MXPA00001638A - Procedimiento para la preparacion por fermentacion de l-aminoacidos utilizando bacterias corineformes - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos utilizando bacterias corineformes, en las cuales se refuerza el gen de dihidrogenasa de glutamato.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN POR FERMENTACIÓN DE L-AMINOACIDOS UTILIZANDO BACTERIAS CORINEFORMES Campo de la Invención El objeto de la invención es un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos utilizando bacterias corineformes, en las cuales se refuerza el gen de hidrogenasa de glutamato. Antecedentes de la Invención Los L-aminoácidos se utilizan en la alimentación animal en la medicina humana y en la industria farmacéutica. Los L-aminoácidos se utilizan por fermentación con cepas que produzcan L-aminoácidos de bacterias corineformes en especial con Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia de ese grupo de productos se trabaja continuamente a la mejora de esos procedimientos de preparación. Las mejoras del procedimiento pueden consistir en medidas técnicas de fermentación como por ejemplo agitación y alimentación de oxígeno, o la composición de los medios nutritivos como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o la post-elaboración a la forma de un producto, por medio de cromatografía de intercambio de iones o por medio de propiedades intrínsecas propias de los microorganismos . Para mejorar las propiedades de rendimiento de esos microorganismos se utilizan métodos como mutagenesis, REF.: 32803 selección y selección de mutantes . De esta manera se obtienen cepas que son resistentes contra los antimetabolitos como por ejemplo el análogo de lisina S- (2-aminoetil) -cistenina) o auxótropas para los aminoácidos regulatoriamente importantes y que producen L-aminoácidos. Desde hace algunos años se han utilizado métodos de técnica de recombinación de ADN para el mejoramiento de cepas, de cepas que producen L-aminoácidos de Corynebacterium glutamicun, en la cual genes de biosíntesis individuales se amplifican y se estudia su efecto sobre la producción de los L-aminoácidos. Un articulo sobre esto se encuentra entre otros el de Konoshita ("Glutamicum Acid Bacteria" en Biology of Industrial Microorganisms, Demain y Solomon (Eds.), Benjamín Cummings, Londres, UK, 1985, 115-142) , Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Jetten y Sunskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-.103 (1995)) y Sahm et al., (Annuals of the New York Academy of Science 782, 23-39 (1996)) . La enzima deshidrogenasa de glutamato cataliza la aminación reductiva de ácido a.-cetoglutaríco a ácido qlutámico En ^a publicación francesa 2675492 se describe un fragmento de ADN de Corynebacterium melassecola 801 que porta un gen de deshidrogenasa de glutamato. Probablemente se utiliza allí para aumentar la producción de ácido glutamínico en la fermentación de Corynebacterium melassecola. La secuencia nucleótida del gen de < deshidrogenasa de glutamato de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 fue descrita por Bórmann et al. (Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992)). La secuencia nucleotida del gen de deshidroqenasa de glutamato de Peptostreptococcus asaccharolyticus la da Snedecor et al . (Journal of bacteriology 173, 6162-6167 (1991)). Tarea de la Invención Los inventores se propusieron la tarea de obtener nuevas medidas para mejorar la preparación por fermentación de otros L-aminoácidos. Descripción Detallada de la Invención Los L-aminoácidos tienen aplicación en la alimentación animal, la medicina humana y la industria farmacéutica. Por lo tanto existe un interés general en un procedimiento nuevo y mejorado para la producción de L-aminoácidos . Cuando a continuación se mencionen L-aminoácidos, se implican con eso los aminoácidos formadores de proteína, L-lisina, L-treonina, L-isoleucina, L-valina, L-prolina, L-triptofano y eventualmente sus sales y también L-homoserina, en especial L-lisina, L-treonina y L-triptofano. El objeto de la invención es por lo tanto un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos utilizando bacterias corineformes que en especial ya produzcan los L-aminoácidos correspondientes y en los cuales se refuerza la secuencia nucleotida que codifica a la enzima hidrogenasa de glutamato. Formas de realización preferidas se encuentran en las reivindicaciones . El concepto "refuerzo" describe a este respecto el aumento de la actividad intraceluar de una o varias enzimas en un microorganismo, que son codificadas por el ADN correspondiente, para lo cual por ejemplo se aumenta el numero de copias del gen o de los genes, se utiliza un fuerte promotor o un gen que codifica a la enzima correspondiente con alta actividad, y eventualmente se combinan esas medidas. Los microorganismos que son objeto de la presente invención pueden producir L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones, celulosa o de glicerina y etanol . Puede tratarse d de un representante de las bacterias corineformes en especial del genero Corynebacterium. En el genero Corynebacteirum debe mencionarse en especial el tipo Corynebactyerium glutamicum, que se conocen en la enzima por su capacidad de producir L-aminoácidos . Cepas adecuadas del genero Corynebacterium en especial del tipo Corynebacterium glutamicum, son las cepas tipo nativo conocidas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoácidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC14020 y los mutantes o cepas preparados de ellas, como por ejemplo las cepas productoras de L-lisina Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 y Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712, o las cepas productoras de L-treonina Corynebacterium glutamicum FERM-P 5835 Brevibacterium flavum FERM-P 4164 y Brevibacterium lactofermentum FERM-P 4180, o las cepas productoras de L-isoleucina Corynebacterium glutamicum FERM-P 756 Brevibacterium flavum FERM-P 759 y Brevibacterium lactofermentum FERM-P 4192, o las cepas productoras de L-valina Brevibacterium flavum FERM-P 512 y Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1845, o las cepas productoras de L-triptofano Corynebacterium glutamicum FERM-BP 478 Brevibacterium flavum FERM-P 475 y Brevibacterium lactofermentum FERM-P 7127. De esto los inventores encontraron como las bacterias corineformes después de la sobre-expresión de la hidrogenasa de L-glutamato producen L-aminoácidos de forma mejorada, no reclamándose aquí el ácido L-glutaminico. El gen de hidrogenasa de glutamato de C. glutamicum descrito por Bórmann et al. (Molecular Microbiology 6, 317-326 (1992)) puede utilizarse de acuerdo con la invención. Además es adecuado el gen de dihidrogenasa de glutamato de otros microorganismos como por ejemplo de Peptostptococcus asaccharolytcus, que fue descrito por Snededor et al. (Journal of Bacteriology 173, 6162-6167 (1991)). Además se pueden utilizar los alelos de los genes mencionados, que se obtiene por medio de la degeneración del código genético por medio de mutaciones de sentidos (sense muta ions) de función neutra. Para obtener la sobre-exprésion puede aumentarse el numero de copias del gen correspondientes o puede imitarse la región promotora y reguladora, que se encuentra corriente arriba del gen estructural . De igual manera sirven los cartuchos de expresión que se construyen corriente arriba del gen estructural. Por medio de promotores inducibles es adicionalmente posible aumentar la expresión en el transcurso de la producción pro fermentación de L-aminoácidos. Por medio de medidas para alargar la vida del m-RNA se mejora igualmente la expresión. Además evitando la reducción de la proteína enzimática se refuerza la actividad enzimática. Los genes o las construcciones genéticas pueden encontrarse en los plas idos con diferentes números de copias o estar integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente puede obtenerse una sobre-expresión de los genes en cuestión por medio de la modificación de la composición del medio y la realización del cultivo. Datos sobre esto los encuentra el técnico entre otros en los escritos de Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsychiya y Morinaga (bio/technology 6, 428-430 (1988)) de Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en el escrito de patente europeo EP 0 472 869, en la patente de US 4,601,893, de Schwarzer y Pühler (bio/technology 9, 84-87 (1991) , de Reinscheid et al. (Applied and Enviromental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la solicitud de patente WO 96/15246, de Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), de Makrides (Microbiological Revies 60:512-538 (1996)) y en los textos conocidos de Genética y Biología Molecular. Ejemplos de plasmidos que pueden ser sobre-expresados con la ayuda de su deshidrogenasa de glutamato son pEKl, 0gdh-l y pEKExpgdh, que se encuentran en las cepas ATCC13032/pEKl, 9gfdh-l y DH5a/pEKExpgd . El plasmido pEKl,9gdh-l es un vector péndulo, que contiene el gen de dihidrogenasa de glutamato dependiente de NADP de C-glutamicum. El plasmido pELExpgdh es un vector péndulo que contiene el gen de deshidrogenasa de glutamato dependiente de NAD de Peptostreptococcus asaccharolyticus . Adicionalmente puede ser ventajoso para la producción de los L-aminoácidos correspondientes, además de sobre-expresar la deshidrogenasa de glutamato también uno o mas enzimas de la vía de biosíntesis de aminoácido en cuestión. Asi por ejemplo se puede • para mejorar las bacterias corineformes productoras de L-lisina puede sobre-expresarse el gen codificante a sintasa de deshidrodipicolinato (EP-B 0197335) , • para mejorar las bacterias corineformes productoras de L-valina adicionalmente sobre-expresar el gen codificante a sintasa de ácido acetohidroxi (EP-B- 0356739) , • para mejorar las bacterias corineformes productoras de L-triptofano adicionalmente sobre-expresar el gen codificante a transferasa de fosforibosil de antranílico (EP-B 0234048) , • para mejorar las bacterias corineformes productoras de L-homoserina o L-treonina o L-isoleucina adicionalmente sobre-expresar el gen codificante a deshidrogenasa de homoserina (EP-A 0131171) . Además puede ser ventajoso para la producción de los L-aminoácidos correspondientes además de la sobre-expresión de deshidrogenasa de glutamato evitar reacciones secundarias indeseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms" , en: Overpoduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikytam Vanek (eds.); Academic Press, Londres, UK, 1982), Los microorganismos producidos de acuerdo con la invención pueden cultivarse continua o discontinuamente en procedimientos por lotes o en procedimiento de alimentación (fed batch) o procedimiento de alimentación repetitivo (repeated fed batch) con el fin de producir L-amioácidos. Un resumen de métodos de cultivo conocidos se encuentra en el texto de Chmiel (Bioprozestechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer verlag, Stuttgart, 1991) ) o en el texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo utilizado debe de una forma adecuada ser suficiente para los requisitos de los microorganismos en cuestión. La descripción de medios de cultivo de diferentes microorganismos se encuentra en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la sociedad americana de Bacteriología (Washington D.C., US, 1981) . Como fuente de carbono pueden utilizarse azucares y carbohidratos como por ejemplo glucosa, sacarosa, latosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones y celulosa, aceites y grasas como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos como por ejemplo ácido palmitíco, ácido estearínico y ácido linoléico, alcoholes como por ejemplo glicerina y etanol y ácidos orgánicos como por ejemplo ácido acético. Esas substancias pueden utilizarse individualmente o en mezclas. Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse compuestos orgánicos que contengan nitrógeno como peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de remojo de maiz, harina de soya y urea o compuesto inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse solas o como mezclas. Como fuentes de fósforo pueden utilizarse ácido fosfórico, dihidrofosfato de potasio o hidrofosfato dipotásico o las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe además contener sales de metales como por ejemplo sulfato de magnesio o de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente pueden utilizarse promotores del crecimiento como aminoácidos y vitaminas adicionalmente a las substancias mencionadas.Al medio de cultivo pueden agregarsE etapas previas adecuadas . Los aditivos mencionados pueden agregarse al cultivo en forma de una carga única o en un a forma adecuada agregarse durante el cultivo.

Para controlar el pH del cultivo se utilizan compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico en forma adecuada. Para controlar la formación de espuma pueden utilizarse agentes anti-espumantes como por ejemplo poliglicoléster de ácido graso o aceites de silicona. Para mantener la estabilidad de los plasmidos pueden agregarse al medio substancias de efecto selectivo, por ejemplo antibióticos. Para mantener las condiciones aeróbicas se introducen al cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contengan oxígeno como por ejemplo aire. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente a 20°C a 45°C y preferentemente a 25°C a 40°C. El cultivo se continua hasta que se ha formado una cantidad máxima de L-aminoácido. Este objetivo se alcanza normalmente en el transcurso de 10 a 160 horas . El análisis de L-aminoácidos puede realizarse automáticamente en base a una cromatografía de intercambio de aniones con la subsecuente derivación de ninhidrina tal como lo describe Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, 1190 (1958)) . Los siguientes microroganismos fueron depositados en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania) en conformidad con el Tratado de Budapest : Cepa ATCC13032 (pEKl, 9gdh-l de Corynebacterum glutamicum, como DSM 12614 Cepa DH5a/pEKExpgdh de Escherichia coli K12 como DSM 12613. Ejemplos La presente invención se explicara mas detalladamente con la ayuda de los ejemplos de realización. Para este fin se realizaron pruebas con cepas productoras de aminoácidos, en las cuales se demuestra la superioridad del procedimiento presentado: a) La cepa de Corynebacterium glutamicum productora de L- lisina DSM515, (EP-B-0435 132) y b) la cepa de Brevibacterium flavum productora de DSM5399 (EP-B-0385940) y c) La cepa ATCC13032?ilvA productora de L-valina que requiere isoleucina, que fue depositada como DSM12455 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares en Braunschweig (Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest . Ejemplo 1 Preparación de productores de L-aminoácidos con deshidroaenasa de glutamato reforzada El plasmido pEKl,9gfdh-l corresponde al plasmido descrito por Bórmann et al. (Molecular Microbiology 6, 317- 326 (1992)). Se aisló de ATCC13032/pEKl, Ogdh-l. De igual manera el plasmido conocido pEKExpgdh (Marx et al . , Metabolic Engineering 1, 35-48 (1999)), que porta el gen de deshidrogenasa de glutamato de Peptostreptococcus asaccharolyticus (Snedecor et al., Journal of Bacteriology 173, 6162-6167 (1991)), se aisló de la cepa de E. coli DH5a/pEKExpgdh. Las cepas DSM5715, DSM5399 y ATCC13032?ilvA se transformaron como lo describe Leibl et al. (Fems Microbiology letters 65, 299-304 (1989)) con el plasmido pekl,9gdh-l. La selección de los transformantes se realizo sobre una agar de cerebro-corazón de la firma Merck (Darmstadt, Alemania) con fue suplementada con 50 mg/l. De esta manera se formaron las cepas DSM5715/Pekl, 9gdh-l, DSM5399/pEKl,9gdh-l y ATCC13032?lLVa/Pekl, 9gdh-l . De la misma manera se transformo la cepa DSM5715 con el plasmido pEKExpgdh y se obtuvo la cepa DSM5715/pEKExpgdh. Ejemplo 2 Preparación de L-lisina La cepa DSM5715/Pekl, 9gdh-l se precultivo en un medio complejo 2TY consistente de 16 g/1 de Trypton, 10 g/1 extracto de levadura y 5 g/1 de NaCl. Para esto se agregan 60 ml de medio 2TY, que se obtuvieron en un matraz Erlenmeyer de 500 ml con 2 bocas, se inocula con una unidad de la cepa y el cultivo se cultivo durante 12 horas a 150 rpm, y 30°C. Para inocular 60 ml del medio de producción, que se obtuvo en el matraz Erlenmeyer de 500 ml con 2 bocas, se centrifugó el precultivo a 5000 rpm, en una centrífuga Sepatech Minifuge RF (Heraeus, Hanau, Alemania) durante 10 minutos . La nata se desecho y la pelotilla se resuspendio en l ml de medio de producción. Una alícuota de esa suspensión celular se agrego al medio de producción, de tal forma que se obtuvo un OD600 de aprox. 2.0. Como medio de producción se utilizó el medio CGXII descrito por Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)) con pH 7.0 (Tabla 1) suplementado con 20 g/1 glucosa, 350 mg/l de leucina y 50 mg/l monosulfato de kanamicina. Los cultivos se incubaron durante 72 horas a 30°C y 150 rpm. Tabla 1 A continuación se determinaron las densidades ópticas (OD) (Biochrom Novaspec 4049, LKB Instrument GmbH, Gr feling, Alemania) a una longitud de onda medida de 600 nm y la concentración de L-lisina formada con un analizador de aminoácidos de la firma Eppenmdorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por medio de cromatografía de iatercambio iónico y reacción de postcolumna con detección de hibidrina. En la tabla 2 se dan los resultados de esta prueba. Tabla 2 Ejemplo 3 Preparación de L-treonina y L-isoleucina La cepa DSM5399/pEKl, 9gdh-l se precultivo en medio completo CglII (Kase & Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36 (9) 1611-1621 (1972) con 50 µg/ml kanamicina. Para esto se inocularon 10 ml de medio CglII, que se que habían obtenido en el matraz Erlenmeyer de 100 ml con 4 bocas con una unidad de la cepa y el cultivo se incubó durante 16 horas a 240 rpm y 30°C. Para inocular de 10 ml de medio de producción que se obtuvieron en el matraz Erlenmeyer de 100 ml con 4 bocas, se determino la OD (660 n) del precultivo. El cultivo principal se inoculó a un OD de 0.1. Como medio de producción se utilizó el medio CgXII descrito por Keilhauer et al., (Journal of Bacteriology 1993, 175: 5595-5603). La composición del medio se representa en el ejemplo 2. Se agregaron 4% de glucosa y 50 mg/l de sulfato de kanamicina.

Se incubaron las células a 33°C, 250 rpm y 80% de humedad del aire durante 48 horas. A continuación se determinaron las densidades ópticas a 660 nm y la concentración de L-treonina y L-isoleucina formadas como se describió en el ejemplo 2. En la tabla 3 se dan los resultados de esas pruebas.

Tabla 3 Ejemplo 4 Preparación de L-valina La cepa ATCC13032?ilvA/pEKl, 9gdh-l se precultivo en medio completo CglII (Kase & Nakayama, Agricultural and Biological Chemistry 36 (9) 1611-1621 (1972)) con 50 µg/ml kanamicina. Para esto se inocularon 50 ml de medio CglII, que se que habían obtenido en el matraz Erlenmeyer de 500 ml con 4 bocas con una unidad de la cepa y el cultivo se incubo durante 16 horas a 140 rpm y 30°C. Para inocular de 60 ml de medio de producción que se obtuvieron en el matraz Erlenmeyer de 500 ml con 4 bocas, se determino la OD (660 n) del precultivo. El cultivo principal se centrifugó y el residuo se desecho. La pelotilla se tomo en 5 ml de medio de producción y el cultivo principal se inoculo a un OD de 0.3. Como medio de producción se utilizó el medio CgXII descrito por Keilhauer et al., (Journal of Bacteriology 1993, 175: 5595-5603) como se describe en el ejemplo 3 (con 4% de glucosa) . La composición del medio se representa en el ejemplo 2. Se incubaron las células a 30°C, 150 rpm durante 48 horas. A continuación se determinaron las densidades ópticas a 660 nm y la concentración de L-valina formada como se describió en el ejemplo 2. En la tabla 4 se dan los resultados de esas pruebas . Tabla 4 E emp o 4 Preparación de L-lisina, L-valina y L-alanina La cepa DSM5715/pEKExpgdh se precultivo en un medio complejo 2TY consistente de 16 g/1 de Trypton, 10 g/1 extracto de levadura y 5 g/1 de NaCl. Para esto se agregan 60 ml de medio 2TY, que se obtuvieron en un matraz Erlenmeyer de 500 ml con 2 bocas, se inocula con una unidad de la cepa y el cultivo se cultivo durante 12 horas a 150 rpm, y 30°C. Para inocular 60 ml del medio de producción, que se obtuvo en el matraz Erlenmeyer de 500 ml con 2 bocas, se centrifugó el precultivo a 5000 rpm, en una centrífuga Sepatech Minifuge RF (Heraeus, Hanau, Alemania) durante 10 minutos. La nata se desecho y la pelotilla se resuspendid" en 1 ml de medio de producción. Una alícuota de esa suspensión celular se agrego al medio de producción, de tal forma que se tuvo un OD600 de aprox. 0.4. Como medio de producción se utilizó el medio CGC descrito por Schrumpf et al . (Journal of Bacteriology 173, 4510-4516 (1991)) (Tabla 5) suplememntado con 25 g/1 glucosa, 350 mg/l de leucina y 52 g/1 ácido 3-morfolinopropansulfónico y 50 mg/l de sulfato de kanamicina a un pH de 7. Los cultivos se incubaron durante 30 horas a 30° y 150 rpm. Tabla 5 A continuación se determinaron las densidades ópticas (OD) (Biochrom Novaspec 4049, LKB Instrument GmbH, Gráfeling, Alemania) a una longitud de onda medida de 600 nm y la concentración de L-alanina, L-lisina y L-valina formada con un analizador de aminoácidos de la firma Eppenmdorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por medio de cromatografía de intercambio iónico y reacción de postcolumna con detección de hibidrina. En la tabla 6 se dan los resultados de esta prueba . Tabla 6 r ue o r ación a s a ec a, e mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (6)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:
1. l.- Procedimiento para ?a preparación de L-aminoácidos por medio de la fermentación de bacterias corineformes, caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales la secuencia nucleotida que codifica a deshidrogenasa de glutamato se refuerza, en especial se sobre-expresa.
2. 2.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la hidrogenasa de glutamato producida en las bacterias utilizadas depende de NADP.
3. 3.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la hidrogenasa de glutamato producida en las bacterias utilizadas depende de NAD.
4. 4.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales adicionalmente se refuerzan los otros genes de la vía metabólica de la formación de los L-aminoácidos deseados.
5. 5.- Procedimiento de acuerdo con a reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales las vías metabólicas que reducen la formación de los L-aminoácidos deseados, están por lo menos parcialmente desactivadas.
6. 6. - Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se utiliza una cepa transformada con un vector de plasmido y el vector de plasmido porta la secuencia nucleotida codificante a dihidrogenasa de glutamato. 1 . - Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porgue se utilizan bacterias transformadas con el vector de plasmido pEKl,9gdh-l depositado en Corynebacterium glutamicum bajo el numero DSM 12614. 8.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque se utilizan bacterias transformadas con el vector de plasmido pEKExpgdh depositado en E. coli bajo el numero DSM 12613. 9. - Procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se realizan los siguientes pasos: a) fermentación de las bacterias productoras de L- aminoácidos en las cuales cuando menos se refuerza el gen de dihidrogenasa de glutamato, b) aumento de los L-aminoácidos deseados en el medio o en las células de las bacterias y c) aislado de los L-aminoácidos. 10.- Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porgue se utilizan bacterias corineformes que producen uno o varios de los aminoácidos L-lisina, L-treonina, L-isoleucina, L-valina, L-prolina, L-triptofano y L-homoserina.