MXPA00009831A - Respuestas de celula t citotoxica especifica para vih - Google Patents

Abstract

Un método para genera una respuesta de célula T citotóxica, específica para VIH, en un hospedero que implica una administración inicial de una molécula auxiliar T haciael hospedero para cebar las células auxiliares T del sistema inmunológico del hospedero y subsecuentemente, administrar al hospedero una mezcla de la molécula auxiliar T y una molécula derivada de VIH que induce células T, a fin de generar una respuesta de célula T específica para VIH en el hospedero.

Description

RESPUESTAS DE CÉLULA T CITOTOXICA ESPECIFICA PARA VIH CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de la inmunología y, en particular, con la generación de respuestas de célula T específicas para VIH en un hospedero.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es una enfermedad que es el resultado final de la infección con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) . Actualmente, no existe vacuna efectiva que pueda proteger a la población humana contra la infección con VIH, por lo tanto, existe una urgente necesidad de una vacuna contra VIH y de un protocolo para administrar la misma. Previamente, las partículas de VIH-1 inactivadas exhaustivamente por tratamientos químicos, un vector de vaccinia que codifica para la proteína de envolvente completa (gplßO) de VIH-1 y gpl20 recombinante purificado, se han evaluado como vacunas candidatos contra VIH. Aunque las preparaciones de virus de VIH-1 inactivos produjeron una reacción de Hipersensibilidad Tipo Retardado (DTH) mediada por células T, en humanos, y los candidatos de la vacuna recombinante gpl20 y gplßO/vaccinia indujeron anticuerpos neutralizantes del virus, ninguno de estos inmunógenos ha mostrado ser una vacuna eficaz contra VIH en humanos . El interés de los inventores en el área de las vacunas contra VIH es desarrollar vacunas de péptidos sintéticos VIH-1 y considerar que su uso, solo o junto con otras vacunas candidato contra VIH-1, puede conducir a la producción de respuestas inmunológicas más eficaces contra VIH-1. Los inventores ya han descrito previamente en sus patentes otorgadas de los Estados Unidos Nos. 5,817,318 (Patente Europea No. 470,980) y 5,639,854, cuyas exposiciones se incorporan aquí como referencia, entre otros, la identificación y caracterización de un epítope de célula T de la proteína de núcleo, p24E, del VIH-1, así como su uso en la construcción de péptidos quiméricos sintéticos e inmunogénicos que comprenden p24E ligada a las secuencias de aminoácido de diferentes epítopes de célula B de una proteína de núcleo o envolvente de VIH-1. Este esfuerzo se ha virado hacia el diseño de vacunas contra VIH capaces de producir inmunidad mediada por células (CMI) y protocolos para el uso de las mismas. En este contexto, los inventores han enfocado su interés en la proteína viral, Rev, expresada tempranamente durante el ciclo de vida del virus VIH debido a que la mitad del carboxilo terminal es rica en motivos de célula T citotóxica humana (CTL) . Los péptidos que se han generado por inmunización con una vacuna construida adecuadamente que contiene a la proteína Rev, pueden presentarse, por lo tanto, en el contexto de las moléculas clase 1 del Complejo de Histocompatibilidad Principal (MHC - Major Histocompatibility Complex) para inducir respuestas de efector CTL capaces de exterminar a las células infectadas con virus de manera temprana para limitar la propagación de los virus. Sin embargo, el protocolo de inmunización que se proporciona aquí se aplica a los péptidos que contienen epítope de célula T derivado de otras proteínas de VIH.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con otro aspecto de esta invención, se proporciona un método para generar una respuesta de célula T citotóxica específica para VIH (CTL) en un hospedero, que comprende : administrar al hospedero una molécula auxiliar T para cebar las células auxiliares T del sistema inmunológico del hospedero, y subsecuentemente administrar al hospedero una mezcla de la molécula auxiliar T y una molécula derivada de VIH que induce a la célula T, a fin de generar una respuesta de célula T específica para VIH, en el hospedero. En consecuencia, el sistema inmunológico del hospedero, que puede ser un hospedero humano, se ceba mediante cualquier molécula auxiliar T conveniente y después se administra subsecuentemente la molécula auxiliar T mezclada con una molécula inductora de célula T. En esta forma, se obtiene una respuesta de célula T específica para VIH. La molécula auxiliar T puede ser cualquiera de los materiales bien conocidos que proporcionan esta actividad auxiliar MHC clase II en el sistema inmunológico, incluyendo los epítopes de célula T específicos para DP, DR, DQ, humanos, de célula T. Los materiales utilizados como moléculas auxiliares T en la experimentación que aquí se describe son un péptido que corresponde a una porción del antígeno de nucleocapside del virus de hepatitis B, identificado como CLP-243 (SEQ ID NO: 10) . La molécula auxiliar T puede administrarse con un adyuvante, si se desea. La molécula derivada de VIH inductora de la célula T en general incluye un péptido que corresponde a una porción de un antígeno de VIH-1 y que contiene por lo menos un epítope de célula T. En particular, los péptidos pueden corresponder a secuencias de la proteína Rev de VIH- 1, particularmente aminoácidos correspondientes 52 a 116 (SEQ ID NO:9) (Cuadro 2) de Rev (CLP-164) de VIH-1 (LAI) . La secuencia de aminoácidos de la proteína Rev es la de los aislados LAI . La invención incluye el uso de las correspondientes secuencias de péptido a partir de las proteínas Rev de otros aislados de VIH-1, incluyendo a los aislados primarios. En la experimentación que aquí se describe, el péptido resultó eficaz en el protocolo aquí descrito al proporcionarse en forma de un polipéptido, particularmente cuando el lípido es palmitoilo o colesterol. Dos lipopéptidos particulares aquí utilizados son CLP-175 y CLP- 176, donde los derivados de palmitoilo y colesterol, respectivamente, son de CLP-164. Las mezclas de la molécula auxiliar T y de la molécula derivada de VIH que induce a la célula T pueden administrarse con un adyuvante adecuado. La presente invención proporciona ¡además, en otro aspecto, algunos péptidos novedosos derivados de la proteína Rev de VIH-1. En consecuencia, en este aspecto de la invención, se proporciona un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 52 a 116 (SEQ ID NO: 9) de la secuencia de la proteína Rev de VIH y que contiene a los epítopes de célula T dentro de los aminoácidos 65 a 75 (SEQ ID NO:3), 78 a 87 (SEQ ID N0:5) y 102 a 110 (SEQ ID N0:8) (Cuadro 1) . Este péptido puede proporcionarse en forma de un lipopéptido que incluye CLP-175 o CLP-176. Las secuencias de aminoácido específicas del péptido que tiene la SEQ ID NO: 9, es la del aislado LAI de VIH-1. Dentro del alcance de la invención se encuentra el péptido correspondiente y las secuencias correspondientes de epítope de célula T de la proteína Rev de otros aislados de VIH-1, entre los que se incluyen a los aislados primarios. Las ventajas de la presente invención incluyen: - un procedimiento de inmunización para inducir la respuesta de célula T en un hospedero - péptidos inmunogénicos para utilizarse en este procedimiento .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra los resultados de los experimentos de estabilización in vitro de HLA-A2 conducidos utilizando ciertos péptidos derivados de Rev mediante FACS (clasificación celular de anticuerpos fluorescentes). El péptido CLP-72 (SEQ ID NO:8), CLP-182 (SEQ ID N0:7), CLP-178 (SEQ ID NO : 3 ) y CLP-177 (SEQ ID NO: 2) se encuentran unidos a HLA-A2 sobre la célula T2 , y se muestran por el desplazamiento de los picos fluorescentes respectivos. La Figura 2, que comprende los pianeles A a F, ilustra la imunogenicidad de los inmunógenos Rev de VIH-1 (LAI) en ratones transgénicos A2Kb utilizando CLP-175, 176 y 164 (SEQ ID N0:9), con o sin cebado con CLP-243 (SEQ ID NO: 10) . La Figura 3, que comprende los paneles A a X, ilustra la inducción CTL específica para Rev de VIH-1 (LAI) en ratones transgénicos A2Kb que emplean diversos protocolos como se describe abajo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores han encontrado que dos péptidos nanoméricos, designados CLP-177 (SEQ ID NO: 2) y CLP-72 (SEQ ID NO:8), un hexámero designado CLP-178 (SEQ ID NO:3) y un 12-mer designado CLP- 182 (SEQ ID NO: 7) de la proteína Rev de VIH-1 (LAI) (la secuencia de aminoácidos de los péptidos respectivos se encuentra en el Cuadro 1) , pudieron individualmente unirse a las moléculas clase 1 del Complejo de Histocompatibilidad Principal Humano (HLA) unido a la membrana, HLA-A2, y estabilizarlo, este complejo es el subtipo clase 1 de HLA predominante que se encuentra en la raza caucásea. Los inventores también encontraron que un péptido largo (SEQ ID NO:9), que abarca los residuos de aminoácido 52 a 116 de la proteína Rev de VIH-1 (LAI) y se construyeron con una sola entidad colesterol o palmitoilo unida a su amino- (N-) terminal mediante un enlazante KSS, para formar lipopéptidos, CLP- 176 y CLP- 175 respectivamente, también es capaz producir CTL así como P115 respuestas de anticuerpo en ratones transgénicos HLA-A2. Con base en los experimentos que se proporcionan aquí, se proporciona un protocolo de inmunización novedoso para inducir respuesta de célula T citotóxica específica para VIH en un hospedero, mediante la administración inicial de una molécula auxiliar T para cebar el sistema inmunológico del hospedero, seguido por la administración de una mezcla de la molécula auxiliar T y un péptido que contiene al epítope de célula T que corresponde a una porción de un antígeno de VIH. La invención se ilustra aquí utilizando, como molécula auxiliar T, un péptido que corresponde una porción del antígeno de nucleocapside del virus de hepatitis B. Sin embargo, pueden emplearse otras moléculas auxiliares T, por ejemplo aquellas que proporcionan la actividad auxiliar clase II MHC en el sistema inmunológico. La invención se ilustra aquí utilizando, como el péptido que contiene al epítope de célula T de VIH, algunos lipopéptidos derivados de la proteína Rev. Sin embargo, el epítope de célula T de VIH que contiene a los péptidos derivados de cualesquiera otras proteínas de VIH, podrán emplearse . Un modelo se ha utilizado recientemente para predecir los determinantes antigénicos CTL humanos con base en la secuencia primaria (ver referencias 1 a 3, en esta P115 descripción se harán varias referencias para describir más completamente el estado de la técnica al que pertenece la invención. La información bibliográfica completa de cada cita se encuentra al final de la especificación, inmediatamente antes de las reivindicaciones. Las exposiciones de estas referencias se incorporan aquí en su totalidad como referencia) . Se ha propuesto que los epítopes CTL que están más favorecidos para unirse y alojarse dentro de la ranura de la unión del péptido de la molécula clase 1 de MHC humano, por ejemplo HLA-A2 , normalmente tiene 9 aminoácidos. Sin embargo, los péptidos que contienen 8 a 13 aminoácidos capaces de interactuar con las moléculas HLA clase 1 también se han reportado. En la mayoría de los casos, estos péptidos contienen una leucina (L) o metionina (M) en la posición 2, y bien una L o una valina (V) en sus extremos carboxi terminal. La ubicación de los motivos que contienen CTL potencial de la proteína Rev de VIH-1 (LAI) se ha predicho por los algoritmos de motivo de unión a péptido, reportados. El Cuadro 1 muestra las secuencias de aminoácidos de esos péptidos predichos (SEQ ID NOS: 1 A 8) . La habilidad de los péptidos que contienen estos motivos, para unirse y estabilizar a la molécula HLA-A2 unida a la membrana, fue valorada utilizando la línea celular T2. La línea celular se encuentra bien documentada con respecto a P1154 su función defectuosa de transportador de TAP, que origina que la mayoría de los péptidos generados intracelularmente sean incapaces de transportarse hacia el retículo endoplásmico para asociarse con las moléculas clase 1 HLA recientemente sintetizadas, es decir HLA-A2 (ver referencias 4, 5) . La mayoría de las moléculas HLA-A2 desplegadas en la superficie de las células T2 están, por lo tanto, vacías (es decir no contienen péptidos) y son inestables. Durante la interacción con los péptidos adecuados introducidos exógenamente, la estabilidad de las moléculas HLA-A2 puede restablecerse. Los resultados de los experimentos de estabilización de HLA-A2 in vi tro que se llevaron a cabo demostraron que dos nanómeros, a saber CLP-177 (SEQ ID N0:2) y CLP-72 (SEQ ID N0:8); y un 11-mer y un 12-mer representados por los péptidos, a saber CLP- 178 (SEQ ID N0:3) y CLP-182 (SEQ ID NO:4), respectivamente; fueron capaces de unirse a HLA-A2 en las células T2. Este resultado se muestra en el desplazamiento de los picos fluorescentes respectivos hacia la derecha, debido a una mayor densidad de las moléculas clase 1 desplegada sobre las células, como se muestra en la Figura 1 acompañante. La comparación de los índices de fluorescencia respectivos reveló que la potencia de los péptidos es en el siguiente orden: CLP-177 > CLP-72 > CLP-178 > C P-182.

Las construcciones de los péptidos Rev lipidados que fueron probados se muestran en el Cuadro 2. Los resultados ilustrados en la Figura 2 muestran péptidos lipidados de Rev 52 a 116 (SEQ ID N0:9), CLP-175 y CLP-176; así como sus contrapartes no lipidadas, CLP-164, que fueron inmunogénicas, como lo determina el título IgG, al inyectarse tres veces a una dosis de 100.0 µg dentro de ratones transgénicos A2Kb (ref. 6) . Altos títulos de anticuerpos IgG dirigidos contra el péptido de Rev 52 a 116 (CLP- 164) se detectaron en los animales que recibieron CLP- 175 formulado con Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) o CLP-176 o CLP-164 (Paneles A, B y C) . Los ratones en prueba bajo diferentes entornos experimentales, al cebarlos con una dosis de CLP-243 en IFA, seguida por un doble refuerzo con una mezcla de CLP-243 + CLP- 175 formulados con IFA, o CLP-243 + CLP-176 o CLP-243 + CLP-164, formulados con IFA, produjeron similarmente altas respuestas de anticuerpo anti-CLP-164 (Paneles D a F) . CLP-243 es un péptido I -Ab -restringido que abarca los residuos de aminoácidos 128 a 140 (TPPAYRPPNAPIL; SEQ ID NO: 10) del antígeno de nucleocapside del virus de hepatitis B (ref. 6) . Los resultados de los experimentos de inmunogenicidad demostraron que los lipopéptidos, CLP-176 y CLP-175, fueron inductores de CTL, como se muestra en la Figura 3. Los ratones transgénicos A2Kb cebados por vía subcutánea con una dosis de péptido I-Ab-restringido, CLP-243 en IFA, y con dosis de refuerzo P1154 doble utilizando la misma vía de inmunización con una mezcla de dosis de cebado de CLP-243 y 100.0 µg de cualquiera de los siguientes: CLP-176 o CLP-175, en IFA, generaron células efectoras que exterminaron a las células blanco Jurkat-A2Kb pulsadas con nanómero, CLP-177 (Paneles A, B, E, F) . La actividad citotóxica de los efectores fue específica debido a que las células Jurkat A2Kb no cargadas con CLP-177 no fueron exterminadas (Paneles C, D, G y H) . En contraste, los animales transgénicos A2Kb inyectados similarmente una vez con el inoculo CLP-243/IFA, y después dos veces con CLP-243 más CLP-164 en IFA, no produjeron una respuesta efectora específica para CLP-177, significativa (Paneles I, J, K, L) . Los resultados de los experimentos de inmunización demostraron que el cebado con el péptido I-Ab-restringido, CLP-243, seguido por el refuerzo con una mezcla de CLP-243 y CLP-176 o CLP 175, fue más eficaz que la inmunización con el lipopéptido respectivo solo, para la inducción de la respuesta CTL, como se muestra en la Figura 3. Se encontró que los esplenocitos de ratones transgénicos A2Kb inyectados 3 veces en vía subcutánea con una dosis de 100.0 µg de CLP-176, o CLP-175, o CLP-164 (Rev 52-116 no lipidada) en IFA y cuando se re-estimularon con células Jurkat A2Kb pulsadas con CLP- 177 y CLP-175 añadido exógenamente a una concentración de 15.0 µg por ml , no dieron origen a la generación de efectores capaces de exterminar a las células Jurkat pulsadas con el péptido CLP-177 (Paneles M a X) .

Los resultados de los experimentos de re-estimulación in vi tro mostraron que la re-estimulación simultánea de las células auxiliares T I-Ab-restringidas específicas para CLP-243 se lograron mediante la adición del péptido CLP-243 y los efectores específicos para CLP-177 se lograron co-cultivándolas con las células Jurkat A2Kb pulsadas con CLP-177, requiriéndose aumentar el enriquecimiento de los efectores específicos para CLP- 177 y permitir su detección en el ensayo de CTL in vi tro . Los componentes se administran en una forma compatible con la formulación de dosis y en una cantidad que será terapéuticamente efectiva, inmunogénica y protectora en el protocolo de inmunización. La cantidad de material a administrarse depende del sujeto que se va a tratar, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunológico del individuo para la síntesis de anticuerpos y para producir una respuesta inmunológica mediada por células. Las cantidades precisas de los ingredientes activos requeridos que tienen que administrarse dependen del juicio del médico. Sin embargo, los intervalos de dosis adecuados pueden determinarse fácilmente por un experto en este campo y pueden ser del orden de microgramos a miligramos del material. La dosis también puede depender de la vía de administración y variará de acuerdo a la talla deJ hospedero. La inmunogenicidad puede mejorarse significativamente si los antígenos se co-administran con adyuvantes. Los adyuvantes refuerzan la inmunogenicidad de un antígeno, pero P1154 no necesariamente son por sí mismos inmunogénicos. Los adyuvantes pueden actuar reteniendo al antígeno localmente cerca del sitio de administración para producir un efecto depósito que facilite una liberación sostenida y lenta del antígeno hacia las células del sistema inmunológico. Los adyuvantes también pueden atraer células del sistema inmunológico hacia un depósito de antígeno y estimular estas células para producir una respuesta inmunitaria. Los agentes inmunoestimuladores o adyuvantes se han utilizado por muchos años para mejorar las respuestas inmunitarias del hospedero hacia, por ejemplo, las vacunas. Los adyuvantes intrínsecos, por ejemplo lipopolisacáridos, normalmente son los componentes de las bacterias atenuadas o muertas utilizadas como vacunas. Los adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que típicamente se unen en forma no covalente a los antígenos y se formulan para mejorar las respuestas inmunitarias de los hospederos. Por lo tanto, se han identificado adyuvantes que mejoran la respuesta inmunitaria ante antígenos administrados por vía parenteral. Algunos de estos adyuvantes son tóxicos, sin embargo, y pueden provocar efectos colaterales indeseables haciéndolos inadecuados para su uso en vacunas humanas y veterinarias. La eficacia del alumbre en toxoides está bien establecida y una vacuna HbsAg ha contenido alumbre como adyuvante.

Una amplia gama de adyuvantes extrínsecos puede provocar respuestas inmunológicas potentes ante los antígenos. Entre estos, se incluyen fosfato de alúmina, hidróxido de aluminio, QS21, Quil A, derivados y componentes de los mismos, fosfato de calcio, hidróxido de calcio, hidróxido de zinc, un análogo de glucolípido, un éster de octodecilo de un aminoácido, un muramil dipéptido, polifosfazeno, una lipoproteína, una matriz ISCOM, DC-Chol, DDBA y otros adyuvantes y toxinas bacterianas, componentes y derivados de las mismas. La combinación particularmente ventajosa se describe en la Solicitud copendiente de los Estados Unidos No. 08/258,228, presentada el 13 de junio de 1994 y la 08/483,856 presentada el 7 de junio de 1995, cedida a la cesionaria de la presente y cuya exposición se incorpora aquí como referencia (WO 95/34308) . Bajo circunstancias particulares, los adyuvantes que inducen la respuesta Thl son los deseables. La invención se ilustrará además de conformidad con los siguientes Ejemplos. La exposición anterior, en general describe a la presente invención. Para una comprensión más completa de la misma se hará referencia a los siguientes Ejemplos específicos. Estos Ejemplos se describen únicamente con el fin de ilustrar la invención y no pretenden limitarla de ninguna manera. Se contemplan cambios en la forma y la P1154 substitución de equivalentes de acuerdo con las circunstancias. Aunque sean utilizados términos específicos en la presente, esos términos pretenden ser descriptivos y de ninguna manera tienen fines limitativos.

EJEMPLOS Los métodos de la síntesis de péptidos y polipéptidos, los cultivos celulares, los inmunoensayos con enzimas (EIA) , los ensayos CTL y otros procedimientos de prueba no se describirán explícitamente en este documento pero se encuentran ampliamente reportados en la literatura científica y quedan dentro del alcance de aquellos con pericia en este campo.

Ejemplo 1; Este Ejemplo ilustra la síntesis de péptidos y lipopéptidos . Se llevaron a cabo síntesis de péptido en fase sólida sobre un sintetizador de péptidos automático ABl 430A de acuerdo a los protocolos estándares del fabricante.

Las secuencias de aminoácidos de los péptidos sintetizados se muestran en el siguiente Cuadro 1. Los residuos de lisina designados para lipidación subsecuente se incorporaron en los péptidos utilizando Na-t-butiloxicarbonil-Ne-fluorenilmetoxicarbonil-lisina (Boc-Lys (Fmoc) -OH) . Las entidades de lípido se incorporaron por remoción manual del grupo protector Fmoc de cadena lateral, seguido por la acilación con el ácido carboxílico apropiado, activado con hexafluorofosfato de 0-benzotriazol-l-il-N,N,N' ,N' -tetrametiluronio (HBTU) y diisopropiletilamina en dimetilformamida (DMF) . Los lipopéptidos se escindieron del soporte sólido por tratamiento con ácido fluorhídrico líquido en presencia de tiocresol, anisol, y sulfuro de metilo. Los productos crudos se extrajeron con ácido trifluoroacético (TFA) y se precipitaron con dietil éter. Los lipopéptidos y los péptidos no lipidados se muestran en el Cuadro 2.

Ejemplo 2; Este Ejemplo ilustra el método utilizado para demostrar la unión de HLA-A2 y la modulación de los péptidos . La línea celular T2 que expresa las moléculas HLA-A2 se obtuvo a partir del Dr. Peter Creswell de Howard Hughes Research Institute de la Universidad de Yale . Las células se propagaron en medio completo de Iscove (medio de Iscove suplementado con suero bovino de inactivación térmica al 10%, 120.0 unidades por ml de penicilina sódica G, 120 µg por ml de sulfato de estreptomicina y 0.35 mg por ml de L-glutamina) . La habilidad de los péptidos P1154 individuales 8 a 13 mer, preparados como se describe en el Ejemplo 1 e identificados en el Cuadro 1, para unirse y modular la estabilidad de las moléculas A2 sobre las células T2 se determinó utilizando un ensayo de ensamble de MHC clase 1 inducido por péptido, que se modificó del protocolo descrito por Yuping Deng et al. (ref. 6) . En esencia, se incubaron 1 x 105 células T2 con una concentración específica del péptido de prueba en 250.0 µl del medio libre de suero Iscove (medio Iscove suplementado con 120.0 unidades por ml de penicilina sódica G, 120.0 µg por ml de sulfato de estreptomicina y 0.35 mg por ml de L-glutamina) en un tubo Eppendorf estéril a 37°C por toda la noche. Después las células se incubaron sobre hielo por 30 min, antes de que se añadiera 1.0 ml de medio completo de Iscove suplementado con 5.0 µg por ml de Brefeldin A, se añadieron 12.5 µg por ml de' anisomicina y 5.0 µg por ml de ciclohexamida. Después, las muestras se incubaron por 3.0 horas en un incubador con C02 a 37°C. En la presencia de los fármacos, se inhibe la síntesis adicional de proteínas y la administración intracelular de moléculas HLA-A2 hacia la superficie celular y se presenta la desestabilización de la conformación de las moléculas clase 1 unidas a la membrana en la temperatura fisiológica. Las células después se lavaron dos veces con PBA P1154 enfriado en hielo (un regulador que contiene cloruro de sodio al 0.9%, albúmina de suero bovino al 0.5% y azida de sodio al 0.02%). Posteriormente, se añadieron 100.0 µl de PBA que contenía 5.0 µg de un anticuerpo monoclonal de ratón específico para HLA-A2 , sensible a la conformación, BB7.2 (ref. 7), a cada muestra de prueba. La reacción se llevó a cabo sobre hielo por 45 min. Las células se lavaron entonces tres veces con PBA enfriado en hielo. La unión de BB7.2 después se detectó añadiendo 100.0 de PBA que contiene 1.0 µg de conjugado de fluoresceína e IgG F(ab') anti-ratón de cabra (FITC) a cada muestra celular. Después de 30 min de incubación en hielo, las células se lavaron dos veces con PBA y otras dos veces con PBS, pH 7.2. Las células se fijaron inmediatamente después del lavado añadiendo 100.0 µl de 1.0% paraformaldehído al granulado celular. Las células después se resuspendieron suavemente y se analizaron por FACS normalmente en un término de tres días después de que se completaron los experimentos. El índice de fluorescencia, que es un indicador del aumento de la densidad de las moléculas A2 unidas a la membrana, se calculó dividiendo la fluorescencia media de una muestra experimental (células T2 tratadas con péptido) mediante la fluorescencia media de la muestra control (células T2 no tratadas con péptido) . Los resultados P115 obtenidos se establecen en la Figura 1.

Ejemplo 3; Este Ejemplo describe el protocolo de inmunización y de refuerzo utilizado para probar la inmunogenicidad de los péptidos y los lipopéptidos. Los ratones con un fondo BIO que fueron transgénicos para el gen quimérico A2Kb se adquirieron y se obtuvo licencia de la Clínica Scripps en California, USA. La colonia se mantuvo en las Instalaciones de Servicio Animal en Pasteur Merieux Connaught Canadá. Un primer grupo de ratones se inyectó por vía subcutánea en la base de la cola con una dosis de 100.0 µg de péptido formulado con IFA o lipopéptido emulsificado en IFA y después se dio dosis de refuerzo a los 30 días y de nuevo a los 42 a 48 días posteriores, con el mismo inoculo. Un segundo grupo de ratones se inyectó por vía subcutánea en la base de la cola con una dosis de 100.0 µg de un CLP-243 formulado con IFA y después se les aplicó dosis de refuerzo con una mezcla formulada con IFA de la misma dosis del inmunógeno de cebado y 100.0 µg de CLP-175 o CLP-176 o CLP-164. Los sueros de los animales experimentales recolectados en los días 10 u 11 posteriores a la inyección final se analizaron para determinar anticuerpos IgG P1154 específicos para CLP-164 utilizando un EIA estándar. los resultados obtenidos se muestran en la Figura 2. Los esplenocitos de los ratones experimentales se cultivaron de manera simultánea par enriquecerlos para los CTLs antes de la valoración de la actividad efectora, como se describe a continuación.

Ejemplo 4; Este Ejemplo ilustra un método de cultivo in vi tro que se utiliza para enriquecer los efectores CTL y la valoración CTL. Los esplenocitos de los ratones transgénicos A2Kb experimentales del Ejemplo 3 a 3.0 x 107 se cultivaron con 1.3 x 107 células Jurkat transfectadas con A2Kb, pulsadas con los péptidos CLP 175 o CLP 176 en 15..0 ml de medio completo (RPMI 1640 suplementado con 10.0% de suero bovino inactivado térmicamente a 56°C, 120.0 unidades por ml de penicilina sódica G, 120.0 µg por ml de sulfato de estreptomicina y 0.35 mg por ml de L-glutamina) por 25 cm2 en un matraz de cultivo de tejido. El péptido I-Ab-restringido, CLP-243, se añadió también a una concentración de 15.0 µg por ml al inicio del cultivo. Los cultivos se mantuvieron a 37°C en un incubador con C02 durante 7 días y los respondedores después se probaron contra transfectante A2Kb Jurkat pulsado con péptido en un ensayo estándar CTL P1154 in vi tro por 4 horas, en la siguiente forma. Los respondedores se recolectaron de los cultivos de 7 días y se lavaron dos veces con el medio completo. El blanco positivo se creó incubando 1 x 106 células Jurkat A2Kb con 100.0 µg del péptido especificado, durante toda la noche en un incubador con C02 a 37°C. Las células blanco después se etiquetaron con 51Cr a 250.0 uCi por 1 x 106 células durante 1.5 horas en presencia de 25.0 µg de los mismo péptidos de prueba. Después de lavar dos veces con medio completo para remover el exceso de 51Cr, los blancos se incubaron a 2.5 x 103 con diferentes números de respondedores por 4 horas en un incubador con C02 a 37°C. La mitad del sobrenadante se retiró después y se contó la radioactividad. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 3.

SUMARIO DE LA EXPOSICIÓN Como resumen de la exposición, esta invención proporciona un protocolo novedoso para lograr una respuesta CTL específica para VIH en un hospedero, incluyendo un hospedero humano, mediante un proceso de inoculación/refuerzo utilizando moléculas auxiliares T y péptidos lipidados de la proteína VIH, asi como péptidos novedosos y lipopéptidos novedoso. Son posibles modificaciones dentro del alcance de la invención.

P1154 CUADRO 1 Motivos CTL restringidos en HLA-A2 de la proteína Rev de VIH-1 (LAI) PÉPTIDO SECUENCIA AMINOÁCIDOS SEQ ID NO: 1. CLP-279 DLIKAVRL 11-18 1 2. CLP-177 YLGRSAEPV 65-73 2 3. CLP-178 YLGRSAEPVPL 65-75 3 4. CLP-179 QLPPLERL 78-85 4 . CLP-180 QLPPLERLIL 78-87 5 6. CLP-181 PLQLPPLERL 76-85 6 7. CLP-182 PLQLPPLERLIL 76-87 7 8. CLP-72 ILVESPAVL 102-110 8 CUADRO 2 Lipopéptidos/péptidos Rev 52-116 de VIH-1 (LAI) probados Lipopéptido/ Construcción péptido CLP- 175 K[Palmitoil]SS-RQIHSISERILSTYLGRSAEPVPLQLPPLERLTL- -DCNEDCGTSGTQGVGSPQILVESPAVLESGTKE CLP- 176 K [colesterol] SS-RQIHSISERILSTYLGRSAEPVPLQLPPLERLTL- -DCNEDCGTSGTQGVGSPQILVESPAV ESGTKE CLP- 164 RQIHSISERI STY GRSAEPVP Q PP ERLT - -DCNEDCGTSGTQGVGSPQILVESPAVLESGTKE (SEQ ID NO: 9) P1154 REFERENCIAS Ian A Wilson and David H Fremont. Seminars in Immunology, Vol 5, pp 75-80, 1993. Kirsten Falk and Olaf Rotzschke. Seminars in Immunology, Vol 5, pp 81-94, 1993. Víctor H Engelhard. Current Opinión in Immunology, Vol 6, pp 13-23, 1994. Salter R D and Creswell P. EMBO J. , Vol 5, pp943, 1986. Townsend A. et al. Nature, Vol 340, pp 443, 1989. Yuping Deng et al. Journal of Immunology, Vol 158, pp 1507-1515, 1997.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES ; 1. El uso de una molécula derivada de VIH que induce células T, en la manufactura de un medicamento que se utiliza para generar una respuesta de célula T citotóxica (CTL) específica para VIH, en un hospedero, mediante : administrar al hospedero una molécula auxiliar T para cebar las células auxiliares T del sistema inmunológico del hospedero, y subsecuentemente administrar al hospedero una mezcla de la molécula auxiliar T y una molécula derivada de VIH que induce la célula T para generar una respuesta de célula T específica para VIH, en el hospedero.
2. 2. El uso de la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula auxiliar T se selecciona de los epítopes auxiliares T restringidos en HLA clase II.
3. 3. El uso de la reivindicación 2, caracterizado porque los epítopes auxiliares T se seleccionan del grupo que consiste de epítopes de célula T específicos para DP, DR y DQ.
4. 4. El uso de la reivindicación 2, caracterizado porque la molécula auxiliar T es CLP-243 (SEQ ID NO: 10) .
5. 5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la molécula auxiliar T se administra con un adyuvante. P1154
6. 6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la molécula derivada de VIH que induce la célula T incluye un péptido que corresponde a una porción de un antígeno de VIH-1 y que contiene por lo menos un epítope de célula T„
7. 7. El uso de la reivindicación 6, caracterizado porque el péptido corresponde a las secuencias de la proteína Rev de VIH-1.
8. 8. El uso de la reivindicación 6, caracterizado porque el péptido es un lipopéptido.
9. 9. El uso de la reivindicación 8, caracterizado porque el lípido es palmitoilo o colesterol.
10. 10. El uso de la reivindicación 6, caracterizado porque el lipopéptido es CLP-175 o CLP-176.
11. 11. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque la mezcla se administra con un adyuvante.
12. 12. Un péptido que tiene un aminoácido que corresponde a los aminoácidos 52 a 116 (SEQ ID No: 9) de la secuencia de la proteína Rev del aislado LAI de VIH-1 y que contiene los epítopes de célula T dentro de los aminoácidos 65 a 75 (SEQ ID NO : 3 ) , 78 a 87 (SEQ ID NO:5)y 102 a 110 (SEQ ID N0:8), o que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente de otro aislado de VIH-1.
13. 13. El péptido según la reivindicación 12, en P115 forma de un lipopéptido.
14. 14. El péptido según la reivindicación 13, caracterizado porque el lípido es palmitoilo o colesterol.
15. 15. El péptido según la reivindicación 13, caracterizado porque el lipopéptido es CLP-175 o CLP-176.
16. 16. El péptido según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, que se utiliza como un medicamento para generar una respuesta citotóxica (CTL) específica para VIH, en un hospedero.
17. 17. El uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en la fabricación de un medicamento que se utiliza para generar una respuesta citotóxica (CTL) específica para VIH, en un hospedero. P1154