MXPA98008964A - Polipeptidos procesados con acatividad il-16, procesos para su produccion y su uso - Google Patents
Polipeptidos procesados con acatividad il-16, procesos para su produccion y su usoInfo
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Abstract
Unácido nucleico, el cual puede ser usado para expresar un polipéptido con actividad de interleucina-16 en una célula hospedera procariótica o eucariótica en donde dichoácido nucleico codifica para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEC ID NO:2 o una SEC ID NO:2 N-terminalmente elongada por un residuo deácido aspártico o una forma acertada al C-termino por hasta 8 aminoácido, es conveniente para la producción de un polipéptido IL-16 activo.
Description
POLIPEPTIDOS PROCESADOS CON ACTIVIDAD IL-16, PROCESOS PARA Sü PRODUCCIÓN Y SU USO.
La invención concierne a polipéptidos con actividad IL-16, procesos para su producción y su uso. La invención describe IL-16 procesados con alta actividad.
El IL-16 (interleucina-16) es un linfocito el cual es también referido como factor de quimio atracción o atracción química del linfocito (LCF) o linfocito de supresión del virus de inmunodeficiencia (ISL) . El IL-16 y sus propiedades son descritas en las Patentes WO 94/28134 y WO 96/31607 y por Crui shank, W.W. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113 y por Baier, M. , et al., Nature 378 (1995) 563. La producción recombinante de IL-16 se describe también en estas referencias. De conformidad con este IL-16 es una proteína con una masa molecular de 13,385 D. Cruikshank también encuentra que el LSI eluye en una cromatografía de malla molecular como una forma multimérica con un peso molecular de 50-60 y 55-60 kD. La actividad de quimio atracción o atracción química ha sido atribuida a esta forma multimérica el cual es un homotetrámero catiónico (información del producto AMS Biotechnology Ltd., Europe, Cat. No. 11177186). Se describe
EF.: 28535 por Baier, una forma homodimérica de IL-16 con un peso molecular de 28 kü. Sin embargo, la actividad de quimio atracción o atracción química descrita por Cruikshank et al. en J. Immunol. 146 (1991) 2989-2934 y la actividad del IL-16 recombinante humano descrita por Baire es muy pequeña.
El objeto de la presente invención es mejorar la actividad de IL-lß y proporcionar formas IL-16 las cuales tienen una baja inmunogenidad y son ventajosamente convenientes para una aplicación terapéutica.
El objeto de la invención es alcanzado por un ácido nucleico el cual puede ser usado para expresar un polipéptido con actividad interleucina-16 en una célula hospedera procariótica o eucariótica en donde dicho ácido nucleico
a) corresponde a la secuencia de ADN de SEC. ID NO:l o a un DNA elongado al extremo 5' por un codon de ácido aspártico (GAC) , o a sus hebras complementarias . b) generar hibridación bajo condiciones estringentes con el DNA de la SEC. ID No:l o con un DNA el cual está elongado al extremo 5' por un codon de ácido aspártico. c) o es una secuencia de ácido nucleico la cual podría híbridarse bajo condiciones estringentes con las secuencias de ácido nucleico definidas por a) o b) sin la degeneración del código genético. d) y a los códigos de extremos 5' por una de las secuencias de aminoácidos SEC. ID NO: 7 a 10 o por las secuencias análogas las cuales están elongadas N-terminalmente por un ácido aspártico.
Tal código de ácido nucleico preferiblemente codifica para un polipéptido con la secuencia aminoácido SEC ID NO: 2 o para un polipéptido con una secuencia la cual, comparada con la SEC ID NO: 2, está elongada N-terminalmente por un codon de ácido aspártico. En una modalidad preferida adicional, los códigos de ácido nucleico para un polipéptido con actividad IL-16 se acortan con hasta 8 aminoácidos al término C.
El código de ácido nucleico para un polipéptido procesado con actividad IL-16, particular y preferiblemente IL-16 natural de primates tales como IL-16 humano o IL-16 de una especie de mono o de otro mamífero tal como el ratón.
Se ha encontrado sorprendentemente que la Figura 2 de la Patente WO 94/28134 no describe el IL-16 correctamente procesado. El codon inicial "ATG" de la forma precursora de la proteína no está con el nucleótido 783 sino preferentemente con los nucleótidos 54 o 174. Esta estructura lectora resulta cuando un A se inserta después del nucleótido 156, un C se inserta después del nucleótido 398 y un G se inserta después del nucleótido 780. Las secuencias también muestran diferencias adicionales a la Figura 2 de la Patente WO 94/28134. Estos son por ejemplo, substituciones de nucleótidos (313 G en A, 717 C en A) . La IL-16 es procesada durante la expresión en las células eucarióticas. De esta forma, un polipéptido de conformidad con la SEC ID NO: 2 y/o un polipéptido con una secuencia que es N-terminalmente elongada se compara a la SEC ID NO: 2 por un codón de ácido aspártico. El conocimiento de los IL-16 procesados incrementa la producción de IL-16 y sus derivados con alta actividad y baja inmunodeficiencia.
La secuencia de IL-16 puede diferir por una cierta extensión de las secuencias de proteínas codificadas por tales secuencias de ADN. Tales variaciones de secuencias pueden ser substituciones de amino ácidos, eliminaciones o adiciones. Sin embargo, la secuencia de aminoácidos de IL-16 es preferiblemente al menos 75% y particularmente preferiblemente al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2. Las variantes de las partes del amino y de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:l/SEC ID NO: 2 están por ejemplo descritas en la Patente WO 96/31607 y en las Solicitudes de Patente Internacional PCT/EP96/05662 y PCT/EP96/05661. Sin embargo, es esencial que los polipéptidos tengan un N-término correcto. Consecuentemente, las proteínas son preferidas en la cual los primeros tres a diez aminoácidos del N-término no están cambiados o están sin cambios y además están N-terminalmente con las secuencias de aminoácidos SEC ID NO: 6 a 8 o con secuencias análogas las cuales están extendidas N-terminalmente por un residuo de ácido aspártico. Las proteínas también preferidas son las cuales se acortan al C-término por hasta 8 aminoácidos.
Los ácidos nucleicos dentro del sentido de 'la invención están sobreentendidos por ejemplo con DNA, RNA y derivados y análogos del ácido nucleico. Los análogos de ácido nucleico preferidos son aquellos compuestos en los cuales la columna principal de fosfato de azúcar está reemplazada por otras unidades tales como por ejemplo aminoácidos. Tales compuestos son preferidos como PNA y son descritos en la Patente WO 92/20702. Puesto que los enlaces PNA-DNA son por ejemplo más fuertes que los enlaces üNA-DNA, las condiciones estringentes descritas arriba no son aplicables para ia hibridación PNA-DNA. Sin embargo, las condiciones de hibridación adecuadas están descritas en la Patente WO 92/20703.
El término "IL-16" se entiende dentro del sentido de la invención como un polipéptido con la actividad de IL-16. El IL-16 exhibe preferiblemente la acción establecida en el procedimiento de prueba descrito en la Patente WO 96/31607 o estimula la división celular de conformidad con el documento WO 94/28134.
IL-16 enlaza a los linfocitos CD4+ y puede suprimir la replicación de los virus tales como por ejemplo el HIV-1, HIV-2 y SIV. La función del IL-16 no está limitada por su presentación en el complejo MHC.
En particular, el IL-16 exhibe una o varias de las siguientes propiedades:
- enlazando a las células T vía el receptor CD4 - la estimulación de la expresión del receptor de IL-2 y/o el antigen HLA-DR en los linfocitos CD+4, la estimulación de la proliferación de células ayudantes o asistentes T en la presencia de IL-2, - la supresión de la proliferación de las células T ayudantes o asistentes con anticuerpos anti- CD3 - la supresión de la replicación de los virus preferiblemente de HIV-1, HIV-2 o SIV.
Los ácidos nucleicos preferidos son aquellos que generan híbridos con ácidos nucleicos de la SEC ID N0:1 bajo condiciones estringentes. El término "generar híbridos bajo condiciones estringentes" sugiere que dos fragmentos de ácido nucleico generen híbridos con otros bajo condiciones de hibridación estandarizadas como se describe por ejemplo en Sa brook et al., "Expresión de genes clonados en E.coli" en Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Tales condiciones son por ejemplo hibridación en 6.0 x SSC a aproximadamente 45°C seguido por una etapa de lavado con 2 x SSC a 50°C. A fin de seleccionar la estringencia la concentración de la sal en la etapa de lavado puede por ejemplo ser elegida o seleccionada entre 2.0 x SSC a 50°C para baja estringencia y 0.2 x SSC a 50°C para alta estringencia. Además, la temperatura de la etapa de lavado se puede variar entre la temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, para baja estringencia y 65°C para alta estringencia.
El IL-16 es preferiblemente recombinantemente producido en células hospederas procarióticas o eucarióticas. Tales procesos de producción son descritos por ejemplo en la Patentes WO 94/28134 y WO 96/31607 los cuales son también para este propósito un tema de la descripción de la presente invención. Sin embargo, a fin de obtener las formas de conformidad con la invención de IL-lß por la producción recombinante en una manera definida y reproducible, se han tomado medidas adicionales más allá de los procedimientos para la producción recombinante, familiar para un experto en la técnica.
El recombinante IL-16 puede ser producido por métodos familiares por un experto en la técnica como expresión heteróloga o como una expresión homologa (después de la recombinación homologa del ácido nucleico IL-16 en el genoma del organismo hospedero) . Para esto un DNA es producido primeramente, el cual es capaz de producir una proteína la cual tienen la actividad de IL-16. El DNA es clonado en un vector el cual puede ser transferido en una célula hospedera y puede ser replicado allí. Tal vector contiene elementos reguladores adicionales a la secuencia 1L-16 las cuales son necesarias para la expresión de la secuencia de ADN. Este vector el cual contiene ia secuencia IL-16 y los elementos reguladores es transferido en un vector el cual es capaz de expresar el DNA de IL-16. La célula hospedera es cultivada bajo condiciones las cuales son convenientes para la amplificación del vector y entonces aislar el IL-16. En este proceso las medidas adecuadas permiten que la proteína pueda adoptar una estructura terciaria activa en la cual exhiba las propiedades IL-16.
La secuencia de ácido nucleico de la proteína puede también ser modificada. Tales modificaciones son por ejemplo:
- modificación del ácido nucleico a fin de introducir varias secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción para facilitar las etapas de ligación, clonación y mutagénesis.
- modificación del ácido nucleico para incorporar los codones preferidos para la célula hospedera
- extensión del ácido nucleico por los elementos operadores adicionales a fin de optimizar la expresión en la célula hospedera.
La proteína se expresa preferiblemente en microorganismos en particular en procariotas y en este caso en E. Coli. La expresión en procariotas produce un polipéptido no glicosilado.
Los vectores de expresión podrán contener un promotor el cual permite la expresión de la proteína en el organismo hospedero. Tales promotores son conocidos por un experto en la técnica y son por ejemplo el promotor lac (Chang et al., Nature 198 (1977) 1056), promotor trp (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (19'80) 4057), promotor ?PL (Shimatake et al., Nature 292 (1981) 128) y promotor T5 (Patente Norteamericana No. 4,689,406), Los promotores sintéticos tales como por ejemplo el promotor tac (Patente Norteamericana No, 4, 551,433) son también adecuados. Los sistemas promotores en pares o acoplados son igualmente convenientes como por ejemplo la polimerasa T7-RNA/sistema promotor (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113). Son convenientes también los promotores híbridos compuestos de un promotor bacteriófago y la región operadora del microorganismo (EP-A 0 267 851) . Un sitio efectivo enlazante del ribosoma es necesario en adición al promotor. En el caso de E. Coli este sitio enlazante de ribosoma es referido como la secuencia Shine-üalgarno (Sü) (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. Coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA) .
A fin de mejorar la expresión, es posible expresar la proteína como una proteína de fusión. En este caso, una secuencia de DNA la cual codifica la parte N-terminal de una proteína bacterial endógena o de otra proteína estable está fusionada usualmente al extremo 5 de la secuencia codificante para IL-16. Ejemplos de estos son por ejemplo lacZ (Phillips y Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884), trpE (Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990) 161-166) .
Después de la expresión del vector el cual es preferiblemente un plasmidio biológicamente funcional o un vector viral, las proteínas de fusión están desdobladas preferiblemente con enzimas (por ejemplo factor Xa) (Nagai et al., Nature 309 (1984) 810). Ejemplos adicionales de los sitios de desdoblamiento son los sitios de desdoblamiento de la proteasa IgA (WO 91/11520, EP-A o 495 398), el sitio de desdoblamiento ubicuo (Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698) y el sitio de desdoblamiento de la enterocinasa.
Las proteínas expresadas de esta manera en la bacteria son obtenidas de la manera usual por la disrupción o el rompimiento disyuntivo de la bacteria y el aislamiento de la proteína.
En una modalidad adicional es posible secretar las proteínas a partir de los microorganismos como proteínas activas. Para esto un producto de fusión es usado preferiblemente el cual se compone de la señal de secuencia que es conveniente para la secreción de las proteínas en los organismos hospederos usados y del ácido nucleico que codifica a la proteína. En este caso la proteína está ya sea secretada en el medio (en una bacteria gram positiva) o en el espacio periplasmático (en una bacteria gram negativa) . Es oportuno insertar un sitio de desdoblamiento entre la secuencia de señal y la secuencia que codifica para el IL-16 el cual permite el desdoblamiento de la proteína ya sea durante el procesamiento o en una etapa adicional. Tales secuencias de señales se derivan a partir de por ejemplo ompA (Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437), phoA (Oka et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7212).
Los vectores adicionalmente contienen terminadores. Los terminadores son secuencias DNA que señalan el final de un proceso de transcripción. Están usualmente caracterizados por dos características estructurales: una región rica en C/G reversiblemente repetitiva la cual puede formar una doble hélice intramolecularmente así también como un número de residuos U (o T) . Los ejemplos son los terminadores principales en el DNA de las fases fd (Beck y Zink, Gene 16 (1981) 35-38) y rrnB (Brosius et al., J. Mol. Biol. 148 (1981) 107-127).
Además de los vectores de expresión, usualmente contienen un marcador selectivo a fin de seleccionar las células transformadas. Tales marcadores selectivos son por ejemplo, los genes de resistencia para ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, canamicina, neomicina y tetraciclina (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469) . Los marcadores selectivos los cuales son igualmente convenientes son los genes para las substancias esenciales para la biosíntesis de substancias necesarias para la célula tales como por ejemplo, histidina, triptofano y leucina.
Se conocen numerosos vectores bacteriales convenientes. Los vectores por ejemplo, han sido descritos para las siguientes bacterias: Bacillus subtilis (Palva et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582), E. coli (Aman et al., Gene 40 (1985) 183); Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113), Streptococus cremoris (Powell et al., App. Environ. Microbiol. 54 (988) 655), Streptococus lividans y Streptomyces lividans (Patente Norteamericana No. 4,747,056) .
Los métodos de ingeniería genética adicionales para la producción y la expresión de vectores convenientes se describen en J. Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, N.Y.
En adición a los microorganismos procarióticos, es posible también expresar el IL-16 recombinante en eucariotas (tales como por ejemplo células CHO, levaduras o células de insecto) . Se prefieren los sistemas de levaduras o células de insectos como un sistema de expresión eucariótica. La expresión en las levaduras puede ser realizada por medio de tres tipos de vectores de levaduras: (vectores YIP integrantes (plasmidios integrantes de las levaduras), vectores replicantes YRP (plasmidios de replicación de la levadura) y vectores YEP episomales (plasmidios episomales de levaduras) . Más detalles de estos se describen en por ejemplo S.M. Kingsman et al. Tibtech 5 (1987) 53-57.
La invención además concierne a una célula hospedera procariótica o eucariótica la cual es transformada o transfectada con un ácido nucleico el cual codifica para un polipéptido IL-16 de conformidad con la invención en una forma tal que la célula hospedera exprese al polipéptido. Tal célula hospedera usualmente contiene un vector de ácido nucleico biológicamente funcional, preferiblemente un vector de DNA, un plasmidio DNA, el cual contiene este ácido nucleico.
Se prefiere adicionalmente un polipéptido IL-16 monomérico el cual no puede ser desdoblado en subunidades adicionales.
Se ha encontrado sorprendentemente que el ácido nucleico y la secuencia de proteína de IL-16 descrita en la patente WO 94 /28134 no corresponde a las secuencias humanas naturales. Se sabe, que en estos es un análogo IL-16 no natural. Sin embargo, una proteína preferiblemente usada para una aplicación terapéutica la cual cualquiera idéntica a la proteína natural o solamente difiere ligeramente de la proteína natural y al menos exhibe actividad e inmunogenidad comparable. La secuencia de la proteína se describe en la SEC ID NO: 2 (opcionaimente con la elongación N-terminal por un residuo de ácido aspártico y/ el acortamiento al C-término por hasta 8 aminoácidos) .
La secuencia de ácido nucleico de IL-16, puede, dentro del ámbito de la invención contener supresiones, mutaciones y adiciones. La forma monomérica de IL-16 puede ser multimerizada en una modalidad preferida. La actividad del IL-16 se puede incrementar de esta manera. Tales formas multiméricas son preferiblemente formas diméricas, tetraméricas u octaméricas.
En una modalidad adicional los polipéptidos de la invención pueden adicionalmente contener una cantidad definida de iones de metales, el número de iones de metales por subunidades son preferiblemente de 0.5 a 2.
Los numerosos iones de metal son convenientes como iones de metal dentro del sentido de la invención. Se ha encontrado que los metales alcalino férreos así también como los elementos de los grupos laterales son convenientes. Los metales alcalino férreos, cobalto, zinc, selenio, manganeso, níquel, cobre, hierro, magnesio, calcio, molibdeno y plata son particularmente convenientes. Los iones pueden ser monovalentes, divalentes, trivalentes o tetravalentes. Los iones divaientes son particularmente preferidos. Los iones se añaden preferiblemente como soluciones de MgCl2, CaCl2, MnCl2, BaCl2, LiCl2, Sr(N03)2, Na2Mo04, AgCl2.
Tales formas multiméricas y formas de IL-16 que contienen iones de metal se describen en la Solicitud de Patente Internacional PCT/EP96/05661.
El polipéptido de conformidad con la invención puede ser producido por el cultivo de células hospederas eucarióticas o procarióticas, las cuales han sido transformadas o transfectadas con una secuencia de ácido nucleico como se reivindicó en las reivindicaciones 1 o 2 bajo las condiciones de nutrientes adecuadas y opcionalmente aisladas al polipéptido deseado. Si se intenta producir el polipéptido in vivo en el contexto de un tratamiento de terapia de gen, el polipéptido no está por supuesto, aislado de la célula.
Un tema adicional de la invención es una composición farmacéutica la cual contiene un polipéptido de conformidad con la invención en una cantidad y/o actividad específica la cual es suficiente para una aplicación terapéutica así también como opcionalmente un diluyente adyuvante y/o portador farmacéuticamente conveniente.
Los polipéptidos de conformidad con la invención son especialmente convenientes para el tratamiento de los estados patológicos los cuales son causados por replicación viral, en particular por replicación retroviral y por in unomodulación. Tales aplicaciones terapéuticas están también descritas en la Patente WO 96/31607. Esta también describe el diagnóstico de los procedimientos de prueba.
Los polipéptidos de conformidad con la invención pueden también ser usados preferiblemente para inmunosupresión. Esta inmunosupresión es preferiblemente alcanzada o realizada por una inhibición de la función asistente o ayudante de las células TH0 y/o TKi y/o TH2. Puesto que los polipéptidos de conformidad con la invención son de valor terapéutico en todos los padecimiento en los cuales, un componente inmunodesregulador es postulado en la patogénesis y en particular una hiperinmunidad. Los padecimientos pueden ser tratados por IL-16 en cardiología/angiología son por ejemplo padecimientos tales como miocarditis, endocarditis y pericarditis, en pulmonología por ejemplo bronquitis, asma, en hematologías neuropenias autoinmunes y en rechazo de transplantes, en gastroenterología de gastritis crónica, en endocrinología de diabetes melitus tipo I, en nefrología glomerulonefritis, padecimientos reumáticos, padecimientos en oftalmología, en neurología tales como esclerosis múltiples y eczemas en dermatología. Los polipéptidos de conformidad con la invención pueden ser usados en particular para padecimientos autoinmunes, alergias y para evitar rechazos de transplantes.
La invención además concierne al uso de los ácidos nucleicos de conformidad con la invención dentro del contexto de terapia de gen, Los sistemas de vector retroviral o no viral son por ejemplo sistemas de vectores convenientes para estos.
En adición a la invención se concierne un anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal anti-IL-16 o un fragmento inmunoactivo del mismo el cual enlaza a los primeros 3-20 aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o a la SEC ID NO: 2 N-terminalmente elongado por un residuo de ácido aspártico, así también como a los procesos para la producción de tales anticuerpos y a su uso para la determinación de IL-16 y para la determinación de infecciones virales en células eucarióticas y en particular en material de células de mamíferos. Las células de mamíferos de virus activados en particular con células T pueden también ser determinadas con IL-16. La producción de tales anticuerpos se realiza por inmunización con un polipéptido de conformidad con la invención. La producción de tal anticuerpo se realiza de conformidad con los procedimientos familiares por un experto en la técnica por inmunización con un inmunogen el cual contiene los primeros 3-20 aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o una SEC ID NO: 2 N-terminalmente elongada por un residuo de ácido aspártico como el hapteno. Subsecuentemente el anticuerpo puede ser aislado de una manera usual a partir del mamífero inmunizado y opcionalmente puede ser producido un anticuerpo monoclonal.
Los siguientes ejemplos y publicaciones así también como el protocolo de la secuencia aclaran además el ámbito protector de la invención el cual resulta a partir de las reivindicaciones de patente. Los procedimientos descritos están así bien entendidos como los ejemplos que aún describen el objeto de la invención aún después de las modificaciones.
EJEMPLO 1 Clonación, expresión y purificación de IL-16
1.1 Aislamiento de RNA Se cultivaron 5 x 107 PMBC (de humanos o changos) por 48 horas con 10 µg/ml de concanavalina A y 180 U/ml de IL-2. A fin de preparar el RNA, las células se lavaron una vez con PBS y subsecuentemente la lisis o disolución de las células con 5 mi de solución de desnaturalización (equipo de aislamiento de RNA, estratagen) . El lisiado o disolución de las células se mantuvo en hielo por 15 minutos después de la adición de lml de acetato de NA, 5 mi de fenol y 1 mi de cloroformo/alcohol de isoamilo (24:1). La fase acuosa se mezcló subsecuentemente con 6 mi de isopropanol a fin de precipitar el RNA y se almacenó por 2 horas a -20°C. El precipitado se lavó finalmente una vez con etanol puro y se disolvió en 150 µl de H20. El rendimiento se determinó fotométricamente y fue de 120 µg.
1.2 Sintesis de cDNA La mezcla para la síntesis de cDNA contenía 10 µg de RNA, 0.2 de µg de oligo-dT, 13 mM de DTT y 5 µl de volumen de la primera hebra de la mezcla de reacción (equipo de síntesis de cDNA de la primera hebra, Pharmacia) en una cantidad de 15 µl. La mezcla se incubó por 1 hora a 37°C y se almacenó subsecuentemente a -20°C para uso posterior.
La amplificación, clonación de cDN IL-16 y producción de un clon de expresión se llevó a cabo o realizó como se describe en la Patente WO 94/28134 o WO
96/31607 tomando en consideración las secuencias modificadas .
1.3 10 1 fermentación de un clon de expresión de E. Coli para IL-16 y disrupción o rompimiento disyuntivo de alta presión
Los precultivos se tomaron a partir de pilas de cultivos (substancia untada en una placa o ámpulas almacenadas a -20°C) los cuales son incubados a 37°C mientras se sacuden. El volumen de inoculación en las siguientes dimensiones superiores es de 1-10 % de volumen en cada caso) . La ampicilina (50-100 mg/l) es usada en el precultivo y cultivo principal para la selección contra menos plasmidio.
Las proteínas digeridas enzimáticamente y/o extractos de levaduras como una fuente N y C así también como el glicerol y/o ia glucosa como una fuente C adicional son usadas como nutrientes. El medio es amortiguado a pH 7 y las sales de metal son agregadas a concentraciones fisiológicamente toleradas para estabilizar el proceso de fermentación. La fermentación se lleva a cabo como un alimentador batch con un extracto de levadura mezclado/dosificaciones de fuentes C. La temperatura de fermentación es de 25-37°C. La presión de oxígeno disuelta parcialmente (p02) se mantiene aproximadamente por debajo de 20% por medio de la proporción de aireación, r.p.m, regulación y proporción de las dosificaciones. El crecimiento se determina por la determinación de la densidad óptica (OD) a 528 nm. La expresión del IL-16 se induce por medio de IPTG. Después de un periodo de fermentación de 10 a 20 horas la biomasa es cosechada o recolectada por centrifugación a OD aún detenidas.
La biomasa es tomada hasta en 50 mM de fosfato de sodio, 5 mM de EDTA, 100 mM de NaCl, pH 7 y se disrumpe o tiene rompimiento disyuntivo a 1000 bar por medio de una presión continua a alta presión. La suspensión obtenida de esta manera, es centrifugada nuevamente y el sobrenadante el cual contiene el IL-16 es procesado adicionalmente.
1.4 Purificación del IL-16 recombinante humano 550 mi del sobrenadante de la lisis o disolución de la célula en 50 mM de fosfato de sodio, 5 mM de EDTA, 100 mM de NaCl, pH 7.2 se mezclan con 55 mi de NaCl 5 M, 60 mM MgCl2, pH 8.0, agitada por 30 minutos y centrifugada subsecuentemente por 30 minutos a 20,000 g. Se toman 400 mi del sobrenadante en una columna de Sefarosa de quelato de níquel (V = 60 mi; Pharmacia) , el cual ha sido previamente cargado con 30 µMol de NiCl2/ml de gel y equilibrado con 50 mM de fosfato de sodio, 0.2M de NaCl, pH 8.0. La columna se lava subsecuentemente con 300 mi de fosfato de sodio 50 mM, NaCl 0.5 M, pH 7.0 y la proteína de fusión IL-16 luego se eluye con un gradiente de 0 M a 300 mM de imidazol , pH 7.0 en 50 mM de fosfato de sodio, NaCl 0.1 M, pH 7.0
(volúmenes de 2 x 0.5 1 gradientes). Las fracciones que contienen IL-16 se identificaron por medio de SDS-PAGE, vertidas y dializadas contra 20 mM de fosfato de sodio, pH 7.0.
Se dializaron o disolvieron 300 mg de la proteína de fusión obtenida de esta forma, a 4°C contra 20 1 de imidazol 20 mM, pH 5.5 y centrifugada subsecuentemente por 30 minutos a 20,000 g a fin de eliminar turbosidades. El sobrenadante de la centrifugación subsecuentemente se ajustó a pH 8.5 con NaOH, mezclado con 0.3 mg de trombina
(Boehringer Mannheim GmbH) e incubado por 4 horas a 37°C.
Subsecuentemente la mezcla desdoblada se ajustó a pll 6.5 con HCl y la conductividad de colocó a 1.7 S por dilución con H20. Las muestras se aplicaron a una columna FF de Q- Sefarosa (45 mi; Pharmacia) la cual ha sido previamente equilibrada con 20 M de i idazol, pH 6.5. El IL-16 se identificó por medio de SDS-PAGE y se vertió. La identidad de IL-16 se confirmó por medio de análisis de masas (peso molecular 13,566 ± 3D) y análisis automatizado de la secuencia N-terminal. La absorción de UV de IL-16 a 280 nm y un coeficiente de extinción molar calculado de 5540 M"1 c "1 a su longitud de onda (Mack et al. (1992) Analyt. Biochem. 200, 74-80) se usaron para determinar la concentración.
A fin de obtener el N-termino deseado este se re-desdobla opcionalmente con una aminopeptidasa (por ejemplo hidrolasa de a-aminoacilo peptido) o dipeptidilo peptidasa (por ejemplo catpsina CCATH) .
EL IL-16 obtenido de esta manera, tiene una pureza de más de 95% en SDS-PAGE bajo condiciones reducidas.
Se usó una columna 4 x 180 mm de Vidac, Proteína & Petptido C18, para analizar la pureza por medio de RP-HPLC. Se eluyó con un gradiente linear de 0% a 80% B (solvente B:90% de acetonitrilo en 0.1 % de TFA; solvente A: 0.1% TFA en H20) dentro de 30 minutos a una proporción de flujo de 1 ml/min. La detección fue a 220 nm.
Ejemplo 2 Producción de IL-16 acortado usando un sitio de desdoblamiento de enterocinasa
2.1 Clon de expresión La amplificación y clonación de cDNA IL-16 y la preparación de un clon de expresión se realizaron como se describe en las Patentes WO 94/28134 o WO 96/31607 tomando en cuenta las secuencias modificadas.
Un oligonucleótido que tiene la secuencia SEC ID NO:3 se usa como un primer principio el cual contiene el sitio EcoRI, 6 His y un sitio de desdoblamiento de enterocinasa (D4K) : cccqaattc tatg cat cae cae cae cae cae qatqacqac acaaa-tctqcaqcctcaqcctctqc
EcoRI H6 D4K
Un oligonucleótido que tiene la secuencia
SEC ID NO: 6 el cual también contiene un sitio EcoRi, 6His y un sitio de desdoblamiento de enterocinasa (D4K) es usado como un primer principio para la secuencia elongada al extremo 5 por un codon de ácido aspártico: cccgaattc tatg cat cae cae cae cae cae gatgacqac acaaa-tctqcaqccteaqcctctqc
EcoRI H6 D4K
Cualquiera de los oligonucleótidos IL-16-R? (SEC ID NO: 4) : IL-16-Rj.: gcg gat cea age tta gga gtc tec age age tgt g
o los oligonucleótidos IL-16-R2 (SEC ID NO:5) son usados como los primeros reversos : IL-16-R2: gcg gat cea age tta ttc ctt gga ctg gag gct ttt te
Los dos primeros reversos contienen sitios de desdoblamiento BamHI y HindIII para clonación.
Se obtiene una secuencia con IL-16-R?, la cual codifica para una proteína de conformidad con la
SEC ID NO:2.
Se obtiene una secuencia con IL-I6-R1 la cual codifica para un IL-16 acortado por 8 aminoácidos al C-termino. Este C-termino IL-16 es también activo.
La reacción PCR, clonación y preparación del clon de expresión (proteína de fusión con una parte N-terminal poly-His para purificación) se llevan a cabo de conformidad a las condiciones estándares:
una mezcla de 0.2 mM dNTP, 1 mol/µl cada uno de los primeros inicios y reversos, amortiguador 1 x alta fidelidad (Boehringer Mannheim, D) , 1.5 Mm MgCl2, 2.6 U de mezcla de enzima de alta fidelidad (Boehringer Mannheim, D).
µl de volumen final instrumento: Perkin Elmer GeneAmp 9600
Curso de la reacción: 3 minutos 94°C, 1 min 56°C, 2 min 72°C, luego 25 ciclos (20 sec 94°C, 20 sec 56°C, 1 min 72°C) .
2.2 Fermentación La fermentación se lleva a cabo análogamente al ejemplo 1.3.
2.3 Puri icación y desdoblamiento. Se mezclaron 700 ML de lisis del sobrenadante en 50 mM de fosfato de sodio 5 nM de EDTA, 100 mM de NaCl, pH 7.2, con 70 mi 5 M de NaCl, MgCl2 60 mM, pH 8.0, agitados por 30 minutos y centrifugados subsecuentemente por 30 minutos a 20,000 g. El sobrenadante centrifugado se aplico a una columna de quelato de níquel (V = 200 mi, Pharmacia) el cual ha sido previamente cargado con una solución de NiS04 (c= 10 mg/ml) y equilibrado con fosfato de sodio 50 mM, NaCl 0.5 M, pH. 8.0. La columna se lavó subsecuentemente con equilibrio del amortiguador hasta la base de la línea (detección de UV a 280 nm) alcanzándose más. Después o posteriormente la columna se enjuagó con 1 1 de fosfato de sodio 50 mM, NaCl 0.5 M, pH 7.0 y con 1 1 de fosfato de sodio 50 mM, NaCl 1 M, pH 7.0. La proteína de fusión se eluyó con un gradiente de 0 - 300 mM de imidazol, pH 7.0 en una solución de fosfato de sodio 50 mM, NaCl 0.1 M, pH 7.0 (1 1 2 x 1.6=. Las fracciones que contienen IL-16 se identificaron por medio de SDS-PAGE y se vertieron. Este IL-16 vertido se concentró en un Provario (Filtron, membrana omega 5K) a una concentración de 5 mg proteína/ml y dializado contra 50 M de Tris, pH 8.0.
Un equivalente del vertido que contenía 100 mg de la proteína de fusión se diluyó con 50 mM de Tris, pH 8.0 a una concentración de proteína de c = 1 mg/ml para el desdoblamiento de la enterocinasa. Después de la adición de 33 µg de enterocinasa (Boehringer Mannheim; 1 : 3000 p/p) la mezcla desdoblada se incubó durante la noche (14 horas) a 37°C. Subsecuentemente, el valor de pH se ajustó a pH 6.5 con HCl. El IL-16 sin desdoblar se eliminó por la agitación en 20 mi de sefarosa de quelato de níquel (para la preparación ver arriba; tiempo de enlazado 2 horas) y centrifugación subsecuente (10,000 g) o por filtración por succión del sobrenadante sobre un filtro derretido. La identidad del IL-16 desdoblado contenido en el sobrenadante se confirmo por la secuencia N-terminal y el análisis de masas. La pureza se verificó por SDS-PAGE y EP-HPLC (Vidac, difenil, 4.6 x 150 mm, gradiente lineal de 20% a 95% B en 45 minutos; solución A: 20 mM fosfato de potasio en H20, pH 7.5; solución B: 100% de acetonitrilo.
Ejemplo 3 Desdoblamiento del IL-16 recombinante con células diluidas mediante lisis .
3.1 Separación de linfocitos CD8+ y CD4+ via MACS
Los linfocitos aislados de una cubierta lisa por medio de gradientes Ficoll son resuspendidas en 500 µl de PBS-azida/células 1 x 108 (salina amortiguada con fosfato sin Ca2+ y Mg2+, 0.01% de azida de sodio, 5 mM de EDTA, pH 7.2). Después de la adición de 20 mi de microcamas CD8/células 1 x 107 esperadas (anticuerpos de ratones antihumanos CD8, conjugados con partículas magnéticas, Miltenyi Biotec GmbH), son incubadas por 15 minutos a 4°C. 2 mg de DTAF/1 x 107 de células esperadas (anti-raton IgG FITC conjugado, Dianova Company) se añaden por 5 minutos más a 4°C. Después de la dilución con 25 mi de PBS-azida/1% de BSA nuevamente se centrifuga (10 min, 1200 rpm, 4°C) . El sobrenadante es descargado, las células son resuspendidas en 2 mi de PBS/1% de BSA y la suspención de las células se aplica a una columna la cual se localiza en un separador magnético (Miltenyi Biotec GmbH) . Las células CD8+ a las cuales las microcamas CD8 son acopladas, están retenidas en la columna, además, la fracción del flujo contiene todos los linfocitos (aproximadamente 80% de células CD4+) excepto las células CD8+. Después del lavado la columna se toma del agujero y la fracción de la célula CD8+ se eluye con PBS-azida/1% de BSA. La fracción del flujo y la fracción de la célula CD8+ son centrifugadas, resuspendidas en un medio de cultivo celular (RPMI 1649, 20% FCS, 2 mM de glutamina, 180 U/ml de IL-2), el conteo de célula se ajusta a 3 x 106 células/ml y las células son estimuladas con PHA (9 mg/ml). La calidad de la separación de la subpoblación del linfocito es verificada por medio de FACS.
3.2 Preparación de lisis o dilución de células y digestión de IL-16
Los linfocitos 1 x 108 CD8+ los cuales han sido estimulados por tres días con PHA son lisiados o diluidos por 10 minutos en hielo en 2 mi de PBS el cual es mezclado con 1% de Tritón x 100. Luego, los restos de células y núcleos celulares son eliminados por centrifugación. 45 µl de la célula de disolución o lisis obtenida de esta manera se incuba por 16 horas a temperatura ambiente con 10 µg de IL-16 recombinante el cual es expresado ya sea al extremo amino-terminal o carboxi-terminal en fusión con un objetivo o blanco de histidina (blanco HIS, por ejemplo seis histidinas con sitios de desdoblamiento del ejemplo de la Patente WO 94/28134). Luego los fragmentos llevados del objetivo HiS son purificados con el auxilio de una matriz de agarosa de níquel. Después de ia purificación adicional de los fragmentos que son formados en el HPLC, las masas de los fragmentos son determinadas por la espectografía de masas y con ello se determina el tamaño del fragmento N-terminal. De esta manera, un fragmento IL-16 procesado naturalmente identificado es el que inicia con el N-término descrito en la SEC ID NO: 1/2 o con un N-término elongado por un codon de ácido aspártico.
Lista de Referencias
Aman et al., Gene 40 (1985) 183 Baier, M., et al., Nature 378 (1995) 563 Beck y Zinck, Gene 16 (1981) 35-58 Brosius et al., .J. Mol. Biol. 148 (1981) 107-127 Chang et al., Nature 198 (1977) 1056 Cruikshank, W.W., et al., J. Immunol. 146 (1991) 2928-2934
Cruikshank, W.W., et a., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91
(1994) 5109-5113 Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469 EP-A 0 267 851 EP-A O 495 398 European Patent Application No. 95 113 013.7 Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437 Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057 International Patent Application PCT/EP96/05661 International Patent Application PCT/EP96/05662 Kingsman, S.M., et al, Tibtech 5 (1987) 53-57 Mack et al., Analyt. Biochem. 200 (1992) 74-80 Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698 Nagai et al., Nature 309 (1984) 810 Oka et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7212 Palva et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582 Phillips y Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884 Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 655 Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli' in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA Shimatake et al., Nature 292 (1981) 128 Studier et al., J. Mol. Bio. 189 (1986) 113 US-Patent No. 4,551,433 US-Patent No. 4,689,406 US-Patent No. 4,747,056 WO 91/11520 WO 92/20702 WO 92/20703 Yansura, Meth, Enzymol. 18b (1990) 191-166
LISTADO DE SECUENCIAS
fl) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE (A) NOMBRE: República Federal de Alemania, representada por ei ministerio desaiud (B) DIRECC. - (C) CIUDAD: Bonn (E) PAÍS: Alemania (F) CÓDIGO POSTAL (2IP) ; D-53108 (A) OMBRE: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH ( )DIRECC: Sand ofer Str. 116 (C) CIUDAD: Mannheim (E* PAÍS: Alemania (F> CÓDIGO POSTAL (ZIP) : D-68305 (G) TELEFONO: 08856/60-3446 (H) TELEFAX: 08856/60-3451 ( ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Polipéptidos procesados con actividad IL-16, procesos para su producción y su uso. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS : 10 (lv) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA (A) TIPO DE MEDIO: Disco Duro ( Bj COMPUTADORA- IBM pC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Fatentln Reléase #1.0 , Versión #1.30B (EPO)
(vi) FECHA DE SOLICITUD PREVIA: (A) NUMERO DE SOLICITUD: DE 196 17 202.0 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN 30-A BR""1996 (v:¡_) FECHA DE SOLICITUD PREVIA: (A) NUMERO DE SOLICITUD: DE 196 17 203.9 (B)FECHA DE PRESENTACI0N 30-ABR-1996
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 366 pares de bases (B) TIPO: nucleotid O (C) TIPO DE HEBRA: Doble hebra r (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDMA (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1. . 366
(XÍ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 : TCT GCA GCC TCA GCC TCT GCA GCC AGT GAT GTT TCT GTA GAA TCT ACÁ 48 Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val ser Val Glu Ser Thr 1 5 10 15 GCA GAG GCC ACÁ GTC TGC ACG GTG ACÁ CTG GAG AAG ATG TCG GCA GGG 96 Ala Glu Ala Thr Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly 20 25 30 G GGC TTC AGC CTG GAA GGA GGG AAG GGC TCC CTA CAC GGA GAC AAG 144 eu Gly Phe Ser Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys 35 40 45 CCT CTC ACC ATT AAC AGG ATT TTC AAA GGA GCA GCC TCA GAA CAÁ AGT 192 Pro Leu Thr He Asn Arg He Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gln Ser 50 55 60 GAG ACÁ GTC CAG CCT GGA GAT GAA ATC TTG CAG CTG GGT GGC ACT GCC 240
Glu Thr Val Glp Pro Gly Asp Glu He Leu Gln Leu Gly Gly Thr Ala 65 70 75 30 ATG CAG GGC CTC ACÁ CGG TTT GAA GCC TGG AAC ATC ATC AAG GCA CTG 288 Met Gln Gly Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn lie He Lys Ala Leu 85 90 95 "CCT GAT GGA CCT GTC ACG ATT GTC ATC AGG AGA AAA AGC CTC CAG TCC 336 Pro Asp Gly Pro Val Thr He Val He Arg Arg Lys Ser Leu Gln Ser 100 105 110 AAG GAA ACC ACÁ GCT GCT GGA GAC TCC TAG 366
Lys Glu Thr Thr Ala Ala Gly Asp Ser * 115 120
(2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 2 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 122 aminoácidos ( B) UFO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal ( Ü) TIPO DE MOLÉCULA: protßina (XÍ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 * Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr 1 5 10 15 Illa Glu Ala Thr Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly 20 25 30 Leu Gly Phß Ser Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys 35 40 45 Pro Leu Thr He Asn Arg He Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gln Ser 50 55 60 Glu Thr Val Gln Pro Gly Asp Glu He Leu Gln Leu Gly Gly Thr Ala 65 70 75 80 Met Gln Gly Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn He He Lys Ala Leu 85 90 95 Pro Asp Gly Pro Val Thr He Val He Arg Arg Lys Ser Leu Gln Ser 100 105 110 Lys Glu Thr Thr Ala Ala Gly Asp Ser * 115 120 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : ( ) LONGITUD: 66 pares de bases (B) TIPO: nucleotido ( C ) TIPO DE HEBRA: una sola hebra ( ) TOPOLOGÍA: 1 ineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = -primer extremo"
(Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3 : CCCGAATTCT ATGCATCACC ACCACCACCA CGATGACGAC GACAAATCTG CAGCCTCAGC 60
CTCTGC 66
(2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 4 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares base ( B ) TIPO: nusleot id o (C) TIPO DE HEBRA: una sola hebra (D) TOPOLOGÍA lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /dess = " primer reverso IL-16-R1"
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO : 4 : GCGGATCCAA GCTTAGGAGT CTCCAGCAGC TGTG 34
(2) INFORMACIÓN PARA LA S?Q ID NO: 5 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 38 pares base (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: una sola hebra (°) TOPOLOGÍA: lineal ( i i ) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /d?SC » "primer reverso I L- 16 -R2 "
(XÍ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO : 5 : GCGGATCCAA GCTTATTCCT TGGACTGGAG GCTTTTTC 38
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 6 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 66 pares base Cß) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: Lineal ( i i ) TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc m -primer extremo"
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6 : CCCGAATTCT ATGCATCACC ACCACCACCA CGATGACGAC GACAAAGACT CTGCAGCCTC 60 AGCCTC 66 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido ( C) TIPO DE HEBRA: una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(XÍ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7 :
Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala 1 5
(2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 8 : ( i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos ( C ) TIPO DE HEBRA: una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: Lineal ( ü) TIPO DE COLECULA: péptido
(XÍ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ 10 NO : 8 :
Ser Ala Ala Ser Ala ser i 5
(2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ü) TIPO DE MOLÉCULA: pépfldo
(xi) SEQ ID NO: 9 :
Ser Ala Ala Ser Ala 1 5 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 10 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 amino ácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: lineal ( Ü) TiPO DE MOLÉCULA: péptido
( i) SEQ ID NO: 10;
Ser Ala Ala Ser 1
Se hace constar que, con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.
Claims (14)
1. El ácido nucleico el cual puede se usado para expresar un polipéptido con actividad interleucina-lß en una célula hospedera procariótica o eucariótica, caracterizado porque dicho ácido nucleico a) corresponde a la secuencia de DNA de SEC. ID N0:1 o a un DNA elongado al extremo 5' por un codon de ácido aspártico (GAC) , o a sus hebras complementarias . b) generar hibridación bajo condiciones estringentes con el DNA de SEC. ID NO:l o con un DNA el cual está elongado al extremo 5' por un codon de ácido aspártico. c) o es una secuencia de ácido nucleico la cual podria generar hibridación bajo condiciones estringentes con las secuencias de ácido nucleico definidas por a) o b) sin la degeneración del código genético. d) y los códigos de extremos 5' por una de las secuencias de aminoácidos SEC. ID NO: 7 a 10 o por las secuencias análogas las cuales están elongadas N-terminalmente por un ácido aspártico.
2. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se codifica para la interleucina-16 a partir de primates.
3. La célula hospedera procariótica o eucariótica caracterizada porque es transformada o transfectada con un ácido nucleico de conformidad con en las reivindicaciones 1 o 2 en una forma tal que la célula hospedera expresa a dicho polipéptido.
4. El vector de ácido nucleico biológicamente funcional caracterizado porque contiene un ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2.
5. La interleucina-16 a partir de primates puede ser obtenida como el producto de una expresión eucariótica de un ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque está esencialmente libre de otras proteínas humanas.
6. La interleucina-16 humana puede ser obtenida como un producto de una expresión eucariótica de un ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1 o 3 después de un procesamiento, caracterizada porque está libre de otras proteínas humanas.
7. El polipéptido con actividad interleucina-16 caracterizado porque es codificado por un ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2.
8. El polipéptido con actividad de interleucina-lß de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque representa un multimero compuesto de un número definido de subunidades el polipéptido de la reivindicación 7 es una subunidad.
9. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque está compuesto de 4 a 32 subunidades.
10. El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque contiene una cantidad definida de iones de metales, el número de iones de metales por subunidad es de 0.5 a 2.
11. Proceso para la producción de un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque una célula procariótica o eucariótica es transformada o transfectada con una secuencia de ácido nucleico como se reivindica en las reivindicaciones 1 o 2 cultivadas bajo condiciones de nutrientes adecuados y en donde el poiipéptido deseado se aisla opcionalmente.
12. Composición farmacéutica caracterizada porque contiene un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 5 a 10 asi también como un diluyente, adyuvante y/o portador farmacéuticamente conveniente.
13. Composición farmacéutica que contiene un polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 5 a 10 en una cantidad adecuada para una aplicación terapéutica.
14. Proceso para la producción de un anticuerpo contra un polipéptido con actividad de interleucina-lß, caracterizado porque un mamífero es inmunizado con un inmunógeno o agente inmune el cual contiene los primeros 3 - 20 aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o de una SEC ID NO: 2 N-terminalmente elongada por un residuo de ácido aspártico como un hapteno y en donde el anticuerpo se aisla subsecuentemente del mamífero.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19672020 | 1996-04-30 | ||
| EPEP97/02216 | 1997-04-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MXPA98008964A true MXPA98008964A (es) | 2000-01-01 |
Family
ID=
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