DE19648715A1 - Prozessierte Polypeptide mit IL-16 Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung sind Polypeptide mit IL-16-Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstel­ lung und ihre Verwendung. Die Erfindung beschreibt prozessiertes IL-16 mit hoher Aktivität.

IL-16 (Interleukin-16) ist ein Lymphokin, welches auch als "lymphocyte chemoattracting factor" (LCF) oder "immunodeficiency virus suppressing lymphokine" (ISL) bezeichnet wird. IL-16 und seine Eigenschaften sind in der WO 94/28134, der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01486 sowie von Cruikshank, W.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113 und von Baier, M., et al., Nature 378 (1995) 563 beschrieben. Dort ist auch die rekombinante Herstellung von IL-16 beschrieben. Danach ist IL-16 ein Protein mit einer mo­ lekularen Masse von 13,385 D. Von Cruikshank wurde ebenfalls gefunden, daß ISL in einer Molekularsiebchromatographie als multimere Form mit einem Molekulargewicht von 50-60 bzw. 55-60 kD eluiert. Dieser multimeren Form, welche ein kationisches Homotetramer ist (Produktinformation AMS Biotechnology Ltd., Europe, Cat. No. 11177186), wird die "chemoattractant activity" zugeschrieben. Von Baier wird eine homodimere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von 28 kD beschrieben. Die von Cruikshank et al. in J. Immunol. 146 (1991) 2928-2934 beschriebene "chemoattractant activity" und die von Baier beschrie­ bene Aktivität von rekombinantem humanem IL-16 sind jedoch sehr gering.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Aktivität von IL-16 zu verbessern und IL-16- Formen bereitzustellen, die geringe Immunogenität zeigen und vorteilhaft für eine therapeuti­ sche Anwendung geeignet sind.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch eine Nukleinsäure, mit welcher die Expression eines Polypeptids mit Interleukin-16-Aktivität in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle erreicht werden kann, wobei die genannte Nukleinsäure für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 codiert.

Eine solche Nukleinsäure codiert ein prozessiertes Polypeptid mit IL-16-Aktivität, besonders bevorzugt natürliches IL-16 von Primaten, wie humanes IL-16 oder IL-16 einer Affenart oder eines anderen Säugetiers, wie z. B. Maus.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß Fig. 2 der WO 94/28134 nicht das korrekt prozessierte IL-16 beschreibt. Das Startcodon "ATG" der precursor-Form des Proteins beginnt nicht mit Nukleotid 783, sondern mit Nukleotid 54 oder 174. Dieser Leserahmen ergibt sich, wenn nach Nukleotid 156 ein A, nach Nukleotid 398 ein C und nach Nukleotid 780 ein G eingefügt wird. Die Sequenz zeigt noch weitere Unterschiede zu Fig. 2 der WO 94/28134. Dabei handelt es sich z. B. um Nukleotidaustausche (313 Gin A, 717 C in A). Bei der Expression in eukaryontischen Zellen wird IL-16 prozessiert. Dabei entsteht ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2. Die Kenntnis des prozessierten IL-16 erlaubt die Herstellung von IL-16 und Derivaten mit hoher Aktivität und geringer Immunogenität.

IL-16 kann sich in seiner Sequenz von den von solchen DNA-Sequenzen codierten Protein­ sequenzen in gewissem Umfang unterscheiden. Solche Sequenzvariationen können Amino­ säureaustausche, -deletionen oder -additionen sein. Vorzugsweise ist die Aminosäuresequenz von IL-16 jedoch zu wenigstens 75%, besonders bevorzugt zu wenigstens 90% identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2. Varianten von Teilen der Amino- und Nuklein­ säuresequenz SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 sind beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01486 und den deutschen Patentanmeldungen Nr. 195 48 295.6 und 195 47 933.5 beschrieben. Wesentlich ist jedoch, daß die Polypeptide einen korrekten N-Terminus besitzen. Bevorzugt sind demnach Proteine, in denen die ersten drei bis zehn Aminosäuren des N-Terminus unverändert sind. Ebenfalls bevorzugt sind Proteine, die am C-Terminus um bis zu 8 Aminosäuren verkürzt sind.

Unter Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind beispielsweise DNA, RNA und Nukleinsäu­ rederivate und -Analoga zu verstehen. Bevorzugte Nukleinsäure-Analoga sind solche Verbin­ dungen, bei denen das Zuckerphosphatgerüst durch andere Einheiten, wie z. B. Aminosäuren, ersetzt ist. Solche Verbindungen werden als PNA bezeichnet und sind in der WO 92/20702 beschrieben. Da beispielsweise PNA-DNA-Bindungen stärker als DNA-DNA-Bindungen sind, sind die nachstehend beschriebenen stringenten Bedingungen für PNA-DNA-Hybridisierung nicht anwendbar. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind jedoch in der WO 92/20703 beschrieben.

Unter dem Ausdruck "IL-16" ist im Sinne der Erfindung ein Polypeptid mit der Aktivität von IL-16 zu verstehen. Vorzugsweise zeigt IL-16 in dem in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01486 beschriebenen Testverfahren die genannte Wirkung oder stimuliert die Zell­ teilung gemäß WO 94/28134.

IL-16 bindet an CD4⁺ Lymphozyten und kann die Replikation von Viren, wie beispielsweise HIV-1, HIV-2 und SIV supprimieren. Die Funktion von IL-16 ist nicht durch seine Präsenta­ tion im MHC-Komplex limitiert.

Insbesondere zeigt IL-16 eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften:

• - Bindung an T-Zellen über den CD4-Rezeptor,
• - Stimulierung der Expression von IL-2-Rezeptor und/oder HLA-DR-Antigen auf CD4⁺-Lymphozyten,
• - Stimulierung der Proliferation von T-Helferzellen in Gegenwart von IL-2,
• - Suppression der Proliferation von mit Anti-CD3-Antikörpern stimulierten T- Helferzellen,
• - Suppression der Replikation von Viren, vorzugsweise von HIV-1, HIV-2 oder SIV.

Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen mit Nukleinsäuren der Sequenz SEQ ID NO: 1 hybridisieren. Der Ausdruck "unter stringenten Bedingungen hybridisieren" bedeutet, daß zwei Nukleinsäurefragmente unter standardisierten Hybridisierungsbedingungen miteinander hybridisieren, wie beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Solche Bedingungen sind beispielsweise Hybridisierung in 6,0 × SSC bei etwa 45°C, gefolgt durch einen Waschschritt bei 2 × SSC bei 50°C. Zur Auswahl der Stringenz kann die Salzkonzentration im Waschschritt beispielsweise zwischen 2,0 × SSC bei 50°C für geringe Stringenz und 0,2 × SSC bei 50°C für hohe Stringenz gewählt werden. Zusätzlich kann die Temperatur des im Waschschritt zwischen Raumtemperatur, ca. 22°C, für geringe Stringenz und 65°C bei hoher Stringenz variiert werden.

IL-16 wird vorzugsweise rekombinant in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen hergestellt. Derartige Herstellverfahren sind beispielsweise beschrieben in WO 94/28134 und der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01486, die auch hierfür Gegenstand der Offenbarung der vorliegenden Erfindung sind. Um allerdings die erfindungsgemäßen Formen von IL-16 durch rekombinante Herstellung definiert und reproduzierbar zu erhalten, müssen über die dem Fachmann geläufigen Verfahren zur rekombinanten Herstellung zusätzliche Maßnahmen ergriffen werden.

Die Herstellung von rekombinantem IL-16 kann nach den dem Fachmann geläufigen Metho­ den als heterologe Expression oder als homologe Expression (nach homologer Rekombination der IL16 Nukleinsäure ins Genom des Wirtsorganismus) erfolgen. Dazu wird zunächst eine DNA hergestellt, welche in der Lage ist, ein Protein zu produzieren, welches die Aktivität von IL-16 besitzt. Die DNA wird in einen Vektor kloniert, der in eine Wirtszelle transferiert werden kann und dort replizierbar ist. Ein derartiger Vektor enthält zusätzlich zur IL-16- Sequenz Regulator-Elemente, die zur Expression der DNA-Sequenz erforderlich sind. Dieser Vektor, der die IL-16-Sequenz und die Regulator-Elemente enthält, wird in einen Vektor transferiert, der in der Lage ist, die DNA von IL-16 zu exprimieren. Die Wirtszelle wird unter Bedingungen, die zur Amplifikation des Vektors geeignet sind, kultiviert und IL-16 gewon­ nen. Dabei wird durch geeignete Maßnahmen sichergestellt, daß das Protein eine aktive tertiä­ re Struktur einnehmen kann, in der es IL-16-Eigenschaften zeigt.

Auch die Nukleinsäuresequenz des Proteins kann modifiziert sein. Derartige Modifikationen sind beispielsweise:

• - Veränderung der Nukleinsäure, um verschiedene Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen zur Erleichterung der Schritte der Ligation, Klonierung und Mutagenese einzuführen
• - Veränderung der Nukleinsäure zum Einbau von bevorzugten Codons für die Wirtszelle
• - Ergänzung der Nukleinsäure um zusätzliche Operator-Elemente, um die Expres­ sion in der Wirtszelle zu optimieren.

Die Expression des Proteins erfolgt vorzugsweise in Mikroorganismen, insbesondere in Pro­ karyonten, und dort in E. coli. Die Expression in Prokaryonten führt zu einem unglycosylier­ ten Polypeptid.

Die Expressionsvektoren müssen einen Promotor enthalten, der die Expression des Proteins im Wirtsorganismus erlaubt. Derartige Promotoren sind dem Fachmann bekannt und sind bei­ spielsweise lac Promotor (Chang et al., Nature 198 (1977) 1056), trp Promotor (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057), λ_PL Promotor (Shimatake et al., Nature 292 (1981) 128) und T5 Promotor (US-Patent Nr. 4,689,406). Ebenfalls geeignet sind synthetische Promoto­ ren wie beispielsweise tac Promotor (US-Patent Nr. 4,551,433). Ebenso geeignet sind ge­ koppelte Promotorsysteme wie beispielsweise T7-RNA-Polymerase/Promotorsystem (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113). Ebenso geeignet sind hybride Promotoren aus einem Bacteriophagen-Promotor und der Operator-Region des Mikroorganismus (EP-A 0 267 851). Zusätzlich zum Promotor ist eine effektive Ribosomenbindungsstelle erforderlich. Für E. coli wird diese Ribosomenbindungsstelle als Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bezeichnet (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA).

Zur Verbesserung der Expression ist es möglich, das Protein als Fusionsprotein zu exprimie­ ren. In diesem Fall wird üblicherweise eine DNA-Sequenz, welche für den N-terminalen Teil eines endogenen bakteriellen Proteins oder ein anderes stabiles Protein codiert, an das 5'-Ende der für IL-16 codierenden Sequenz fusioniert. Beispiele hierfür sind beispielsweise lacZ (Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884), trpE (Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990) 161-166).

Nach Expression des Vektors, vorzugsweise eines biologisch funktionellen Plasmids oder eines viralen Vektors, werden die Fusionsproteine vorzugsweise mit Enzymen (z. B. Faktor Xa) gespalten (Nagai et al., Nature 309 (1984) 810). Weitere Beispiele für Spaltstellen sind die IgA-Protease-Spaltstelle (WO 91/11520, EP-A 0 495 398), die Ubiquitin-Spaltstelle (Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698) und die Enterokinase-Spaltstelle.

Die auf diese Weise in Bakterien exprimierten Proteine werden durch Aufschluß der Bakterien und Proteinisolierung in üblicher Weise gewonnen.

In einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, die Proteine als aktive Proteine aus den Mikroorganismen zu sezernieren. Hierzu wird vorzugsweise ein Fusionsprodukt verwendet, welches aus der Signalsequenz, die für die Sekretion von Proteinen in den verwendeten Wirts­ organismen geeignet ist, und der Nukleinsäure, welche für das Protein codiert, besteht. Das Protein wird dabei entweder in das Medium (bei grampositiven Bakterien) oder in den peri­ plasmatischen Raum (bei gramnegativen Bakterien) sezerniert. Zwischen der Signalsequenz und der für IL-16 codierenden Sequenz ist zweckmäßig eine Spaltstelle angebracht, die ent­ weder bei der Prozessierung oder in einem zusätzlichen Schritt die Abspaltung des Proteins erlaubt. Derartige Signalsequenzen stammen beispielsweise von ompA (Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437), phoA (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7212).

Zusätzlich enthalten die Vektoren noch Terminatoren. Terminatoren sind DNA-Sequenzen, die das Ende eines Transkriptionsvorganges signalisieren. Sie zeichnen sich meist durch zwei strukturelle Eigenarten aus: eine umgekehrt repetitive G/C-reiche Region, die intramolekular eine Doppelhelix bilden kann, sowie eine Anzahl von U(bzw. T)-Resten. Beispiele sind der Haupt-Terminator in der DNA des Phagen fd (Beck und Zink, Gene 16 (1981) 35-58) sowie rrnB (Brosius et al., J. Mol. Biol. 148 (1981) 107-127).

Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren üblicherweise einen selektierbaren Marker, um transformierte Zellen zu selektieren. Derartige selektierbare Marker sind beispielsweise die Resistenzgene für Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracyclin (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469). Ebenso geeignete selektier­ bare Marker sind die Gene für essentielle Substanzen der Biosynthese von für die Zelle not­ wendigen Stoffen wie z. B. Histidin, Tryptophan und Leucin.

Es sind eine Vielzahl von geeigneten bakteriellen Vektoren bekannt. Beispielsweise sind für die folgenden Bakterien Vektoren beschrieben: Bacillus subtilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582), E. coli (Aman et al., Gene 40 (1985) 183; Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 655), Streptococcus lividans und Streptomyces lividans (US-Patent Nr. 4,747,056).

Weitere gentechnologische Verfahren zur Herstellung und Expression von geeigneten Vekto­ ren sind in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, N.Y. beschrieben.

Eine Expression von rekombinanter IL-16 ist außer in prokaryontischen Mikroorganismen auch in Eukaryonten (wie beispielsweise CHO-Zellen, Hefe oder Insektenzellen) möglich. Als eukaryontisches Expressionssystem wird das Hefesystem oder Insektenzellen bevorzugt. Die Expression in Hefe kann über drei Arten von Hefevektoren (integrierende YI_P (yeast integra­ ting plasmids)-Vektoren, replizierende YR_P (yeast replicon plasmids)-Vektoren und episomale YE_P (yeast episomal plasmids)-Vektoren) erfolgen. Näheres hierzu ist beispielsweise in S.M. Kingsman et al, Tibtech 5 (1987) 53-57 beschrieben.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine prokaryontische oder eukaryontische Wirts­ zelle, welche mit einer Nukleinsäure, welche für ein erfindungsgemäßes IL-16-Polypeptid codiert, so transformiert oder transfiziert ist, daß die Wirtszelle das genannte Polypeptid exprimiert. Eine solche Wirtszelle enthält üblicherweise einen biologisch funktionellen Nukleinsäurevektor, vorzugsweise einen DNA-Vektor, eine Plasmid-DNA, welche diese Nukleinsäure enthält.

Weiter bevorzugt ist ein monomeres IL-16-Polypeptid, welches nicht in weitere Untereinhei­ ten aufspaltbar ist.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die in der WO 94/28134 beschriebene Nuklein­ säure und Proteinsequenz von IL-16 nicht den natürlichen humanen Sequenzen entsprechen. Es handelt sich hier lediglich um ein nicht natürliches IL-16-Analoges. Für eine therapeutische Anwendung ist es jedoch bevorzugt, ein Protein zu verwenden, welches entweder mit dem natürlichen Protein identisch ist oder sich vom natürlichen Protein nur geringfügig unterschei­ det und/oder mindestens vergleichbare Aktivität und Immunogenität zeigt. Die Sequenz des Proteins ist in SEQ ID NO: 2 beschrieben.

Die Nukleinsäuresequenz von IL-16 kann im Rahmen der Erfindung Deletionen, Mutationen und Additionen erhalten. Die monomere Form von IL-16 kann in einer bevorzugten Ausfüh­ rungsform multimerisiert sein. Dadurch kann die Aktivität von IL-16 gesteigert werden. Vorzugsweise sind solche multimeren Formen dimere, tetramere oder oktamere Formen.

In einer weiteren Ausführungsform können die Polypeptide der Erfindung zusätzlich einen definierten Gehalt an Metallionen enthalten, wobei die Anzahl der Metallionen pro Unterein­ heit vorzugsweise 0,5 bis 2 beträgt.

Als Metallionen im Sinne der Erfindung sind eine Vielzahl von Metallionen geeignet. Wie sich gezeigt hat, sind sowohl Erdalkalimetalle als auch Elemente der Nebengruppen geeignet. Besonders geeignet sind Erdalkalimetalle, Kobalt, Zink, Selen, Mangan, Nickel, Kupfer, Eisen, Magnesium, Kalzium, Molybdän und Silber. Die Ionen können ein-, zwei-, drei- oder vierwer­ tig sein. Besonders bevorzugt werden zweiwertige Ionen. Die Ionen werden vorzugsweise als Lösungen zugesetzt von MgCl₂, CaCl₂, MnCl₂, BaCl₂, LiCl₂, Sr(NO₃)2, Na₂MoO₄, AgCl₂.

Solche multimeren Formen und metallionenhaltige Formen von IL-16 sind in der deutschen Patentanmeldung Nr. 195 47 933.5 beschrieben.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann dadurch hergestellt werden, daß eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 oder 2 transformiert oder transfiziert ist, unter geeigneten Nährbedingungen kultiviert wird und das gewünschte Polypeptid gegebenenfalls isoliert wird. Falls die Herstellung des Poly­ peptids im Rahmen einer gentherapeutischen Behandlung in vivo erfolgen soll, wird das Poly­ peptid natürlich nicht aus der Zelle isoliert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid in einer für eine therapeutische Anwendung ausreichenden Menge und/oder spezifische Aktivität sowie gegebenenfalls ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel, Adjuvans und/oder Trägermittel enthält.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind insbesondere geeignet zur Behandlung von patholo­ gischen Zuständen, die durch virale Replikation, insbesondere retrovirale Replikation, verur­ sacht sind, und zur Immunmodulation. Derartige therapeutische Anwendungen sind in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01486 beschrieben. Hierin sind ebenfalls auch diagnostische Testverfahren beschrieben.

Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen Polypeptide zur Immunsuppression verwendet werden. Diese Immunsuppression erfolgt vorzugsweise über eine Hemmung der Helferfunk­ tion der TH₀ und/oder TH₁ und/oder TH₂ Zellen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind demnach bei allen Erkrankungen von therapeutischem Wert, bei denen eine immundisregulato­ rische Komponente bei der Pathogenese postuiert wird, insbesondere eine Hyperimmunität. Als IL-16-therapierbare Erkrankungen können in der Kardiologie/Angiologie Erkrankungen wie Myokarditis, Endokarditis und Perikarditis in Frage kommen, in der Pulmonologie beispielsweise Bronchitis, Asthma, in der Hämatologie Autoimmunneuropenien und Trans­ plantatabstoßung, in der Gastroenterologie chronische Gastritis, in der Endokrinologie Diabetes mellitus Typ I, in der Nephrologie Glomerulonephritis, Erkrankungen im rheumati­ schen Formenkreis, Erkrankungen in der Ophthalmologie, in der Neurologie, wie Multiple Sklerose, in der Dermatologie Ekzeme. Insbesondere können die erfindungsgemaßen Poly­ peptide bei Autoimmunerkrankungen, Allergien und zur Vermeidung von Transplantat­ abstoßungen verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nuklein­ säuren im Rahmen der Gentherapie. Hierfür geeignete Vektorsysteme sind beispielsweise retrovirale oder nicht-virale Vektorsysteme.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein polyklonaler oder monoklonaler Anti-IL-16- Antikörper oder ein immunoaktives Fragment davon, welcher an die ersten 3-20 Aminosäuren von SEQ ID NO: 2 bindet, sowie Verfahren zur Herstellung von solchen Antikörpern und ihre Verwendung zur Bestimmung von IL-16 sowie zur Bestimmung von viralen Infektionen in eukaryontischen Zellen und insbesondere in Säugerzellmaterial. Mit IL-16 können auch Virus-aktivierte Säugerzellen, insbesondere T Zellen, bestimmt werden. Die Herstellung solcher Antikörper erfolgt durch Immunisierung mit einem erfindungsge­ mäßen Polypeptid. Die Herstellung eines solchen Antikörpers wird nach den dem Fachmann geläufigen Verfahren durchgeführt, durch Immunisierung mit einem Immunogen, welches die ersten 3-20 Aminosäuren von SEQ ID NO: 2 als Hapten enthält. Anschließend kann der Antikörper aus dem immunisierten Säugetier in üblicher Weise gewonnen werden und gegebenenfalls ein monoklonaler Antikörper hergestellt werden.

Die folgenden Beispiele und Publikationen sowie das Sequenzprotokoll erläutern die Erfin­ dung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreiben.

Beispiel 1 Klonierung, Expression und Reinigung von IL-16 1.1 RNA Isolierung

5 × 10⁷PBMC (vom Menschen oder Affen) wurden 48 Stunden mit 10 µg/ml Concanavalin A und 180 U/ml IL-2 kultiviert. Zur Herstellung der RNA wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit 5 ml Denaturierungslösung (RNA Isolation Kit, Stratagene) lysiert. Nach Zugabe von 1 ml Na-Acetat, 5 ml Phenol und 1 ml Chloroform/Isoamyl-Alkohol (24 : 1) wurde das Lysat 15 min. auf Eis gehalten. Die waßrige Phase wurde anschließend mit 6 ml Isopropanol vermischt, um die RNA auszufallen, und 2 Stunden bei -20°C gelagert. Das Präzipitat wurde schließlich einmal mit reinem Ethanol gewaschen und in 150 µl H₂O gelöst. Die Ausbeute wurde photometrisch bestimmt und betrug 120 µg.

1.2 cDNA Synthese

Die Mischung für die cDNA Synthese enthielt 10 µg RNA, 0,2 µg Oligo-dT, 13 mM DTT und 5 µl "bulk first strand reaction mix" (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia) in einer Menge von 15 µl. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend bei -20°C zur späteren Verwendung gelagert.

1.3 Expressionsklon

Amplifikation, Klonierung von IL-16 cDNA und Herstellung eines Expressionsklons erfolgen wie in der WO 94/28134 oder der internationalen Patentanmeldung PCT/EP96/01486 beschrieben, unter Berücksichtigung der veränderten Sequenzen.

Als Vorwärtsprimer wird ein Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO: 3 verwendet, der eine EcoRI site, 6 His und eine Enterokinase-Spaltstelle (D₄K) enthält:

Als reverse primer werden entweder Oligonukleotid IL-16-R₁ (SEQ ID NO: 4):

oder Oligonukleotid IL-16-R₂ (SEQ ID NO: 5) verwendet:

Die beiden reverse primer enthalten BamHI und HindIII Schnittstellen zur Klonierung.

Mit IL-16-R₁ wird eine Sequenz erhalten, welche für ein Protein gemäß SEQ ID NO: 2 codiert.

Mit IL-16-R₂ wird eine Sequenz erhalten, welche für ein um 8 Aminosäuren am C-Terminus verkürztes IL-16 codiert. Dieses C-terminale IL-16 ist ebenfalls aktiv.

Die PCR-Reaktion, Klonierung und Herstellung des Expressionsklons (Fusionsprotein mit N-terminalem Poly-His-Anteil zur Aufreinigung) erfolgen nach Standardbedingungen:

0,2 mM dNTP Mix, je 1 pmol/µl forward und reverse Primer, 1 × high fidelity buffer (Boehringer Mannheim, D), 1,5 mM MgCl2, 2.6 U high fidelity enzyme mix (Boehringer Mannheim, D).
20 µl Endvolumen
Maschine: Perkin Elmer GeneAmp 9600
Reaktionsverlauf:
3 min 94°C, 1 min 56°C, 2 min 72°C, dann 25 Zyklen (20 sec 94°C, 20 sec 56°C, 1 min 72°C)

Beispiel 2 10 l Fermentation eines E. coli Expressionsklons für IL-16 und Hochdruckaufschluß

Aus Stammkulturen (Plattenausstrich oder bei -20°C gelagerten Ampullen) werden Vorkultu­ ren angesetzt, die geschüttelt bei 37°C inkubiert werden. Das Überimpfvolumen in die nächst­ höhere Dimension beträgt jeweils 1-10 Vol.-%. Zur Selektion gegen Plasmidverlust wird in Vor- und Hauptkultur Ampicillin (50-100 mg/l) eingesetzt.

Als Nährstoffe werden enzymatisch verdautes Eiweiß und/oder Hefeextrakt als N- und C- Quelle sowie Glycerin und/oder Glucose als zusätzliche C-Quelle verwendet. Das Medium wird auf pH 7 gepuffert und Metallsalze werden zur Stabilisierung des Fermentationsprozesses in physiologisch verträglichen Konzentrationen zugesetzt. Die Fermentation wird als Feed­ batch mit einer gemischten Hefeextrakt/C-Quellen-Dosage durchgeführt. Die Fermentations­ temperatur beträgt 25-37°C. Über Belüftungsrate, Drehzahlregulierung und Dosagege­ schwindigkeit wird der gelöste Sauerstoffpartialdruck (pO₂) <20% gehalten.

Das Wachstum wird über Ermittlung der optischen Dichte (OD) bei 528 nm bestimmt. Mittels IPTG wird die Expression des IL-16 induziert. Nach einer Fermentationsdauer von ca. 10 Stunden wird bei OD-Stillstand die Biomasse durch Zentrifugation geerntet. Die Biomasse wird in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM Natriumchlorid, pH 7 aufgenommen und über eine kontinuierliche Hochdruckpresse bei 1000 Bar aufgeschlossen. Die so erhaltene Suspension wird erneut abzentrifugiert und der Überstand, der das gelöste IL-16 enthält, wird weiterverarbeitet.

Beispiel 3 Reinigung von rekombinantem humanem IL-16

550 ml Aufschlußüberstand in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,2 wurden mit 55 ml 5 M NaCl, 60 mM MgCl₂, pH 8,0 versetzt, 30 min. gerührt und an­ schließend 30 min. bei 20.000 g zentrifugiert. 400 ml des Überstandes wurden auf eine Nickel- Chelat-Sepharose-Säule (V=60 ml; Pharmacia) aufgezogen, die vorher mit 30 µMol NiCl₂/ml Gel beladen und mit 50 mM Natriumphosphat, 0,2 M NaCl, pH 8,0 äquilibriert worden war. Die Säule wurde anschließend mit 300 ml 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M NaCl, pH 7,0 gespült und das IL-16-Fusionsprotein dann mit einem Gradienten von 0 M bis 300 mM Imida­ zol, pH 7,0 in 50 mM Natriumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0 (2× 0,5 l Gradientenvolumen) eluiert. IL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und vereinigt.

100 mg des so erhaltenen Fusionsproteins wurden bei 4°C gegen 20 l 50 mM Tris/HCl, pH 8,0 dialysiert und anschließend zur Entfernung von Trübungen 30 min. bei 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand der Zentrifugation wurde anschließend mit 0,1 mg Enterokinase (Novagen) versetzt und 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Spaltansatz mit HCl auf pH 6,5 und die Leitfähigkeit durch Verdünnung mit H₂O auf 1,7 mS eingestellt. Die Probe wurde auf eine Q-Sepharose FF-Säule (8 ml; Pharmacia) aufgetragen, die vorher mit 20 mM Imidazol, pH 6,5 äquilibriert worden war. Die Elution von IL-16 erfolgte mit einem Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl in 20 mM Imidazol, pH 6,5. IL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und vereinigt. Die Identität von IL-16 wurde durch Massenanalyse und automatisierte N-terminale Sequenzanalyse bestätigt. Zur Konzentrationsbestimmung wurde die UV-Absorption von IL-16 bei 280 nm (Mack et al. (1992) Analyt. Biochem. 200, 74-80) verwendet.

Das so erhaltene IL-16 wies in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen eine Rein­ heit von mehr als 95% auf. Die analytische Superdex 75 FPLC-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Na-Phosphat, 0,5 M NaCl, 10% Glycerin, pH 7,0 und einer Flußrate von 1 ml/min. eluiert. Die aufgetragene Proteinmenge in einem Volumen von 100 bis 150 µl betrug 1,5 bis 15 µg Protein. Die Detektion erfolgte bei 220 nm.

Zur Reinheitsanalyse mittels RP-HPLC wurde eine Vydac, Protein & Peptide C18, 4×180 mm Säule verwendet. Die Elution erfolgt durch einen linearen Gradienten von 0% nach 80% B (Lösungsmittel B: 90% Acetonitril in 0,1% TFA; Lösungsmittel A: 0,1% TFA in H₂O) inner­ halb von 30 min. mit einer Flußrate von 1 ml/min. Die Detektion erfolgte bei 220 nm.

Referenzliste

Aman et al., Gene 40 (1985)183
Baier, M., et al., Nature 378 (1995) 563
Beck und Zink, Gene 16 (1981) 35-58
Brosius et al., J. Mol. Biol. 148 (1981) 107-127
Chang et al., Nature 198 (1977) 1056
Cruikshank, W.W., et al., J. Immunol. 146 (1991) 2928-2934
Cruikshank, W.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113
Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469
Deutsche Patentanmeldung Nr. 195 47 933.5
Deutsche Patentanmeldung Nr. 195 48 295.6
EP-A 0 267 851
EP-A 0 495 398
Internationale Patentanmeldung PCT/EP96/01486
Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437
Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057
Kingsman, S.M., et al, Tibtech 5 (1987) 53-57
Mack et al., Analyt. Biochem. 200 (1992) 74-80
Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698
Nagai et al., Nature 309 (1984) 810
Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7212
Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582
Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884
Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 655
Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA
Shimatake et al., Nature 292 (1981) 128
Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113
US-Patent Nr. 4,551,433
US-Patent Nr. 4,689,406
US-Patent Nr. 4,747,056
WO 91/11520
WO 92/20702
WO 92/20703
WO 94/28134
Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990) 161-166

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (14)

1. Nukleinsäure, mit welcher die Expression eines Polypeptids mit Interleukin-16-Aktivität in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle erreicht werden kann, wobei die genannte Nukleinsäure für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder für ein Polypeptid mit einer am C-Terminus um bis zu 8 Aminosäuren verkürzten Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 codiert.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, die Interleukin-16 von Primaten codiert.

3. Prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, welche mit einer Nukleinsäure nach den Ansprüchen 1 oder 2 so transformiert oder transfiziert ist, daß die Wirtszelle das genannte Polypeptid exprimiert.

4. Biologisch funktioneller Nukleinsäurevektor, der eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2 enthält.

5. Interleukin-16 aus Primaten, wie es als Produkt einer eukaryontischen Expression einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2 im wesentlichen frei von anderen Humanprotei­ nen erhältlich ist.

6. Humanes Interleukin-16, wie es als Produkt einer eukaryontischen Expression einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2 nach Prozessierung im wesentlichen frei von anderen Humanproteinen erhältlich ist.

7. Polypeptid mit Interleukin-16-Aktivität, welches codiert wird von einer Nukleinsäure nach den Ansprüchen 1 oder 2.

8. Polypeptid mit Interleukin-16-Aktivität gemaß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Multimeres aus einer definierten Anzahl von Untereinheiten darstellt, wobei das Polypeptid von Anspruch 7 eine Untereinheit ist.

9. Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es aus 4 bis 32 Untereinhei­ ten besteht.

10. Polypeptid nach den Ansprüchen 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es einen definier­ ten Gehalt an Metallionen enthält, wobei die Anzahl der Metallionen pro Untereinheit 0,5 bis 2 beträgt.

11. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 oder 2 transformiert oder transfiziert ist, unter geeigneten Nährbedingungen kultiviert wird und das gewünschte Polypeptid gege­ benenfalls isoliert wird.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach den Ansprüchen 5 bis 10 sowie ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel, Adjuvans und/oder Trägermit­ tel enthält.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Polypeptid gemäß den Ansprüchen 5-10 in einer für eine therapeutische Anwendung ausreichenden Menge.

14. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gegen ein Polypeptid mit Interleukin-16- Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß ein Säugetier mit einem Immunogen welches die ersten 3-20 Aminosäuren von SEQ ID NO : 2 als Hapten enthält, immunisiert wird und der Antikörper anschließend aus dem Säugetier gewonnen wird.