MXPA98009118A - Metodo y composiciones transgenicos para producirfrutos y hortalizas partenocarpicos - Google Patents

Abstract

La invención describe un método transgénico para producir frutos partenocárpicos o frutos con un número reducido de semillas;implica la expresión temporal de una fitohormona, presursor o un gen, de modo que se potencia la actividad de la giberelina u otra actividad hormonal similar que interviene en el inicio de la actividad de formación del fruto;el gen estáenlazado operablemente a un promotor regulador, de modo que la expresión es sincronizada antes del desarrollo del polen o la fecundación;la expresión de la hormona causa desarrollo del fruto en ausencia de fecundación;el método da como resultado también un fruto que tiene semillas de tamaño reducido o muy pocas semillas;la invención incluye también construicciones, vectores y métodos transgénicos para la producción de plantas partenocárpicas.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES TRANSGEN I CQS PARA PRODUCIR FRUTOS Y HOftTA S?S PtAftTENQC PEGOS GAMPP E I INVENC ÓN Esta invención se refiere generalmente al campo de biología molecular vegetal» y en particular a plantas» semillas y tejidos transgénicos» los cuales han sido genéticamente modificados para crear plantas que evitarán la necesidad de fecundación y la formación inicial del fruto y que» sin considerar estas últimas» producirán frutos y hortalizas sin semilla en varias condiciones de crecimiento.

NTSCEPENTES PE l» ENVENCtON En plantas angiospermas» el fruto se desarrolla del pericarpio» que rodea a la semilla en desarrollo. El desarrollo del fruto ocurre después de la polinización y la fecundación» lo cual da como resultado la producción de un embrión. Después de la fusión del gameto masculino con otras células en el óvulo» da inicio la formación del endospermo» y se desarrolla conconmi tante con la proliferación del embrión del protoplasto. Conforme los óvulos se desarrollan en las semillas» el ovario se hincha en el fruto. A menudo» el desarrollo del fruto en especies no apo í'ticas es desencadenado por la fecundación de los óvulos» y si la polinización o fecundación no ocurren» entonces ocurre abscisión de la flor y no se forma fruto alguno. La formación del fruto es obstaculizada también por factores externos tales como fluctuaciones de temperatura» disponib lidad del agua y condiciones de luz. Por ejemplo» las pimientas son muy sensibles a las fluctuaciones de temperatura. Una temperatura menor de 10°C durante la noche o mayor de 26.6°C durante el día» hará que el fruto no se forme después de la polinización. Las variaciones menores conducirán a la formación desigual del fruto» dando como resultado frutos de forma anormal. La posibilidad de controlar el inicio de la formación del fruto en las plantas puede evitar estos problemas» ya que la formación del fruto se puede controlar internamente sin importar los factores externos» mejorando así el rendimiento» así como también las áreas de crecimiento potenciales. Dicho control se puede proveer también para el inicio de la formación del fruto sin fecundación» es decir» la producción de un fenotipo par enocárpico. Esto puede permitir el desarrollo del fruto por una especie vegetal sin considerar los factores externos» y puede permitir el desarrollo del fruto sin considerar la fecundación. Con frecuencia» el fenotipo parteñocarpico no sólo permite la formación del fruto sin fecundación» pero sin fecundación» el desarrollo de la semilla se reduce al mínimo o ee inhibido por completo» proveyendo un segundo beneficio de la partenocarpia. Los frutos y hortalizas sin semilla han sido por mucho tiempo un objetivo de aquellos en el campo de los productos agrícolas. Los beneficios de dichas plantas incluyen la obvia atracción para los consumidores de la facilidad para preparar y consumir dichos productos. Otros beneficios incluyen un fruto u hortaliza más dulce y fresco» así como un aumento de la porción comestible» toda vez que la cavidad de la semilla está ausente o se reduce ampliamente. Se han logrado varios avances en este campo» normalmente con la aplicación tópica de hormonas o con procedimientos de reproducción altamente complejos que dan como resultado un genotipo triploide. Las aplicacio nes tópicas de giberelina se han usado durante mucho tiempo para inducir un fenotipo sin semilla <partenocár ico) en uvas. Este método requiere normalmente un procedimiento de aspersión que es problemático» dependiente del clima y que debe de ser sincronizado correctamente para que ocurra inmediatamente después de la polinización. Otro método requiere de un complejo procedimiento de reproducción para la producción de sandías sin semilla. La condición de sin semilla en la sandía es casi siempre el resultado de la presencia de tres complementos homólogos por célula» en lugar de los dos normales» conocido como triploide. Estas sandías tienen problemas para desarrollarse normalmente en un embrión y ocasionan la ausencia de semillas en las plantas t ipíoides. La formación anormal del embrión ocasiona el cese del desarrollo ovular normal de una semilla en una etapa temprana. Típicamente» las sandías sin semilla contienen pequeños óvulos blancos comestibles similares a los de los pepinos inmaduros. Un método transgénico para crear frutos sin semillas se describe en la patente mundial W091/09957. Incluye un sistema de excisión para recombinación altamente complejo llamado "CRE-LOX". Generalmente» el producto genético del CRE produce una prateína reco binasa que actúa en la secuencia de ADN LOX específica. Se describen varias funciones de recombinación» siendo la más consistente la excisión de la secuencia de ADN LOX. En la solicitud se formula la hipótesis de que las sandías sin semilla ocurren bajo condiciones que incluyen transformación con el gen barnasa derivado de Baci llus amylol iguefaciens. Generalmente» la semilla femenina tiene un promotor específico del tegumento (SC) ?CRE* terminador , y la semilla masculina tiene un promotor SC?gen barnasa? ? lo ? ? en barnasa? terminado . No existen cambios fenotípicos en los dos progenitores cuando son propagados» y en el campo de producción de semillas el progenitor femenino productor de semillas tiene un conjunto normal de semillas porque ambos genes no están funcionando al mismo tiempo (el tegumento sólo es tejido materno). Sin embarga» en la generación Flr el tejido materno contendrá ambos genes. En esta configuración» la constitución del tegumento (planta Fl » semillas F2) es promotor SC?gen barnasa? ;- ? en barnasa? terminador » en donde ??-?? representa el punto en donde el gen lox es cortado» produciendo un gen para toxina funcional específico para el tegumento. En teoría» si el tegumento se colapsa» el desarrollo de la semilla será detenido debido a la falta de flujo de nutrientes hacia el embrión. No se describen datos experimentales» y el éxito del protocolo propuesto para el desarrollo de sandías sin semilla reales no se muestra en ninguna parte. De esta manera» se puede observar a partir de lo anterior» que existe la necesidad en la técnica de protocolos de producción para frutos y hortalizas partenocárpicos» que sean simples» directos y fácilmente repetibles. Un objetivo de la presente invención es proveer construcciones de expresión» que cuando sean expresadas en una planta transgénica» den como resultado la formación de frutos sin fecundación» así como también la producción de frutos y hortalizas sin semilla. Es también otro objetivo de la invención proveer líneas progenituras endagámicas que puedan ser reproducidas en forma cruzada» dando co o resultado una planta Fl que será parteño arpica y no producirá semillas o exhibirá una reducción significativa en la cantidad de semillas presentes. Es también un objetivo de esta invención proveer plantas» células vegetales y tejidos vegetales que contengan las construcciones de expresión de la invención . Un objetivo más de la invención es proveer vehículos para la transformación de las células vegetales» incluyendo vectores virales o plásmidos y cassettes de expresión que incorporen los genes y promotores de la invención. Es también otro objetivo de la invención proveer células bacterianas que comprendan dichos vectores para replicación de mantenimiento y transformación de plantas. Otros objetivos de la invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad» la invención comprende la manipulación genética de plantas para potenciar los efectos de las giberelinas u otras hormonas que intervienen en el inicio de la formación del fruto. La invención comprende la expresión temporal de un gen estructural que codifica para una fitohormona tal como giberelinas o citocinas» o proteínas asociadas can la producción de dichas hormonas (es decir» enzimas» intermediarios biosintéticos» etc.)» los cuales están asociados con el inicio de la formación del fruto. El gen estructural se pone bajo el control de un promotor específico de la icrospora o megaspora del polen» de modo que la expresión de la hormona sea sincronizada para que ocurra antes de la polinización» de modo que el desarrollo y la maduración del fruto sean inducidos sin necesidad de fecundación.

PE5GRIPGIQN PETAi Pft PE * I VENCIÓN El uso tópico de hormonas exógenas para facilitar la formación del fruto» o en algunos casos para inducir la par tenocarpia» está bien establecido en las áreas de cultivo de frutos y hortalizas. Ya se había logrado previamente el uso del inhibidor de auxina Tomaset (ácido N-meta-toli l-ftalámico» o 4-CPA) para inducir la partenocarpia en el tomate bajo condiciones de frío en invernaderos. Los productores de pimienta en Florida usan la aplicación de GA para mejorar la formación del fruto durante la estación de crecimiento. Las vides son tratadas habitualmente con giberelinas para inducir la formación del fruto» alargar el tamaño de los racimos y uniformar el crecimiento del fruto» especialmente en el caso de los tipos sin semilla. Véase» por ejemplo» Jankiewicz» L.S.» Flores» A.E.r Gsrec i» R. » Staniaszek» M» "Effect of growth regulators on parthenocarpic fruit in Capsicu annum" . Se usa el tratamiento adicional con giberelina para asegurar que el nuevo fruto sea formado conforme los frutos anteriores maduran y son cosechados. Véase» SO? Folia-Hor ticul urae (Polonia) (1991)» v. 3(2)» p. 3-16. En la siguiente descripción» se usan exhaustivamente varios términos. Se proveen las siguientes definiciones para eliminar las ambigüedades en el intento o el alcance de su uso en la especificación y las reivindicaciones» y para facilitar el entendimiento de la invención. s Como se usa en la presente» el término giberelina debe incluir cualquier producto que posea la actividad biológica de una giberelina» y puede incluir proteínas similares a giberelinas que posean homología con un producto de giberelina» de modo que su actividad biológica se conserve mediante estudios de mutación descritos más adelante. Como se usa en la presente» el término fruto debe incluir cualquier angiosper a que tenga su polen y órganos productores de óvulos en flores» con óvulos encerrados en un ovario» y después de la fecundación» con cada óvulo desarrollándose en una semilla» mientras el ovario se expande en un fruto. Cualquier fruto que sea conveniente para ser producido en forma partenac rpica» es abarcado por esta definición. Además» se pretende que sean abarcadas fuentes alimenticias consideradas tradicionalmente como hortalizas» pero que son producidas de esta manera» tales como tomates» pimientas y similares. Un promotor es una secuencia de ADN que dirige la transcripción de un gen estructural. Típicamente» un promotor se localiza en la región 5" de un gen» próxima al sitio de inicio de la transcripción de un gen estructural. Un promotor específico del polen es cualquier promotor capaz de regular la expresión temporal en un momento previo a la polinización» o poco después de la misma» para que el desarrollo y la maduración del fruto sean inducidos» sin desarrollo significativo de la semilla. Dichos promotores tales como los mencionados aquí incluyen» pero no están limitados a» promotores inducibles» promotores de microsporas o megasporas» promotores específicos del polen o promotores de tejido materno» tales como promotores del tegumento» o cualquier otro promotor asociado con un gen implicado en la polinización o la maduración o el desarrollo del óvulo. Un gen estructural es una secuencia de ADN que es transcrita en ARN mensajero (ARNm)» el cual es traducido después en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico. El término expresión se refiere a la biosíntesis de un producto genético. En el caso de un gen estructural» la expresión implica la transcripción del gen estructural en ARNm» y después la traducción del ARNm en uno o más polipéptidos. Un vector de clonación es una molécula de ADN tal como un plásmido» cós ido o fago bacteriano que tiene la capacidad de replicarse en forma autónoma en una célula hospedera. Los vectores de clonación contienen típicamente uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción en los cuales se pueden insertar secuencias de ADN introducidas en forma deter inable sin pérdida de la función biológica esencial del vector» así como también un gen marcador que es adecuado para su uso en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Un vector de expresión es una molécula de ADN que comprende un gen que es expresado en una célula hospedera.

Típ camente» la expresión del gen es puesta bajo el control de ciertos elementos reguladores que incluyen promotores» elementos reguladores específicos de tejidos» y mejoradores. Se dice que dicho gen está "enlazado operablemente a" los elementos reguladores. Un hospedero recombinante puede ser cualquier célula pracariótica o eucariótica que contenga ya sea un vector de clonación o un vector de expresión. Este término incluye también las células pracarióticas o eucarióticas que han sido manipuladas mediante técnicas de ingeniería genética para contener los genes clonados en el cromosoma o genoma de la célula hospedera. Una planta transgénica es una planta que tiene una o más células vegetales que contienen un vector de expresión. El tejido vegetal incluye tejidos o plantas diferenciados o indiferenciados incluyendo» pero no limitados a» raíces» tallos» v stagos» hojas» polen» semillas» tejido tumoral » y varias formas de células y cultivos tales como células individuales» protoplastos» embriones y tejido calloso. El tejido vegetal puede estar en una planta o en un cultivo de órganos» tejidos o células.

TÉCNICAS DE TRANSFORMACIÓN MOLECULAR La producción de un tejido vegetal genéticamente modificado que expresa un gen estructural bajo el control de promotores reguladores» combina las enseñanzas de la presente descripción con una variedad de técnicas y expedientes conocidos en la materia. En la mayoría de los casos» existen expedientes alternos para cada etapa del procedimiento global. La elección de los expedientes depende de variables tales como el sistema de vector de plásmido elegido para la clonación e introducción de la molécula de ADN recombinante» la especie vegetal que será modificada» el gen estructural en particular» elementos del promotor y elementos hacia el extremo 5' usados. Los expertos en la técnica son capaces de seleccionar y usar alternativas adecuadas para lograr funcionalidad. Las condiciones de cultiva para expresar genes estructurales y células cultivadas deseados» son conocidas en la técnica. También» como se conoce en la técnica» un número de especies vegetales monocotiledóneaß y dicotiledóneas son transformables y regenerables para que se puedan obtener plantas enteras que contengan y expresen genes convenientes bajo el control regulador de las moléculas del promotor de conformidad con la invención. Como es sabido por los expertos en la técnica» la expresión en plantas transformadas puede ser específica del tejido y/o específica para ciertas etapas del desarrollo. La selección del promotor truncado» y la selección del gen para hormona estructural» son otros parámetros que pueden ser optimizados para lograr la expresión vegetal deseada» como es sabido por los expertos en la técnica y se enseña en la presente.

La selección de un vector de expresión adecuado dependerá del método para introducir el vector de expresión en células hospederas. Típicamente» un vector de expresión contiene (1) elementos de ADN procarióticos que codifican para un origen de replicación bacteriano y un marcador de resistencia a antibióticos para proveer el crecimiento y la selección del vector de expresión en un hospedero bacteriano» (2) elementos de ADN que controlan el inicio de la transcri ción» tales como un promotor» (3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de transcritos» tales como la secuencia de terminación/poliadeni lación de la transcripción» y (4) un gen reportero que está enlazado operablemente a los elementos de ADN que controlan el inicio de la transcripción. Los genes reporteros útiles incluyen ß-glucuronidasa» 0-galactosidasa» cloranfenicol acetil transferasa» luciferasa» y similares. En forma preferible» el gen reportero es fl-glucuronidasa (GUS) o luciferasa. Descri ciones generales de vectores de expresión y genes reporteros en plantas pueden encontrarse en Gruber y otros» "Vertors for Plant Transformation» en Methods in Plant Molecular Biology ét Biotechnology"» en Glich y otros (Eds. pp. 89-119» CRC Press» 1993). Más aún» los vectores de expresión para GUS y los cassettes de gen para GUS» están disponibles a partir de Clone Tech Laboratories» Inc.» Palo Alto» California» mientras que los vectores de expresión para luciferasa y los cassettes de gen para la misma están disponibles a partir de Pro Mega Corp. (Madison» Wisconsin). Los vectores de expresión que contienen fragmentos genómicos o sintéticos pueden ser introducidos en el protoplasto o en tejidos intactos o células aisladas. En forma preferible» los vectores de expresión son introducidos en tejido intacto. Métodos generales para cultivar tejidos vegetales son provistos» por ejemplo» por Maki y otros» "Pracedures for Introducing Foreign DNA into Plants"» en Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology» Glich y otros (Eds. pp. 67-88 CRC Press» 1993); y por Phillips y otros» "Cell-Tissue Culture and In~Vitra Manipulat ion" » en Carn & Corn I provement» 3a. edición» Sprague y otros (Eds. pp. 345-387)» American Society of Agrono y Inc. y otros» 1988. Los métodos para introducir vectores de expresión en tejidos vegetales incluyen la infección directa o co-cultivo de células vegetales con A robacteriu tumefaciens» Horsch y otros» Science» 227:1229 (1985). Descripciones de sistema de vector de Agrobacterium» y métodos para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium» son provistos por Gruber y otros» citado anteriormente. Preferiblemente» los vectores de expresión son introducidos en loe tejidos de la planta usando un método directo de transferencia de genes» tal como liberación mediada por icroproyectiles» inyección de ADN» electroporación» y similares. Más preferiblemente» los vectores de expresión se introducen en tejidos vegetales usando la liberación mediada por icroproyectiles con el dispositivo biolístico. La invención comprende también el uso de estos tipos de procedimientos de transformaci n para generar una planta en la cual la formación del fruto sea inducida antes de la fecundación» dando como resultado una planta partenocárpica que contendrá también poca o ninguna semilla. Esto es de valor particular para las plantas en las cuales la formación de la semilla es inhibida tempranamente por factores externos tales como fluctuaciones de temperatura» precipitación» etc.. Una construcción que comprenda una hormona que estimule la formación y el desarrollo del fruto» o que comprenda un gen que codifique para una proteína que promueve la producción de dicha hormona (una molécula precursora o enzima) enlazada operablemente a un promotor específico del polen» es introducida en dicha planta. En una modalidad preferida» la invención comprende el uso de un gen estructural el cual promueve la síntesis de» o codifica para» cualquiera de la familia de giberelinas o fitohormonas similares a giberelina. Los métodos de la invención descrita aquí pueden ser aplicables a cualquier especie de angiasperma» cuyo fruto u hortaliza sea conveniente para ser producido en una amplia gama de condiciones sin que exista algún impacto negativo sobre la formación y el desarrollo del fruto y en la cual sea conveniente obtener la condición sin semilla. Las plantas productoras de frutos y hortalizas que pueden hacerse sin semilla de conformidad con los métodos de la invención incluyen» pero no están limitados a» melones tales como sandía y melón común» bayas tales como fresas y arándanos» pimientos tales como pimientos verdes» pimientos rojos» pimientos amarillos» tomates» naranjas» ciruelas» alfalfa» calabaza» berenjena» maíz dulce» chícharos» algodón» aguacates» mangos» papayas» nectarinas» manzanas» toronja» limones» limas» mandarinas» peras y duraznos. En una modalidad preferida» la invención se usa con frutos tales como la pimienta» en la cual la formación del fruto es muy sensible a las condiciones externas. A continuación se ilustrarán los métodos de la invención en relación a modalidades particulares. Una fitohor ona que es crítica para la formación y el desarrollo del fruto» es una que incluye hormonas que son críticas para la formación y/o función del polen» icrosporas» macrosporas o embrión» e incluye proteínas o enzimas que son fundamentales en el desarrollo del fruto» incluyendo células y/o tejidos de los cuales se desarrolla el fruto» células y/o tejidos que forman parte del ovario» endospermo» pericarpio o embrión» u otra estructura femenina en la cual se desarrolle el fruto después de la fecundación. La secuencia de ADN puede ser cualquier secuencia de ADN identificable que codifique para productos genéticos que sean capaces de inducir la formación y el desarrollo del fruto en una célula o una planta. Ejemplos de dicha secuencia de ADN incluyen hormonas tales como giberelina» auxinas» etc.» precursores de dichas hormonas» o enzimas que intervienen en la biosíntesis de dichas hormonas. Las giberelinas (GAs) son una familia de fitohormonas di terpenoides del crecimiento» algunas de las cuales son reguladores del crecimiento bioactivas. Las GAs se requieren para controlar procesos tan diversos como la germinación de la semilla» la elongación y la división celular» la expansión foliar» la elongación del tallo» la floración y la formación del fruto. Las GAs han sido el tema de muchos estudios fisiológicos y bioquímicos» y se han estudiado varios mutantes de plantas con patrones alterados de biosíntesis a respuesta de GA (Graebe» J.E.» Ann. Rev. Plant Physiol. 38?419-465 (1987)). Estudios bioquímicos exhaustivos realizados en intermediarios endógenos de GA en mutantes enanos que responden a la GA» han permitido la determinación de la vía biosintética de la GA y de varios loci genéticos que intervienen en la biosíntesis de la misma (revisado por Graebe» J.E.» Ann. Rev. Plant Physiol. 38*419-465 (1987). Se han aislado varios mutantes enanos que responden a la GA de varias especies de plantas» tales como maíz» chícharo y Arabidopsis (Phinney» B.O. y otros» "Chemical Genetics and the Gibberellin Pathway" in Zea mays L. » en Plant Grawth Substance» ed. » P.F. Waering» New York? Academic (1982) pp. 101-110? Ingram, T.J. y otros» Planta 160?455-463 (1984)» Koornneef» M.» Arabidopsis Inf. Serv. 15? 17-20 (1978)). Los mutantes enanos del maíz (enano 1» enano 2» enano 3» enano 5) se han utilizado para caracterizar la vía biosintética de la GA del maíz determinando pasos específicos que conducen a metabolitas biológicamente importantes (Phinney» B.O. y otros» "Chemical Genetics and the Gibberellin Pathway" en Zea mays L.» en Plant Growth Substance» ed.» P.F. Waering» New York* Academic (1982) pp. 101-110; Fujiaka» S. y otros» Plant Physiol. 88? 1367-1372 (1988)). Se han realizado estudios similares con los mutantes enanos del chícharo (Pisum sativum L.)( Ingram» T.J. y otros» Planta 160?455-463 (1984)). También se han aislado mutantes deficientes en GA de Arabidopsis (gal» ga2» ga3» ga4» ga5) ( oornneef» M. y otros» Theor. Appl. Genet. 58?257-263 (1980)). Uno de los estudios genéticos más exhaustivos de mutantes de GA ha sido llevado a cabo por Koornneef (Theor. Appl. Genet. 58?257-263 (1980)? Koornneef y otros» Genet. Res. Ca b. 41?57-68 (1983)) en la crucifera Arabidopsis thaliana. Usando súlfonato de e ilmetano (EMS) y mutagénesis rápida con neutrones» Koornneef ha realizado el mapeo de 9 alelos aislados para el locus de GA1 de A. thaliana (Koornneef y otros» (Theor. Appl. Genet. 58?257-263 (1980)? Koorneef y otros» Genet. Res. Camb. 41 ?57-68 (1983)). Los genes estructurales útiles para el método de la invención» incluyen genes que codifican para giberelina o un intermediario de la biosíntesis de la misma» tal como una enzima o precursor que finalmente es convertido en giberelina. En todavía otra modalidad» el receptor de giberelina puede ser mutado para hacer que sea máe sensible a la giberel ina. Un ejemplo de un gen útil en la práctica de la invención incluye aquel descrito en la solicitud de Patente Europea EPO 692537A2 por Tai-Ping Sun y otros» "Recombinant Gibberellin DNA and Uses Thereof"» cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. La publicación describe el ADNc y el ADN genómico que corresponde al locus de GAl de Arabidopsis thaliana que codifica para ent-kaureno sintetasa. La enzima codificada por el gen GAl interviene en la conversión de GGPP en ent-kaureno (Barendse y Koornneef » Arabidopsis Inf. Serv. 19?25-28 (1982)? Barendse y otros» Physiol. Plant. 67:315-319 (1986); Zeenvaart» J.A.D.» en Plant Research '86» Annual Report of the MSU-DOE Plant Research Laboratory» 130-131 (East Lansing» MI» 1986))» un intermediario clave en la biosíntesis de GAs (Graebe» J.E.» Ann» Rev. Plant Physiol. 38?419-465 (1987)). La ent-kaureno sintetasa sólo ha sido parcialmente purificada a partir de varias plantas (Duncan» Plant Physiol. 68? 1128-1134 (1981)). La síntesis de GGPP a partir de mevalonato es común en los terpenas. GPPP es un metabalita de punto de ramificación que no sólo es el precursor de GAs» sino también un precursor de otros diterpenos» tales como la cadena de fitol de las clorofilas» y tetraterpenos tales como los carotenaides. El primer paso obligado de la vía de GA es la conversión de GGPP en ent-kaureno en una reacción de ciclización de dos pasos.

GGPP es ciclizado parcialmente hasta el intermediario» pirofasfato de copalila (CPP)» por ent-kaureno sintetasa A» y el CPP es convertido inmediatamente en ent-kaureno por la ent-kaureno sintetasa B. Dado que el ent-kaurena es un intermediario clave en la vía de la GA» es probable que su síntesis sea un punto regulador para la biosíntesis de GA. Además» se ha demostrado que la producción de ent-kaureno es alterada por cambios en el fotoperíodo» temperatura» y el potencial de crecimiento de los tejidos en ciertas especies (Chung y Coolbaugh» 1986» Moore y Moore» 1991; Zeevaart y Gage» 1993). Examinando las lesiones moleculares en varios alelos de GAl» se estableció una correlación directa de los mapas genético y físico del locus de GAl» y se determinó una velocidad de recombinación de 10~5 cM por nucleótido para esta región del genoma de A. thaliana (Koornneef» Genet. Res. Comb. 41:57-68 (1983) ) . Otro ejemplo de un gen útil para la práctica de la invención» incluye aquel descrito en la publicación de PCT W094/28141 por Theodor Lange y otros» "Regulation of Plant Growth"» cuya descripción se incorpora en la presente co o referencia. Esta solicitud describe la clonación molecular del gen que codifica para giberelina (GA) 20-oxidasa y su uso. La (GA)20 oxidasa es una enzima reguladora» y la producción de GA es particularmente sensible a su actividad. La expresión de la enzima aumenta los niveles de giberelinas biológicamente act ivas . Todavía otros genes estructurales útiles para la invención incluyen el gen AN1 a ANZ descrito en W095 35383 "Plant anther ear genes encoding cyclase affect gibberellic acid biosynthesis-useful for altering height and fertility in monocotyledons" » por Benson» R.J. y otros» cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. La publicación describe la clonación y la expresión de genes para mazorca y anteras 1 (AN1) y mazorca y anteras 2 (ANZ) clonados del maíz. El producto genético afecta la conversión de GGPP en ent-kaureno en la biosíntesis de ácido giberélico. Un mutante de tomate deficiente en GA es anormal» y el resultado son frutos deformados. Este fenotipo puede ser superado mediante la aplicación de GAs biaactivas. Las mutaciones del tomate incluyen gibl» gib2» gib3» ninguna de las cuales ha sido clonada. La mutación gibl del tomate es el equivalente metabólica de AN1 en el maíz. La observación de que la adición de GA biaactiva para desarrollar frutos de gibl» gib2 y gib3 sugiere que la expresión de un gen estructural hace que la GA bioactiva de como resultado la formación y forma anormales del fruto en la pimienta y otros frutos. Se han hecho observaciones similares en Arabidopsis. En Arabidopsis» el gen GAl es el equivalente metabólico de AN1 en el maíz» y ha sido clonado y se ha determinado su secuencia. En chícharos» la remoción de las semillas en una etapa temprana conduce al desarrollo anormal de la vaina» dado que la fuente de la GA bioactiva es la semilla. Así» en una modalidad preferida» la invención incluye los genes AN1 o AN2 que tienen actividad similar a la giberelina para lograr el fenotipo partenocárpico. La pérdida de AN1 reduce la cantidad del producto metabólico en 807. del total producido. Aún no se ha determinado la contribución de ANZ en el 207. restante. AN2 es un gen expresado con alta homología con AN1 ( 707. idéntico). Ambos genes se describen en W095/35383» cuya descripción ha sido incorporada previamente como referencia. Existe aproximadamente 50 a 60% de identidad en el nivel de aminoácidos entre AN1 y los genes GAl. Se ha utilizado la secuencia de AN1 para recuperar secuencias similares en el arroz. Se puede usar una comparación de las secuencias del maíz y de Arabidopsis para derivar una secuencia consenso que sería útil para aislar genes similares en la pimienta u otras especies para la práctica de la invención. Otro gen potencial incluye el gen GA4 de Arabidopsis. Estos productos genéticos catalizan el último paso en el proceso biosintético de la giberelina que hace que la GAl sea bioactiva. Los ácidos giberélicos se sintetizan a partir del isoprenaide GGPP» iniciando con las cid izaciones de GGPP en CPP» y entonces CPP en ent-kaureno» catalizadas por las kaureno sintetasas A y B» respec ivamente (Duncan y otros» 1981). Se piensa que la mayoría de las plantas superiores son similares al maíz porque» en el maíz» el ent-kaureno es oxidado gradualmente hasta ácido 7-h droxi-kaurenoico» el cual es convertido en la primera giberelina verdadera» el aldehido GA12 (Suzuki y otros» 1992). Este último compuesto es oxidado entonces hasta una GA activa mediante una de tres vías paralelas. En el maíz» la via dominante parece ser la vía temprana del 13-hidraxila (Hedden y otros» 1982)» siendo GAl el penúltimo producto activo» típicamente presente en cantidades menores de 1 ug/100 gfwt (Fujioka y otros» 1988). La homología entre las secuencias predichas de aminoácidos de AN1 del maíz y GAl de Arabidopsis» señala hacia una función común para estos genes. Es notable su identidad total de 47% (68% de similitud)» pero es incluso mayor en un segmento interno de 300 aminoácidos que es 68% idéntico (94% similar). Como en el caso del dominio de unión putativo de poly prenil-pirofosfata dentro de este segmento» AN1 y GAl comparten 100% de similitud. Otroe genes de plantas de loe cuales se ha determinado su secuencia y que usan substratos poly prenil-pirofosfori lados (geranil-» farnisil- y geranil eranil-pirofosfato)» comparten también homología significativa con AN1 en este dominio (Facchini y otros» 1992)» pero mucho menos homología general con AN1 (de 20 a 25% de identidad). Estas homologías de secuencia indican claramente que AN1 codifica para una ciclasa que funciona en la conversión de GGPP en ent-kaureno. Los promotores usados en los métodos de la invención» pueden ser un promotor específico del polen» un promotor de tejido materno» un promotor inducible o un promotor constitutivo. Se apreciará que el término polen como se usa en la presente» y en particular en relación al promotor inducible descrito en la descripción y las reivindicaciones» incluye células y/o tejidos a partir de los cuales se desarrolla el polen (por ejemplo» icrasporas pre eióticas y uninucleadas) , células y/o tejidos que forman parte de la estructura masculina en la cual se desarrolla el polen (por ejemplo» antera» tapeto o filamento)» y el polen mismo. Se incluye también cualquier promotor que correlacione la expresión con el inicio temprano de la reproducción de la planta conforme la planta avanza hacia el estado vegetativo. Esto puede incluir promotores asociados con la fecundación» o la planta fértil incluyendo todos los órganos sexuales» así como también promotores del desarrollo temprano de la sem lla. El promotor específico del polen usado se puede seleccionar del grupo de promotores que se sabe dirigen la expresión en la antera» tapeto» filamento» polen mismo» a en el ovario» pericarpio del endosper o o estructuras del embrión correspondientes . Ejemplos de promotores específicos del polen incluyen aquellos que se describen en la patente de E.U.A. No. 5»086»169 por Mascarenhas» la cual describe un promotor específico del polen aislado del maíz» la patente de E.U.A. No. 5»412»085 por Alien y otros» la cual describe otro promotor específico del polen aislado del maíz? la patente de E.U.A. No. 5»477»002 por Tuttle y otros» la cual describe un promotor específico de la antera» la patente de E.U.A. No. 5»470»359 por Huffman y otros» la cual describe un promotor específico del tapeto; W092 11379 por Draper y otros» que describe un promotor específico del tapeto aislado de Brassicaceae (braeicáceas) » Plant» Julio de 1995 8(1) p. 55-63» donde se describe un promotor específico del polen del tabaco» y Plant Mol. Biol.» Enero de 1992 18(2) p. 211-8» donde se describe todavía otro promotor específico del polen del maíz. Estos son sólo algunos ejemplos de promotores que se pueden usar» pero la invención no está limitada a los mismos. Otros promotores son conocidos por los expertos en la técnica» y se pretende que sean abarcados dentro del alcance de la invención. La descripción de todo la anterior se incorpora en la presente como referencia. Otros promotores útiles incluyen cualquier promotor que se pueda derivar de un gen cuya expresión esté asociada aternalmente con el embrión y/a el endospermo» o con la formación temprana del polen. Los promotores preferidos se pueden usar en conjunto con secuencias transcritas o de codificación flanqueantes que ocurren naturalmente» de genes específicos de la semilla o cualquier otra secuencia transcrita o de codificación que sea crítica para la formación y/a función de la semilla. Puede ser también conveniente incluir algunas secuencias de intrón en las construcciones del promotor» dado que la inclusión de secuencias de intrón en la región de codificación puede dar como resultado expresión y carácter específico mejoradas. Así» puede ser ventajoso unir las secuencias de ADN que van a ser expresadas a una secuencia de promotor que contenga las primeras secuencias de intrón y exón de un polipéptido que sea único para las células/tejidos de una planta y que es crítico para la formación y/o función de la semilla. Además» se pueden unir regiones de un promotor a regiones de un promotor distinto para obtener la actividad deseada del promotor que dé como resultado un promotor quimérico. También se pueden usar promotores sintéticos que regulen l expresión de los genes para el desarrollo de la semilla. El promotor usado en el método de la invención puede ser un promotor inducible. Un promotor inducible es un promotor que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripci n de una secuencia de ADN en respuesta a un inductor. En ausencia de un inductor» la secuencia de ADN no será transcrita. Típicamente» el factor de proteína que se une específicamente a un promotor inducible para activar la transcripción está presente en una forma inactiva que es convertida entonces directa o indirectamente en la forma activa por el inductor. El inductor puede ser un agente químico tal como una proteína» metabolito (azúcar» alcohol» etc.)» un regulador del crecimiento» herbicida» o un compuesto fenólico o un factor de estrés fisiológica impuesto directamente mediante calor» sales» elementos tóxicos» etc.» o indirectamente a través de la acción de un patógeno o agente de enfermedad tal como un virus. Se puede exponer ante un inductor a una célula vegetal que contenga un promotor inducible aplicando externamente el inductor a la célula» tal como mediante aspersión» riego» calentamiento» o métodos similares. Ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor de choque térmico 70 KD inducible de D. elanogaster (Freeling» M. » Bennet» D.C.» Maize ADN 1» Ann. Rev. of Genetics 19?297-323)» y el promotor de alcohol deshidrogenasa» que es inducido por etanol (Nagao» R.T. y otros» Miflin» B.J.» Ed. Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology» Vol. 3» p. 384-438» Oxford University Press» Oxford 1986)» o bien el promotor Lex A que es desencadenado con tratamiento químico y está disponible a través de Ligand Pharmaceuticals. El promotor inducible puede eetar en un estado inducido durante la formación de la semilla» o por lo menos durante un periodo que corresponda a la transcripción de la secuencia de ADN de las moléculas de ADN recombinante. En una modalidad preferida» el promotor es uno que es específico de tejido materno» tal como un promotor específico del tegumento» el cual se expresa sólo en tejido materno tal como la subunidad a' de la G-congl icinina de la soya <a'-ß-C6)» que es altamente expresada en el desarrollo temprano de la semilla en el endospermo y el embrión» como se descri e en J.

Biol. Chem. 261: 228 (1986)» incorporado en la presente como referencia. Otro ejemplo de promotor inducible es la secuencia de promotor de gen químicamente inducible aislada de una subunidad de 27 kd del gen para glutatión-S-transferasa (GST II) del maíz. Dos de los inductores para este promotor son N»N»-dialil-2»Z-dicloroacetamida (nombre camún? dicloraamida) o =2-claro-4-( trifluorometil )-5-t iazolcarbaxi lato de bencilo (nombre común' flurazol). Además» se pueden usar varios otros inductores potenciales con este promotor» como se describe en la solicitud de PCT publicada No. PCT/GB90/00110 por ICI . Otra ejemplo de promotor inducible es el promotor de proteína de unión de clorofila a/b (CAB) inducible por la luz» descrito también en la solicitud de PCT publicada No. PCT/GB90/00110 por ICI. Se han descrita también promotores inducibles en la solicitud publicada No. EP89/10388T.7 por Ciba-Geigy. En esta solicitud» se identifican varios promotores inducibles» incluyendo los genes para proteína PR» especialmente los genes para proteína PR del tabaco» tales como PR-la» PR-lb» PR-lc» PR-1» PR-A» PR-S» el gen para quitinasa del pepino» y los genes para beta-1 »3-glucanasa acida y básica del tabaco. Existen numerosos inductores potenciales para estos promotores» como se describe en la solicitud No. EP89/103888.7. El promotor puede ser un promotor constitutivo. Un promotor constitutivo es un promotor que funciona en todos» muchos» o varias tipas de células» e incluyen células/ tej i dos críticos para la formación y/a función del polen. Un ejemplo de dicho promotor constitutivo es 35S o preferiblemente HP 101 del CaMV» que han sido aislados de Brassica napus. Las moléculas de ADN recombinante que contienen cualquiera de las secuencias y promotores de ADN descritos en la presente» pueden contener adicionalmente genes marcadores para selección que codifican para un producto genético para selección que confiere» en una célula vegetal» resistencia a un agente químico o factor de estrés fisiológico» o que confiere una característica fenotípica distinguible a las células» de modo que las células vegetales transformadas con la molécula de ADN recombinante» se pueden seleccionar fácilmente usando un agente selectivo. Dicho gen marcador para selección es neomicina fosfotransferasa (NPT ID» que confiere resistencia a la kanamicina y al antibiótico G-418. Se pueden seleccionar células transformadae con este gen marcador para selección realizando pruebas para la presencia» in vitro» de fosforilación de kanamicina usando técnicas descritas en la literatura» o realizando pruebas para la presencia del ARNm que codifica para el gen para NPT II mediante análisis Northern blot en ARN del tejido de la planta transformada. Se puede inducir que las células vegetales transformadas así seleccionadas se diferencien en estructuras vegetales que finalmente produzcan plantas completas. Deberá entenderse que un gen marcador para selección puede ser también nativo para una planta. Una molécula de ADN recombinante que contenga cualquiera de las secuencias y promotores de ADN descritos en la presente» puede ser integrada en el genoma de la planta androestéril o segunda planta» introduciendo primero una molécula de ADN recombinante en una célula vegetal mediante cualquiera de varios métodos conocidos. Preferiblemente» las moléculas de ADN recombinante* se insertan en un vector adecuado» y el vector de utiliza para introducir la molécula de ADN recombinante en una célula vegetal. Se ha sugerido el uso del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Howell» S.H. y otros» 1980» Science 208?l265) y de geminivirus (Goodman» R.M. » 1981» J. Gen Virol. 54?9) como vectores» pero con mucho el mayor éxito reportado ha sido con Aqrobacterium sp. (Horsch» R.B. y otros» 1985» Science 227 ? 1229-1231) . Se han descrito ahora métodos para el uso de Aqrobacte ium con base en sistemas de transformación para muchas especies distintas. Generalmente» se usan cepas de bacterias que alojan las versiones modificadas del plásmido Ti que ocurre naturalmente» de modo que el ADN es transferido a la planta hospedera sin la formación subsecuente de tumores. Estos métodos implican la inserción» dentro de los límites del plásmido Ti» del ADN que va a ser insertado en el genoma de la planta enlazado a un gen marcador para selección para facilitar la selección de las células transformadas. Se cultivan juntas bacterias y tejidos vegetales para permitir la transferencia del ADN introducido en células vegetales» y entonces las plantas transformadas se regeneran en medios selectivos. Cualquier número de órganos y tejidos distintos puede funcionar como objetivos de la transformación mediada por Aqrobacterium» como se describe específicamente para miembros de las Brassicaceae < brasi cáceas ) . Estos incluyen capas delgadas de células (Charest» P.J. y otros» 1988» Theor. APPI . Genet. 75:438-444) » hipocotilos (DeBlock, M. y otros» 1989» Plant Phvsiol. 91?694-701)» discos foliares (Feldman» K.A. y Marks» M.D.» 1986» Plant Sci. 47?63-69)» tallos (Fry J. y otros» 1987» Plant Cell Repts. 6?321-325>» cotiledones (Moloney M. M. y otras» 1989» Plant Cell Repts. 8:238-242) y embroides (Neuhaus» G. y otros» 1987» Theor. APPI. Genet. 75:30-36). Sin embargo» se entiende que puede ser conveniente en algunos cultivos seleccionar un tejido o método de transformación diferente. Puede ser útil generar varias plantas transformadas individuales con alguna construcción recombinante para recuperar plantas libres de algún efecto de posición. También puede ser preferible seleccionar plantas que contengan más de una copia de la molécula de ADN recombinante introducida» de modo que se obtengan altos niveles de expresión de la molécula recombinante. Otros métodos que se han utilizado para introducir moléculas reca binantes en células vegetales implican medios mecánicos» tales como captación directa de ADN» liposomas» electroporación (Guerche» P. y otros» 1987» Plant Science 52:111-116) y icroinyección (Neuhaus» G. y otros» 1987» Theo . APPI. Genet. 75:30-36). También ha recibido atención considerable la posib lidad de usar microproye tiles y una pistola u otras dispositivos para forzar en células pequeñas partículas de metal revestidas con ADN (Klein» T.M. y otros» 1987» Nature 327:70-73). Se contempla en algunas de las modalidades del procedimiento de la invención» que una célula vegetal sea transformada con una molécula de ADN recombinante que contenga por lo menos dos secuencias de ADN» o que sea transformada con más de una molécula de ADN recombinante. Las secuencias de ADN o las moléculas de ADN recombinante en dichas modalidades» pueden estar unidas físicamente estando en el mismo vector» o pueden estar separadas físicamente en diferentes vectores. Una célula puede ser transformada simultáneamente con más de un vector» siempre que cada vector tenga un gen marcador para selección único. Alternativamente» una célula puede ser transformada con más de un vector» permitiendo secuencialmente un paso de regeneración intermedio despuée de la transformación con el primer vector. Además» puede ser posible realizar un cruzamiento sexual entre plantas individuales o líneas de plantas que contengan secuencias de ADN o moléculas de ADN recombinantes diferentes? preferiblemente» las secuencias de ADN o las moléculas recombinantes están enlazadas o localizadas en el mismo cromosoma» por la que se puede seleccionar entonces de la progenie del cruzamiento plantas que contengan secuencias de ADN o moléculas de ADN recombinante. Se puede monitorear la expresión de moléculas de ADN recombinante que contengan las secuencias y promotores de ADN descritos en la presente en células vegetales transformadas» usando técnicas Northern blot y/o técnicas Southern blot conocidas por los expertos en la técnica. Como se indicó anteriormente» puede ser conveniente producir lineas de plantas que sean ho ocigóticas para un gen en particular. En algunas especiee» esto ee logra máe bien fácilmente mediante el uso del cultivo de anteras o el cultivo de microsporas aisladas. Esto es especialmente cierto para el cultivo de semillas oleaginosas Brassica napus (Keller y Armstrong» Z. flanzenzucht 80:100-108» 1978). Mediante el uso de estas técnicas» es posible producir una línea haploide que lleve el gen insertado» y duplicar entonces el número cromosómico espontáneamente o mediante el uso de colchicina. Esto da lugar a una planta que es homocigótica para el gen insertado» la cual puede ser puesta a prueba fácilmente si el gen insertado lleva consigo un gen marcador para selección adecuado para detectar plantas que lleven dicho gen. Altern tivamente» las plantas pueden ser autofecundadas» dando como resultado la producción de una mezcla de semilla que consiste» en el caso más simple» de tres tipos» ho ocigótico (25%) » heterocigótico» (50%) y nulo (25%) para el gen insertado. Aunque es relativamente fácil lograr plantas nulas de aquellas que contienen al gen» es posible en la práctica seleccionar las plantas homocigóticas de las heterocigóticas mediante análisis Southern blat» en cuyo caso se pone atención especial a la carga de cantidades exactamente equivalentes de ADN de la población mixta» y seleccionando los heterocigotos mediante la intensidad de la señal a partir de una sonda específica para el gen insertado. Es aconsejable verificar los resultados del análisis Southern blat» permitiendo que cada transformante independiente se autofecunde» dado que se puede obtener evidencia adicional de homacigocidad por el hecho simple de que si la planta fue homocigótica para el gen insertado» todas las plantas subsecuentes de la semilla autafecundada contendrán al gen» mientras que si la planta fue heterocigótica para dicho gen» la generación obtenida de la semilla autofecundada contendrá plantas nulas. Por lo tanto» utilizando autofecundación simple» es posible seleccionar fácilmente lineas de plantas homocigóticas que también pueden ser confirmadas mediante análisis Southern blot. Se pueden prever varias formas distintas de producir la molécula de hormona específicamente sincronizada con el desarrollo del polen o con la fecundación. En todos los procedimientos» por lo menos un paso en la producción de la molécula de hormona ha ocurrido especifi amente dentro de un tejido involucrado en la polinización y la fecundación en un tiempo poco antes de la misma para inducir a la planta para que continúe con la formación del fruto. Cualquier número de genes se puede usar para llevar a cabo el procedimiento y los métodos de la invención» siempre que la producción simultánea de dos o más actividades enzimáticas o sintéticas específicamente en la planta conduzca a la potenciación de la giberelina sincronizada antes de la fecundación y el desarrollo de la semilla. Esto implica que se puede usar cualquier intermediario en la biosíntesis de giberelina» asi como también enzimas que catalizan estas reacciones o incluso receptores activados por la presencia de giberelina. En todavía atra modalidad» el gen puede ser un oligonucleótido antisentido» el cual interferirá con» y evitará la transcripción de» una enzima que degrade o inhiba a la giberel ina. Como se puede observar» varias combinaciones de genes estructurales y promotores específicoe del desarrollo del polen están contempladas dentro del alcance de la invención. Un sistema sin semilla altamente conveniente» es uno en el cual se desarrolla semilla Fl totalmente fértil» y que se pueda desarrollar en plantas que produzcan sólo frutos sin semilla. Este sistema es económicamente favorable» porque para cada polinización cruzada» se obtiene un gran número de frutos sin semilla: el número de semillas Fl de un cruzamiento X corresponde al número de frutos producidos en una planta Fl . Incorporadas también en este esquema están las ventajas de desarrollar un cultivo híbrido» incluyendo la combinación de características y vigor híbrido más valiosos. Esto se logra de la misma manera como se describió anteriormente» excepto que el gen para hormona se expresa a partir de un promotor inducible o reprimi ble. Esto permitirá la generación de líneas progenitoras que llevarán» pero no expresarán» al gen. El híbrido Fl entre las dos tendrá así también el gen» y despuée de la aplicación de un agente que inducirá la expresión» será par tenocárpico. Con un promotor reprimi ble» los progenitores Fl expresarán el gen» pero este será reprimido en el progen tor femenino usado para la producción de la semilla. El uso de promotores específicos de la temperatura» o promotores suprimibles» también es útil para generar híbridos Fl. La esencia del fenotipo partenocárpico es la expresión de la giberelina cerca o en el momento de la polinización» lo cual debe inducir la señal de que la producción de la semilla ha sido iniciada. La formación de la semilla y el desarrollo temprano de la misma es responsable de la formación del fruto y de la maduración normal del mismo en la pimienta y otras frutos y hortalizas. Otro enfoque es modificar el receptor para GA para aumentar la sensibilidad a los niveles de GA endógena. El producto del gen SPY1 interviene en la transducción de la señal para GA» es decir» un receptor para GA. Se puede usar una combinación de un receptor modificado para GA y promotores específicoe del fruto para modificar el fenotipo del fruto» análogo al uso de genes que dan como resultado mayores niveles de GA bioactiva.

Claims (26)

N0V5PP PE LA INVENCI N REIVINDICACIONES

1.- Una construcción de expresión para la producción de plantas partenocárpicas tranegénicae» caracterizada porque comprende: un gen recombinante que codifica eobre la expresión de una fitohormona» precursor de la misma» o enzima que interviene en la biosíntesis de la misma» en donde dicha hormona promueve la formación y/o el desarrollo del fruto» y un promotor específico del polen enlazado operablemente a dicho gen.

2.- La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 1» caracte izada porque dicha fitohormana es giberelina.

3.- La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 2» caracterizada porque dicha fitohormona es giberelina oxidasa.

4.- La construcción genética de conformidad con la reivindicación 1» caracterizada porque dicho gen es un gen para mazorca y anteras 1.

5.- La construcción genética de conformidad con la reivindicación 1» caracterizada porque dicho gen es un gen para mazorca y anteras 2.

6.- La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 1» caracterizada porque dicha planta es una planta de pimienta.

7.- La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 1» caracterizada porque dicho promotor es un promotor inducible.

8.- Un vector de ácido nucleico» caracterizado porque comprende la construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 1.

9.- El vector de conformidad con la reivindicación 8» caracterizado porque dicho vector es un vector de clonación.

10.- El vector de conformidad con la reivindicación 8» caracterizado porque dicho vector es un vector de expresión.

11.- El vector de conformidad con la reivindicación 8» caracterizado porque comprende además un gen marcador para la selección de células transformadas.

12.- El vector de conformidad con la reivindicación 11» caracterizado porque dicho gen marcador se selecciona del grupo que consiste de un gen para resistencia a ampicilina» un gen para resistencia a tetraciclina y un gen para resistencia a higromicina.

13.- El vector de conformidad con la reivindicación 8» caracterizado porque comprende además una señal de pol iadenilación.

14.- Una célula hospedera pracari?tica o eucariótica, caracterizada porque es transformada con el vector de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7.

15.- Una planta transgénica» caracterizada porque comprende una célula vegetal o un ancestro de dicha célula vegetal» los cuales han sido transformados con el vector de conformidad con la reivindicación 8.

16.- Un fruto partenocárpico producido por una planta que contiene una secuencia de ADN que codifica para un gen recombinante que codifica para una fitohormona que inicia la formación o el desarrollo del fruto» un precursor de dicha hormona» a enzimas que intervienen en la síntesis de dicha hormona» caracterizado porque dicho gen está enlazado operablemente a un promotor específico del polen» de modo que la expresión ocurre antes de la polinización.

17.- Un método para producir frutos partenocárpicos, caracterizado porque comprende: traneformar una célula vegetal de angiosperma con una secuencia de ADN que codifica para una fitohormona que interviene en el inicio de la formación del fruta» a un precursor de dicha hormona o una enzima que interviene en la síntesis de dicha hormona enlazada operablemente a un promotor específico del polen; y generar una planta a partir de dicha célula transformada; en donde dicha planta es partenocárpica y la formación del fruto se inicia sin pol inización.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 17» caracterizado porque dicha planta se selecciona del grupo que consiste de una planta de melón» una planta de pimienta y una planta de tomate.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 17» caracterizado porque dicha secuencia de ADN codifica para giberelina oxidasa.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 19» caracterizado porque dicho promotor se selecciona del grupo que consiste de: un promotor constitutivo» un promotor inducible y un promotor de tejido materno.

21.- Un método para producir una planta partenocárpica híbrida» caracterizado porque dicho método comprende: polinizar una planta pragenitara que ha sido trasformada» o cuyo ancestro ha sido transformado con una secuencia de ADN que codifica para un producto genético para fitohormona enlazado operablemente a un promotor inducible? con una segunda planta pragenitara que ha sido transformada» o cuyo ancestro ha sido transformado con un gen similar» dicha secuencia de ADN enlazada operablemente a un promotor inducible» de modo que después de la aplicación del inductor» la planta será partenocárpica.

22.- Un método para producir frutos y hortalizas partenocárpicos» caracterizado porque comprende? transformar una célula vegetal o un ancestro de la misma con una secuencia de ADN que potenciará la expresión de la giberelina» dicha secuencia siendo regulada por un promotor específico del polen? y generar una planta partenocárpica a partir de dicha célula.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 22» caracterizado porque dicha secuencia de ADN es un gen estructural .

24.- El método de conformidad con la reivindicación 23» caracterizado porque dicho gen es un receptor de giberel ina.

25.- El método de conformidad can la reivindicación 23» caracterizado porque dicho gen codifica sobre la expresión de la giberelina oxidasa.

26.- Un método para producir frutos pa tenacarpicos» caracterizado porque comprende? transformar una célula vegetal de angiosperma con una secuencia de ADN que codifica para una fitohormona que interviene en el inicio de la formación del fruto, o un precursor de dicha hormona o una enzima que interviene en la síntesie de dicha hormona enlazada operablemente a un promotor eepecifico del polen en donde dicha hormona es au ina» y generar una planta a partir de dicha célula transformada; en donde dicha planta es partenocár ica y la formación del fruto se inicia sin polinización. ftSMIN PE INVENCIÓN La invención describe un método transgénico para producir frutos partenocárpi os o frutos con un número reducido de semillas» implica la expresión temporal de una fitohormona» precursor o un gen» de modo que se potencia la actividad de la giberelina u otra actividad hormonal similar que interviene en el inicio de la actividad de formación del fruto; el gen está enlazado operablemente a un promotor regulador» de modo que la expresión es sincronizada antes del desarrollo del polen o la fecundación; la expresión de la hormona causa desarrollo del fruto en ausencia de fecundación; el método da como resultado también un fruto que tiene semillas de tamaño reducido o muy pocas semillas; la invención incluye también construcciones» vectores y métodos transgénicos para la producción de plantas partenocárpi cas . MG/amm*ehp*mmr. P98-1210F.