratocarcinoma de ratón F9 utilizando la afinidad de scFv (CGS-2) maduros y la afinidad menor de scFv(28SI) dirigidos al mismo epitopo de B-FN. El establecimiento como objetivo se detecta tanto en tumores grandes (aproximadamente 0.6 gramos), cubiertos a las 48 horas con una costra negra que parcialmente oscurece la imagen, así como tumores pequeños (de aproximadamente 0.2 gramos). Todos los documentos mencionados en la presente se incorporan como referencia.

Lista de ejemplos Ejemplo 1 - Aislamiento de scFvs humanos específicos para el dominio ED-B de FN humana.

Ejemplo 2 - Maduración de afinidad de scFvs humanos específicos para el dominio ED-B de FN humana. Ejemplo 3 - Especificidad de afinidad de scFvs madurados para fibronectinas que contienen ED-B. Ejemplo 4 - Uso de scFvs contra ED-B madurados en cuanto a afinidad por tinción inmunocitoquímica de secciones de tumor humano y de ratón. Ejemplo 5 - Uso de scFvs contra ED-B, madurado por afinidad en el establecimiento como objetivo in vivo de tumores humanos . Ejemplo 6 - Establecimiento como objetivo de teratocarsinoma F9 de ratón xenoinjertado en ratones atímicos .

Ejemplo 1 - Aislamiento de scFvs humanos específicos para el dominio ED-B de FN humana .

Se utilizó la biblioteca del fago scFv humano (Nissim et al, 1994) para la selección de anticuerpos recombinantes. Se utilizaron dos formas diferentes de isoforma ED-B como una fuente de antígeno para selección y, en ambos casos, la isoforma fue proteína humana recombinante . Los péptidos recombinantes de FN que contienen las secciones repetidas tipo III 2-11 (B-) y 2-11 (B+) se expresan en Es cheri chi a coli .

Se produce un construsto utilizando ADNs de F? de las clonas pFH154 (Kornblihtt et al 1985) , ?F10 y ?F2 (Carnemolla et al, 1989) . Los constructos de AD?c, que abarca las bases 2229-4787, (Kornblihtt et al, 1985) se insertan en el vector pQE-3/5 utilizando el equipo QIAexpress de Qiagen (Chatsworth, CA) . Las F?-III 2-11 (B-) y (B+) recombinantes se purifican por cromatografía de inmunoafinidad utilizando el mAb 3E3 conjugado con Sepharose 4B (Pharmacia) . Se producen fragmentos de AD? para la preparación de los fragmentos de F? recombinantes que contienen las secciones repetidas de homología tipo III 7B89, 789, ED-B y F?-6 producidas por amplificación de reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando AD? polimerasa UltMA (Perkin Elmer) , utilizando AD?c de clonas F? 2-11 (B+) y F? 2-11 (B-) como plantilla. Los iniciadores se diseñan para permitir la clonación de productos PCR en pQE-12 utilizando el equipo QIAexpress (Quiagen) . Posteriormente se transforman en E. coli y se expresan. Todas las clonas de AD?c se secuenciaron utilizando el equipo de secuenciado Sequenase 2.0 AD? (USB). Las proteínas recombinantes se purificaron por cromatografía Ni-?TA (IMAC) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen) , utilizando la etiqueta de hexahistidina en la parte carboxi terminal de los fragmentos de F?. La proteína de fusión ED-B-3Gal se prepara por clonación de ADNc para ED-B dentro del vector bacteriófago ?gtll para proporcionar la clona ?ED-B. Se derivó la clona ?chF?60 (que contiene parte de la secuencia ED-B) como una proteína de fusión de pchFNßO de FN de pollo clonada (Norton et al, 1987) . Para la selección de la biblioteca del fago scFv humano, se realizaron tres rondas de técnica de toma panorámica para cada uno de los dos antígenos recombinantes diferentes (7B89 y ED-B) . Los antígenos fueron revestidos sobre inmunotubos (Nunc; Maxisorp, Roskilde, Dinamarca) durante la noche a 50 µg/ml en PBS (amortiguador de fosfato 20 mM, NaCl 0.15 M, pH 7.2). El primer antígeno fue el fragmento 7B89 de FN recombinante, en la cual el dominio ED-B está flanqueado por las secciones repetidas con homología para N tipo III adyacente; esto fue recubierto 4°C durante la noche. El segundo antígeno utilizado fue ED-B recombinante (Zardi et al, 1987) con una etiqueta hexahistidina en la parte carboxi terminal; esta proteína no contiene residuos lisina, de manera que el grupo amino terminal del primer aminoácido está disponible para inmovilización covalente específica para el sitio de ED-B para las placas reactivas de ELISA (Nunc; Covalink) . El recubrimiento se llevó a cabo durante la noche a temperatura ambiente. Después de las tres rondas de técnica de toma panorámico, el fago eluido se infecta en células E. coli HB2151 y se siembra en placas como se describe (Nissim et al., 1994) . Después de cada ronda de selección, se analizan 95 colonias solas resistentes a ampicilina para identificar scFvs específico para antígeno mediante ELISA. Las clonas las cuales proporcionan las señales más altas en ELISA sobre los antígenos utilizados para la técnica de toma panorámica se seleccionan para análisis adicional y para maduración de afinidad. Estas clonas también demuestra que se proporciona tinción específica de secciones de glioblastoma multiforme y de tumores de mama por tinción inmunocitoquímica, descrita con más detalle en el Ejemplo 4.

Ejemplo 2 - Maduración de afinidad de scFvs humanos específicos para el dominio ED-B de FN humana .

Se seleccionaron clonas 35GE (a partir de la selección con 7B89) y 28SI (a partir de la selección con el dominio ED-B solo) como anticuerpos candidato para maduración por afinidad. Con el fin de diversificar las cadenas ligeras como un medio para mejorar la afinidad, después se exploró la estrategia de maduración de afinidad si ya en base en la aleatorización de los seis residuos sentrales (DSSGNH) de la cadena ligera CDR3 utilizando oligonucleótidos degenerados y PCR (figura 1) , lo que proporciona una diversidad potencial de la secuencia de 206 = ß 4 x 107. Esta región (junto con la cadena pesada CDR3) se localiza en el centro de unión de antígeno (Padlan, 1994) . También mutamos el residuo arginina que precede directamente a la cadena de seis residuos a serina, con el fin de evitar la posibilidad de efectos electrostáticos que dominen la selección. El plásmido a partir de una sola colonia bacteriana que expresa el fragmento scFv "original" se amplificó por PCR con iniciadores LMB3 (5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3 ' ) y CDR3-6-VL-FOR (5' CTT GGT CCC TCC GCC GAA TAC CAC MNN MNN MNN MNN MNN M?N AGA GGA GTT ACA GTA ATA GTC AGC CTC 3') (94C [1'] - 55C [1'] - 72C [1'30"3/ 25 cislos; véase Marks et al., 1991, para amortiguadores y condiciones) . El producto resultante se purificó por gel (con el fin de remover trazas del plásmido que contiene al gen scFv original) y se utilizó como plantilla para una segunda etapa de amplificación con iniciadores LMB3 y Jl-?ot-FOR (5' ATT GCT TTT CCT TTT TGC GGC CGC GCC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC TCC GCC 3') (94C [1'] - 55C [1'] - 72C [1'30"], 25 ciclos) . El producto PCR sin tratar, el cual corre como una banda única de peso molecular correcto en gel de agarosa, se purifica directamente a partir de la mezcla de PCR utilizando Spin-Bind (FMC, Rockland, ME, EUA) , sometido a digestión doble con ?col/?otl y ligado en gel-purificado con el fagémido pHE?l digerido con Ncol/?otl (Hoogenboom et al., 1991) que contiene un inserto falso ?col/?otl para facilitar la separación del vector con doble digestión del vector con una sola digestión. El vector se prepara con un equipo de preparación máxima de plásmido Qiagen (Chatsworth, CA, E.U.A.) aproximadamente 5 µg del plásmido digerido y del inserto se utilizaron en la mezcla de ligación, la cual se extrae una vez con fenol, una vez con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:25:1), y después se precipitó con etanol utilizando glicógeno (Boehringer, Mannheim, Alemania) como un portador, y se secó al vacío a alta velocidad. El sedimento o pastilla se resuspendió en 20 µl de agua y se sometió a electroporación en células E. coli TGl electrocomponentes (Gibson, 1984) . Típicamente utilizamos células electrocompetentes con un título de 109 transformantes/µg si se utilizan concentrados de glicerol, o 1010 transformantes/µg con células electrocompetentes recién preparadas. Esto típicamente proporciona > 107 clonas con el procedimiento indicado aquí . La biblioteca de maduración después se procesa como la biblioteca Nissim (Nissim et al., 1994) para producir partículas de fago, las cuales fueron utilizadas para una ronda de selección en inmunotubos utilizando 7B89 (10 µg/ml) como antígeno, seguido por una ronda de selección cinética (Hawkins et al., 1992) . Esta etapa de selección se realizó al incubar 7B89 biotinado (10 nM) con la suspensión del fago (aproximadamente 1012 t.u.) en PBS con leche al 2% (2% MPBS) a partir de la primera ronda de selección durante 5 minutos, y después agregando 7B89 no biotinado (1 µM) y al dejar que la competencia proceda durante 30 minutos. Posteriormente se agregaron a la mezcla de reacción 100 µl de dinaesferas revestidas con estreptavidina (Dynal : M480) prebloqueadas en MPBS al 2%, se mezclaron durante 2 minutos y después se capturaron en un imán y se lavaron 10 veces con lavados alternados de (PBS + 0.1% Tween-20) y PBS. El fago se eluyó de las esferas con 0.5 ml de trietilamina 100 mM. Esta solución se neutralizó posteriormente, con 0.25 ml de Tris 1 M, pH 7.4 y se utilizó para infectar células HB2151 que crecen exponencialmente (Nissim et al., 1994). Se utilizaron 95 colonias solas resistentes a ampicilina para producir sobrenadantes que contienen scFv, las cuales fueron analizadas por ELISA inmunohistoquímica y vía núcleo BIAcore para identificar los mejores aglutinantes. Después fueron subclonadas entre los sitios Sfil/Notl del vector de expresión pDN268 (Neri et al., 1996), la cual agrega una etiqueta fosforilable, el epitopo FLAG y una etiqueta de hexahistidina en la extremidad C terminal del scFv. Las colonias solas en los anticuerpos relevantes subclonados en pDN268 se hacen crecer a 37 °C en 2 x TY que contienen 10 mg/l de ampicilina y glucosa al 0.1%. Cuando el cultivo celular alcanzó una DO600 = 0.8, se agregó IPTG hasta una consentración final de 1 mM y continúa el crecimiento durante 16-20 h a 30 °C. Después de centrifugación (rotor Sorvall GS-3, 7000 rpm, 30 minutos), el sobrenadante se filtró, se consentró y se sometió a intercambio de amortiguador de cargado (fosfato 50 mM, pH 7.4, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM) utilizando un aparato de flujo tangencial Minisette (Filtron) .

La solución resultante se carga en 1 ml de resina Ni-NTA (Qiagen) , se lava con 50 ml de amortiguador de cargado y se eluye con amortiguador de elusión (fosfato 50 mM, pH 7.4, NaCl 500 mM, imidazol 100 mM) . El anticuerpo purificado se analizó por SDS-PAGE (Laemmli, 1970) y se dializó versus PBS a 4°C. Las preparaciones de scFv purificadas se procesaron adicionalmente por filtración en gel utilizando un aparato de FPLC equipado con una columna S-75, puesto que se sabe que los fragmentos multivalentes de scFv pueden mostrar buena unión artificialmente en BIAnúcleo (Jonsson et al., 1991) en virtud de sus efectos de avidez (Nissim et al., 1994; Crothers y Me zger, 1972) . Se determinaron espectrofotométrisamente la concentración de anticuerpo de las fracciones monoméricas purificadas con FPLC suponiendo una absorbencia a 280 nm de 1.4 unidades para una solución de scFv de 1 mg/ml. La unión de scFv monovalente a diversas concentraciones en el intervalo de 0.1 - 1 µM en PBS se midió en una máquina BIAnúcleo (Pharmacia Biosensor) , utilizando los siguientes antígenos: (i) 1000 unidades de resonancia (UR) de fragmento F? recombinante biotinado de 7B89 inmovilizado en una oblea revestida con estreptavidina la cual se une específisamente a 250 UR de scFv; (ii) 200 UR de ED-B recombinante, inmovilizado químicamente en el grupo amino N-terminal , el cual se une específisamente a 600 UR de scFv; (iii) 3500 UR de WI38VA de fibronectina rico en ED-B (véase el Ejemplo 3) , el cual se une espesífisamente a 150 UR de scFv. El análisis cinético de los datos se realiza de acuerdo con. las instrucciones de los fabricantes. En base en el análisis cualitativo BIAnúcleo de los sobrenadantes que contienen anticuerpo, se seleccionó una versión madurada en cuanto a afinidad de cada clona scFv: la clona CGS-1 de la selección con el fragmento 78B9 y CGS-2 de la selección con el fragmento FN recombinante de ED-B. Las constantes de velocidad de asociación (kon) Y las constantes de velocidad de disociación (koff) se muestran en la Tabla 1, junto con las constantes de disociación (Kd) al equilibrio calculadas de ambos scFv y la clona original 28SI. Aunque ambas clonas CGS-1 y CGS-2 tienen Kd en el intervalo nanomolar, la clona CGS-2 muestra mayor mejoría sobre su clona original, lo que proporciona una Kd de 1 nM (mejorada a partir de 110 nM) con respecto a la totalidad de las tres proteínas probadas en la oblea detectora (Tabla 1) . La mejoría se debe principalmente a una constante de disociación cinética más lenta (~10~4 s"1) , medida con preparaciones de anticuerpo monomérico (no mostradas) . La estrategia de maduración parece ser general, y ha proporcionado anticuerpos de afinidad mejorada contra proteína que se une a maltosa, citocromo C, el dominio extracelular de endoglina de ratón (D.N., L. Wyder, R. Klemenz) , citomegalovirus (A.P., G. Neri, R. Botti, P.N.), la proteína HMGI-C marcadora de tumor nuclear (A.P., P. Soldani, V.

Giansotti, P.N.) y la fosfatasa alsalina plasentaria marcadora de tumor de ovario (M. Deonarain y A.A. Epenetos) . Por lo tanto, la estrategia parece ser por lo menos tan efectiva como otras estrategias de maduración (Marks et al., 1992; Low et al., 1996) y proporciona anticuerpos con afinidades similares a aquéllos derivados de bibliotecas de anticuerpos de fagos muy grandes (Griffiths et al., 1994; Vaughan et al., 1996). Las clonas CGS-1 y CGS-2 maduradas en cuanto a afinidad fueron secuenciadas y alineadas a una base de datos de genes de anticuerpo V de línea germinal humana (V-BASE) y después se tradujeron utilizando elementos de programación MacVector. El gen VH de ambas clonas es el más homólogo a la línea germinal DP47 humana (VH3) , y además cada clona tiene una secuencia CDR3 de VH diferente (figura 1) . El gen VL de ambas clonas tiene la línea germinal DPL16 utilizada en la construcción del repertorio scFv sintético humano descrito en Nissim et al, 1994. Las secuencias CDR3 de VL difieren entre sí en cuatro de seis de los residuos aleatorizados (figura lb) .

TABLA 1 Constantes cinéticas y de disosiación de fragmentos scFv monoméricos CGS-1 y CGS-2 hacia las proteínas que contienen el dominio ED-B Antígeno : ED-B 7B89 FN 138VA ScFv: CGS-1 S128 CGS-2 CGS-1 S128 CGS-2 CGS-1 S128 CGS-2 koffís"1)* 7.0xl0"3 2.7X10"2 1.5X10-4 3.9xl0-3 3.0xl0'2 2.3xl0"4 5.0X10-3 7.1X10-2 ß.5_LTi i k^íM^s'1)* 1.3xl05 2.5X105 1.3xl05' 1. lxlO5 2.9xl0s l.lxlO5 4.1X105 1.2xl06 2.9x3 w Kd(M)* 5.4X10"8 l.lXlO"7 l.lxlO"9 3.5xl0"8 l.OxlO"7 2.1X10"9 1.2X10"8 5.9xl0"8 2&_L? Leyenda para la Tabla 1 Los experimentos se realizaron como se describe en la sección de Materiales y métodos. *Los valores koff y kon son precisos hasta +/- 30%, en base en la precisión de determinaciones de concentración y en relación a la ligera diferencia de resultados obtenidos cuando se utilizan regiones diferentes de los sensogramas para el procedimiento de ajuste. Kd = koff/kon.

Ejemplo 3 - Especificidad de afinidad de scFvs madurados para fibronectinas que contienen ED-B.

Se determinó la inmunorreactividad de las dos scFv, CGS-1 y CGS-2 maduradas en cuanto a afinidad, mediante ELISA y se compararon directamente a mAb BC-1 (el cual reconoce la isoforma B-FN) y mAb e IST-6, el cual únicamente reconoce las isoformas de FN que carecen de ED-B (Carnemolla et al., 1989; 1992) . La caracterización de estos mAb se ha reportado previamente (Carnemolla et al, 1989; 1992) . El análisis específico fino se llevó a cabo posteriormente utilizando un panel extenso de fragmentos de F? derivados por tratamiento con termolisina y de proteínas de fusión recombinantes . Los antígenos utilizados para ELISA y para inmunotransferencia se prepararon como sigue. Se purificó FN a partir de plasma humano y a partir del medio acondicionado de la línea celular WI38VA13, como se ha reportado previamente (Zardi et al, 1987) . Las FN purificadas se digirieron con termolisina (proteasa tipo X; Sigma Chemical Co.) como ha sido reportado por Carnemolla et al (1989) . Se purificaron fragmentos de FN nativos de HOkD (B-) y de FN nativo de 120 kD (B+) (véase la figura 2) a partir de un digerido de Fn como se ha reportado previamente (Borsi et al, 1991) . La isoforma grande de tenacina C se purifica como se ha reportado por Saginati et al (1992) . Las proteínas recombinantes se expresan y purifican como se describe en el Ejemplo 1. Se llevó a cabo análisis por SDS-PAGE y transferencia Western como se describe por Carnemolla et al (1989) . Todos los antígenos utilizados en ELISA se diluyeron en PBS entre 50-100 µg/ml y se recubrieron a 4°C durante la noche sobre pozos Immuno-Plate (Nunc, Roskilde, Dinamarca) . El antígeno no unido se removió con PBS y las placas se bloquearon posteriormente con PBS que contiene albúmina sérica bovina (BSA) al 3% (p/v) durante 2 h a 37 °C. Esto es seguido por cuatro lavados con PBS que contienen Tween 20 al 0.05% (PBST) . Posteriormente se permitió que los anticuerpos se unieran a 37°C durante 1.5 h; se incubaron los scFv con un antisuero dirigido contra la secuencia etiqueta: mAb M2 [Kodak, New Haven CT] para la etiqueta FLAG o 9E10 [ATCC, Rockville, MD] para la etiqueta myc. Los anticuerpos control probados fueron mAb BC-1 e IST-6. Después de cuatro lavados con PBST, las placas se incubaron durante 1 h a 37 °C con IgG de chivo contra ratón biotinada diluida 1:2000 (en PBST + BSA al 3%) (Bio-SPA División, Milán, Italia) . Los lavados se repitieron y se agregó complejo de estreptavidina-fosfatasa alcalina biotinada (Bio-SPA División, Milán, Italia) (diluido 1:800 en PBST que contiene MgCl2 2 mM) durante 1 h a 37 °C. La reacción se desarrolló utilizando tabletas de sustrato de fosfatasa (Sigma) en dietanolamina al 10%, pH 9.8 y se tomó una lectura de la densidad óptica a 405 nm. Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 2.

Tabla 2 CGS-1 CGS-2 BC-1 IST-6 FN plasmático 0.07 0.04 0.09 1.73 WI38VA FN 1.16 0.72 1.20 1.12 nllO kD (B-) 0.03 0.01 0.05 1.20 nl20 kD (B+) 0.82 0.81 1.20 0.02 rec FN7B89 1.11 1.02 1.02 0.01 rec FN789 0.01 0.01 0.05 1.25 rec ED-B 1.21 1.32 0.15 0.04 rec FN-6 0.01 0.01 0.08 0.03 Tenasciña 0.01 0.02 0.06 0.02 La inmunorreactividad de scFv y los anticuerpos monoclonales con antígenos derivados de fibronectina se midió por ELISA. Los valores representan la DO medida a 405 nm después de restar la señal de fondo. Los datos son la media de cuatro experimentos que muestran una desviación estándar máxima de 10%. La identidad de las diferentes formas de fibronectina utilizada en los experimentos es como sigue: Plasma FN = fibronectina plasmática humana; WI38-VA FN = fibronectina de sobrenadante de fibroblastos transformados con SV 40 (Zardi et al, 1987) ; nllOkD = dominio 4 de FN tratado con termolisina, sin ED-B; nl20kD = dominio 4 de F? tratada con termolisina, que contiene ED-B; rec FN7B89 = dominio ED-B flanqueado por secciones repetidas de monoguía con F? tipo III adyacentes; .rec FN789 = secsiones repetidas de homología con FN tipo III, con un dominio ED-B; rec ED-B = ED-B recombinante solo; rec FN6 = dominio 6 de FN recombinante . Tanto CGS-1 como CGS-2 reconocen al péptido ED-B recombinante, así como a todos los fragmentos, nativos o recombinantes de FN que contienen la secuencia ED-B, y al mismo tiempo no se unen a ninguno de los fragmentos de FN que carecen de ED-B. Además, CGS-1 y CGS-2 no reaccionan con tenacina, (la cual comprende quince secciones repetidas de homología tipo III: Siri et al, 1991) y FN plasmático, la cual no contiene consentraciones detectables de la secuencia ED-B en los productos de digestión por termolisina (Zardi et al, 1987) . En contraste, CGS-1 y CGS-2 reaccionan fuertemente con F? purificado de la línea de células WI38VA transformada con SV40. Aproximadamente 70-90% de las moléculas de F? de esta línea celular contienen ED-B, como se muestra por digestión con termolisina y los experimentos con nucleasa SI utilizando F? purificada y ARN total preparado a partir de la línea celular (Zardi et al, 1987; Borsi et al, 1992) . La especificidad de los scFv por el componente ED-B de FN se demuestra adicionalmente mediante la utilización de ED-B recombinante soluble para inhibir la unión de CGS-1 y/o CGS-2 a FN en células WI38VA (datos no mostrados) . Los datos confirman que CGS-1 y CGS-2 únicamente reaccionan específicamente con derivados de FN que contienen el dominio ED-B. Aún muestran la misma reactividad que mAb BC-1, excepto en el caso de ED-B recombinante, el cual no es reconocido por BC-1. La intensidad de las señales de ELISA obtenida en relación a los controles mAb reflejan la alta especificidad de los dos scFv para los antígenos que contienen ED-B. Se investigó adicionalmente la especificidad de CGS-1 y CGS-2 en inmunotransferencias utilizando FN de plasma y de células WI38VA y digeridos por termolisina de los mismos. Ante la digestión de termolina, la FN de las células WI38VA (la mayor parte de la cual contiene ED-B) genera un fragmento de 120 kd (que contiene ED-B) y un fragmento menor de 110 kD, el cual carece de ED-B (figura 2A; Zardi et al, 1987) . La digestión adicional del dominio de 120 kD genera dos fragmentos: un fragmento de 85 kD el cual contiene casi la totalidad de la secuencia de ED-B en su parte carboxi terminal, y una secuencia de 35 kD (figura 2A; Zardi et al, 1987) . En el lado izquierdo de la figura 2B está un gel teñido con Coomassie de las fracciones de proteína analizadas por inmunotransferencia. El FN plasmático (carril 1) y los digeridos de termolisina de la proteína (carril 3, que contiene la proteína de 110 kD, y el carril 4, que contiene la proteína de HOkD digerida) no son reconocidos por CGS-1 y CGS-2.. En contraste, la FN rica en ED-B de células WI38VA, tanto intacta (carril 2) como después de digestión aumentada con termolisina (carriles 5, 6 y 7) se reconoce por ambos fragmentos scFv. El fragmento más pequeño derivado de FN que puede ser reconocido específicamente por CGS-1 es la proteína de 120 kD (que abarca las secciones repetidas III 2-11 inclusive) , mientras que CGS-2 es capaz de reconocer el fragmento de 85 kD que abarca las secciones repetidas 2-7 además de la parte N terminal de ED-B (figura 2B; Zardi et al, 1987). Estos resultados indican.que los dos scFv son reactivos a epitopos distintos dentro de la secuencia ED-B. La unión de CGS-2 al dominio de 85 kD indican que el epitopo para esta clona se encuentra en la parte amino terminal de ED-B. En contraste, la pérdida de unión de CGS-1 cuando se digiere el dominio de 120 kD a 85 kD, demuestra que reconoce un epitopo localizado más hacia la parte carboxi terminal de la molécula de ED-B. La especificidad fina de CGS-1 y CGS-2 se investigó adicionalmente mediante inmunotransferencia utilizando fragmentos de FN recombinantes y proteínas de fusión con o sin la secuencia ED-B. Se prepararon proteínas de fusión de F? como se describe por Carnemolla et al (1989) . Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 3; para la asociación del diagrama esquemático a la estructura de los dominios de FN humana, véase Carnemolla et al, 1992. Los perfiles de unión obtenidos se confirman esencialmente con los encontrados previamente por ELISA e inmunotransferencias sobre FN purificada y productos de ruptura proteolítica: CGS-1 y CGS-2 son fuertemente reactivos con fragmentos de F? que contienen ED-B (carriles 2 y 4) , pero no muestran reactividad a secuencias de FN que carecen de ED-B (carriles 1 y 3) . CGS-1 no reacciona con la proteína de fusión ED-B tanto humana (carril 5) como de pollo (carril 6) , mientras que CGS-2 reaccionan fuertemente con ambos fragmentos (figura 3) . Este resultado puede reflejar ciertas restricciones conformacionales del epitopo en FN que contiene ED-B reconocido por CGS-1; es posible, por ejemplo, que el epitopo sea sensible a desnaturalización o no se presente correctamente cuando se fracciona por SDS-PAGE y se transfiere a un soporte sólido tal como nitrocelulosa. Tomados juntos, estos resultados demuestran que CGS-1 y CGS-2 se unen fuerte y específicamente a las FN que contienen ED-B, en regiones diferentes entre sí y distintas de la estructura de ED-B, la cual se reconoce por mAb BC-1.

Ejemplo 4 - Uso de scFvs contra ED-B madurados en cuanto a afinidad por tinción inmunoci toquímica de secciones de tumor humano y de ratón .

Se han utilizado tanto CGS-1 como CGS-2 para inmunolocalizar moléculas de FN que contienen ED-B en diversos tejidos humanos normales y neoplásicos. Para tejido normal, se eligió la piel, puesto que se sabe que la isoforma B-FN se expresa en macrófagos y fibroblastos durante el sanado de heridas cutáneas (Carnemolla et al, 1989; Brown et al, 1993). Los dos tumores humanos seleccionados previamente han sido analizados por su especificidad de tinción de mAb contra fibronectina: se ha estudiado el glioblastoma multiforme con detalle debido a que las células endoteliales en los vasos de este tumor están en un estado altamente proliferativo con procesos angiogenéticos aumentados que incluyen la expresión de isoformas B-FN (Castellani et al, 1994) . Además, los estudios utilizando un panel diferente del normal de tejidos de mama humana hiperplásicos y neoplásicos han proporcionado evidencia adicional de una correlación entre la angiogénesis y la expresión de B-F? (Kaczmarek et al, 1994) . Para los experimentos descritos aquí, se ha comparado la tinción inmunohistoquímica de CGS-1 y CGS-2 con la del.mAb BC-1 (la cual reconoce la isoforma B-F?) y otros mAb que se sabe reaccionan con cualquiera o la totalidad de las variantes de isoforma de FN (IST-4) o únicamente con las isoformas de FN que carecen de ED-B (IST-6) . La caracterización de la totalidad de estos anticuerpos control ha sido reportada previamente (Carnemolla et al, 1989; 1992).

Se obtuvieron tejidos normales y neoplásticos de muestras tomadas durante cirugía. Ya se ha establecido que la preparación y fijación de tejidos es crítica para una detección precisa y sensible de moléculas que contengan FN (Castellani et al, 1994) . Para inmunohistoquímica, se secaron al aire secciones de crióstato de 5 µm de grueso y se fijaron en acetona fría durante 10 minutos. La inmunotinción se realizó utilizando un equipo de tinción con complejo de estreptavidina-biotina y fosfatasa alcalina (Bio-SPA División, Milán, Italia) y naftol-AS-MX-fosfato y Fast Red TR (Sigma) . Se utilizó hematoxilina de Gill como contratinción, seguido por montaje en glicergel (Dako, Carpenteria, CA) como se ha reportado previamente por Castellani et al, 1994. Con el fin de analizar la especificidad adicional en experimentos en donde se obtiene tinción positiva de tejidos, se demostró la especificidad por ED-B mediante preincubación de anticuerpos con el dominio ED-B recombinante, seguido por detección como se ha descrito previamente . Los resultados de estos experimentos muestran en general que tanto CGS-1 como CGS-2 reacsionan con las mismas estructuras histológicas que mAb BC-1. El patrón de tinción obtenido con gel utilizando CGS-1, CGS-2 y BC-1 reflejan la ausencia de ED-B de la FN que expresa en la dermis . En los cortes de secciones de calcinoma de ducto invasivo, CGS-1, CGS-2 y BC-1 muestran una distribución restringida de tinción, confinada al borde entre las células neoplásicas y el estroma. Esto es consistente con el hecho de que aunque la FN total se distribuye homogéneamente a través del estroma del tumor, la expresión de B-FN se confina a ciertas regiones, y estas áreas son las que previamente se han localizado con éxito (en 95% de los casos) en carcinoma ductal invasivo utilizando mAb BC-1 (Kaczmarek et al, 1994) . Se han confirmado los hallazgos previos en la tinción de BC-1 del tumor multiforme de glioblastoma. Castellani et al (1994) han observado un patrón típico de tinción de estructuras vasculares similares a las glomerulares y en nuestros experimentos, se ha demostrado que el CGS-1 y CGS-2 proporcionan resultados cualitativamente idénticos. Sin embargo, existe una diferencia importante entre CGS-1 y CGS-2 y el mAb BC-1: a dos scFv humanos se ha demostrado que se unen tanto a B-FN de pollo como de ratón, mientras que BC-1 es estrictamente específico para humanos. CGS-2 reacciona con embriones de pollo (datos no mostrados) y tanto CGS-1 como CGS-2 reaccionan con tumores de ratón. La tinción por CGS-1 de estructuras vasculares y cortes de queratocarcinoma F9 de ratón también se ha demostrado. En contraste, todos los tejidos normales de ratón probados (hígado, vaso, riñon, estómago, intestino delgado, intestino grueso, ovario, útero, vejiga, páncreas, glándulas suprarrenales, músculo esquelético, corazón, pulmón, tiroide y cerebro) muestran una reacción de tinción negativa con CGS-1 y CGS-2 (datos no mostrados) . Las estructuras teñidas en los cortes de queratocarcinoma F9 se ha mostrado que son específicas para ED-B mediante la utilización de dominio recombinante del ED-B para inhibir completamente la tinción obtenida (datos no mostrados) .

Ejemplo 5 - Uso de scFvs contra ED-B, madurado por afinidad en el establecimiento como objetivo in vivo de tumores humanos .

La línea celular SKMEL-28 de melanoma humano fue utilizada para desarrollar tumores xenoinjertados en ratones atímicos de 6-10 semanas de edad (Balb-c o MF-l; Harían Reino Unido) , al inyectar 1 x 107 células/ratón subcutáneamente en un flanco. Los ratones qµue presentan tumores se inyectaron en la vena de la cola con 100 µl de solución scFv1-Cy711 mg/ml en PBS cuando los tumores alcanzaron un diámetro de aproximadamente 1 cm. El marcado de anticuerpos recombinantes con CY7 se obtiene al agregar 100 µl de bicarbonato sódico 1 M, pH = 9.3, y 200 µl de CY7-bis-OSu (Amersham; Cat. Nr. PA17000; 2 mg/ml en DMSO) a 1 ml de solución de anticuerpo en PBS (1 mg/ml) . Después de 30 minutos a temperatura ambiente, se agregan 100 µl de Tris ÍM, pH = 7.4, a la mezcla y el anticuerpo marcado se separa del colorante que no ha reaccionado utilizando columnas PD10 desechables (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA) equilibradas con PBS. Las presiones de anticuerpo verde eluidas se concentran hasta aproximadamente 1 mg/ml utilizando tubos Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA, EUA) . La proporción de marcado conseguida generalmente es cercana a una molécula de CY7: una molécula de anticuerpo. Esto se estima espectroscópicamente con cubetas de 1 cm, suponiendo que una solución de anticuerpo de 1 mg/ml proporciona una absorción de 1.4 unidades a 280 nm, y que el coeficiente de expresión molar de CY7 a 747 nm es de 200 '000 (M^cm"1) y despreciando la absorción de CY7 a 280 nm. La inmunorreactividad en las muestras de anticuerpo después del marcado se confirma ya sea por desplazamiento de banda (?eri et al., 1996b), por cromatografía de afinidad sobre una columna de antígeno o por análisis vía núcleo. Se sometió a producción de imagen a ratones con un productor de imagen para ratón construido caseramente a intervalos de tiempo regulares bajo anestesia por inhalación de una mezcla de oxígeno/fluorotano . Se estudiaron de dos a ocho animales para cada muestra, con el fin de determinar lo repetible de los resultados. Los procedimientos se realizaron de acuerdo con la licencia de proyecto de Estados Unidos "Tumor Targeting" otorgada al D. ?eri (Reino Unido PPL 80/1056) . El generador de imágenes infrarrojas de ratón se construye como una modificación del sistema de fotodetección de Folli et al. (1994), que permite el uso del fluoróforo CY7 infrarrojo. Se eligió la iluminación infrarroja con el fin de obtener una mejor penetración del tejido. La fluorescencia de CY7 (>760 nm) es invisible a los humanos y requiere el uso de una cámara CCD controlada por computadora. El generador de imagen, consiste de una caja hermética a la luz, pintada de negro, y para con una lámpara de tungsteno y halógeno de 100 W, colocada con un filtro de excitación de 50 mm de diámetro diseñada específicamente para CY7 (Chroma Corporation, Brattleboro, VT; EUA; 673-748 nm) . El haz de iluminación resultante es, con una buena aproximación, homogéneo sobre un área de un tamaño de 5 x 10 cm, en el cual el ratón se coloca para la generación de imagen. La fluorescencia se detecta en una cámara CCD Pulnix monocrómica de 8 bitios, equipada con un lente de montaje C y un filtro de emisión de 50 mm (Chroma Corporation, Brattleboro, VT, EUA; 765-855 nm) , interconectada con un sistema ImageDOK (Kintec Imaging Ltd., Liverpool, Reino Unido) . Este sistema consiste de una computadora, equipada con un captador de imagen y elementos de programación para la captura e integración de imágenes secuenciales. Típicamente, tres imágenes secuenciales adquiridas 50 ms cada una se utilizan en el proceso de promediado; este número se mantiene constante para la serie de imágenes de un animal, para permitir la preparación directa de establecimiento como objetivo de tumores en diferentes puntos en el tiempo. Las imágenes en el formato TIFF después se convierten a archivos PICT utilizando un programa convertidor de gráficos, y se elaboran utilizando el programa MacDraw Pro con una computadora Power Macintosh 7100/66. En la figura 4 se muestra un esquema del diseño de este aparato. Estos experimentos demuestran que ambos scFv localizan el tumor cuando se visualizan a nivel macroscópico. La demostración microscópica de establecimiento como objetivo de neovasculatura de tumores en desarrollo con los dos scFv contra EDB se detalla a continuación. Ratones atímicos y/o SCID que presentan melanoma humano xenoinjertado SKMEL-28 o un queratocarcinoma F9 de ratón en un flanco, se inyectan ya sea con fragmentos de scFv no marsado con la etiqueta FLAG, o fragmentos scFv biotinados. Los ratones se sacrifican en diferentes momentos en el tiempo después de la inyección, se obtienen secciones tumorales y no tumorales las cuales después se tiñen con protocolos convencionales de inmunohistoquímica, utilizando anticuerpo M2 contra FLAG (Kodak, 181) o reactivos de detección basados en estreptavidina. El establecimiento como objetivo se obtiene generalmente a las 12 horas posteriores a la inyección. Tanto CGS1 como CGS2 se demuestra que se unen a la neovasculatura tanto en el tumor humano xenoinjertado como en el queratocarcinoma de ratón.

^ ^ Ejemplo 6 - Establecimiento como objetivo de teratocarcinoma F9 de ratón xenoinjertado en ratones atímicos.

Desarrollamos tumores sólidos en el flanco de tumores 5 atímicos mediante inyección cutánea de 4 x 106 células de teratocarcinoma F9 de ratón. Este tumor crece muy rápidamente en ratones, alcanzando 1 cm de diámetro en aproximadamente una semana después de la inyección, y está altamente vascularizado. Para generar imágenes del establecimiento como objetivo de los anticuerpos, utilizamos una modificación de la metodología de fotodetección de Folli et al (1994) , lo cual permite una evaluación cinética del establecimiento como objetivo del tumor y de la depuración del anticuerpo en el mismo animal del cual se toma una imagen de diversos puntos en el tiempo, somo se dessribe con detalle antes (véase la figura 4) . Para establecer como objetivo el tumor y para facilitar la detección de los anticuerpos, se anexan scFv (CGS-1), scFv (CGS-2) y scFv (DI.3) contra lisozima (McCafferty et al., 1990) con una etiqueta de homodimerización (Pack et al., 1993) al subclonar los anticuerpos de los sitios Sfil/Notl del vector de expresión pGIN50. Este vector es un derivado de pDN268 (Neri et al., 1996b), en el cual la secuencia His6 de la etiqueta se sustituye por la secuencia: GGC LTD TLQ AFT DQL EDE KSA LQT EIA HLL KEK EKL EFI LAA H, la cual contiene un residuo cisteína en la hélice anfipática de la proteína Fos para la homodimerización covalente de los fragmentos de anticuerpo (Abate et al. 1990). No se obtiene la dimerización covalente completa: aproximadamente 30-50% de los fragmentos de anticuerpo consisten de dímeros unidos covalentemente. Los fragmentos de anticuerpo fueron purificados mediante cromatografía de afinidad en columnas obtenidas al acoplar lisozima de huevo de gallina (Di.3) o 7B89 (anticuerpos contra ED-B; Carnemolla et al., 1996) a Sepharose activada con CNBr (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA) . Los sobrenadantes se cargan en soportes de afinidad, los cuales se lavan posteriormente con PBS, con PBS + NaCl 0.5 M y se eluyen con Et3N 100 mM. Los anticuerpos se dializan posteriormente contra PBS . Los anticuerpos fueron marcados como se describe antes después se inyectan en la vena de la cola de ratones que presentan tumor con 100 µl de solución de scFv1-Cy71 1 mg/ml en PBS, cuando los tumores alcanzaron un diámetro de aproximadamente 1 cm. Como se muestra en la figura 5, scFv (CGS-1) se localiza en el tumor hasta por tres días, aunque también hay una depuración rápida dfel tumor durante este período. Sin embargo, también existe parte de tinción del fémur. El funcionamiento del establecimiento como objetivo de CGS-1 al tumor se mejora notablemente al introducir una hélice anfipática que contiene un residuo cisteína en la parte C terminal para promover la dimerización del anticuerpo (Pack et al., 1993). En realidad, la localización de scFv (CGS-2)2 dimérico no parece disminuir significativamente de 24 a 72 horas. En contraste, un control negativo (el anticuerpo dimérico scFv (DI.3) 2, anticuerpo contra lisozima) , muestra una rápida depuración y no hay una localización detectable sobre el tumor o el fémur. ScFv (28SI) muestra un débil establecimiento como objetivo de tumor a las 6 horas (no mostrado) , pero ninguno es detectable a las 24 horas o después (Figura 6) . La maduración de afinidad lleva a un establecimiento notablemente mejorado como objetivo; por lo tanto scFv (CGS-2) establece como objetivo a tumores F9 pequeños y grandes eficientemente, ya sea como monómero (figura 6) o como dímero (no mostrado) . Después de 2 días, el por ciento de dosis inyectada de anticuerpo por gramo de tumor se encuentra que es de aproximadamente 2 para el monómero scFv (CGS-2) y de 3-4 para el dímero scFv (CGS-2) . La dosis suministrada al tumor por scFv (CGS-2) también es mayor que para scFv (CGS-1) (figuras 5 y 6) , se correlaciona con sus afinidades respectivas (Tabla 1) . Sin embargo, tanto scFv (28SI) como scFv (CGS-2) parecen ser susceptibles a ruptura proteolítica y muestran una alta captación en hígado (figura 6) , mientras que los anticuerpos scFv (CGS-1) son signifisativamente más estables y muestran una captación en hígado mucho más lenta (figura 5) .

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Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT . NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 113 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) CEPA: CGS1 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT . NO: 9: Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Pro Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Arg (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 121 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) CEPA: CGS2 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT . NO: 10: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Gly Ala Phe Agr Pro Tyr Arg Lys His Glu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg 115 120 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 109 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) CEPA: CGS1 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 11; Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg lie Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr lie Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Pro Val Val Leu Asn Gly 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 100 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT . NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 109 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) CEPA: CGS2 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 12: Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg lie Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr lie Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Pro Phe Glu His Asn Leu 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes :

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la producción de un miembro de unión específico aislado de repertorios moleculares sintéticos el cual es específico para y se une directamente al dominio oncofetal de ED-B de fibronectina (FN) , el proceso está caracterizado porque comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica para tal miembro de unión específico.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el proceso comprende: a) analizar una biblioteca de péptidos o proteínas expresadas en el fago con un fragmento de fibronectina recombinante que contiene el dominio ED-B derivado de la proteína de fibronectina; b) infectar células bacterianas huéspedes con clonas positivas; c) someter las clonas de fago positivo a un proceso de maduración de afinidad; d) repetir las etapas a) y b) para seleccionar clonas de fago positivas con afinidad mejorada por antígeno; e) infectar células huéspedes con clonas positivas y purificar moléculas de anticuerpo de tales células huéspedes.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la etapa a) comprende analizar una biblioteca de fago scFv con antígeno recombinante derivado de la proteína fibronectina.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizado porque la biblioteca de fago expresa los scFv de origen humano .

5. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porgue, en la etapa a) , las clonas de fago son analizadas con antígenos recombinantes 7B8 o E^-B.

6. Un miembro de unión específico aislado de repertorios moleculares sintéticos, caracterizado porque es específico para y se une directamente al dominio oncofetal ED-B de fibronectina (FN) , producido por un proceso de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2.

7. Un miembro de unión específico, de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende un anticuerpo con dominio de unión a antígeno.

8. Un miembro de unión específico, de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el anticuerpo con dominio de unión a antígeno es de origen humano.

9. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 , caracterizado porgue se une a todos los FN que contengan ED-B después del tratamiento de la FN con la proteasa termolisina.

10. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porgue se une a todos los FN recombinantes que contengan secciones repetidas de homología tipo III las cuales incluyan al dominio ED-B.

11. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 6 a 10, cuya unión a B-FN se inhibe por el dominio ED-B.

12. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se une a B-FN de humano, ratón, rata, pollo y de cualquier otra especie en la cual se conserve el dominio ED-B.

13. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se une a B-FN sin tratamiento de la FN con N-glicanasa.

14. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque tiene una región de cadena pesada variable (VH) de la secuencia derivada de la línea germinal humana DP47 (codón 1 Glu - codón 98 Arg, inclusive, en la figura 1) y la secuencia CDR3 Ser Leu Pro Lys.

15. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 6 a 13, caracterizado porgue tiene una región de cadena pesada variable (VH) de la secuencia derivada de la línea germinal humana DP47 (codón 1 Glu - codón 98 Arg, inclusive, en la figura 1) y la secuencia CDR3 Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu.

16. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13 , caracterizado porgue tiene una región de cadena ligara variable (VL) de la secuencia derivada de la línea germinal humana DPL16 (codón 1 Ser - codón 90 Ser, inclusive, en la figura 1) y el resto de la secuencia CDR3 como Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val.

17. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13 , caracterizado porgue tiene una región de cadena ligera variable (VL) de la secuencia derivada de la línea germinal humana DPL16 (codón 1 Ser - codón 90 Ser, inclusive, en la figura 1) y el resto de la secuencia CDR3 como- Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val .

18. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13 , caracterizado porque tiene una región de cadena pesada variable (VH) de la secuencia derivada de la línea germinal humana DP47 (codón 1 Glu - codón 98 Arg, inclusive, en la figura 1) y la secuencia CDR3.

19. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porgue, cuando se mide como un monómero purificado, tiene una constante de disociación (Kd) de 6 x 10~9M o menor, para ED-B de FN.

20. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el miembro de unión comprende una molécula scFv.

21. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porgue el miembro de unión comprende una molécula scFv dimérica.

22. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porgue el miembro de unión es un fragmento de anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 14-18.

23. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un miembro de unión específico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en una cantidad efectiva, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

24. Un ácido nucleico caracterizado porque codifica para un miembro de unión específico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 22.

25. Un fago, caracterizado porgue codifica para un miembro de unión específico de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 6 a 22.

26. Una célula huésped, caracterizada porgue está transformada o transfectada con un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 24.

27. Un miembro de unión específico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 22, caracterizado porque se utiliza en terapia.

28. El uso de un miembro de unión específico, de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 6 a 22, caracterizado porgue se utiliza en la elaboración de un medicamento para la formación de imágenes o el establecimiento como objetivo de tumores .

29. Un equipo de diagnóstico caracterizado porque comprende un miembro de unión específico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 22 y uno o más reactivos que permiten la determinación de la unión del miembro a las células .