MXPA98001920A - Composicion farmaceutica util para la transfeccion de acidos nucleicos y sus usos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición farmacéuticaútil para la transfección de unácido nucleico caracterizada porque contiene además de dichoácido nucleico y al menos un agente de transfección, al menos un compuesto que asocia las propiedades de fijación del ADN a una capacidad de vectorización nuclear de este ADN. Se reporta además la utilización de dicha composición para la transferencia in vitro, ex vivo y/o in vivo deácidos nucleicos.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA ÚTIL PARA LA TRANSFECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Y SUS USOS La presente invención se refiere al dominio de la terapia génica y se interesa mas particularmente a la transferencia in vitro, ex vivo y/o in vivo de material genético. Propone en particular una nueva composición farmacéutica útil para transfectar eficazmente las células. También se relaciona con los usos de esta composición. Las deficiencias y/o anomalías (mutación, expresión aberrante, etc. ) cromosómicas son el origen de numerosas enfermedades, un carácter hereditario o no. Durante mucho tiempo, la medicina convencional permaneció imposibilitada en su campo. Actualmente, con el desarrollo de la terapia génica, se espera poder corregir o prevenir en adelante este tipo de aberración cromosómica. Esta nueva medicación consiste en introducir una información genética, en la célula u órgano afectado, con el fin de corregir esta deficiencia o anomalía o aún, de expresarla en una proteina de interés terapéutico. El principal obstáculo a la penetración de un ácido nucleico en una célula o en un órgano receptor, reside en el tamaño y naturaleza polianiónica de este ácido nucleico que se opone a su paso a través de las membranas celulares. Para salvar esta dificultad, se proponen actualmente REF: 26844 diversas técnicas de las cuales en particular la transfección de ADN desnudo a través de la membrana plásmica in vivo (WO90/11092) y la transfección de ADN por via de un vector de transfección. En lo que se refiere, la transfección de ADN desnudo, su eficiencia permanece aún muy pequeña. Los ácidos nucleicos desnudos poseen una vida media plasmática corta en razón de su degradación por las enzimas y de su eliminación por las vías urinarias. Por lo que es la segunda técnica, propone principalmente dos estrategias: La primera emplea los vectores de transfección naturales que son los virus. Así se propone utilizar los adenovirus, los virus del herpes, los retrovirus y mas recientemente los virus adeno asociados. Estos vectores se prueban actuando en el plan de la transfección pero desgraciadamente no se pueden excluir totalmente en su campo ciertos riesgos de patogenicidad, replicación y/o inmunogenicidad, inherentes a su naturaleza viral. La segunda estrategia consiste en utilizar ventajosamente los agentes no virales capaces de promover la transferencia y expresión de ADN en células eucariotas. El objetivo de la presente invención se inscribe particularmente en esta segunda estrategia. Los vectores químicos o bioquímicos representan una alternativa ventajosa con los virus naturales en particular por esta ausencia de respuesta inmunológica y/o recombinación viral. No poseen el poder patógeno, el riesgo de multiplicación de ADN en estos vectores es nulo y no se sujetan a ningún límite teórico en lo que se refiere al tamaño del ADN a transfectar. Estos vectores sintéticos tienen dos funciones principales, condensar el ADN a transfectar y promover su fijación celular así como su paso a través de la membrana plásmica y, en caso de necesidad, las dos membranas nucleares. Por parte de su naturaleza polianiónica, el ADN no tiene ninguna afinidad natural por la membrana plásmica de las células de naturaleza igualmente polianiónica. Para disminuir este inconveniente, los vectores no virales poseen generalmente todas las cargas policatiónicas. Entre los vectores sintéticos desarrollados, los polímeros catiónícos de tipo polilisina y DEAE dextran o aún los lípidos catiónicos o lipofectantes son los mas ventajosos. Poseen la propiedad de condensar el ADN y de promover su asociación con la membrana celular. Mas recientemente, se desarrollo el concepto de la transfección dirigida, mediada por un receptor. Esta técnica pone el beneficio del principio de condensar el ADN gracias al polímero catiónico, todo dirigido a la fijación del complejo en la membrana con ayuda de un acoplamiento químico eriirrc o l polímero catiónico y el ligando de un receptor membranal, presente en la superficie del tipo celular que se quiere insertar. Los cribados del receptor de la transferrina, de la insulina o del receptor de las asialoglicoproteínas de los hepatocitos han sido así descritos. Sin embargo, los vectores sintéticos propuestos actualmente están aún lejos de actuar también como los vectores virales. En particular esto puede ser la consecuencia de una condensación insuficiente del ADN a transfectar y/o de las dificultades encontradas por el ADN transfectado para salir del endosoma y penetrar en el núcleo celular. En efecto, el transporte de ADN en el núcleo de una célula eucariota en reposo expone un problema evidente puesto que las dimensiones de los poros nucleares no permiten mas que la difusión de proteínas de peso molecular inferior a 60000 Da. (I. Davis et al., Ann. Rev. Biochem. 1995; 64; 865- 896) : Un ADN plasmídico que posee un peso molecular superior a 10c no puede por lo tanto penetrar naturalmente en el núcleo celular por simple difusión.

La presente invención tiene precisamente por objetivo proponer una solución ventajosa al problema citado. Mas precisamente, la presente invención propone una composición farmacéutica útil para la transfección de al menos un ácido nucleico caracterizada porque contiene además de dicho ácido nucleico y al menos de un agente de transfección, al menos un compuesto que asocia las propiedades de fijación del ADN con una capacidad de vectorizacíón nuclear de este ADN.

En el sentido de la invención, un compuesto que posee las propiedades de fijación del ADN, cubre todo compuesto capaz de fijarse al menos parcialmente al ADN a vectorizar. En lo que se refiere mas particularmente a su aptitud de vectorizar este ADN, se traduce en sentido de la invención por una eficacia de dirigir este ADN eficazmente a través de las diferentes membranas celulares y/o nucleares para conducir hasta dentro del núcleo de la célula a tratar. El compuesto de acuerdo a la invención también puede presentarse por ejemplo bajo el aspecto de una molécula quimérica que asocia un dominio de fijación del ADN, a un dominio que permite el importe nuclear. En este caso particular, se puede seleccionar entre los dominios de fijación del ADN, los que salen de proteínas reguladoras capaces de unirse por ejemplo a las secuencias específicas o al contrario de proteínas conocidas para poseer una afinidad no secuencia dependiente para el ADN. En lo que se refiere mas particularmente al dominio implicado en el importe nuclear, puede ser por ejemplo por una secuencia de dichos nls (Nuclear localisation Sequence) . Tales secuencias podrían ser aparentes o derivadas del consenso bipartita deducido de la nucleoplasmina o del consenso del antígeno T de SV40.

De acuerdo a una modalidad de realización particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica útil para la transfección de al menos un ácido nucleico caracterizada porque contiene además de dicho ácido nucleico y al menos un agente de transfección, al menos un compuesto que pertenece a la familia de los HMG o uno de sus derivados.

Las proteínas de tipo HMG, por "High Mobility Group" son proteínas ricas en aminoácidos cargados y que poseen una masa molecular inferior a 30000 Da. Solubles en ácido perclórico 2-5%, se extraen clásicamente de la cromatina con NaCl 0.35 M.

Clásicamente, se distinguen 3 familias de proteínas HMG: las proteínas del tipo HMG1/2 de masa molecular vecina de 25000, HMG14/17 de masa molecular vecina de 10-12000, y HMGI/Y de composición vecina de las proteínas de tipo HMG14/17 pero en la que la repartición tisular y el desarrollo de la ontogénesis es diferente. Se sabe que la secuencia primaria de las proteínas se conservó durante la evolución dentro de alguna de estas tres familias.

En lo que se refiere mas particularmente las proteínas de la familia HMG1/2, se caracterizan por la presencia de una secuencia de 80 aminoácidos con predominancia básica (carga neta +20), es decir "caja HMG", que constituye un dominio de unión del ADN. En esta familia se distinguen las proteínas capaces de unirse a las secuencias específicas de ADN de doble hebra y las proteínas de las que la especificidad de unión reside en una estructura tridimensional particular de ADN. En la primera categoría se encuentran las proteínas UBF, SRY, TCF1, ABF2, que estimulan la transcripción de genes específicos (greiss E.A. et al. J. Mol. Evol. (1993) 37:204-210) . La secuencia de cada una de estas proteínas contiene una o mas "cajas HMG". La décima categoría está representada por las proteínas HMGl y HMG2. Su secuencia primaria se caracteriza por la presencia de dos "cajas HMG" y de una secuencia acida en el C-término (Bustin M. B.B.A. (1990) 1049:231-243). Estas proteínas se unen de manera específica sobre las secuencias de ADN palindrómicas extruidas en estructura cruciforme (acopladas intrahebra al nivel del palíndroma) o sobre las secuencias de ADN que presentan una fuerte curvatura. Estos dos tipos de estructura tienen en común ensanchar el pequeño surco de ADN que se vuelve entonces capaz de acomodar la unión de las proteínas de tipo HMG1/2. El papel fisiológico de las proteínas HMGl y HMG2 está actualmente poco elucidado. Se ha demostrado sin embargo que la proteína HMGl de ternero se transporta de manera activa en el núcleo de las células de mamíferos. (L. Kuehl et al; J. Biol. Chem. 1985; 260, 10361-10368).

De forma inesperada, la Firma solicitante ha demostrado que sería posible beneficiarse de estas facultades de las proteínas HMG, de saber sus aptitudes de fijar el ADN y de ser transportadas de manera activa en el núcleo, para promover eficientemente la transfección en el núcleo de las células a tratar de secuencias nucleicas heterólogas, asociadas a al menos un agente transfectante. En el sentido de la presente invención, el término derivado designa todo péptido, pseudopéptido (péptido que incorpora los elementos no bioquímicos) o proteína que difiere del compuesto tal como se definió anteriormente, obtenido por una o mas modificaciones de naturaleza genética y/o química. Por modificación de naturaleza genética y/o química se puede entender toda mutación, sustitución, eliminación, adición y/o modificación de uno o mas residuos por ejemplo de la proteína considerada. Mas precisamente, por modificación química, se entiende toda modificación del péptido o proteína generada por reacción química inserción química de molécula (s), biológica (s) o no, en un número cualquiera de residuos de la proteína. Por modificación genética, se entiende toda secuencia peptídica de la que el ADN híbrido con secuencias o fragmentos ésta y de la que el producto posee las actividades indicadas. Tales derivados pueden generarse con diferentes fines, tales como particularmente aumentar la afinidad del polipéptido correspondiente para su ligando de ADN, mejorar sus niveles de producción, aumentar su resistencia a las proteasas, aumentar y/o modificar una de sus actividades, o conferir nuevas propiedades farmacocinéticas y/o biológicas. Entre los derivados que resultan de una adición, se puede citar por ejemplo las secuencias peptídicas quiméricas que contienen una parte heteróloga suplementaria unida a una extremidad. El término derivado comprende también las secuencias proteicas homologas de la secuencia considerada, obtenidas de otras fuentes celulares y perticularmente células de origen humano, o de otros organismos, y que poseen una actividad del mismo tipo. Tales secuencias homologas pueden obtenerse por experimentos de hibridación del ADN correspondiente. Las hibridaciones pueden realizarse a partir de bancos de ácidos nucleicos, utilizando como sonda la secuencia nativa o un fragmento de ésta, en las condiciones de astringencia convencionales (Maniatis et al.), (Cf técnicas generales de biología molecular) , o, de preferencia, en condiciones de astringencia elevadas. Además, también es considerable en el marco de la presente invención beneficiarse de la fuerte afinidad de ciertas proteínas de la familia HMG, o de sus derivados por las estructuras secundarias presentes en el ADN de doble hebra. Se puede tratar en particular de estructuras de cuatro hebras para las cuales se ha demostrado en particular que el HMGl de rata posee una fuerte afinidad (Bianchi et al. Sciences, 1989, 243, 1056-1059) . Tales estructuras también pueden obtenerse a partir de secuencias naturales tales como los ITRs del virus asociado a los adenovirus o bien ser completamente sintéticas obtenidas a partir de palíndromas artificiales.

De acuerdo a una modalidad de realización preferida de la invención, el compuesto empleado se selecciona entre las proteínas de tipo HMG 1, 2, I, Y, 14 y 17 y sus derivados. Se representa mas preferentemente por toda o parte de la proteína HMGl humana o uno de sus derivados u homólogos tal como se definió anteriormente.

En una modalidad de realización particularmente ventajosa, las composiciones de la presente invención contienen además un elemento de direccionamiento que permite orientar la transferencia del ácido nucleico. Este elemento de direccionamiento puede ser un elemento de direccionamiento extracelular, que permite orientar la transferencia del ácido nucleico hacia ciertos tipos celulares o ciertos tejidos deseados (células tumorales, células hepáticas, células hematopoiéticas, etc) . También puede tratarse de un elemento de direccionamiento intracelular, que permite orientar la transferencia del ácido nucleico hacia ciertos compartimentos celulares privilegiados (mitocondrias, núcleo, etc) . Mas preferentemente el elemento de direccionamiento se une, de forma covalente o no covalente, al compuesto de acuerdo a la invención. El elemento de direccionamiento también puede unirse al ácido nucleico. De acuerdo a una modalidad privilegiada de la invención, dicho compuesto se asocia, por vía de una parte heteróloga suplementaria unida a una de sus extremidades, a un ligando del receptor celular presente en la superficie del tipo celular como por ejemplo un azúcar, la transferrina, la insulina o la proteína asialo-orosomucoide. También se puede tratar de un ligando de tipo intracelular como una secuencia señal de localización nuclear, nls, que privilegia la acumulación del ADN transfectado dentro del núcleo.

Entre los elementos de direccionamiento útiles dentro del marco de la invención, se pueden citar los azúcares, los péptidos, los oligonucleótidos o los lípidos. Preferentemente, se trata de azúcares y/o péptidos tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, ligandos de receptores celulares o fragmentos de éstos, receptores o fragmentos de receptores, etc. En particular, puede tratarse de ligandos de receptores de factores de crecimiento, de receptores de citocinas, de receptores de lectinas celulares o de receptores de proteínas de adhesión. También se puede citar el receptor de la transferrina, de los HDL y de los LDL. El elemento de direccionamiento también puede ser un azúcar que permite direccionar las lectinas tales como los receptores asialoglicoproteícos, o aún un fragmento Fab de anticuerpos que permiten direccionar el receptor del fragmento Fe de las inmunoglobulinas.

Ventajosamente, el compuesto de acuerdo a la invención puede ser además poliglicosilado, sulfonado y/o fosforilado y/o insertado en los azúcares complejos o a un compuesto lipófilo como por ejemplo una cadena policarbonada o un derivado del colesterol.

La composición de acuerdo a la invención puede por supuesto contener compuestos de acuerdo a la invención, de naturaleza diferente. Igual, se prueba poder asociar al compuesto de acuerdo a la invención, otro compuesto de direccionamiento nuclear anteriormente descrito, un segundo compuesto caracterizado por su capacidad de compactar el ADN. Tales compuestos se describen particularmente en la solicitud FR 95/01865.

El compuesto de acuerdo a la invención está presente en cantidad suficiente para actuar con el ácido nucleico de acuerdo a la invención. Es así que la relación compuesto/ácido nucleico (expresada en peso) puede estar comprendida entre 0.01 y 5 y mas preferentemente entre 0.25 y 0.5.

En lo que se refiere al agente de transfección presente en la composición de acuerdo a la invención, se elige preferentemente entre los polímeros catiónicos y los lipofectantes.

De acuerdo a la presente invención, el polímero catiónico es de preferencia un compuesto de fórmula general I, en la que - R puede ser un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula - n es un número entero comprendido entre 2 y 10; - p y q son números enteros, entendiéndose que la suma p+q es tal como el peso molecular promedio del polímero que está comprendido entre 100 y 107 Da. Se entiende que, en la fórmula (I) el valor de n puede variar entre los diferentes elementos p. Así, la fórmula (I) reagrupa a la vez los homopolímeros y los heteropolímeros.

Mas preferentemente, en la fórmula (I), n está comprendido entre 2 y 5. En particular, los polímeros de polietilén imina (PEÍ) y polipropilén imina (PPl) presentan todas las propiedades ventajosas. Los polímeros preferidos para emplear la presente invención son aquellos en las que el peso molecular está comprendido entre 103 y 5.106. A manera de ejemplo, se puede citar la polietilén imina de peso molecular promedio 50 000 Da (PEI50K) o la polietilén imina de peso molecular promedio 800 000 Da (PEI800K) .

La PEI50K o la PEI800K son disponibles comercialmente.

En cuanto a los otros polímeros representados por la fórmula general I, pueden ser preparados de acuerdo al procedimiento descrito en la solicitud de patente FR 94 08735.

Para obtener un efecto óptimo de las composiciones de la invención, las proporciones respectivas del polímero y el ácido nucleico se determinan de preferencia de tal forma que la relación molar R = aminas del polímero/fosfatos del ácido nucleico este comprendida entre 0.5 y 50, mas preferentemente entre 5 y 30. Todos los resultados particularmente ventajosos se obtienen utilizando de 5 a 15 equivalentes de aminas de polímero por carga de ácido nucleico.

En lo que se refiere mas particularmente a los lipofectantes, se trata de moléculas amfifilas que contienen al menos una región hidrófila catiónica, por ejemplo poliamina, y una región lipófila. La región catiónica, preferentemente poliamina, cargada catiónicamente, es capaz de asociarse de manera reversible con el ácido nucleico, cargado negativamente. Esta interacción compacta fuertemente al ácido nucleico. La región lipófila hace esta interacción iónica inaccesible al medio acuoso externo, recubriendo la partícula nucleolipídica formando una película lipídica.

Ventajosamente, estos lipofectantes también pueden elegirse entre las lipopoliaminas en las que la región poliamina responde a la fórmula general II en la que m es un número entero superior o igual a 2 y n es un número entero superior o igual a 1, m puede variar entre los diferentes grupos de carbono comprendidos entre dos aminas. Preferentemente, m está comprendido entre 2 y 6 inclusivamente y n está comprendido entre 1 y 5 inclusivamente. Aún mas preferentemente, la región poliamina está representada por la espermina, la termina o uno de sus análogos que han conservado las propiedades de unión al ADN. En cuanto a la región lipófila, está representada por al menos una cadena hidrocarbonada, saturada o no, de colesterol, un lípido natural o un lípido sintético capaz de formar las fases lamelares o hexagonales, unida de manera covalente a la región hidrófila.

La solicitud de patente EP 394 111 describe otras lipopoliaminas de fórmula general III susceptibles de emplearse en el marco de la presente invención H,N-(-(CH)rn-NH-)n-H II en la que R representa en particular un radical de fórmula general (R:R2) N-CO-CH2-NH-CO-.

A forma representativa de estas lipopoliaminas se puede citar mas particularmente la dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) y la 5-carboxiespermilamida de la palmitoilfosfatidiletanolamina (DPPES) .

Las lipopoliaminas descritas en la solicitud de patente FR 94 14596 también pueden utilizarse ventajosamente a título de agente de transfección de acuerdo a la invención. Se representan por la fórmula general III anterior en la que R representa con - X y X1 representando, independientemente una de la otra, un átomo de oxígeno, un grupo metileno -(CH2)q- con q igual a 0, 1, 2 o 3, o un grupo amino -NH- o -NR'- con R' representando un grupo alquilo de Cx a C4, - Y y Y' representando independientemente una de la otra un grupo metileno, un grupo carbonilo o un grupo C=S, - R3, R4 y R5 representando independientemente uno del otro un átomo de hidrógeno o un radical alquilo, sustituido o no, de Cx a C4, con p que puede variar entre 0 y 5, - R6 representa un derivado del colesterol o un grupo alquilo amino -NR^ con Rx y R2 representando independientemente uno del otro un radical alifático, saturado o no, lineal o ramificado de C12 a C22.

A título representativo de estas lipopoliaminas se puede citar particularmente todo el (Dioctadecil-carbamoilmetoxi) -acetato de 1, 3-bis- (3-amino-propilamino) -2-propilo.

Las solicitudes de patente EP 394 111 y FR 94 también describen un procedimiento útil para la preparación de las lipopoliaminas correspondientes.

De forma particularmente ventajosa, se pueden utilizar dentro del marco de la invención la dioctadecila idoglicil espermina (DOGS) la 5-carboxiespermilamida de la palmitoilfosfatidiletanolamina (DPPES), el (Dioctadecil-carbamoilmetoxi) -acetato de 2, 5-bis- (3-amino-propilamino) -pentilo o el (Dioctadecil-carbamoilmetoxi) -acetato de 1,3-bis- (3-amino-propilamino) -2-propilo.

Para obtener un efecto óptimo de las composiciones de la invención, las proporciones respectivas de la poliamina y el ácido nucleico se determinan de preferencia de tal forma que la relación R cargas positivas del agente de transfección/cargas negativas del ácido nucleico este comprendida entre 0.1 y 10 y mas preferentemente entre 0.5 y 2.

La presencia de un compuesto de acuerdo a la invención dentro de una composición transfectante es ventajosa de varias formas. En particular, se sigue de una toxicidad netamente disminuida que hace en adelante posible por ejemplo la transfección de células sensibles al origen del agente de transfección como por ejemplo las células hematopoiéticas con las lipopoliaminas.

En las composiciones de la presente invención, el ácido nucleico puede ser tanto un ácido desoxirribonucleico como un ácido ribonucleico. Puede tratarse de secuencias de origen natural o artificial, y en particular de ADN genómico, ADNc, ARNm, ARNt, ARNr, de secuencias híbridas o de secuencias sintéticas o semi-sintéticas. Estos ácidos nucleicos pueden ser de origen humano, animal, vegetal, bacteriano, viral, etc. Pueden obtenerse por toda técnica conocida por el experto en el arte, y en particular por cribado de bancos, por síntesis química o aún por métodos mixtos que incluyen modificación química o enzimática de secuencias obtenidas por cribado de bancos. Por otro lado pueden incorporarse dentro de vectores, tales como los vectores plasmídicos.

Con respecto mas particularmente a los ácidos desoxirribonucleicos, pueden ser de hebra simple o doble. Estos ácidos desoxirribonucleicos pueden codificar para los genes terapéuticos, secuencias reguladores de la transcripción o de la replicación, secuencias antisentido, regiones de unión a otros componentes celulares, etc. En el sentido de la invención, se entiende por gen terapéutico en particular todo gen que codifica para un producto proteico que tiene un efecto terapéutico. El producto proteico así codificado puede ser una proteína, un péptido, etc. Este producto proteico puede ser homólogo frente a la célula blanco (es decir un producto que se expresa normalmente en la célula blanco cuando no presenta ninguna patología) . En este caso la expresión de una proteína permite por ejemplo paliar una expresión insuficiente dentro de la célula o la expresión de una proteína inactiva o pequeñamente activa en razón de una modificación, o aún de sobreexpresar dicha proteína. El gen terapéutico también puede codificar una mutante de una proteína celular, que tiene una estabilidad aumentada, una actividad modificada, etc. El producto proteico también puede ser heterólogo frente a la célula blanco. En este caso, una proteína expresada puede por ejemplo completar o aportar una actividad deficiente dentro de la célula, lo que permite combatir una patología, o estimular una respuesta inmunitaria.

Entre los productos terapéuticos en el sentido de la presente invención, se pueden citar mas particularmente las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocinas: interleucinas, interferones, TNF, etc. (FR 9203120), los factores de crecimiento, los neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, los factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofina, etc; las apolipoproteínas: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la distrofina o una minidistrofina (FR 9111947), la proteína CFTR asociada a la mucoviscidosis, los genes supresores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, -rev, etc (FR 93 04745), los genes que codifican para factores implicados en la coagulación: Factores VII, VIII, IX, los genes que intervienen en la reparación del ADN, los genes suicidas (timidina cinasa, citosina desaminasa), etc.

Los genes terapéuticos también pueden ser un gen o una secuencia antisentido, del que la expresión dentro de la célula blanco permite controlar la expresión de genes o la transcripción de ARNm celulares. Tales secuencias pueden, por ejemplo, ser transcritas dentro de la célula blanco en ARN complementarios de ARNm celulares y bloquear así su traducción en proteína, de acuerdo a la técnica descrita en la patente EP 140 308. Los antisentidos también contienen las secuencias que codifican para los ribosomas, que son capaces de destruir selectivamente los ARN blancos (EP 321 201) .

Como se indica mas adelante, el ácido nucleico también puede contener uno o mas genes que codifican para un péptido antigénico, capaz de generar en el hombre o animal una respuesta inmunitaria. Dentro de esta modalidad particular de empleo, la invención permite por consecuencia la realización ya sea de vacunas ya sea de tratamiento inmunoterapéuticos aplicados al hombre o al animal, particularmente contra los microorganismos, virus o cánceres. Se puede tratar en particular de péptidos antigénicos específicos del virus de Epstein Barr, del virus de VIH, del virus de hepatitis B (EP 185 573), del virus de la pseudo-rabia, o aún específicos de tumores (EP 259 212) .

Preferentemente el ácido nucleico que también contiene las secuencias que permiten la expresión del gen terapéutico y/o del gen que codifica para el péptido antigénico dentro de la célula u órgano deseado. Puede tratarse de secuencias que son naturalmente responsables de la expresión del gen considerado cuando estas secuencias son susceptibles de funcionar dentro de la célula infectada. También puede tratarse de secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o también sintéticas) . Particularmente, puede tratarse de secuencias promotoras de genes eucariotes o virales. Por ejemplo, puede tratarse de secuencias promotoras obtenidas del genoma de la célula que se desea infectar. También, puede tratarse de secuencias promotoras obtenidas del genoma de un virus. A este respecto, se pueden citar por ejemplo los promotores de los genes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. Además, estas secuencias de expresión pueden ser modificadas por adición de secuencias de activación, de regulación, etc. Por otro lado, el ácido nucleico también puede contener, en particular mas alto que el gen terapéutico, una secuencia señal que dirige el producto terapéutico sintetizado en las vías de secreción de la célula blanco. Esta secuencia señal puede ser la secuencia señal natural del producto terapéutico, pero también puede tratarse de otra secuencia señal funcional, o de una secuencia señal artificial. Mas preferentemente, las composiciones de la invención contienen además uno o mas lípidos neutros. Tales composiciones son particularmente ventajosas, en particular cuando la relación R es pequeña. La firma solicitante ha demostrado en efecto que la adición de un lípido neutro permite mejorar la formación de partículas nucleolipídicas y, de manera sorprendente, favorecer la penetración de la partícula en la célula desestabilizando su membrana. Mas preferentemente, los lípidos neutros utilizados dentro del marco de la presente invención son lípidos de dos cadenas grasas. De manera particularmente ventajosa, se utilizan los lípidos naturales o sintéticos, zwiteriónicos o desprovistos de carga iónica en las condiciones fisiológicas. Pueden elegirse mas particularmente entre la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), la oleoil-palmitoilfos-fatidiletanolamina (POPE), la di-estearoil, -palmitoil, -miristoil fosfatidiletanolamina así como sus derivados N-metilados 1 a 3 veces; los fosfatidilgliceroles, los diacilgliceroles, los glicosildiacilgliceroles, los cerebrósidos (particularmente tales como los galactocerebrósidos) , los esfingolípidos (particularmente tales como las esfingomielinas) o aún los asialogangliósidos (particularmente tales como los asialoGMl y GM2) . Estos diferentes lípidos pueden obtenerse ya sea por síntesis, ya sea por extracción a partir de órganos (ejemplo: el cerebro) o de huevos, por las técnicas clásicas bien conocidas por el experto en el arte. En particular, la extracción de lípidos naturales puede realizarse por medio de solventes orgánicos (también ver Lehninger, Biochemistry) . Preferentemente las composiciones de la invención, emplean a título de agente de transfección un lipofectante, contienen de 0.1 a 20 equivalentes de lípido neutro por 1 equivalente de lipopoliamina, y, mas preferentemente, de 1 a 5. En el caso donde el agente de transfección es un polímero catiónico, las composiciones de la invención contienen, mas del polímero catiónico en las relaciones citadas antes, de 0.1 a 20 equivalentes molares de lípido neutro por 1 equivalente molar de fosfato de ácido nucleico, y, mas preferentemente, de 1 a 5.

Las composiciones de acuerdo a la invención pueden formularse con objeto de administraciones por vía tópica, cutánea, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, sub-cutánea, intraocular, transdérmica, etc.. De preferencia, las composiciones farmacéuticas de la invención contienen un vehículo farmacéutico aceptable para una formulación inyectable, en particular para una inyección directa al nivel del órgano deseado, o para una administración por vía tópica (en piel y/o mucosa) . Puede tratarse en particular de soluciones estériles, isotónicas, o de composiciones secas, en particular liofilizadas, que, por adición según el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de solutos inyectables. Las dosis de ácido nucleico utilizadas para la inyección así como el número de administraciones pueden ser adaptados en función de la manera de administración utilizada, de la patología referente, del gen a expresar, o aún de la duración del tratamiento investigado. Pueden utilizarse ventajosamente para transfectar una gran variedad de tipo celular como por ejemplo las células hematopoiéticas, los linfocitos, los hepatocitos, las células endoteliales, las células de melanomas, de carcinomas y de sarcomas, las células musculares lisas, las neuronas y los astrocitos.

La presente invención proporciona así un método particularmente ventajoso para el tratamiento de enfermedades que utilizan la transfección in vitro, ex vivo o in vivo de un ácido nucleico apto para corregir dicha enfermedad en asociación con un agente de transfección de tipo polímero catiónico o lipofectante, y un compuesto tal como se definió anteriormente. Mas particularmente, este método es aplicable a las enfermedades que resultan de una deficiencia en un producto proteico o nucleico y el ácido nucleico administrado codifica para dicho producto proteico o contiene la secuencia que corresponde a dicho producto nucleico. Las composiciones de acuerdo a la invención son particularmente interesantes por su biodisponibilidad y su nivel de transfección.

La presente invención también se refiere a toda utilización de un compuesto de acuerdo a la invención acoplado a un ligando del receptor celular, un anticuerpo o derivado de anticuerpo, dirigir un ácido nucleico hacia las células que expresan los receptores o anti-genes correspondientes. Dentro de esta perspectiva, un ligando, anticuerpo o derivado de anticuerpo potencial se acopla a dicho compuesto y se aprecia el poder de transfección de esta molécula quimérica comparativamente al compuesto solo.

La presente invención será descrita mas completamente con la ayuda de los siguientes ejemplos, que deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos.

FIGURAS: Figura 1: Representación en intensidades luminosas de la eficiencia de transfecciones realizadas de acuerdo a la invención en diferentes tipos celulares.

Figura 2: Apreciación de la eficiencia de transfecciones realizadas en presencia y en ausencia de HMGl.

MATERIALES Y MÉTODOS: La construcción utilizada para demostrar la actividad de las composiciones de la invención es un plásmido que contiene el gen que codifica para la luciferasa (Luc) , pCMV-Luc.

El plásmido pCMV-luc contiene el promotor del Citomegalovirus (CMV) , extraído del plásmido vector pcDNA3 (Invitrogen) para cortar con las enzimas de restricción Mlu I y HindIII, situado por arriba del gen que codifica para la luciferasa, insertado en los sitios Mlul y HindIII en el vector pGL basic Vector (Promega) .

EJEMPLO 1: PREPARACIÓN DE LA PROTEÍNA HMGl DE RATA 1.1 Expresión de la proteina HMGl en E. coli Esta proteína recombinante que proviene de un mamífero ha sido preparada para sobreexpresión en E. coli . El plásmido T7-RNHMG1 que codifica para la proteína HMGl de rata (M. E. Bianchi, Gene, 104 (1991) 271-275) se introduce en la cepa de E. coli BL21(DE3) . La cepa se cultiva enseguida a 37°C en medio LB+Ampicilina (25 mg/L) . Se obtiene un precultivo a partir de una colonia aislada. Permite sembrar un cultivo de 500 ml. Cuando la absorbancia a 600 nm del cultivo tenga el valor de 0.7, la síntesis de HMGl se induce por adición de IPTG. Las células se cosechan enseguida por centrifugación (5000 x g, 20 minutos), lavadas con 200 ml de agua destilada centrifugadas de nuevo. El paquete de células se conserva a -80°C hasta la purificación. 1.2: purificación de la proteína HMGl recombinante La purificación de la proteína HMGl puede efectuarse por cromatografía a partir de un cultivo de la cepa de E. coli descrita en el ejemplo 1.1, por ejemplo utilizando el siguiente protocolo: Salvo indicación contaría, el conjunto de la purificación descrita a continuación se efectúa a 4°C. Las células obtenidas a partir de 500 ml de cultivo se resuspenden en 15+ml de amortiguador Tris/HCl 50 mM pH 7.7 que contiene EDTA 500 µM, DTT 5 mM, Pefabolc SC [4- (2-aminoetil) -bencensulfonil fluroruro hidrocloruro] 200+µM, y glicerol al 10% (peso/volumen) . Después del rompimiento de las células por sonicación durante 15+min, los restos celulares se separan por centrifugación (50 000 x g; lh) . El extracto celular se cromatografía enseguida a través de una columna Sephadex G-25 (Pharmacia) equilibrada y eluida con amortiguador A [Hepes 20 mM pH 7.9 que contiene cloruro de sodio 400 mM, EDTA 200 mM, DTT 1 mM, Pefabloc SC 200 µM, Nonidet P40 al 0.2%, y glicerol al 10%]. La fracción que contiene las proteínas se recolecta y cromatografía a través de una columna de gel DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia) equilibrado con el amortiguador A. La fracción proteica no retenida en esta columna se mezcla progresivamente con sulfato de amonio sólido hasta una concentración final de 2.8 M. Después de 2 h, esta suspensión se centrifuga (30 000 x g; 15 min) . El sobrenadante se cromatografía a 20°C a través de una columna Phényl-Superose HR 5/5 (Pharmacia) equilibrada con el amortiguador Hepes 20 mM pH 7.9 que contiene EDTA 200 mM, DTT 500 µM, y sulfato de amonio 2.8 M. Las proteínas se eluyen de la columna con un gradiente lineal que decrece de sulfato de amonio (2.8 M a 0 M) en el mismo amortiguador. Las fracciones que contienen la proteína HMGl se reagrupan y dializan extensivamente contra el amortiguador Tris/HCl 50 mM pH 7.7 que contiene EDTA lmM y DTT 500 µM. Esta muestra se inyecta enseguida en una columna MonoQ HR 5/5 (Pharmacia) que enseguida se eluye con un gradiente lineal de cloruro de sodio 0 a 0.5 M en el amortiguador Tris/HCl 50 mM pH 7.7-DTT 500 µM. La proteína HMGl, que forma un pico de absorbancia simétrico a 280 nm, se colecta en este amortiguador. La proteína HMGl se pone enseguida en un amortiguador Mes 10 mM pH 6.2-NaCl 140 mM-DTT 500 µM después de la concentración por centrifugación en Centrikon 10. La proteína HMGl se almacena a -80°C hasta la utilización. Esta preparación presenta una sola banda proteica que migra con un peso molecular aparente de 31 000 cuando se analiza por electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS) y revelación en Coomassie. El rendimiento global de la purificación es de 850 µg de proteína HMGl pura por 500 ml de cultivo de partida.

EJEMPLO 2: TRANSFERENCIA DE ACIDO NUCLEICO IN VITRO EN CÉLULAS DE MAMÍFERO Este ejemplo muestra como una proteína, de tipo HMGl, se une al ADN siendo importadas dentro del núcleo de manera activa, puede ser utilizada para estimular la transferencia de ADN plasmídico. La construcción utilizada para demostrar la actividad de las composiciones de la invención es el plásmido que contiene el gen que codifica para la luciferasa (Luc) descrito anteriormente. El protocolo se establece para placas de 24 pozos (D 16 mm) para recolectar 2 días después de la transfección (células en confluencia) . Todos los parámetros pueden modificarse proporcionalmente. El día J las células NIH 3T3 (ATCC: CRL1658), 3LL (Isakov N et al., JNCI 71(1983) 139-145) H460 (Maxwell et al., Oncogene 8 (1993), 3421-3429) son sembradas con 105 células por pozo. El día J+2 las células se enjuagan con PBS (para eliminar las trazas de suero) y se ponen en 250 ml de RPMI (3LL y H460) o DMEM (NIH3T3), suplementado o no con Suero Fetal de Bovino al 10% (SFV) Composición empleada para la transfección: Por equivalente de pozo, en un tubo se añade: - H20 qsp 20 ml - NaCl qsp 140 mM final - 0.5 mg de ADN plasmídico - 125 ng de HMGl y después se agita en vórtex moderadamente y se incuba a temperatura ambiente 15 minutos antes de añadir 1.5 nmol de lipofectante DOGS. Se agita de nuevo en vórtex moderadamente y se incuba a temperatura ambiente 15 minutos Las células son tranfectadas añadiendo 20 ml de mezcla ADN/HMGl/lipofectante al medio de cultivo, incubadas durante 2 a 4 horas a 37°C. Este medio se reemplaza enseguida por medio completo. El día J+4 las células se enjuagan a temperatura ambiente con 250 ml de PBS, se lisan en 100 ml de amortiguador ad hoc (Repórter (Promega) +TCK y Aprotinin) . 10 ml de lisado y 50 ml de sustrato (Promega) se utilizan para medir la actividad de la luciferasa sintetizada. Los resultados presentados en las figuras 1 y 2 son el promedio de cuatro experimentos, repetidos independientemente 2 veces. Para hacer esto se aprecian las Unidades Luminosas (UL) obtenidas por expresión del gen Luc en las células transfectadas.

La figura 1 agrupa los valores obtenidos por los tres tipos celulares citados anteriormente, en presencia de la cantidad variable de proteína HMGl. La figura 2 agrupa de manera sinóptica los factores de estimulación de la transfección obtenidos añadiendo diferentes cantidades de proteínas HMGl. El aumento de la eficiencia de transfección por la proteína HMGl es variable de acuerdo a los tipos celulares. Se observa así como se maximiza cuando el medio que contiene la composición necesaria para la transfección se suplementa con SFV al 10%. Esto es interesante porque la presencia de SFV representa las condiciones encontradas in vi vo . Por otro lado es notable que la presencia de SFV disminuye la eficiencia de transfección, particularmente en ausencia de proteína HMGl. Se puede pensar que la presencia de SFV en el medio de cultivo disminuye la cantidad de ADN susceptible de ser internalizado por las células. En este marco se puede concluir que HMGl es particularmente ventajosa para la transfección en condiciones donde la cantidad de ADN es limitante. La relación HMG1/ADN (en masa) óptima para la transfección es 0.25 a 0.5. Tales condiciones no se describen como capaces de compactar el ADN (Bottger M. et al., B.B.A. 950 (1988), 221-228); Stros M. et al., N.A.R. 22 (1994), 1044-1051) . En efecto el plásmido no está saturado por HMGl (Kohlstaedt L.A. et al., Biochemistry 33 (1994), 12702-12707). Por consecuencia el efecto de la proteína HMGl se explica por su capacidad de unirse a ADN y a ser transportado hacia el núcleo de la célula.

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Composición farmacéutica útil para la transfección de al menos un ácido nucleico, caracterizada porque contiene además de dicho ácido nucleico y al menos un agente de transfección al menos un compuesto que asocia las propiedades de fijación del ADN a una capacidad de vectorización nuclear de este ADN.

2. Composición farmacéutica útil para la transfección de al menos un ácido nucleico, caracterizada porque contiene además de dicho ácido nucleico y al menos un agente de transfección al menos un compuesto que pertenece a la familia de HMG o uno de sus derivados .

3. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el compuesto se elige entre las proteínas de tipo HMG 1, 2, I, Y, 14 y 17 y sus derivados.

4. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el compuesto está presente en toda o parte de la proteína HMGl humana, uno de sus derivados u homólogos.

5. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicho compuesto está además poliglicosilado, sulfonado, fosforilado y/o insertado en los azúcares complejos o en un agente lipófilo.

6. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque dicho compuesto está además asociado a un ligando del receptor celular o nuclear.

7. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el agente de transfección es un polímero catiónico o un lipofectante.

8. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 7, caracterizada porque el polímero catiónico es de preferencia un compuesto de fórmula general (I) : en la que - R puede ser un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula - n es un número entero comprendido entre 2 y 10; - p y q son números enteros, entendiéndose que la suma p+q es tal como el peso molecular promedio del polímero que está comprendido entre 100 y 107.

9. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizada porque el polímero catiónico se elige entre la polietilén imina (PEÍ) y la polipropilén imina (PPl).

10. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 9, caracterizada porque el polímero se elige entre la polietilén imina de peso molecular promedio 50 000 Da (PEI50K) o la polietilén imina de peso molecular promedio 800 000 Da (PEI800K) .

11. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 7, caracterizada porque el lipofectante comprende al menos una región hidrófila poliamina de fórmula general II H2N-(-(CH)m-NH-)n-H II en la que m es un número entero superior o igual a 2 y n es un número entero superior o igual a 1, m puede variar entre los diferentes grupos de carbono comprendidos entre dos aminas asociadas de manera covalente a una región lipófila de tipo cadena hidrocarbonada, saturada o no, de colesterol, un lípido natural o sintético capaz de formar las fases lamelares o hexagonales.

12. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 11, caracterizada porque la región poliamina está representada por la espermina, la termina o uno de sus análogos que han conservado las propiedades de unión al ácido nucleico.

13. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 11, caracterizada porque la región lipófila y está representada por la fórmula general IV en la que - X y X' representando, independientemente una de la otra, un átomo de oxígeno, un grupo metileno -(CH2)q- con q igual a 0, 1, 2 o 3, o un grupo amino -NH- o -NR'- con R1 representando un grupo alquilo de Cx a C4, - Y y Y' representan independientemente una de la otra un grupo metileno, un grupo carbonilo o un grupo C=S, - R3, R4 y R5 representan independientemente uno del otro un átomo de hidrógeno o un radical alquilo, sustituido o no, de Cj. a C4, con p que puede variar entre 0 y 5, - R6 representa un derivado del colesterol o un grupo alquilo amino -NR^ con Rt y R2 representando independientemente uno del otro un radical alifático, saturado o no, lineal o ramificado de C12 a C22.

14. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones 11 a 12 o 13, caracterizada porque se trata de preferencia de una lipopoliamina elegida entre dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS), la 5-carboxiespermilamida de la palmitoilfosfatidiletanolamina (DPPES), el (Dioctadecil-carbamoilmetoxi) -acetato de 2, 5-bis- (3-amino-propilamino) -pentilo o el (Dioctadecil-carbamoilmetoxi) -acetato de 1,3-bis- (3-amino-propilamino) -2-propilo.

15. Composición farmacéutica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 a 12 y 14, caracterizada porque el agente de transfección es la dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) .

16. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el ácido nucleico es un ácido desoxirribonucleico.

17. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el ácido nucleico es un ácido ribonucleico.

18. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 16 o 17, caracterizada porque el ácido nucleico se modifica químicamente.

19. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 16, 17 o 18, caracterizada porque el ácido nucleico es un antisentido.

20. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones 16 a 19, caracterizada porque el ácido nucleico contiene un gen terapéutico.

21. Composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones anteriores que contiene además uno o mas lípidos neutros.

22. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 21, caracterizada porque el o los lípidos neutros se eligen entre lípidos sintéticos o naturales, zwiteriónicos o desprovistos de carga iónica en las condiciones fisiológicas.

23. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 21 o 22, caracterizada porque el o los lípidos neutros se eligen entre la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), la oleoil-palmitoilfos-fatidil-etanolamina (POPE), la di-estearoil, -palmitoil, -miristoil fosfatidiletanolamina así como sus derivados N-metilados 1 a 3 veces; los fosfatidilgliceroles, los diacilgliceroles, los glicosildiacilgliceroles, los cerebrósidos (particularmente tales como los galactocerebrósidos) , los esfingolípidos (particularmente tales como las esfingomielinas) y los asialogangliósidos (particularmente tales como los asialoGMl y GM2) .

24. Utilización de una composición farmacéutica de acuerdo a una de las reivindicaciones 1 a 23 para la transferencia in vitro, ex vivo y/o in vivo de ácidos nucleicos .

25. Utilización de un compuesto tal como se definió en la reivindicación 1 o 2, acoplado a un ligando del receptor celular, un anticuerpo o derivado de anticuerpo, dirigir un ácido nucleico hacia las células que expresan los receptores o anti-genes correspondientes.