MXPA98010218A

MXPA98010218A - Acido desoxirribonucleico que codifica para la dihidrofolato reductasa-timidilato sintetasa de neospora

Info

Publication number: MXPA98010218A
Application number: MXPA/A/1998/010218A
Authority: MX
Inventors: Rajendra Krishnan Balakrishnan; Ann Durtschi Becky; Christine Yoder Susan
Original assignee: Brunswick Bowling & Billiards Corporation
Priority date: 1997-12-04
Filing date: 1998-12-03
Publication date: 2000-04-24

Abstract

La presente invención proporciona moléculas de polinucleótidos aisladas que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína DHFR-TS de Neospora, siendo estas moléculas de polinucleótidosútiles en la preparación de vacunas vivas modificadas contra la neosporosis, y como reactivos diagnósticos. La presente invención proporciona además vectores de clonación y expresión, células hospedadoras transformadas, proteínas DHFR-TS sustancialmente purificadas y fragmentos peptídicos, constructos genéticosútiles para la delección dirigida de un gen, y composiciones de vacuna.

Description

ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO QUE CODIFICA PARA LA DIHIDROFOLATO REDUCTASA-TIMIDILATO SINTETASA DE NEOSPORA 1.- CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuadra en el campo de la salud animal y se refiere a las composiciones de vacunas y a los diagnósticos de una enfermedad. Más especialmente, la presente invención se refiere a las moléculas de polinucleótido que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican para la proteína dihidrofolato reductasa-timidilato sintetasa (DHFR-TS) de Neospora, siendo estas moléculas de polinucleótidos útiles en la producción de vacunas contra la neosporosis y como reactivos diagnósticos. 2.- ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Neospora de un protozoo parásito patógeno de animales que ha sido reconocido como la principal causa de aborto, muerte neonatal, infección congénita y enfermedad encefalítica en mamíferos. Dubey and Lindsay, 1996, Vet . Parasitol . 67:1-59; Dubey and Lindsay, 1993, Paraditology Today, 9:452-458. N. caninum infecta a perros e infecta congénitamente a los a los cachorros, provocando a menudo parálisis. Los taquizoítos de N. caninum han sido aislados a partir de cachorros infectados de forma natural. Linday and Bubey, 1989, J. Parasitol. 75:163- 165. Neospora es la principal causa de aborto en las vacas lecheras . También se ha informado de casos de enfermedad relacionada con Neospora, es decir, neosporosis, en cabras, ovejas y caballos. Aunque N. caninum es similar superficialmente al patógeno Toxoplasma gondii, N. canunum y T. gondii se ha distinguido uno de otros antigénica y ultraestructural ente . Dubey and Lindsay, 1993, más arriba. Asimismo, se vio que los parásitos protozoarios del tipo Neospora aislados de los cerebros de fetos bovinos abortados y cultivados continuamente in vitro eran antigénica y ultraestructuralmente distintos de T. gondii y Hammondia hammondi , siendo más similares a N. caninum. Conrad y otros, 1993, Parasitology 106:239-249. Asimismo, e análisis de los genes nucleares del ARN ribosomal de la subunidad pequeña no reveló ninguna diferencia en cuanto a nucleótidos entre las cepas de Neospora aisladas de vacas y de perros, pero sin embargo presentaban unas diferencias evidentes entre Neospora y T. gondi . Marsh y otros, 1995, J. Parasitol. 81:530-535. Se ha confirmado el papel etiológico de un aislado bovino de Neospora en el aborto bovino y en la enfermedad congénita. Barr y otros, 1994, J. Vet. Diag. Invest. 6:207-215. Se ha desarrollado un modelo en roedores de neosporosis en el sistema nervioso central utilizando ratones BALB/c endogámicos infectados con N. caninum, Lindsay y otros, 1995. J. Parasitol. 81:313-315. Asimismo, Colé y otros, 1995. J. Parasitol. 81:730- 732 y Long y otros, 1996, J. Parasitol, 82:608-611 has descrito modelos para estudiar la transmisión transplacentaria de N. caninum en ratones hembra preñadas exogámicas y endogámicas respectivamente. Asimismo, Lindsay y otros, 1995, Am. J. Vet. Res. 56:1176-1180 ha demostrado un modelo experimental en cabra pigmea con N. caninum que se parece mucho al aborto en las vacas inducido por Neospora adquirida de forma natural . En protozoos tales como T. gondii y Neospora, se sabe que las enzimas metabólicas esenciales dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidilato sintetasa (TS) residen en la misma molécula de proteína en dos dominios enzimáticos distintos, es decir, "el dominio DHFR" y el "dominio TS" . Se ha descrito que en T. gondii los dominios DHFR y TS están separados por una región de unión de - 70 aminoácidos. Roos, 1993, J. Biol. Chem. 268:6269-6280. Esta proteína bifuncional ha servido en al menos una especie de parásitos como una diana de deleción para crear una cepa atenuada para su uso en una vacuna viva. Así, Titus y otros, 1995, Proc. Nati. Acad. Sci. 92:10267-10271 describe la delección dirigida por recombinación homologa del gen DHFR-TS del protozoo parásito Leishmania mejor para producir células mutantes dhfr-ts nulas para su uso en una vacuna contra una cepa virulenta de L. mejor. 3.- SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un aislado de molécula de polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína DHFR-TS de Neospora. En una realización preferida, la proteína DHFR-TS de Neospora contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS como la presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) . En una realización no limitante, el aislado de la molécula de polinucleótido contiene la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS de Neospora. En una realización preferida, el aislado de la molécula de polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS de Neospora contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:l desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199 o una secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS como la presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) . En otra realización no limitante, la molécula de polinucleótido que codifica para la proteína DHFR-TS comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. La presente invención proporciona además un aislado de molécula de polinucleótido que es sustancialmente homologa a una molécula de polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS como se ve en la SEQ ID N0:1 desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 0199, o la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS como la presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO : 2. La presente invención proporciona además un aislado de una molécula de polinucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que es sustancialmente homólogo a una proteína DHFR-TS de Neospora que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS como la presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) . La presente invención proporciona además una molécula de polinucleótidos que consiste en una secuencia de nucleótidos que es una parte sustancial de cualquiera de las moléculas de polinulcleótidos anteriormente mencionadas. En una realización preferida, la molécula de polinucleótidos consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de péptido de una cualquiera de las proteínas DHFR-TS de Neospora anteriormente mencionadas o polipéptidos sustancialmente homólogos, tales como un polipéptido que consiste en el dominio DHFR o el dominio TS de la proteína DHFR-TS. Además de las secuencias de nucleótidos de cualquiera de las moléculas de polinucleótidos relacionadas con las proteínas DHRF-TS anteriormente mencionadas, las moléculas de polinucleótidos de la presente invención pueden comprender además, o como alternativa pueden consistir en secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural al gen DHFR-TS in situ en N. caninum, tales como, por ejemplo las secuencias de nucleótidos flanqueantes mostradas en la SEQ ID N0:1 o partes de la misma. La presente invención también proporciona composiciones y procedimiento para la clonación y expresión de una molécula de polinucleótido de la presente invención, incluyendo vectores de clonación, vectores de expresión y células hospedadoras transformadas que contienen dichos vectores. En una realización no limitante, la presente invención, proporciona un vector de clonación que contiene una molécula de polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS de la cepa NC-1 de N. caninum, tal como por ejemplo, un vector de clonación del fago lambda designado como lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) . La presente invención proporciona además una proteína parcialmente o sustancialmente purificada que contiene la secuencia de aminoácidos de la proteína DHFR-TS de Neospora. En una realización no limitante, la proteína contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 3 , o una secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) . La presente invención proporciona además polipéptidos que son sustancialmente homólogos a la proteína DHFR-TS de Neospora. La presente invención proporciona además fragmentos de péptidos de cualquiera de las proteínas o polipéptidos anteriormente mencionados, tales como, por ejemplo un polipéptido que consiste en un aislado del dominio DHRF o TS de Neospora . La presente invención proporciona además anticuerpos obtenidos contra una proteína DHFR-TS de Neospora o contra un fragmento de péptido de dicha proteína. La presente invención proporciona además un constructo genético que contiene cualquiera de las moléculas de polinucleótidos anteriormente mencionadas, tales como, por ejemplo, una molécula de polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS, como se muestra en la SEQ ID NO:l desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199 o como la presente en el fago lambdaclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) , o una molécula de polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos, la cual es una parte sustancial de cualquiera de dichas secuencias de nucleótidos, pero modificada por tener una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones de nucleótidos, o que consiste en una o más secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural al gen DHFR-TS in situ en N. caninum; de forma que la molécula de polinucleótido cuando se inserta en un gen DHFR-TS del tipo silvestre, o se utiliza para sustituir una parte de éste, produce una secuencia modificada del gen DHFR-TS que codifica una proteína parcialmente defectuosa o totalmente defectuosa, o que no codifica o no produce ninguna proteína en absoluto. Dichas constructos genéticos son útiles para producir células de Neospora modificadas en las que el gen DHFR-TS o una porción del mismo han sido parcialmente o completamente inactivadas, resultando células que presentan un fenotipo dhfr— o ts— (denominado en lo sucesivo colectivamente como fenotipo dhfr-ts-) . La presente invención proporciona además células de Neospora vivas modificadas en las que el gen DHFR-TS nativo o una mezcla del mismo, ha sido parcialmente o completamente inactivado. En una realización preferida, las células de Neospora presentan un fenotipo mutante dhfr—ts— como consecuencia de una disrupción del gen DHFR-TS mediante la recombinación homologa con una construcción genética de la invención. Dichas células de Neospora vivas modificadas son útiles en las composiciones de vacuna para proteger a los mamíferos contra la neosporosis. La presente invención proporciona además un procedimiento para preparar las células de Neospora vivas modificadas. La presente invención proporciona además una vacuna contra la neosporosis, que contiene una cantidad inmunológicamente eficaz de las células de Neospora vivas modificadas de la presente invención y un vehículo veterinariamente aceptable. La presente invención proporcionan además una vacuna de combinación para la protección de un mamífero contra la neosporosis y, opcionalmente, una o más de otras enfermedades o trastornos patológicos que pueden afectar al mamífero, conteniendo dicha vacuna de combinación una cantidad inmunológicamente eficaz de un primer componente que contiene células de Neospora vivas modificadas de la presente invención; una cantidad inmunológicamente eficaz de un segundo componente capaz de inducir una respuesta protectora frente a una enfermedad o trastorno patológico que puede afectar a un mamífero y un vehículo veterinariamente aceptable. La presente invención también proporciona un procedimiento para la preparación de la vacuna de la presente invención, que comprende la combinación de una cantidad inmunológicamente eficaz de las células de Neospora vivas modificadas de la presente invención con un vehículo veterinariamente aceptable. La presente invención proporciona además un procedimiento para la vacunación de un mamífero contra la neosporosis, que comprende la administración al mamífero de la vacuna de la presente invención. La presente invención proporciona además un estuche para la vacunación de un mamífero contra la neosporosis, que comprende un primer envase que tiene una composición que contiene una cantidad inmunológicamente eficaz de células de Neospora vivas modificadas de la presente invención y un segundo envase que tiene un vehículo o diluyente veterinariamente aceptable. 4. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 4.1 Moléculas de polinucleótidos sue codifican para la DHFR-TS de Neospora La presente invención proporciona: (i) un aislado de molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína DHFR-TS de Neospora, que incluye un aislado de molécula de polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS de Neospora; (ii) un aislado de molécula de polinucleótido que es sustancialmente homologa a cualquiera de las moléculas de polinucleótidos anteriormente mencionadas; (iii) un aislado de molécula de polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que es sustancialmente homólogo al de la proteína DHFR-TS de Neospora .• y (iv) una molécula de polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos que es una parte sustancial de cualquiera de las moléculas de polinucleótidos anteriormente mencionadas, incluyendo una molécula de polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de péptido de cualquiera de las proteínas o polipéptidos sustancialmente homólogos de DHFR-TS de Neospora . Tal y como se utiliza en la presente, se pretende que el término "gen", "molécula de polinucleótido", "secuencia de nucleótidos", "secuencia codificadora" y "región codificadora" incluya tanto las moléculas de ADN como las de ARN, que pueden ser de hebra sencilla o doble. Asimismo, como se utiliza en la presente, se pretende que el término "gen", "secuencia codificadora" y "región codificadora" se refiera a moléculas de polinucleótidos que se pueden transcribir y traducir (ADN) , o traducir (ARN) en una proteína DHFR-TS de Neospora, o en un polipéptido que es sustancialmente homólogo a una proteína DHFR-TS de Neospora, o en un fragmento de péptido de la proteína DHFR-TS de Neospora anteriormente mencionada, o en un polipéptido sustancialmente homólogo, en un sistema de expresión en una célula hospedadora cuando se coloca en asociación operativa con los elementos reguladores apropiados. Las moléculas de polinucleótidos pueden incluir, pero no se limitan a una o más secuencias procariotas, secuencias eucariotas, secuencias de ADNc, secuencias de ADN genómico (exones o intrones) , y secuencias de ADN y ARN químicamente sintetizadas, o cualquier combinación de las mismas. Un aislado de molécula de polinucleótido de la presente invención puede tener una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las especies o cepas de Neospora, pero es preferible que provenga de una especie patógena de Neospora, tal como N. caninum. Un ejemplo no limitante de una cepa de N. caninum de la cual se puede aislar o derivar la molécula de polinucleótido de la presente invención es la cepa NC-1, la cual está disponible en las células hospedadoras renales de mono MARC-145 con el número de registro CRL-12231 de la American Type Culture Collection (ATCC) , situada en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, EE.UU. La cepa NC-1 también se describe en Dubey y otros, 1988, j. Am. Vet. Med. Assoc. 193:1259-1263, cuya publicación se incorpora en la presente como referencia. Como alternativa, las cepas o especies patogénicas de Neospora para su uso en la práctica de la presente invención se pueden aislar a partir de órganos, tejidos o fluidos corporales de animales infectados utilizando técnicas de aislamiento estándar, tales como las descritas en las publicaciones indicadas anteriormente. La presente invención proporciona un aislado de molécula de polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína DHFR-TS de Neospora. En una realización preferida, la proteína DHFR-TS de Neospora contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS tal como está presente en el fago lambdaclDHFRTS (N° de registro 209512) . En una realización no limitante, la molécula de aislado de polinucleótido contiene la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS de Neospora. En una realización preferida, la molécula de aislado de polinucleótido contiene la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS de la cepa NC-1 de N. caninum, la cual contiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:l desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199, o una secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS como la presente en el fago lambdaclDHFRTS (N° de registro 209512). En la SEQ ID NO:l, el dominio DHFR predicho del gen DHFR-TS está codificado desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 4664; el dominio TS predicho del gen DHFR-TS está codificado desde aproximadamente el nt 4665 hasta aproximadamente el nt 8199. En otra realización no limitante, la molécula de polinucleótido que codifica para la proteína DHFR-TS contiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, en la cual el dominio DHFR predicho está codificado por aproximadamente los nt 1 hasta aproximadamente el nt 969 y el dominio predicho TS está codificado por aproximadamente el nt 970 hasta aproximadamente el nt 1836. La presente invención proporciona además un aislado de una molécula de polinucleótido que es sustancialmente homologa a una molécula de polinucleótidos que contiene la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS como se muestra en la SEQ ID NO:l desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199, o la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS como está presente en el fago lambdaclDHFRTS (N° de registro 209512) o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2. Cuando se utiliza el "término sustancialmente homólogo" para referirse a una molécula de polinucleótido relacionada con la DHFR-TS, indica una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos: (a) que codifica para la misma proteína que la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS mostrado en la SEQ ID NO:l desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199, o como está presente en el fago lambdaclDHFRTS (N° de registro 209512) o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO : 2 , pero que incluye uno o más cambios silenciosos en la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la degeneración del código genético; o (b) que híbrida con el complemento de una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para la misma proteína que la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS mostrado en la SEQ ID N0:1 desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199, o como está presente en el fago lambdaclDHFRTS (N° de registro 209512) o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO : 2 , en condiciones moderadamente estrictas, es decir, hibridación con el ADN unido al filtro en NaHP04 0,5 M, dodecil sulfato sódico 7% (SDS), EDTA 1 mM a 65°C y lavado en 0,2xSSC/SDS AL 0.1%, a 42°C (véase Ausubel y otros, (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Bioloay, Vol. I, Green Pubiishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en p. 2.10.3) y que es útil para la práctica de la presente invención. En una realización preferida, la molécula de polinucleótido sustancialmente homologa híbrida con el complemento de una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para la misma proteína que la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS mostrado en la SEQ ID NO:l desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199, o como esta'presente en el fago la bdaclDHFRTS (N° de registro 209512) o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO : 2 , en condiciones ligeramente estrictas, es decir, hibridación con el ADN unido al filtro en NaHP04 0.5 M, SDS al 7%, EDTA 1 mM a 65°C y lavado en 0. lxSSC/al SDS 0.1% a 68°C (Ausubel y otros, 1989, más arriba) y es útil para la práctica de la presente invención. Como se utiliza en la presente, una molécula de polinucleótido es "útil para la práctica de la presente invención" cuando se puede utilizar la molécula de polinucleótido como un reactivo diagnóstico para detectar la presencia de un polinucleótido específico de Neospora en una muestra de fluido o tejido de un animal infectado con Neospora, o cuando la molécula de polinucleótido se puede utilizar para preparar un constructo genético útil en la preparación de células de Neospora vivas modificadas de la presente invención, como se describe posteriormente en la sección 4.4. Las moléculas de polinucleótido sustancialmente homologas de la presente invención no incluyen las moléculas de polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína DHFR-TS de T. crondii. La presente invención proporciona además un aislado de molécula de polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo a una proteína DHFR-TS de Neospora que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS como está presente en el fago lambdaclDHFRTS (N° de adquisición 209512) . Como se usa en la presente para referirse a los polipéptidos, el término "sustancialmente homólogo" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos: (a) que es preferentemente al menos aproximadamente el 70%, más preferentemente al menos aproximadamente el 80% y aún más preferentemente al menos aproximadamente el 90% igual que la de la proteína DHFR-TS que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 3 , o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS como está presente en el fago lambdaclDHFRTS (N° de registro 209512) y cuyo polipéptido sustancialmente homólogo es útil para la práctica de la presente invención; y/o (b) en el que uno o más restos de aminoácidos presentes en una proteína DHFR-TS de Neospora tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS como la presente en el fago lambdaclDHFRTS (N° de registro 20915) , ha sido conservativamente sustituido con un residuo de aminoácido diferente, siendo el polipéptido útil en la práctica de la presente invención. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede esperar razonablemente que uno o más restos de aminoácidos de una proteína DHFR-TS de Neospora se pueda sustituir conservativamente con un resto de aminoácido de carga, tamaño o polaridad similar, siendo el polipéptido resultante útil para la práctica de la presente invención. Las reglas para realizar dichas sustituciones incluyen aquellas descritas por Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found. , Washington, D.C., Vol. 5 Sup. 3, entre otras. Más específicamente, las sustituciones de aminoácidos conservativas son aquellas que generalmente tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en cuatro grupos: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos lisina, arginina, histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la triosina también se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. Una o más sustituciones dentro de cualquier grupo en particular, por ejemplo, de una leucina por isoleucina o valina, de un aspartato por glutamato, o de una treonina por serina, o de cualquier otro resto de aminoácido por un resto de aminoácido estructuralmente relacionado, tendrán generalmene un efecto insignificante sobre la utilidad del polipéptido resultante en la práctica de la presente invención. Como se utiliza en la presente, se considera una proteína o polipéptido "útil para la práctica de la presente invención" cuando la proteína o polipéptido se puede utilizar para cualquiera o más de una variedad de objetivos, incluyendo, por ejemplo, la selección de agentes inhibidores dirigidos específicamente a cualquiera de los dos dominios enzimáticos de la proteína DHFR-TS de Neospora, o para obtener anticuerpos contra la proteína completa o uno de los dos dominios enzimáticos de la misma. La presente invención proporciona además una molécula de polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos que es una parte sustancial de cualquiera de las moléculas de polinucleótidos anteriormente mencionadas. Tal y como se utiliza en la presente, una "parte sustancial" de cualquiera de las moléculas de polinucleótidos anteriormente mencionadas indica una molécula de polinucleótido que consiste en menos de la secuencia de nucleótidos completa de la molécula de polinucleótido relacionada con la DHFR-TS particular, pero que comprende al menos aproximadamente el 50% de la secuencia de nucleótidos de la molécula de polinucleótido relacionada con la DHFR-TS y que es útil para la práctica de la presente invención, definiéndose la utilidad según lo anterior para las moléculas de polinucleótidos. En una realización preferida, la molécula de polinucleótido consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento peptídico de cualquiera de las proteínas o polipéptidos sustancialmente homólogos de la DHFT-TS de Neospora anteriormente mencionados, tal como un polipéptido que consiste en el dominio DHFR o el domino TS de la proteína DHFR-TS. Tal y como se utiliza en la presente, el "fragmento peptídico" se refiere a un polipéptido que consiste en una o más sub-secuencias de la secuencia de aminoácidos completa de la proteína DHFR-TS de Neospora, o del polipéptido sustancialmente homólogo, siendo las sub-secuencias más cortas en cuanto a longitud que la molécula de longitud completa, y en las que el fragmento peptífico resultante es útil en la práctica de la presente invención, siendo la utilidad lo definido anteriormente para los polipéptidos. Así, si la molécula de longitud completa está representada por tener "n" restos de aminoácidos, un fragmento peptídico de la misma sería cualquier polipéptido más pequeño que la secuencia de longitud completa, que incluye un polipéptido que tiene n-1 residuos de aminoácidos, siendo dicho polipéptido útil en la práctica de la presente invención. Los fragmentos peptídicos de la presente invención tienen preferentemente al menos aproximadamente 10 restos de aminoácidos de longitud. En una realización no limitante, el fragmento peptídico consiste en el dominio DHFR o el dominio TS de la proteína DHFR-TS de Neospora . Cuando el fragmento peptídico consiste en más de una sub-secuencia de una proteína DHFR-TS o polipéptido sustancialmente homólogo, la molécula de polinucleótido que codifica para el fragmento peptídico se puede formar de forma que se agrupan varias sub-secuencias situándolas contiguamente en el fragmento peptídico allí donde las correspondientes sub-secuencias no eran contiguas en el polipéptido o en la proteína de longitud completa. Asimismo, una molécula de polinucleótido que codifica para un fragmento peptídico se puede formar de tal forma que se colocan diferentes sub-secuencias que comprenden el fragmento peptídico en un orden relativo diferente unas de otras en comparación con la proteína o polipéptido de longitud completa, o de forma que el fragmento peptídico codificante comprenda múltiples copias de una sub-secuencia específica. Por ejemplo, la molécula de polinucleótidos puede codificar para múltiples copias del dominio DHFR o del dominio TS, para regiones epitópicas seleccionadas de las mismas o una combinación de los mismas. La presente invención comprende asimismo las coléculas de polinucleótidos que codifican para un polipéptido de longitud completa (n) , en el cual las sub-secuencias de la proteína nativa se han despuesto cercanas unas de otras, además de las moléculas de polinucleótidos que codifican para polipéptidos que son más largos que la proteína nativa, incluyendo polipéptido de hasta 2n de longitud. Dichos polipéptidos pueden contener múltiples copias de la proteína completa, de los dominios individuales, de las regiones epitópicas o de alguna combinación de la misma. Además de las secuencias de nucleótidos de cualquiera de las moléculas de polinucleótidos relacionadas con la DHFR-TS anteriormente mencionadas, las moléculas de polinucleótidos de la presente invención pueden contener también, o como alternativa pueden consistir en una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas entre las secuencias que flanquean de forma natural al gen DHFR-TS in situ en N. caninum, tal como por ejemplo, las secuencias de nucleótidos flanqueantes mostradas en la SEQ ID NO : 1 o partes de la misma. Las secuencias de moléculas de polinucleótido de la presente invención proporcionan además la información necesaria para construir moléculas de oligonucleótidos que pueden utilizase como cebadores en las técnicas de amplificación, o como sondas en el diagnóstico diferencial de enfermedades, y que pueden ser diseñadas fácilmente por aquellos expertos en la técnica a la luz de esta descripción, Dichos oligonucleótidos tendrán preferentemente una longitud de al menos 15 nucleótidos aproximadamente. La amplificación se puede llevar a cabo utilizando oligonucleótidos convenientemente diseñados aplicando técnicas convencionales, tales como, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , la cual se describe, entre otros, en Innis y otros, (eds) , 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; and Erlich (ed) , 1992, PCR Technology, Oxford Uneversity Press, Nueva York, cuyas publicaciones se incorporan en la presente como referencia. En cuando al diagnóstico, los oligonucleótidos de la presente invención, se pueden utilizar en la amplificación mediante la PCR para detectar la presencia de las moléculas de polinucleótidos específicas de Neospora en una muestra de un tejido o fluido de un animal, tal como el tejido cerebral, el tejido pulmonar, el tejido placentario, el fluido sanguíneo, el fluido cerebroespinal, mucus, urina, fluido amniótico, etc. La producción de un producto de amplificación específico se puede utilizar para apoyar un diagnóstico de infección por Neospora, mientras que la falta de un producto amplificado puede apuntar a una ausencia de infección. Generalmente, para la PCR, se prepara una mezcla que contiene los cebadores diseñados de forma apropiada, un molde que contienen la secuencia de nucleótidos a amplificar, y las enzimas y tampones para la PCR apropiados y se procesa de acuerdo con los protocolos convencionales para amplificar una molécula de polinucleótido específica de la DHFR-TS de Neospora del molde o una parte de la misma. Otras técnicas de amplificación conocidas en la técnica, por ejemplo, la reacción en cadena de la ligasa, se pueden usar como alternativa. Se pretende que todas las referencias posteriores referentes a una "molécula de polinucleótido" incluyan cualquiera de las moléculas de polinucleótidos anteriormente mencionadas de la presente invención, incluyendo las moléculas de polinucleótidos que contienen la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS como se muestra en la SEQ ID N0:1 desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199, o como está presente en el fago NclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512), o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:2; las moléculas de polinucleótidos que son sustancialmente homologas a una molécula de polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS como se muestra en la SEQ ID N0:1 desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199, o la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS como está presente en el fago NclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO : 2 ; las moléculas de polinucleótidos que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo a una proteína de DHFR-TS de Neospora que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS que codifica para el gen DHFR-TS como están presente en el fago NclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512); y las moléculas de polinucleótidos que consisten en una secuencia de nucleótidos que es una parte sustancial de cualquiera de las moléculas de polinucleótidos anteriormente mencionados, que incluyen las moléculas de polinucleótidos que consisten en una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento peptídico de cualquiera de las proteínas DHFR-TS de Neospora anteriormente mencionadas o polipéptidos sustancialmente homólogos, a menos que se indique de otra forma . Se pretende que todas las referencias posteriores a una "proteína DHFR-TS", "proteína", o "polipéptido" incluyan una proteína que tenga la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS como está presente en el fago NclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) ; los polipéptidos que son sustancialmente homólogos a cualquiera de las proteínas anteriormente mencionadas, y los fragmentos peptídicos de cualquiera de las proteínas o polipéptidos anteriormente mencionados, a menos que se especifique de otra forma . La producción y manipulación de las moléculas de polinucleótidos y oligonucleótidos de la invención están dentro de la técnica y se pueden realizar de acuerdo con las técnicas genéticas conocidas, descritas entre otros sitios, en Maniatis y otros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel y otros, 1989, más arriba; Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Innis y otros, 1995, más arriba; y Erlich, 1992, más arriba, las cuales se incorporan a la presente como referencia. 4.2. Sistemas de expresión recombinantes 4.2.1. Vectores de clonación y de expresión La presente invención proporciona además vectores de clonación y expresión que contiene una molécula de polinucleótido de la presente invención. En una realización no limitante, un vector de clonación proporcionado por la presente invención es el fago NclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) , el cual contiene una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS completo de la cepa NC-1 de N. caninum. Los vectores de expresión de la presente invención se construyen preferentemente de forma que la molécula de polinucleótido está en asociación operativa con uno o más elementos regulatorios necesarios para la transcripción y la traducción. El vector de expresión se utiliza en un sistema de expresión, tal como una célula hospedadora transformada, para producir una proteína DHFR-TS recombinantemente expresada. Tal y como se utiliza en la presente, el termino "elemento regulador" • incluye pero no se limita a las secuencias de nucleótidos que codifican promotores, intensificadores, operadores inducibles y no inducibles, y otros elementos conocidos en la técnica que sirven para dirigir y/o regular la expresión de una secuencia de polinucleótidos codificantes. Tal y como se utiliza en la presente, la secuencia codificante DHFR-TS está en "asociación operativa" con uno o más elementos reguladores, registrado los elementos reguladores de manera eficaz y proporcionan la transcripción de la secuencia codificante DHFR-TS o la traducción de su ARNm, o ambas. Existen procedimientos bien conocidos en la técnica para la construcción de vectores de expresión que contienen secuencias codificadoras particulares en asociación operativa con los elementos reguladores apropiados y éstos pueden utilizarse para la práctica de la presente invención. Dichos procedimientos incluyen técnicas de recombinación in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo, como se ha descrito entre otros en Maniatis y otros, 1989, más arriba; Ausubel y otros, 1989, más arriba; y Sambrook y otros, 1989, más arriba. En la técnica se conocen varios vectores de expresión que pueden utilizarse para expresar la secuencia codificante de una molécula de polinucleótidos de la presente invención, incluyendo ADN recombinante de bacteriófagos, ADN de plásmidos y vectores de expresión de ADN de cósmidos que contienen la secuencia codificadora DHFR-TS para la transformación de una bacteria o de una levadura; y vectores de expresión en virus recombinantes, tales como por ejemplo, baculovirus, que contienen la secuencia codificante DHFR-TS para la transfección de células de insecto, o adenovirus o virus de vacuna que contiene la secuencia codificante DHFR-TS para la transfección de células de mamífero, entre otros. Los plásmidos, vectores de expresión en procariotas típicos que se pueden construir de forma que contengan una molécula de polinucleótido de la presente invención, incluyen pUC8, pUC9, pBR322 y pBR329 (Biorad Laboratories, Richmond, CA) y pPL y pKK223 (Pharmacia, Piscata ay, NJ) , entre otros. Los vectores de expresión en eucariotas típicos que se pueden construir para contener una molécula de polinucleótido de la presente invención incluyen un sistema de expresión en mamíferos inducible por ecdisona (Invitrogen, Carlsbad, CA) , sistemas basados en promotores-intensificadores en citomegalovirus (Promega, Madison, Wl ; stratagene, La Jolla. CA: Invitrogen) y sistemas de expresión basados en baculovirus (Promega), entre otros.

Los elementos reguladores de estos y otros vectores pueden variar en su potencia y especificidad. Dependiendo del sistema de hospedador/vector utilizado, se puede utilizar cualquiera de un número de elementos de transcripción y traducción apropiados. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas celulares de mamíferos, se pueden utilizar los promotores aislados del genoma de las células de mamífero, por ejemplo, el promotor de la metalotioneína de ratón, o de virus que y desarrollan en estas células, por ejemplo, el promotor del virus de vacuna 7.5K o la repetición larga terminal del virus del sarcoma murino de Moloney. Los promotores obtenidos por ADN recombinante o técnicas sintéticas también se pueden utilizar para la transcripción de la secuencia insertada. Asimismo, la expresión de determinados promotores se puede aumentar en presencia de inductores particulares, por ejemplo, iones de zinc y cadmio para los promotores de la metalotioneína. Los ejemplos no limitantes de las regiones reguladoras transcripcionales o promotores incluyen para las bacterias, el promotor ß-gal, el promotor T7, el promotor TAC, los promotores lambda izquierdo y derecho, los promotores trp y lac, los promotores fusionados trp-lac, etc; para las levaduras, los promotores de enzimas glicolíticas, tales como los promotores ADH-I Y II, el promotor GPK, el promotor PGI, el promotor TRP, etc; para las células de mamíferos, los promotores temprano y tardío de SV40, los promotores tardíos principales de adenovirus, etc.

También se requieren señales de iniciación específicas para la traducción suficiente de las secuencias codificadoras DHFR-TS insertada. Estas señales incluyen típicamente un codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos en los que la molécula de polinucleótido de la presente invención, incluyendo su propio codón iniciador y secuencias adyacentes, están insertadas en el vector de expresión apropiado, no se necesitan señales de control de la traducción adicionales. Sin embargo, en los casos donde solo se inserta una parte de una secuencia codificante, se requieren señales exógenas para el control de la traducción, incluyendo el codón de iniciación ATG. Estas señales de control de la traducción exógenas y codones iniciadores se pueden obtener de una variedad de fuentes, tanto naturales como sintéticas. Asimismo, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la región codificadora DHFR-TS para asegurar la traducción en el marco del inserto completo. Los vectores de expresión de proteínas de fusión se pueden usar para expresar una proteína de fusión DHFR-TS. La proteína de fusión purificada se puede utilizar para obtener un antisuero contra la proteína DHFR-TS, para estudiar las propiedades bioquímicas de la proteína DHFT-TS, para construir proteínas de fusión DHFR-TS con diferentes actividades enzimáticas, o para facilitar la identificación o purificación de la proteína DHFR-TS expresada. Los vectores de expresión de proteínas de fusión posibles incluyen', pero no se limitan a vectores que incorporan secuencias que codifican para las fusiones de ß-galactosidasa y trpE, las fusiones de la proteína de unión a maltosa, las fusiones de la glutation-S-transferasa y las fusiones de la polihistidina (regiones vehículo) . Se pueden utilizar los procedimientos conocidos en la técnica para construir vectores de expresión que codifican para dichas proteínas de fusión DHFR-TS. Como se ha dicho anteriormente, la proteína de fusión puede ser útil para facilitar la purificación de la proteína expresada. Por ejemplo, las fusiones de DHFR-TS-proteína de unión a la maltosa se pueden purificar utilizando resina de amilosa; las proteínas de fusión DHFR-TS-glutation-S-transferasa se pueden purificar utilizando perlas de glutation-agarosa; y las fusiones DHFR-TS-polihistidina se pueden purificar utilizando resina de níquel divalente. Como alternativa, los anticuerpos contra una proteína o péptido vehículo se pueden usar para la purificación por cromatografía de afinidad de la proteína de fusión. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica para el epítopo diana de un anticuerpo monoclonal se puede construir en el vector de expresión en asociación operativa con los elementos reguladores, y situarse de tal forma que el epítopo expresado se fusiona con la proteína DHFR-TS. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica para el epítopo tag FLAG™ (International Biotechnologies Inc.), el cual es un péptido marcador hidrófilo, se puede insertar mediante técnicas convencionales en el vector de expresión en un punto correspondiente, por ejemplo, al carboxilo terminal de la proteína DHFR-TS. El producto de fusión de proteína DHFR-TS- epítopo FLAG™ expresado se puede detectar y purificar por afinidad utilizando anticuerpos anti-FLAG T1M disponibles comercialmente . El vector de expresión también se puede construir de forma que contenga secuencias de policonector, que codifican para los sitios de corte de una proteasa específica, de forma que la proteína DHFR-TS expresada se puede liberar de la región portadora o compañera de fusión mediante tratamiento con una proteasa específica. Por ejemplo, el vector de la proteína de fusión puede incluir secuencias de ADN que codifican para los sitios de corte de la trombina o factor Xa, entre otros. Se puede construir una secuencia señal cadena arriba y en marco de lectura con la región codificadora DHFR-TS en el vector de expresión mediante procedimientos conocidos para dirigir la conducción y secreción de la proteína expresada. Los ejemplos no limitantes de secuencias señal incluyen aquellas del factor alfa, inmunoglobulinas, proteínas de la membrana externa, penicilinasa y receptores de la célula T, entre otros. Para facilitar la selección de las células hospedadoras transformadas o transfectadas con un vector de expresión de la presente invención, el vector de expresión se puede construir de forma que contenga además una secuencia codificadora para un producto génico informativo u otro marcador seleccionable . Una secuencia codificadora de este tipo está preferentemente en asociación operativa con las secuencias codificadoras del elemento regulador, como se ha descrito anteriormente. Los genes informativos que son útiles en la invención son bien conocidos en la técnica e incluyen aquellos que codifican para la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) , la proteína fluorescente verde, la luciferasa de la luciérnaga y la hormona de crecimiento humana, entre otros. Las secuencias de nucleótidos que codifican para marcadores seleccionables son bien conocidas en la técnica e incluyen aquellas que codifican para los productos génicos que confieren resistencia a antibióticos y anti-metabolitos, o que proporcionan un requerimiento auxotrófico. Los ejemplos de dichas secuencias incluyen aquellas que codifican para la actividad de la timidina quinasa o la resistencia al metotrexato, ampicilina, kenamicina, cloranfenicol, zeocina, pirimetamina, aminoglucósidos o himicromicina, entre otros. 4.2.2. Transformación de las células hospedadoras La presente invención proporciona células hospedadoras transformadas que contienen una molécula de polinucleótido o vector de expresión recombinante de la presente invención y líneas celulares derivadas de las mismas. Las células hospedadoras útiles útiles en la práctica de la invención pueden ser eucariotas, aunque se prefieren las células procariotas. Dichas células hospedadoras transformadas, incluyen pero no están limitadas a microorganismos, tales como bacterias transformadas con el ADN del bacteriófago recombinante, ADN plásmido o vectores de expresión del ADN cósmido; o levaduras transformadas con un vector de expresión recombinante; o células animales, tales como las células de insecto infectadas con un vector de expresión recombinante; o células animales, tales como las células de insecto infectadas con un vector de expresión vírico recombinante, por ejemplo, , baculovirus, o células de mamífero recombinante, por ejemplo, , baculovirus, o células de mamífero infectadas con un vector de expresión vírico recombinante, por ejemplo, adenovirus o virus de vacuna entre otros . Se pueden usar células bacterianas células hospedadoras. Por ejemplo, se puede usar una cepa de E. coli, tal como por ejemplo, la cepa de DH5Ó, disponible en la ATCC, Rockville, MD, EE.UU. (No. de registro 31343) o de Strategene (La Jolla, CA) . Las células hospedadoras eucariotas incluyen células de levadura, aunque también se pueden utilizar de forma eficaz células de mamífero, tales como de ratón, hámster, vaca, mono o una línea celular humana. Ejemplos de células hospedadoras encariotas que se pueden utilizar para expresar la proteína de ovario de hámster chino (OCH) (por ejemplo, No. de registro ATCC No. CCL-61) , las células embrionarias de ratón suizo NIH NIH/3T3 (por ejemplo, No. de registro CRL-1658) , las células renales bovinas Madin-Darby (MDBK) No. de registro CCL-229 y las células deficientes en timidina quinasa, por ejemplo, L-M (TK) (No. de registro CCL-1.3) y tk-tsl3 (No. de registro CRL-1632) . El vector de expresión recombinante de la invención se transforma o se transfecta preferentemente en una o más células hospedadoras de un cultivo de células sustancialmente homogéneo. El vector de expresión se introduce generalmente en células hospedadoras de acuerdo con técnicas conocidas, tales como, por ejemplo, la precipitación con fosfato calcico, el tratamiento de cloruro calcico, la microinyección, la electroporación, la transíectación mediada por liposomas, la transfección con DEAE-dextremo, la transducción, la conjugación o el bombardeo con microproyetiles, entre otros. La selección de los transformantes se puede realizar mediante procedimientos convencionales, tales como la selección de células que expresan un marcador seleccionable, por ejemplo, resistencia a antibióticos asociado con el vector de expresión recombinante. Una vez que el vector de expresión se ha introducido en la célula hospedadora, la integración y el mantenimiento de la molécula de polinucleótido de la presente invención, bien en el geoma de la célula hospedadora o bien episo almente, se puede confirmar por técnicas convencionales, por ejemplo, por análisis de hibridación Southern, análisis con enzimas de restricción, análisis de PCR incluyendo la PCR con transcriptasa inversa (rt-PCR) o mediante ensayo inmunológico para detectar el producto proteico esperado. Las células hospedadoras que contienen y/o expresan la molécula de polinucleótido de la presente invención se pueden identificar mediante cualquiera de al menos cuatro procedimientos generales, los cuales son conocidos en la técnica, y que incluyen: (i) hibridación ADN-ADN, ADN-ARN o ARN-ARN antisentido; (ii) la detección de la presencia de funciones de genes "marcadores"; (iii) la determinación del nivel de transcripción como se mide por la expresión, por ejemplo, de los transcritos de mARN específicos de la DHFR-TS en la célula hospedadora; o (iv) la detección de la presencia del producto polipeptídico maduro, por ejemplo, por inmunoensayo o por detección de una actividad enzimática, tal como por ejemplo, la conversión del dihidrofolato en tetrahidrofolato catalizada por la oxidación del NADPH o una actividad enzimática TS, tal como por ejemplo, la conversión del dihidrofolato en tetrahidrofolato catalizada por la oxidación del NADPH o una actividad enzimática TS, tal como por ejemplo, la conversión de la desoxiuridina monofosfato en la desoxitimidina monofosfato, como se conoce en la técnica. 4.2.3. Expresión y purificación de polipéptidos recombinantes Una vez que la molécula de polinucleótido de la presente invención ha sido introducida en forma estable en una célula hospedadora apropiada, la célula hospedadora transformada se propaga clónicamente y las células resultantes crecen en condiciones que dan lugar a la máxima producción de la proteína DHFR-TS codificada. Dichas condiciones incluyen típicamente el crecimiento de las células transformadas hasta una alta densidad. Cuando el vector de expresión contiene un promotor inducible, se utilizan condiciones de inducción apropiadas, tales como por ejemplo, la oscilación de temperatura, el agotamiento de nutrientes, la adición de inductores innecesarios (por ejemplo, análogos de hidratos de carbono, tales como isoporopil-ß-D-tiogalactopiranósido (IPTG), la acumulación del exceso de subproductos metabólicos o similares, según se necesiten para inducir la expresión. Cuando la proteína DHFR-TS expresada se retiene en el interior de las células hospedadoras, las células se recogen y se lisan y el producto se purifica del lisado en condiciones de extracción conocidas en la técnica para minimizar la degradación proteica, tales como por ejemplo, a 4°C, o en presencia de inhibidores de la proteasa, o ambos, Cuando la proteína DHFR-TS expresada se secreta fuera de las células hospedadoras, simplemente se recoge el medio nutritivo agotado y se aisla la proteína del mismo. La proteína DHFR-TS expresada se puede purificar de los usados celulares o del medio de cultivo, según se proceda, utilizando procedimientos convencionales, incluyendo, pero sin limitarse a uno o más de los siguientes procedimientos: precipitación con sulfato amónico, fraccionamiento por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, HPLC, centrifugación por densidad y cromatografía de afinidad. Cuando la proteína DHFR-TS expresada presenta actividad enzimática, por ejemplo, la capacidad de convertir o el dihidrofolato en tetrahidrofolato, como cuando está catalizado por la oxidación del NADPH (DHFR) , o la desoxiuridina monofosfato en desoxitimidina monofosfato (TS) , el aumento de pureza de la preparación se puede controlar con cada paso del procedimiento de purificación mediante el uso de un ensayo apropiado, como se conoce en la técnica. Si la proteína expresada no tiene actividad biológica, se puede detectar basándose, por ejemplo, en el tamaño o en la reactividad con un anticuerpo que por otra parte es específico de la proteína DHFR-TS, o por la presencia de un tag de fusión. Para el uso en la práctica de la presente invención, la proteína DHFR-TS recombinantemente expresada puede estar en un estado no purificado, como el producido en el cultivo o como está presente en un lisado celular, o se puede purificar parcial o sustancialmente de los mismos. Así, para la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de la proteína DHFR-TS que comprende el cultivo de la célula hospedadora transformada con un vector de expresión recombinante conteniendo dicho vector de expresión recombinante una molécula de polinucléotido de la presente invención en asociación operativa con uno o más elementos reguladores, en condiciones que producen la expresión de la proteína DHFR-TS y la recogida de la proteína DHFR-TS del cultivo celular. La presente invención proporciona además un aislado de proteína DHFR-TS DE Neospora que contiene la secuencia de aminoácidos presentados como SEQ ID NO: 3, o una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos de la proteína DHFR-TS codificada por el gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC No. de registro 209512) ; polipétidos sustancialmente homólogos de la misma y fragmentos peptídicos de las proteínas y polipéptidos anteriormente mencionados. Por ejemplo, los fragmentos peptídicos de la invención pueden consistir en el dominio DHFR o el dominio TS de la proteína DHFR-TS de Neospora . Una secuencia de aminoácidos del dominio DHFR predicho en la proteína DHFR-TS de Neospora se muestra en la SEQ ID NO: 3 desde aproximadamente el resto aminoácido 323; una secuencia de aminoácidos del dominio TS predicho va desde aproximadamente el esto aminoácido 612. 4.3 Uso de la proteínas DHFR-TS Una vez que se ha obtenido una proteína DHFR-TS DE pureza suficiente, éste se puede caracterizar por procedimientos convencionales, incluyendo SDS-PAGE, cromatografía de exclusión molecular, análisis de la secuencia de aminoácidos, la determinación de la actividad biológica, etc. La proteína DHFR-TS se puede caracterizar además utilizando el análisis de hidrofilicidad (véase, por ejemplo, Hopp and Woods, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:3824) o algoritmos de software análogos, para identificar las regiones hidrófobas e hidrófilas. Se puede llevar a cabo el análisis estructural para identificar las regiones de la proteína DHFR- TS que asuma estructuras secundarias específicas. Se pueden utilizar procedimientos biofísicos, como la cristalografía de rayos X (Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13), la simulación por ordenador (Fletterick and Zoller (eds) , 1986, en Cúrrente Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) y la resonancia magnética nuclear (RMN) para mapear y estudiar los sitios de interacción entre la proteína DHFR-TS y cualquiera de sus substratos. La información obtenida a partir de estos estudios se puede utilizar para diseñar mutantes de deleción más eficaces y composiciones para vacunas, o para diseñar o seleccionar compuestos terapéuticos o farmacológicos que pueden bloquear específicamente la actividad enzimática del dominio DHFR o del TS de la proteína DHFR-TS de Neospora in vivo. Los aislados de proteínas DHFR-TS de la invención, recombinantes o no, son útiles para una serie de fines. Por ejemplo, la proteína se puede utilizar para buscar agentes inhibidores que bloquean específicamente la actividad enzimática del dominio DHFR o del TS . Tales procedimientos de selección son bien conocidos en la técnica. Las proteína DHFR-TS de la invención también pueden usarse como antígenos para obtener anticuerpos policlonales o monoclonales, como se describe más adelante, que reaccionen específicamente con la proteína. Dichos anticuerpos pueden ser útiles, por ejemplo, como reactivos de afinidad con los cuales purificar la proteína nativa o recombinante DHFR-TS, o como reactivos diagnósticos para detectar la presencia de una proteína DHFR-TS específica de Neospora en la muestra de célula, tejido o fluido procedente de un animal, tal como por ejemplo, mediante los ensayos ELISA o transferencia Western. Se pueden obtener anticuerpos contra una proteína DHFR-TS utilizando procedimientos conocidos. Se pueden inmunizar varios animales hospedadores, incluyendo cerdos, vacas, caballos, conejos, cabras, ovejas y ratones, con el antígeno parcial o sustancialmente purificado. Se puede usar un adyuvante, tal como el descrito posteriormente, para intensificar la producción de anticuerpos. Se pueden obtener anticuerpos policlonales ha partir del suero de un animal inmunizado y ensayarlos para determinar la especificidad de la anti-proteína DHFR-TS utilizando técnicas monoclonales contra la proteína DHFR-TS utilizando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero no se limitan a la técnica del hibridoma, originalmente descrita por Kohler y Milstein (Nature, 1975, 256: 495-497; la técnica del hibridoma de la célula B humana (Kosbor y otros, 1983 Immunology Today 4:72; Cote y otros, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030) y la técnica EBV-hibridoma (Colé y otros, 1985, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77.96), Como alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (véase, por ejemplo, la patente estadounidense 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos del antígeno DHFR-TS. Estas publicaciones se incorporan a la presente como referencia. Los fragmentos de anticuerpo que contienen sitios de unión específicos para un antígeno DHFR-TS también están incluidos dentro de la presente invención y se pueden general mediante técnicas conocidas. Dichos fragmentos incluyendo, pero no se limitan a los fragmentos F(ab')2' l°s cuales se pueden obtener por digestión con pepsina o e una molécula de anticuerpo intacta, y los fragmentos Fab, los cuales se pueden obtener por reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2- Como alternativa, se pueden construir bancos de expresión de Fab (Huse y otros, 1989, Science 246: 1275-1281) que permiten la identificación rápida de los fragmentos Fab que tienen la especificidad deseada para el antígeno DHFR-TS. Las técnicas para la producción de los anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la t y se describen adicionalmente, entre otros, en Harlow and Lañe, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory y en J. W. Goding, 1986, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, Londres, los cuales se incorporan en la presente como referencia. 4.4. Mutación dirigida del gen DHFR-TS de Neospora 4.4.4. Constructos genéticos Basándose en la descripción de las moléculas de polinucleótido de la presente invención, se pueden preparar constructos genéticos para su uso de la inactivación de un gen DHFR-TS de Neospora. El gen de DHFR-TS de Neospora se puede desactivar utilizando un constructos genético diseñado de forma apropiada en combinación con técnicas genéticas conocidas en la actualidad o a desarrollar en el futuro. Por ejemplo, un gen DHFR-TS de Neospora se puede desactivar utilizando una construcción genética de la presente invención que funciona para: (a) suprimir toda o una parte del gen DHFR-TS; o (b) sustituir una parte del gen DHFR-TS con una secuencia de nucleótidos diferentes; o (c) una molécula de oligonucleótido, o una molécula de polinucleótido, la cual puede contener una secuencia de nucleótidos de Neospora o de otra fuente. Las células de Neospora en las que un gen DHFR-TS se ha desactivado son útiles en la práctica de la presente invención cuando la desactivación del gen DHFR-TS reduce la patogenicidad de las células de Neospora que llevan el gen DHFR-TS desactivado en comparación con las células de la misma cepa de Neospora de los cuales el gen DHFR-TS todavía no ha sido desactivado, y en las que dichas células de Neospora que llevan el gen DHFR-TS desactivado se pueden usar en una composición para una vacuna, especialmente en una vacuna viva modificada, para inducir la respuesta protectora en un mamífero contra la neosporosis. En una realización no limitante, el constructo genético de la presente invención se usa para desactivar un gen DHFR-TS de Neospora del tipo salvaje por sustitución de la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS de tipo salvaje o una párate de la misma, con un gen DHFR-TS de Neospora mutado o porción del mismo. Las secuencias de los genes DHFR-TS de Neospora mutadas para su uso en un constructo genético de este tipo se pueden producir por varios procedimientos conocidos, incluyendo el uso de la PCT proclive al error o mediante mutagénesis de módulo. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida con oligonucleótidos se puede emplear para alterar la secuencia ORF del gen DHFR-TS de Neospora de tipo salvaje de una forma definida, por ejemplo, para introducir un desplazamiento del marco o un codón de terminación en regiones específicas dentro de la secuencia. Como alternativa, o además, una secuencia de nucleótidos mutada para su uso en el constructo genético de la presente invención se puede preparar por inserción en el gen DHFR-TS de Neospora de uno o más nucleótidos, moléculas de oligonucleótidos o moléculas de polinucleótidos, o por sustitución de una parte del gen DHFR-TS d Neospora con uno o más nucleótidos, moléculas de oligonucleótidos o moléculas de polinucleótidos. Dichas moléculas de oligonucleótidos o moléculas de polinucleótidos se pueden obtener a partir de cualquier fuente que exista en forma natural o bien puede ser sintética. La secuencia insertada puede servir simplemente para interrumpir el marco de lectura del gen DHFR-TS de Neospora, o también puede codificar un producto génico heterólogo, tal como un marcador seleccionable . También se puede utilizar la mutagénesis al azar para producir una secuencia mutada del gen DHFR-TS de Neospora para su uso en una construcción génica de la presente invención. La mutagénesis al azar se puede llevar a cabo mediante cualquier técnica conocida en la actualidad o a desarrollar en el futuro, tal como por ejemplo, exponiendo las células que llevan el gen DHFR-TS de Neospora o radiación ultravioleta o rayos x o a mutágenos químicos, tal como la N-metil-N' -nitrosoguanidina, el metansulfonato de etilo, el ácido nitroso o la mostaza de nitrógeno y seleccionando a continuación las células que llevan una mutación en el gen DHFR-TS. Véase por ejemplo, Ausubel, 1989, más arriba, para un estudio de las técnicas de mutagénesis. Las mutaciones para la producción de las células de Neospora modificadas que son útiles en la práctica de la presente invención, como se ha definido más arriba, se pueden producir en cualquier lugar del gen DHFR-TS de Neospora, incluyendo en la región ORF o en la región del promotor, o en cualquier otra secuencia que flanquea el gel o la ORF. Dichas células de Neospora pueden ser mutantes en las cuales se produce una forma modificada de la proteína codificada por el gen DHFR-TS de Neospora, o en los cuales no se produce nada de dicha proteína. En una realización preferida, dichas células de Neospora presentan un fenotipo mutante dhfr o ts o dhfr-ts (denominado en los sucesivo colectivamente como fenotipo dhfr- ts) . Asimimso, dichas células de Neospora pueden ser mutantes nulos, condicionales o deficitarios. Como alternativa, una construcción genética de la presente invención puede contener secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural al gen DHFR-TS de Neospora o la ORF in situ, como se seleccionan a partir de las secuencias flanqueantes mostradas en el SEQ ID N0:1, presentando pocas o ninguna secuencia de nucleótidos de la región codificante del gen en sí mismo. Una construcción genética de este tipo, sería útil, por ejemplo, para suprimir el gen entero o la ORF. En una realización preferida, un constructo genérico de la presente invención contiene una molécula de polinucleótido que se pude utilizar para desactivar un gen DHFR-TS de Neospora, que contiene: (a) una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína DHFR-TS de N. caninum, pero cuya secuencia de nucleótidos contiene además una o más mutaciones desactivantes; o (b) una molécula de polinucleótido proteína polimerización de olefinas polinucleótidos que flanquea de forma de una forma natural la ORF de un gen DHFR-TS de Neospora in situ. Una vez transformada en células de una cepa de Neospora, la molécula de polinucleótido el constructo genético se dirige específicamente al gen DHFR-TS de Neospora, por ejemplo, por recombinación homologa y con ello sustituye el gen o la parte del mismo, o se inserta en el gen. Como consecuencia de este acontecimiento de recombinación, se desactiva el gen DHFR-TS, por otra parte nativo de esa cepa particular de Neospora. Los procedimientos para realizar una sustitución genética homologa en protozoos parásitos son conocidos en la técnica y se describen, entre otros en Cruz y Beverley, 1990, Nature 348:171-173; Cruz y otros, 1991. Proc. Nati Acad.d Scie. USA 88:7170-7174; Donald and Roos , 1994, Mol. Biochem. Parasitol. 63:243-253; and Titus y otros, 1995, Proc. Nati. Acad. Scie. USA 92:10267-10271, todas las cuales se incorporan a la presente por referencia. Para la mutación genética dirigida mediante recombinación homologa, el constructo genético es preferentemente un plásmido, circular o linealizado, que contiene una secuencia de nucleótidos mutada, como se ha descrito anteriormente. En una realización no limitante, se utilizan al menos aproximadamente 200 nucleótidos de la secuencia mutada para dirigir específicamente el constructo genético de la presente invención para la recombinación homologa del gen DHFR-TS de Neospora, aunque también pueden ser eficaces longitudes más cortas de nucleótidos. Asimismo, el plásmido contiene preferentemente una secuencia adicional de nucleótidos que codifica para un producto de un gen informativo u otro marcador seleccionable que se construye de forma que se inserte en el genoma de Neospora en asociación operativa con el elemento regulador que codifica para las secuencias de un gen DHFR-TS de Neospora nativo. Los genes informativos que se pueden utilizar en la práctica de la invención son bien conocidos en la técnica e incluyen aquellos que codifican para la CAT, la proteína fluorescente verde y la ß-galactosidasa, entre otros. Las secuencias de nucleótidos que codifican para marcadores seleccionables son bien conocidas en la técnica e incluyen aquellas que codifican para los productos génicos que confieren resistencia a antibióticos y anti-metabolitos, o que proporcionan un requerimiento auxotrófico. Los ejemplos de dichas secuencias incluyen aquellas que codifican para la resistencia a la pirimetamina o a la neomicina fosfotransfereasa (la cual confiere resistencia a os aminoglucósidos) o la higromicin fosfotransferasa (que confiere resistencia a la higromicina) . Los procedimientos que se pueden usar para crear un constructo genético de la presente invención son bien conocidos en la técnica e incluyen técnicas de recombinación genética in vivo, como se ha descrito, entre otros, en Maniatis y otros, 1989, más arriba; Ausubel, y otros, 1989 más arriba; y Sambrook y otros, 1989, más arriba. Las células de Neospora se pueden transformar o transfectar con un constructo genético de la presente invención de acuerdo con técnicas conocidas, tales como por ejemplo, electroporación. La selección de los transformantes se puede llevar a cabo utilizando técnicas convencionales, tales como por selección de las células que expresar un marcador seleccionable asociado con el constructo. La identificación de los transoformantes en los cuales se ha producido un acontecimiento de recombinación con éxito y en los que el gen diana particular ha sido desactivado, se puede llevar a cabo por análisis genético, tal como detectar una falta de transcriptos de mARN que codifican para proteína DHFR-TS o por aparición de un nuevo fenotipo, tal como patogenicidad reducida o células que no tienen proteína DHFR-TS, como se ha determinado, por ejemplo, por análisis inmunológico o alguna combinación del mismo. Las células de Neospora que se pueden modificar de acuerdo con la presente invención son preferentemente taquizoítos, pero como alternativa pueden ser bradizoítos u oosistos. Aunque las células en determinadas etapas del ciclo de vida de Neospora son diploides, los taquizoítos son haploides. Así, se prefiere el uso de taquizoítos en la producción e células de Neospora modificadas que expresan el fenotipo mutante apropiado debido a que los taquizoítos requieren solamente un sólo acontecimiento de recombinación satisfactorio para romper el gen de Neospora particular. Como alternativa, en las células diploides de Neospora , se deben romper dos alelos por cada gen. Esto se puede llevar a cabo seleccionando secuencialmente el primer alelo y a continuación el segundo alelo con constructos genéticos que lleva dos marcadores seleccionables diferentes. En otra realización no limitante, el constructo genético de la presente invención puede contener adicionalmente un gen diferente o una región codificadora de Neospora o de un patógeno diferente que pueda infectar a un animal, codificando este gen a la región codificadora un antígeno útil para inducir una respuesta inmune protectora separada y distinta en el animal cuando se le vacuna con las células de Neospora vivas modificadas de la presente invención. Este gen adicional o región codificadora se puede construir adicionalmente para que contenga una secuencia señal que produzca la secreción del antígeno codificado a partir de la célula de Neospora viva modificada, permitiendo así que el antígeno se muestre al sistema inmune del animal vacunado. La presente invención proporciona así células de Neospora vivas modificadas en las que el gen DHFR-TS ha sido destruido. Además, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar células de Neospora vivas modificadas que comprende; (a) la transformación de las células de Neospora con un constructo genético de la invención; (b) la selección de células transformadas en las cuales el gen DHFR-TS ha sido destruido por el constructo genético; y (c) la selección entre las células del paso (b) de aquellas células que se pueden usar en una vacuna para proteger a un mamífero de la neosporosis. 4.4.2. Cultivo de células de Neospora Las células de Neospora para su uso en la presente invención se pueden cultivar y mantener in vitro por infección de cualquier línea celular receptora, preferentemente en una línea celular de mamífero, con taquizoítos de acuerdo con las técnicas conocidas descritas en la técnica. Las líneas celulares de mamíferos en las cuales se pueden cultivar las taquizoítos de Neospora, incluyen por ejemplo, fibroblastos de prepucio humano (Lindsay y otros, 1993, Am. J. Vet. Res. 54:103-106), células endoteliales aórticas cardiopulmonares bovinas (Marsh y otros, 1995, más arriba), monocitos bovinos (Lindsay y Dubey, 1989, más arriba) y células renales de mono, entre otras. Por ejemplo, se pueden cultivar taquizoítos de N. caninum en monocapas de células de fibroblastos de prepucio humano Hs68 (ATCC n° de registro CRL-1635) (Lindsay y otros, 1993, más arriba) ; y células renales de mono MARC145 infectadas con taquizoítos de la cepa NC-1 de N. caninum para su uso en la presente invención están depositadas en la ATCC (n° de registro 12231) . Los bradizoítos se pueden cultivar y manipular de forma similar. Los cultivos de células de mamíferos pueden cultivarse y los cultivos celulares que han sido infectados con Neospora pueden mantenerse, en cualquiera de los muchos tipos de medios de cultivo descritos en la técnica. Por ejemplo, los cultivos en monocapa estacionarios de células endoteliales aórticas cardiopulmonares bovinas infectadas con taquizoítos de N. caninum pueden crecer en Medio Esencial Mínimo de Dulbeco (DMEM: Gibco Laboratories, N.Y.) suplementado con suero bovino fetal (FBS) ínactivado con calor al 10% (v/v) o suero equino adulto (ES) , L-glutamina 2mM, 50 U/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina (Conrad y otros, 1993, más arriba). Las monocapas de células de fibroblastos de prepucio humano Hs68 se pueden mantener en RPMI 1640 conteniendo FBS al 2% (v/v) , piruvato sódico 1.0 mM, 1 x 104 U/ml de penicilina, 1 x 10 µg/ml de estreptomicina, 5 x 10" mM de 2-mercaptoetanol y 0.3 mg/ml de L-glutamina (medio de matenimiento) . Los cultivos en monocapa de células de fibroblastos de prepucio humano Hs68 infectadas con Neospora se pueden mantener en medios idénticos, pero en los cuales el FBS se ha aumentado hasta el 10% (v/v) (medio de crecimiento) . Los cultivos monocapa de células de mamífero infectadas con Neospora se mantienen típicamente en condiciones de cultivo de tejidos convencionales, tales como por ejemplo, cultvio de tejidos convencionales, tales como por ejemplo, a 37°C y CO2 al 5%. Los taquizoítos se pasan típicamente a cultivos monocapa no infectados cuando el 70-90% de las células de mamífero en el cultivo se han infectado, lo cual se puede determinar microscópicamente utilizando técnicas convencionales. Los taquizoítos se pueden recoger de los cultivos de las células de mamífero infectadas Usando las células hospedadoras utilizando cualquier técnica convencionales y recogiendo los taquizoítos, por ejemplo, por filtración o por centrifugación. Las células de Neospora que han sido modificadas de acuerdo con la presente invención y las cuales presentan un fenotipo dhfr—ts, se pueden cultivar en células de mamífero, como se ha descrito anteriormente, en medio que contiene timidina . 4.5. Vacunas Anti-Neospora La presente invención proporciona una vacna contra la neosporois, que contiene una cantidad inmunológicamente eficaz de células de Neospora modificadas vivas, tales como por ejemplo, los mutantes nulos dhfr ts anteriormente mencionados y un vehículo veterinariamente aceptable. La presente invención proporciona además un procedimiento para preparar una vacuna que proteja a un mamífero contra la neosporosis, que comprende la preparación de células vivas modificdas, tales como por ejemplo, aquellas que presentan un fenotipo dhfr ts preparadas como se ha descrito anteriormente y la combinación de una cantidad inmunológicamente eficaz de las células vivas modificadas con un vehículo veterinariamente aceptable en una forma apropiada para su ácido al mamífero. Tal y como se utiliza en la presente, el término "cantidad inmunológicamente eficaz" se refiere a aquella cantidad de células de Neospora vivas modificadas de la presente invención capaces de inducir una respuesta protectora contra la neosporosis cuando se administran a un miembro de una especie animal después de una administración única o después de administraciones múltiples. La frase "capaz de inducir una respuesta protectora" se usa ampliamente en la presente para incluir la inducción o la intensificación de cualquier respuesta a base inmune en el animal en respuesta a la vacunación, incluyendo o un anticuerpo de inmunidad mediada por células o ambas, que sirve para proteger al animal vacunado contra la neosporosis. Los términos "respuesta protectora" y "protege", tal y como se utilizan en la presente, se refieren no solamente a la prevención absoluta de la neosporosis o a la prevención absoluta de la infección por un patógeno que produce la neosporosis, sino también a cualquier reducción detectable en el grado o velocidad de infección por dicho patógeno, o cualquier reducción detectable en la gravedad de la enfermedad o cualquier síntoma o trastorno resultante de la infección con le patógeno, incluyen, por ejemplo, cualquier reducción detectable en la velocidad de formación o en el número absoluto de lesiones formadas en uno o más tejidos, o cualquier reducción detectable en la velocidad de formación o en el número absoluto de lesiones formadas en uno o más tejidos, o cualquier reducción detectable en la producción de abortos o la transmisión de la infección desde un mamífero preñado a su feto, o desde un mamífero parental a su descendencia en el animal vacunado en comparación con un animal infectado no vacunado de la misma especie. La vacuna puede simplemente contener una alícuota del fluido de cultivo que contiene células de Neospora vivas modificadas, libres en el medio o residentes en las células hospedadoras de mamífero o una combinación de ambos, la cual se administra directamente al mamífero, o en su lugar puede contener células de Neospora vivas modificadas combinadas con un vehículo veterinariamente aceptable seleccionado entre aquellos conocidos en la técnica según sea la vía de administración. Se prefiere que al menos se mantenga algún grado de viabilidad de las células de Neospora vivas modificadas en la composición de la vacuna. Por ejemplo, una composición de la vacuna de la presente invención se pude formular siguiendo los procedimientos convencionales aceptados utilizando tampones, vehículos, estabilizantes, diluyentes, conservadores y/o solubilizantes convencionales y también se puede formular para facilitar la liberación sostenida. Los diluyentes pueden incluir también agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol, y similares. Los aditivos para la isotonicidad pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Se conocen otros vehículos y aditivos apropiados, que son particularmente útiles en las vacunas vivas modificadas o bien serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 18a ed., 1990, Mack Pubiishing, que se incorpora a la presente como referencia. Las células de Neospora vivas modificadas que se pueden utilizar en la vacuna de la presente invención son preferentemente taquizoítos, pero pueden ser como alternativax bradizoítos u oocistos, o alguna combinación de los mismos. La vacuna de la presente invención puede contener además uno o más componentes inmunomoduladores, tales como por ejemplo, un adyuvante o una citoquina, entre otros, siempre y cuando se mantenga cierto grado de viabilidad de las células de Neospora vivas modificadas. Los ejemplos no limitantes de los adyuvantes que se puden utilizar en la vacuna de la presente invención incluyen el sistema de adyuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, MT) , alumbre, geles minerales, tal como gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, tal como por ejemplo, adyuvantes de Freund completo e incompleto, copolímeros de bloque (CytRx, Atlanta GA) , adyuvante QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA) y SAF-M (Chiron, Emeryville CA) , AMPHIGENR, saponina, Quil A u otra fracción de saponina, monofosforil lípido A y adyuvante lipídico-amino Avridina. Los ejemplos específicos no limitantes de emulsiones de aceite de agua útiles para la vacuna de la invención incluyen formulaciones modificadas SEAM62 y SEAM 1/2. La SEAM62 modificada en una emulsión de aceite de agua que contiene escualeno al 5% (v/v) (Sigma) , detergente SPANR 85 (ICI Surfactants) al 1% (v/v), detergente TWEENR 80 al 0.7% (v/v) (ICI Surfactants), etanol al 2.5% (v/v), 200 µg/ml de Quil A, 100 µg/ml de colesterol y lecitina al 0.5% (v/v). La SEAM 1/2 modificada es una emulsión aceite en agua que contiene escualeno al 5% (v/v) , detergente SPANR 85 al 1% v/v, detergente TWEENR 80 al 0.7% (v/v), etanol al 2.5% (v/v), 100 µg/ml de Quil A y 50 µg/ml de colesterol. Otros agentes inmunomoduladores que se pueden incluir en la vacuna incluyen, por ejemplo, una o más interleucinas, interferones u otras citocinas conocidas. La vacuna se puede almacenar congelada, descongelándola antes de su administración. La vacuna de la presente invención puede opcionalmente formularse para la liberación sostenida de las células de Neospora vivas modificadas, siempre y cuando se mantenga al menos cierto grado de viabilidad de las células de Neospora vivas modificadas en la composición de la vacuna. Los ejemplos de formulaciones de liberación sostenida de este tipo incluyen células de INeospora vivas modificadas en combinación con los materiales compuestos de polímeros biocompatibles, tais como por ejemplo, poli (ácido láctico), poli (ácido láctico-co-glicólico) , hipromelosa, ácido hialurónico, colágeno y similares. La estructura, selección y uso de polímeros degradables en vehículos de liberación de fármacos se ha indicado en varias publicaciones incluyendo A. Domb y otros, 1992. Polymers for Advances Technologies 3:279-292, la cual se incorpora a la presente como referencia. En el texto de M. Chasin y R. Langer (eds), 1990, "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems" en: Drugs and the Pharmaceutical Sciences. Vol. 45, Dekker, NY, se puede encontrar una guía adicional para la selección y uso de polímeros en las formulaciones farmacéuticas, el cual se incorproa también en la presente invención como referencia. Como alternativa, o además, las células de Neospora vivas modificadas se pueden microencapsular para mejorar la administración y eficacia, siempre y cuando se mantenga al menos cierto grado de viabilidad de las células de Neospora vivas modificadas en la composición de vacuna. Los procedimientos para la microencapsulación de antígenos son bien conocidos en la técnica e incluyen técnicas descritas, por ejemplo, en la patente estadounidense 3.137.631; patente estadounidense 3.959.457; patente estadounidense 4.205.060; patente estadounidense 4.606.940; patente estadounidense 4.744.933; patente estadounidense 5.132.117 y publicación internacional WO 95/28227, todos los cuales se incorporan enla presente como referencia. Los liposomas también pueden usarse para proporcionar la liberación sostenida de las células de Neospora vivas modificadas de la invención, siempre y cuando se mantenga cierto grado de viabilidad de las células de Neospora vivas modificadas en la composición de la vacuna. Los detalles concernientes a cómo preparar y usar las formulaciones de liposomas se pueden encontrar entre otros, en la patente estadounidense 4.016.100; la patente estadounidense 4.452.747; la patente estadounidense 4.921.706; la patente estadounidense 4.927.637; la patente estadounidense 5.008.050 y la patente estadounidense 5.009.956, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. La presente invención proporciona además una vacuna de combinación para la protección de un mamífero contra la neosporosis y, opcionalmente, una o más enfermedadaes o trastornos patológicos que pueden afectar al mamífero, comprendiendo esta vacuna de combinación una cantidad inmunológicamente eficaz en un primer componente que contiene células de Neospora vivas modificadas; una cantidad inmunológicamente eficaz de un segundo componente capaz de inducir una respuesta protectora contra una enfermedad o trastorno patológico que afecte a un mamífero, y un vehículo veterinariamente aceptable. El segundo componente de la vacuna de combinación se selecciona en base a su capacidad de inducir una respuesta protectora contra la neosporosis u otra enfermedad o trastorno patológico que pueda afectar a miembros de la especie de los mamíferos, como se sabe en la técnica. Cualquier composición inmunogénica conocida que pueda ser útil en una composición de vacuna en la especie de mamífero en particular, se puede usar en el segundo componente de la vacuna de combinación, siempre y cuando se mantenga cierto grado de viabilidad de las células de Neospora vivas modificadas en la composición de vacuna resultante. Dichas composiciones inmunogénicas incluyen, pero no están limitadas a aquellas que proporcionan protección contra los patógenos seleccionados entre el grupo que consiste en el virus del herpes bovino (sin: rinotraqueitis bovina infecciosa) , virus sincitial respiratorio bovino, virus de diarrea viral bovina, virus de parainfluenza tipo I, II o III, Leptosispira spp., Campylobacter spp., Staphylococcus aureus , Streptococcus agalactiae, Mvcoplasma spp., Klebsiella spp., Salmonella spp., rotavirus, coronavirus, virus de la rabia, Pasteurella hemolytica. Pasteurella multocida, Clostridia spp., el toxoide de Tetanus, E. Coli, Cyptosporidium spp., Eimeria spp . , Trichomonas spp., y otros parásitos eucariotas, entre muchos otros. La vacuna de combinación de la presente invención puede contener además uno o más componentes inmunomoduladores adicionales, incluyendo por ejemplo, un adyuvante o una citocina, como se ha descrito más arriba, siempre y cuando se mantenga la viabilidad de las células de composición de la vacuna. Los antígenos de la vacuna de combinación pueden almacenarse congelados y descongelados antes de la administración. La presente invención proporciona además un procedimiento para la protección de un mamífero contra la neosporosis, que comprende la administración al mamífero de una vacuna que contiene una cantidad inmunológicamente eficaz de células vivas modificads de Neospora de la presente invención y un vehículo veterinariamente aceptable. La vacuna se administra preferentemente por vía parenteral, por ejemplo, por incluyen subcutánea o intramuscular. Sin embargo, la vacuna se puede administrar por inyección intraperitoneal o intravenosa por otras vías, incluyendo, por ejemplo, las vías oral, intranasal, rectal, vaginal, intraocular o mediante la combinación de vías, y también mediante dispositivos de liberación retardada como se conocen en la técnica. El experto en la técnica sabrá cómo formular la composición de la vacuna de acuerdo con la vía elegida. Se puede determinar una dosificación eficaz por medios convencionales, comenzando con una dosis baja de células de Neospora vivas modificadas y aumentando a continuación la dosis a la vez que se van controlando los efectos. Se pueden tomar en consideración numerosos factores cuando se determina una dosis óptima por animal. Entre las principales está la especie, tamaño, edad y estado general del animal, la presencia de otros fármacos en el animal, la virlencia de una especie en particular de la cepa de Neospora contra la cual se va a vacunar y similares. La dosificación real se elige preferentemente después de considerar los resultados procedentes de otros estudios en animales. Los regímenes de vacunas también se pueden seleccionar basándose en los factores anteriormente descritos. La vacuna de la invención también se puede administrar en cualquier momento durante la vida de un animal en particular dependiendo de varios factores incluyendo, por ejemplo, la aparición de un brote de neosporosis en otros animales, etc. La vacuna se puede administrar a los animales en edad de destete o más jóvenes o a animales más maduros, etc., como una vacuna antes del cruce para protegerles contra la enfermedad congénita o aborto relacionados con Neospora. La protección eficaz puede requerir solamente una vacunación primaria o bien se puede necesitar una o más vacunaciones de refuerzo. Un procedimiento para detectar si se ha obtenido una protección inmune adecuada es determinar la seroconversión y la valorización de anticuerpos en el animal después de la vacunación. La pauta de la vacunación y el número de vacunas de recuerdo, dado el caso, se determinarán preferentemente por un veterinario basándose en el análisis de todos los factores relevantes, algunos de los cuales se han descrito anteriormente. La cantidad de células de Neospora vivas modificadas en la vacuna oscila preferentemente entre aproximadamente 1 x 103 y aproximadamente 1 x 108/ml y más preferentemente entre aproximadamente 1 x 105 y aproximadamente 1 x 10 /ml. Un tamaño de dosificación apropiado oscila entre aproximadamente 0.5 ml y aproximadamente 10 ml y más preferentemente entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 5 ml . La vacuna de la presente invención es útil para proteger a los mamíferos contra la neosporosis. Tal y como se utiliza en la presente, el té ino "mamífero" se refiere a cualquier especie animal que se pueda proteger contra la neosporosis utilizando la vacuna de la invención, incluyendo perros, vacas, cabras, ovejas y caballos entre otros. La vacuna es útil para proteger tanto a mamíferos preñados como no preñados . La presente invención proporciona además un estuche para la vacunación de un animal contra la neosporosis, que contiene un primer envase que tiene una cantidad inmunológicamente eficaz de células de Neospora vivas modificadas de la presente invención y un segundo envase que tiene un vehículo o diluyente veterinariamente aceptable. Las células vivas modificadas del estuche se pueden almacenar congeladas, descongelándolas antes de su administración. El siguiente ejemplo es sólo ilustrativo y no se pretende que limite el alcance de la presente invención.

EJEMPLO 5 AISLAMIENTO DEL GEN DHFR-TS DE NEOSPORA .1 Amplificación del exón 1 del Dominio DHFR de N. caninum Se diseñaron cebadores de oligonucleótidos de viente pares de bases de longitud específicos para los extremos 5 ' y 3 ' de la secuencia de ADN del exón 1 del gen DHFR-TS de T. gondii y se sintetizaron basándose en la secuencia publicada del gen DHFR-TS de T. gondii (Roos, 1993, J. Biol. Chem. 268:6269-6280). Se preparó el ADN genómico de la cepa NC-1 de N. caninum utilizando el estuche GNOME™ (Bio 101, La Jolla, CA) utilizando los reactivos y protocolos proporcionados por el fabricante. La PCR se llevó a cabo con 0.5 µg de ADN genómico; 120 pmol de cada uno de los cebadores Tgdhfrexon 1-5' (5'-ATGCAGAAACCGGTGTGTCT) (SEQ ID NO : 4 ) y Tgdhfrexonl-3 ' (51-AGGAAGAGGAAACGACGAT) (SEQ ID NO : 5 ) ; 2.5 mM de dATP, dGTP, dCTP y dTTP (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) ; tampon PCR (Perkin-Elmer) ; y 1.5 U de ADN polimerasa AMPLITAQ™ (Perkin-Elmer). El ciclo PCR fue 1 ciclo de 94°C durante 1 min y 29 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto, 72 °C durante 1 minuto. Se obtuvo un producto de la PCR de aproximadamente 0.3 kb y se clonó en un vector pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA) , sin tratamiento posterior utilizando ADN ligasa T4. El fragmento clonado de aproximadamente 0.3 kb se secuenció mediante el procedimiento de secuenciación de terminación de la cadena didesoxi y se determina que la secuencia era >85% homologa con la secuencia del exón 1 DHFR-TS correspondiente de T. gondii. .2. Clonación y secuenciación del gen DHFR-TS de Neospora Se hizo un banco del ADN genómico de la cepa NC-1 de N. caninum en el vector bacteriófago lambda DASHII (Stratagene, La Jolla, CA) . El fragmento de ~0.3 kb anterior se marcó radioactivamente con O -P-dCTP y se busco en aproximadamente 5 x 105 clones de fagos la reactividad del fragmento marcado mediante hibridación en placa. Después de tres rondas de selección para enriquecer los clones reactivos, se identificaron 12 clones de fagos reactivos con la secuencia de ~0.3 kb. Se preparó el ADN del clon del bacteriófago lambda a partir de 3 de los 12 clones positivos utilizando un sistema de aislamiento del ADN de lambda (Qiagen, Chatsworth, CA) de acuerdo con los protocolos del fabricante. El ADN de uno de los clones del fago lambda, el cual ha sido denominado como lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) (también denominado como 4C13 o lambdaCY50) se digirió con Notl liberando un fragmento de ADN de 11 kg, el cual se subclonó de acuerdo con los procedimientos descritos en Sambrook y otros, 1989, más arriba. La PCR se realizó sobre el ADN de un subclon plasmídico que contenía el fragmento de ADN de 11 kb utilizando los siguientes oligonucleótidos, los cuales se diseñaron en base a la secuencia DHFR-TS: 5 '-CCCCTCGTGGACCGGCTGAATA (SEQ ID NO: 6). 5' -TCCGTGCGTGCCAAGA-GACTG (SEQ ID NO: 7); 5-ATGGAGATGGCGATGGGAGGAC (SEQ ID NO : 8 ) ; Y 5' AGTATGTACACGAAGCCTCAAT (SEQ ID NO: 9). Se utilizaron oligonucleótidos para la PCR en las siguientes combinaciones: SEQ ID NOS: 6 & 8; SEQ ID NOS: 6 & 9; SEQ ID NOS: 7 & 8 ; y SEQ ID NOS: 7 & 9. La PCR rindió unos productos específicos que sugieran de la presencia del gen DHFR-TS de Neospora dentro del fragmento de 11 kb. Unos análisis de restricción adicionales del subclon plasmídico que contenía el fragmento de 11 kb indicaron la presencia de un sitio asimétrico HindIII dentro de los aproximadamente 1.5 kb de uno de los sitios Notl. A continuación se determinó la secuencia de ADN del sitio Notl en un extremo del sitio HindIII y en el otro extremo (~9.6 kb) por paseo con cebadores aplicando el procedimiento de secuenciación de terminación de la cadena didesoxi. Las secuencias de ADN así obtenidas se analizaron utilizando el programa de software DNASTAR" (DNASTAR Inc., Madison, Wl). La longitud del fragmento anteriormente secuenciado es de 9603 pb (SEQ ID NO:l) y contiene la secuencia del gen DHFR-TS entero de la cepa NC-1 de N caninum. La secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS de Neospora se comparó con la de la secuencia publicada del gen DHFR-TS para T. gondii para predecir las localizaciones de exones e intrones, así como los límites de los dominios DHFR-TS y TS.. Se cree que el gen DHFR-TS de Neospora contiene 10 exones y 9 intrones de la siguiente forma: Exón 1 -desde <2405-2724; Exón 2 -desde 3212-3348; Exón 3 -desde 3925-4262; Exón 4 -desde 4491-4737; Exón 5 -desde 5214-5307; Exón 6 -desde 5678-5750; Exón 7 -desde 6129-6270; Exón 8 -desde 6685-6777; Exón 9 -desde 7264-7574; y Exón 10 -desde 8116->8199) . Las señales consenso de corte y empalme están presentes en las uniones intrón-exón. El dominio predicho DHFR va desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 4664; y eldominio TS predicho va desde aproximadamente el nt 4665 hasta aproximadamente el nt 1899, basándose en la analogía estructural con la secuencia DHFR-TS publicada para T. gondii. El marco de lectura abierta (ORF) predicho que codifica para la proteína DHFR-TS de la cepa NC-1 de N. caninum tiene 1.839 pb de longitud (SEQ ID NO:2). El marco ORF que codifica para el dominio predicho va desde aproximadamente el nt 1 hasta aproximadamente el nucleótido 969. La ORF que codifica el dominio TS predicho va desde aproximadamente el nt 870 hasta aproximadamente el nt 1836. La secuencia de aminoácidos deducida de la proteína DHFR-TS de la cepa NC-1 de N. caninum es de 612 aminoácidos de longitud (SEQ ID NO: 3) . La secuencia de aminoácidos deducida que comprende el dominio DHFR-TS predicho va desde aproximadamente el resto aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 323; la secuencia de aminoácidos deducida que comprende el domino TS predicho va desde aproximadamente el resto aminoácido 324 hasta aproximadamente el resto aminoácido 612. El análisis de la secuencia indica que existen 73 diferencias entre aminoácidos en el dominio DHFR y 15 aminoácidos de diferencia en el dominio TS entre la secuencia de aminoácidos deducida de N. caninum y la secuencia predicha de DHFR-TS de T. gondii.

Depósito de material biológico El siguiente material biológico se depositó en el American Type Culture Collection (ATCC) en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, EE.UU. el 3 de diciembre de 1997 y se le adjudicó el siguiente número de registro: fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) . Todas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones citadas más arriba se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. La presente invención no está limitada en su alcance por las realizaciones específicas descritas, las cuales solo se pretende que sean ilustraciones concretas de los aspectos individuales de la invención. Las composiciones y procedimientos funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Así, varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Dichas modificaciones se pretende que entren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE FRECUENCIAS <110> Kn siman, B . Retendrá Yodar, ? . Chx? atine Durtschi . Beclty A . <120> DNA QUE CODIFICA PARA LA DIHIDROFOLATO REDUCTASA TIMIDILATO SINTETA8A DE NEOSPORA <130> DHGR-TS <140> <141> <150> 60/067,501 <151> 1997-12-04 <160> 9 <170> Paceptln Ver. 2.0 - beca <210> 1 <211> 9603 <212> DNA <213> Neospora caninum <220> <221> gen <222> (2405) ..18199) <400> 1 gcggccgccg gcacaatgec gagggcagcg cagggaaaaa ccggccgaag ctgcttcacg 60 tgcctgaaaa tagagccagc gctactrteg cttcaaagaa cgagacttcc gcgccacaaa 120 tcggtagtga cggcggccgg aagcgaaaat tttacgacga gcagctgcca gtcggcgtgt 180 accgtcacca gcagaagtat gtcgcgaact gggtagaccc gaaaacccgg agacaaatca 240 aggtctgttt ccccatcgac gtgtg ggag acrctcaagc tcgcaacatg gctgccgttg 300 cgaggcgtga gcgctgcgtg gatgtcgacg aggt gctge tattttcaat cgtgaagagc 360 gcaccaagac atcaggacgt catccgagtc cttcgaggga tgacagcaaa cagacagcgt 420 ctttcaatag tgctgttagg atgccagcag tccagggtgt ggattcaaaa acggagacgc 480 actcggctcc ggcgctcgaa agcgcgtaga gcctgaggcc acaccacttc tggttttcag 540 agagggcgtc gcactcacaa ttttcttcga cttctttccg cacactgggg ccgtgtgctc 600 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gtgcggcttt cccc ggggt ctttgcttct ctctgttcgc cgccttgcct 4860 gccacatttt cccttcattt tttttctctg tctcccttgc tcttttgtcc taacgttcgt 4920 actcgccttc gtctcgcagt ccacgcttca aaacagacgg gctaccgaaa cgtgttttcc 4980 cectgcacgg cct ttttcac acgccgttgt cgcttgactc tcgctgacgc ggggtttgcc 5040 gcttcctgga agaaagaagg ecttt cctca ectgttegcc cttttcgctg tttcacagaa 5100 agacgagaga gattccgcct ccattttctc aattege?tt .c;tgccc=a agcagatgtg 5160 ccctgatctg gaggctcttc gccgctcccc ttctcccct? tcgccgcttt caggcgttgg 5220 agtcatctcc aagttcggct geaccatgcg gttctcgct; gataaggcct tccctcecct 5280 caccacaaag cgtgtgttct ggaaagg?ta cggcgcccta caaaaatctg tatatattta 5340 acaggcacac gtgtgcgtgt ctgacctgca cacgtgttca taaacgtgca cgcaattgta 5400 t :gtggctg sc gtggagtcgt ccacgaacag gaaatattcs catgcatgca ctctacagac 5460 gtgcctggac tgcttctcta ccttcgtttg tctgtttatt tgctttaatt tcgcccggtg 5520 accgtcgcgc ctcegtctga ccgtgcattt gcttgcgect catcgtagtg tgcgtatcga 5580 agacgagaga gcatgtgacg ctgttgtcta egccgagta: gagaagtecg cacgacggtc 5640 gctgaacgat gttctttt cc gtgtgggttg ctctcaga?i cctcgaggag ctgttgtggt 5700 tcatccgcgg tgacacgaac gcgaatcacc tctctgaaaa gggcgtaaag gcaagtcttc 5760 aagcaccgct gctctcgttc aggctcctcc gcagacttgg cgctttcctt cgcggcgtca 5820 cccctccgag gcttcacact eacattgagt gtacecgtf. gtcttctaga ccgtctgctg 5880 cgtttgcagg cccccgcgtg agegcaggcc cttcatcgee gagtgtggcc gtagctttgc 5940 gcgacgaaga cagtcgatag gccttccaga gcacgttcct tctgtctccc gttttccccg 6000 tttttttccg cgtcttcctc cgacagcctc gcacggctea catcccctct gagccgggac 6060 agggctcgcc taaggcagag taccacgctc cgtaacttcc ggcatgcgtt tctgggtttt 6120 cgttttagat ctgggacaag aatgtgacaa gagagttcct tgattcacgc aatctttccc 6180 accgagaggt cggagacatc ggeccgggtt acggcttcca gtggagacac ttcggcgcga 6240 cctacaagga catgcacacg gactacactg gtatgtcccg gcgttctttg aggggggaag 6300 ggaaagcagc cgaacccgcg aaacggcgct gatgccegtt ctcgcttcgt gtgctggacc 6360 gaccgttcca gccatatcgc aggttecaat agccgccaca aacggagatg aaaatgcaag 6420 gcgacgactc tgcgctcgcg cacaactggt gacagacgcc actccgtgtg gacgaattcg 6480 gttgcaaact 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( 1B39) <400> 2 atg cag aaa cea gtg tet ctt aet gee gcg atg aec eec agg agg ggc 48 Met Gln Lys Pro Val Ser Leu He Ala Ala Mat Thr Pro Arg Arg Gly 1 5 10 15 ate ggc gtc aac aac ggc ctg cea tgg ecc cae tzz gcc acá gat ttc 96 He Gly Val Asn Asn Gly Leu Pro Trp Pro Has Le. Aia Thr Asp Phe 20 25 30 aaa cae ttt tet cgc gtg acg aaa acg acg gcc gac gaa gtc tet cgc 144 Lys His Phe Ser Arg Val Thr Lys Thr Thr Ala Asp Glu Val Ser Arg 35 «0 45 ctg aac gca tgg ctt ecg aaa aaa att gcc aag acg ggc gat teg gga 192 Leu ?sn Ala Trp Leu Pro Lys Lys He Ala Lys Thr Gly Asp Ser Gly 50 55 6C ctt ecc tet ecc gcc ttc ggt gtc aac aga ttc aac gct gtt gtc atg 240 Leu Pro Ser Pro Ala Phe Gly val Asn Arg Phe Asn Ala Val Val Het 65 70 75 80 gga cga aaa acc tgg gag age ttg ceg cta aaa ttt cgt ecc etc gtg 288 Gly Arg Lys Thr Trp Glu Ser Leu Pro Leu Lys Phe Arg Pro Leu Val 85 90 95 gac cgg ctg aat ate gtg gtt tec tec tec etc aaa gaa gaa gac ate 336 Asp Arg Leu Asn He Val Val Ser Ser Ser Leu Lys Glu Glu Asp He 100 105 110 gcg gcg gag aag ect cta gtc gaa ggc cag caá cgc gtg cga gtc tgc 384 Ala Ala Glu Lys Pro Leu Val Glu Gly Gln Gln Aro Val Arg Val cys 115 120 125 gat tea etc ecc gca gcc ctg cgc ctt gtg gac gas gag tac aga gag 432 Aap Ser Leu Pío Ala Ala Leu Arg Leu Val Asp Glu Glu Tyr Arg Glu 130 135 140 tet gtt gae cag att tae gtt gtg gga gga gcg ggg etc tat gag gaa 480 Ser Val Asp Gln Ue Tyr Val Val Gly Gly Ala Gly Leu Tyr Glu Glu 145 150 155 160 gcc ctg ter ctg ggc gtg gtg tet cae etc tac ate acc cgc gtg gcg 528 Ala Leu Ser Leu Gly Val Val ser Hls Leu Tyr He Thr Arg Val Ala 165 170 175 cgt gac ttt cea tgc gac gtt ttc ttt ecc gct ttc ecc gga gac tec 576 Arg Asp Phe Pro Cys Asp Val Phe Phe Pro Ala Phe Pro Gly Asp Ser 180 185 190 att ctt tea aac aag cag gcg gcc tec gcg agt cag ect teg gct gct 62« Ue Leu Ser Asn Lys Gln Ala Ala Ser Ala Ser Gln Pro Ser Ala Ala 195 200 205 gcg gaa ceg gtg tet gtt ceg ttt tac ecc cag etc ggg aga gag aag 672 Ala Glu Pro al Phe Val Pro Phe Cys Pro Gln Leu Gly Arg Glu Lys 210 215 220 age aat gaa gcg teg tac cga ecc ate ttt att tea aag acc tac teg 720 Ser Asn Glu Ala Ser Tyr Arg Pro He Phe He Ser Lya Thr Tyr Ser 225 230 235 240 gac aac gga gtg ecc tac gac ttt gtg gtt ctt gaa aaa ggg agg aag 768 Asp Asn Gly Val Pro Tyr Asp Phe Val Val Leu Glu Lys Gly Arg Lys 245 250 235 gct gac gct tgc age gcc acg gaa teg tgc gag ctt cgc ggc ect tgg 816 Ala Asp Ala Cys Ser Ala Thr Glu Ser Cys Glu Leu Arg Gly Pro Trp 260 265 270 acc tec acc gga gag acg tec cea gag acg agg ctt ceg tet tec tec B64 Thr Ser Thr Gly Glu Thr Ser Pro Glu Thr Arg Leu Pro Ser Ser Ser 275 280 285 gcc tea gcc gtt gcc cag gt? ttg gct tgg atg gcc gac gaa gac cgg 912 Ala Ser Ala Val Ala Gln Val Leu Ala Trp Met Ala Asp Glu Asp ?rg 290 295 300 aaa aaa tgc gag aag aaa gae ate att cgg gca gtg ect cae gtc cae 960 Lys Lys Cys Glu Lys Lys Glu He He Arg Ala Val Pro Hls Val His 305 310 315 320 ttt cgg ggc cae gaa gaa ttc cag tac etc gac etc att gcc gat att 1008 Phe Arg Gly Hia Glu Glu Phe Gln Tyr Leu Asp Leu He Ala Asp He 325 330 335 ate aac aac gga gcg acá atg gac gac cga acg ggc gtt gga gtc ate 1056 He Asn Asn Gly Ala Thr Met Asp Asp Arg Thr Gly Val Gly Val He 340 345 350 tec aag tec ggc tgt acc atg cgg ttc teg ctg gat aag gcc ttc ect 1104 Ser Lys Phe Gly Cys Thr Met Arg Phe Ser Leu Asp Lys Ala Phe Pro 355 360 365 etc etc acc acá aag cgt gtg ttc tgg aaa gga gtc etc gag gag ctg 1152 Leu Leu Thr Thr Lys Arg Val Pne Trp Lys Gly Val Leu Glu Glu Leu 370 375 380 teg tgg tec ate cgc ggt gac acg aac gcg aat cae cte tet gaa aag 1200 Leu Trp Phß He Arg Gly Asp Thr Asn Ala Asn His Leu Ser Glu Lys 385 390 395 400 ggc gta aag ate tgg gac aag aat gtg acá aga gag etc ctt gat tea 1248 Gly Val Lys He Trp Asp Lys Asn Val Thr Arg Glu Phe Leu Asp Ser 405 410 415 cgc aat ctt tec cae cga gag gtc gga gac ate ggc ceg gge eac ggc 1296 Arg Asn Leu Ser Hxs Arg Glu Val Gly Asp He Gly Pro Gly Tyr Gly 420 425 430 etc cag tgg aga cae ttc ggc gcg ace tac aag gac atg cae acg gac 1344 Phe Gln Trp Arg His Phe Gly Ala Thr Tyr Lys Asp Met His Thr Asp 435 440 445 tac ace ggt cag ggc gta gac caá ctg aag aag gtg ate aac atg ctg 1392 Tyr Thr Gly Gln Gly Val Asp Gln Leu Lys Lys Val He Asn Het Leu 450 455 460 aga acg aat cea ac gac cgg cgc atg cte atg aec gct tgg aac ect 1440 Arg Thr Asn Pro Thr Asp Arg Axg Met Leu Met Thr Ala Trp Asn Pro 465 470 475 480 gcg gcg ctg gac gaa atg gcg ttg ceg cet tgc cae ttg ctg tgt cag 1488 Ala Ala Leu Asp Glu Met Ala Leu Pro Pro Cys His Leu Leu Cys Gln 485 490 495 ttc tac gtg gag aac gac aga gac ttg tet tgc gtc atg tat cag cgg 1536 Phe Tyr Val Glu Asn Asp Arg Asp Leu Ser Cys Val Met Tyr Gln Arg 500 505 510 tec tgc gac gtt ggc etc ggg gtg ceg ttc aac att gcg tec tat tec 1584 Ser Cys Asp Val Gly Leu Gly Val Pro Phe Asn lie Ala Ser Tyr Ser 515 520 525 ctt ctg acg etc atg gtt gcg cae gtc tgc aac ctg aag ceg aag gag 1632 Leu Leu Thr Leu Met Val Ala His Val Cys Asn Leu Lys Pro Lys Glu 530 535 540 ttc att cae ttc atg ggc aac acg cae gte tac teg aac cae gtc gag 1680 Phe He His Phe Met Gly Asn Thr His Val Tyr Ser Asn His Val ßlu 545 550 555 560 gcc ctg aag gag cag ctg cgc aga gaa ceg aga ect ttc ecc ate gtg 1728 Ala Leu Lys Glu Gln Leu Arg Arg Glu Pro Arg Pro Phe Pro He Val 565 S70 575 aac ate ctg aac aag gaa cgc ate cag gaa ate gac gac tte acc gcc 1776 Asn Ue Leu Asn Lys Glu Arg He Gln Glu Ue Asp Asp Phe Thr Ala 580 585 590 gag gar etc gag gec geg ggc tac gtg ceg cat gga cga ate cag atg 1B24 Glu Asp Phe Glu Val Val Gly Tyr Val Pro His Gly Arg Ue Gln Met 595 600 605 gag atg get gtt tag 133g Glu Met Ala Val 610 <210> 3 <211> 612 <212> PRT <213> Neospora caninum <400> 3 Met Gln Lys Pro Val ser Leu Ue Ala Ala Het Thr Pro ?rg Arg Gly 1 5 10 15 He Gly Val Asn Asn Gly Leu Pro Trp Pro His Leu Ala Thr Asp Phe 20 25 30 Lys His Phe Ser Arg Val Thr Lys Thr Thr Ala Asp Glu Val Ser Arg 35 40 45 Leu Asn Ala Trp Leu Pro Lys Lys Ue Ala Lys Thr Gly Asp Ser Gly 50 55 60 Leu Pro Ser Pro Ala Phe Gly Val Asn Arg Phe Asn Ala Val Val Met 65 70 75 80 Gly Arg Lys Thr Trp Glu Ser Leu Pro Leu Lys Phe Arg Pro Leu Val 85 90 95 Asp ?rg Leu Asn Ue Val Val Ser Ser Ser Leu Lys Glu Glu Asp Ue 100 105 110 Ala Ala Glu Lys Pro Leu Val Glu Gly Gln Gln ?rg Val ?rg Val Cys 115 120 125 Asp Ser Leu Pro Ala Ala Leu Arg Leu Val Asp Glu Glu Tyr Arg Glu 130 135 140 Ser Val Asp Gln Ue Tyr Val Val Gly Gly Ala Giy Leu Tyr Glu Glu 145 150 155 160 Ala Leu Ser Leu Gly Val Val Ser His Leu Tyr He Thr Arg Val Ala 165 170 175 Arg Asp Phe Pro ys Asp Val Phe Phe Pro Ala Phe Pro Gly Asp Ser 180 185 190 Tle Leu Ser Asn Lys G n Ala Ala Ser Ala Ser G n Pro Ser Ala Ala 195 200 205 Ala Glu Pro Val Phe Val Pro Phe Cys Pro Gln Leu Gly Arg Glu Lys 210 215 220 Ser Asn Glu Ala Ser Tyr Arg Pro Ue Phe He Ser Lys Thr Tyr Ser 225 230 235 240 Aßp Aan Gly Val Pro Tyr Asp Phe Val Val Leu Glu Lys Gly Arg Lys 245 250 255 Ala Asp Ala Cys Ser Ala Thr Glu Ser Cys Glu Leu ?xg Gly Pro Trp 260 265 270 Thr Ser Thr Gly Glu Thr Ser Pro Glu Thr Arg Leu Pro Ser Ser Ser 275 280 285 Ala ser Ala Val Ala Gln Val Leu Ala Trp Met Ala ?sp Gl? Asp Arg 290 295 300 Lys Lys Cys Glu Lys Lys Glu He He Arg Ala Val Pro His Val His 305 310 315 320 Phe Arg Gly H s Glu Glu Phe Gln Tyr Leu Asp Leu Ue Ala Asp He 325 330 335 Ue Asn Asn Gly Ala Thr Met ?sp ?sp Arg Thr Gly Val Gly Val Ue 340 345 350 Ser Lys Phe Gly Cys Thr Met Arg Phß Ser Leu Asp Lys Ala Phe Pro 355 360 365 Leu Leu Thr Thr Lys Arg Val Phe Trp Lys Gly Val Leu Glu Glu Leu 370 375 380 Leu Trp Phe Ue Arg Gly ?sp Thr Asn Ala Asn His Leu Ser Glu Lys <400> 4 atgcagaaac cggtgtgtct <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Neospora caninum <400> 5 agggaagagg aaacgacgat 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Neospora caninum <400> 6 cccctcgtgg accggctgaa ca <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Neospora caninum <400> 7 tccgtgcgtg ccaagagaec g 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Neospora caninuro <400> 8 atggagatgg egatgggagg ac 22 <210> 9 <211? 22 <212> DNA <213> Neospora caninum <400> 9 agtatgtaca cgaagcctca at 22

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una molécula de polinucleótido aislada que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína DHFR-TS de Neospora.

2.- La molécula de polinucleótido aislada de la reivindicación 1, en el que la proteína DHFR-TS contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (atcc n° de registro 209512) .

3. - La molécula de polinucleótido aislada de la reivindicación 2, que contiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:l desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199, o una secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512), o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO : 2.

4.- Una molécula de polinucleótido aislada que es sustancialmente homologa a una molécula de polinucleótido que contiene: (a) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:l desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199; o (b) la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512), o (c) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO : 2.

5. - Una molécula de polinucleótido aislada que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo a una proteína DHFR-TS de Neospora que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3, o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) .

6.- Una molécula de polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos que sustancialmente es una parte de: (a) una molécula de polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO : 1 desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199; (b) una molécula de polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) ; (c) una molécula de polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2; (d) una molécula de polinucleótido que es sustancialmente homologa a cualquiera de las moléculas de polinucleótidos de (a) , (b) o (c) ; o (e) una molécula de polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo a una proteína DHFR-TS de neospora que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) .

7.- La molécula de polinucleótido de la reivindicación 6, que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento peptídico de (a) una proteína DHFR-TS que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512); o (b) un polipéptido que es sustancialmente homólogo a una proteína DHFR-TS de Neospora que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 3 , o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) .

8.- La molécula de polinucleótido de la reivindicación 7, que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica para el dominio DHFR o el dominio TS de la proteína DHFR-TS.

9.- Una molécula de polinucleótido aislada que contiene una secuencia de nucleótidos que flaquea el gen DHFR-TS in situ en N. caninum, comol la seleccionada a partir de las secuencias de nucleótidos flanqueantes mostradas en la SEQ ID NO:l.

10.- Un vector recombinante que comprende: (a) una molécula de polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO : 1 desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199; (b) una molécula de polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) ; (c) una molécula de polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO : 2 ; (d) una molécula de polinucléotido que es sustancialmente homologa a cualquiera de las moléculas de polinucleótidos de (a) , (b) o (c) ; o (e) una molécula de polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo a una proteína DHFR-TS de Neospora que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512); o (f) una molécula de polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos que es una parte sustancial de cualquiera de las moléculas de polinucleótidos de (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .

11.- El vector recombinante de la reivindicación 10, en el que la molécula de polinucleótido contiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:l desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199.

12.- El vector recombnante de la reivindicación 11, el cual es el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) .

13.- Una célula hospedadora transformada, que contiene el vector recombinante de la reivindicación 10.

14.- Una proteína sustancialmente purificada que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de aminoácidos de una proteína DFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) .

15.- Un polipéptido sustancialmente purificado que es sustancialmente homólogo a la proteína de la reivindicación 14.

16.- Un fragmento peptídico de la proteína de la reivindicación 14 ó 15.

17.- El fragmento peptídico de la reivindicación 16, que consiste en un aislado del dominio DHFR o TS de Neospora .

18.- Un anticuerpo que reacciona específicamente contra una proteína DHFR-TS de Neospora que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de aminoácidos de una proteína DHFR-TS como la codificada por el gen DHFR-TS presente en el fago lambdaNclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) .

19.- Un constructo genético que se puede usar para desactivar un gen DHFR-TS de Neospora, conteniendo dicho constructo genético: (a) una molécula de polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 desde aproximadamente el nt 2405 hasta aproximadamente el nt 8199, o una secuencia de nucleótidos que es la misma que la secuencia de nucleótidos del gen DHFR-TS presente en el fago lambdaclDHFRTS (ATCC n° de registro 209512) ; (b) una molécula de polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2; (c) una molécula de polinucleótido que es sustancialmente homologa a cualquiera de las moléculas de polinucleótidos de (a) o (b) ; o (d) una molécula de polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos que es una parte sustancial de cualquiera de las moléculas de polinucleótidos de (a) , (b) o (c) ; pero conteniendo además esta secuencia de nucleótidos de la molécula de polinucleótido de (a) , (b) , (c) o (d) una o más mutaciones capaces de desactivar el gen DHFR-TS de Neospora o una parte de dicho gen; o una molécula de polinucleótido que consiste en una o más secuencias de nucleótidos que flanquean in situ el marco de lectura abierto de un gen DHFR-TS de Neospora; de forma que dicha transformación de una célula de Neospora con el constructo genético produce la desactivación del gen DHFR-TS de Neospora o una parte del mismo.

20.- El constructo genético de la reivindicación 19 que contiene además un marcador seleccionable.

21.- El constructo genético de la reivindicación 19, que es útil para separar el dominio DHFR o el dominio TS del gen DHFR-TS.

22.- Una célula de Neospora transformada con el constructo genético de la reivindicación 19.

23.- La célula de Neospora transformada con el constructo genético de la reivindicación 22, la cual presenta un fenotipo seleccionado entre el grupo que consiste en dhfr, ts y dhfr-ts .

24.- Un procedimiento para preparar las células de Neospora vivas modificadas, que comprende la transformación de las células de Neospora con el constructo genético de la reivindicación 19 y la selección de las células transformadas que presentan un fenotipo mutante seleccionado entre el grupo que consiste en dhfr, ts y dhfr-ts como resultado de dicha transformación .

25.- Una vacuna para la protección de un mamífero contra la neosporosis, que contiene una cantidad inmunológicamente eficaz de células vivas modificadas de Neospora que presentan un fenotipo mutante seleccionado entre el grupo que consiste en dhfr, ts y dhfr-ts y un vehículo veterinariamente aceptable.

26.- La vacuna de la reivindicación 25, en la que las células vivas modificada de Neospora presentan un fenotipo mutante seleccionado entre el grupo que consiste en dhfr, ts y dhfr-ts como consecuencia de la transformación con el constructo genético de la reivindicación 19.

27.- La vacuna de la reivindicación 25, que contiene además un adyuvante o una citocina.

28.- La vacuna de la reivindicación 27, en la que el adyuvante se selecciona entre el grupo que consiste en el sistema de adyuvante RIBI, alumbre, geles minerales, una emulsión de aceite en agua, una emulsión de agua en aceite, copolímero de bloque, QS-21, SAF-M, adyuvante AMPHIEGENR, saponina, Quil A, monofosforil lípido A y adyuvante lipídico- amino Avridina, SEAM62 y SEAM 1/2.

29.- Un procedimientto para la preparación de una vacuna contra la neosporosis, que comprende la combinación de una cantidad inmunológicamente eficaz de células vivas modificadas de Neospora que presentan un fenotipo mutante seleccionado entre el grupo que consiste en dhfr, ts y dhfr-ts y un vehículo veterinariamente aceptable.

30.- El uso de una cantidad inmunológicamente eficaz de células vivas modificas de Neospora que presentan un fenotipo mutante seleccionado del grupo que consiste en dhfr-ts y dhfr-ts, en la fabricación de una vacuna contra la neosporosis en un mamífero.

31.- Una vacuna de combinación para la protección de un mamífero contra la neosporosis y, opcionalmente, de una o más enfermedades o trastornos patológicos que pueden afectar al mamífero, conteniendo la vacuna de combinación una cantidad inmunológicamente eficaz de un primer compuesto que contiene células vivas modificadas de Neospora que presentan un fenotipo mutante seleccionado entre el grupo que consiste en dhfr-ts y dhfr-ts; una cantidad inmunológicamente eficaz de un segundo componente capaz de inducir una respuesta protectora contra la otra enfermedad o trastorno patológico que puede afectar al mamífero; y un vehículo veterinariamente aceptable.

32. - La vacuna de combinación de la reivindicación 31, en la que el segundo componente es capaz de inducir una respuesta protectora contra un patógeno seleccionado entre el grupo que consiste en el virus del herpes bovino, virus sincitial respiratorio bovino, virus de la diarrea viral bovina, virus de parainfluenza tipo I, II o III, Leptospira spp., Campylobacter spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus aqalactiae, Mycoplasma spp., Klebsiella spp., Salmonella spp., rotavirus, coronavirus, virus de la rabia, Pasteurella hemolytica, Pasteurella multocida, Clostridia spp., el toxoide de Tetanus, E. Coli, Cryptosporidium spp., Eimeria spp., y Trichomonas spp.

33.- Un estuche para la vacunación de un mamífero contra la neosporosis que contiene un primer envase que tiene una cantidad inmunológicamente eficaz de células modificadas vivas de Neospora que presentan un fenotipo mutante seleccionado entre el grupo que consiste en dhfr-ts y dhfr-ts; y un segundo envase que tiene un vehículo o diluyente veterinariamente aceptable.