MXPA98009774A - Proceso mejorado para estabilizar proteinas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento perfeccionado para prevenir la formación de agregados de proteína en un liofilizado reconstituido de una composición farmacéutica de una proteína, en el cual una solución acuosa tamponada de la proteína se congela, se descongela, se divide en compartimientos de cantidades inyectables y dichos compartimientos se liofilizan y el cual se caracteriza porque la solución acuosa tamponada de la proteína contiene tampón de fosfato de potasio como substancia tampón y la relación de iones potasio a iones sodio en la solución es como mínimo de 10:1, puede emplearse ventajosamente para producir liofilizados estables de composiciones farmacéuticas.

Description

PROCESO MEJORADO PARA ESTABILIZAR PROTE NAS Campo de la Invención La invención se refiere a un procedimiento perfeccionado para la estabilización de proteínas en un procedimiento de congelación o liofilización o durante el almacenamiento a bajas temperaturas.

Breve descripción de la invención Las proteínas tales como las enzimas o anticuerpos así como fragmentos de los mismos, son inestables y susceptibles de perder su actividad y/o formar agregados solubles o insolubles en soluciones acuosas y cuando se almacenan a bajas temperaturas (por debajo de 0°C) y en particular en congelaciones y descongelaciones repetidas estos agregados se hacen visibles formando partículas y con ello turbideces . Sin embargo, esta formación de agregados y/o partículas no puede ser tolerada, a no ser solamente en trazas, para las composiciones farmacéuticas de proteínas. Una composición farmacéutica debe ser una solución transparente y si está presente como liofilizado, debe FEF. 028857 formar igualmente una solución transparente libre de partículas cuando se la reconstituye, la cual debe estar también libre de agregados solubles de proteínas. Se conocen numerosos procedimientos y aditivos para la estabilización de proteínas en soluciones. Por ejemplo, la estabilización de proteínas de choque térmico tales como la HSP25 está descrita por ejemplo en la patente EP-A 0 599 344. La estabilización de anticuerpos mediante la adición de polímeros de bloque compuestos de poliox propileno y polioxi-etileno y mediante fosfolípidos esté descrita en la patente EP-A 0 318 081. La patente EP-A 0 025 275 describe la estabilización de inmunoglobulinas mediante la adición de una sal de una substancia básica que contiene nitrógeno como la arginina, guanidina o imidazol. Otros aditivos adecuados para la estabilización son los poliéteres (EP-A 0 018 609) , glicerina, albúmina y sulfato de dextrano (patente USA 4,808,705), detergentes como el Tween's20 m(DE 26 52 636, GB 8514349), "chaperones" como GroEL (Mendoza, J.A. Biotechnol. Tech. 10 (1991) 535 - 540), tampón de citrato (WO 93/22335) o agentes quelantes (WO 91/15509) . Aunque estos aditivos permiten estabilizar las proteínas hasta un cierto grado en solución acuosa, se ha constatado sin embargo, que ninguno de los procedimientos conocidos en la técnica anterior es adecuado para la estabilización de proteínas cuando tienen lugar repetidos procesos de congelación y descongelación, de manera que no se forme ningún agregado soluble o insoluble o solamente cantidades significantes para fines terapéuticos durante el descongelado, durante el almacenamiento a temperatura debajo de 0°C, ó cuando una solución se reconstituye después de la liofilización. En la patente Ep-A 0 314 095 se describe un liofilizado de una proteína plasmática tal como el factor VIII, que contiene tampón de histidina como substancia tampón y cloruro de calcio como aditivo y está presente con una gran fuerza iónica (0,35 a 1,2 moles/litro de NaCl). Un liofilizado de una proteína plasmática tal como el factor VIII está descrito en la patente EP-A 0 315 968, el cual contiene de 0,5 a 15 mmoles/litro de cloruro de sodio o cloruro de potasio, 0,01 a 10 mmoles/litro de hidrocloruro de lisina y 0,2 a 5 mmoles/litro de histidina como ion tampón. Sin embargo, el tampón de histidina no es adecuado para la estabilización de la proteína ni para prevenir la formación de agregados y partículas cuando se reconstituyen los liofilizados de proteínas.

En consecuencia, el objeto de la invención es el de proporcionar un procedimiento que pueda prevenir substancialmente la formación de agregados y partículas cuando se reconstituyen los liofilizados de composiciones farmacéuticas de proteínas. Por lo tanto, la invención se refiere a un procedimiento perfeccionado para prevenir la formación de agregados de proteínas en una solución de una composición farmacéutica de una proteína, de preferencia un anticuerpo, que es reconstituido a partir de un liofilizado, en donde una solución acuosa tamponada de la proteína se congela, descongela, se divide en compartimientos de cantidades inyectables y estos compartimientos se liofilizan, el cual se caracteriza porque la solución acuosa tamponada de la proteína contiene tampón de fosfato de potasio como substancia tampón y la relación de los iones potasio a los de sodio en la solución es de 10:1 ó mayor. La solución acuosa tampón no contiene de preferencia esencialmente, ningún ion sodio. La invención permite a las composiciones farmacéuticas de proteínas, en particular, proteínas que tienen una tendencia a dimerizar o polimerizar tal como los anticuerpos, que sean formuladas en una composición farmacéutica estable, con un pH neutro (del orden de 6 - 8, de preferencia pH 6,5 - 7,5). Las proteínas como los anticuerpos tienden a agregarse en un orden de pH neutro si la solución se congela (opcionalmente en forma liofilizada) una vez o varias veces y se descongela de nuevo. Una composición farmacéutica es especialmente ventajosa en tampón de fosfato de potasio en un orden de pH entre 6 y 8, a una concentración de tampón entre 10 y 300 mmoles/litro, de preferencia entre 50 y 250 mmoles/litro, en la cual está presente el número más bajo posible de iones sodio en la composición farmacéutica. Una relación adecuada de iones potasio a iones sodio en la solución es de 10:1 o mayor. Es particularmente preferible que el tampón de fosfato de potasio se emplee sólo como substancia tampón en la composición farmacéutica y no se añada ninguna sal de sodio (tal como por ejemplo cloruro de sodio) . En dicho caso casi ningún ion sodio está presente en la composición farmacéutica o solamente los contiene en cantidades tan pequeñas que no ocasionan formación de agregados de proteínas durante repetidas congelaciones o descongelaciones . Se ha constatado que los liofilizados de soluciones de proteínas que han sido congelados por lo menos una vez durante el proceso de producción pueden a continuación ser reconstituidos substancialmente sin formación de turbideces si el tampón de fosfato de potasio se utiliza como substancia tampón. Los tampones habituales tales como el tampón de fosfato de sodio, tampón de histidina o tampón de citrato conducen a la formación de agregados en dicho proceso, que están compuestos principalmente por la proteína y así pues, conducen también a turbideces en un grado considerable. Las soluciones de proteína congelada están ya completamente congeladas a los -15°C, tienen puntos eutécticos por encima de aproximadamente -15°C y así ya pueden almacenarse a esta temperatura o a temperaturas inferiores, de preferencia por ejemplo a -20°C. Dado que una solución está sólo completamente congelada por debajo de la temperatura eutéctica, esto significa que una proteína en un tampón de fosfato que contenga iones sodio, está sometida a un gran esfuerzo durante el almacenamiento congelado (habitualmente a -20°C) y durante el proceso congelado/descongelado si se compara con un tampón exento de iones sodio o en un tampón en el cual la concentración de ion sodio es muy baja. De acuerdo con la invención este esfuerzo se evita en las formulaciones mencionadas más arriba, en las cuales se obtiene como resultado la supresión de la formación de la formación de agregados y partículas. Esta formulación permite un almacenamiento estable de la solución de proteína a -20°C, lo cual permite el ahorro de costes. Los tampones de fosfato de potasio en contraste con los tampones de fosfato de sodio presentan solamente una ligera variación del pH (de preferencia como máximo +1 unidad de pH, de preferencia particularmente como máximo +0,5 unidades de pH) durante el proceso de congelación. Se ha constatado que la concentración del tampón de fosfato debe ser por lo menos de 10 mmoles/litro, de preferencia aproximadamente 50 mmoles 1/litro o mayor, con el fin de prevenir eficazmente la formación de partículas. Dado que la osmolaridad no debe ser demasiado alta (debe ser ventajosamente del orden fisiológico, de preferencia aproximadamente 300 Osm una vez reconstituido (+20 mOsm, un margen de 100 a 500 mOsm es también adecuado) ) en composiciones farmacéuticas (es decir, preferentemente en la solución reconstituida) , la concentración de la substancia tampón u opcionalmente la suma de la substancia tampón y la sal no debe ser mayor de 250 - 300 mmoles/litro. La concentración del tampón está de preferencia entre 50 y 250 mmoles/litro en el compartimiento. Sin embargo, mayores concentraciones de substancia tampón y/o sal, pueden ser toleradas en la producción de soluciones (género a granel) usadas para producir los compartimientos. Si se desea un aditivo salino en la composición farmacéutica especialmente para ajustar la fuerza iónica, es ventajoso de acuerdo con la invención, no usar tampoco sales de sodio o escoger una concentración de iones sodio de forma que sea substar.cialmente menor que la concentración de iones potasio. Es por lo tanto conveniente añadir una sal de potasio como por ejemplo el cloruro de potasio en lugar del habitual cloruro de sodio. Sin embargo, se ha constatado que bajas cantidades de sales de sodio (por ejemplo aproximadamente 10 mmoles/litro o menos) no interfieren, siempre que la relación iones potasio a iones sodio sea de 10:1 ó mayor. No es posible añadir sales de calcio tales como por ejemplo cloruro de calcio ya que con tal adición precipita el fosfato de calcio y por lo tanto, aparte de la formación de una turbidez indeseable, el efecto tampón del fosfato de potasio de acuerdo con la invención, queda anulado. Los agregados insolubles cuya formación debe -prevenirse en el proceso de acuerdo con la invención, se comprende que son esencialmente agregados proteínicos cuyo tamaño es habitualmente como mínimo, de 1 µm, pero pueden también ser de un orden superior a 10 µm. Las partículas pueden determinarse mediante métodos adecuados de contaje de partículas empleando instrumentos de contaje de partículas, que pueden adquirirse comercialme..te, tales como por ejemplo el instrumento de contar partículas AccuSizer 700 de PSS (Particle Sizing Systems, USA) . De acuerdo con la invención se logra una mejora del proceso, si el número de partículas entre 2 y 400 µm/ml es < 3000 ó el número de partículas entre 10 y 400 µm/ml es 2000 ó menos. De acuerdo con la USP (Farmacopea de USA), está permitido un máximo de 6000 partículas en un margen por encima de 10 µm, y un máximo de 600 partículas en un margen por encima de 25 µm, por dosis inyectada de una preparación farmacéutica. Esto puede lograrse de acuerdo con la invención, de una manera sencilla, para las composiciones terapéuticas de proteínas. Las proteínas (Polipéptidos) están comprendidas dentro del ámbito de la invención como proteínas o fragmentos e proteínas, así como también como proteínas químicamente modificadas. Las proteínas que se desea establizar para composiciones farmacéuticas son de preferencia anticuerpos, proteínas de fusión de anticuerpos tales como las inmunotoxinas, enzimas y hormonas proteínicas como la eritropoyetina, somatostatina, insulina, citocinas, interferones o activadores del plasminógeno. Los compartimientos, dentro del ámbito de la invención, se entienden como alícuotas de la solución de proteína, los cuales, opcionalmente, después de posteriores procesos (adición de otras substancias farmacéuticamente aceptables), son adecuados como composiciones farmacéuticas, de preferencia para administrar como inyectable a los pacientes. El margen de pH en el cual la composición farmacéutica se estabiliza mediante el tampón de fosfato de potasio, es de preferencia un margen ligeramente ácido, neutro o ligeramente alcalino (aproximadamente PH 6-8, de preferencia alrededor de pH 7). De acuerdo con la invención es preferible añadir un detergente no iónico tal como un polisorbato (por ejemplo Tween^dO), de preferencia a una concentración de como máximo 0,1 % en peso y como mínimo 0.01% en peso. Además, es preferible añadir crioprotectores o formadores de hielo tales como un azúcar no reductor (de preferencia sacarosa o trehalosa) , ventajosamente a una concentración de cómo mínimo 10 mg/ml, de preferencia de aproximadamente 30 - 100 mg/ml. Consiguientemente, otro objeto de la invención, consiste en una forma de almacenamiento de proteína con bajo contenido de agregados, sólida fusible, esencialmente amorfa, compuesta de una solución congelada de la proteína y tampón de fosfato de potasio como la principal substancia tampón, en la cual la relación de iones potasio a iones sodio en la solución es como mínimo de 10:1. Independientemente de la concentración de iones potasio- y del contenido residual de iones sodio, la relación de iones potasio a iones sodio debe de ser como mínimo 10:1, de preferencia como mínimo 50:1. Es particularmente preferible emplear esencialmente un tampón de potasio exento de iones sodio. En otra versión preferida de la invención, la composición farmacéutica contiene una proteína que ha sido producida mediante un cultivo de células in vitro (por ejemplo la producción recombinante o cultivo de una línea celular de hibridomas, para producir anticuerpos monoclonales) . En este caso es conveniente o bien añadir una sal de potasio y/o tampón de fosfato de potasio, con la primera adición de sal y/o tampon, o bien retamponar la última vez en el proceso de aislamiento y purificación. Esto permite el almacenamiento provisional estable de la preparación de polipéptido por debajo de 0°C. El retamponado se entiende como un intercambio de iones por ejemplo por diálisis. En el proceso de purificación y aislamiento de la proteína la concentración del tampón o de la sal puede ser efectivamente mayor de 50 - 100 mmoles/litro antes de la compartimentación dado que estas composiciones no se emplean terapéuticamente. Sin embargo, es esencial que una osmolaridad que ha de ser adecuada para una composición inyectable, se ajuste antes de la compartimentación. Los siguientes ejemplos, publicaciones y figuras aclaran con más detalle la invención, el ámbito protectivo de la cual resulta de las reivindicaciones de la patente. Los procedimientos descritos deben entenderse como ejemplos que describen con más detalle el tema objeto de la invención, incluso después de modificaciones.

Breve descripción de las figur s La figura 1 muestra la determinación de los puntos eutécticos de varios tampones y soluciones salinas.

La figura 2 muestra la desviación del valor del pH durante la congelación, de los tampones de fosfato. La figura 3 muestra la formación de partículas de soluciones de un anticuerpo (frente a la L-selectina) en varias soluciones de tampones (A, B, C) después del esfuerzo de cizallamiento o de congelación/descongelación. A : AB en 10 mmoles/litro KP, 150 mmoles/litro de NaCl, pH 7; B : AB en 100 mmoles/litro de KP, pH 7,2; C : AB en 100 mmoles/litro de KP, 0,01 % en peso de Tween^dO, pH 7,2; a : centrifugado (material de partida) ; b: después del esfuerzo de cizallamiento (30 segundos de mezcla de Vortex) , c : después de seis ciclos de congelación/descongelación (-20°C) . La figura 4 muestra la formación de partículas de soluciones de un anticuerpo frente al HBV en varias soluciones de tampón (A, B y C) después del esfuerzo de cizallamiento o de congelación/descongelación. A : AB en 10 mmoles/litro de KP, 30 mmoles/litro de NaCl, pH 6,5; B : AB en 100 mmoles/litro de KP, pH 7,2; C : AB en 100 mmoles/litro de KP, 0,01 % en peso de Tween®80, pH 7,2; La figura 5 muestra el análisis HPLC de permeación sobre gel, de agregados solubles en soluciones de proteína (IgH humanizado de acuerdo con el ejemplo 3) después de un almacenamiento a temperaturas por debajo de 0°C. A : AB en 10 mmoles/litro de KP, 150 mmoles/litro de NaCl, pH 7,0; B : AB en 100 mmoles/litro de KP, pH 7,2. Ejemplo 1 Temperaturas eutécticaß de varias soluciones tampón y soluciones salinas A partir de la figura 1, es evidente que la temperatura eutéctica de los tampones que contienen NaCl es aproximadamente 10°C inferior que la de los tampones exentos de NaCl o soluciones que contienen KCl en lugar de NaCl. Dado que una solución sólo está completamente congelada por debajo de la temperatura eutéctica, esto significa que una proteína en un tampón de fosfato conteniendo NaCl está sometida a un mayor esfuerzo que en un tampón exento de NaCl durante el almacenamiento congwelado (habitualmente a 20°C) , y durante el proceso de congelación/descongelación. De acuerdo con la invención este esfuerzo se evita en las formulaciones formuladas más arriba, lo cual suprime la formación de agregados y partículas. Esta formulación permite un almacenamiento estable de la solución de proteína a -20°C, mediante lo cual puede lograrse un ahorro en los costes.

Ejemplo 2 Variación del valor del pH durante la congelación de los tampones de fosfato Es evidente a partir de la figura 2 que en los tampones de fosfato que contienen NaCl el valor del pH disminuye en alto grado durante el proceso de congelación debido al fosfato disódico precipitado. El valor del pH permanece en gran parte constante en el tampón de fosfato de potasio exento de NaCl.

Ejemplo 3 Formación de partículas en las soluciones de proteínas después del esfuerzo de cizalla ißnto o de congelación/descongelación . Se analizaron soluciones de un IgG humanizada (anticuerpo anti-L selectina) en varios tampones (A, B, C) para averiguar el contenido en partículas (Accu Sizer, Particle Sizing Systems, USA) : A) AB en 10 mmoles/litro de KP, 150 mmoles/litro de NaCl, pH 7 B) AB en 100 mmoles/litro de KP, pH 7,2 C) AB en 100 mmoles/litro de KP, 0,01 % en peso de Tween®80, pH 7,2 a) centrifugado (material de partida) b) después del esfuerzo de cizallamiento (30 segundos de tratamiento en el Vortex) c) después de seis ciclos de congelación/descongelación (-20°C) .

Los datos de la figura 3 se refieren cada uno de ellos a una r.uestra de 0,7 mi. De la figura 3 se desprende que la formación de partículas está suprimida de acuerdo con la invención mediante el uso _.e tampones de fosfato de potasio exentos de sodio. Este efecto puede incrementarse mediante la adición de un detergente no iónico (Tween*80, 0,01% en peso) .

Ejemplo 4 Formación de partículas en soluciones de proteínas despuós del esfuerzo de cizallamiento o de congelación/descongelación. Se analizaron soluciones de un anticuerpo anti HBV en varios en varios tampones (A, B, C) para averiguar el contenido en partículas (Accu Sizer, Particle Sizing Systems) : A) AB en 10 mmoles/litro de KP, 30 mmoles/litro de NaCl, pH 6,5 B) AB en 100 mmoles/litro de KP, pH 7,2 C) AB en 100 mmoles/litro de KP, 0,01 % en peso de Tweenf80, pH 7,2 a) centrifugado (material de partida) b) después del esfuerzo de cizallamiento (30 segundos de tratamiento en el Vortex) c) después de seis ciclos de congelación/descongelación (-20°C) Los datos de la figura 3 se refieren cada uno de ellos una muestra de 0,7 mi. De la figura 4 se desprende que la formación de partículas está suprimida de acuerdo con la invención mediante el uso de tampones de fosfato de potasio exentos de sodio. Este efecto puede incrementarse mediante la adición de un detergente no iónico Ejemplo 5 Prevención de la formación de agregados solubles durante el almacenamiento de soluciones de proteínas (IgG humanizada de acuerdo con el ejemplo 3) a temperaturas inferiores a 0°C Se almacenaron soluciones de proteínas durante varias semanas a -20°C en A) 10 mM de fosfato de potasio, 150 mM de NaCl, pH 7,0, y B) en lOOmM de fosfato de potasio, pH 7,2. Análisis de agregados solubles y la proteína nativa se efectuaron mediante HPLC de permeación sobre gel (figura 5) . De acuerdo con la invención se forma un número considerablemente menor de agregados de proteína con el tampón exento de NaCl que con el tampón conteniendo NaCl. Esto es debido ante todo al hecho de que se ha prevenido substancialmente una variación del valor del pH en el tampón exento de NaCl y la temperatura de almacenamiento es considerablemente inferior a la temperatura eutéctica (ver también los ejemplos 1 y 2) . Ejemplo 6: Formación de partículas en soluciones de proteínas después del esfuerzo de congelación/descongelación Se analizaron los anticuerpos MAB L-selectina, MAB HBV; MAB PDGF-R y MAB LNGF-R en varios tampones, para averiguar el contenido en partículas antes y después del esfuerzo de congelación/descongelación (6 x congelación/descongelación) (Accu Sizer, Particle Sizing Systerr.^1 (ver resultados en tabla 1, Cprot. : concentración de proteína) . Se detectaron partículas con un tamaño de 2-400 µn por mi) . Es evidente que la formación de partículas está suprimida de acuerdo con la invención mediante el uso de tampones de fosfato de potasio exento de sodio (KP) . Este efecto puede ser incrementado mediante la adición de un detergente no iónico.

Tabla 1 Lista de referencias DE 26 52 636 EP-A 0 018 609 EP-A 0 025 275 EP-A 0 314 095 EP-A 0 315 968 EP-A 0 318 081 EP-A 0 599 344 GB 8514349 Mendoza, J.A. Biotechnol. Te>_n 10 (1991) 535 540 Patente USA 4.808.705 WO 91/15509 WO 93/22335 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (12)

RE I V I ND I C AC I ONE S

1. Procedimiento perfeccionado para prevenir la formación de agregados de proteína en un liofilizado reconstituido de una composición farmacéutica de una proteína, de acuerdo con el cual una solución acuosa tamponada de la proteína se congela, se descongela, se divide en compartimientos de cantidades inyectables y dichos compartimientos se liofilizan, y en el cual la solución acuosa tamponada de la proteína contiene tampón de fosfato de potasio como substancia tampón y la relación de iones potasio a iones sodio en la solución es de 10:1 ó mayor.

2. Procedimiento según se ha reivindicado en la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de tampón en el compartimiento está entre 10 mmoles/litro y 300 mmoles/litro.

3. Procedimiento según se ha reivindicado en las reivindicaciones 1 - 2, caracterizado porque la osmolaridad de la solución reconstituida del compartimiento está de preferencia entre 100 y 500 mOsm, de preferencia 300 + 50 mOsm.

4. Procedimiento según se ha reivindicado en las reivindicaciones 1 - 3, caracterizado porque la solución acuosa tamponada está tamponada en un margen de pH entre 6 - 8.

5. Procedimiento según se ha reivindicado en las reivindicaciones 1 - 4, caracterizado porque la solución acuosa tamponada contiene un detergente no iónico.

6. Procedimiento según se ha reivindicado en las reivindicaciones 1 - 5, caracterizado porque la solución acuosa tamponada contiene un azúcar a una concentración de 10 - 100 mg/ml.

7. Procedimiento según se ha reivindicado en las reivindicaciones 1 - 6, caracterizado porque la proteína es un anticuerpo.

8. Forma de almacenamiento sólida fundible de una proteína con un bajo contenido de agregados, caracterizada porque es esencialmente amorfa, contiene una solución congelada de la proteína con tampón de fosfato de potasio como substancia tampón y la relación de los iones potasio a los iones sodio es como mínimo de 10:1.

9. Forma de almacenamiento sólida de una proteína como se ha reivindicado en la reivindicación 8, caracterizada porque la forma de almacenamiento se prepara por medio de una liofilización.

10. Forma de almacenamiento de una proteína como se ha reivindicado en las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizada porque la proteína es un anticuerpo.

11. Composición farmacéutica de una proteína en una solución acuosa tamponada en el margen de pH entre 6 y 8, caracterizada porque la solución contiene tampón de fosfato de potasio como substancia tampón, y a) la relación de los iones potasio a iones sodio en la solución es de 10:1 ó mayor, b) la concentración de tampón está entre 10 y 300 mmoles/litro.

12. Composición farmacéutica como se ha reivindicado en la reivindicación 11, caracterizada porque la proteína es un anticuerpo.