MXPA99001484A - Metodo para inmortalizar celulas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la introducción de p53 bajo el control del promotor metalotioneina en células primarias para producir líneas de células inmortalizadas. Las células sonútiles como sustratos para propagación viral, como fuentes libres de contaminante para producción de proteínas recombinante, para producción de virus recombinante y como sustratos celulares para soportar células primarias y mejorar el rendimiento de virus durante la propagación de virus.

Description

MÉTODO PARA INMORTALIZAR CÉLULAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con el campo de la inmortalización de células y el uso de células como reservorios para crecimiento de virus y expresión de proteínas recombinantes. En particular, esta invención se relaciona con el uso de la proteina p53 bajo el control de un promotor inducible para producir células inmortalizadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Muchos virus de aves utilizados para la producción de vacunas de aves y animales se propagan en huevos de pollo embrionarios o en cultivos de fibroblastos de pollo primarios.

Los ejemplos de vacunas animales fabricadas utilizando estos sustratos de pollo incluyen moquillo canino, vacunas para la enfermedad de Marek para pavos, reovirus, viruela y vacunas para la enfermedad de la bursa infecciosa para aves. Los cultivos de células primarios pueden ser altamente variables y presentan riesgo de contaminación por virus endógenos, micoplasmas y similares. Las fuentes para tejidos animales para los cuales se derivan los cultivos de células primarias con frecuencia están limitados y son costosos debido a la necesidad REF. 29394 de mantener cantidades de animales en un estado libre de patógenos . Existe la necesidad por desarrollar una metodología que se pueda repetir para generar sustratos de células de ave inmortalizados, libres de virus que sean adecuados para uso en la fabricación de productos para vacunas de animales. La disponibilidad de líneas de células inmortalizadas (es decir continuas) bien caracterizadas, tiene el beneficio de eliminar o reducir la dependencia de cultivos de tejido animal primario los cuales son poco controlados desde un punto de vista de calidad. En la industria de vacunas, los requerimientos reguladores para seguridad del producto, consistencia y potencia son los impulsores de que las compañías busquen líneas celulares como la mejor alternativa a la práctica actual de utilizar sustratos de vacuna de células basados en huevos y de células primarias. Las compañías de producción de vacunas deben tener líneas de células consistentes definidas para producción de virus, para satisfacer los requerimientos de reglamentos y permitir a las compañías diseminar sus vacunas. Los fabricantes de productos de vacuna tanto humanos como animales tanto en los Estados Unidos como en el extranjero deben de mostrar que sus sustratos de vacunas están libres de contaminantes. La llegada de un método reproducible para generar líneas celulares animales continuas derivadas de tejidos primarios permitirá a los fabricantes de productos biológicos controlar mejor los procesos de producción e incrementar tanto la seguridad como la consistencia y al mismo tiempo reducir costos .

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con un método para transformar células y células producidas al introducir ácido nucleico que codifica para p53 bajo el control del promotor metalotioneína en células, y seleccionar células con características inmortalizadas. En un aspecto de esta invención, se describe un método para transformar células humanas diferentes de roedor que comprende las etapas de: colocar el ácido nucleico que codifica para p53 bajo el control de un promotor de metalotioneína en un vector genético capaz de dirigir la expresión de p53; introducir el vector genético en células primarias diferentes de roedor; seleccionar focos de células con tiempos de duplicación de población de aproximadamente 0.6 a aproximadamente 1.5 duplicaciones de población por día, en donde las células son transcriptasa inversa negativas y no tumorigénicas. En una modalidad, las células primarias diferentes de roedor se derivan de aves, y en otra modalidad, las células primarias diferentes de roedor se derivan de humanos. Las células primarias utilizadas en esta invención se pueden formar de cualquier número de tejidos y, en una modalidad preferida, las células se obtienen de tejido cutáneo, tejido de músculo de pecho y/o tejido de músculo cardíaco. En otro aspecto de la invención, se describen células. Estas células son fibroblastos inmortalizados que contienen un vector genético capaz de expresar p53 bajo el control del promotor de metalotioneína. En una modalidad, las células se derivan de ave. Esta invención también se relaciona con un método para hacer crecer virus que comprende las etapas de : poner en contacto por lo menos una partícula de virus infeccioso con por lo menos una célula de un cultivo de células inmortalizadas, en donde las células del tejido contienen un vector genético capaz de dirigir la expresión de p53 bajo el control del promotor de metalotioneína; y recolectar virus producido por las células. En una modalidad, el virus es reovirus, en otra, el virus es HVT y en una tercera modalidad el virus es el virus de viruela. En otro aspecto de esta invención, se describe un método para propagar virus, que comprende las etapas de: poner en contacto por lo menos una partícula entre virus infeccioso con una célula primaria; hacer crecer las células primarias con células inmortalizadas que contienen un vector genético que expresa p53 bajo el control del promotor metalotioneína en cultivo celular; y colectar virus producidos del cultivo celular.

La invención también se relaciona con células no transformadas, inmortalizadas, que contienen p53 bajo el control del promotor de metalotioneína y que contiene por lo menos un vector capaz de dirigir la expresión de proteína recombinante en células. En una modalidad, las células expresan proteína recombinante y en otra modalidad el vector codifica para por lo menos una porción de un virus recombinante. En otra modalidad adicional, el vector es un vector retroviral.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 es un esquema del vector pJFNII, utilizado en una modalidad preferida de esta invención. La figura 2 es un esquema del vector pJFNIIcMTD, utilizado en una modalidad preferida de esta invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Existe la necesidad por un método para inmortalizar de manera repetible células primarias y generar líneas de células continuas. El desarrollo de tecnologías líneas de células bien caracterizadas que soporten la replicación viral permitirá a las compañías ahorrar tiempo al generar repetidamente células primarias y eliminar los problemas asociados con los contaminantes e inconsistencias que existen entre lotes de huevos. Las líneas de células inmortalizadas definidas para crecimiento de virus reduce costos asociados con pruebas de control de calidad de los productos finales. Esta invención estriba en la inmortalización de células animales primarias diferentes de roedor, en particular células de ave y humano utilizando p53 recombinante bajo el control del promotor inducible de metalotioneína. Las células son útiles para crecimiento de concentrado de virus, para expresar proteínas de virus y como líneas de célula de empacado para producir virus recombinantes . Los cultivos de células primarias con mucha frecuencia están derivados de células aisladas frescas de tejidos y tactos. Las células con frecuencia son una buena fuente de material libre de virus y son adecuadas como células huésped para replicación de virus. Las células primarias no siempre son eficientes para replicar virus y las células de animales primarias muestran una duración de vida limitada, y finalmente experimentan senescencia. En la senescencia, las células cesan de dividirse y mueren en cuestión de tiempo. La capacidad de las células para dividirse depende de varios parámetros que incluyen la especie de origen de la célula y la edad del tejido cuando se coloca en cultivo. Las células que experimentan senescencia no se pueden mantener en cultivo durante períodos prolongados de tiempo y por lo tanto no son huéspedes reproducibles para el crecimiento de concentrados de virus. Las células primarias generalmente experimentan entre 23-26 pasajes antes de llegar a la senescencia. Las células de esta invención preferiblemente se transfectan con p53 aproximadamente en el pasaje 2 a aproximadamente en el pasaje 4. Las células inmortalizadas, como se utilizan a través de esta invención, se refieren a células capaces de crecer en cultivo durante más de 25 pasajes. Las células inmortalizadas se diferencian de las células transformadas en que, a diferencia de las células transformadas, las células inmortalizadas muestran supresión de crecimiento dependiente de la densidad y mantienen una morfología normal. En contraste con las células inmortalizadas, las células transformadas son capaces de crecer en agar suave y habitualmente son capaces de formar tumores cuando se inyectan en animales de laboratorio. Las células de esta invención se inmortalizan por la introducción de p53 bajo el control de un promotor inducible de metalotioneína en células preferiblemente primarias. El oncogen nuclear p53 es el gen supresor de tumores mejor estudiado debido en parte al hecho de que las mutaciones en el gen p53 contribuyen de alguna manera a incrementar a 50% todos los cánceres humanos (Levine et al., Nature 351:453-456, 1991) . p53 es una fosfoproteína celular y con frecuencia se encuentra en concentraciones elevadas en células transformadas (De Leo, A.B. et al. Proc. Nati . Acad. Sci 76:2420-2424, 1979). p53 de tipo silvestre parece funcionar de manera supresora de crecimiento (Michalovity et al. Cell 62:671-680, 1990) y p53 suprime células en los puntos de verificación del ciclo celular en respuesta al daño a 7ADN (Kastan, et al. Cáncer Res . 51:6304-6311, 1991). La función de punto de verificación se lleva a cabo por la acumulación de p53 y la inducción subsecuente de los genes GADD45 (una importante proteína de reparación de cortes) , WAFl (p21) y MDM2 (la cual forma un complejo estable con p53) . (Kastan, et al. Cell 71:587-597, 1992) . Esta teoría es soportada por la observación de que las mutaciones en p53 pueden resultar en inmortalización celular. Varios informes relacionan la molécula p53 de tipo silvestre con la inhibición de la división celular mediante inhibidor universal de ciclina cinasas (es decir, Cipl, El-Deiry et al. Cell 75:817-825, 1993: WAFl por Harper et al., Cell 75:805-816, 1993). Los experimentos muestran que la proteína p53 estimula la producción de otra proteína, p21, la cual en células normales, está involucrada en un complejo cuaternario que incluye cinasa dependiente de ciclina, ciclina, antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) y p21. En células transformadas, la pérdida de la función de p53 parece deberse a mutaciones que llevan a la pérdida de p21 y PCNA a partir del complejo de multiproteína lo que resulta en un crecimiento incontrolado. Aunque las mutaciones en p53 se han asociado con la regulación de la proliferación celular, existen otras teorías que postulan otras rutas para la regulación de p53 de la proliferación celular. (Milner, et al. Cell Biol . Int . Rep. 4:663-667, 1980, Milner et al. 112:785-788, 1981, Mercer et al. Proc. Nati . Acad. Sci . 79:6309-6312, 1982 y Mercer et al. Molec. Cell . Biol . 4:276-281, 1984) . Por ejemplo, las mutaciones en el gen p53 pueden ser responsables para negar a las células la capacidad de reparar lesiones en las que se incurren durante los puntos críticos en el ciclo celular debido a los parámetros fisiológicos físicos tales como tinción, envejecimiento, de radiación ionizante o posición a carcinógenos . Se sabe en la técnica que p53 regula la proliferación celular. Existe cierta evidencia de que p53 de rata no mutado puede inmortalizar células de roedores. Jenkins et al. demostraron la inmortalización de condriocitos de rata únicamente cuando se utilizaron promotores constitutivos de virus tumorogénicos tales como el virus de sarcoma de rous (RSV) y el virus simio 40 (SV40) (Jenkins et al. Nature 317:816-818, 1985). Eliyahu et al. (Nature 312:646-649, 1984) y Parada, et al. (Nature 312:649-651, 1984) también fueron capaces de inmortalizar células de rata, pero sus datos contradicen a los de Jenkins et al y demuestran de los constructos que p53 no inmortalizan células cuando el gen p53 es transíectado sólo, pero los constructos de p53 generaron focos transformados cuando las células se cotransfectan con el oncogen ras. Aunque estas células tienen características de células transformadas, las células experimentan senescencia y dejan de multiplicarse dentro de un período de tiempo relativamente breve después de la transformación. A diferencia de Jenkins, Eliyahu y Parada (todos supra) , Rovinski y Benchimol ( Oncogene 2:445-452, 1988) demostraron la inmortalización de fibroblastos de embrión de rata utilizando p53 de rata bajo el control de su promotor endógeno. Los resultados publicados por Rovinski se pueden publicar por otros estudios que indican que las células de rata se sabe que experimentan fácilmente inmortalización y transformación. Se cree que las células son cebadas de alguna manera de modo que son particulármente sensibles a estímulos de inmortalización y transformación. Los estudios han demostrado de manera repetible que los fibroblastos de roedor inmortalizan espontáneamente a frecuencia elevada (Ponten, J. Virol . Monogr. 8:1, 1971; Ponten J. , Biochi , Biophys . Acta 458:397, 1976; Todaro y Green J. Cell Biol . 17:299-313, 163; Meek et al., Exp. Cell Res . 107:277-284 y Curatolo, et al., In Vi tro 20:597-601, 1984) . En realidad, Rovinski y Bechimol ( supra en la página 446) notaron que sus controles de fibroblastos de embrión de rata, transfectados con un marcador de expresión sólo y que tiene una frecuencia espontánea de inmortalización de aproximadamente 10%. En contraste, una revisión en Science y otros estudios indican que no hay informes de fibroblastos humanos o de pollo a partir de donadores normales que inmortalicen espontáneamente (Smith et al. Science 273:63-67 , 1996, Hayflick, Exp. Cell Res . 37:614-636, 1965 y Smith et al., Adv. Cáncer Res . 54:63-77, 1990). Además, las células de rata transportan una gran variedad de virus endógenos, particularmente retrovirus que los vuelve poco adecuados para producción comercial de vacunas . Existe una gran cantidad de genes p53 que se han aislado de diversos mamíferos, por ejemplo, la secuencia de p53 de pollo (SEC. DE IDENT. N0:1) está disponible de GenBank como número de acceso X 13057 y está disponible en la literatura a partir de Soussi, et al. (Nucí . Acids Res . 16(23) : 11383, 1988) . La secuencia de p53 humano normal está disponible de GenBank como números de acceso W88747 y HSP53G, y la clona está disponible al público a través de Washington University School of Medicine. El gen p53 humano también se proporciona como exones 1-11 como GenBank números de acceso M22881-M22884, M22887-M22888 M22894-M33898 y se publicó por Buchman, et al.

( Gene 70 (2) : 245-252 , 1988). La proteína p53 de caballo está disponible como GenBank número de acceso U37120 y de mono verde africano (GenBank número de acceso X16384) . La proteína p53 de mono rhesus está disponible como GenBank número de acceso L20442, la p53 de vaca como X81704 (véase también Dequiedt F. et al., PNA Seg. 5 (4) :261-64, 1995) y ?53 de gato está disponible como GenBank número de acceso D26608 (Okuda M. et al. Int . J. Cáncer 58(4):602-7, 1994)-. Otras secuencias y publicaciones en las que se hace referencia al uso de estas secuencias se pueden obtener de varias bases de datos de genes tales como GenBank y similares. Aquéllos familiarizados en la técnica serán capaces de reconocer en la literatura o en las bases de datos de genes para obtener las secuencias de genes para p53 que son conocidas en la técnica. El promotor de metalotioneína tiene muchas regiones de unión de metal y la expresión de genes regulados por el promotor de metalotioneína se puede inducir por Cd++, Cu++ y Zn++. El promotor contiene muchos sitios de unión potenciales para factores reguladores de metal y para factores de transcripción que incluyen SP1 y MLTF. Los elementos que responden a metal dentro de las regiones promotoras y otras regiones identificadas en el promotor se discuten con detalle por Mueller et al. ( Genes & Development 4 : 412-426, 1988) y Lee et al. (Nature 325:368-372, 1987). Al igual que los genes que codifican para p53, existen numerosos genes de metalotioneína de diversas especies que se conocen en la técnica. Por ejemplo, la secuencia del promotor de metalotioneína para pollos (SEC. DE IDENT. NO: 2) está disponible en la literatura de Fernando, et al. ( Gene . 8:177-183, 1989). La región promotora se puede identificar a partir de la secuencia del gen de metalotionelna de numerosas secuencias de gen de metalot.i oneína publicadas disponibles en la técnica, en base en las características publicadas del promotor de metalotioneína (Mueller et al . , supra y Lee et al . , supra) . La secuencia del gen promotor de metalotioneína humano está disponible de GenBank como W68639, X65607, V00594 (véase también Stennard et al. Biochim. Biophys . Acta 1218(3) : 357-365, 1994; Richards et al., Cell 37 ( 1) -.263-272, 1984 y Karin et al., Nucí . Acids . Res . 10 (10) :3165-3173, 1982). El promotor de metalotioneína en borrego está disponible de GenBank como número de acceso X04626 (véase Peterson et al., Eur. J. Biochem . 160 (3) :579-585, 1986). Otras secuencias y publicaciones que se refieren al uso de la secuencia se pueden obtener de numerosas bases de datos de genes tales como GenBank, GenEMBL y similares. Aquéllos familiarizados en la técnica serán capaces de investigar fácilmente en la literatura o en las bases de datos de genes para obtener las secuencias de genes para los promotores de metalotioneína que son conocidos en la técnica. Las células de esta invención se inmortalizan a través de la introducción de ácido nucleico que codifica para p53 dentro de las células en donde el ácido nucleico que codifica para p53 está bajo el control del promotor de metalotioneína, esto es, el promotor de metalotioneína está unido operablemente a ácido nucleico que codifica para p53. En una modalidad preferida de esta invención, se introduce en las células, en un reactor de expresión, p53 bajo el control del promotor de metalotioneína. Existen una- variedad de vectores de expresión disponibles comercialmente y aquéllos familiarizados en la técnica apreciarán con facilidad que se pueden utilizar diversos vector para expresar p53 en una célula animal diferente de roedor. El vector de expresión puede incluir diversas características adicionales que faciliten la replicación del vector en células procarióticas, selección del vector, integración de otras secuencias de genes o que faciliten la expresión del gen mediante la adición de otras secuencias reguladoras. Los ejemplos de estas características incluyen, pero no se limitan a la inclusión de un origen de replicación bacteriano, genes que confieran resistencia a antibióticos, otros marcadores seleccionables que incluyen pero que no se limitan a ß-galactosidasa, luciferasa o similares, secuencias alargadoras o mejoradoras, sitios de clonación múltiple y similares. El ejemplo 1 detalla la identificación de un promotor de metalotioneína y un gen p53 junto con la incorporación del promotor, p53 en un vector de expresión. Preferiblemente, el promotor de metalotioneína y el gen p53 son de la misma especie. El constructo de p53 bajo el control del promotor de metalotioneína se introduce en las células. Preferiblemente, las células son células primarias y las células primarias, como se utilizan en esta descripción, son preferiblemente células que han nacido en cultivo durante 1-10 pasajes y/o menos de 2 meses. Las células primarias generalmente son caracterizadas como células con una capacidad finita de crecer en cultivo. Las células primarias son aquéllas células aisladas de tejidos intactos y colocadas en cultivo. Las células se pueden obtener de numerosos tej idos a partir de una variedad de especies de mamíferos. Las biopsias humanas, muestras de tejido de perro, caballo, cerdo, pollo, vaca, tejidos embriónicos y similares pueden ser cortados en pedazos pequeños, digeridos con tripsina y aislados para transfección como células únicas en suspensión o como cultivos de monocapa o como muestras de tejido pequeño pero intacto. Las células aisladas adecuada para transfección incluyen fibroblastos, células musculares, células epiteliales, células endoteliales y otras. Aquéllos familiarizados en la técnica reconocerán que existen métodos bien conocidos para obtener y aislar una variedad de células de una diversidad de muestras de tejido y que estos métodos pueden llevarse a cabo sin experimentación indebida. El ejemplo 2 describe un método para aislar células de tejido embriónico de pollo que incluye células de la piel, músculo cardíaco y músculo del pecho. Existen numerosos métodos conocidos en la técnica para introducir un vector capaz de dirigir la expresión de una secuencia de ácido nucleico o para introducir un fragmento de ácido nucleico en las células. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a precipitación con CaP04, eleetroporación, técnicas de transfección con lipofectina, técnicas de transfección con poliamina y transfección con partículas virales. El ejemplo 3 proporciona un método para introducir los fragmentos de ácido nucleico de p53/metalotione-ína de esta invención en células eucarióticas utilizando lipofectamina. Están disponibles varios equipos comerciales que permiten que se incorporen fragmentos de ácido nucleico dentro de células eucarióticas utilizando diversos métodos. Por lo tanto, los métodos de introducción del ácido nucleico que codifica para p53 bajo el control del promotor de metalotioneína no se retractan del alcance de esta invención. Después de la transfección, las células de la invención se hacen crecer y se expanden bajo presión de crecimiento selectiva, si es necesario, para identificar clonas que contienen al fragmento de ácido nucleico transfectado. Las células tratan con los cationes necesarios para promover la expresión del promotor de metalotioneína. El ejemplo 3 utiliza ZnS04 para inducir el promotor de metalotioneína. Los focos de células se seleccionan y se hacen crecer en cultivo. El término "focos" se refiere a grupos de células que tienen características que son diferentes de las células circundantes. En esta invención, las células inmortalizadas por el fragmento de ácido nucleico que codifica para p53 bajo el control del promotor de metalotioneína crecen más rápidamente que sus contrapartes no inmortalizadas. Las células inmortalizadas crecen más rápidamente y forman grupos sobre las monocapas de cultivo primario. Estos grupos pueden ser aislados utilizando anillos de clonación y se pueden expandir en cultivo. Se considera que las células están inmortalizadas cuando se han experimentado aproximadamente 25 pasajes de cultivo de tejido después de la introducción del constructo que contiene p53/metalotioneína dentro de las células y cuando las células experimentan por lo menos aproximadamente 0.6 duplicaciones de población por día, y preferiblemente entre aproximadamente 0.6 y aproximadamente 1.5 duplicaciones de población por día. Las células mantienen una morfología normal y muestran densidad dependiente y/o crecimiento inhibido por contacto. Las células de tres tejidos de embriones de pollo fueron analizadas para determinar su capacidad para ser inmortalizadas por los métodos de esta invención. Se identificaron numerosas clonas de células de músculo cardíaco, células de músculo de pecho y células cutáneas se proporcionaron en el ejemplo 5. Las células inmortalizadas de esta invención deben ser examinadas para determinar contaminantes virales así como otros contaminantes de cultivo de tejido tales como contaminantes bacterianos a baja concentración, micoplasmas y similares. Las células pueden ser probadas para evidencia de infección retroviral, influenza aviar (tipo A) , reovirus aviar, adenovirus aviar (Grupos I-III) , virus de encefalomielitis aviar, viruela, virus de la enfermedad de Newcastle, Paramyxovirus (tipo 2) , así como Micoplasma, salmonella y otros contaminantes tales como los listados en 9 C.F.R. § 113 y sus subsecciones . Las células pueden ser probadas para una amplia gama de contaminantes virales utilizando la reacción en cadena de polimerasa para identificar fragmentos de ácido nucleico contaminante. Existen diversos equipos de prueba disponibles comercialmente para varios virus que pueden ser utilizados para determinar si las células de esta invención contienen virus contaminante. Similarmente, existen pruebas disponibles comercialmente para detectar antígeno viral, en donde el antígeno se deriva de una variedad de virus diferentes . Estas pruebas incluyen ensayos ELISA, ensayos inmunofluorescentes y similares. La totalidad de estos ensayos son bien conocidos e involucran técnicas experimentales habituales. Él ejemplo 4 proporciona un método para determinar si las células de esta invención son transcriptasa inversa negativas . La evidencia de actividad de transcriptasa inversa en células inmortalizadas que contienen p53 bajo el control de un promotor de metalotioneína es evidencia de contaminación por retrovirus . También se probaron las células para determinar su potencial tumorigénico. Las células de esta invención preferiblemente son no tumorigénicas. Las pruebas para determinar si una población de células- es tumorigénica, son conocidas en la técnica. El ejemplo 6 proporciona métodos para determinar el crecimiento de células inmortalizadas de esta invención en agar suave y el ejemplo 7 proporciona un método para introducir las células de esta invención en un animal que es preferiblemente especie para las células de esta invención, para determinar si las células de la invención son capaces de inducir tumores en los animales receptores . Para probar el potencial tumorogénico de células humanas que contienen ácido nucleico que codifica p53 bajo el control de un promotor de metalotioneína, las células pueden ser probadas para crecimiento en agar suave y se pueden probar para crecimiento en ratones atímicos o desnudos, o en ratones u otros animales de laboratorio con sistemas inmunes humanos reconstituidos. En un aspecto de esta invención, las células son útiles para propagar virus. Las células de esta invención soportan infección por reovirus, herpesvirus de pavo (HVT) y virus de la enfermedad de Marek, como se demuestra en el ejemplo 8. Las células de esta invención derivadas de tejido de pollo también sirven como huéspedes para virus de la enfermedad bursal infecciosa, virus de bronquitis infecciosa, virus de la enfermedad de Ne castle, virus de laringotráqueo infecciosa, una variedad de adenovirus que incluyen adenovirus tipo III, circodnaviridae, HSV de pollo, virus de viruela y otros. Numerosos virus humanos y animales crecen en huevos embrionados e incluyen, pero no se limitan a virus de rabia, parvovirus canino, virus de panleucopenia felina, virus calici, virus de hepatitis, virus de influenza, virus de varicela Zoster y un huésped de otros virus. Estos virus también se pueden probar para determinar su capacidad para crecer en células inmortalizadas de esta invención. Para producir un concentrado de virus, las células de esta invención se pueden sembrar en matraces de cultivo de tejido, botellas giratorias, cultivo giratorio o en reactores de fibra hueca. Para la propagación de virus en botellas giratorias, se siembran las células a aproximadamente 2-5 x 104 células/cm2 de área superficial. La multiplicidad de infección (proporción de partículas de virus infeccioso respecto a las células) para iniciar el crecimiento de virus concentrado variará en base a la cepa de virus. Aquéllos familiarizados en la técnica de virología y familiarizados con el crecimiento de virus particulares y cepas de virus serán capaces de maximizar el rendimiento de concentrado de virus mediante manipulación estándar de la multiplicidad de infección, temperatura, variaciones del medio y similares, sin experimentación indebida. Los métodos para recolectar los virus después de infección para obtener concentrados de virus infecciosos también varía con la cepa de virus. Los virus envueltos salen del medio de cultivo más lentamente que los virus no envueltos. Los concentrados de virus se pueden obtener a partir de medio de cultivo sólo o de lisados celulares acumulados con el medio acondicionado. Para virus líticos (aquéllos eficientes para Usar una célula durante la salida del virus) , recolección de medio de cultivo acondicionado (por ejemplo, medio agotado que contiene virus) después de una etapa de centrifugación suave para remover los residuos celulares, es suficiente. Nuevamente, los métodos para recolectar y guardar virus de una amplia gama de cepas de virus son bien conocidos en la técnica. Existen diversos métodos, también conocidos en la técnica, para cuantificar el crecimiento de virus a partir de un cultivo de células. Por ejemplo, el título de un concentrado de virus para miembros de la familia herpesvims y para una variedad de virus que producen focos de citopatología de una superficie de monocapa de células se cuantifican fácilmente por ensayo en placa (una unidad formadora de placa/ml de fluido de cultivo o como unidades formadoras de placa/dosis para cuantificación de virus de inoculo de vacuna) o como la dosis 50 infecciosa de cultivo de tejido (TCIDS0) . Los virus que producen lisis rápidamente se cuantifican mejor por TCID50 como la dosis o dilución de concentrado de virus capaz de infectar 50% de los cultivos en un período de tiempo definido. Los métodos para hacer crecer y cuantificar virus son bien conocidos en la técnica y las fuentes para enseñar métodos de cuantificación de virus son conocidas en Fields et al. (eds) Fundamental Virology 1991, Raven Press, New York o en Mandell, et al. (eds) . Principies and Practice of Infectious Diseases, 1985, John Wiley & Sons, New York. Las células de esta invención también son útiles para producir proteínas recombinantes que incluyen proteínas virales y similares . Los métodos para incorporar ácido nucleico que codifica para la proteína recombinante dentro de un vector de ácido nucleico bajo el control de elementos reguladores capaces de dirigir la expresión de una proteína en una célula eucariótica, tal como las células inmortalizadas de esta invención, son bien conocidos en la técnica. Los vectores de expresión son fragmentos de ácido nucleico replicables que pueden dirigir la expresión de una proteína recombinante. Están disponibles muchos vectores de expresión, que incluyen vectores retrovirales en la técnica, a través de publicaciones periféricas y proveedores comerciales. Los componentes de vector de expresión replicable generalmente incluyen, pero no se limitan a uno o más de los siguientes. Un origen de replicación, uno o más genes marcadores, elementos alargadores, elementos promotores, secuencias de señal opcionales y secuencias de terminación de transcripción. Los genes de selección o marcadores codifican proteína que sirve para identificar una población de células transformadas o transfectadas. Los genes de selección típicos codifican proteínas que contienen resistencia a antibióticos u otras toxinas, complementan deficiencias auxotróficas o suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos. Los vectores de expresión que tienen ácido nucleico que codifica para proteínas recombinantes se transfectan en células y se utilizan para dirigir la expresión de la proteína recombinante en las células inmortalizadas de esta invención. Preferiblemente el vector puede codificar cualquier proteína recombinante capaz de expresión en células de fibroblasto embriónico de pollo que incluyen, pero que no se limitan a proteína viral, que incluye transcriptasa inversa y/o proteína estructural viral. Los ejemplos de vectores para producir proteína recombinante en una célula incluyen vectores retrovirales para producir proteína supresora de tumores, o proteína estructural viral tal como aquélla descrita por Givol, et al. Oncogene 11 (12) : 2609-2618, 1995, Givol, et al. Cell Growth & Dif fer en iat ion 5 (4) :419-429 , 1994, Akiyama, et al. Virology 203(2) :211-220, 1994 y Boyer, et al. Oncogene 20:457-66, 1993. Las células de esta invención pueden servir como sustratos para expresar -virus recombinante, que incluyen, pero que no se limitan a retrovirus recombinante. Las células de esta invención pueden servir como líneas de células de empacado para virus sometidos a ingeniería genética útiles para terapia de genes, o similares. Los constructos y métodos para uso de una línea de células particular como una línea de células de empacado son conocidos en la técnica. Por ejemplo, Boerkoel, et al. ( Virology 195 (2) : 669-79, 1993) describen métodos para empacar virus utilizando fibroblastos embriónicos de pollo primarios como la línea de células de empacado. Estos mismos métodos pueden ser utilizados para empacar virus en las células inmortalizadas de esta invención. Puesto que la mayor parte de las líneas de célula de ave y las células de ave transformadas así como virtualmente todas las líneas de células transformadas de roedor contienen contaminantes virales tales como virus endógeno o producen proteína viral , no son adecuadas para la producción de vacunas humanas o animales. No se pueden utilizar las células para producir proteína recombinante debido a que los contaminantes endógenos pueden contaminar preparaciones de proteína recombinantes purificadas. Ventajosamente, las células de esta invención proporcionan una alternativa adecuada para estos problemas . Las células de esta invención también pueden servir como un sustrato para soportar el crecimiento de virus desde otras células. Estas otras células incluyen células primarias, o células cultivadas que muestran crecimiento mejorado o longevidad en cultivo en presencia de otras células o en presencia de proteínas de matriz extracelular tales como colágenos, lamininas y similares. En una modalidad, las células se mezclan con virus y después se mezclan con las células de esta invención preferiblemente en una proporción de células: respecto a células de esta invención de aproximadamente 1 : 5 células hasta aproximadamente 1:20 células, y de manera más preferible en una proporción desde aproximadamente 1:10 (una célula respecto a aproximadamente 10 células de esta invención. Las células mezcladas después se colocan en cultivo. En una segunda modalidad, las células se mezclan con virus y se siembran en placas sobre la superficie de las células inmortalizadas de esta invención que ya están unidas a una superficie de cultivo de tejido. Las células de esta invención sirven como soporte para las otras células y, sin intentar limitar el alcance de esta invención, las células de esta invención pueden suministrar factores de crecimiento y similares así como componentes de matriz extracelular y similares para soportar a las otras células mientras producen virus. El ejemplo 9 proporciona un ejemplo de uso de las células de esta invención como un sustrato celular. Todas las referencias mencionadas en la presente se incorporan expresamente como referencia dentro de esta descripción. Las modalidades particulares de esta invención se discutirán con detalle y se ha hecho referencia a las posibles variaciones dentro del alcance de esta invención. Existen diversas técnicas alternativas y procedimientos disponibles para aquéllos familiarizados en la técnica las cuales de manera similar permiten realizar con éxito la invención propuesta.

Ejemplo 1 Preparación del vector de expresión p53 ejemplar Se construyó el plásmido pJFNII (5436 pb) al comenzar con el vector pBluescript SK (Stratagene, LaJolla, CA) . El sitio de clonación múltiple y el gen lacZ se removieron utilizando PvuII. El fragmento vector de 2513 pb se trató con fosfatasa alcalina de intestino vacuno. El fragmento después se trató con EDTA, se incubó a 65 °C y se extrajo con fenol/cloroformo seguido por precipitación con etanol. El plásmido pRSVneo (Gorman, C, et al. Science 221 : 551-553, 1983) se digirió con Bam Hl y Ndel . El fragmento se trató con el fragmento Klenow de AD? polimerasa (Stratagene, LaJolla, CA) y se ligaron los extremos romos con el fragmento de vector de 2513 pb. Después del aislamiento de esta clona, el vector se digirió con EcoRI, se trató con el fragmento Klenow y se volvió a ligar. Esta digestión removió el sitio EcoRI de la región promotora. Se denominó el plásmido pJF?II (véase la figura 1) . Se cortó pJF?II con BamHl en el sitio del vector a aproximadamente 1000 pb hacia el extremo 3' desde la señal de poliadenilación SV40 utilizada por el gen que codifica para resistencia a neomicina. Se obtuvo el promotor de metalotioneína de pollo utilizando PCR. Se utilizaron los siguientes cebadores o iniciadores en reacciones de cadena de polimerasa (PCR) para obtener el promotor de metalotioneína. Cebador izquierdo 5 ' CGAAGATCTCTCAGCACGGCCCCACGCT 3' (SEC. DE IDENT. NO : 3 ) Cebador derecho 5 ' CGAAGATCTTTATTCTCGAGATATCGAATTCT CGGGTGGGCTCGTAGCAGT 3' (SEC. DE IDENT. NO: 4) En estos experimentos, la plantilla para la reacción por PCR fue el plásmido pCBcMTlacZ . El promotor inducible por metalotioneína de pollo (Fernando y Andrés, Gene 81:177-183, 1989) en el plásmido pCBcMtlacZ se obtuvo del Dr. Ann Gibbins (University of Guelph, Guelf , Ontario, Canadá) . Aquéllos familiarizados en la técnica apreciarán que el promotor también se puede identificar a partir de bibliotecas de expresión del gen para obtener el promotor de otras especies, incluyendo al pollo. Los cebadores se adquirieron de IDT (Coralville, IA) . Tanto el cebador izquierdo como el derecho se diseñaron para incluir a los sitios Bglll . La amplificación utilizando estos cebadores generó el promotor de metalotioneína contenido dentro del fragmento de ácido nucleico que corresponde a la SEC. DE IDENT . NO : 2. La secuencia promotora de metalotioneína de pollo preferida (SEC. DE IDENT. NO: 2) es : 5' CT CTCAGCACGG CCCCACGCTG TGCGCACCGC CTCGCAGCGC GGCCCGGGGG GGTGGCGGGG GTGGGAGCAG CAGTGGCGCA ATGACCCCTC CGGGTCACAT TCCCGCAACC GAGCGCAGAG TGCGTGGCCG GGAAATTCCC CCCCCCCAAT TCGCCTTTCG GCAGCCAAAG CGGGAGGGGG GGAGTGAGGA GGGTCAGGCA CGTTGGGGTC CGTGCCGTGT TCTGGCAAAG TGTCGTGTTT GGGGGGGGGG GGGAGCAAGG AAGGGAGGCG AGGGGTGAGG ACACAAAGCA AAAGCGCCCT AAATCTGTTG GCACACATGG CCATCCCACA GCTGTATCCC CCTGCTTTGG GGGAACCCCA ACACCAGGGC TGGCCCCGCG GTGAGGCTCC CCCCAGGCAG GGGGCACGGC CGTGACCCCG CTGAGCACGG CACGGCGCTG CCCCGCCCCG CTGAGCACGG CACGGCACGG CACGGCACGG CCCCCCGAGC ACGGCTCAGC ACGGCACGGC GCTCAGCACG GCACGGATCG GCACCGCCCC GCCGTGCGCT GCGCGCAGCA CCACCCCGGC CCTATAAATA CAGGGCGGGC AGCGGGACTC GGGACTGCTA CGAGCCCACC CGAG3 ' Este promotor contiene tres elementos reguladores de metales principales, las regiones de caja GC y una caja TATA.

Los elementos reguladores de metal unen metal e inducen al gen de metalotioneína de pollo colocado hacia el extremo 3d El fragmento de metalotioneína amplificado que incorpora las partes terminales Bgll de los cebadores izquierdo y derecho se liga en pJFNII utilizando BairíRI . La clona de vector identificada a partir de esta ligación se selecciona por su capacidad para conferir resistencia a neomicina. La clona se denominó pJFNIIcMTD y es de aproximadamente 6088 pb. El vector incluye sitios múltiples de clonación que incluyen a EcoRI, EcoRV y Xhol . Una señal de poliadenilación dentro del cebador derecho permite la expresión eficiente de secuencias de ADN que carecen de esta señal . El ADNc para p53 de pollo (SEC. DE IDENT. N0:1) proporcionado como inserto por ScoRI a partir de T. Soussi (GenBank acceso #X13057) se incorporó en pJFNIIcMTD en el sitio de endonucleasa de restricción EcóRI en el sitio de clonación múltiple. La secuencia de ADNc (Soussi et al., Nucí . Acids .

Res . 16:11383, 1988) contiene 64 pb de la región no traducida 5' (UTR), un marco de lectura abierta de 1101 pb que codifica para una molécula de 367 aminoácidos, un UTR 3' 390 y una cola pequeña poli-A. p53 de pollo tiene aproximadamente 47% de homología con el homólogo humano. Se obtuvo un ADNc para p53 de pollo de inserción de 1555 pb que contiene extremos cohesivos EcoRI y el constructo cMT (metalotioneína) /SK+ se digirió con EcoRI . El inserto de ADNc de p53 de pollo se ligó en el sitio EcoRI . Se identificaron las clonas que contienen al inserto p53 en la orientación directa (con sentido) . El constructo se transfectó en células E. coli XL-1 Blue competentes (Stratagene) y creció en caldo LB más ampicilina, durante la noche. Se aislaron los plásmidos por el método de preparación de plásmido máximo de Sambrook et al . (Molecular Cloning, A Laboratory Manual , 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Se purificó el ADN plasmídico dos veces por centrifugación en CsCl2, antes de la transfección.

Ejemplo 2 Aislamiento de células primarias de tejido intacto Los embriones de pollo de la linea SPAFAS embriónicos (HyVac, Abel, IA) fueron la fuente de células primarias para estos experimentos. Los huevos y sus capas fueron certificados por el proveedor como negativas para influencia aviar (tipo A) , reovirus aviar, adenovirus aviar (grupos I-III) , virus de encefalomielitis aviar, viruela, virus de la enfermedad de Newcastle, paramixovirus (tipo 2) , micoplasma, salmonela y otros agentes infecciosos conocidos que infectan a los concentrados de aves . Los huevos fertilizados se incubaron en un incubador aislado esterilizado y se procesaron embriones de 10 días de edad y de 19 días de edad para establecer los cultivos primarios. Se utilizaron tres embriones SPAFAS de 10 días de edad para obtener células del corazón, hígado, piel y músculo (pecho y muslo) . También se utilizó un embrión de 19 días de edad para establecer cultivos de piel primarios. El tejido embriónico se disoció utilizando una solución de tripsina/EDTA y se sembró en placas en medio DMEM (Gibco) que contiene 10% de suero bovino fetal (Gibco) . 1% de antibiótico/antimicótico (Gibco) que contiene L-glutamina 2 mM (Gibco) . La suspensión celular disociada se colectó in tubos de centrífuga de 50 ml que contiene 10% de suero bovino fetal para inactivar la tripsina y se centrifugó a 700 x g durante 10 minutos. Las células se resuspendieron en 10 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco enriquecido con 36 µg/ml de insulina (Sigma), 1.6 µg/ml de transferrina (Sigma, St. Louis, MO) , L-glutamina 2 mM, 10% de suero bovino fetal, 1% de solución de antibiótico/antimicótico y se pipetearon en 4-5 recipientes de 100 mm2 a aproximadamente 1 x 106 células/recipiente, y se incubaron a 40.5°C en C02 al 5%, 95% de aire. Después de 24 horas de incubación, se cambió el medio . Se permitió que los cultivos crecieran hasta confluencia (5 días) y se removieron de las placas utilizando una solución de tripsina/EDTA (0.05% de tripsina y 0.02% de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en PBS) y se volvieron a sembrar en placas para el segundo pasaje. Los concentrados de células se congelaron en nitrógeno líquido.

Ejemplo 3 Transfección del constructo de promotor p53/metalotioneína en células Las células de piel de pollo primarias de ELL-0 de embriones de 19 días se transformaron del primero al segundo pasaje. Las células se sembraron en placa a una densidad de 5 x 102 células en recipientes de 100 -mm2 con DMEM alta en glucosa más 10% de suero bovino fetal certificado y enriquecido con 1.6 µg/ml de transferrina (Sigma, St . Luis, MO) , 36 µg/ml de insulina (Sigma) y antibióticos. Las células se hicieron crecer durante la noche para estabilizar los cultivos y se volvieron a alimentar la mañana siguiente con 9 ml de medio y se transfectaron utilizando lipofectamina Transit II utilizando las instrucciones del empaque (Pan Vera Corporation, Madison, Wl) . Cada transfección utilizó 10 µg del constructo p53 purificado. Las células se transfectaron durante 5 h y se cambió el medio utilizando antibióticos seleccionables G418 (Sigma, St. Louis, MO) a 600 µg/ml. Las células transfectadas fueron sometidas a pasaje en medio selectivo hasta que se desarrollaron focos (habitualmente 4-10 días) y los focos fueron seleccionados clonalmente y propagados. Las células se hicieron crecer por 2-3 pasajes para generar un foco de células (aproximadamente 103-104) resistentes a G418 (600 µg/ml) . Las células se dividieron inicialmente cuando se necesitó a 5 x 105 células/recipiente de 100 mm2 para evitar influencias de densidad de sembrado en placa sobre los efectos de la expresión de p53. Las células control no infectadas fueron transfectadas en falso con un plásmido control . Las células control senescieron y murieron en el pasaje 12. Las células se hicieron crecer en medio selectivo de ZnS04 50 µM durante dos semanas hasta que las células transfectadas de manera estable comenzaron a proliferar. Varios recipientes de cultivo control no recibieron sulfato de zinc (no hubo inducción del promotor de metalotioneína) . Después de dos semanas de realimentación (cuatro semanas post-transfección) comenzaron a aparecer focos de células fenotípicamente diferentes que crecían más rápidamente que las células que se observaban más viejas circundantes. Después de realimentaciones adicionales, uno de los focos de las células cutáneas transfectadas demostró células que crecían rápidamente. Se removieron aproximadamente 5 x 104 células/foco de la placa de cultivo utilizando un anillo de clonación. Estas células se transfirieron a una placa de seis pozos. Dos recipientes de células casi en confluencia crecieron en presencia de zinc y se dividieron en seis recipientes a 2 x 10s células/recipiente con la adición de zinc 50 µM. Las células cutáneas se propagaron cada 3-4 días en presencia de zinc a 1 x 105 células/cm2, hasta el pasaje 17. Hubo una disminución en la población de duplicaciones aproximadamente en el pasaje 20-22 y un incremento posterior nuevamente a aproximadamente 0.7 a aproximadamente 1.0 duplicaciones de población por día. Los focos de células también se obtuvieron de células cutáneas transfectadas aisladas de embriones de pollo de 10 días de edad. Los resultados de este experimento son sorprendentes debido a que p53 es bien sabido en la literatura que es un supresor de tumorigénesi's y es un regulador del crecimiento.

Los cultivos duplicados de células cutáneas se transfectaron con un constructo idéntico que contiene un fragmento de gen p53 antisentido. Las células transfectadas con ese constructo no experimentaron inmortalización. Para músculo cardíaco primario y células de músculo de pecho, los cultivos congelados se recalentaron y se sometieron a pasaje. Se transfectaron 8 x 106 células (40-70% de confluencia) en cada tipo de célula con el constructo p53 directo con el compuesto poliamina, lipofectamina Transit II (Pan Vera Corporation, Madison, Wl) en el pasaje 2. Las células no transíectadas se mantuvieron como un control de crecimiento positivo y como un control de muerte celular negativo (cultivos con adición de G418) . Para la transfección, se agregaron a gotas 2-12 µl/µg de ADN en 100 µl de medio libre de suero (RPMl 1640, Life Technologies) . La mezcla se combinó suavemente y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos . Se diluyeron 1-3 de ADN en el reactivo Transit II suministrado por el fabricante y se incubó durante 6 horas. Las células se lavaron y volvieron a alimentar. Después de un período de recuperación de 24 h, las células tanto cardíacas como del pecho se dividieron en 4 recipientes, cada uno de 3 x 10s células y se colocaron bajo selección con G418 de inducción de zinc. Se identificaron en los cultivos de prueba focos de células . No se obtuvieron focos de los recipientes control que recibieron 50 µM de zinc.

Ejemplo 4 Prueba de células que contienen el constructo p53 para determinar contaminantes de virus Se probaron las células para actividad de transcriptasa inversa. Se aislaron 1 x 106 células de cultivos de crecimiento rápido en 4 ml de medio . El medio se tomó a través de varios procesos de enfriamiento y recalentamiento a -80 °C para lisar las células. El medio con las células Usadas se estratificó sobre un gradiente de glicerol al 10%. El gradiente se hizo girar durante 60 minutos a 40,000 rpm utilizando un rotor SW40 (Beckman Instruments, Pal Alto, CA) . Las partículas de virus, en caso de estar presentes, sedimentaron. Se desechó el medio y el sedimento se resuspendió en 20 µl de Nonidet P-40 (Sigma Chemical Co . , St. Louis, MO) . Se calentó un tubo eppendorf a 41 °C. Se agregaron µl de muestra a 45 µl de mezcla de transcriptasa inversa que contiene Tris 45 mM, pH 7.8, 2 ß-mercaptoetanol 2 mM, acetato manganoso 2 mM, Tritón X-100 al 0.1%, 10 µM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP (Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN) , 2.4 µg de poliA (Sigma), 60 ng de cebador dT 12-19 (Pharmacia), 0.4 µCi/reacción de 3H trifosfato de timidina (15,000 a 28,000 cpm/pmol de actividad, Amersham).

La reacción se mantuvo durante una hora a 41°C. Un control negativo utilizó 5 µl de ddH20 y 45 µl de mezcla. Se incluyeron con el ensayo dos controles positivos conocidos. Los ensayos se detuvieron al agregar 1 ml de ácido tricloroacético al 10% (TCA, Columbus Chemical Industries, Inc., Columbus, Wl) . La mezcla se filtró a través de prefiltro de 0.45 micrómetros de vidrio Whatman GF/C. Se realizaron varios lavados utilizando TCA a 5%. El filtro se transfectó a un recipiente de centelleo que contiene 5 ml de fluido de conteo de centelleo. Las muestras se contaron en un contador de centelleo de Beckman Instruments utilizando un ajuste de intervalo de 0.50 a 600. Se consideró positivo un incremento de tres veces las cuentas con respecto a la mezcla de fondo (control negativo) . Los cultivos primarios demostraron ser negativos como las demás otras células utilizadas en esta invención. Para información adicional respecto a los ensayos de transcriptasa inversa véase (Crittenden, et al. Virology 57:128-138, 1974).

Ejemplo 5 Identificación de células inmortalizadas Las células fueron caracterizadas como inmortales cuando habían experimentado más de aproximadamente 25 pasajes en cultivo de tejido posterior a la inducción del constructo que contiene p53/metalotioneína en células y experimentaron aproximadamente 0.6 a aproximadamente 1.5 de duplicaciones de población por día. Esta velocidad se comparó con la última etapa no tratada (es decir, células que no habían recibido al constructo promotor de p53/metalotioneína) controles que tenían velocidades de duplicación de población de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.2 duplicaciones de población/día. Las células cutáneas que recibieron el promotor de p53/metalotioneína actualmente están en el pasaje 70 después de la introducción de constructo del gen dentro de las células. Se identificaron más de 20 clonas inmortalizadas en el procedimiento de transíección. Las células fueron morfológicamente normales y se inhibían por contacto. Las células de músculo de pecho actualmente están en el pasaje 52, son morfológicamente normales, demuestran crecimiento inhibido por contacto y actualmente tienen una velocidad de duplicación de población de aproximadamente 0.72. Se seleccionaron 13 clonas para análisis. Las células del corazón actualmente están en el pasaje 20, son morfológicamente normales, son inhibidas por contacto y tienen una velocidad de duplicación de población promedio de 0.6. Varias de las clonas tienen velocidades de duplicación de población de entre aproximadamente 0.8 y 1.1. Se seleccionaron más de 10 clonas para estudio posterior.

Ejemplo 6 Ensayo de formación de colonias en agarosa suave para determinar el potencial tu origénico de las células Para probar el potencial tumorigénico, las células transfectadas con el promotor p53/metalotioneína se probaron para determinar el crecimiento en agar suave. Se fabricó una base de agarosa suave al mezclar 12 ml de una solución de agarosa al 2% (que ha sido sometida a autoclave previamente y enfriada a 56°C) en 21.6 ml de medio 5A de McCoy enriquecido [BRL/Gibco, 120 ml de suero bovino fetal (inactivado por calor, 5 ml de piruvato de sodio, (concentrado de 2.2%), 1 ml de L-serina (concentrado de 21 mg/ml) , 5 ml de L-glutamina (concentrado de 200 mM) , 12.5 ml de hepes (concentrado ÍM) ] , 5.9 ml de asparagina (concentrado de 4.4 mg/ml esterilizado por filtración) . Se virtieron 7 ml de medio tibio/agarosa en un recipiente de cultivo de tejido de 100 mm2 y se permitió que solidificara a temperatura ambiente en una campana de cultivo de tejido durante 1 h. Las células fueron removidas de crecimiento activo (desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 70% de confluencia) por tripsinización para obtener una suspensión de células únicas en medio DMEM fresco que contiene suero bovino fetal al 10% (con L-glutamina y antibióticos-antimicóticos) .

Se agregaron aproximadamente 1 x 106 células a 4.2 ml de medio (DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal, 0.75 ml de agarosa al 1% y 50 µl de 2 ß-mercaptoetanol . Se tiene cuidado de que el medio caliente/agarosa esté a 42 °C antes de agregar las células. Rápidamente, se superpusieron 5 ml de la suspensión celular anterior sobre las placas de agarosa. Las células se hicieron crecer a 37°C en C02 al 5% y aire al 95% en incubador, y se observaron durante 35 días. Las placas por duplicado se tiñieron con clorito de 3 p-nitrofenil-5-feniltetrazolio (tinción INT) y se examinaron los días 0, 5, 10, 15, 20, 30 y 35 para determinación de formación de colonias y crecimiento. Todas las colonias teñidas de más de 60 µm se consideraban positivas. Todas las células probadas fueron negativas. Información adicional relacionada con el ensayo de agar suave está disponible de Hamburger, et al. Prog. Clin . Biol . Res . 48: pps 43, 135, 179, 1980.

Ejemplo 7 Tumorigenicidad de células inmortalizadas Bajo las líneas de guía delineadas en el University of Minnesota Animal Usage Protocol (protocolo #950300-1, marzo de 1995-diciembre de 1996) las células fueron inyectadas en los animales de prueba para determinar si las células eran o no tumorigénicas . Para demostrar el potencial tumorigénico de p53 de pollo bajo el control del promotor de metalotioneína de pollo, se inyectaron células inmortalizadas en pollos. Se removieron las células que crecen activamente de las placas de cultivo celular y se inyectaron en seis pollos adultos de la línea SPAFAS. Las inyecciones subcutáneas de 4 x 106 células se colocaron en la nervadura del ala de los pollos. Se examinaron los sitios de inyección semanalmente durante 3.5 meses. No se observaron tumores en el sitio de inyección para ninguna de las células transfectadas (piel, corazón y músculo) producidas hasta la fecha y todos los animales permanecieron sanos .

Ejemplo 8 Propagación de virus en líneas de células p53/metalotioneína Se probaron estas células para determinar su capacidad de soportar la producción de virus. Se infectaron 2.5 x 108 células que contienen el constructo promotor p53 /metalotioneína con WSS-Reo 1733 cepa de reovirus que tiene un título de 8.2 TCID50/ml . Las células se infectaron a una multiplicidad de infección de 0.005, 0.001 ó 0.0005 partículas infecciosas del virus/célula. Las células infectadas crecieron en frascos giratorios y se probaron a las 48, 64 y 72 horas después de la inyección y demostraron crecimiento viral productivo. Las células también se sembraron en frascos giratorios a 2.0 x 104 células/cm2. Los frascos giratorios se incubaron a 37 °C durante 8 días en un recipiente giratorio ajustado a 0.4-0.5 rpm. Las células se infectaron con herpesvirus de pavo (virus HVT, cepa R2/23) . Las células se infectaron a una multiplicidad de infección de 0.001 cuando había aproximadamente 1.33 x 107 células en los frascos giratorios. Las células se recolectaron desde aproximadamente 90 hasta aproximadamente 96 horas cuando aproximadamente 40% de la monocapa presentaba evidencia de citopatología asociada con infección. Las células hicieron crecer y se mantuvieron en DMEM con FBS irradiado ? Hyclone al 10%, 2.5 g/1 de TPB, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 0.10 mg/ml de estreptomicina, 0.25 µg/ml de amfotericina B, 1.6 mg/l de insulina y 1.6 mg/l de transferrina. Los estudios iniciales demostraron que las células producen aproximadamente 1.4 x 104 ufv/ml. Las células también fueron capaces de soportar la replicación del virus de la enfermedad de Marek.

Experimento 9 Uso de células cutáneas transfectadas como un sustrato celular Las células de esta invención son útiles como sustrato para soportar la replicación viral de células primarias. En estos experimentos, se mezclan células cutáneas inmortalizadas p53 con células primarias. En un estudio, las células primarias se infectan y se mezclan con las células inmortalizadas y se colocan en cultivo, y en otro estudio las células primarias se infectan y colocan sobre las células inmortalizadas en donde las células inmortalizadas ya están colocadas como una capa en el matraz de cultivo de tejido. En un ejemplo, el virus es el virus del síndrome de huevo caído, y las células primarias son células hepáticas embriónicas de pollo primarias. En un segundo ejemplo, las células primarias son células endoteliales, preferiblemente células endoteliales renales, y el virus es el virus de bronquitis infecciosa. La proporción preferida de células primarias respecto a células imortalizadas es de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:20 y de manera más preferible de aproximadamente 1:10. Los títulos de virus de las células primarias que crecen en la población de células mezcladas es mayor que los títulos de virus de células primarias en cultivo cólo. Las células inmortalizadas permiten que las células primarias se utilicen para propagación de virus bajo condiciones comerciales. Aunque se han descrito con detalle modalidades particulares de la invención, será evidente para aquéllos familiarizados en la técnica que estas modalidades son ejemplares en vez de limitantes, y que el alcance verdadero de la invención es aquél definido por las reivindicaciones que siguen. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES - Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en lo siguiente: 1. Un método para transformar células de pollo primarias, caracterizado porque comprende las etapas de: colocar ácido nucleico que codifica para p53 bajo el control de un promotor de metalotioneína en un vector genético capaz de dirigir la expresión de p53; introducir el vector genético en células de pollo primarias; y seleccionar focos de células con tiempos de duplicación de población de aproximadamente 0.6 a aproximadamente 1.5 de duplicaciones de población por día, en donde las células son negativas a transcriptasa inversa y no son tumorigénicas .
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células son células cutáneas .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células son células de músculo de pecho.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células son células de músculo cardíaco.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células son fibroblastos.
6. 6. Un método para propagar virus, caracterizado porque comprende las etapas de: poner en contacto por lo menos una partícula de virus infecciosa con por lo menos una célula de un cultivo de células de pollo inmortalizadas, en donde las células del cultivo contienen un vector genético que expresa p53 bajo el control del promotor de metalotioneína; y colectar el virus producido por las células .
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el virus es reovirus.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el virus es herpesvirus de pavos .
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el virus es el virus de viruela.
10. 10. Un método para propagar el virus, caracterizado porgue comprende las etapas de : poner en contacto por lo menos una partícula infecciosa de virus con una célula primaria; hacer crecer las células primarias con células de pollo inmortalizadas qué contienen un vector genético que expresa p53 bajo el control del promotor de metalotioneína en el cultivo celular; y colectar el virus producido del cultivo celular.
11. 11. Células de pollo no transformadas, inmortalizadas, caracterizadas porque contienen p53 bajo el control del promotor de metalotioneína y que contiene por lo menos un vector capaz de dirigir la expresión de proteína recombinante en las células .
12. 12. Las células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque expresan la proteína recombinante .
13. 13. Las células de conformidad con la reivindicación 12, caracterizadas porque el vector codifica por lo menos una porción del virus recombinante.
14. 14. Las células de conformidad con la reivindicación 11, caracterizadas porque el vector es un vector retroviral .