MXPA03009306A - Antigenos para aumentar una respuesta inmune contra patogenos rickettsieae y ehrlichieae. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con la identificacion de polipeptidos que son utiles para aumentar una respuesta inmune contra patogenos Ehrlichieae y Rickettsieae cuando se administran en un sujeto. Estos polipeptidos, y polinucleotidos que codifican para los mismos, se pueden utilizar en diversas estrategias para prevenir o tratar infecciones por Ehrlichieae y Rickettsieae.

Description

ANTÍGENOS PARA AUMENTAR UNA RESPUESTA INMUNE CONTRA PATÓGENOS RICKETTSIEAE Y EHRLICHIEAE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la identificación de polipéptidos que son útiles para aumentar una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y Rickettsieae cuando se administran en un sujeto. De manera más particular, la presente invención se relaciona con la identificación de polipéptidos antigénicos provenientes de Anaplasma margínale .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades producidas por garrapatas son un problema principal de la producción de ganado doméstico en grandes áreas del mundo, aunque son más agudas en regiones tropicales y subtropicales. Los agentes causantes de fiebres por garrapatas incluyen Babesia bovis, Anaplasma margínale y Babesía bigemina , los primeros dos son los más importantes y patogénicos . Anaplasma margínale, el principal patógeno que provoca anaplasmosis , es una rickettsia intra-eritrocitica, que provocan destrucción extra-vascular de eritrocitos. La patología se manifiesta como una anemia que, especialmente en reses adultas no inmunes, provoca grave morbididad y con frecuencia mortalidad. Las reses que sobreviven a la infección inicial, aunque portan el patógeno, son resistentes a la enfermedad clínica. Se han producido vacunas atenuadas en vivo para estas enfermedades. Se confiere un grado de inmunidad contra Anaplasma margínale mediante la vacunación de las reses con sangre bovina infectada con el Anaplasma céntrale menos virulento. Sin embargo, al igual que muchas de estas vacunas atenuadas las mismas tienen desventajas. Se reduce un nivel significativo de patología en la vacunación y en algunos animales, en particular reses viejas, esto puede ser grave. En segundo lugar, a pesar del control de calidad cuidadoso, siempre existe un riesgo significativo de que otros organismos de enfermedad se puedan transmitir inadvertidamente con la vacuna. En tercer lugar, en particular en el caso de Babesia bovis, existe una posibilidad de reversión a la virulencia después de la transmisión por garrapatas de los organismos de vacuna parcialmente atenuada. Esto conduce, como mínimo, a una renuencia para utilizar la vacuna en áreas donde la incidencia de enfermedad no es alta mientras que en algunas áreas la vacuna no se puede utilizar en absoluto. La baja cobertura también es debido, en parte, al uso de ganado Bos indicus que es mucho más resistente a las garrapatas y babesiosis que las crias de Bos taurus más productivas. Sin embargo, un estudio reciente (Bock et al. 1997) ha mostrado que las crias Bos taurus y Bos indicus son igualmente susceptibles a anaplasmosis , de esta forma soportan en uso de una vacuna no viva independiente contra A. margínale . Además, en algunas áreas, el avance de ganado "final" en porciones de alimentación también es significativo para el uso futuro de vacunas contra A. margínale a medida que es mucho más probable que se presente bajo transmisión mecánica de condiciones intensivas . En los Estados Unidos, donde se descarta el uso de A. céntrale en vivo, A. margínale se ha purificado a partir de sangre infectada a una escala comercial y se ha utilizado como una vacuna no viva (por ejemplo, "Anaplaz", Fort Dodge Laboratories, "Am-Vax", Scheering Plough, "Plaz-Vax", Mallinckrodt ) . En diversas ocasiones en el pasado se han presentado problemas de seguridad con estas vacunas debido a la contaminación del producto con antigenos de eritrocitos hospederos que dan por resultado en mortalidad debido a isoeritrólisis en becerros lactantes de madres vacunadas. Este mismo complejo de enfermedades es de mayor importancia incluso sobre grandes áreas de América central y Suramérica y en partes de Asia del este, por ejemplo la mitad del sur de China. En la mayoría de estas áreas las vacunas atenuadas en vivo no están disponibles o su uso está muy restringido, debido, en parte, a su costo relativamente alto. Sin embargo, la gran falta de incentivo es la dificultad de mantener un control de calidad adecuado de la vacuna y asegurar su suministro en una forma eficaz en todas las áreas. A pesar del hecho de que la vacunación protectora con material de Anaplasma exterminado se ha demostrado repetidamente (Montenegro-James et al., 1991) poco se sabe de los antígenos protectores en sí mismos. Una dificultad mayor para identificar antígenos novedosos es la presencia de grandes cantidades de antígenos conocidos inmunodominantes aunque deficientemente protectores que son, en la mayoría de los casos, bastante variable. El trabajo se ha enfocado a una mezcla compleja de proteínas superficiales marcadas con el complejo de Proteína Superficial Principal (MSP, por sus siglas en inglés), (por ejemplo, Vidotto et al., 1994) y en particular sobre una proteina Aml05 de superficie sensible a la neutralización (Palmer et al., 1986). Estas proteínas han estado disponibles durante algún tiempo, aunque el progreso para generar una vacuna recombinante se ha hecho lento. La evidencia disponible sugiere que los antígenos son de eficacia inadecuada . Las especies Anaplasma que infectan rumiantes distintos del ganado incluyen Anaplasma ovis que infecta ovejas. Los patógenos estrechamente relacionados incluyen Cowdria ruminantíum (también conocido como "heartwater") que es el principal problema en Sudáfrica y el Caribe, muchos patógenos Ehrlichieae y Rickettsieae de animales domésticos (incluyendo caballos), asi como también patógenos que infectan a seres humanos tales como por ejemplo, Ehrlichia phagocytophila , Ehrlichia chaffeensis, Rickettsia prowazekii (que provocan tifus epidémico) , Ríckettsía rickettsii y Rickettsia conorii (ambos provocan fiebre con manchas), y Ehrlichia sp . que provoca erlichiosis granulocítica humana. Los inventores de la presente en la actualidad han identificado y caracterizado polipéptidos que se pueden utilizar en una vacuna para proporcionar protección inmune contra patógenos Ehrlichieae y Rickettsieae .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención proporciona una vacuna que comprende al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO:l; b) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a (a) ; c) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO : 2 ; d) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a (c) ; e) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 3; f) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a (e) ; g) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 4; y h) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a (g) ; en donde el polipéptido aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickattsieae cuando se administra a un sujeto. De preferencia, el polipéptido es al menos 60% idéntico, de mayor preferencia al menos 70% idéntico, de mayor preferencia al menos 80% idéntico, de mayor preferencia al menos 85% idéntico, de mayor preferencia al menos 90% idéntico, de mayor preferencia al menos 95% idéntico, e incluso con la máxima preferencia al menos 99% idéntico a (a) , (c) , (e) o (g) . De preferencia, el polipéptido tiene una secuencia N-terminal según se proporciona en la SEQ ID NO: 12 y tiene un peso molecular de aproximadamente 17kDa. Además, se prefiere que el polipéptido se pueda purificar a partir de una especie de Ehrlichieae o Rickettsieae . De preferencia, el polipéptido se puede purificar a partir de una especie seleccionada del grupo que consiste de: Anaplasma sp. , Ehrlichia sp . , Rickettsia sp. y Cowdria sp . De mayor preferencia, el polipéptido se puede purificar a partir del grupo que consiste de: Anaplasma margínale, Anaplasma céntrale, Anaplasma ovis, Cowdria ruminantium, Ehrlichia egui, Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia chaffeensis, Rickettsia prowazekií , Rickettsia rickettsii, Rickettsia conoríi, y Ehrlichia sp. que provocan a erlichiosis granulocítica humana. Incluso de mayor preferencia, el polipéptido se puede purificar a partir de Anaplasma margínale . De preferencia, la vacuna comprende un portador farmacéuticamente aceptable. También se prefiere que la vacuna comprenda un adyuvante. Como se sabe en la técnica, se puede proporcionar una respuesta inmune a través del uso de vacunas de AD . Por consiguiente, en otro aspecto la presente invención proporciona una vacuna de ADN que comprende al menos un polinucléotido seleccionado del grupo que consiste de: a) una secuencia que codifica para un polipéptido proporcionado en la SEQ ID NO : 1 ; b) una secuencia que codifica un polipéptido que es al menos 50% idéntico a la SEQ ID NO : 1 ; c) una secuencia que codifica para un polipéptido proporcionado en la SEQ ID NO : 2 ; d) una secuencia que codifica un polipéptido que es al menos 50% idéntico a la SEQ ID NO : 2 ; e) una secuencia que codifica para un polipéptido proporcionado en SEQ ID NO: 3; f) una secuencia que codifica un polipéptido que es al" menos 50% idéntico a la SEQ ID NO : 3 ; g) una secuencia que codifica a polipéptido proporcionado en la SEQ ID NO: 4; y h) una secuencia que codifica un polipéptido que es al menos 50% idéntico a la SEQ ID NO : 4 ; en donde el polipéptido codificado por el polinucleótido aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando la vacuna de ADN se administra a un sujeto. De preferencia, el polinucleótido que codifica para un polipéptido que es al menos 60% idéntico, de mayor preferencia al menos 70% idéntico, de mayor preferencia al menos 80% idéntico, de mayor preferencia al menos 85% idéntico, de mayor preferencia al menos 90% idéntico, de mayor preferencia al menos 95% idéntico, e incluso con la máxima preferencia al menos 99% idéntico a cualquiera de las SEQ ID NO' s 1 a 4. De preferencia, el polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia N-terminal según se proporciona en la SEQ ID NO: 12 y tiene un peso molecular de aproximadamente 17kDa. Además, se prefiere que el polinucleótido se pueda aislar de una especie de Ehrlichieae o Rickettsieae . De preferencia, el polinucleótido se puede aislar de una especie seleccionada del grupo que consiste de: Anaplasma sp., Ehrlichia sp . , Rickettsia sp . y Cowdria sp. De mayor preferencia, el polinucleótido se puede aislar del grupo que consiste de: Anaplasma margínale, Anaplasma céntrale, Anaplasma ovis, Cowdria ruminantium, Ehrlichia equi, Ehrlichia phagocytophila , Ehrlichia chaffeensis, Rickettsia prowazekii , Rickettsia rickettsíi , Rickettsia conorii, y Ehrlichia sp . que provocan erlichiosis granulocitica humana. Incluso de mayor preferencia, el polinucleótido se puede aislar de Anaplasma margínale . En otra modalidad preferida, el polinucleótido está contenido en un vector. De mayor preferencia, el vector es un vector viral. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para aumentar una respuesta inmune contra un patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto al menos una vacuna de acuerdo con la presente invención.

Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir una infección por Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto al menos una vacuna de acuerdo con la presente invención . De preferencia, el patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae se selecciona del grupo que consiste de: Anaplasma sp. , Ehrlichia sp . , Rickettsia sp . y Cowdría sp. De mayor preferencia, el patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae se selecciona del grupo que consiste de: Anaplasma margínale, Anaplasma céntrale, Anaplasma ovis, Cowdría ruminantium , Ehrlichia equi, Ehrlichia phagocytophila , Ehrlichia chaffeensis, Rickettsia prowazekii , Rickettsia rickettsii , Rickettsia conorii, y Ehrlichia sp . que provocan erlichiosis granulocítica humana. Incluso de mayor preferencia, el patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae es Anaplasma margínal . De preferencia, el sujeto es un mamífero.

En una modalidad, el mamífero se selecciona del grupo que consiste de: vacas, ovejas, cabras, perros y caballos. En otra modalidad, el mamífero es un ser humano . En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de una vacuna de acuerdo con la presente invención para la elaboración de un medicamento para aumentar una respuesta inmune contra un patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto. También se sabe en la técnica que una respuesta inmune se puede proporcionar mediante el consumo de una planta transgénica que expresa un antigeno. De esta forma, en un aspecto adicional la presente invención proporciona una planta transgénica que produce al menos un polipéptido seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO : 1 ; b) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a (a) ; c) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 2; d) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a ( c) ; e) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 3; f) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a (e) ; g) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: ; y h) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a (g) ; en donde el polipéptido aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando la planta transgénica se administra oralmente a un sujeto. De preferencia, el polipéptido es al menos 60% idéntico, de mayor preferencia al menos 70% idéntico, de mayor preferencia al menos 80% idéntico, de mayor preferencia al menos 85% idéntico, de mayor preferencia al menos 90% idéntico, de mayor preferencia al menos 95% idéntico, e incluso con la máxima preferencia al menos 99% idéntico a (a) , (c) , (e) o (g) . Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para aumentar la respuesta inmune contra un patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto, el método comprende administrar oralmente al sujeto al menos una planta transgénica de la invención. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir una infección por Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto, el método comprende administrar oralmente al sujeto al menos una planta transgénica de la invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo para aumentar la respuesta contra un polipéptido seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 1; b) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a (a) ; c) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO : 2 ; d) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a ( c) ; e) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO:3; f) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a (e) ; g) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO : 4 ; y h) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a (g) ; en donde el anticuerpo proporciona protección inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando se administra a un sujeto. De preferencia, el polipéptido es al menos 60% idéntico, de mayor preferencia al menos 70% idéntico, de mayor preferencia al menos 80% idéntico, de mayor preferencia al menos 85% idéntico, de mayor preferencia al menos 90% idéntico, de mayor preferencia al menos 95% idéntico, e incluso con la máxima preferencia al menos 99% idéntico a (a) , (c) , (e) o (g). En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir una infección por Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto al menos un anticuerpo dé acuerdo con la invención . En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido purificado sustancialmente que se une específicamente a un anticuerpo de acuerdo con la invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido purificado sustancialmente, el polipéptido se selecciona de: (i) un polipéptido que comprende la secuencia proporcionada como SEQ ID NO:l; y (ii) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a (i) ; en donde el polipéptido aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando se administra a un sujeto. De preferencia, el polipéptido es al menos 60% idéntico, de mayor preferencia al menos 70% idéntico, de mayor preferencia al menos 80% idéntico, de mayor preferencia al menos 85% idéntico, de mayor preferencia al menos 90% idéntico, de mayor preferencia al menos 95% idéntico, e incluso con la máxima preferencia al menos 99% idéntico a (i). De preferencia, el polipéptido tiene una secuencia N-terminal según se proporciona en la SEQ ID NO: 12 y tiene un peso molecular de aproximadamente 17kDa . En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido purificado sustancialmente , el polipéptido se selecciona de: (i) un polipéptido que comprende la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 2; y (ii) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a (i) ; en donde el polipéptido aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando se administra a un sujeto. De preferencia, el polipéptido es al menos 60% idéntico, de mayor preferencia al menos 70% idéntico, de mayor preferencia al menos 80% idéntico, de mayor preferencia al menos 85% idéntico, de mayor preferencia al menos 90% idéntico, de mayor preferencia al menos 95% idéntico, e incluso con la máxima preferencia al menos 99% idéntico a (i) . En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido purificado sustancialmente, el polipéptido se selecciona de: (i) un polipéptido que comprende la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 3; y (ii) un polipéptido que es al menos 50% idéntico a (i) ; en donde el polipéptido aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando se administra a un sujeto. De preferencia, el polipéptido es al menos 60% idéntico, de mayor preferencia al menos 70% idéntico, de mayor preferencia al menos 80% idéntico, de mayor preferencia al menos 85% idéntico, de mayor preferencia al menos 90% idéntico, de mayor preferencia al menos 95% idéntico, e incluso con la máxima preferencia al menos 99% idéntico a (i) . En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido purificado sustancialmente, el polipéptido se selecciona de: (i) un polipéptido que comprende la secuencia proporcionada como SEQ ID NO : 4 ; y (ii) un fragmento antigénico de (i), en donde el polipéptido, o fragmento antigénico del mismo, aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando se administra a un sujeto. Además, se prefiere que el polipéptido se pueda purificar a partir de una especie de Ehrlichieae o Rickettsieae de preferencia, el polipéptido se puede purificar a partir de una especie seleccionada del grupo que consiste de: Anaplasma sp. , Ehrlichia sp . , Rickettsia sp. y Cowdria sp . De mayor preferencia, el polipéptido se puede purificar a partir del grupo que consiste de: Anaplasma margínale, Anaplasma céntrale, Anaplasma ovis, Cowdria ruminantium , Ehrlichia equi, Ehrlichia phagocytophila , Ehrlichia chaffeens.is, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia conorii, y Ehrlichia sp. que provocan erlichiosis granulocitica humana. Incluso de mayor preferencia, el polipéptido se puede purificar a partir de Anaplasma margínal . Se prefiere que la respuesta inmune sea contra la infección por Anaplasma margínale .

En una modalidad preferida adicional, un polipéptido de la presente invención se puede obtener al: (i) romper Anaplasma margínale en una muestra para obtener un homogeneizado; (ii) centrifugar el homogeneizado proveniente del paso (i) para obtener un sedimento; (iii) extraer el sedimento proveniente del paso (ii) con un detergente para obtener una fracción soluble en el detergente y una fracción insoluble en el detergente; y (iv) someter la fracción soluble en el detergente a pasos adicionales de purificación; Anaplasma margínale en la muestra se puede romper por cualquier medio adecuado tal como por ejemplo, sonicación y/o degradación enzimática. De preferencia, el detergente es n-dodecil-N, N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonato . Además, se prefiere que los pasos adicionales de purificación incluyan enfoque isoeléctrico. En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteina de fusión que comprende un polipéptido de acuerdo con la invención fusionado a al menos una secuencia polipeptidica heteróloga. De preferencia, al menos una secuencia polipeptídica heteróloga se selecciona del grupo que consiste de: un polipéptido que intensifica la estabilidad del polipéptido de la presente invención, y un polipéptido que ayuda en la purificación de la proteina de fusión. Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado, el polinucleótido tiene una secuencia seleccionada de: (i) una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID N0:5; (ii) una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 6; (iii) una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7; (iv) una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 57; (v) una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO : 8 ; (vi) una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 56; (vii) una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con la presente invención; (viii) una secuencia capaz de hibridarse selectivamente a cualquiera de (i) hasta (iv) bajo alto rigor; y (ix) una secuencia de nucleótidos que es al menos 50% idéntica a cualquiera de (i) hasta (iv) , en donde el polinucleotido codifica para un polipéptido que aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando se administra a un sujeto. De preferencia, el polinucleotido es al menos 60% idéntico, de mayor preferencia al menos 70% idéntico, de mayor preferencia al menos 80% idéntico, de mayor preferencia al menos 85% idéntico, de mayor preferencia al menos 90% idéntico, de mayor preferencia al menos 95% idéntico, e incluso con la máxima preferencia al menos 99% idéntico a cualquiera de (i ) hasta ( iv) . En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector que comprende al menos un polinucleotido de la invención. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmido, virus o fagovectores proporcionados con un origen o duplicación, y de preferencia un promotor para la expresión del polinucleotido y opcionalmente un regulador del promotor. El vector puede contener uno o más marcadores seleccionables , por ejemplo, un gen de resistencia a ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano, o un gen de resistencia a neomicina para un vector de expresión de mamífero. El vector se puede utilizar in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN o se puede utilizar para transfectar o transformar una célula hospedera, de preferencia, el vector es un vector viral. En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula hospedera que comprende un vector de la invención. De preferencia, la célula hospedera es una célula mamífera. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un proceso para preparar un polipéptido de acuerdo con la invención, el proceso comprende cultivar una célula hospedera de acuerdo con la invención bajo condiciones que permitan la expresión del polinucleótido que codifica para el polipéptido,, recubrir el polipéptido expresado. Este proceso se puede utilizar para la producción de cantidades comercialmente útiles del polipéptido codificado. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable. La invención en lo sucesivo se describirá mediante las siguientes figuras y ejemplos no limitantes .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1: estrategia de fraccionamiento para una proteína de Anaplasma margínale señalada en el Ej emplo 2. Figura 2: estrategia de fraccionamiento para una proteína de Anaplasma margínale señalada en el Ejemplo 3. Figura 3: fraccionamiento de Anaplasma margínale para un estudio de vacunación en el ejemplo 4. Figura 4: fraccionamiento de antígenos de Anaplasma margínale en el ejemplo 5. Figura 5: títulos de anticuerpo específico rAna29 antes de la inoculación. Se vacunaron reses con la proteína recombinante en adyuvante CSIRO. Figura 6: títulos de anticuerpo rAna32 después de la vacunación. Se vacunaron reses con rAna32 en adyuvante CSIRO.

CLAVE PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS i SEQ ID NO:l - Secuencia de aminoácidos de Ana 29 proveniente de A. margínale .

SEQ ID NO: 2 - Secuencia de aminoácidos de Ana 43 proveniente de A. margínale . SEQ ID NO: 3 - Secuencia de aminoácidos de Ana 37 proveniente de A. margínale . SEQ ID NO: 4 - Secuencia de aminoácidos de Ana 32 proveniente de A. margínale . SEQ ID NO: 5 - Secuencia de nucleótidos que codifica para Ana 29 proveniente de A. margínale . SEQ ID NO: 6 - Secuencia de nucleótidos que codifica para Ana 43 proveniente de A. margínale . SEQ ID NO: 7 - Secuencia de nucleótidos que codifica para Ana 37 proveniente de A. margínale . SEQ ID NO: 8 - Secuencia de nucleótidos que codifica para Ana 32 proveniente de A. margínale . SEQ ID NO: 9 - Fragmento proveniente de A. margínale Msp-1. SEQ ID NO: 10 - Fragmento proveniente de A. margínale Msp-2. SEQ ID NO: 11 - Fragmento proveniente de A. margínale sp-4. SEQ ID NO's: 12 hasta 14 - Fragmentos secuenciados de Ana 29 proveniente de A. margínale . SEQ ID NO: 15 - Fragmento secuenciado de Ana 32 proveniente de A. margínale . SEQ ID NO's: 16 hasta 20 - Fragmentos secuenciados de Ana 37 proveniente de A. margínale . SEQ ID NO's: 21 hasta 26 - Fragmentos secuenciados de Ana 43 proveniente de A. margínale . SEQ ID NO's: 27 hasta 55 - Cebadores de oligonucleótido utilizados en experimentos PCR. SEQ ID NO: 56 - Secuencia de nucleótidos de Ana 32 proveniente de A. céntrale . SEQ ID NO: 57 - Secuencia de nucleótidos de Ana 29 proveniente de A. céntrale . SEQ ID NO: 58 y 59 - Fragmentos de Ana 29 proveniente de A. margínale .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Un "sujeto" se refiere en la presente a cualquier organismos susceptible a un patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae . De preferencia, el sujeto es un mamífero. Típicamente, el mamífero se selecciona del grupo que consiste de reses, ovejas, cabras, caballos y seres humanos. Mediante "tratamiento o prevención de una infección por Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto" se debe entender la reducción o prevención de al menos un síntoma asociado con la infección.

Una "respuesta inmune" es la reacción inmunológica total de un animal a un estimulo inmunogénico . En general, se considera que existen dos tipos de respuestas inmunes producidas por dos poblaciones de linfocitos. Los linfocitos B son responsables de la inmunidad humoral, que produce anticuerpos que circulan en la corriente sanguínea, mientras que los linfocitos T son responsables de la inmunidad suministrada por células. Un "inmunógeno" o un "antígeno" es una molécula, típicamente un polipéptido, que cuando se administra en un sujeto provoca una respuesta inmune. "Anaplasmosis" se caracteriza por anemia extravascular asociada con parasitismo intraeritrocítico . Se conocen en la técnica muchos patógenos que provocan anaplasmosis , entre los que se incluyen Anaplasma margínale, Anaplasma céntrale y Anaplasma ovis. A menos que se establezca de otra manera, los valores de peso molecular definidos en la presente son como se determina por SDS-PAGE. A lo largo de esta especificación, la palabra "comprenden" o variaciones tales como por ejemplo, "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un elemento establecido, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos, aunque no la exclusión de ningún otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos.

Métodos generales A menos que se indique de otra manera, las técnicas de ADN recombinante utilizadas en la presente invención son procedimientos estándar, bien conocidos por aquellos expertos en este campo. Estas técnicas se describen y se explican a todo lo largo de la literatura en fuentes tales como por ejemplo, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991) , D.M. Glover and B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 and 1996) , and F.M. Ausubel et al. (Editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pu . Associates and Wiley-Interscience (1988, que incluyen todas las actualizaciones hasta el presente) y se incorporan en la presente como referencia.

Polipéptidos Por "polipéptido purificado sustancialmente" se debe entender un polipéptido que en general se ha separado de los lipidos, ácidos nucleicos, otros polipéptidos y otras moléculas contaminantes con las cuales se asocia en su estado natural. De preferencia, el polipéptido purificado sustancialmente está al menos 60% libre, de preferencia al menos 75% libre, y con la máxima preferencia al menos 90% libre de otros componentes a los cuales están asociados en la naturaleza. El % de identidad de un polipéptido se determina mediante análisis GAP (Needleman and Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalidad para creación de intervalos = 5, y una penalidad para extensión de intervalos = 0.3. La secuencia en cuestión es de al menos 10 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP se alinea con las dos secuencias sobre una reacción de al menos 10 aminoácidos. De mayor preferencia, la secuencia en cuestión es de al menos 20 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP se alinea con las dos secuencias sobre una región de al menos 20 aminoácidos. De mayor preferencia, la secuencia en cuestión es de al menos 50 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP se alinea con las dos secuencias sobre una región de al menos 50 aminoácidos. De mayor preferencia, la secuencia en cuestión es de al menos 100 aminoácidos de longitud y el análisis GAP se alinea con las dos secuencias sobre una región de al menos 100 aminoácidos. Incluso con la máxima preferencia, la consecuencia en cuestión es de al menos 200 aminoácidos en longitud y el análisis GAP se alinea con las dos secuencias sobre una región de al menos 200 aminoácidos. Se apreciará que la presente invención abarca precursores variantes alélicas homólogos de especies mutantes y fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos de la invención. Un "precursor" de un polipéptido se refiere a grandes formas del polipéptido que se procesan para producir el plipéptido. Esto se puede lograr a través de la eliminación de una región de señal hidrofóbica proveniente del N-término de un precursor. Alternativamente, las exo- y endopeptidasas pueden escindir moléculas precursoras para producir un polipéptido procesado. Una "variante alélica" será una variante que se presenta en la naturaleza dentro de un organismo individual.

Las secuencias polipept dicas son "homologas" o "homólogos de especies" si se relacionan por divergencia a partir de un ancestro común. Por consiguiente, un homólogo de especie de un polipéptido será el polipéptido equivalente que se presenta en la naturaleza en otros especies o cepas de una especie. Dentro de cualquier especie puede existir un homólogo como muchas variantes alélicas, y éstas se considerarán homólogos del polipéptido. Las variantes alélicas y homólogos de especies se pueden obtener mediante las siguientes técnicas estándar conocidas por aquellos expertos en este campo. Los homólogos de especies preferidas incluyen aquellos obtenidos a partir de representativos del mismo Orden, de mayor preferencia la misma Familia e incluso con la máxima preferencia del mismo Género. Los mutantes de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar al introducir cambios nucleotidicos adecuados en una secuencia de ácido nucleico, o mediante la síntesis in vitro del polipéptido deseado. Estos mutantes incluyen, por ejemplo, supresiones inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. Se puede hacer una combinación de supresión, inserción en sustitución hasta llegar a la construcción final, con la condición de que el producto de la proteina final posea las características deseadas. En el diseño de imitantes de secuencia de aminoácidos, se debe modificar la ubicación del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerá de las características. Los sitios de mutación se pueden modificar individualmente o en serie, por ejemplo, al (1) sustituir primero con elecciones de aminoácido conservador y luego con selecciones más radicales dependiendo de los resultados alcanzados, (2) suprimir el residuo blanco, o (3) insertar otros residuos adyacentes al sitio ubicado. Las supresiones de la secuencia de aminoácidos en general varían de aproximadamente 1 hasta 30 residuos, de mayor preferencia de aproximadamente 1 hasta 10 residuos y típicamente de aproximadamente 1 hasta 5 residuos contiguos. Los mutantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácidos en la molécula polipeptídica eliminada y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para mutagénesis sustitucional incluyen los sitios identificados como las regiones para determinación antigénica, y los sitios activos. Otros sitios de interés son aquellos en los cuales son idénticos los residuos particulares obtenidos a partir de diversas especies. Estas posiciones pueden ser importantes para una actividad biológica. Estos sitios, en especial aquellos que quedan dentro de una secuencia de al menos tres sitios distintos conservados idénticamente, de preferencia se sustituyen en una forma relativamente conservadora. Estas sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 con el encabezado de "sustituciones de ejemplo". Además, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no naturales o análogos de aminoácidos químicos como una sustitución o adición en el polipéptido de la presente invención. Estos aminoácidos incluyen de manera enunciativa: los D-isómeros de aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico , ácido a-aminoisobutírico, ácido 4-aminobutírico , ácido 2-aminobutírico , ácido 6-aminohexanóico , ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminopropiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cistético, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina , ciclohexilalanina, ß-alanina, fluoro-aminácidos, aminoácidos diseñadores tales como por ejemplo, ß-met ilaminoácidos , Coc-metilaminoácidos , Na-metilaminoácidos , y análogos de aminoácidos en general . Tabla 1. Sustituciones de Ejemplo También se incluyen dentro del alcance de la invención los polipéptidos de la presente invención que se modifican de manera diferencial durante o después de la síntesis, por ejemplo, mediante biotinilación, bencilación, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación y grupos de protección/bloqueo conocidos, escisión proteolítica, ligamiento a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Estas modificaciones pueden servir para aumentar la estabilidad o bioactividad del polipéptido de la invención. También se incluyen dentro del alcance de la invención fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos de la presente invención. Por "fragmento biológicamente activo" se debe entender un fragmento de una secuencia de la presente invención que retiene al menos una de las actividades del polipéptido natural. De mayor preferencia, un "fragmento biológicamente activo" de la presente invención es capaz de aumentar una respuesta inmune contra un patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae cuando el fragmento se administra a un sujeto. Estos fragmentos también se denominan en la presente como "fragmento antigénico". Los fragmentos antigénicos preferidos incluyen porciones de los polipéptidos de la presente invención que se exponen naturalmente sobre la superficie externa de la especie de Ehrlichieae o Rickettsieae . Ejemplos de estos fragmentos antigénicos incluyen de manera enunciativa: un polipéptido que tiene una secuencia N-terminal según se proporciona en la en SEQ ID NO: 12 y tiene un peso molecular de aproximadamente 17kDa, RLSQEGLESSVLLKRPEFIA (SEQ ID NO:58), o TADLIGSGFAAA PLQQAWV (SEQ ID NO:59). Como se podría conocer por alguien con experiencia, las técnicas para identificar un fragmento biológicamente activo o mutante de un polipéptido de la presente invención que sea capaz de aumentar una respuesta inmune contra un patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto son bien conocidas en este campo. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones y/o supresiones al polipéptido de la presente invención y el fragmento/mutante resultante probado por su capacidad de aumentar una respuesta inmune contra un patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae en el sujeto. Los polipéptidos de la presente invención se pueden producir en una variedad de formas, incluyendo la producción y recuperación de proteínas naturales, la producción y recuperación de proteínas recombinantes , y la síntesis química de las proteínas. En una modalidad, un polipéptido aislado de la presente invención se produce al cultivar una célula capaz de expresar el polipéptido bajo condiciones eficaces para producir el polipéptido, y recuperar el polipéptido. Las condiciones de cultivo eficaces incluyen de manera enunciativa: medio eficaz biorreactor, temperatura, condiciones de pH y oxígeno que permitan la producción de proteínas. Un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el cual se cultive una célula para producir un polipéptido de la presente invención. Este medio típicamente comprende un medio acuoso que tenga fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y fosfato, y sales minerales, metales y otros nutrientes adecuados, tales como por ejemplo, vitaminas. Las células de la presente invención se pueden cultivar en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de prueba, discos microtituladores, y discos de petri. El cultivo se puede llevar a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno adecuados para una célula recombinante . Estas condiciones de cultivo están dentro de la experiencia de alguien con experiencia en la técnica.

Polinucleótidos Por "polinucleótido aislado" se debe entender un polinucleótido que en general se haya separado de las secuencias polinuclotidicas con las cuales se asocia o vincula en su estado natural. De preferencia, el polinucleótido aislado está al menos 60% libre, de preferencia al menos 75% libre, y con la máxima preferencia al menos 90% libre de otros componentes con los cuales estén asociados en la naturaleza. Además, el término "polinucleótido" se utiliza indistintamente en la presente con el término "molécula de ácido nucleico". El % de identidad de un polinucleótido se determina mediante análisis GAP (Needleman and Wunsch, 1981) (programa GCG) con una penalidad para creación de intervalos =5, y una penalidad para extensión de intervalos =3. La secuencia en cuestión es de al menos 15 nucleótidos de longitud, y el análisis GAP se alinea con las dos secuencias sobre una reacción de al menos 15 nucleótidos. De preferencia, la secuencia en cuestión es de al menos 150 nucleótidos de longitud, y el análisis GAP se alinea con las dos secuencias sobre una región de al menos 150 nucleótidos, De mayor preferencia, la secuencia en cuestión es de al menos 300 nucleótidos de longitud y el análisis GAP se alinea con las dos secuencias sobre una región de al menos 300 nucleótidos. Incluso de mayor preferencia, la secuencia en cuestión es de al menos 600 nucleótidos de longitud y el análisis GAP se alinea con las dos secuencias sobre una región de al menos 600 nucleótidos . Una secuencia de polinucleótidos de la presente invención se puede hibridar selectivamente a un polinucleótido que codifique para un polipéptido de la presente invención, o una secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID NO' s 5 a 8, 56 ó 57, bajo alto rigor. Además, los oligonucleótidos de la presente invención tienen una secuencia que se híbrida selectivamente a un polinucleótido de la presente invención. En el sentido en el que se utiliza la presente, condiciones de rigor son aquellas que: (1) emplean baja resistencia iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo, NaCl 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/ NaDodS04 al 01% a 50°C; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como por ejemplo, formamida, por ejemplo, formamida al 50% (vol/vol) con albúmina de suero bovino al 0.1%, Ficoll al 0.1%, polivinilpirrolidona al 0.1%, amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con NaCl 750 m , citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl al 0.75 M, citrato de sodio al 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma sonicado de salmón ADN (50 g/ml), SDS al 0.1% y sulfato de dexano al 10% a 42°C en 0.2 x SSC y SDS al 0.1%. Los polinucleótidos de la presente invención pueden poseer, cuando se comparan con las moléculas que se presentan en la naturaleza una o más mutaciones que son supresiones, inserciones o sustituciones de residuos nucleotidicos . Los mutantes pueden ser ya sea naturaleza (es decir, aislados de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, al realizar una mutagénesis sitio-dirigida sobre el ácido nucleico) . De esta forma es vidente que los polinucleótidos de la invención pueden ser ya sea naturaleza o recombinantes . Los oligonucleótidos de la presente invención pueden ser ARN, ADN o derivados de cualquiera. El tamaño mínimo de estos oligonucleótidos es el tamaño requerido para la formación de un híbrido estable entre un oligonucleótido y una secuencia complementaria sobre una molécula de ácido nucleico de la presente invención. La presente invención incluye oligonucleótidos que se pueden utilizar como, por ejemplo, soluciones de ensayo para identificar moléculas de ácido nucleico, cebadores para producir moléculas de ácido nucleico o como agentes que regulan la trascripción génica y/o vida media del ARNm (por ejemplo, como reactivos con base en fármacos antisentido, de formación triple, de ribosina y/o ARN) Vectores Una modalidad de la presente invención incluye un vector recombinante, que incluye al menos una molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención, insertada en cualquier vector capaz de suministrar la molécula de ácido nucleico en una célula hospedera. Este vector contiene secuencias de ácido nucleico heterólogo, es decir, secuencias de ácido nucleico que no se encuentran en la naturaleza adyacentes a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención y que de preferencia se derivan de una especie distinta de la especie de la cual se derivaron las moléculas de ácido nucleico. El vector puede - ser ya sea ARN o ADN, ya sea procariótico o eucariótico, y típicamente es un virus o un plásmido. ün tipo de vector recombinante comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención vinculada operativamente a un vector de expresión. La frase vinculada operativamente se refiere a una inserción de una molécula de ácido nucleico en un vector de expresión de manera tal que la molécula sea capaz de ser expresada cuando se transforma en una célula hospedera. En el sentido en el que se utiliza en la presente, un vector de expresión es un vector de ADN o ARN que sea capaz de transformar una célula hospedera y efectuar la expresión de una molécula de ácido nucleico específica. De preferencia, el vector de expresión también es capaz de reproducirse dentro de la célula hospedera. Los vectores de expresión pueden ser ya sea procarióticos o eucarióticos , y típicamente son virus o plásmidos. Los vectores de expresión de la presente invención incluyen cualesquiera vectores que funcionen (es decir, expresión génica directa) . En células recombinante de la presente invención, entre las que se incluyen: bacterias, hongos, endoparásitos , artrópodos, animales y células vegetales. Los vectores de expresión preferidos de la presente invención pueden dirigir la expresión génica en células bacterianas, de levadura, vegetales y mamiferas. En particular, los vectores de expresión de la presente invención contienen secuencias reguladoras tales como por ejemplo, secuencias para control de trascripción, secuencias para control de traducción, orígenes de reproducción, y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante y que controlan la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. En particular, las moléculas recombinantes de la presente invención incluyen secuencias para control de trascripción. Las secuencias . para control de trascripción son secuencias que controlan el inicio, alargamiento y término de la trascripción. Las secuencias para control de trascripción, particularmente importantes son aquellas que controlan el inicio de la trascripción, tales como por ejemplo, secuencias promotoras, intensifxcadoras , operadoras y represoras. Las secuencias para control de trascripción adecuadas incluyen cualquier secuencia para control de trascripción que pueda funcionar en al menos una de las células recombinantes de la presente invención. Se conocen por aquellos expertos en la técnica una variedad de secuencias para control de trascripción. Las secuencias para control de trascripción preferidas incluyen aquellas que funcionan en células bacterianas, de levadura, vegetales y mamiferas, tales como por ejemplo de manera enunciativa: tac, lac, trp, trc, oxy-pro, omp/lpp, rrnB, bacteriófago lambda, bacteriófago T7, T71ac, bacteriófago T3, bacteriófago SP6, bacteriófago SP01, metalotioneina, factor de apareamiento alfa, alcohol oxidasa Pichia, promotores sugenómicos de alfavirus (tales como por ejemplo, promotores sugenómicos de virus Sindbis), gen de resistencia a antibióticos, baculovirus, virus del insecto Heliothis zea, virus de vaccinia, herpesvirus, poxvirus de mapache, otros poxvirus, adenovirus, citomegalovirus (tales como por ejemplo, promotores tempranos intermedios), virus 40 de simio, retrovirus, actina, repetición terminal larga retroviral, virus de sarcoma Rous, choque térmico, secuencias para control de trascripción con fosfato y nitrato, asi como también, otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células procarióticas o eucarióticas . Las secuencias para control de trascripción adecuada adicionales incluyen promotores de tejido especifico e intensificadores , así como también, promotores inducibles por linfocina (por ejemplo, promotores . inducibles por interferones o interleucinas ) . Las moléculas recombinantes de la presente invención también pueden (a) contener señales secretoras (es decir, secuencias de ácido nucleico con segmento de señal) para permitir que un polipéptido expresado de la presente invención se secrete a partir de la célula que produce el polipéptido y/o (b) contener secuencias de fusión que conducen a la expresión de moléculas de ácido nucleico de la presente invención como proteínas de fusión. Ejemplos de segmentos de señal adecuados incluyen cualquier segmento de señal capaz de dirigir la secreción de una proteína de la presente invención. los segmentos de señal preferidos incluyen de manera enunciativa activador de plasminógeno de tejidos (t-PA) , interferón, interleucina , hormona del crecimiento, histocompatibilidad y segmentos de señal de glucoproteína con envoltura viral, así como también, secuencias de señal naturales. Además, una molécula de ácido nucleico de la presente invención se puede unir a un segmento de fusión que dirige la proteína codificada para el proteosoma, tal como por ejemplo, un segmento de fusión a ubiquitina. Las moléculas recombinantes también pueden incluir secuencias interpuestas y/o sin traducir circundantes y/o dentro de las secuencias de ácido nucleico de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención.

Células hospederas Otra modalidad de la presente invención incluye una célula recombinante que comprende una célula hospedera transformada con una o más moléculas recombinantes de la presente invención. La transformación de una molécula de ácido nucleico en el interior de una célula se puede llevar a cabo mediante cualquier método por el cual se pueda insertar en la célula una molécula de ácido nucleico.

Las técnicas de transformación incluyen de manera enunciativa: transfección, electroporación, microinducción, microinyección, lipofección, adsorción, y fusión de protoplastos . Una célula recombinante puede permanecer unicelular o puede crecer en un tejido, órgano o un organismo multicelular. Las moléculas de ácido nucleico transformadas de la presente invención pueden permanecer extracromosomales o se pueden integrar en uno o más sitios dentro de un cromosoma de la célula transformada (es decir, recombinante ) de tal forma que se conserve su capacidad de ser expresado. Las células hospederas adecuadas para transformación incluyen cualquier célula que se pueda transformar con un polinucleótido de la presente invención. Las células hospederas pueden ser ya sea células sin transformar o células que ya se hayan transformado con al menos una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más proteínas de la presente invención) . Las células hospederas de la presente invención pueden ya sea ser capaces de producir endógenamente (es decir, naturalmente) las proteínas de la presente invención o pueden ser capaces de producir estas proteínas después de ser transformadas con al menos una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Las células hospederas de la presente invención pueden ser cualquier célula capaz de producir al menos una proteína de la presente invención, e incluyen células de bacterias, hongos (entre los que se incluyen levaduras) parásitos, artrópodos, animales y vegetales. Las células hospederas preferidas incluyen células bacterianas, micobacterianas, de levadura, vegetales y mamíferas. Las células hospederas más preferidas incluyen células de Agxohacterium, Salmonella , Escherichia , Bacillus, Listeria , Saccharomyces, Spodoptera , Mycobacteria , Trichoplusia , BHK (riñon de hámster recién nacido) , células de MDCK (linea celular normal de riñon de perro para el cultivo de herpesvirus canino) , células de CRFK (linea celular normal de riñon de gato para cultivo de herpesvirus felino) , células de CV-1 (linea celular de riñon de mono africano utilizado, por ejemplo, para cultivar poxvirus de mapache) , células COS (por ejemplo, COS-7) y células Vero. Las células hospederas particularmente preferidas son E. coli, incluyendo derivados de E . coli K-12; Salmonella typhi; Salmonella typhímurium, incluyendo cepas atenuadas, células de Spodoptera frugiperda; Trichoplusia ni; células de BHK; células de MDCK; células de CRFK; células de CV-1; células de COS; células Vero y células de mioblasto G8 de ratón no tumorigénicas (por ejemplo, ATCC CRL 1246). Las células hospederas mamiferas adecuadas, adicionales, incluyen otras lineas celulares de riñon, otras lineas celulares de fibroblastos (por ejemplo, lineas celulares de humano, múrido o fibroblasto de embrión de pollo), lineas celulares de mieloma, células ováricas de hámster Chino, células de ratón NIH/3T3, células MMTK y/o células HeLa. Las tecnologías de ADN recombinantes se pueden utilizar para mejorar la expresión de las moléculas de polinucleótido transformadas al manipular, por ejemplo, el número de copias de las moléculas de polinucleó ido dentro de una célula hospedera, la eficiencia con la cual se transfieren aquellas moléculas de polinucleótido, la eficiencia con la cual se transcriben aquellas moléculas de polinucleótido, la eficiencia con la cual se traducen las transcripciones resultantes, y la eficiencia de modificaciones post-traduccionales . Las técnicas recombinantes útiles para aumentar la expresión de moléculas de polinucleótido de la presente invención incluyen de manera enunciativa: moléculas de polinucleótido que se vinculan operativamente a plásmidos con alto número de copias, la integración de moléculas de polinucleótidos en uno o más cromosomas celulares hospederos, la adición de secuencias de estabilidad vector para plásmidos, sustituciones o modificaciones de las señales para control de trascripción (por ejemplo, promotores, operadores, intensificadores) , sustituciones o modificaciones de las señales para control traduccional (por ejemplo, sitios de unión de ribosomas, secuencias Shine-Dalgarno) , la modificación de moléculas de polinucleótido de la presente invención para que correspondan al uso de codones de la célula hospedera, y la supresión de las secuencias que desestabilizan las transcripciones. La actividad de una proteina recombinante expresada de la presente invención se puede mejorar mediante fragmentación, modificación o derivación de moléculas de polinucleótido que codifican para esta proteina.

Vacunas Las vacunas se pueden preparar a partir de uno o más polipéptidos de la invención. Se conoce por aquellos expertos en la técnica la preparación de vacunas que contienen un polipéptido o polipéptidos inmunogénicos como ingredientes activos.

Típicamente, estas vacunas se preparan como materiales inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones, también se pueden prepara formas sólidas adecuadas para solución en o suspensión en, líquido antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar, o la proteína se pueden encapsular en liposomas. Los ingredientes inmunogénicos activos con frecuencia se mezclan con portadores/excipientes que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los portadores/excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o lo semejante y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como por ejemplo, agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores de pH y/o adyuvantes que intensifiquen la efectividad de la vacuna . En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "adyuvante" significa una sustancia que no intensifica específicamente una respuesta inmune para un inmunógeno. Ejemplos de adyuvantes que pueden ser eficaces incluyen de manera enunciativa: hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, denominado como nor-MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1' -2' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi ) -etilamina (CGP 19835A, denominado como MTP-PE) , y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, lípido A de monofosforilo , dimicolato de trealosa y esqueleto de pared celular ( PL+TDM+CWS ) en una emulsión de escualeno/Tween 80 al 2%. Ejemplos adicionales de adyuvantes incluyen hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio-potasio (alum) , endotoxina bacteriana, lípido X, Corynebacterium parvum {Propionobacterium acnés), Bordetella pertussis , polirribonucleótidos , alginato de sodio, lanolina, lisolecitina, vitamina A, saponina, liposomas, levamisol, DEAE-dextrano, copolimeros bloqueados u otros adyuvantes sintéticos. Un adyuvante preferido es el CSIRO (que contiene lmg de Quil A, lOmg de DEAE Dextrano, 1.2ml de ontanide ISA 50V, y 0.8mi de PBS - por 2ml) . Estos adyuvantes están disponibles comercialmente de diversas fuentes, por ejemplo, Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.) o Adyuvante Incompleto de Freund o Adyuvante Completo (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) . La proporción de inmunógeno y adyuvante se puede variar sobre una amplia gama siempre y cuando ambos estén presentes en cantidades eficaces. Por ejemplo, el hidróxido de aluminio puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.5% de la mezcla de vacuna (base de AI2O3) . De manera conveniente, las vacunas se formulan para que contengan una concentración final de inmunógeno en el intervalo de 0.2 hasta 200 µ?/ml, de preferencia 5 hasta 50 µg/ml con la máxima preferencia aproximadamente 15 µg/ml. Después de la formulación, la vacuna se puede incorporar en un contenedor estéril que luego se sella y se almacena a baja temperatura, por ejemplo 4°C, o se puede liofilizar. La liofilización permite el almacenamiento a largo plazo en una forma estabilizada. Las vacunas se administran convenientemente de manera parenteral, mediante inyección, por ejemplo, ya sea subcutánea o intramuscularmente . Las formulaciones anteriores que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para los supositorios, los aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos ; estos supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contengan el ingrediente activo en el intervalo de 0.5% hasta 10%, de preferencia 1% hasta 2%. Las formulaciones orales incluyen estos excipientes empleados normalmente como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y lo semejante. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen de 10% hasta 95% del ingrediente activo, de preferencia de 25% hasta 70%. Cuando la composición de vacuna se liofiliza, el material liofilizado se puede reconstituir antes de la administración, por ejemplo, como una suspensión. La reconstitución de preferencia se efectúa en un amortiguador. Las cápsulas, tabletas y pildoras para administración oral a un paciente se pueden proporcionar con un recubrimiento entérico que comprende, por ejemplo, Eudragit "S", Eudragit "L", acetato de celulosa, acetato ftalato de celulosa o hidroxipropilmetilcelulosa .

Vacunas de ADN La vacunación con ADN implica la introducción directa in vivo de ADN que codifica para un antigeno en el interior de células y/o tejidos de un sujeto para la expresión del antigeno mediante las células del tejido del sujeto. Estas vacunas se denominan en la presente "vacunas de ADN" "vacunas con base de ácido nucleico". Ejemplos de vacunas de ADN se describen en la US 5,939,400, US 6,110,898, WO 95/20660 y WO 93/19183. La capacidad de inyectar directamente ADN que codifica para un antigeno para producir una respuesta inmune protectora se ha demostrado en muchos sistemas experimentales (véase, por ejemplo, Conry et al., 1994; Cardoso et al., 1996; Cox et al., 1993; Davis et al., 1993; Sedegah et al., 1994; Montgomery et al., 1993; Ulmer et al., 1993; Wang et al., 1993; Xiang et al., 1994; Yang et al. , 1997) . A la fecha, la mayoría de las vacunas de ADN en sistemas mamíferos han dependido de promotores virales derivados de citomegalovirus (CMV) . Estos tienen buena eficiencia tanto en inoculación muscular como cutánea en varias especies mamíferas. Un factor conocido para afectar la respuesta inmune producida por la inmunización por ADN es el método de suministro de ADN, por ejemplo, las vías parenterales pueden proporcionar bajas proporciones de transferencia de genes y producir una considerable variabilidad de la expresión génica (Montgomery et al., 1993). La inoculación de plásmidos a alta velocidad, utilizando una pistola de genes, intensifica las respuestas inmunes de ratones (Fynan et al., 1993; Eisenbraun et al., 1993), supuestamente debido a una mayor eficiencia de la transfección del ADN y la presentación de antigenos más eficaces mediante células dendriticas. Los vectores que contienen la vacuna con base en ácido nucleico de la invención también se pueden introducir en el hospedero deseado mediante otros métodos conocidos en este campo, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrana, precipitación mediante 'fosfato de calcio, lipofección (fusión de lisosomas), o un transportador del vector de ADN.

Derivados de vacunas provenientes de plantas transgénicas El término "planta" se refiere a plantas totales, órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raices, etc.), semillas, células vegetales o lo semejante. Las plantas contempladas para utilizarse en la práctica- de la presente invención incluyen tanto monocotiledoneas como dicotiledóneas. Las dicotiledóneas de ejemplo incluyen maíz, tomate, papa, frijol, soya y lo semejante). Típicamente la planta transgénica se utiliza de manera rutinaria como una fuente de alimentación para animales de granja, en particular vacas.

Plantas transgénicas , según se definen en el contexto de la presente invención, incluyen plantas (asi como también, partes y células de las plantas) y su progenie que se haya modificado genéticamente utilizando técnicas de ADN recombinante para provocar o intensificar la producción de al menos un polipéptido de la presente invención en la planta deseada y órgano vegetal. Existen diversas técnicas para introducir material genético extraño en una célula vegetal, y para obtener plantas que mantengan y expresen establemente el gen introducido. Estas técnicas incluyen la aceleración de material genético recubierto sobre microparticulas directamente en el interior de las células (véase, por ejemplo, la US 4,945,050 y la US 5,141,131). Las plantas se pueden transformar utilizando tecnología agrobacteriana (véase, por ejemplo, la US 5,177,010, US 5,104,310, US 5,004,863, US 5,159,135). La tecnología de electroporación también se pueden utilizar para transformar plantas (véase, por ejemplo, la O 87/06614, US 5,472,869, 5,384,253, WO 92/09696 y la WO 93/21335). Además de las muchas tecnologías para transformar plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes extraños puede variar también.

Este tejido podría incluir aunque no se limita a tejido embriogénico, tipo I y II de tejido de callo, hipocotilo, meristema y lo semejante. Casi todos los tejidos vegetales se pueden transformar durante el desarrollo y/o diferenciación utilizando las técnicas adecuadas descritas en la presente. Varios de los vectores adecuados para la transfección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas se han descrito en, por ejemplo, Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987 ; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; y Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Típicamente, los vectores para expresión vegetal incluyen, por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control transcripcional de las secuencias reguladoras 5' y 3' y un marcador seleccionable dominante. Estos vectores para expresión vegetal también pueden contener una región reguladora del promotor (por ejemplo, una región reguladora para controlar la expresión específica celular o de tejidos, regulada ambientalmente o mediante desarrollo, constitutiva, inducible) . Un sitio de arranque para el inicio de la trascripción, un sitio de unión ribosomática, una señal para procesamiento de ARN, un sitio para el término de la trascripción y/o una señal de poliadenilacion. Ejemplos de promotores vegetales incluyen de manera enunciativa: una pequeña sub-unidad de ribulosa-1, 6-difosfato carboxilasa, promotor de beta-conglicina, promotor de faseolina, promotor de ADH, promotores de choque térmico y promotores específicos de tejidos. Los promotores también pueden contener ciertos elementos de secuencia intensificadora que pueden mejorar la eficiencia de trascripción. Los intensificadores típicos incluyen de manera enunciativa: Adh-intron 1 y Adh-intron 6. Los promotores constitutivos dirigen la expresión génica continua en todos los tipos celulares y en todo momento (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S). los promotores específicos de tejidos son responsables de la expresión génica en células específicas o tipos de tejido, tales como por ejemplo, las hojas o semillas (por ejemplo, zeina, oleosina, napina, ACP, globulina y lo semejante) y también se pueden utilizar estos promotores. Los promotores también pueden ser activos durante una cierta etapa del desarrollo de la planta así como también, activos en los tejidos y órganos vegetales.

Ejemplos de estos promotores incluyen de manera enunciativa: promotores específicos de polen, específicos de embriones, específicos de seda de maíz, específicos de fibra de algodón, específicos de raíz, y específicos de endosperma de semilla. Bajo ciertas circunstancias puede ser conveniente utilizar un promotor inducible. Un promotor inducible responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica, tal como por ejemplo: estímulo físico (genes de choque térmico); luz (RUBO carboxilasa ) ; hormona (Em) ; metabolitos, y estrés. Se pueden utilizar otros elementos de trascripción y traducción convenientes que funcionen en plantas. Además de los promotores vegetales, los promotores provenientes de una variedad de fuentes se pueden utilizar eficazmente en células vegetales para expresar genes extraños. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores de origen bactriano, tales como por ejemplo, el promotor de octopina sintasa, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de manopina sintasa; los promotores de origen viral, tales como por ejemplo, el virus mosaico de coliflor (5S y 19S) y lo semejante. Actualmente se están desarrollando varias de las vacunas comestibles derivadas de vegetales tanto para patógenos animales como humanos (Hood and Jilka, 1999) . Las respuestas inmunes que han resultado de la inmunización oral con plantas transgénicas que producen partículas similares a virus (VLP, por sus siglas en inglés), o virus vegetales quiméricos que exhiben epítopes antigénicos (Masón et al., 1996; Modelska et al., 1998; Kapustra et al., 1999; Brennan et al., 1999) . Se ha sugerido que la forma en partículas de estos VLPs de virus quiméricos puede dar por resultado en mayor estabilidad del antígeno en el estómago, aumentando eficazmente la cantidad de antígeno disponible para la absorción en el intestino (Masón et al. 1996, Modelska et al. 1998).

Anticuerpos La invención también proporciona anticuerpos monoclonales o policlonales para los polipéptidos de la invención, o fragmentos antigénicos de los mismos. De esta forma, la presente invención también proporciona un proceso para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales para los polipéptidos de la invención. Si se desean anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, vaca, etc.) se inmuniza con un polipéptido inmunogénico de la presente invención. El suero proveniente del animal inmunizado se recolecciona y se trata de acuerdo con procedimientos conocidos. Si el suero que contiene los anticuerpos policlonales para un polipéptido de la presente invención contiene anticuerpos para otros antigenos, los anticuerpos policlonales se pueden purificar mediante cromatografía por inmunoafinidad . Las técnicas para producir y procesar antisueros policlonales se conocen en este campo. Con el fin de que estos anticuerpos se puedan producir la invención también proporciona los polipéptidos de la invención, o fragmentos antigénicos de los mismos, tratados con hapteno para otro polipéptido para utilizarse como inmunógenos en animales o humanos. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra los polipéptidos de la invención también ya se pueden producir por alguien con experiencia en la técnica. Es bien conocida la metodología general para elaborar anticuerpos monoclonales. Las líneas celulares productoras de anticuerpos inmortales se pueden crear mediante fusión celular, y también mediante otras técnicas tales como por ejemplo, transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o transfección con virus Epstein-Barr . Los paneles de anticuerpos ' monoclonales producidos se pueden seleccionar por diversas propiedades, es decir, por afinidad de isotipos y epitopes. Una técnica alternativa incluye seleccionar bibliotecas que exhiben fagos donde, por ejemplo, el fago expresa fragmentos scFv sobre la superficie de su recubrimiento con una gran variedad de regiones determinantes de complementaridad (CDR, por sus siglas en inglés). Esta técnica es bien conocida en este campo. Los anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales , que se dirigen contra los polipéptidos de la presente invención son particularmente útiles en el diagnóstico, y aquellos que son neutralizantes son útiles- en inmunoterapia pasiva. Los anticuerpos monoclonales, en particular, se pueden utilizar para aumentar anticuerpos anti-idiotipo . Los anticuerpos anti-idiotipo son inmunoglobulinas que portan una "imagen interna" del antigeno del agente contra el cual se desea la protección. Las técnicas para aumentar anticuerpos anti-idiotipos se conocen en este campo. Estos anticuerpos anti-idiotipo también pueden ser útiles en terapia.

Para los fines de esta invención, el término "anticuerpo" a menos que se especifique lo contrario, incluye fragmentos de anticuerpos totales que mantienen su actividad aglutinante para un antigeno blanco. Estos fragmentos incluyen los fragmentos Fv, F(ab') y F(ab' )2, asi como también, anticuerpos de cadena individual (scFv). Además, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos humanizados, por ejemplo, como se describe en la EP-A-239400. Los anticuerpos se pueden utilizar en el método para detectar los polipéptidos de la presente invención en muestras biológicas mediante un método que comprende : (a) proporcionar un anticuerpo de la invención; (b) incubar una muestra biológica con el anticuerpo bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de anticuerpo-antigeno; (c) determinar si se forma un complejo de anticuerpo-antigeno que comprenda el anticuerpo. Los anticuerpos de la invención pueden estar unidos a un soporte sólido y/o empacados en equipos de reactivos en un contenedor adecuado junto con los reactivos adecuados, controles, inspecciones y lo semej ante .

EJEMPLOS EJEMPLO 1 - TÉCNICAS GENERALES Vacunación e inoculación de parásitos Típicamente, hasta ocho (8) grupos cada uno de 5 a 7 reses de 4-7 meses de edad y libres del hemoparásito benigno Theileria orientalis se distribuyeron aleatoriamente en grupos por peso como una indicación de la edad relativa. Aunque benigno por sí mismo, el hemoparásito T. orientalis puede transmitir un grado Variable de inmunidad no específica contra A. margínale . Las reses se vacunaron con fracciones de A. margínale mediante inducción subcutánea, dos veces 4 semanas por separado con antígenos suministrados en Quil A (Biofos 1 mg mlT1) y se inocularon 2 semanas después de la segunda vacunación con 108 de eritrocitos infectados con A. margínale (cepa homologa) mediante inyección intravenosa. De vez en cuando, se utilizaron infecciones de 106 hasta 108 de parásitos. Las reses se monitorearon diariamente y se determinó disminución de parasitemia y hematocritos o PCV. La parasitemia se midió a partir de películas sanguíneas delgadas teñidas con Giemsa. Típicamente, se contaron 100 campos microscópicos y se calculó el porcentaje de parasitemia mediante el número de parásitos en 100 campos con 300 eritrocitos por campo. Este método tuvo una sensibilidad de 0.003 por ciento. La destrucción o pérdida de eritrocitos se midió en los experimentos descritos en el Ejemplo 2 hasta el Ejemplo 4 mediante la disminución del volumen de células empaquetadas (PCV) . En los Ejemplos 5, 6 y 9, se midió mediante la disminución de hematocritos. En ambos casos, se reporta como disminución porcentual a partir de la pre-inoculación. Para animales individuales, un hematocrito o PCV cae del 50% de valores iniciales a un PCV del 15% en el criterio de tratamiento con fármacos para prevenir la muerte. Todos los animales control típicamente mostraron síntomas de anaplasmosis química. Para grupos de vacunación y control, las parasitemias medias se calcularon como la media geométrica de parasitemias diarias. Como otro indicador del impacto de la infección, se utilizó un parasitemia acumulativa, a saber la suma de parasitemias sobre el pico de la infección.

Anaplasma margínale - aislamiento de parásitos y procedimiento de solubilización de la membrana Se preparó una fracción enriquecida para Anaplasma margínale utilizando sangre proveniente de un becerro donador con parasitemia de preferencia en exceso del 50%. Después de la eliminación del plasma y la capa leucocitaria, los parásitos se liberaron mediante lisis de los eritrocitos con cloruro de amonio (NH4C1) al 0.83%. Los leucocitos restantes y las células sin lisar se eliminaron mediante centrifugación a baja velocidad. Los parásitos y el estroma se sedimentaron mediante centrifugación a alta velocidad y se lavaron completamente hasta eliminar la hemoglobina. Después de tres lavados, fueron evidentes en el sedimento dos capas bastante distintas. El examen de las dos capas mediante frotes teñidos con Giemsa reveló que la capa inferior fue predominantemente parásitos mientras que la capa superior fue estroma de eritrocitos con algunos parásitos evidentemente adheridos al estroma. La capa inferior se eliminó y se sometió a centrifugación por gradiente PercollMR. Este paso dio por resultado en la concentración de los parásitos en una banda amplia individual. Esta banda se retiró y se estimó el número de parásitos. Se inyectó una alícuota (estimada como 10 organismos) en un becerro no sujeto a experimentación previa para determinar la viabilidad del parásito. El periodo de pre-permeabilidad indicó que aunque menos del 5% de organismos fueron viables, la mezcla todavía fue infecciosa. Esto sugiere que todos los componentes esenciales del parásito probablemente estarán presentes en este material. Típicamente, se extrajeron tres litros de sangre infectada con Anaplasma margínale (aislado Gypsy Plains) proveniente de un becerro mediante venipuntura. La sangre se recolectó en heparina. Para el aislamiento de parásitos, el nivel blanco de infección fue mayor a 200 parásitos por campo a 1,000 aumentos con un PCV de preferencia a aproximadamente 20%. La sangre se almacenó a 4°C hasta que se procesó (normalmente 1-2 horas). El plasma se eliminó de la sangre mediante centrifugación en un rotor Beckman JA10 (6X500ml), a lOOOg durante 30 minutos a 4°C. Las células sanguíneas se lavaron tres veces con amortiguador Tris HCl 50 mM frío a pH 7.4 que contiene sacarosa 0.25 M. Después de mezclar completamente las células y el amortiguador, la mezcla se centrifugó como antes y se eliminó la capa de plasma/amortiguador. Algo de la capa leucocitaria se eliminó en cada lavado. Aproximadamente 500 mi de células sanguíneas se Usaron diferencialmente con la adición de una solución de cloruro de amonio a una concentración final de 0.75% peso/vol y a un volumen final de 1.5 L. La mezcla se dejó mezclar a temperatura ambiente hasta que fue visible la lisis de los eritrocitos ( -15 minutos ) . Los leucocitos y trombocitos restantes se sedimentaron a aproximadamente 440 g durante 20 minutos a 4°C. el lisado que contiene los parásitos y manchas de eritrocitos luego se sometió a una serie de fases de lavado con amortiguador Tris/HCl 25 mM a pH 7.4 que contienen sacarosa 0.25 M, EDTA 2 mM y AEBSF 50 µ?. Después de cada uno de los tres pasos de lavado, los parásitos y manchas de eritrocitos se separaron diferencialmente a partir del lisado/amortiguador mediante centrifugación en un rotor Beckman JA14 (6X250ml), a 17500g durante 30 minutos a 4°C. En la centrifugación, se formaron dos capas de sedimento. La capa inferior contiene principalmente cuerpos iniciales de anaplasma marginales y la capa superior predominantemente manchas de eritrocitos junto con algunos parásitos. En cada paso de lavado, una gran porción de la capa superior de manchas de eritrocitos se decantó hasta agotar y el sedimento restante se resuspendió en amortiguador recién preparado. A medida que se redujo el volumen de sedimento que contenia parásitos, la mezcla se transfirió a tubos centrífugos más pequeños (8x40ml) y se sometieron a centrifugación en un rotor Beckman JA20, a 18500g durante 20 minutos a 4°C (3 lavados). La separación final de los parásitos provenientes de las manchas de eritrocitos restantes y los otros desechos celulares se realizó en un gradiente de PercollMR al 16%. El sedimento lavado de parásitos se resuspendió en amortiguador Tris/HCl 25 mM a pH 7.4 que contiene sacarosa 0.25 M, EDTA 2 mM y AEBSF 50 µ? aun volumen de 270ml. Se separó una solución de 52.8 mi de PercollMR y 5.9 mi de sacarosa 2.5 . Esta solución luego se mezcló con la solución de parásitos y se cargó en ocho tubos Beckman Quick-SealMR de 40 mi. Se formó un gradiente in sxtu mediante centrifugación en un rotor Kontron 65.38 a 20000g durante 1 hora a 4°C. El agregado de cuerpos iniciales de Anaplasma margínale en un sedimento aproximado en la parte inferior del tubo justo por arriba de un pequeño sedimento PercollMR. Las manchas de eritrocitos restantes y los otros componentes de células sanguíneas restantes migraron a la región superior del gradiente. La región superior del gradiente se aspiró hasta agotar y el sedimento de parásitos se recolectó mediante pipeta.

Aislamiento y separación de membranas de parásitos El material de parásitos se sometió a sonicación con ciclos de sonicación de 2 x 2 minutos que fueron suficientes para romper los cuerpos iniciales de A. margínale. Se agregó endonucleasa (Sigma Cat. No. E8263) a 2 U por mi y se dejó incubar a 4°C durante 30 minutos. El material de parásitos luego se centrifugó en un rotor Kontron 65.38 a 100,000g durante 1 hora a 4°C. El sedimento de membranas de parásitos se recolectó y se resuspendió en Tris/HCl 50 mM a pH 7.4 que contenía EDTA 2mM y AEBSF 50µ? (Tris/HCl++) y se centrifugó como anteriormente. El sedimento de membranas se resuspendió en Tris/HCl++ a un volumen de 12ml. El material de membranas se combinó con 12ml de n-dodecil-N, -dimetil-3-amonio-1-propanesulfonato al 4% (peso/vol) (adquirido como Zwittergent® 3-12 de Boehringer Mannheim) en Tris/HCl++ y se incubó a temperatura ambiente, con balanceo, durante 2 horas. Después de la incubación el material se centrifugó en un rotor Beckman 70.1 TI rotor a 100,000g durante 1 hora a 4°C. El sobrenadante se recolectó y se denominó el material soluble de Zwittergent® 3-12.

Enfocamiento Isoeléctrico (IEF) El material soluble de Zwittergent® 3-12 luego se preparó para enfocamiento isoléctrico de radiación amplia (WR-IEF, por sus siglas en inglés)). A 100 mi de agua Milli Q ( QW) , se agregaron y disolvieron 18 mi de AmpholineMR a pH 3.5-10.0 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala) y 1.35 g de Zwittergent® 3-12. El volumen se ajustó a 270 mi con MQW y se agregaron y dejaron aumentar de volumen completamente 16.0 g de gel granulado de UltrodexMR (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala) . Se utilizó el sistema Multiphor II IEF (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala) para el IEF. Se preparó un gel de lecho plano (19 cm X 24 cm X 0.5 cm de profundidad), y el gel pre-enfocado para IEF a 12W y 10°C para 1500Vh. Mientras tanto, a 19.0 mi del material soluble de Zwittergent® 3-12, se combinaron 1.36 mi de AmpholineMR a pH 3.5-10.0 y aproximadamente 1.0 g de gel granulado de UltrodexMR y el gel se dejó aumentar de volumen completamente. La muestra se cargó en el gel para IEF pre-enfocado al pH bajo final (región de pH final ~ 4.0-4.3). El material soluble de Zwittergent® 3-12 se enfocó a 12W y 10°C durante 12000Vh. Después de la electroforesis , el gel en bloque para IEF se cortó horxzontalraente en 30 fracciones iguales, proporcionando fracciones a partir de pH bajo a pH alto. Se separó la porción acuosa del gel granulado mediante centrifugación a través de una malla de gasa. El gel se lavó (2 X 2ml) con MQW que contenia Zwittergent® 3-12 al 0.2% y AEBSF 50µ?. El pH de cada fracción se registró y el pH muestra se ajustó a 7.4 con 1.0 mi de amortiguador Tris/HCl 1.0 a pH 7.4. Los componentes proteinicos de las fracciones para IEF se visualizaron en SDS-PAGE.

Tinción Western utilizando antisuero aumentado para péptidos sintéticos conjugados provenientes de secuencias de antigenos conocidos Eliminación de antígenos caracterizados anteriormente MSP-1 y proteínas relacionadas incluyendo AmV70. Se requirió una solución de ensayo para permitir que esta proteina se detectara y se monitoreo su eliminación de las fracciones de vacuna. Se han producido antisueros de conejo para un péptido derivado del análisis de la secuencia de aminoácidos (15 aminoácidos CQRVAAQERSRELSRA (SEQ ID NO:9)). Se incluyó un residuo de cisteina para · facilitar la conjugación para hemociania limpet 5 de ojo de cerradura. El anticuerpo peptidico anti-MSP-1 probó ser un reactivo útil en la identificación de MSP-1 mediante tinción Western de geles SDS-PAGE, bajo condiciones de reducción. MSP-2 y MSP-4. Se aumentaron antisueros de conejo adicionales contra varios polipéptidos de parásitos, inicialmente para ser utilizados para la identificación de proteínas. Estos incluyen: CVDGHINPKFAYRVK ( SEQ ID NO: 10) proveniente de MSP 2, y ESSKETSYVRGYDKSIATIDC (SEQ ID NO: 11) proveniente MSP 4.

Antisueros aumentados para antigenos naturales purificados de Anaplasma, cuya identidad se había confirmado mediante secuenciación N-terminal Se purificaron MSP-2 y MSP-4 utilizando varias técnicas de cromatografía y la identidad se confirmó mediante una secuencia de aminoácidos N-terminal. Se produjeron antisueros polivalentes en conejos utilizando técnicas estándar. Los antisueros preparados contra MSP-2 específicamente reconocieron sólo MSP-2 aunque los antisueros para MSP-4 reconocieron tanto MSP-2 como MSP-4. El examen de la base de datos mostró suficiente homólogo de secuencia para explicar este resultado. Se concluyó que estas soluciones de ensayo serán reactivos satisfactorios para determinar la presencia o ausencia de estas proteínas en las fracciones preparadas a partir de A. margínale .

EJEMPLO 2 - DEMOSTRACIÓN DE QUE EL MATERIAL SOLUBLE, UNIDO A MEMBRANAS Y QUE SE PUEDE EXTRAER DE DETERGENTES A PARTIR DE ANAPLASMA MARGINALE CONTIENE ANTIGENOS PROTECTORES Se preparó una fracción de antigeno crudo de parásitos mediante sonicación de parásitos purificados mientras que se preparó una fracción equivalente utilizando sangre proveniente de un becerro donador recolectada antes de la infección con A. margínale. La ultracentrifugación (100,000 g) proporcionó una fracción soluble. El sedimento se extrajo con Zwittergent®3-12 durante 90 minutos a 37°C y se ultracentrifugó (100,000g) para proporcionar fracciones solubles en detergente e insolubles en detergente. Todas las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción.

SDS-PAGE mostró que la mayoría del material hospedero se había eliminado según se indica por la ausencia de las proteínas principales de bovino. Las sub-fracciones del material de partida mostraron que había bandas comunes entre las fracciones, en particular entre los materiales solubles e insolubles en detergentes, aunque también hubo especies únicas en cada fracción. El procedimiento se muestra en la Figura 1. La eficacia de vacunación se define como aquellas fracciones que mostraron una diferencia estadísticamente significativa en parasitemia en comparación con el grupo control (becerros vacunados con material normal de eritrocitos) . Se indujo una protección significativa mediante la vacunación con material solubilizado 3-12 y el residuo después de la extracción 3-12, en particular cuando se compara con el extracto de parásitos total de partida. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Resultados de la vacunación con antigenos Anaplasma complejo *No. de reses tratadas en el número tratado en el dia 23, cuando se terminó el experimento *CP es parasitemia acumulativa, la parasitemia diaria media para el grupo, sumada durante los días 12 a 22 (n=ll) .

El material de parásito total y el material soluble indujo protección: de hecho, aparecieron en este experimento para agravar la parasitemia. Esto muestra nuevamente la variabilidad experimentada en la vacunación con material crudo, asi como también, la capacidad de una respuesta inmune inadecuada para agravar la enfermedad.

EJEMPLO 3 - FRACCIONAMIENTO DE MATERIAL SOLUBLE EN DETERGENTES PROVENIENTE DE ANAPLASMA MARGINALE MEDIANTE IEF Aislamiento de parásitos y fraccionamiento de proteínas para un estudio de vacunación Se aislaron parásitos de A. margínale como se describió anteriormente en las técnicas generales. Las proteínas se fraccionaron para el paso soluble 3-12 e insoluble 3-12 de Zwittergent®, como se describe en las Técnicas Generales. Se alcanzó una f accionamiento adicional de proteínas de parásitos al correr la fracción soluble 3-12 de Zwittergent® en un IEF de amplia variación de lecho plano (3.5-10) como se describió en las Técnicas Generales y las fracciones para IEF se reunieron en grupos. Cinco grupos para IEF se probaron en el experimento de vacunación/inoculación. Además, el material de Zwittergent® 3-12 se trató con guanidina -HC1 6M y las proteínas solubles se libraron mediante pre-tratamiento también cuando se probaron. Este proceso se muestra en la Figura 2. Los parásitos aislados recientemente se utilizaron para la preparación del material para la 2a vacunación. El procedimiento de fraccionamiento se repitió fácilmente con los perfiles de proteína de fracciones de vacunación correspondientes que exhiben buena capacidad de reproducción cuando se comparan con las fracciones utilizadas para la primera vacunación. El procedimiento de fraccionamiento es vigoroso y se puede reproducir. Tres (3) proteínas de superficie principal de A. margínale (MSPs) identificadas y secuencias anteriormente se habían identificado en las fracciones de proteína mediante secuenciación N-terminal (MSP-1 "Am 105", MSP-2 y MSP-4) . Además se utilizaron para identificar MSP-1 anticuerpos anti-péptido de conejo para MSP-1. La presencia de los genes MSP conocidos en las fracciones de vacunación se proporciona en la Tabla 3.

Tabla 3. grupos de vacunación de Anaplasma margínale Grupo Antígeno Especies conocidas principales 1 Fracción 1 para IEF pl 6.8-8.6 Hb a-cadena 2 Fracción 2 para IEF pl 5.7-6.8 MSP 2, Hb a-cadena 3 Fracción 3 para IEF pl 5.2-5.7 MSP 2, MSP 4 4 Fracción 4 para IEF pl 4.2-5.2 Am 105 5 Fracción 5 para IEF pl 3.1-4.2 6 Material soluble de guanidina-HCl 7 Z ittergent® 3-12 soluble total 8 Control Los antigenos que serán caracterizados adicionalmente (los antigenos Ana) también estuvieron visibles en algunas de las fracciones de vacunación. Debido a su baja abundancia sin embargo, algunas fracciones contuvieron casi uno o más de los antigenos Ana, aunque a niveles que no se podrían distinguir en mezclas de proteína compleja.

Experimento de vacunación/inoculación Ocho grupos (Tabla 3) cada uno de 6 reses de 5-7 meses de edad se vacunaron con fracciones de A. margínale y se inocularon como se describió en las Técnicas Generales. Las reses se monitorearon para parasitemia y disminución de hematocritos (Tabla 4). Todos los animales control (Grupo 8) mostraron síntomas de anaplasmosis química (parasitemia máxima >10%) y declinación grave en PCV. Dos animales requirieron tratamiento. Todos los grupos de tratamiento mostraron algún grado de control de parasitemia. Un animal en los grupos 1, 2, 6 y 7 requirió de tratamiento, utilizando como criterios para el tratamiento una gota en PCV para 0.15 L L_1.

Tabla 4. resultados de la vacunación 5 10 CP es la parasitemia acumulativa, la suma de las parasitemias medias 15 diarias a partir de los días 14 a 19 inclusive (n=5) .

Los datos de parasitemia para este experimento mostraron que todas las Fracciones para IEF demostraron un grado de eficacia en el control de la parasitemia. Sin embargo, los datos de PCV demostraron que las reses vacunadas con Fracciones para IEF 4 y 5 y el material soluble de guanidina-HCl tuvo una disminución menor en comparación con los controles y otros grupos. Esto sugiere que la vacunación con más fracciones definidas de A. margínale puede dar por resultado en una respuesta inmune que controla la parasitemia aunque no da por resultado en una disminución seria de PCV. Por lo tanto, estos resultados demuestran que el material soluble Zwittergent® 3-12 de A. margínale se puede fraccionar en 5 fracciones utilizando enfocamiento isoeléctrico preparativo (IEF) , todas las fracciones mostraron un grado significativo de eficacia. El material solubilizado de guanidina-HCl también demostró algún grado de eficacia. Algunas fracciones para IEF contuvieron antigenos MSP (vlz MSP-1, SP-2 y MSP-4) . Éstos se identificaron mediante la secuencia de aminoácidos N-terminal. Otros no contuvieron MSPs detectables/identificables conocidos anteriormente.

EJEMPLO 4 - FRACCIONAMIENTO ADICIONAL DE ANTÍGENOS PURIFICADOS PARA IEF Y SEPARACIÓN A PARTIR DE ANTÍGENOS IDENTIFICADOS ANTERIORMENTE Aunque los antisueros polivalentes contra MSP-1, MSP-2 y MSP-4 denominados anteriormente fueron satisfactorios para la detección de estas proteínas en tinciones Western, no fueron adecuados para la eliminación cuantitativa de estos antigenos a partir de fracciones de purificación. Por lo tanto se probó una variedad de procedimientos en material de Anaplasma purificado parcialmente por su capacidad para eliminar ' estos antigenos. El intercambio iónico a alta presión y la cromatografía por exclusión de tamaño bajo una variedad de condiciones fue incapaz de alcanzar la resolución necesaria. Se encontró que es útil la HPLC de hidroxiapatita . También se probó un arreglo de apoyos de afinidad para ligandos de tinte. Por último, una combinación de IEF, hidroxiapatita y métodos de ligando de tinte proporcionó las fracciones necesarias. En' resumen, los parásitos aislados recientemente se utilizaron para la preparación de material para este experimento de vacunación. El material de parásitos se solubilizó en Zwittergent® 3-12 y se sometió a enfocamiento isoeléctrico de variación amplia (IEF) como se describió en las Técnicas Generales. El procedimiento de fraccionamiento se repitió fácilmente con los perfiles de proteina de fracciones de vacunación correspondientes que exhiben buena capacidad de reproducción cuando se comparan con las fracciones utilizadas para los dos experimentos de vacunación anteriores. Varias de estas fracciones para IEF se sometieron a cromatografía de hidroxiapatita y el material sin unir luego se sometió a cromatografía de • ligando de tinte. Un total de 6 fracciones se generaron, tres de las cuales mostraron contener ya sea MSP-2 o SP-4, mientras que SP-1, 2 y 4 podrían no ser detectados en las otras tres fracciones. El procedimiento se resume en la Figura 3, mientras que la Tabla 5 lista las fracciones. Los antígenos caracterizados adicionalmente en este reporte fueron visibles en algunas de las fracciones de vacunación. Debido a su baja abundancia sin embargo, algunas fracciones casi no contuvieron uno o más de los antígenos Ana, aunque a niveles que podría no ser distinguidos en mezclas de proteína compleja. Los antígenos identificables en cada una de las fracciones de vacunación se listan en la Tabla 7 como son la ocurrencia de los MSP identificados anteriormente .

Resultados de vacunación Un experimento de vacunación/inoculación se llevó a cabo utilizando estas seis (6) fracciones (Tabla 5). Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 5. Fracciones de vacunación Ejemplo 4 Todas las fracciones de proteina mostraron algún efecto para reducir la destrucción de eritrocitos y la parasitemia. Algunos animales necesitaron ser tratados en cada uno de los Grupos 4, 5, 6 y 7 (véase la Tabla 6) . Los Grupos 4 y 5, que contenían predominantemente SP4 y SP2 respectivamente, indujeron la protección más deficiente de todas las fracciones de proteína. Los Grupos 1 y 2 produjeron la mejor respuesta inmune protectora con la parasitemia que permaneció a bajos niveles, dando por resultado en una reducción significativa de la destrucción de eritrocitos. El hecho de que las fracciones 1 y 2 no contuvieron MSP detectables es una fuerte evidencia de que existen antigenos protectores novedosos en Anaplasma margínale. El perfil de proteína de las fracciones 1 y 2 (datos no mostrados) muestra un número de especies de proteína común para ambas fracciones. La posibilidad de que los mismos antígenos protectores estén presentes en ambas fracciones es evidente.

Tabla 6. resultados de vacunación 5 10 CP es la parasitemia acumulativa, la suma de las parasitemias medias diarias a partir de los dias 12 a 21 inclusive (n=9) .

Tabla 7. Proteínas principales visibles fracciones de vacunación EJEMPLO 5 - FRACCIONAMIENTO ADICIONAL DE ANTIGENOS EN LA VARIACIÓN PI DE 7.7 A 9.5 En el Ejemplo 4, los principales MSP se separaron de otras proteínas menos abundantes dando por resultado en diversas fraccione de vacunación que contuvieron grupos específicos de proteínas libres de MSP. Las proteínas MSP aisladas también se valoraron. Estas indujeron sólo bajos niveles de protección. Las fracciones libres de MSP indujeron niveles variables de protección. Las dos fracciones para IEF de amplia variación, IEF-E y IEF-F (proteínas de incorporación de pl 7.30 - 9.07) fueron las más eficaces sobre la inoculación de parásitos. MSP2 en particular está presente en cantidades muy grandes en extractos de parásitos. Esto, más su naturaleza hipervariable , hace su eliminación de las fracciones antes de los estudios de vacunación un reto continuo. El éxito en la fracción y purificación de antigenos tuvo la consecuencia inevitable de que el aislamiento de demasiado material para un estudio de vacunación se convierta en una dificultad siempre en aumento. En el ejemplo 4, las fracciones para IEF combinadas E y F (IEF-EF) se igualó a menos de 1% de la proteína total de parásitos (348 mg) . Este 1% fue el "material de partida" para el ejemplo actual. La fracción de IEF-EF contuvo siete a ocho principales proteínas y un número considerable (> 15) de menos especies abundantes. Por consiguiente, incluso las principales proteínas de esta fracción son especies menores en los organismos de A. margínale como un todo. No obstante, las proteínas de fracción IEF-EF se han separado adicionalmente y las proteínas se recuperan en cantidades adecuadas. La fraccionamiento de proteínas de A. margínale con puntos isoeléctricos mayores de aproximadamente 7.7 fue el principal enfoque del Ejemplo 5.

Fraccionamiento de proteínas en la f acción IEF-EF (pl 7.7 a 9.5) La fraccionamiento de antigenos potenciales provenientes de la recolección IEF-EF se diseñó para segregar las especies de proteina más abundantes. Algunas de estas proteínas estuvieron presentes en ambas fracciones protectoras IEF-E y IEF-F en el Ejemplo 4. Las principales proteínas entre 17 y 57 kDa se seleccionaron como especies "blanco" para separarse entre sí. Las proteínas se aislaron utilizando varias técnicas incluyendo: (a) IEF (b) ultrafiltración a través de un filtro de corte de 30 kDa (principalmente para aislar material de bajo peso molecular) [< lOkDa] prevalente en las fracciones pl altas) y (c) (AE)-HPLC de intercambio aniónico en un intercambiador aniónico Applied Biosystems AX-300. En la Figura 4 se muestra un diagrama de flujo del procedimiento de fraccionamiento. Las principales especies de proteínas en cada fracción se listan en la Tabla 8.

Estudio de vacunación Debido a la baja abundancia de proteínas "blanco" en la fracción IEF-EF, la sangre proveniente de tres becerros con extirpación de bazos infectados fue necesaria para el aislamiento de parásitos. No obstante, la cantidad de proteina por vacunación por animal fue incluso relativamente bajo (Tabla 9). Incluso las especies más abundantes en los estudios de vacunación estarán presentes únicamente en bajas cantidades de microgramos. Debido a la naturaleza de la respuesta inmunoprotectora se había caracterizado sólo parcialmente, la capacidad para producir la respuesta adecuada se puede evaluar únicamente a través de inoculación de parásitos.

Tabla 8. Principales proteínas visibles en las fracciones de vacunación Grupo Principales Principales especies novedosas especies conocidas IEF 21-23 >30 KDA Ana 29, Ana 17 Hb a-cadena IEF 27-30 >30 kDa Ana 43, Ana 32 Hb a-cadena IEF 21-30 <30 kDa None AX-300 (A) [nulo] Ana 43, Ana 37, Hb a-cadena Ana 32, Ana 17 AX-300 (B) Ninguna [retenido] Grupo Principales Principales especies novedosas especies conocidas AX-300 (C) Ana 29 Ninguna [retenido] IEF 21-30 Todo lo anterior Ninguna [material de partida] Tabla 9. Fracciones de vacunación - estimaciones proteínas Los resultados de la vacunación se proporcionan en la Tabla 10. Todos los grupos de vacunación, la Fracción 1 (IEF 21-23 >30kDa) fue claramente la más protectora, que demuestra la menor destrucción de eritrocitos (17% caída en Hct, día 17) y la menor parasitemia (reducción de 5 veces con relación a los controles) . El material de partida, Grupo 7 (equivalente a IEF-EF, la fracción protectora del Ejemplo 4) también mostró una reducción significativa en la destrucción de eritrocitos y en la parasitamía (31% de controles, día 17) que confirma el resultado anterior. El grupo control y los grupos vacunados no protegidos mostraron reducciones en Hct el día 17 de 39% a 45%.

Tabla 10. Resultados de vacunación 5 10 CP la parasitemia acumulativa, la suma de las parasitemias medias diarias a partir de los días 12 a 20 inclusive (n=9) .

En conclusión, las proteínas en la variación pl 7.7 a 9.5 se fraccionaron utilizando una combinación de uiltrafiltración y cromatografía líquida de alto desempeño de intercambio aniónico (??-HPLC) . Se aislaron seis grupos distintos de proteínas en suficiente cantidad para un estudio de vacunación en reses. El grupo mejor protegido fue el Grupo 1, con los Grupos 2, 4 y 6 que también mostraron una protección significativa, mediada mediante una reducción en la parasitemia y supervivencia aumentada. El antígeno del Grupo 1, fue relativamente complejo, las principales especies de proteínas son Ana 29 y Ana 17 (en donde, por ejemplo, Ana 29 indica que el polipéptido tuvo un PM de aproximadamente 29kDa) . El Grupo 2 contuvo principalmente Ana 43 y Ana 32. El Grupo 4 fue nuevamente complejo, conteniendo como las proteínas de especie principal probablemente identificables con Ana 43, 37, 32 y 17. El Grupo 6 contuvo principalmente Ana 29 con algunas especies menores.

EJEMPLO 6 - IDENTIFICACIÓN DE ANTÍGENOS PROTECTORES INDIVIDUALES El Ejemplo 5 probó la eficacia de las fracciones separadas de la recolección IEF-EF, la fracción más eficaz del Ejemplo 4. Las proteínas "blanco" se aislaron utilizando varias técnicas En resumen, la Fracción 1, que contenía predominantemente Ana 29, Ana 17 y Hb alfa-cadena de bovino fue claramente la mas protectora, demostrando la menor destrucción de eritrocitos (reducción del 17% en Hct, día 17) y la menor parasitemia (reducción de 5 veces con relación a los controles). Otras fracciones, que contenía cantidades variables y combinaciones de Ana 43, Ana 37 Ana 32 y Ana 29, mostraron protección, aunque a un nivel menor. El material de partida, Grupo 7 ( (equivalente a IEF-EF, la fracción protectora del Ejemplo 5) también mostró una reducción significativa en la destrucción de eritrocitos y parasitemia (31% de los controles, día 17) que confirma el resultado anterior. El grupo control y los grupos vacunados no protegidos mostraron reducciones en Hct el día 17 de 39% hasta 45%. La proteína Ana 29 y una proteína librante cercana a 25 kDa se sometieron a diversos tiempos de secuenciación N-terminal y se encontró que poseen secuencia N-terminal idéntica. Probablemente es debido a que la proteína 25kDa puede ser un producto de rompimiento parcial de Ana 29. Por lo tanto, tanto la forma 25kDa como la 29kDa se denominan como Ana 29. Ambas estuvieron presentes en estudios de vacunación .

Aislamiento de antigenos de Anaplasma margínale protectores novedosos Aislamiento SDS-PAGE de proteínas en la fracción WR-IEF pl 7.8-9.8 Tres bueyes con bazos extirpados se infectaron con Anaplasma margínale y se utilizaron para la recolección de parásitos. Los parásitos de Anaplasma margínale se aislaron y se fraccionaron utilizando el protocolo estándar. Las principales proteínas de A. margínale presentes en la fracción de variación 7.8 a 9.8 de R-IEF pl se purificaron hasta homogeneidad en SDS-PAGE. Las proteínas "blanco" para aislamiento en este caso, no sólo incluyeron las proteínas principales presentes en la Fracción 1 como se señala en el Ejemplo 5 (la mayor eficacia), sino que también aquellas presentes en menos eficacia aunque fracciones todavía protectoras. Las proteínas "blanco" incluyeron Ana 43, Ana 37, Ana 32, Ana 29 y Ana 17. Las bandas de proteína resueltas en SDS PAGE se visualizaron con Coomassie Brilliant Blue R-250, suprimido del gel, eluido pasivamente con un acetato//SDS/amortiguador DTT, luego se precipitaron en metanol para eliminar los residuos de detergente y acrilamida indeseables.

Estudio de vacunación Las cinco proteínas nominadas anteriormente se purificaron en suficientes cantidades y de adecuada pureza para vacunación. Estas proteínas fueron Ana 43, Ana 37, Ana 32, Ana 29 y Ana 17. Otras proteínas en el gel SDS-PAGE (entre 17 kDa y 100 kDa), presentes sólo en cantidades menores también se extrajeron del gel, se recolectaron conjuntamente y representan la sexta fracción de proteína (denominada "en descanso") . Los estimados de la cantidad de proteína inyectada en cada animal en cada una de las dos vacunaciones se muestra en la Tabla 11. Se debe observar que la cantidad de Ana 43, y Ana 32 inyectada en el estudio es baja y es un resultado directo de la dificultad de precipitación de estas especies en metanol en el paso para eliminación de detergentes. Se obtuvo en el Ejemplo 5 la evidencia de eficacia de estas dos proteínas conjuntamente. Las cantidades de Ana 29 y Ana 17 inyectadas en este experimento fueron mayores que en el Ejemplo 5. Los resultados del estudio de vacunación se muestran en la Tabla 11.

Identificación de proteínas mediante secuenciación N-terminal Aproximadamente una quinta parte de material de proteina (WR-IEF pl 7.8-9.8) fraccionado de los primeros dos animales donadores se utilizó para la adquisición de los datos de la secuencia de aminoácidos N-terminal. Diversas fracciones WR-IEF pl 7.8-9.8 se corrieron en SDS-PAGE luego se inocularon a la membrana PVDF. Las bandas de proteina se separaron y se secuenciaron utilizando un Secuenciador de Proteínas Applied Biosystems 471A. El resultado de la secuenciación de aminoácidos N-terminal se muestra en la Tabla 12. Ana 43, Ana 37 y Ana 29 poseyeron secuencia novedosa. No se obtuvo ninguna homología de secuencia significativa para estas proteínas a partir de las bases de datos de la secuencia de proteína (Swiss-Prot y EMBL) . Como se sabe anteriormente, una proteína principal presente en la fracción WR-IEF pl 7.9-9.8,. se secuenció y se confirmó para ser Hb alfa-cadena de bovino. Debido a que se realizó este trabajo, una secuencia génica Tabla 11. Resultados de la vacunación CP es la parasitemia acumulativa: la suma de las parasitemias medias diari partir de los dias 13 a 24 inclusive (n=12) .

Las concentraciones de proteina presentadas (*) se estimaron a partir de bandas teñidas con plata en geles SDS-PAGE. Las bandas de proteina de Anaplasma se compararon con la banda de anhidrasa carbónica (0.83µg de proteina/µ? de estándar cargado). Las cantidades de proteínas (**) se estimaron utilizando el reactivo BCA con BSA como el estándar . Ana 29, Ana 37 y Ana 43 ya se habían secuenciado adicionalmente y comprende las secuencias mostradas en la Tabla 12. Además, se ha establecido que Ana 17 es un fragmento antigénico truncado C-terminalmente de Ana 29. Además, el marco de lectura abierto completo del gen que codifica para Ana 32 se ha secuenciado a partir de un aislado australiano de A. marginale (SEQ ID NO: 8) . La proteína codificada por este marco de lectura abierto se proporciona en la SEQ ID NO : .

Tabla 12. Secuencias parciales de Ana Ana29 SFKIKDERLSAHIANPDGTRYMRQG (SEQ ID NO:12) Ana2901 HVSFVS/RSGR (SEQ ID NO: 13) Ana29P105 E/GMN/EGLYPNAAYLVAPA (SEQ ID NO:14) Ana32 AAPNVGSAAPGVGAEGEL (SEQ ID NO: 15) Ana37 SPRPIDES/QRGEGASGFFASVQYK (SEQ ID NO:16) Ana37_A VGVQYFASR (SEQ ID NO: 17) Ana37_B AAL/1FAYAYASR (SEQ ID NO: 18) Ana37_C GPDL/IASGGSFEGK (SEQ ID NO: 19) Ana37_D QSVSVGYSEL/IVR (SEQ ID NO: 20) Ana43 AEAFGPYVSFGYTPAAGDV (SEQ ID NO:21) Ana43H10/18 LNLXN/FLFTAT (SEQ ID NO: 22) Ana43H5/12 PYLSYSDK (SEQ ID NO:23) Ana43H04 HTMLGQALPK (SEQ ID NO: 24) Ana43H04b ASVFVGGVLHR (SEQ ID NO: 25) Ana43H14P12 I/LXPYGVTGAV (SEQ ID NO: 26) EJEMPLO 7 - CLONACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL ADNc QUE CODIFICA PARA ANA29, ANA32 , ANA37 AND ANA 3.

Extracción de ARN de parásitos y síntesis de ADNc Se preparó ARN total a partir de 10 mi de A. margínale (aislado de Gypsy Plains) o sangre infectada con Anaplasma céntrale utilizando Reactivo Trizol según las recomendaciones del fabricante (Life Technologies) . Para la síntesis de ADNc, 2 µg de ARN total se transcribieron inversamente en una mezcla de reacción de 20 µ? utilizando 0.5 µg/µl de cebador oligo (dT) 12-18 y Superscript II (Life Technologies) a 42°C durante 70 minutos. Para las síntesis de ADNc 5' RACE y 3' RACE, aproximadamente 2µg del ARN total se transcribieron inversamente en una reacción de 20 µ? utilizando 1 µ? de SMART oligo II, 1 µ? de oligo dT y Transcriptasa Inversa Powerscript (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA) a 42°C durante 70 minutos.

Reacciones RT-PCR Una reacción PCR estándar consiste de Tris-HC1 45 mM (pH 8.8), NH4S04 11 mM, gCl2 4.5 mM, 2-mercaptoetanol 6.7 mM, EDTA 4.4µ? (pH 8.0), 1 mM cada uno de cuatro dNTP's y 1 µ? de cada cebador de oligonucleótidos . En todas las reacciones PCR se utilizaron 0.5-1 µ? de ADNc preparado como anteriormente . Los oligonucleótidos degenerados se diseñaron para las secuencias N-terminales y de proteína interna de Ana29, Ana37 y Ana43 como sigue: Ana25-2, 5 ' GACGGNACNAGRTAYATG (SEQ ID NO:27); Ana25-3, 5' GGATANARNCCYTCCATYTC (SEQ ID NO:28); Ana37-C, 5' CGCTWGCGTAWGCRTANGC (SEQ ID NO:29); Ana37-E 5' TTCTTCGCWAGYGTNCARTAYAA (SEQ ID NO:30); Ana43-A, 5' GCTGARGCNTTYGGNCCNTAYGT (SEQ ID NO: 31) y Ana43-B 5 ' CTGCBCCWGTNACNCCRTANGG (SEQ ID NO: 32) . Las condiciones de ciclización se utilizaron como sigue: desnaturalizar as 94°C durante 20 segundos, reasociar a 40°C durante 40 segundos, extensión a 72°C durante 2 minutos. La temperatura de reasociación se aumentó en 0.5°C durante 20 ciclos, seguido por 10 ciclos a 50°C. Para Ana43, se obtuvo una secuencia adicional utilizando los cebadores Ana43-H 5' TGATGAAGTATTATCCTGGTCTAGCT (SEQ ID NO: 33) y el cebador degenerado Ana43-C 5 ' GCYTGNCCNAGCATNGTRTG (SEQ ID NO: 34) . Para 5' RACE y 3 ' RACE PCR, se utilizaron condiciones de ciclización a 94°C durante 20 segundos, 70°C durante 40 segundos y 72°C durante 2 minutos durante 10 ciclos, seguidos por 10 ciclos a 65°C de reasociación luego unos 15 ciclos adicionales a 60°C. Los cebadores utilizados para 5' RACE fueron Ana25-5 5 ' AGCGCTGATGGTCATGCTG (SEQ ID NO: 35) y Ana25-6, 5' CGTGGTCTGCAATGAACATCAG (para PCR anidada) (SEQ ID NO:36); Ana37-J 5 ' TCGGACGAGCCCGCTGGAGGCGTT (SEQ ID NO:37); Ana37-K 5 'AAGCGCCTTACCTTTGTCTTCTACTA (PCR anidada) ( SEQ ID NO: 38); Ana43-E 5' CAGGACATACCAAGTCTCTCCAGGA (SEQ ID NO: 39) y Ana43-F 5' CAACGTATAGGTTTCTAACACCTC (PCR anidada) (SEQ ID NO:40). Para 3'RACE se utilizaron los siguientes cebadores: Ana25-7, 5 ' CTGACGCATATACCTCGTAC (SEQ ID NO: 41) y Ana25-8, 5 ' GGCAACTACTATGACCGAC (PCR anidada) (SEQ ID NO: 2), Ana37-L 5 ' GCGGTGGTGGCAGTCTAGTCAGGT (SEQ ID NO:43); Ana37-M 5 ' GGTGCAGTATTTCGCGTCTAGGAA (PCR anidada) (SEQ ID NO: 44); Ana43-J2 5' TAACTATGTTGGGTCGGCGACCATG (SEQ ID NO: 5) y Ana43-K 5' CCGGCAGCAACTGGTCAAGTAAGC (PCR anidada) (SEQ ID NO:46). Se utilizaron cebadores específicos junto con cebadores universales y universales anidados según se suministra por Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, CA) . La amplificación del fragmento de gen Ana29 de longitud completa se obtuvo utilizando los cebadores Ana25-F, 5' GAGGATCCATGTCCTTCAAGATTA (SEQ ID NO: 7) y Ana25-Rl, 5 ' ACCCGGGTTACATTGCAACGGGAGTT (SEQ ID NO:48). Ana32, Ana37 y Ana43 de longitud completa se amplificaron utilizando los siguientes conjuntos de cebadores: Ana32-B 5 ' GGATCCGGCGGCTCCCAATGT (SEQ ID NO:49), Ana32-C 5 ' ACCCGGGTCAAAGTAACACCCTTATG (SEQ ID NO:50); Ana37-N 5 ' GCATGCTCCCCCAGGCCCATAGACT (SEQ ID NO:51), Ana37-P 5 ' CCCGGGATAAGTACGAGTCTTATNCCG (SEQ ID NO:52); Ana43-M 5 ' GGATCCGCCGAAGCATTTGGTCCGTAC (SEQ ID NO:53), Ana43-R 5 ' GTCGACCTACGTGAGTATAAGCCTCA (SEQ ID NO: 54) . Se incluyeron sitios de restricción en los extremos 5' de los cebadores para permitir la subclonación del fragmento PCR en los vectores de expresión. Las condiciones de ciclo PCR utilizadas fueron a 94°C durante 20 segundos, 50°C durante 40 segundos, 72 °C durante 1 minuto para 30 ciclos. Los homólogos de Ana 29 y Ana 32 de A. margínale también se obtuvieron a partir de A. céntrale. Los cebadores utilizados para amplificar los genes fueron Ana25-F (SEQ ID NO: 47) y Ana25-Rl (SEQ ID NO: 48) para Ana29; Ana32-A 5 ' GGATCCATGAGTCGTAAAAGTCTG (SEQ ID NO: 55) y Ana32-C (SEQ ID NO:50) . Las condiciones de ciclización PCR utilizadas fueron 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 40 segundos y 72°C durante 1 minuto repetidas 35 veces. 20 µ? de la reacción PCR se sometió a electroforesis a través de' un gel de agarosa al 1% en amortiguador IxTAE y se visualizó con bromuro de etidio. Las bandas se suprimieron del gel y se recuperó el ADN mediante centrifugación a través de una columna de giro ( Sigma-Aldrich ) durante 10 minutos a 10 000 g. Se utilizaron procedimientos estándar para la electroforesis en gel, subclonación, y transformación y crecimiento de E. coli (Sambrook et al., 1989).

Clonación y secuenciación Los productos PCR eluidos se clonaron en un vector pCR2.1 TA (Invitrogen, California) siguiendo las recomendaciones del fabricante. El ADN del plásmido proveniente de al menos dos colonias recombinantes se aislaron utilizando un equipo mini-prep de plasmidos (QIAGEN Inc., California). El tamaño del inserto se determinó al comparar la digestión EcoRI del plásmido con una sucesión de ADN lkb después de la electroforesis . Los genes de longitud total se suprimieron de pCRAna25 F/Rl y pCRAna32 B/C mediante digestión con Bamtil y Smal seguida por separación en gel de agarosa. pCRAna43 M/R se digirió con BamRI y Salí para recuperar el gen de longitud completa. Las enzimas de restricción Sphl y Smal se utilizaron para subclonar pCRAna37 P/N. Los fragmentos recuperados se ligaron en el vector pQE30 diferido con enzimas adecuadas (QIAGEN Inc., California). Los recombinantes se analizaron para la presencia del injerto y se diseñaron como pQEAna25-4, pQEAna32 B/C, pQEAna37N/P y pQEAna43 M/R para plásmidos que codifican para las proteínas A. margínale Ana29, Ana32, Ana37 y Ana43 respectivamente. Estos plásmidos se utilizaron para transformar la cepa de E. coli M15 pRep 4 para la producción de proteínas recombinantes . Los plásmidos que contenían insertos se secuenciaron utilizando química de terminador Big Dye en un secuenciador de ADN ABI Prism 377 ( Perkin-Elmer Applied Biosystems , California) . La secuencia de ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas se analizaron utilizando el paquete de software isconsin GCG (Genetic Computer Group, Inc., Madison, Wis.) . Las secuencias de aminoácidos de ADN y deducidas se compararon con las secuencias en la base de datos pública por BLAST en el recurso microbiano comprensivo NCBI, Sanger y TIGR. No se encontraron homologías significativas en las bases de datos de secuencias utilizando ADN Ana29 o secuencias de aminoácidos, homología limitada (aproximadamente 30%) para A. margínale conocida MSP 4 ni se obtuvieron proteínas de membrana externa de Ehrlichial con secuencias de aminoácidos de Ana32, Ana37 y Ana43. La secuencia Ana32 (SEQ ID NO: 8) contuvo un marco de lectura abierto de 894 pares de bases que codifican para 297 aminoácidos (SEQ ID N0:4). El peso molecular teórico de esta proteina es 31kDa y tuvo un pl de 9.32. La proteina contuvo un péptido señal de 23 aminoácidos, que se omitió de pQEAna32 B/C. Se observaron cuatro sustituciones de nucleótido, en los 119, 267, 303 y 808 pares de bases de las posiciones entre Ana32 proveniente de Gypsy Plains, aislado australiano en comparación con la secuencia publicad de aislados americanos (Barbet et al., 2000). Estos codificaron para dos cambios en la secuencia de aminoácidos (identidad del 99%). Además, la secuencia homologa de polinucleótidos proveniente de A. céntrale (SEQ ID NO: 56) se encontró que contenia sólo el cambio de base imperceptible en los 504 cuatro pares de base de la posición según se compara con la SEQ ID NO: 8. De esta forma, la secuencia de polipéptidos Ana32 proveniente de A. c ntrale es idéntica a la expuesta en la presente proveniente de A. margínale (SEQ ID NO:4). La secuencia de polinucleótidos Ana29 (SEQ ID NO: 5) contiene un marco de lectura abierto de 786 pares de base que codifica para 261 aminoácidos (SEQ ID NO:l) . Todas las secuencias de péptido Ana29 naturales listadas en la Tabla 12 se encontraron dentro de la secuencia de ADNc traducido. El peso molecular teórico de esta proteina es 27 kDa y tiene un pl de 8.6. La secuencia homologa de polinucleótidos proveniente de A. céntrale (SEQ ID NO: 57) se encontró que contenia sólo dos cambios de base imperceptibles en los 294 pares de bases y 669 pares de bases de las posiciones cuando se compara con la SEQ ID NO:5. De esta forma, la secuencia de polipéptidos Ana 29 proveniente de A. céntrale es idéntica a la expuesta en la presente proveniente de A. margínale (SEQ ID N0:1). La secuencia de polinucleótidos Ana43 (SEQ ID NO: 6) contiene un marco de lectura abierto de 1269 pares de bases que codifican para 422 aminoácidos (SEQ ID NO:2). El peso molecular teórico de esta proteina es 45 kDa tiene un pl de 9.2. Las secuencias peptidicas internas obtenidas (Tabla 12) se representan en la secuencia traducida. No se encontraron codones de metionina iniciales en la dirección 5' del N-terminal conocido por lo tanto se desconoce el inicio del gen. Sin embargo, en el marco del codón finalizador se encontraron 48 aminoácidos en la dirección 5' de la proteina madura N-terminal, lo que sugiere la presencia de un péptido señal de hasta 48 aminoácidos de longitud. La secuencia de polinucleótidos Ana37 (SEQ ID NO: 7) contiene un marco de lectura abierto de 990 pares de bases que codifican para 330 aminoácidos (SEQ ID NO: 3). El peso molecular teórico de esta proteina es 35kDa y tiene un pl de 8.2. Todas las secuencias peptidicas internas obtenidas (Tabla 12) se representan en la secuencia traducida. El análisis de secuencia indica que Ana 32, Ana 37 y Ana 43 todas son proteínas superficiales. Ana 29 posee cuatro regiones transmembrana potenciales, y por lo tanto puede funcionar como un transportador.

EJEMPLO 8 - EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES NA29 , rANA32 , rANA37 Y rANA43. Las proteínas de A. margínale recombinantes pQEAna25-4, pQEAna32 B/C, pQEAna43 M/R y pQEAna37 N/P se expresan en células de E. coli M15 pRep4 y se purifican mediante cromatografía de afinidad en resina de ácido níquel-nitrilo-tri-acético como se describe en el protocolo Qiagen. Se utilizaron geles de gradiente SDS-PAGE (Laemmli, 1970) teñidos con nitrato de plata (Morrissey, 1981) para visualizar la expresión de la rpoteína y el grado de pureza. Para tinciones Western, las proteínas se inocularon sobre Hybond C (Amersham) y la proteína recombinante se detectó con Ni-Nta-HRP (Qiagen) . El desarrollo de color fue con 4-cloro-naftol . Se determinaron las concentraciones de proteínas recombinantes después de la purificación con el reactivo Pierce BCA. El rendimiento obtenido a partir de un cultivo de un litro de E. coli que expresa el gen Ana29 fue de 2.5 mg de rAna29 purificado. Después de almacenamiento a largo plazo a 4°C se observó un grado de agregación de la proteína recombinante . Se obtuvieron rendimientos · similares de proteína recombinante purificada a partir de un litro de cultivos de E . coli para rAna32 (3.8mg) y rAna43 (8.5mg) . No se observó agregación de estas proteínas después del almacenamiento a 4°C.

EJEMPLO 9 - EXPERIMENTOS DE VACUNACIÓN/INOCULACIÓN CON AN íGENOS RECOMBINANTES Grupos de 6 reses, de 5-7 meses de edad, se vacunaron utilizando un total de 100 µg de proteína recombinante purificada en dos dosis. En todos los experimentos de vacunación, las reses se inocularon 2 semanas después de la vacunación final con 108 eritrocitos infectados con A. margínale . Las reses se monitorearon diariamente para parasitemia y caída de hematocritos . El resultado se muestra en la Tabla 13. Los grupos control de reses en la vacunación 2001-1 y 2001-2 se inyectaron con 100 µg de una proteína recombinante y relevante en el adyuvante CSIRO. Los grupos control de reses en la vacunación 2001-3 se vacunaron con el adyuvante solamente. Se realizó la inoculación con Anaplasma de la vacunación 2001-1 y 2001-2. En una dosis de 2 mi por animal el adyuvante CSIRO contuvo 1 mg de Quil A, 10 mg de DEAE Dextrano, 1.2 mi de Montanide ISA 50V, y 0.8 mi de PBS.

Vacunación 2001-1 Para la vacunación 2001-1, se inyectó proteína recombinante de Ana29 en tiempo 0 y 6 semanas utilizando adyuvante CSIRO. La proteína recombinante Ana29 en el adyuvante CSIRO protegió significativamente las reses contra la inoculación (Grupo 2, Tabla 13). De manera importante, ninguna res de este grupo requirió de tratamiento con fármacos, una parasitemia significativamente inferior (5.1 ± 4.4%) y una disminución menor de hematocritos (33.4%) se observaron en comparación con los controles (12 ± 6.6% y 42.2% respectivamente, P<0.001) (Grupo 1, Tabla 13). Todos los animales control mostraron síntomas de anaplasmosis clínica y una declinación importante de hematocritos .

Vacunación 2001-2 Las reses en este estudio recibieron dos vacunaciones con rAna32 en el adyuvante CSIRO separado por tres semanas (Grupo 4, Tabla 13) . En esta vacunación se observó alguna protección como una caída reducida de hematocritos y un retardo en la parasitemia pico en comparación con los controles (Grupo 3, Tabla 13) . Pocas reses requirieron tratamiento en reses vacunadas contra control.

Vacunación 2001-3 Las reses recibieron dos vacunaciones con rAna43 en adyuvante 4 semanas de separación. Las reses vacunadas se protegieron significativamente (P< 0.01) contra la inoculación contra A. margínale según se demuestra por la parasitemia reducida (11.8 en comparación con 25.5 para los controles) y una disminución menor y retardada en los hematocritos (Grupo 6, véase el Grupo 5, Tabla 13) . Todos los animales control mostraron síntomas de anaplasmosis química y una grave declinación en hematocritos con todos los seis animales en el grupo control que requirieron tratamiento en comparación con sólo un animal en el grupo vacunado.

Cn Tabla 13. Vacunación 2001- 1, 2 y 3 10 #CP es la parasitemia acumulativa, la suma de las parasitemias medias diarias a partir de los días 13 a 24 inclusive para los grupos 1,4 los días 14 a 21 15 inclusive para los grupos 5 y 6.

Análisis de anticuerpos mediante ELISA Se recubrieron placas microtituladoras con Immunolon 2 (Dynex) con 1 µ?/ta? rAna29, rAna32 o rAna43 en amortiguador de carbonato. Todos los lavados se realizaron con PBS/Tween (0.1%). Los sueros de prueba se diluyeron inicialmente 1:1000 seguidos por diluciones dobles a través de la placa. Un suero positivo control y negativo control, que consiste de una mezcla de cuatro sueros provenientes de reses vacunadas y control, se incluyó en cada placa para análisis de estandarización. Se obtuvieron anticuerpos secundarios HRP de IgG, IgGl e IgG2 anti-bovino de oveja a partir de Serotec y se utilizaron a diluciones de 1:3000. El color se desarrolló mediante la adición de sustrato ABTS y se leyó en un lector de placa microtituladora Mulktiskan Ascent a 405 nm. Los títulos se determinaron en un OD seleccionado arbitrariamente y se estandarizaron para los sueros control positivos. Los títulos de anticuerpo se estimaron mediante extrapolación de la sección lineal de gráficas de densidad óptica contra log (dilución inversa) .

Vacunación 2001-1 Se determinaron niveles de anticuerpos para reses vacunadas con rAna29 en adyuvantes. Los títulos para IgG, IgGl e IgG2 específicos de rAna29 después de la vacunación fueron 52000, 26000 y 37000 respectivamente (Figura 5). La proporción de IgG2 : IgG fue 0.7, lo que sugiere que los anticuerpos IgG2 representan aproximadamente 70% de los anticuerpos IgG totales presentes en los sueros de reses vacunadas.

Vacunación 2001-2 Los títulos para IgG, IgGl e IgG2 específicos de rAna32 fueron 56000, 32000 y 22500 respectivamente (Figura 6) . IgG2 comprende aproximadamente 40% del IgG específico total para rAna32 estimulado por vacunación.

Vacunación 2001-3 Los títulos IgG, IgGl e IgG2 específicos para rANA43 total fueron 27400, 12000 y 10000 respectivamente. IgG2 comprende aproximadamente 36% del IgG total específico para rAna43 estimulado por vacunación, similar a lo observado en Vacc2001-2. En conclusión, se ha demostrado un grado significativo de protección observado después de la vacunación utilizando las proteínas recombinantes rAna29, rAna43 y rAna32. También se ha mostrado que las cantidades significativas de anticuerpos se aumentan contra las proteínas recombinantes especificas después de la vacunación. Se apreciará por los expertos en la técnica que se pueden realizar muchas variaciones y/o modificaciones a la invención como se muestra en las modalidades especificas sin apartarse del espíritu o alcance de la invención como se describe ampliamente. Por lo tanto, las modalidades de la presente se deben considerar en todos aspectos como ilustrativas y no restrictivas . Todas las publicaciones analizadas anteriormente se incorporan en la presente en su totalidad . Cualquier discusión de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o lo semejante que se haya incluido en la presente especificación se presenta únicamente con el fin de proporcionar un contexto para la presente invención. No se debe tomar como una admisión que cualquiera de todas estas materias forma parte de la base de la técnica anterior o donde el conocimiento general común en el campo relevante de la presente invención existe en Australia antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta aplicación.

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. LISTA DE SECUENCIAS <110>E1 Consejero del Instituto Queensland de Búsqueda Médica ANTÍGENOS PARA ADMENTAR UNA RESPUESTA INMUNE CONTRA PATÓGENOS RICKETTSIEAE Y EHRLICHIEAE <130> 500403 <150> AU PR4400 <151> 2001-04-12 <150> AU PR7597 <151> 2001-09-10 <150> AU PS0861 <151> 2002-03-01 <160> 59 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <400> 1 Met Ser Phe Lys lie Lys Asp Glu Arg Leu Ser Ala His lie Ala As 1 5 10 15 Pro Asp Gly Thr Arg Tyr Met Arg Gln Gly Leu Gly Val Thr Thr Ala 20 25 30 Leu Ser Val lie Val Val Ala Ala Leu Ala Ala Arg Val Trp Arg Leu 35 40 45 Ser Gln Glu Gly Leu Glu Ser Ser Val Leu Leu Lys Arg Pro Glu Phe 50 55 60 lie Ala Leu Met Val Met Leu Ala Val Phe Val Val Ala Ala lie Gly 65 70 75 80 Leu Ala Val Val Cys Asn Glu His Gln Lys Lys Ala Lys Glu Met Asn 85 90 95 Gly Leu Tyr Pro Asn Ala Ala Tyr Leu Val Ala Pro Ala Arg Gly Ala 100 105 110 Glu Gly Glu Leu Gly Arg Arg Glu Thr Arg His Val Ser Phe Val 115 125 Ser Ser Gly Arg Thr Asn Pro Phe 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tttcggatat 180 acaccagctt ggggaggtgt tagaaaccta tacgttggca ttcctggaga gacttggtat 240 gtcctgccct ataagaaaga tgtatcaggt gatgaagtat tatcctggtc tagctttgac 300 tggtggggta agaacggagg cgctcctggt gatgatccaa taaagtttaa acgtataagc 360 ccatatggtg tcactggagc tgtaggctat gctctgggtg acactaggat agagcttgga 420 gtgattgggc aagagttttc tgtttctgag attagtggta gacattggaa acaaggaaac 480 tccttgttct tgttgctagg gaagcgtagt gcagatcttg tgaggtggtt gcgcccctac 540 attagtacta atgccggcga tggtaagtcc gtggaagaag gtaagaggct taacaatctt 600 ctgctcgcac tccgccgtgg cctgaatggg ctatctgaat ccggacggaa ggcagaagca 660 gcaagcgcga agatgttgct taactatgtt gggtcggcga ccatgcccgg cagcaactgg 720 tcaagtaagc cggatgttgt caaacggcta cacaccatgc tcgggcaggc gttgcctaag 780 gtctggccat atctttcata tagcgataag gacgaagcgt ggcgtgccct gggtgagtat 840 ggggacaacg gggttgtggc gatttctgct gttgagctca ccgctgttac ggttgttggg 900 tgtcgcgatc ttgcgctgtc gaatctattt acggccgcgg ctactcggaa cttggatgcg 960 tacggttgtg ctggaatggg ggtaaacttt gtacgcgggg ccgggaagaa tgttgcggaa 1020 tttggtgctg agttgaagct tggtgtgagc tacagattat ctcgcgctgc atcggtgttt 1080 gttggcgggg tgctgcatag aactgcgaat tatgatttta acttgcccgt tattcctatg 1140 ggggctgata gtgggtctgt ggcggcggcg ggaggccatg cagactacgc aaggaatgag 1200 gaggctcgga tctcttttgg ggtgctgaat ctcgctggag aagtgggcct gaggcttata 1260 ctcacgtag 1269 <210> 7 <211> 993 <212> ADN <213> Anaplasma margínale <400> 7 atgaagaagg tctacggctt ggtttacgct gcgttgtctt tgttgttcac gccttgcggg 60 tcatttgctt cccccaggcc catagacttc tctaggggcg agggtgcgtc aggattcttc 120 gccagtgtac agtacaagct ggcagtcccg cactttaggg actttatagt agaagacaaa 180 ggtaaggcgc ttaatacgtt tgccatgaag gaaaaacagc agggtggcac cgctaaggca 240 gcggcgggcg ctgcaacgcc tccagcggcc tcgtccgacg ccgaggctcc gcccgctaaa 300 gggccagatc tagcttcggg cggcagcttt gaggggaagt actcccctga gtaccttagg 360 agtgctaagg ccgggtccgt atcggttggg tactccgctg gaaatgtgcg gctggaggct 420 gaaggcatgt atcagaaatt ccccgtagat actaagaagt acaaggacaa tcctgagcgc 480 gcgtatcgtt ttgccatttc agcgcctgat gagaatagta caactgtcgc tacaaggccg 540 caggagccct accacatcac cgctgagaat aaggaagtga ccacagcatc cctgatggcc 600 aatctgtgct acgacctctt gcctgagtcc tcccagatct ctccaagcgc ctgcgtcggc 660 ggtggtggca gtctagtcag gtttctgggc gtgaccgagg tgcggtgggc gtaccaggca 720 aaggttgggg tgcagtattt cgcgtctagg aaggcagccc tgttcgcgta cgcttatgca 780 agtagggtgc atccggaaaa gttctccaac atacctgtag tacaccacat caagacagag 840 tcacctaaag gatcccaggg tgcagcaggt agcagtgggg gcgagagcag cgcccaggcg 900 gccggcggta agctgcccgg tttgctatac ccgcaagcga gcttggggct ggactatttt 960 gggtttgagt gcgggataag actcgtactt tag 993 <210> 8 <211> 894 <212> ADN <213> Ahaplasma margínale <400> 8 atgagtcgta aaagtctgtt cgtgctgcct tgtcttctct ttgtggcggt gtccaccgcc 60 gggaacgggg cggctcccaa tgttggtagc gccgcaccgg gcgtcggggc ggagggtgag 120 ctctatgtag cggctcagta caagccggca ctgcctgtgg tgcgggagtt cgccgtgcgt 180 gaaaacaggc ttaccgctcc aagcaagctt tttaggctcg cgcccagcac atctgttctg 240 actgccgagc aggcaacggg tgctacactc ttagactctc ctctgctcag ggctctgcgg 300 gataggaata actttgagcc tagctacacg ccatcatacg aggtcagtat gtgtggggtt 360 tcaggtgtgc tgggctactc cagagcgggc accagagtgg aacttgaggt ttcttttgag 420 gatttcaggg ttaagaagtc cgggaagccg gtgctcaaag gcgggcacga atattttgcc 480 gctgggagaa ccagcgacac tcaacgggtt gtttttgcaa atcgcgcaat ctctgctggc 540 tcagccgtag ttagcatctg tcgcgatttc cctgcaggcc cctctggagg aagcgttacc 600 ccgtacacat gcctgggcgg cggcgtggag ttccttgaca ttcttggcat ggcgaacaca 660 cgcttcgcat accaggcgaa aatgggcgca gctttaaact tgcaccctcg tgccagcatc 720 ttcgcagcag gttactaccg gggaaccctg gagcgggcta ttaggcccct tcctgccgtg 780 gtcgtgatac cggctactgc tggggagagg gagaacttgg gcctgccacc gttcgagggt 840 aacgcaggag tgcggtacct tggcgtcgaa gcaggcataa gggtgttact ttga 894 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <400> 9 Cys Gln Arg Val Ala Ala Gln Glu Arg Ser Arg Glu Leu Ser Arg Ala 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <400> 10 Cys Val Asp Gly His lie Asn Pro Lys Phe Ala Tyr Arg Val Lys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <400> 11 Glu Ser Ser Lys Glu Thr Ser Tyr Val Arg Gly Tyr Asp Lys Ser I 1 5 10 15 Ala Thr lie Asp Cys 20 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <400> 12 Ser Phe Lys lie Lys Asp Glu Arg Leu Ser Ala His lie Ala Asn P 1 5 10 15 Asp Gly Thr Arg Tyr Met Arg Gln Gly 20 25 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <220> <221> mise feature <222> (6).. (6) <223> X = S o R <400> 13 His Val Ser Phe Val Xaa Ser Gly Arg 1 5 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> X = E o G <220> <221> misc_feature <222> (3).. (3) <223> X = N o E <400> 14 Xaa Met Xaa Gly Leu Tyr Pro Asn Ala Ala Tyr Leu Val Ala Pro Ala 1 5 10 15 <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <400> 15 Ala Ala Pro Asn Val Gly Ser Ala Ala Pro Gly Val Gly Ala Glu Gly 1 5 10 15 Glu Leu <210> 16 <211> 23 <212> PRT <213> Anaplasma marginale <220> <221> misc_feature <222> (8).. (8) <223> X = S o Q <400> 16 Ser Pro Arg Pro lie Asp Glu Xaa Arg Gly Glu Gly Ala Ser Gly Phe 1 5 10 15 Phe Ala Ser Val Gln Tyr Lys 20 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <400> 17 Val Gly Val Gln Tyr Phe Ala Ser Arg 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <220> <221> misc_feature <222> {3} .. (3) <223> X = L o I <400> 18 Ala Ala Xaa Phe Ala Tyr Ala Tyr Ala Ser Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <220> <221> misc_feature <222> (4).. (4) <223> X = L o I <400> 19 Gly Pro Asp Xaa Ala Ser Gly Gly Ser Phe Glu Gly Lys 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <220> <221> misc_feature <222> (10).. (10) <223> X = L o I <400> 20 Gln Ser Val Ser Val Gly Tyr Ser Glu Xaa Val Arg 1 5 10 <210> 2.1 <211> 19 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <400> 21 Ala Glu Ala Phe Gly Pro Tyr Val Ser Phe Gly Tyr Thr Pro Ala Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <220> <221> misc_feature <222> (4) .. (4) <223> X = cualquier aminoácido <220> <221> misc_feature <222> (5) .. (5) <223> X = N o F <400> 22 Leu Asn Leu Xaa Xaa Leu Phe Thr Ala 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <400> 23 Pro Tyr Leu Ser Tyr Ser Asp Lys 1 5 <211> <212> PRT <213> Anaplasma margínale <400> 24 His Thr Met Leu Gly Gln Ala Leu Pro Lys 1 5 10 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <400> 25 Ala Ser Val Phe Val Gly Gly Val Leu His Arg 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> X = I o L <220> <221> misc_feature <222> (2) .. (2) <223> X = cualquier aminoácido <400> 26 Xaa Xaa Pro Tyr Gly Val Thr Gly Ala 1 5 <210> 27 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR degenerado <220> <221> misc_feature <222> (6).. (6) <223> n = a, c, g o t <220> <221> misc_feature <222> (9) .. (9) <223> n = a, c, g o t <400> 27 gacggnacna grtayatg <210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR degenerado <220> <221> misc_feature <220> <223> Cebador PCR degenerado <220> <221> misc_feature <222> (6) .. (6) <223> n = a, c, g o t <220> <221> misc_feature <222> (9) .. (9) <223> n = a, c, g o t <400> 28 ggatanarnc cytccatytc <210> 29 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR degenerado <220> <221> misc_feature <222> (17) .. (17) <223> n = a, c, g or t <400> 29 cgctwgcgta wgcrtangc <210> 30 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR degenerado <220> <221> misc_feature <222> (15).. (15) <223> n = a, c, g o t <400> 30 ttcttcgcwa gygtncarta yaa <210> 31 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR degenerado <220> <221> mise feature <222> (9).. (9) <223> n = a, c, g o t <220> <221> misc_feature <222> (15).. (15) <223> n = a, c, g o t <220> <221> misc_feature <222> (18) .. (18) <223> n = a, c, g o t <400> 31 gctgargcnt tyggnccnta ygt <210> 32 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR degenerado <220> <221> misc_feature <222> (12).. (12) <223> n = a, c, g o t <220> <221> misc_feature <222> (15) .. (15) <223> n = a, c, g o t <220> <221> misc_feature <222> (21) .. (21) <223> n = a, c, g o t <400> 32 actgcbccwg tnacnccrta ngg <210> 33 <211> 26 <212> ADN <213> Anaplasma margínale <400> 33 tgatgaagta ttatcctggt ctagct <210> 34 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR degenerado <220> <221> misc_feature <222> (6) .. (6) <223> n = a, c, g o t <220> <221> misc_feature <222> (9) .. (9) <223> n = a, c, g o t <220> <221> misc_feature <222> (15).. (15) <223> n = a, c, g o t <400> 34 gcytgnccna gcatngtrtg <210> 35 <211> 20 <212> ADN <213> Anaplasma margínale <400> 35 tagcgctgat ggtcatgctg <210> 36 <211> 22 <212> ADN <213> Anaplasma margínale <400> 36 cgtggtctgc aatgaacatc ag 22 <210> 37 <211> 24 <212> ADN <213> Anaplasma margínale <400> 37 tcggacgagc ccgctggagg cgtt <210> 38 <211> 26 <212> ADN <213> Anaplasma margínale <400> 38 aagcgcctta cctttgtctt ctacta <210> 39 <211> 25 <212> ADN <213> Anaplasma margínale <400> 39 caggacatac caagtctctc cagga <210> 40 <211> 24 <212> ADN <213> Anaplasma margínale <400> 40 caacgtatag gtttctaaca cctc <210> 41 <211> 20 <212> ADN <213> Anaplasma margínale <400> 41 ctgacgcata tacctcgtac <210> 42 <211> 19 <212> ADN <213> Anaplasma margínale <400> 42 ggcaactact atgaccgac <210> 43 <211> 24 <212> ADN <213> Anaplasma margínale <400> 43 gcggtggtgg cagtctagtc aggt <210> 44 <211> 24 <212> ADN <213> Anaplasma marginal <400> 44 ggtgcagtat ttcgcgtcta ggaa <210> 45 <211> 25 <212> ADN <213> Anaplasma margínale <400> 45 taactatgtt gggtcggcga ccatg <210> 46 <211> 24 <212> ADN <213> Anaplasma margínale <400> 46 ccggcagcaa ctggtcaagt aagc <210> 47 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR <400> 47 gaggatccat gtccttcaag atta 24 <210> 48 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR <400> 48 tacccgggtt acattgcaac gggagtt <210> 49 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR <400> 49 tggatccggc ggctcccaat gt <210> 50 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR <400> 50 acccgggtca aagtaacacc cttatg <210> 51 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR <400> 51 gcatgctccc ccaggcccat agact <210> 52 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR <220> <221> misc_feature <222> (24) .. (24) <223> n = a ,c, g or t <400> 52 cccgggataa gtacgagtct tatnccg <210> 53 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR <400> 53 ggatccgccg aagcatttgg tccgtac <210> 54 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR <400> 54 gtcgacctac gtgagtataa gcctca <210> 55 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador PCR <400> 55 tggatccatg agtcgtaaaa gtctg <210> 56 <211> 894 <212> ADN <213> Anaplasma céntrale <400> 56 atgagtcgta aaagtctgtt cgtgctgcct tgtcttctct ttgtggcggt gtccaccgcc 60 gggaacgggg cggctcccaa tgttggtagc gccgcaccgg gcgtcggggc ggagggtgag 120 ctctatgtag cggctcagta caagccggca ctgcctgtgg tgcgggagtt cgccgtgcgt 180 gaaaacaggc ttaccgctcc aagcaagctt tttaggctcg cgcccagcac atctgttctg 240 actgccgagc aggcaacggg tgctacactc ttagactctc ctctgctcag ggctctgcgg 300 gataggaata actttgagcc tagctacacg ccatcatacg aggtcagtat gtgtggggtt 360 tcaggtgtgc tgggctactc cagagcgggc accagagtgg aacttgaggt ttcttttgag 420 gatttcaggg ttaagaagtc cgggaagccg gtgctcaaag gcgggcacga atattttgcc 480 gctgggagaa ccagcgacac tcagcgggtt gtttttgcaa atcgcgcaat ctctgctggc 540 tcagccgtag ttagcatctg tcgcgatttc cctgcaggcc cctctggagg aagcgttacc 600 ccgtacacat gcctgggcgg cggcgtggag ttccttgaca ttcttggcat ggcgaacaca 660 cgcttcgcat accaggcgaa aatgggcgca gctttaaact tgcaccctcg tgccagcatc 720 ttcgcagcag gttactaccg gggaaccctg gagcgggcta ttaggcccct tcctgccgtg 780 gtcgtgatac cggctactgc tggggagagg gagaacttgg gcctgccacc gttcgagggt 840 aacgcaggag tgcggtacct tggcgtcgaa gcaggcataa gggtgttact ttga 894 <210> 57 <211> 783 <212> ADN <213> Anaplasma céntrale <400> 57 atgtccttca agattaaaga tgagaggctg agtgcgcaca tagcgaaccc agatggtacg 60 aggtatatgc gtcagggttt gggtgttact acagctttgt cggtcatagt agttgccgcg 120 cttgcagcgc gtgtgtggag gctgtctcag gagggcctgg aatctagcgt gcttctgaag 180 cgtcccgagt tcatagcgct gatggtcatg ctggctgtgt ttgttgttgc tgctataggc 240 ttggccgtgg tctgcaatga acatcagaag aaggctaagg agatgaacgg cctgtatccg 300 aatgccgcat acttggtagc tcctgctagg ggggcagaag gtgagctggg acggagacat 360 gagacgcggc acgtgtcttt tgtttcgagc ggtcgcacaa atccgttctc cacgcctaca 420 tctatggcgg gtctggtgac tctgactgtg ttcgctgcgc tgtctggtgc gctgcctagt 480 tctacggcta ttactgccga tttgataggt tccgggtttg ctgctgctac tcctctgcaa 540 caagcgtggg ttgtcatgct attcttagct atggctgtaa cgttctttgc tgccatgaga 600 ggtggattgc ttgcctccgg tcaggggaac aggctttgtg ttgtgagctc tggtgatgtc 660 tccgctgcag atggggtcct ccccgctggt gcgctgggtc cagagaccga cttcaacgag 720 gttatggcta tacacgtaca cgatgctaat tacaggggcg gcgcggcaac tcccgttgca 780 atg 783 <210> 58 <211> 20 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <400> 58 Arg Leu Ser Gln Glu Gly Leu Glu Ser Ser Val Leu Leu Lys Arg Pro 1 5 10 15 Glu Phe lie Ala 20 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Anaplasma margínale <400> 59 Thr Ala Asp Leu lie Gly Ser Gly Phe Ala Ala Ala Thr Pro Leu Gln 1 5 10 15 Gln Ala Trp Val 20

Claims (36)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Una vacuna que comprende al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) una secuencia proporcionada en la SEQ ID
2. NO: 1; b) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a (a) ; c) una secuencia proporcionada en la SEQ ID
3. NO : 2 ; d) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a (c) ; e) una secuencia proporcionada en la SEQ ID
4. NO : 3 ; f) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a (e) ; g) una secuencia proporcionada en la SEQ ID
5. NO : ; y h) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a ( g) ; caracterizada porque el polipéptido aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando se administra a un sujeto. 2. La vacuna según la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido tiene una secuencia N-terminal según se proporciona en SEQ ID NO: 12 y tiene un peso molecular de aproximadamente 17kDa . 3. La vacuna según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido se puede purificar a partir de una especie de Ehrlichíeae o Rickettsieae . 4. La vacuna según la reivindicación 3, caracterizada porque el polipéptido se puede purificar a partir de Anaplasma margínale . 5. La vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la vacuna comprende un portador farmacéuticamente aceptable .
6. 6. La vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la vacuna comprende un adyuvante.
7. 7. Una vacuna de ADN que comprende al menos un polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia que codifica a polipéptido proporcionado en la SEQ ID N0:1; b) una secuencia que codifica para un polipéptido que es al menos 80% idéntico a la SEQ ID NO : 1 ; -, c) una secuencia que codifica a un polipéptido proporcionado en la SEQ ID NO: 2; d) una secuencia que codifica a un polipéptido que es al menos 80% idéntico a la SEQ ID NO : 2 e) una secuencia que codifica a un polipéptido proporcionado en la SEQ ID NO: 3; f) una secuencia que codifica a un polipéptido que es al menos 80% idéntico a la SEQ ID NO : 3 g) una secuencia que codifica a un polipéptido proporcionado en SEQ ID NO: 4; y h) una secuencia que codifica a un polipéptido que es al menos 80% idéntico a la SEQ ID NO: 4; caracterizada porque el polipéptido codificado por el polinucleótido aumenta una respuesta inmune contra patógenos Bhrlichieae y/o Rickettsieae cuando la vacuna de ADN se administra a un sujeto.
8. 8. La vacuna de ADN según la reivindicación 7, caracterizada porque el polinucleótido codifica para un polipéptido que tiene una secuencia N-terminal según se proporciona en la SEQ ID NO: 12 y tiene un peso molecular de aproximadamente 17kDa.
9. 9. La vacuna de ADN según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, caracterizada porque el polinucleótido se puede aislar a partir de una especie de Ehrlichieae o Rickettsieae .
10. 10. La vacuna de ADN según la reivindicación 9, caracterizada porque el polinucleótido se puede aislar a partir de Anaplasma margínale.
11. 11. La vacuna de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizada porque la vacuna comprende un portador farmacéuticamente aceptable .
12. 12. La vacuna de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizada porque el polinucleótido está contenido en un vector.
13. 13. La vacuna de ADN según la reivindicación 12, caracterizada porque el vector es un vector viral .
14. 14. Un método para aumentar una respuesta inmune contra un patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto al menos una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. 15. Un método para tratar o prevenir una infección por Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto al menos una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
16. 16. El método según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, caracterizado porque el patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae se selecciona del grupo que consiste de: Anaplasma sp.r Ehrlichia sp . , Rickettsia sp . y Cowdria sp.
17. 17. El método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.
18. 18. El método según la reivindicación 17, caracterizado porque el mamífero se selecciona del grupo que consiste de: vacas, ovejas, cabras, perros y caballos.
19. 19. El método según la reivindicación 17, caracterizado porque el mamífero es un ser humano.
20. 20. El uso de una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de un medicamento para aumentar una respuesta inmune contra un patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto.
21. 21. Una planta transgénica que produce al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO : 1 ; b) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a (a) ; c) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO : 2 ; d) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a (c) ; e) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO : 3 ; f) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a ( e) ; g) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO : 4 ; y h) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a (g) ; caracterizada porque el polipéptido aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando la planta transgénica se administra oralmente a un sujeto.
22. 22. Un método para aumentar una respuesta inmune contra un patógeno Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto, el método comprende administrar oralmente al sujeto al menos una planta transgénica según la reivindicación 21.
23. 23. Un método para tratar o prevenir una infección por Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto, el método comprende administrar oralmente al sujeto al menos una planta transgénica según la reivindicación 21.
24. 24. Un anticuerpo aumentado contra un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO:l; b) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a (a) ; c) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO : 2 ; d) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a (c) / e) una secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 3; y f) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a (e) ; caracterizado porque el anticuerpo proporciona protección inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o .RicJcettsieae cuando se administra a un sujeto.
25. 25. Un anticuerpo aumentado contra un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: a) una secuencia proporcionada como la SEQ ID NO: 4; y b) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a (a) ; caracterizado porque el anticuerpo proporciona protección inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando se administra a un sujeto.
26. 26. Un método para tratar o prevenir una infección por Ehrlichieae o Rickettsieae en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto al menos un anticuerpo según la reivindicación 24 o la reivindicación 25.
27. 27. Un polipéptido purificado sustancialmente que se une específicamente a un anticuerpo según la reivindicación 24.
28. 28. Un polipéptido purificado sustancialmente, el polipéptido se selecciona de: (i) un polipéptido que comprende la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO:l y (ii) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a ( i ) ; caracterizado porque el polipéptido aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando se administra a un sujeto.
29. 29. El polipéptido según la reivindicación 28, caracterizado porque el polipéptido tiene una secuencia N-terminal según se proporciona en la SEQ ID NO: 12 y tiene un peso molecular de aproximadamente 17kDa.
30. 30. Un polipéptido purificado sustancialmente , el polipéptido se selecciona de: (i) un polipéptido que comprende la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO: 2; y (ii) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a ( i ) ; caracterizado porque el polipéptido aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando se administra a un sujeto.
31. 31. Un polipéptido purificado sustancialmente , el polipéptido se selecciona de: (i) un polipéptido que comprende la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO: 3; y (ii) un polipéptido que es al menos 80% idéntico a (i) ; caracterizado porque el polipéptido aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando se administra a un sujeto.
32. 32. Un polipéptido purificado sustancialmente, el polipéptido se selecciona de: (i) un polipéptido que comprende la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO: 4; y (ii) un fragmento antigénico de (i); caracterizado porque el polipéptido, o fragmento antigénico del mismo, aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando se administra a un sujeto.
33. 33. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, caracterizada porque el polipéptido se puede purificar a partir de una especie de Ehrlichieae o Rickettsieae .
34. 34. El polipéptido según la reivindicación 33, caracterizado porque el polipéptido se puede purificar a partir de Anaplasma margínale .
35. 35. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 34, caracterizado porque la respuesta inmune es contra infección por Anaplasma margínale .
36. 36. Una proteina de fusión caracterizado porque comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 35 fusionado a al menos una secuencia polipeptidica heteróloga. 36. Un polinucleótido aislado, el polinucleótido ' tiene una secuencia seleccionada de: (i) una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID N0:5; (ii) una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 6; (iii) una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7; (iv) una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 57; (v) una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 8 ; (vi) una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:56; (vii) una secuencia que codifica para un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 36; (viii) una secuencia capaz de hibridarse selectivamente con cualquiera de (i) a (iv) bajo alto rigor, y (ix) una secuencia de nucleótidos que es al menos 80% idéntica a cualquiera de (i) a (iv) , caracterizado porque el polinucleótido codifica para un polipéptido que aumenta una respuesta inmune contra patógenos Ehrlichieae y/o Rickettsieae cuando se administra a un sujeto. 38. Un vector que comprende al menos un polinucleótido según la reivindicación 36. 39. El vector según la reivindicación 38, caracterizado porque el vector es un vector viral. 40. Una célula hospedera que comprende el vector según la reivindicación 38 o la reivindicación 39. 41. La célula hospedera según la reivindicación 40, que es una célula mamifera. 42. Un proceso para preparar un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 36, el proceso comprende cultivar una célula hospedera según la reivindicación 40 o la reivindicación 41, bajo condiciones que permitan la expresión del polinucleótido que codifica para el polipéptido, y recuperar el polipéptido expresado. 43. Una composición que comprende el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 36 y un portador farmacéuticamente aceptable.