MXPA99001485A - Lineas de celulas inmortalizadas para crecimientode virus - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la producción y uso de líneas de células inmortalizadas a partir de fibroblastos embriónicos primarios de pollo. Las células sonútiles como sustratos para propagación de virus, expresión de proteínas recombinantes y producción de virus recombinantes.

Description

LÍNEAS DE CÉLULAS INMORTALIZADAS PARA CRECIMIENTO DE VIRUS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con los campos de biología celular y virología. En particular, esta invención se relaciona con el uso de células inmortalizadas para propagación de virus .

J*.NTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En 1931, Alice Miles oodruff y Ernest Goodpasture introdujeron un método nuevo para cultivar virus. Reportaron que los virus de viruela pueden crecer en la membrana corioelantoidea de embriones de pollo en desarrollo. Las lesiones que contienen el virus aparecen sobre la membrana después de la inoculación del virus . El huevo es relativamente barato y se puede obtener fácilmente en comparación con animales los cuales eran el sustrato para los estudios anteriores de virus . El huevo tiene una variedad de células y membranas susceptibles a infección por diferentes virus y puede mantenerse en un ambiente estable y controlado. Los embriones de pollo han contribuido de una manera importante al desarrollo de la virología al proporcionar convenientemente una variedad de tipos de células susceptibles a muchos virus.

REF. 29395 Aunque el huevo soporta la replicación de una variedad de cepas de virus, los métodos para infectar los huevos y mantener el crecimiento de virus requieren tiempo y son molestos. Por ejemplo, la inoculación de la membrana corioelantoidea, primero se taladra un orificio a través de la cascara de huevo y la membrana de la cascara. La cascara sobre el saco de aire se perfora lo que provoca que entre aire entre la membrana de la cascara y la membrana corioelantoidea, lo que genera un saco artificial de aire, en donde se deposita la muestra. La muestra hace contacto con el epitelio coriónico y el virus crece como lesiones sobre la membrana. No es inesperado que el uso de huevos para replicación de virus haya disminuido con el advenimiento de técnicas de cultivo celular. Muchas células pueden crecer in vitro . Los cultivos celulares son fáciles de mantener y pueden mantenerse en un ambiente controlado, en comparación con los huevos. Sin embargo, existen aún algunas cepas de virus que parecen crecer mejor en células de huevos embrionados en comparación con células cultivadas. Además, muchas líneas de células cultivadas presentan agentes infecciosos endógenos que incluyen micoplasmas, contaminantes bacterianos a bajo nivel, virus endógenos y similares. Algunos tipos de células que son los más eficientes para soportar la replicación de virus tienen problemas para producción de concentrados virales en que las células contienen virus endógenos . El virus endógeno es replicante a bajo nivel o se puede activar cuando las células se infectan con una segunda cepa de virus. Por ejemplo, se sabe que las células de roedor transportan virus endógenos y la microscopía electrónica de células de roedor en cultivo con frecuencia demuestra la existencia de partículas virales identificables dentro de las células. Las líneas de células contaminadas no pueden ser utilizadas como sustratos para vacunas comerciales vivas o inactivadas . Para algunos virus, el método de elección para replicación viral son los pollos embrionados . Por ejemplo, el virus de la influenza humana, la rabia, el virus del moquillo canino, el virus de la enfermedad de Marek, el reovirus y el virus de la viruela son virus que crecen preferencialmente en huevos embrionados debido a que el huevo soporta un crecimiento concentrado de virus de alto título sobre células primarias derivadas de huevos embrionados. En otros casos, los virus crecen en huevos debido a que se necesita sustrato celulares libres de virus certificables. Los cultivos de células primarias son cultivos de células que son aislados de manera fresca de tejidos intactos. Estas células con frecuencia son una buena fuente de material libre de virus y son muy adecuadas como células huésped para replicación de virus. Las células primarias no siempre son eficientes en replicar virus y principalmente las células animales muestran una duración de vida limitada en cultivo, experimentando finalmente senescencia. En la senescencia, las células dejan de dividirse y mueren en cuestión de tiempo. La capacidad de las células para dividirse con respecto al tiempo de cultivo depende de varios parámetros que incluyen la especie de origen de la célula y la edad del tej ido cuando se coloca en cultivo. Las células que experimentan senescencia no se pueden mantener en cultivo durante períodos de tiempo prolongados y por lo tanto no son huéspedes reproducibles útiles para el crecimiento de concentrados de virus comerciales . Algunas células primarias escapan a la senescencia y adquieren la capacidad de volverse inmortales . Las células de roedor parecen experimentar inmortalización espontánea muy fácilmente (Curatolo et al. In vi tro 20:597-601, 1984) pero las células humanas normales y de ave raramente se ha demostrado, en caso de que se haya hecho, que son capaces de inmortalización espontánea (Harvey, et al. Genes and Development 5:2375-2385, 1991; Pereira-Smith, J". Cell Physiol 144:546-9, 1990; Smith et al. Science 273 : 63 -67 , 1996). Existe una variedad de razones por las cuales una población particular de células experimentaría inmortalización. Las células se pueden inducir para que experimenten inmortalización después de la exposición a agentes que se sabe inducen mutaciones genéticas . Algunas personas postulan que el cese de crecimiento, relacionado con la senescencia, es dominante a la inmortalización y los eventos que son indicativos a los genes que restringen el crecimiento pueden resultar en la inmortalización (Pereira-Smith et al., Proc. Nati . Acad. Sci (USA) 85:6042-6046, 1988). La disponibilidad de células libres de virus, inmortalizadas, puede eliminar o reducir el uso de cultivos de tejido animal primario. Los cultivos primarios generalmente se definen mal como poblaciones de células y con frecuencia están contaminados . Estos cultivos con frecuencia no cumplen los requerimientos reguladores para producción comercial de vacunas. Los cultivos primarios de células se pueden contaminar con Circodnavirideae (por ejemplo, el virus de la anemia de pollo) o el virus del síndrome del huevo caído. Por ejemplo, la vacuna de la enfermedad de Marek (una vacuna de virus vivo) puede crecer como concentrados de virus en huevos de pato para vacunar aves. En 1976, grupos de pollos recibieron la vacuna mostraron evidencia del síndrome de huevo caído, provocado por un adenovirus de pato que se considera había contaminado el concentrado de vacuna y se adaptó al crecimiento en pollos. En la industria de las vacunas, los requerimientos reguladores para seguridad de producto, consistencia y potencia están impulsando a las compañías a adquirir líneas de células como la mejor alternativa para la actual práctica de utilizar sustratos de vacuna basados en huevo y de células primarias . La preocupación por seguridad y consistencia es compartida por los fabricantes de productos de vacuna tanto humanas como animales debido a un ambiente regulatorio cada vez más estricto respecto a los sustratos de vacuna tanto en los Estados Unidos como en Europa. La identificación de células adecuadas para el crecimiento de virus para sustituir en huevos embrionados también es favorecida en vista de los US Government Principies for the Utilization and Care of Vertébrate gAnimals in Testing, Research, and Training and the Animal Welfare Act (7 U.S.C. § 2131) que establece, en parte, que en todos los casos, métodos tales como sistemas biológicos in vitro deben considerarse en lugar de sistemas de modelos animales in vivo. Existe la necesidad por células que estén libres de virus y soporten el crecimiento de virus exógenos para generar productos de vacuna animal .

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con la identificación de líneas de células de fibroblastos de pollo inmortalizadas espontáneamente y con métodos para obtener las líneas celulares. En particular, esta invención se relaciona con una línea de células inmortalizadas espontáneamente derivadas de fibroblastos embriónicos de pollo primarios que tienen las características de la línea de células inmortalizadas espontáneamente UMNSAH-DFl que se depositó ante la ATCC bajo los términos y condiciones del Tratado - de Budapest. Además, esta invención se relaciona con cultivos de estas células y con subclonas inmortalizadas de la línea de células inmortalizadas que soportan la replicación de virus. En un aspecto de esta invención, las células inmortalizadas de esta invención contienen virus, en otra, las células inmortalizadas de esta invención contienen por lo menos un vector capaz de dirigir la expresión de proteína recombinante en las células. En una modalidad, las células de esta invención expresan proteína recombinante y en otro aspecto de esta invención el vector está contenido en las células de esta invención y codifica para por lo menos una porción de un virus recombinante. En otra modalidad el vector es un vector retroviral . En otro aspecto de esta invención, se describe un método para producir una línea de células inmortalizadas a partir de fibroblastos embriónicos de pollo que comprende las etapas de: hacer crecer fibroblastos embriónicos de pollo primarios en cultivo,- pasar los fibroblastos en cultivo hasta que comienza la senescencia celular; concentrar las células durante la senescencia celular para mantener aproximadamente 30% a aproximadamente 60% de confluencia de cultivo; identificar focos de células no senescentes; y hacer crecer las células no senescentes por más de 30 pasajes.

En otro aspecto adicional de esta invención, se describe un método para hacer crecer virus en una célula que comprende las etapas de: hacer crecer una línea celular inmortalizada espontáneamente derivada de fibroblastos embriónicos de pollo primarios en cultivo; infectar las células con virus; permitir que el virus se replique en las células; y recolectar virus que se han replicado en las células .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Hasta la fecha esencialmente no hay líneas de células de ave no virales, sin proteínas virales no químicas transformadas, disponibles. Las líneas de células primarias son problemáticas para generar continuamente para producción de concentrado de virus y deben ser validadas por separado como depósitos libres de contaminante para crecimiento de virus. Esta invención describe la inmortalización de células fibroblásticas de embrión de pollo (CEF) derivadas de la línea East Lansing Line (ELL-0) de embriones de pollo. El término inmortalización se utiliza en la presente para referirse a células diferentes de roedor capaces de crecer en cultivo durante más de 30 pasajes que mantienen un tiempo de duplicación en cultivo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 días y que han estado en cultivo continuo durante más de aproximadamente 6 meses . Las células de ave generalmente se consideran inmortalizadas después de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 pasajes en cultivo. Las células inmortalizadas se diferencian de las células formadas en que a diferencia de las células transformadas, las células inmortalizadas dependen de la densidad y/o suprimen su crecimiento (por ejemplo, se inhiben al contacto) . Las células transformadas son capaces de crecimiento en agar suave y habitualmente son susceptibles de formar tumores cuando se inyectan en animales de laboratorio. Las células de esta invención son útiles como depósitos para crecimiento de virus o para expresar proteína recombinante o un virus particularmente en donde es importante que las células no alberguen virus o proteína viral contaminante . Las células también son útiles para estudiar los mecanismos subyacentes de senescencia celular e inmortalización. Se obtuvieron células primarias fibroblásticas de embrión de pollo (CEF) de huevos de 10 días de edad ELL-0 al tomar el torso embriónico de embriones de 10 días de edad, cortar en trozos pequeños el tejido y colocar las células en cultivo. Los huevos fertilizados están disponibles en Hy-Vac (Adel, Iowa) . Los huevos y sus capas se certificaron por el proveedor como negativos para influenza aviar (tipo A) , reovirus aviar, adenovirus aviar (grupos I-III) , virus de encefalomielitis aviar, viruela, virus de la enfermedad de Newcastle, paramixovirus (tipo 2) , micoplasma, salmonella y otros agentes infecciosos que se sabe infectan a el ganado de aves. El aislamiento de células primarias y la identificación de células inmortalizadas se proporciona en el ejemplo 1. Las células fueron identificadas debido a que en el momento del descubrimiento de la línea inmortalizada, las poblaciones celulares se seleccionaron para estudiar los efectos de la senescencia celular. Se sabe que las células humanas y de las aves son algunas de las células más difíciles de inmortalizar bajo condiciones de cultivo de tejido. A diferencia de las células de roedor, no hay informes revisados previos de métodos para inmortalizar fibroblastos humanos de pollo a partir de donadores normales (Smith, et al. Science 273:63-67, 1996). En fibroblastos de ave, las células no tratadas típicamente duran sólo 20-25 pasajes. Esto es, a los 30 pasajes los cultivos primarios de estas células aviares están muertos o en etapa de morir. Como se describe en esta invención, para alcanzar 20 pasajes, las células se hacen pasar y se concentran (véase ejemplo 1) entre aproximadamente el pasaje 12 hasta aproximadamente el pasaje 20 sobre placas más pequeñas, según se necesite. Se observan los focos de células que crecen más rápidamente y estos focos se aislan utilizando anillos de clonación (Bélico Glass, Inc. Vineland, N.J.) y se expanden en cultivo. La senescencia se define en la presente como células que tienen duplicación de población de aproximadamente 0.5 duplicaciones de población o menos por día. Para esta invención, las células inmortalizadas son células en cultivo durante más de 30 pasajes, que crecen a una velocidad de duplicación de población (determinada por las cuentas de células totales y cuentas de células viables por día utilizando exclusión de azul de tripan) de aproximadamente entre 0.6 a aproximadamente 1.2 duplicaciones de población por día y preferiblemente entre aproximadamente 0.7 a aproximadamente 1.0 duplicaciones de población por día, y al mismo tiempo muestran inhibición por contacto, dependencia de la densidad y morfología celular normal . Las células obtenidas de los focos identificados originalmente, como se describen en el ejemplo 1, han experimentado más de 400 (duplicaciones de población) y más de 160 pasajes. El término focos se utiliza en la presente para referirse a grupos de células morfológicamente uniformes que pueden ser diferenciadas de la morfología de las células que los rodean. Estos focos de células se pueden remover fácilmente y subclonar para estudio adicional . Las células de esta invención han continuado duplicándose cada 22-24 horas. Las células fueron inhibidas por contacto, negativas a transcriptasa inversa (véase ejemplo 2) , suprimidas por dependencia a la densidad, aneuploides (como se observa por análisis de dispersión de cromosoma bajo microscopía de inmersión en aceite del cariotipo que es una mezcla de cariotipos diploide/tetraploide con algunas células mostrando una traslocación aparente del cromosoma 1) , y crecimiento a densidades de sembrado de placa elevado de entre 1.1-1.9 x 10s células/cm2. No se observaron células gigantes multinucleadas . Las células tienen un fenotipo uniforme. Las células también mantienen un patrón característico de crecimiento rápido lo cual es importante para la propagación de virus . Las células no fueron transformadas como se demuestra por su capacidad de crecer en ensayos de agar suave (véase ejemplo 3) . Además, las células no producen tumores cuando se inyectan en las alas de pollo (véase ejemplo 4) . Las células ejemplares de esta invención se denominaron células UMNSAH-DF1 y se depositaron ante American Type Culture Collection (ATCC) , 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland, 20852 como número de acceso CRL-12203, depositado el 11 de octubre de 1996 bajo los términos y condiciones del Tratado de Budapest. Esta invención también se relaciona con células de fibroblasto embriónico de pollo inmortalizadas de esta invención en cultivo y con subclonas de las células inmortalizadas de esta invención. Por ejemplo, las células de esta invención se identifican como células inmortalizadas espontáneas. Las células se obtienen de en capas libres de contaminante químico conocido, libres de virus conocido (gallinas que producen tejidos embriónicos que son la fuente de esta invención) y los tejidos embriónicos utilizados para producir las células de esta invención también son libres de contaminantes químicos (es decir, están libres de tratamientos por carcinógenos conocidos u otros agentes que se sabe que transforman células de roedores) y libres de virus conocidos. Una vez que las células inmortalizadas de esta invención están en cultivo, es posible subclonar adicionalmente células para seleccionar otros parámetros fisiológicos que pueden variar en la población de células y al mismo tiempo mantener inhibición por contacto y susceptibilidad a infección por virus. Se probaron las células para determinar su capacidad para replicar HVT (herpes virus de pavos) , herpes virus aviar (serotipo III), virus de viruela y reovirus . Las células se pueden probar para determinar su capacidad para replicar circodnavirideae, HSV de pollo serotipo II para una variedad de otros virus que se han probado como un sustrato para transfección. Las células fueron útiles para propagar virus tanto aviares como no aviares. El ejemplo 5 detalla métodos para propagar HVT, virus de viruela y reovirus. Las células son útiles como sustrato para producción viral, y en particular las células son útiles para producción de retrovirus, puesto que las células y sus capas (es decir, sus madres) no tienen infecciones detectables por retrovirus . Las células son susceptibles de soportar replicación del virus de leucemia de sarcoma aviar y del virus de sarcoma de Rous .

Para producir el concentrado de virus, las células de esta invención se pueden sembrar en matraces de cultivo de tejido, frascos giratorios, cultivo en agitación, en reactores de fibra hueca u otros sistemas de cultivo en masa. Para propagación de virus en frascos giratorios, las células se siembran a aproximadamente 2-5 x 104 células/cm2 de área-superficial. La multiplicidad de infección (proporción de partículas de virus infecciosas respecto a las células) para iniciar el crecimiento concentrado de virus variará en base a la cepa de virus. Aquéllos familiarizados en la técnica de virología y familiarizados en el crecimiento de virus particulares y cepas de virus serán capaces de maximizar el rendimiento de concentrado de virus mediante la manipulación estándar de la multiplicidad de infección, temperatura, variaciones en el medio y similares, sin experimentación indebida . Los métodos para recolectar el virus después de la infección para obtener concentrados de virus infecciosos también varía con la cepa de virus. Los virus envueltos (con cápside) progresan en los medios de cultivo más lentamente que los virus sin envoltura. Los concentrados de virus se pueden obtener de medio de cultivo sólo o a partir de lisados de células concentrados con el medio acondicionado. Para virus líticos (aquéllos eficientes en el lisado de una célula durante el progreso del virus) , recolección del medio de cultivo acondicionado (por ejemplo medio gastado que contiene el virus) después de una etapa de centrifugación suave para remover los residuos celulares es suficiente. Nuevamente, los métodos para recolectar y guardar virus de una amplia gama de cepas de virus son bien conocidos en la técnica. Existen una variedad de métodos, también conocidos en la técnica, para cuantificar el crecimiento de virus a partir de un cultivo de células. Por ejemplo, el título de un concentrado de virus para miembros de la familia de herpesvirus y para una variedad de virus que producen focos de citopatología sobre una superficie de monocapa celular se cuantifican fácilmente por ensayo en placa (como unidades formadoras de placa/ml de fluido de cultivo o como unidades formadoras de placa/dosis para cuantificación de virus por inoculo de vacuna) o como la dosis infecciosa de tejido de cultivo-50 (TCID50) . Los virus que producen lisis rápidamente se cuantifican mejor por TCIDS0 o la dosis o dilución de concentrado de virus capaz de infectar 50% de los cultivos en un período de tiempo definido. Los métodos para hacer crecer y cuantificar virus son conocidos en la técnica y las fuentes para enseñar métodos de cuantificación de virus se encuentran en Fields, et al. (eds) Fundamental Virology 1991, Raven Press, New York o en Mandell, et al. (eds.) Principies and Practice of Infectious Diseases. 1985, John Wiley & Sons, New York.

Además de soportar el crecimiento de virus, las células de esta invención se pueden utilizar como líneas de empacado para producir virus recombinante, que incluyen a retrovirus. Las células también se pueden utilizar para producir proteínas recombinantes, que incluyen proteínas virales, y similares. Los métodos para incorporar proteína recombinante que codifica para ácido nucleico dentro de un vector de ácido nucleico bajo el control de elementos reguladores capaces de dirigir la expresión de una proteína en una célula eucariótica, tal como las células inmortalizadas de esta invención, son bien conocidos en la técnica. Los vectores de expresión son fragmentos de ácido nucleico replicables que pueden dirigir la expresión de una proteína recombinante. Están disponibles en la técnica muchos vectores de expresión, que incluyen vectores retrovirales, a través de publicaciones periódicas y proveedores comerciales. Los componentes del vector de expresión replicable generalmente incluyen, pero no se limitan a uno o más de los siguientes : un origen de replicación, uno o más genes marcadores, elementos alargadores, elementos promotores, secuencias de señal opcional y secuencias de terminación de transcripción. Los genes de selección o marcadores codifican para proteína que sirve para identificar una población de células transformadas o transfectadas. Los genes de selección típicos que codifican para proteínas que confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, complementan deficiencias auxotróficas o suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos. Los vectores de expresión que tienen ácido nucleico que codifica para proteína recombinante se transfectan en las células y se utiliza para dirigir la expresión de la proteína recombinante en las células inmortalizadas de esta invención. El vector preferiblemente puede codificar cualquier proteína recombinante capaz de expresión en células de fibroblasto embriónico de pollo que incluyen, pero que no se limitan a proteína de virus, que incluye transcriptasa inversa y/o proteína estructural viral. Los ejemplos de vectores para producir proteína recombinante en una célula incluyen vectores retrovirales para producir proteína supresora de tumores, o proteína estructural viral tal como aquéllos descritos por Givol, et al. Oncogene 11 (12) :2609-2618, 1995, Givol, et al. Cell Growth & Differentiation 5 (4) :419-429 , 1994, gAkiyama, et al. Virology 203 (2) : 211-220, 1994 y Boyer, et al. Oncogene 20:457-66, 1993. Las células de esta invención pueden servir como sustrato para expresar virus recombinante que incluyen, pero que no se limitan a retrovirus recombinante. Las células de esta invención son adecuadas para servir como líneas de células de empaque para virus sometidos a ingeniería genética útiles para terapia de genes, o similar. Los constructos y métodos para utilizar una línea de células particular como una línea de células de empaque son conocidos en la- técnica. Por ejemplo, Boerkoel, et al. ( Virology 195 (2) :669-79, 1993) describe métodos para empacar virus utilizando fibroblastos embriónicos de pollo primarios como la línea de células de empaque. Estos mismos métodos pueden ser utilizados para empacar virus en las células inmortalizadas de esta invención. Puesto que la mayor parte de las líneas de células aviares y todas las células aviares transformadas así como virtualmente todas las líneas de células transformadas de ratón contienen contaminantes virales tales como virus endógenos o producen proteína viral , no son adecuados para la producción de vacunas humanas o animales . Las células no pueden ser utilizadas para producir proteína recombinante debido a que los contaminantes endógenos pueden contaminar preparaciones de proteína recombinante purificada. Ventajosamente, las células de esta invención proporcionan una alternativa adecuada a estos problemas. Las células de esta invención también pueden servir como un sustrato para soportar el crecimiento de virus de otras células. Estas otras células incluyen células primarias, o células cultivadas que muestran crecimiento o longevidad mejoradas en cultivo, en presencia de otras células o en presencia de proteínas de matriz extracelular tales como colágenos, lamininas y similares. En una modalidad, las células se mezclan con virus y después se mezclan con células de esta invención preferiblemente en una proporción de células respecto a células de esta invención de aproximadamente 1:5 células a aproximadamente 1:20 células y de manera más preferible en una proporción de aproximadamente 1:10 (1 célula respecto a aproximadamente 10 células de esta invención) . Las células mezcladas después se colocan en cultivo. En una segunda modalidad, las células se mezclan con virus y se siembran en placas sobre la superficie de las células inmortalizadas de esta invención que ya están unidas a la superficie de cultivo de tejido. Las células de esta invención sirven como un soporte para otras células y, sin intentar limitar el alcance de esta invención, las células de esta invención pueden suministrar factores de crecimiento y similares así como componentes de matriz extracelular y similares para soportar a las otras células mientras están produciendo virus. El ejemplo 6 proporciona un ejemplo del uso de las células de esta invención como un sustrato celular. Las modalidades particulares de esta invención se discutirán con detalle y se ha hecho referencia a posibles variaciones dentro del alcance de esta invención. Existe una variedad de técnicas alternativas y procedimientos disponibles para aquéllos familiarizados en la técnica los cuales de una manera similar permiten a una persona realizar con éxito la invención propuesta.

Ejemplo 1 Establecimiento de una línea de células de fibroblasto de pollo espontánea Se ordenaron dos docenas de huevos ELL-0 de East Lansing USDA de los concentrados de aves. Los huevos se incubaron en una incubadora aislada esterilizada durante 10 días y se procesaron para cultivos primarios. Se disoció el tejido embriónico utilizando una solución de tripsina/EDTA y se sembró en placas en medio DMEM (Gibco) que contiene suero bovino fetal al 10% (Gibco) , antibiótico/antimicótico al 1% (Gibco) que contiene L-glutamina 2 mM (Gibco) . La suspensión de células disociadas se recolecta en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene suero bovino fetal 10% ml para inactivar la tripsina y se centrifugó a 700 x g por 10 minutos. Las células se resuspendieron en 10 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco enriquecido con 36 µg/ml de insulina (Sigma), 1.6 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO) , L-glutamina 2 mM, 10% de suero bovino fetal, 1% de solución de antibiótico/antimicótico y se transfirieron en pipeta a un matraz de cultivo de tejido corning de 25 cm2 y se incubaron a 40.5°C en C02 al 5%, aire al 95%. Después de 24 horas de incubación se cambió el medio. El cultivo primario contiene numerosos explantes con centros de células similares a las epiteliales y fibroblastos radiantes. Se permitió que los cultivos crecieran hasta confluencia (5 días) y se removieron de las placas utilizando una solución de tripsina/EDTA (tripsina al 0.05% y ácido etilendiaminotetraacético al 0.02% (EDTA) en PBS) y se volvieron a sembrar en placa para un segundo pasaje. En el segundo pasaje, algunas de las células fueron congeladas en un medio acondicionado que contiene medio DMEM al 50%, DMSO al 12% y suero bovino fetal al 38%. Estas células se congelaron en nitrógeno líquido en fase de vapor durante 24 horas y después se transfirieron a nitrógeno líquido acuoso para almacenamiento a largo plazo. Las células en el segundo pasaje (P2) se volvieron a sembrar en placas a una velocidad de sembrado de 2.7 x 104 células/cm2. Las células se subcultivaron durante varios meses. Los fibroblastos cultivados crecieron rápidamente por 8 a 9 pasajes, después comenzaron a disminuir con muerte celular significativa. Durante la crisis, las células se pasaron utilizando una solución ATV (8 g/1 de NaCl, 0.4 g de KCl, 1 g de dextrosa, 0.58 g de NaHC03, 0.5 g de tripsina (Difco 1:250) , 0.2 g de versene (sal disódica) en 1000 ml) . Las células se hicieron crecer en medio de Eagle modificado por Dulbecco enriquecido con 36 µg/ml de insulina (Sigma) , 1.6 µg/ml de transferrina (Sigma), L-glutamina 2 mM, suero bovino fetal al 10% y solución de antibiótico/antimicótico al 1% . Se hace notar que la mayor parte de las células en el pasaje 11 (Pll) estaban muertas o a punto de morir,- sin embargo, una pequeña subpoblación de células aparecían ser fibroblastos sanos . Las células Pll permanecieron en el recipiente durante cuatro semanas con realimentación cada tres días con medio fresco. Algunas células fueron congeladas y las células restantes se concentraron en un área más pequeña y se permitió que crecieran otras dos semanas antes de que fueran lo suficientemente confluentes durante un segundo subcultivo. En P15 , las células parecían ser más homogéneas en morfología celular y crecieron a una velocidad de 0.32 duplicaciones de población por día. En P20, la duplicación de población se incrementó a aproximadamente 0.7 a aproximadamente 0.8 duplicaciones de población por día. En este momento, las células parecían tener una morfología muy uniforme. Las células se denominaron UMNSAH/DF #1 y han estado en cultivo continuo durante más de diecinueve meses . Las células actualmente están en el pasaje 160. Las células se congelaron (como en lo anterior) y se recalentaron desde P5. Las células subclonadas se expandieron y se confirmó la capacidad de repetición del método mediante la identificación de otras clonas. Se obtuvieron varias subclonas adicionales en Pll.

Ejemplo 2 Pruebas en las células para determinar contaminantes de virus Las células de esta invención fueron probadas para determinar si existen contaminantes virales utilizando PCR para identificar fragmentos de ácido nucleico contaminantes. Existe una amplia variedad de equipos de prueba disponibles comercialmente para una variedad de virus que pueden ser utilizados para determinar si las células de esta invención contienen virus contaminantes. Similarmente, existen disponibles comercialmente pruebas para detectar antígeno viral (por ejemplo ensayos de ELISA disponibles comercialmente y similares) , en donde el antígeno se deriva de una variedad de virus diferentes. Estas pruebas se pueden utilizar en las células de esta invención utilizando técnicas experimentales sistemáticas o de rutina para demostrar que los cultivos están libres de virus contaminantes. En una serie de pruebas, las células se prueban para actividad de transcriptasa inversa. Se aislan 1 x 106 células de cultivos que crecen rápidamente, en 4 ml de medio. El medio se toma a través de varios intervalos de congelamiento y recalentamiento a -80 °C para lisar las células. El medio con las células lisadas se estratifica sobre un gradiente de glicerol al 10%. El gradiente se somete a centrifugación durante 60 minutos a 40,000 rpm utilizando un rotor SW40 (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) . Las partículas de virus, en caso de estar presentes, se sedimentan. El medio se desecha y el sedimento se resuspende en 20 µl de Nonidet P-40 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) . Un tubo eppendorf se calentó a 41 °C. Se agregaron 5 µl de muestra a 45 µl de mezcla de transcriptasa inversa que contiene Tris 45 mM, pH 7.8, 2-3-mercaptoetanol 2 mM, acetato manganoso 2 mM, Tritón X-100 al 0.1%, 10 µM de cada uno de dATPC, dCTP, dGTP (Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN) , 2.4 µg de poliA (Sigma), 60 ng de cebador o iniciador dT 12-19 (Pharmacia), 0.4 µCi/reacción de 3H de trifosfato de timidina (15,000 a 28,000 cpm/pmol de actividad, Amersham) . La reacción se incubó durante una hora a 41°C. Un control negativo incluyó 5 µl de ddH20 y 45 µl de la mezcla. Se incluyeron dentro del ensayo dos controles positivos conocidos. El ensayo se detuvo al agregar 1 ml de ácido tricloroacético al 10% (TCA, Columbus Chemical Industries, Inc., Columbus, Wl) . La mezcla se filtró a través de un prefiltro de 0.45 micrómetros de vidrio GF/C Whatman. Se realizaron varios lavados utilizando TCA al 5%. El filtro se transfirió a un contador de centelleo Beckman Instruments utilizando rasgos de centelleo que contienen 5 ml de fluido de conteo de centelleo.

Las muestras se contaron en un ajuste de intervalo de 050 a 600. Un incremento de tres veces las cuentas con respecto al fondo de la mezcla (control negativo) se consideró positivo. Los cultivos primarios probaron ser negativos para transcriptasa inversa así como las células inmortalizadas obtenidas en esta invención. Para información adicional respecto a los ensayos para transcriptasa inversa véase (Crittenden, et al. Virology 57 : 128-138, 1974).

Ejemplo 3 Ensayo de formaciones de colonias de agarosa suave para determinar el potencial tumorigénico de células Para determinar el potencial tumorigénico, las células se probaron para crecimiento en agar suave. Se elaboró una base de agarosa suave al mezclar 12 ml de una solución de agarosa al 2% (que ha sido sometida a autoclave y enfriada a 56 °C) en 21.6 ml de medio 5A de McCoy enriquecido [Gibco, 120 ml de suero bovino fetal (inactivado por calor, 5 ml de piruvato de Na (concentrado 2.2%), 1 ml de L-serina (21 mg/ml de concentrado) , 5 ml de L-glutamina (200 mM concentrado) , 12.5 ml de Hepes (ÍM de concentrado)], 5.9 ml de Asparagina (4.4 mg/ml de concentrado esterilizado y filtrado) . Se virtieron 7 ml de medio tibio/agarosa en un recipiente de cultivo de tejido de 100 mm2 y se permitió que solidificara a temperatura ambiente en una capa de cultivo de tejido durante 1 h. Se removieron las células de los cultivos que crecen activamente (aproximadamente 40% a aproximadamente 70% de confluencia) por tripsinización para obtener una sola suspensión celular en medio DMEM fresco que contiene suero bovino fetal al 10% (con L-glutamina y antibióticos/antimicóticos) . Se agregaron aproximadamente 1 x 10s células a 4.25 ml de medio DMEM que contiene suero bovino fetal al 10%, 0.75 ml de agarosa al 1% y 50 µl de 2/3-mercaptoetanol . Se tuvo precaución para asegurarse que el medio caliente/agarosa estaba a 42 °C antes de agregar las células. Rápidamente se superpusieron 5 ml de la suspensión celular anterior sobre las placas de agarosa. Las células se hicieron crecer a 37 °C en un incubador con C02 al 5% y aire al 95%, y se observaron durante 35 días. Las placas por duplicado se tiñieron con clorito de 3 p-nitrofenil-5-feniltetrazolio (tinción INT) y se examinaron los días 0, 5, 10, 15, 20, 30 y 35 para formación de colonias y crecimiento. Todas las colonias teñidas con más de 60 µm se consideraron positivas . Todas las células probadas fueron negativas . Información adicional en relación al ensayo de agar suave está disponible de Hamburger, et al. Prog. Clin . Biol . Res . 48: pps 43, 135, 179, 1980.

Ejemplo 4 Tumorigenicidad de células inmortalizadas Bajo las líneas de guía indicadas por el University of Minnesota Animal Usage Protocol (protocolo #950300-1, marzo 1995-diciembre 1996) se inyectaron las células a animales de prueba para determinar si las células eran o no tumorigénicas . Las células que crecieron activamente se removieron de placas de cultivo celular y se inyectaron en seis pollos adultos de la línea SPAFAS (Hy-Vac, Adel, Iowa) . Se introdujeron inyecciones subcutáneas de 4 x 106 células en las nervaduras de las alas de los pollos . Se examinaron los sitios de inyección semanalmente durante 3.5 meses. No se observaron tumores en el sitio de inyección para ninguna de las células transfectadas producidas hasta la fecha con todos los animales y permanecieron sanos . Los experimentos demostraron que las células inmortalizadas no son tumorigénicas .

Ejemplo 5 Capacidad de las células para soportar el crecimiento de virus Se sembraron las células en frascos giratorios a 5.0 x 10s células/cm2. Se permitió que las células se unieran durante 24 horas y se recolectó control para cuenta celular. Las células se hicieron crecer por infección por virus en DMEM (4.5 g/1 de glucosa), suero bovino fetal al 4%, L-glutamina 2 mM, 50 mg/L de gentamicina. Las células se infectaron a una multiplicidad de infección de 0.0006 partículas de virus HVT por célula. Los frascos giratorios se observaron diariamente para provisión de CPE. Las células se recosecharon a las 46 horas post-infección cuando había aproximadamente 50% de CPE . Las células infectadas con HVT se congelaron en medio de crecimiento en DMSO al 10% a una concentración de 2.0 x 107 células/ml. Se cuantificaron los títulos de HVT por ensayo en placa. El virus fue diluido esencialmente en medio de crecimiento y colocado sobre monocapas confluentes de células permisibles. Los cultivos se incubaron durante un tiempo designado y las células se fijaron y se tiñeron. Las placas en las monocapas se contaron y el título de virus se expresó como unidades formadoras de placa por dosis.

Estas células también se probaron para determinar su capacidad para soportar la producción de reovirus . Se infectaron 2.5 x 10ß células con la cepa WSS-Reo 1733 de reovirus que tiene el título de 8.2 TCIDS0/ml. Las células fueron infectadas a una multiplicidad de infección de 0.005, 0.001 ó 0.0005 partículas de virus infeccioso/célula. Las células infectadas se hicieron crecer en frascos giratorios y se probaron a las 48, 64 y 72 horas después de la infección para demostrar crecimiento viral productivo.

Experimento 6 Uso de células cutáneas transfectadas como un sustrato celular Las células de esta invención son útiles como un sustrato para soportar la replicación de virus de células primarias. En estos experimentos, las células inmortalizadas se mezclan con células primarias. En un estudio, las células primarias se infectan y se mezclan con las células inmortalizadas y se colocan en cultivo, y en otro estudio las células primarias se infectan y colocan sobre células inmortalizadas en donde las células inmortalizadas ya están colocadas como una capa en el matraz del cultivo de tejido. En un ejemplo, el virus es el virus del síndrome de huevo caído y las células primarias son células hepáticas embriónicas de pollo primarias. Un segundo ejemplo, las células primarias son células endoteliales, preferiblemente células endoteliales renales y el virus hacia el virus de bronquitis infeccioso. La proporción preferida de células primarias respecto a células inmortalizadas es de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:20, y de manera más preferible de aproximadamente 1:10. Los títulos de virus de células primarias que crecen en la población de células mezcladas son superiores que los títulos de virus de células primarias en el cultivo sólo. Las células inmortalizadas permiten que las células primarias sean utilizadas para propagación de virus bajo condiciones comerciales . Todas las publicaciones citadas se incorporan como referencia en su totalidad en este texto. Aunque la invención ha sido descrita en el contexto de modalidades particulares, se entiende que el alcance de cobertura de la patente está limitado únicamente por la referencia a las siguientes reivindicaciones . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES - Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: 1. Una línea de células inmortalizadas espontáneamente, derivadas de fibroblastos embriónicos de pollo primario, en donde la línea celular es capaz de crecimiento en cultivo a una velocidad de duplicación de población de aproximadamente entre 0.6 y aproximadamente 1.2 duplicaciones de población por día.
2. 2. Los cultivos de subclonas inmortalizadas de la línea de células inmortalizadas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque soportan la replicación de virus .
3. 3. Las células de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizadas porque contienen virus.
4. 4. Las células de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizadas porque contienen por lo menos un vector capaz de dirigir la expresión de proteína recombinante en las células .
5. 5. Las células de conformidad con la reivindicación 4, caracterizadas porque expresan proteína recombinante .
6. 6. Las células de conformidad con la reivindicación 4, caracterizadas porque el vector codifica por lo menos una porción de un virus recombinante.
7. 7. Las células de conformidad con la reivindicación 4, caracterizadas porque el vector es un vector retroviral .
8. 8. Un método para producir una línea de células inmortalizadas a partir de fibroblastos embriónicos de pollo, caracterizado porque comprende las etapas de: hacer crecer en cultivo fibroblastos embriónicos de pollo primarios; pasar los fibroblastos en cultivo hasta que comience la senescencia celular; concentrar las células durante la senescencia celular para mantener aproximadamente 30% a aproximadamente 60% de confluencia de cultivo,- identificar focos de células no senescentes en el cultivo,- aislar las células no senescentes; y hacer crecer las células no senescentes por más de 30 pasajes.