MXPA98002760A - Ligando antagonista rar-gamma o agonista rar-alfa como inhibidor de la apoptosis - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a utilización de al menos un ligando seleccionado entre un ligando agonista específico a los receptores de tipo RAR-alfa y un ligando antagonista específico a los receptores de tipo RAR-y en la preparación de una composición farmacéutica destinada para disminuir el porcentaje de apoptosis en al menos una población celular. Estas composiciones pueden servir particularmente para tratar una enfermedad o un desorden relacionado con a un exceso del porcentaje de apoptosis en al menos una población celular.

Description

LIGANDO ANTAGONISTA RAR-GAMMA O AGONISTA RAR-ALFA COMO INHIBIDOR DE LA APOPTOSIS La presente invención se refiere a la utilización de retinoides particulares en la preparación de una composición farmacéutica con miras a disminuir el porcentaje de apoptosis. Existen dos tipos de mecanismos implicados en la muerte de las células. El primer de tipo clásico se denomina la necrosis. Morfológicamente, la necrosis se caracteriza por un hinchazón de las mitocondrias y del citoplasma y por una alteración nuclear, seguida de la destrucción de las células y su autolosis, siendo esto acompañado por un fenómeno de inflamación. La necrosis se produce de forma pasiva e incidental. La necrosis tisular se debe generalmente a un trauma fisico de las células o a un veneno químico, por ejemplo. La otra forma de muerte celular se llama la apoptosis [Kerr, J.F.R. and Wyllie, A.H., Br. J. Cáncer, 265, 239 (1972)], pero contrariamente a la necrosis la apoptosis no produce un fenómeno de inflamación. Se describe que la apostosis puede producirse bajo diferentes condiciones fisiológicas. Es una forma altamente selectiva del suicida celular que se REF: 27200 caracteriza por fenómenos morfológicos y bioquímicos fácilmente observables. Asi, se observa particularmente una condensación de la cromatina asociada o no con una actividad endonucleásica, la formación de cuerpos apópticos y una fragmentación del ácido desoxirribonucléico (A.D.N.) por la activación de endonucleasas en fragmentos de A.D.N de 180-200 pares de bases (estos fragmentos pueden ser observados por electrofóresis sobre gel de agarosa) . La apoptosis puede ser considerada como una muerte programada de las células implicada en el desarrollo, la diferenciación y la renovación de los tejidos. Se considera igualmente que la diferenciación, el crecimiento y la maduración de las células están estrechamente relacionadas con la apoptosis y que las substancias capaces de jugar un papel sobre la diferenciación, el crecimiento y la maduración de las células están también relacionadas con el fenómeno de la apoptosis. Asi, en un ser humano con buena salud, existe un equilibrio entre el conjunto de estos fenómenos. En el ámbito médico, un cierto número de situaciones patológicas presenta un mecanismo de apoptosis modificado, incluso desajustado, o un mecanismo de apoptosis que no proporciona un desajuste de otro fenómeno biológico para llegar al equilibrio. Asi, se describe que una modulación voluntaria de la apoptosis al inducirla o reprimirla puede permitir tratar numerosas enfermedades relacionadas con una insuficiencia del porcentaje de apoptosis, tales como en el caso del cáncer, las enfermedades auto-inmunes o las alergias, o por el contrario las enfermedades relacionadas con un exceso del porcentaje de apoptosis, tal como en los casos del síndrome de inmunodeficiencia del virus de inmunodeficiencia humano (H.I.V.), de las enfermedades neuro-degenerativas (enfermedad de Alzheimer) o daños excesivos inducidos en el infarto de miocardio. Concretamente, se ha descrito ya numeosos inhibidores de apoptosis, tales como la cicloheximida, la ciclosporina y ciertas interleuquinas. En el ámbito de los retiniodes, se sabe que el ácido retinóico todo-trans es un potente modulador (es decir un inhibidor o, por el contrario, un estimulador, según la naturaleza de las células tratadas) de la diferenciación Y de la proliferación de numerosos tipos celulares normales o transformados. Por ejemplo, inhiben la diferenciación de las células epiteliales, tales como los queratinocitos de la epidermis. Inhibe también la proliferación de numerosas células transformadas tales como las células de melanomas. Estos efectos sobre la proliferación y la diferenciación pueden afectar simultáneamente a un mismo tipo celular, como es por ejemplo, el caso para las células promielocitarias humanas, referenciadas HL-60; asi, es sabido que la proliferación de estas células es inhibida por el ácido retinóico todo-trans y, al mismo tiempo, que se induce su diferenciación en granulocitos y su apoptosis. Se sabe de una manera general, que al ácido retinóico todo-trans (all-trans retinoic acid) actúa sobre la diferenciación y la proliferación de las células interactuando con receptores nucleares llamados RARs (Retinoic Acid Receptors) contenidos en el núcleo celular. Existen, hoy en dia, tres sub-tipos identificados de receptores RAR llamados respectivamente RAR-a, RAR-ß y RAR-?. Estos receptores, después de la fijación del ligando (es decir del ácido retinóico todo-trans), interactúan con la región promotora de genes regulados por el ácido retinóico a nivel de elementos de respuestas especificas (RARE) . Para fijarse sobre los elementos de respuesta, los RARs se heterodimerizan con otro tipo de receptores conocidos bajo el nombre de RXRs. El ligando natural de los RXRs es el ácido 9-cis-retinóico. Los RXRs se consideran como "master regulatory proteins" pues interactúan con otros miembros de la superfamilia de los receptores esteroidianos/tiroidianos para formar heterodimeros, como los RARs, tales como el receptor de la vitamina D3 (VDR) , el receptor de la triyodotiroxina (TR) y los PPARs (Peroxisome Proliferator Activated Receptors) . Además, los RXRs pueden interactuar con elementos de respuesta específicos (RXRE) en forma de homodimeros . Estas interacciones complejas y la existencia de múltiples receptores RARs y RXRs expresados de forma diferente en función del tejido y del tipo clular explican los efectos pleiyotrópicos de los retinoides en prácticamente todas las células. Numerosos análogos estructurales sintéticos del ácido retinóico todo-trans o del ácido 9-cis-retinóico, corrientemente denominados "retinoides", han sido descritos hasta ahora en la literatura. Algunas de estas moléculas son capaces de fijarse y de activar específicamente los RARs o, por el contrario, los RXRs. Además, algunos análogos pueden fijarse y activar un sub-tipo de receptor RAR (a, ß, ó ?) particular. Otros análogos, por último, no presentan ninguna actividad selectiva particular respecto a estos diferentes receptores. A este respecto, y por ejemplo, el ácido 9-cis-retinóico activa a la vez los RARs y los RXRs, sin selectividad notable para uno u otro de estos receptores (ligando agonistas no especifico), mientras que el ácido retinóico todo-trans activa, en cuanto a él, selectivamente los RARs (ligando agonistas especifico RARs), cualquier sub-tipo confundido. De una manera general y cualitativamente, una substancia dada (o ligando) se denomina especifica de una familia de receptores dada (respectivamente respecto a un receptor particular de esta familia) cuando la indicada subtancia presenta una afinidad para el conjunto de los receptores de esta familia (respectivamente para el receptor particular de esta familia) más fuerte que la que presenta por otro lado para todos los receptores de cualquier otra familia (respectivamente para todos los demás receptores, de esta misma familia o no) . Se describe que el ácido 9-cis retinóico y el ácido retinóico todo-trans son moduladores de la apoptosis (activador o inhibidor de la apoptosis particularmente en función del tipo celular) y que el ácido 9-cis retinóico es el más activo de estos dos moduladores, pudiendo esto explicarse por el hecho de que activa a la vez los RARs y los RXRs contrariamente al ácido retinóico todo-trans que solo activa los RARs. Teniendo en cuenta lo que se ha dicho anteriormente, parecería interesante encontrar nuevos moduladores de la apoptosis. En este sentido, la Firma solicitante acaba de descubrir que los ligandos agonistas específicos a los receptores de tipo RAR-a o los ligando antagonistas específicos a los receptores de tipo RAR-? son excelentes inhibidores de la apoptosis en diferentes tipos celulares, y más particularmente en los timocitos, habiendo sido esta apoptosis inducida por medio de los receptores de tipo RAR-? o receptores de las células T (T-cell receptors) . Asi, la presente invención tiene por objeto la utilización de al menos un ligando seleccionado entre un ligando agonista especifico a los receptores de tipo RAR-a y un ligando antagonista especifico a los receptores de tipo RAR-? en la preparación de una composición farmacéutica destinada para disminuir el porcentaje de apoptosis en al menos una población celular. Más particularmente, la población celular corresponde a células en las cuales la apoptosis puede ser regulada por inducción y/o inhibición por medio de los receptores de tipo RAR-? y/o RAR-a o en la cual la apoptosis pude ser regulada por inducción por medio de los receptores de las células T. La composición farmacéutica según la invención comprende un medio fisiológicamente aceptable. Por ligando agonista especifico a los receptores de tipo RAR-a, se entiende según la invención cualquier ligando agonista que presente una constante de disociación para los receptores de tipo RAR-a al menos 10 veces inferior a su constante de disociación para los receptores de tipo RAR-? y que induce la diferenciación de las células F9. Por ligando antagonista especifico a los receptores de tipo RAR-?, se entiende según la invención cualquier ligando que presente una constante de disociación para los receptores de tipo RAR-? al menos 10 veces inferior a su constante de disociación para los receptores de tip RAR-a y que no inducen la diferenciación de las células F9. Se sabe en efecto que el ácido retinóico todo-trans y algunos de sus análogos son capaces de inducir la diferenciación de las células (F9) de teratocarcinoma embrionario de ratón, se las considera entonces como agonistas a los receptores RARs. La secreción del activador plasminógeno que acompaña esta deferenciación es un Índice de la respuesta biológica de las células F9 a los retinoides (Skin pharmacol, 1990; 3 : páginas 256-267). Las constantes de disociación se determinan por medio de ensayos clásicos por el experto en la materia. Estos ensayos se describen particularmente en las referencias siguientes : (1) "Selective Synthetic Ligands for Nuclear Retinoic Acid Receptor Subtypes" in RETINIODS, Progress in Research and Clinical Applications, Capítulo 19 (páginas 2.61-267), Marcel Dekker Ine, editado por Maria A. Livrea y Lester Packer; (2) "Synthetic Retinoids : Receptor Selectivity and Biological Activity" in Pharmacol Skin, Basel, Karger, 1993, Volumen 5, páginas 117-127; (3) "Selective Synthetic Ligands for Human Nuclear Retinoic Acid Receptors" in Skin Pharmacology, 1992, Vol. 5 páginas 57-65; (4) "Identification of Synthetic Retinoids with Selectivity for Human Nuclear Retinoic Acid Receptor-?" in Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 186, No 2, Julio 1992, páginas 977-983; (5) "Selective High Affinity RAR-a or RAR-ß Retinoic Acid Receptor Ligands" in Mol. Pharmacol., Vol 40. páginas 556-562. Otras características, aspectos, objetos y ventajas de la invención aparecerán todavía más claramente con la lectura de la descripción que sigue, así como de los diversos ejemplos concretos, pero en modo algunos limitativos, destinados para ilustrarla. Entre los ligandos agonistas específicos a los receptores de tipo RAR-a, se pueden particularmente citar el ácido 4-( (5, 6, 7, 8-tetrahidro-5, 5, 8, 8-tetrametil-2-naftalenil) carboxamido) benzoico, el ácido 4- ((5, 6,7,8-tetrahidro-5, 5, 8, 8-tetrametil-2-naftalenil) carbamoil) benzoico y el ácido 2-hidroxi-4-(5,5,8, 8-tetrametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-naftalen-2-carboxamida) -benzoico. De preferencia, se utiliza en la presente invención, entre los ligandos agonistas específicos a los receptores de tipo RAR-a, al menos un ligando agonista que presenta una constante de disociación para los receptores de tipo RAR-a al menos 20 veces inferior a su constante de disociación para los receptores de tipo RAR-?, tal como el ácido 4- ( (5, 6, 7, 8-tetrahidro-5, 5, 8, 8-tetrametil-2-nftalenil) carboxamido) benzoico y el ácido 2-hidroxi-4- (5,5,8, 8-tetrametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-naftalen-2-carboxamido) -benzoico. Entre los ligandos antagonistas específicos a los receptores de tipo RAR-?, se pueden particularmente citar el ácido 2-hidroxi-4-[7- (l-4-[7- (1-adamantil) -6-benciloxi-2-naftil]benzóico, el ácido 2-hidroxi-4-[7-adamantil) -6-hexiloxi-2-naftil]benzóico, el ácido 4-[7-(l-adamantil ) -6-metoxietoximetoxi-2-naftiljbenzóico, el ácido 5-[7- (1-adamantil) -6-benciloxi-2-naftil]-2-tiofencarboxílico, el ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-benciloxi-2-naftil]benzóico, el ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-benciloxicarbonil-2-naftil]benzóico, el ácido 2-hidroxi-4-[7- (1-adamantil) -6- (4-fluorobencil) oxi-2-naftiljbenzóico, el ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-heptiloxi-2-naftil]benzóico, el ácido 6-[7- (1-adamantil) -6-metoxietoximetoxi-2-naftil]nicotínico, el ácido 2-hidroxi-4-[7- ( 1-adamantil) -6-metoxietoximetoxi-2-naftil]benzóico, el ácido 2-cloro-4-[7- (1-adamantil) -6-metoxietoximetoxi-2-naftil]benzóico, el ácido 4-[7-(l-adamantil) -6-metoxibutiloxi-2-naftil]benzóico, el ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-metoximetoxipropil-2-naftiljbenzóico, el ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-metoxietoxipropil-2-naftiljbenzóico y el ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-acetiloxibutoxi-2-naftiljbenzóico. De preferencia, se utiliza en la presente invención los ligandos agonistas específicos a los receptores de tipo RAR-?, al menos un ligando antagonista que presenta una constante de disociación para los receptores de tipo RAR-? al menos 20 veces inferior a su constante de disociación para los receptores de tipo RAR-a, tal como el ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-metoxietoximetoxi-2-naftiljbenzóico.

Así, la composición farmacéutica según la invención se podrá utilizar cuando es necesaria una disminución del porcentaje de apoptosis para al menos una población celular. Más particularmente, la población celular corresponde a células en la cual la apoptosis puede ser regulada por inducción y/o inhibición por medio de los receptores de tipo RAR-? y/o RAR-a o en la cual la apoptosis puede ser regulada por inducción por medio de los receptores de las células T, y por consiguiente particularmente en poblaciones celulares donde receptores de tipo RAR-? y/o RAR-a o receptores de las células T están presentes, tales como por ejemplo en las células procedentes del timo donde estos tres tipos de receptores están presentes. Una disminución del porcentaje de apoptosis puede mostrarse necesario cuando existe por consiguiente un exceso de porcentaje de apoptosis, resultando este exceso de condiciones genéticas o adquiridas presentadas por la persona a quien se le desea administrar la composición farmacéutica. Estas condiciones genéticas o adquiridas favorecen la acumulación de señales que inducen la apoptosis o disminuyen el umbral al cual estas señales inducen la apoptosis. Entre las enfermedades o los desórdenes relacionados con un exceso de porcentaje de apoptosis, se pueden citar más particularmente el síndrome de inmunodeficiencia del virus de inmunodeficiencia humano (H.I.V.), las enfermedades neuro-degenerativas, los síndromes mielodisplásicos (tales como la anemia aplasica) , los síndromes de isquemia (tales como el infarto de miocardio) , las enfermedades del hígado inducidas por toxinas (tales como el alcohol), la alopecia, los daños de la piel debidos a los rayos U.V., el liquen plano, la atrofia de la piel, la catarata o también el rechazo de transplantes. Así, en las enfermedades neuro-degenerativas, se pueden citar más particularmente la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrópica y otras enfermedades relacionadas con una degeneración del cerebro, tales como la enfermedad de Creutzfeld Jakob. La administración de la composición según la invención puede ser realizada por vía enteral, parenteral, tópica u ocular. De preferencia, la composición farmacéutica se acondiciona bajo una forma que es adecuada para una aplicación por vía sistémica (para inyección o perfusió) . Por vía enteral, la composición, más particularmente la composición farmacéutica, puede presentarse en forma de comprimidos, de cápsulas, de grageas, de jarabes, de suspensiones, de soluciones, de polvos, de granulados, de emulsiones, de microesferas o de nanoesferas o vesículas lipídicas o poliméricas que permiten una liberación controlada. Por vía parenteral, la composición puede presentarse en forma de soluciones o suspenciones para perfusión o para inyección. Los ligandos seleccionados entre los ligandos agonistas específicos a los receptores de tipo RAR-a y los ligandos antagonistas específicos a los receptores de tipo RAR-? utilizados según la invención se administran generalmente a una dosis diaria de aproximadamente 0,01 mg/Kg a 100 mg/Kg en peso corporal en 1 a 3 tomas. Por vía tópica, la composición farmacéutica o cosmética según la invención está más particularmente destinada para el tratamiento de la piel y de las mucosas y puede presentarse en forma de ungüentos, de cremas, de leches, de pomadas, de polvos, de tampones, empapados, de soluciones, de geles, de pulverizaciones, de lociones o de suspenciones. La misma puede igualmente presentarse en forma de microesferas o nanoesferas o vesículas lipídicas o poliméricas o de parches poliméricos y de hidrogeles que permiten una liberción controlada. Esta composición por vía tópica puede presentarse bien sea en forma anhidra, o en forma acuosa. Por vía ocular, son principalmente colirios. 1 Los ligandos seleccionados entre los ligandos agonistas específicos a los receptores de tipo RAR-a y los ligandos antagonistas específicos a los receptores de tipo RAR-? se utilizan por vía tópica u ocular a una concentración generalmente comprendida entre 0,001% y 10% en peso, de preferencia entre 0,1 y 1% en peso, con relación al peso total de la composición. Las composiciones tales como se han descrito antriormente pueden bien entendido además contener aditivos inertes o incluso farmacodinámicamente activos o combinaciones de estos aditivos, y particularmente : agentes humectantes; agentes despigmentantes tales como la hidroquinona, el ácido azeláico, el ácido caféico o el ácido cojico, emolientes; agentes hidratantes como el glicerol, el PEG 400, la tiamorfolia, y sus derivados o bien también la urea; agentes antiseborréicos o antiacnéicos, tales como la S-carboximetil-cisteína, la S-bencil-cisteamina, sus sales o sus derivados, o el peróxido de benzoilo; agentes antifúngicos tales como el quetoconazol o los 4, 5-polimetilen 3-isotiazolidonas; antibacterianos, carotenóides y, particularmente, el ß-caroteno; agentes anti-psoriáticos tales como la antralina y sus derivados; y por ultimo los ácidos 5, 8, 11, 14, -eicosa tetrainóico y 5, 8, 11-eicosa trinóico, sus esteres y amidas. Estas composiciones pueden igualmente contener agentes de mejora del sabor, agentes conservadores tales como los esteres del ácido parahidroxibenzóico, los agentes estabilizantes, agentes reguladores de humedad, agentes reguladores de pH, agentes modificadores de presión osmótica, agentes emulsionantes, filtros UV-A y UV-B, antioxidantes, tales como el a-tocoferol, el butilhidroxianisol o el butilhidroxitolueno. Bien entendido, el experto en la materia cuidará de elegir el o los eventuales compuestos a añadir a estas composiciones de talmanera que las propiedades ventajosas relacionadas intrinsicamente con la presente invención no sean o sustancialmente alteradas por la adición considerada. Se facilitarán a continuación, a título en modo alguno limitativo, varios ejemplos destinados para ilustrar la presente invención.

EJEMPLO 1 Este ejemplo evidencia la eficacia in vitro como inhibidor de apoptosis de ligando antagonistas específico de RAR-?, habiendo sido inducida la apoptosis por otros retiniodes.

Cultivo y preparación de las células Se prepararon suspenciones de timocitos a partir de las glándulas de timo de ratones macho NMRI de 4 semanas (vendidos por la Sociedad LATÍ, Gódóllo, Hungria) sin tratar. El medio utilizado es el medio RPMI 1640 de Sigma suplementado en suero de ternera fetal de Gibco, 2mN de glutamina, 100UI de penicilina y 100 µg de estreptomicina/ml. Los timocitos se lavaron seguidamente y diluyeron para obtener una concentración final de 107 células/ml, antes de la incubación a 37 °C en un incubador humidificado bajo una atmósfera del 5% de C02 y el 95% de aire. La muerte de las células se midió por la toma de azul de tripan.

Análisis cualitativo y cuantitativo de ADN Los timocitos se incubaron en 24 pocilios con diversos compuestos a ensayar. Después de 6 horas de incubación, se sometieron a lisis 0,8 mi de suspenciones celulares mediante la adición de 0,7 mi de tampón de lisis conteniendo un 0,5% (v/v) de Tritón X-100, 10 mM Tris, 20mM EDTA, pH 8,0, antes de la centrifugación durante 15 minutos a 13000g.

- Análisis cuantitativo del ADN : El contenido en ADN en el sobrenadante (los fragmentos) y el residuo (cromatina intacta) se precipitó con una cantidad equivalente del 10% de ácido triclroacético, suspendido de nuevo en 5% de ácido tricloroacético, luego cuantificado utilizando el reactivo difenilamina (Burton, K. (1956) Biochem. J. 62, 315-322). - Análisis cualitativo del ADN : Paralelamente, el sobrenadante se precipitó durante una noche en etanol conteniendo 0,15 mM de Nací. Los residuos se disolvieron de nuevo en un tampón que contiene 10 mM Tris, 1 mM de EDTA, pH 8,0, tratados con RNasa, secuencialmente extraídos con idéntico volumen de fenol, cloroformo/isoamilalcohol (24/1) y precipitados en etanol antes de la electrofóresis durante 3 horas a 60V en 1,8% de gel de agarosa. Los fragmentos de ADN se visualizaron seguidamente mediante UV después de haber coloreado el gel con bromuro de etidio. Los geles obtenidos presentan la imagen de una escala de fragmentos de ADN múltiples de 180 a 200 pares de bases típicas de una inducción de apoptosis. El grado de fragmentación guarda relación con el número de células muertas positivas según el ensayo con azul de tripan a lo largo de los ensayos. Los resultados del análisis cuantitativo se indican en la tabla 1 siguiente.

Tabla ATRA es el ácido retinóico todo-trans 9-cisRA es el ácido 9-cis retinóico CD437 es el ácido 6, 3- (1-adamantil) -4-hidroxifenil) -2- naftanóico CD2665 es el ácido 4-[7- ( 1-adamanti1 ) -6- metoxietoximetoxi-2-naftiljbenzóico. El porcentaje de fragmento de ADN en esta tabla corresponde a la diferencia de porcentaje de fragmeto de ADN obtenido en timocitos tratados y del porcentaje de fragmento de ADN obtenido en timocitos no tratados (porcentaje basal de apoptosis de estos timocitos) . Esta tabla muestra claramente que la apoptosis inducida por ATRA, 9-cisRA y CD437 es inhibida por el CD2665 que es un ligando antagonista específico de los receptores de tipo RAR-?.

EJEMPLO 2 Este ejemplo evidencia la eficacia in vitro como inhibidor de apoptosis de ligando agonista específico de RAR-a, habiendo sido inducida la apoptosis por otro retinoide. Se procedió de la misma manera que en el ejemplo precedente, modificando la naturaleza de los ligandos a ensayar y su concentración. Así, el CD437 (ácido 6, 3- (1-adamantil) -4-hidroxifenil) -2-naftanóico) (a una sola concentración) se incubó con los timocitos en presencia de diferentes concentraciones de CD336 (ácido 4- ( (5, 6, 7, 8-tetrahidro- 5, 5, 8, 8-tetrametil-22-naftalenil) carboxamido) enzoico) . La tabla 2 siguiente agrupa los resultados obtenidos.

Tabla 2 El porcentaje de fragmento de ADN en esta tabla corresponde con la diferencia de porcentaje de fragmento de ADN obtenido en timocitos tratados y del porcentaje de fragmento de ADN obtenido en timocitos no tratados (porcentaje basal de apoptosis de estos timocitos) . Así, esta tabla muestra claramente que la apoptosis inducida por el CD437 que es un ligando agonista específico de los receptores de tipo RAR-? se inhiben de forma dosis dependiente por el CD336 que es un ligando agonista específico de los receptores de tipo RAR-a.

EJEMPLO 3 Este ejemplo evidencia la eficacia in vitro como inhibidor de la apoptosis de ligando agonista específico de RAR-a, habiendo sido inducida la apoptosis por la activación de un receptor de las células T. Se procedió de la misma manera que en el ejemplo 1, modificando la naturaleza de los compuestos a ensayar y su concentración. Es sabido que las células T se diferencian en linfocitos T maduros en el timo. Durante esta diferenciación, las células T proliferan y generan receptores a las células T. Las células que expresan receptores de células potencialmente autoreactivos y que interreaccionan con las células que presentan un antígeno experimentan la apoptosis (selección negativa) (Smith y col. (1989) Nature 337, 181-184) . In vitro, esta selección puede ser mimada estimulando la molécula CD3 asociada con un receptor a las células T añadiendo simultáneamente dibutirato de forbol y un Ca++ ionóforo (Iseki y col. (1991) J. Immunol. 147, 4286-4292). Así, el dibutirato de forbol (5ng/ml) y un Ca++ ionóforo (0,5 µM) se incubaron con los timocitos en ausencia o en presencia de diferentes concentraciones de CD336 (ácido 4- ( (5, 6, 7, 8-tetrahidro-5, 5, 8, 8-tetrametil-2- naftalenil) carboxamido) ) benzoico) . La tabla 3 siguiente reagrupa los resultados obtenidos.

Tabla P + C significa dibutirato de forbol (5ng/ml) y un Ca++ ionóforo (0,5 µM) El porcentaje de fragmento de ADN en esta tabla corresponde a la diferencia de porcentaje de fragmento de ADN obtenido en timocitos tratados y del porcentaje de fragmento de ADN obtenido en timocitos no tratados (porcentaje basal. de apoptosis de estos timocitos) .

Así, esta tabla muestra claramente que la apoptosis inducida por P + C es inhibida en forma de dosis-dependiente por el CD336 que es un ligando agonista específico de los receptores de tipo RAR-a.

EJEMPLO 4 Este ensayo muestra la eficiencia in vivo del ligando antagonista específico de RAR-? como inhibidor de apoptosis, habiendo sido inducida la apoptosis por un ligando agonista específico de RAR-?. Se utilizaron ratones macho NMRI de 4 semanas (vendidos por la Sociedad LATÍ, Godóllo, Hungría) . Para la inducción de la apoptosis en el timo, estos animales macho se trataron mediante inyección intraperitoneal única con 0,5 mg del ácido 6, 3- (1-adamantil) -4-hidroxifenil) -2-naftanóico, disuelto en 40 µl de DMSO y 0,5 mi de etanol al 20%. Para ver el efecto inhibidor de apoptosis inducida por un ligando agonista específico de RAR-? en el timo, los ratones macho se trataron mediante inyección intraperitoneal única con una mezcla de 0,5 mg de ácido 6, 3- (1-adamantil) -4-hidroxifenil) -2-naftanóico (CD437) y de 5mg de ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-metoxietoximetoxi-2-naftil]benzóico (CD2665), habiéndose disuelto esta mezcla en 40 µl de DMSO y 0,5 mi de etanol al 20%. Para el control, se trataron ratones macho mediante inyección intraperitonial única de una mezcla de 40 µl de DMSO y de 0,5 mi de etanol al 20%. El CD2665 se sometió a ensayo igualmente solo en las mismas condiciones que anteriormente en 0,5 mg. El peso del timo se determinó después de 48 horas de tratamiento, los resultados se indican en la tabla 4 siguiente.

Tabla Así, se observa una involución del tipo después de un tratamiento con el CD 437 solo, no se observó ningún cambio significativo con el CD 2665, mientras que la asociación de CD 2665 y CD 437 presenta un involución del timo mucho menos importante que la observada con el CD 437 solo.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere .

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Utilización de al menos un ligando seleccionado entre un ligando agonista específico a los receptores de tipo RAR-a y un ligando antagonita específico a los receptores de tipo RAR-? en la preparación de una composición farmacéutica destinada para disminuir el porcentaje de apoptosis en al menos una población celular.

2. Utilización según la reivindicación anterior, caracterizada porque la población celular corresponde a células en las cuales la apoptosis puede estar regulada por inducción y/o inhibición por medio de receptores de tipos RAR-? y/o RAR-a o en la cual la apoptosis puede ser regulada por inducción por medio de receptores de células T.

3. Utilización según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el ligando antagonista específico a los receptores de tipo RAR-?, es elegido entre el ácido 2-hidroxi-4-[7- (1-adamantil) -6-benciloxi-2-naftilJbenzóico, el ácido 2-hidroxi-4-[7- ( 1-adamantil) -6-hexiloxi-2-naftilJbenzóico, 2 el ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-metoxietoximetoxi-2-naftiljbenzóico, el ácido 5-[7- (1-adamantil) -6-benciloxi-2-naftil]-2-tiofencarboxílico, el ácido 4-[7-(l-adamantil) -6-benciloxi-2-naftiljbenzóico, el ácido 4-[7-(1-adamantil) -6-benciloxicarbonil-2-naftiljbenzóico, el ácido 2-hidroxi-4-[7- (1-adamantil) -6- (4-fluorobencil) oxi-2-naftiljbenzóico, el ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-heptiloxi-2-naftiljbenzóico, el ácido 6-[7- (1-adamantil) -6-metoxietoximetoxi-2-naftil]nicotínico, el ácido 2-hidroxi-4-[7- ( 1-adamantil ) -6-metoxietoximetoxi-2-naftiljbenzóico, el ácido 2-cloro-4-[7- (1-adamantil) -6-metoxietoximetoxi-2-naftil]benzóico, el ácido 4-[7-(l-adamantil) -6-metoxibutiloxi-2-naftil]benzóico, el ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-metoximetoxipro?il-2-naftiljbenzóico, el ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-metoxietoxipropil-2-naftiljbenzóico y el ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-acetiloxibutoxi-2-naftiljbenzóico.

4. Utilización según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el ligando antagonista específico a los receptores de tipo RAR-? presenta una constante de disociación de este ligando para los receptores de tipo RAR-? al menos 20 veces inferior a la constante de disociación de este ligando para los receptores de tipo RAR-a, tal como el ácido 4-[7- (1-adamantil) -6-metoxietoximetoxi-2-naftiljbenzóico.

5. Utilización según la reivindicación 1 6 2, caracterizada porque el ligando agonista específico a los receptores de tipo RAR-a presenta una constante de disociación para los receptores de tipo RAR-a al menos 20 veces inferior a su constante de disociación para los receptores de tipo RAR-?.

6. Utilización según una de las reivindicaciones 1, 2 y 5, caracterizada porque el ligando agonista específico a los receptores de tipo RAR-a es elegido entre el ácido 4- ( (5, 6, 7, 8-tetrahidro-5,5,8, 8-tetrametil-2-naftalenil) carboxamido) benzoico y el ácido 2-hidroxi-4- (5, 5, 8, 8-tetrametil-5, 6, 7, 8-tetrahidro-naftalen-2-carboxamido) -benzoico.

7. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composición farmacéutica está destinada para tratar las enfermedades relacionadas con un exceso del porcentaje de apoptosis.

8. Utilización según la reivindicación anterior, caracterizada porque las enfermedades relacionadas con un exceso del porcentaje de apoptosis son seleccionadas entre el síndrome de inmunodeficiencia del virus de inmunodeficiencia humano (H.I.V.), las enfermedades neuro-degenerativas, los síndromes mielodisplásticos, los síndromes de isquemia, las enfermedades del hígado inducidas por toxinas, la alopecia, los daños de la piel debidos a los rayos U.V., el liquen plano, la atrofia de la piel, las cataratas o también el rechazo de transplantes.

9. Utilización según la reivindicación precedente, caracterizada porque las enfermedades neurodegenerativas son seleccionadas entre la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrópica y otras enfermedades relacionadas con una degeneración del cerebro, tal como la enfermedad de Creutzfeld Jakob.