MXPA97009364A - Secuencia de acido desoxirribonucleico y proteina codificada especifica de mama para detectar cancer de mama - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una secuencia de ADN purificada y aislada y la proteína codificada específica de mama, la mamaglobina;también se describen métodos para detectar cáncer de mama con base en la sobreexpresión y secreción de mamaglobina por células de cáncer de mama;los métodos detectan y/o cuantifican la presencia de mamaglobina o el ARNm que codifica mamaglobina.

Description

SECUENCIA DE ACIDO DESQXIRRIBONUCLEICQ Y PROTEINA CODIFICADA ESPECIFICA DE MAMA PARA DETECTAR CÁNCER DE MAMA ANTECEDENTES DE LR INVENCIÓN 1. Campo de la Invención Pista invención se refiere generalmente ai campo de pa o.ono is de c ncer' de mama y rnuy part ula men e a una secuencia de RüMc y proteina codificada especifica de mama para sai se en la detección y tratamiento je c ncer- de mama. 2. Descripción de la técnica relacionada El cáncer de mama es uno de los tipos de cáncer mas comunes y potencial ente letales. Aunque el diagnostico temprano y el tratamiento pueden reducir la morbilidad y mor-, al i d d relacionadas con la enfermedad, se ha estimado que el valor deductivo ?os?t_v? de la rnarnogra ia es solo de aproximadamente 25% (Hall y otros, Engl 3 Med 327:319-328, 1992, que se incorpora por referencia). Por lo tanto, debe ser conveniente tener medios para detectar el cáncer mas temprano que el cáncer pueda ser detectado usando rnarnografia y un marcador genético o bioquímico podpa proveer dichos medios para complementar e incrementar el valor pred ctivo de la mamogratia (Hayes, Hernatol Oncol Clin N Am 8:485, 1994, que se incorpora aquí por referencia). El desarrollo de cáncer de mama se logra por un numero de <arnb?o<, ge éri s (para revisi n, véase Porter lordan, Hematol Oncol N nrn (3:73, 1994, que se incorpora aqu por- referencia) Dichos cambios incluyen aHeraciones cíOinosoini cas gruesas v perdida de marcadores genéticos ( Dev. lee y oíros, Uiochirn ?Siophys fl ta 1190:113, 1994 ; C- lanan v otros, 3 Cell Tüochem Suppl 17: L67, 1993, que se incorporan aquí por referencia). 1:1 progí eso de neoplasia de ama también ha mostrado dar- por resultado cambios cua tat ivos y cuan . ?t at ivos on expresión do genos previamente i ent ificados que codifican factores de crecimiento y sus receptor-es (Zajchowsl- i y otros, Cancel- Res 48:7041, 1988, que se incorpora aquí por re fe rene La), proteínas estructurales (Tras y otros, Proc Nati Road S i O?: 2319, 1990 que se incorpora aquí por re f-erenc a) , segundas proteínas mensajeras (Ohuchi y otros, Cáncer Res 25:2511, 1986 que se incorpora aquí por' referencia), y factores de transcripción (Harps, adv Cáncer Res 59:69:1992 (jue se incorpora aquL por- referencia). Estos cambios en expresión de genes podrían formar potencialmente la base para el desarrollo de un marcador de cáncer de rnarna, aunque el rol preciso de estos cambios de genes en la patogénesis de carcinomas de mama en muestras de biopsia de pacientes no es bien entendida. Ademas de proveer un marcador genético o bioquímico par-a cáncer de mama para detección temprana de la enfermedad, también seria deseable tener un marcador de tumor que pud Lera proveer una estimación de pronóstico, medios para selección y evaluaci n de terapia y medios para La direcci n de la terapia. Pilinque se ha iden ificado un numero de maleadores de tejido,, ninguno es su ici ntemente sensible o especifico del tumor para hacerlo idealmente adecuado para diagnostico o para seleccionar la población general (Id.). De esta maner-a, sigue ex LStiendo una continua necesidad de un marcador' de cáncer- de mama tal co o un gen junto con su proteina expresada que pueda usarse para identificar- específicamente y selectivamente la apariencia y desarrollo patog nico de (.ancor de mama <n un paciente. Usando una técnica de reacción en cadena de poli merasa de despliegue d erencial modificado para aislar-etiquetas de secuencia di ferencial ent e expresadas de carcinoma de mama, se aislaron varios fragmentos de secuencia que fueron únicamente expresados en tejido epitelial de ama neoplásticos en comparación con controles de tejido normales (Uatson y Fleming, Cáncer- Res 54:4598-4602, 1994, que se meorpora aquí por referencia). El descubrimiento de una de estas etiquetas de secuencia identificada corno DEST002 ha conducido al descubrimiento y aislamiento del ADNc de longitud completa novedoso y prote na codificada ahora conocida corno rnarnaglobina. El ADNc y La proteina son ambos nuevos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por- lo tanto, en breve, la presente invenci n esta dirigida a la Ldent f-i cacion de genes novedosos cuya expresión se incrementa el anc \ de ma a y el aislamiento de flDNc a part ir- de los ARNin de estos genes. Por con igui nte, Los sol citantes han tenido éxito en el descubrimiento de un flDNc novedoso y La pro te a secretora <od i deada especi fica de mama, inamaglobma. Fl ADNc es a on forma p?p fj cada y aislada y se i en i i a corno SI.C ID NO: 1 y la pro teína puri f icada, inarna lobi a esta en forma pur ficada y aislada y se iden ifica como CC GD NO: 2.. La rnamag lobina se sobreexpresa en 27% de los tumores de cáncer de mama primarios de etapa I. Esto sugiere que la disregulacion del gen de inarnag lobina ocurre temprano y frecuentemente en cáncer de mama. Por- lo tanto, el descubrimiento de la rnarnaglobi nal y su ADNc provee la base para ei desarrollo de métodos y composiciones novedosos para la detección y tratamiento de enfer edades neoplásticas de mama en seres humanos y otros mamíferos. De esta manera, la presente invención también esta dirigida a métodos novedosos para detectar la presencia de células de neoplasia de mama en una muestra. En una modalidad, el ADNc que codifica mam g lobina o un derivado de dicho ADNc se usa para detectar la presencia de ARNrn de marnaglobma en una muestra. El método comprende los pasos de: (a) proveer un pol mucLeot do que contiene el complemento de una secuencia de nucleotLdos que iene la secuencia de SEC ID NO: L o un derivado (je la misma, (b) incubar la secuencia de núcleotidos con la mues ra bajo condiciones en las cuales la secuencia se pueda hibp durar con flRNm a partir de células de neoplas a de mama, y (c) detectar la existencia de un complejo de hibridación de ADN-flRN.. Otro aspecto de la presente invención provee un equipo para detectar' la presencia de células de eoplasia de mama en una muestra. El equ o comprende un pol i nucleotí co que contiene una secuencia de nucleotidos que tiene el complemento de una secuencia de nucleotidos SEC ID N0:1 o un derivado de la misma empacada en un contenedor. En otra modalidad de la presente invención, la rnarnaglobma o un derivado de la misma se usa para detectar la presencia de ADNc que es transcrita en forma inversa a partir-de ARNm de marnaglobma en una rnuest ra. El método comprende los pasos de: (a) producir un ADNc a partir de ARNrn usando el método de transcripción inversa en una muestra obtenida de un paciente, (b) proveer dos oligorneros que sean iniciadores para el rnetodo de reacción de cadena de polirnerasa y que flanqueen o se tiendan dentro de un ADNc que codifica marnaglobma, y (c) amplificar el ADNc que codifica rnamaglobina por el método de reacción de cadena de poli erasa. Los dos oligorneros comprenden SEC ID NO: 3 y SEC OD NO: 4. Otra modalidad para la presente invención provee un equipo par-a detoccLon de la presencia de colulas de neoplasia de mama en una muestra. Fl equipo comprende dos ol gomeros que son iniciadores para el método de reacción de cadena de poli me i -asa y que son flanqueados o tendidos dent o de un ADNc que codifica ina aglobma empacado en un contenedor. l os dos oligo eros comprenden SEC ID NO: 3 y SFIC II) NO: 4. En otra modalidad de la presente invención, la presencia de la inainaglobma expresada por- una célula tumoral es detectada en una muestra usando ant icuerpos específicos para l protema, rnarnaglobi n . Los anticuerpos especí ficos pueden ser antj cuerpos policlonales o rnonoclonales. Entro l s diversas ventajas encontradas par-a ser Logradas por la presente invención, por lo tanto, se puede notar la provisión de una secuencia de nucleotidos y secuencia de aminoácidos codificados que puedan servir como marcador-es para células de cáncer de mama; la provisicion de métodos para la provisión temprana de la presencia de células de neoplasi de mama; la provisión de medios para detectar cáncer de rnarna que pueda complementar la rnarnografia e incrementar el valor predictivo; y la provisión de métodos que puedan proveer una estimación de pronostico; y la provisión de marcadores que permita la dirección de la terapia..

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS l.a figura L ilustra la estrategia usada para a? si arel ADNc de rnarnaglobi na de longitud completa usando l a t cnica (Je reacc'Lon de cadena de polunerasa (PCR) or amp Li f i cacion rápida de extremos de ADNc (RACE) y la subel onac ion subsecuente en vectores PC.EM7Z y ?CFV 7.. La figura 2 L lustra la secuencia de ADNc humana de SFC ED 1.0:1 (nucLeo idos anteriormente numerados) y la secuencia de aminoácidos de la proteina cod icada especi ica de mama, rnarnaglobina (SEC El) NO: 2) (aminoácidos numerados rnas adelante), la barra solida ilustrando el fragmento de 403 pares de bases (SEC ID NO: 5) aislado por el rnetodo de RACE PCR y la barra abierta indicando la secuencia de DEST002 de 206 pares de bases (SEC TD NO: 6) . La figura 3 ilustra la secuencia de amino cidos de la pr-otema mamaria especifica, rnarnaglobina ( hMAM) , (SEC TD N0:2) en comparación con la subumdad C3 de la prote na de enlace de esteroides prostatico de rata (rPSC3) (SEC ID NO:?) y proteina de 10 k de célula humanas (hCCIO) (SEC ID NO: 8) con identidades marcadas por letras negrillas y líneas dobles y aminoácidos estructuralmente similares marcados por lineas individuales; La Figura 4 ilustra (A) el análisis de Northern blot de hibridación de la secuencia de ADNc humana que codifica la protema específica de rnarna, rnarnaglobina (hMAM), a ARNm expresado por tejulos do neoplasa de inarna, tejLdos normales de mama y otros tejidos adultos y (B) l <?nal?sLS de muestras ainplí i i cadas por RT/PCI. de tejidos de neoplasia de mama, tejidos normales (Je mama y otros tejidos adultos; La igura b ilustra la traducci n de la secuencia de ADNc mamaria especifica en un sistema de prueba de lisado de reticuloci o do conejo i n v L t ro ; La Figura 6 ilust a la hibridaci n de Northern biot con l ADNc que -edifica ARNrn ¡le detección de iparnag lobina en tumor 2.10, en tumores de tres a ocho paciente (mostrados en negrillas), y a un grado menor-, en tejido normal de mama (mostrado en cursivas) comparando en dos casos, expresión de marnaglobi a en tejido de tumor y tejido normal igualado del pacien e; La Figura 7 ilustra el análisis de Uestern biot usando anticuerpo policlonal para los 16 aminoácidos C-teraímales (SEC TD NO: 14) (Jel medio condicionado (F) y l sado de células (C) a partir de células de tumor de mama MDA-MB-.15 en ausencia (-) y presencia ( + ) del peptido usado par'a generar anticuerpo policlonal; La Figura 8 ilustra el análisis de Uestern biot de lisados de células a partir- de células tumorales de rnarna humanas que muestran detección de protema amaglobma usando anticuerpo polLCional a los 16 aminoácidos C -terminales (SEC ID N0:1.) y anticuerpo anticonejo visualizado por quiinioluininiseneía ligada a enzima; la I igura 9 ilustra en color- una sección fLjada con para fina de colulas (Je cáncer de mama de un espécimen de paciente Lstoquim cament tenido usando an icuerpo pol clonal a los 16 aminoác dos 0-terrn?na.Les ( FC ID NO: 14) y anticuerpo anti conejo de cabr-a etiquetado ..on peroxLdasa de r bano y de ave corno substrato mostrando una tmcion cafe de coLuias que expresan la pro-tema rnama lob na ; La FLguia 9A ilustra en negro y blanco una sección fijada on parafina de célula (Je cáncer de mama de un espécimen de paciente i nmunoistoquimicarnent e teñido usando ant cuerpo policlonaL a los 16 aminoácidos C- erminales (SEC ID NO: 14) y c.nt Lcuerpo anti conejo de cabra etiquetado con peroxidasa de rábano y de ave corno substrato en donde esta indicada l a tinción cafe de l s células que expresan la protema mamag lobina.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Un aspecto de la presente invención se basa en la identificación y secuenciacion de ADNc identificado corno SEC ID N0:1 que codifica una prote a secretora especifica de ama, rnarnaglobi na, identificada por SEC ID N0:2 (FIG.2). Corno se describe as adelante, el ADNc de rnarnaglob a de longitud completa se aisló empezando a partir de ARNrn de células tumorales que se transcribió a la inversa, se amplifico usando la técnica de PCR y se subclono en vectores de expresión.

Ademas la protema inamaglobina, codificada por el ADNc se i dent i MCO y se caracterizo. Usando La etiqueta (Je secuencia an nima previamente designada DEST002, se demostró que el producto de gen correspondient , que hasta ahora se desconocía pero que aquí se identii ca corno marnaglobina, es particularmente abundante en La linea de células tumor-ales de c ncer- (Je mama MDA-MB-415. Par-a aislar el ADNc de rnarnaglobina de longitud completa, el ARNrn se transcribió a l a inversa a partir de esta linea de células y se clono usando la técnica de RACE PCR (Fdwards y otros NUCIOLC Acids Research 19:5227-32, 1991 (jue se incorpora aquí por referencia). Esta técnica que basa en la estrategia de ligaci n de oligodesoxi rpbonucleotido de una sola cadena al extremo 3' del ADNc (je una sola cadena. El rnetodo por el cual ADNc de rnamaglobina se aislo esta representado esquemáticamente en l a Figura 1. La secuencia de ADNc de 503 pares de bases de longitud completa (SEC ID N0:1) se dedujo a partir de la información de secuencia obtenida del fragmento de 403 pares de bases (SEC ID NO: 5) (FIO.2) aislado por esta técnica junto con información de secuencia previamente obtenida de la secuencia de DEST correspondiente (DEST002, SEC ID NO: 6) en el estudio anterior de los inventores de la presente (Uatson y Fleming, supra) (FIG.2). El ADNc de mamaglobina de longitud completa y el polipeptido codificado se muestran en la Figura 2. Dentro del ADNc de 503 par-es de bases está un marco de lectura abierto de 279 pares de bases que codifica un polipeptido (je 93 1 l aminoácidos y masa molecular predicha de 10.5 (FIG.2). Los primeros 19 residuo1-, de este marco de lectura abierta también predicen una secuencia de señal de peptidos hi drofobica. La metionma inicial del marco de lectura abierta contiene una secuencia de consenso Kozak casi perfecta (Kozak, Cel L 22:7-8, 1980 que se incorpora aquí por referencia). La 60 pares de bases en d reccLon del extremo 3' de esta secuencia no contienen otras metiomnas dentro del marco o topes de traducción. La secuencia no traducida en 3' del ADNc constituye 163 pares de bases y contiene una señal de pol ladeni lacion, AATflflfl, 12 par-es de bases hacia el extremo 3' de este sitio de iniciación de la secuencia de DEST002 original. Esos datos indican que el ADNc de marnag Lob na de longitud completa ha sido aislado. Una b squeda de secuencias de ADN similar a l a secuencia de ADNc de rnarnaglobi na en el banco de genes usando el algoritmo J3LAST (Benson y otros, Nucí Acid Res21 : 2963-2965 , 1993; Altch?l y otros, 3. Mol Biol 215:403-410, 1990 que se incorporan aquí por referencia), no identificaron homologías de secuencia de ADN obvias. Por lo tanto, se cree que el AÜNc de marnaglobina es una secuencia de ADN conocida hasta ahora novedosa. Una búsqueda de otros polipeptidos para secuencias relacionadas con rnanaglobina revelaron una homología de secuencia de amino cido entr-e rnarnaglobina y otros pol peptidos. La marnaglobina mostró una identidad de aminoácidos de 42% (58% incLuyendo substituciones conservadoras) con suburudad C3 (r~PSC3) de protema enlazadora de estero de prostat co de rata (prostateina) (FIG.) (SEC ID NO:?). La pr?teina enlazadora de est roLde pr-ostatico de rata es una proteina <-,ecretora impórtate en la próstata ventral de rata que consiste de un protema tetrarnepca compuesta de dos subumdades dirnepcas difer-entes; C3/C1 y C3/C2 (Parker y otros, Ann N y Acad Sci 438:115-124; Parker y ot os, 3 Steroíd Biochern 20:67-71 , 1984 que se incorpora aquí por referencia). Los genes Ca , 02 y C3 cod fican todos aproximadamen e 6 kD de proteínas secretoras y se piensa que sean originado a partir de duplicación de genes, pero aunque los genes Cl y C2 muestran fuerte homología 1 con respecto al otro, son mucho rnenos sirní lar-es al gen C3. Correspondientemente, la rnarna lobi na no muestra homología de secuencia con las proteínas Ci o C2. Co o se indicó anteriormente, la protema enlazadora (Je esteroide prostatico (prostate a) es la proteina secretora principal en la próstata ventral de rata y su expresión es regulada por esteroides androgénicos (Parker y otros, Ann N y Acad Sci 438:115-24, 1984; Parker y otros, 3. SteroLd Biochern :67-71, 1984 que se incorporan por referencia). Otra proteína, la proteína enlazadora de estrarnustina humana (hEMBP) se ha reportado que se expresa en cáncer de próstata humano, cáncer de rnarna humano y rnelanorna maligno humano (B ork y otros, Cáncer Res 42:1935-1942, 1982; Bjork y otros, Anticancer Res 11:1173-82, 1991 que se incorporan aquí por referencia). La p iOto i na enl zadora de estrarnust ?na humana es inmunoquimi camente similar a la protema enlazadora de est ra ?st ma de rata, que ha s (Jo postulada para ser Ldentica a prot ina enlazadora de esteroide de rafa, prostateina. Corno se indico antes, la secuencia de aminoáci os de marnaglobina mostró iden idad de aminoácidos de 42% y 58% de homología incluyendo substituciones conservadores con la sub?nidad 03 de prostataina. De esta manera, es posible que la rnarnag lobina pudiera estar do al«juna manera relacionada con hEMBP. Sin embargo, aunque al prostatei na y hEMBP se detectan en la pr stata, el ARNm de arnaglo a esta completamen e ausente en este tejido. Por lo tanto, la rnarna lobina no es la rnisrna p oto ina ni una subunidad de hEMBP y por lo tanto la secuencia de hEMBP no ha sido determinada por lo que no se sabe si hay incluso una similitud de la marnaglobina con algún fragmento o sub?mdad de hEMBP. Aunque los reportes recientes han demostrado que el promotor rPSC3 fusionado al antigeno SV40 T produce carcinomas prostatico y mamario en ratones fransgenicos (Maroulakou y otros, Proc Nat Acad Sci E.U.A. 91:11236-11240, 1994; Sandmoller y otros, Oncogene 9:2005-2815, 1994, que se incorporan aquí por referencia), la función biológica verdadera de esta profeina se desconoce. Ademas, independientemente de la relación hipot tica de la µroteina enlazadora de esteroide prostatico de rata a EMBP humano, no se ha identificado polipeptido humano o gen humano correspondiente a rPSC3. De 1. esta manera, La mamaglobina y el ADNc que codifica marnaglobina representan secuencias novedosas hasta ahora desconocidas. Usando alineación manual con otras secuencias que te an menos puntuaciones de BI.AST signi cati as con secuencias de marnaglobma y protema rPSC3, se i entificaron otras homologías con protema de 10 kD de células humanas (hCCIO) (SEC ID N0:ü) (Pep y otros, 3. Clin Invest 92:2099-2109, 1993 que se incorpora aquí por referencia) (Fig. 3) y ademas con proteínas de uteroglobina de conejo y ratón (Miele y ot os, Endocrine Rev 8:474-90, 1987;; Cato y Beato, fínticancer Res 5JI65~72, 1985; Miele y otros, 3 Endocrmol Invest 17:679- 692, 1994, que se incorporan aqu por referenci a ) . Estas homologías, dependiendo de la especie, tuvieron una identidad de 25% o 40% incluyendo sustituciones conservadoras. En particular, un numero de amino cidos se conservaron perfectamente entre todas las proteínas, incluyendo Cys-3 y Cys-69 que se sabe que juegan un papel en la formación de enlace de disulfuro entr-e subumdades de uteroglob a (véase rnas adelante) . Estas homologías sugieren que la rnarnaglobina es un miembro novedoso de una familia pequeña de proteínas que son secretadas por células hepiteliales (Miele y otros, 1994, supra) . El gen hCCIO es el homólogo humano de genes de uteroglobma de conejo y ratón (Pen y otros, 3 Clin Invest 92:2099-2109 , 1993, que se incorpora aquí por referencia). La uteroglobina se caracterizo originalmente corno una proteina secretora en tero de conejo, pero se ha encontrado en otros órganos hepitel ales incluyendo pulmón, mama y próstata. A diferencia de la µrostate a de rata, la uteroglobina es una µroteina hornodirnepca copulada por dos enlaces de di sul furo en los residuos conservados Cys-2 y Cys-69 (Miele y otros, 1994, supra) .. Aunque la transcripción del gen de uteroglobma es regulado por hormonas esteroi dales, la capacidad de la prote a misma µara enlazarse a la proqeoterona u otras hormonas esteroidales es cont roversiaL y nuevamente? la función biológica verdadera de esta µroteina se desconoce (Miele y otros, 199., supra) . La expresión de la rnamaglobi na esta restringida a la glándula mamaria. Esto es en contraste con la observación de que rPSC3 se expresa en próstata ventral de rata (Parker- y otros, Ann N Y Acad Sci 438:115-11 4, 1984 ), y la expresión de hCCiO/uteroglobi na en numerosos tejidos incluyendo pulmón, útero, próstata y ama (Miele y otros, 1907, sup a; Cato y Beato, supra; Miele y otros 199. supra) . Debido a la homología de secuencia entre inarnaglob a y estas proteínas, se determinó ei patrón de expresión especifica de tejido. El mensaje de rnarnaglob a de 500 pares de bases fue fácilmente detectado en espécimen de tumor 2410 (el tejido del cual se aislo esta etiqueta de secuencia original) y a un grado mucho menor en tejido de mama humano normal (Fig. 4A). El mensaje de rnarnaglobi na no se pudo detectar en la linea celular B5-589 epitelial de mama inmortalizada. La expresión de rnarnaglobina también fue indetectable en útero humano y pulm n, dos sLt os de expresi n do ut ero lobina.. La amplificaci n usando ARNm de rnamaglobi na detectada por RT/PCR en tumor- 2410 y tejido de mama normal, pero no en otros 15 tejidos estudiados, incluyendo tejidos (jue normalmente expresan rPSC3 y uteroglobma (pulmón, útero, pr stata), tejidos que responden hormona I men e y est erodiogeni eos (ovario, testículo, placenta), y otros órganos epiteliales secretores (colon) iFig.. 4fl). Por Jo tanto, la expresi n do ARNm de amaglobina es relativamente especi fica par-a tejido inamapo. Con base en ios estudios de este r-e por , la mamaglobma es una proteina relati amen e especifica do mama,. Dos genes conocidos corno sobreexpresados en carcinoma de rnarna son erb-B y cycl D (Jardines y otros, Pathob ology 61 268-282, 1994; Keyornars y Parde, Proe Nat Acad Sci E.U.A. 90:1112- 1116, 1993, que se incorpora aquí por referencia). A diferencia (je la sobreexpresion de erb-B o cyclm D, la sobreexpresion de marnaglobma puede reflejar- una alteración rnas especifica de la célula epitelial mamaria que una taza de crecimiento potencial o mit ótica incrementada general. Corno tal, la aparición de disreguLacion de gen de rnarnaglobma puede tener un efecto mas especifico para la vulnerabilidad terapéutica o el curso clínico de un tumor. La expresión de rnarnaglob a podría no ser detectado en nodulos linfáticos normales o Linfocitos periféricos al nivel de sensibilidad provista por la prueba de RT/PCR de un solo paso,. Esto sugiere que el ana Lis ís de transcripciones de mainaglobina en nodos linfáticos peri ricos pueda ser ut ii par-a detectar met stasis de cáncer- de mama ocul o, como ha SKIO sugerido para otros genes específicos epiteliales ÍSchoenfeld y otros, Cáncer' Res 54:2986- 90 que se mcorpora aquí por re feroncia) . Para demostrar que el ADNc de mamaqlobma codifico una proto na traducible, el clon de ADNc se uso en una prueba de traducción n v11 r-o . la Fi u a 5 muestra el producto do prote na a partir de un Jisado de reticulocito de conejo programado con el ADNc de rnamaglobina. Una prote a de 6 D aproximadamente es generada usando un ADNc de rnamaglob na. El peso molecular evidente es menor que «1 predicho a partir de la traducción conceptual del marco de lectura abierto, pero este hallazgo es comunmente observado con productos de traducción de uteroglob a de conejo y ratón también.. Aunque se detecto sobreexpresion de ARN de rnarnaglob a en un espécimen de tumor (es decir- 2410), no estuvo claro a que frecuencia esta sobreexpresion se ve en otros carcinomas de mama. Hasta ahora se ha examinado un panel de 15 carcinomas de mama primarios de etapa I de tipo histológicos diferentes por hibridación de Northern Biot con la sonda de ADNc de rnarnaglobina. Debido a que la variabilidad del potencial en expresión debida al ambiente influye (por ejemplo, estado hormonal del paciente), también se busca comparar especímenes de tumor directamente con muestras de tejido de rnarna normal IR igualados en el paciente, aunque esto no es po Lble en muchos casos. Corno se muest a en la FLgura 6, el ARNm do marnaglobi a de 500 pares de bases nuevamente se detecto en tejido de rnarna normal y tumor 2410. La inarnaglobi na también se detecto en otros tres tumores, dos de los cuales demostraron poca o ninguna expres ón de tejido normal iguaLado del paciente. En todos, 4 de 15 (27%) de los umor-es examinados sobreexpresaron ARNm de inarnaglobi na. Estos datos sugieren que la sobreexpresion de arna lobina no es nica para un solo espécimen de tumor y, de hecho, es relativamente frecuento entre tumores de mama primarios. Ademas, el hecho de que todos los tumores examinados fueran de etapa I sugiere que esta disregui ción ocurre relativamente temprano en el progreso de neoplasia de mama. Puesto que los solicitantes creen que la rnarnaglob a probablemente pueda ser una proteina secretada, su presencia se esperaría que fuera detectable en suero de pacientes cuyo tumor sobreexprese este producto de gen. Por lo tal, la rnarnaglob a probablemente sea tan clínicamente util co o el anfigeno especifico de próstata (PSA) y otros marcadores de tumor sólidos para manejar pacientes con cáncer de rnarna (Tumor rnarkers diagnostic pathology, Clin Lab Med 10:1-250, 1990 que se incorpora aquí por referencia) . Se determino la predominancia de rnamaglobina como un marcador de tumor en La población general de tumores de cáncer de mama examinando la expresión (je inarnaglobina en varios carcinomas de ama primario. Aunque el numero de especímenes exami ados en este estudio fue pequeño, 27% de los tumores evaluados sobreoxpresaron ARNm de rnamaglobina. Este porcentaje es comparable con la predominancia de otras alteraciones gen ticas tales corno amplificación de erb-B y mutación de p53 (Slamon y otros, Sel 244:707-712, 1909; Thor y otros, 3 Nat / 1 Cáncer Inst 84 : 845 - 855 , 1992, que se i corpora aquí por referencia) , Ademas, debido a que se ha i estpngí do el análisis de Los so Licitantes de La presente a los tumores de la et pa I, la sobreexpresion de marnagLob a realmente seria mas dominante que cualquier otra alteración genética reportada en este subgrupo de tumores (AllLerd y otros, 3 Na 'l Cáncer Tnst 85:20 -206, 1993, que se incorpora aquí por referencia). La identificación de rnarnaglob a corno un marcador de cáncer- de rnarna provee la base para otro aspecto de La presente invención, que implica métodos para detectar la presencia de cáncer- de mama en un paciente. El termino "detección" tal como se emplea aquí en el contexto de detección de enfermedad neopl stica de rnarna pretende ser un aspecto de la determinación de ia presencia de cáncer de mama en un paciente, distinguir cáncer de mama de otras enfermedades, estimar pronostico en t rminos de probable resultado de la enfermedad y prospecto para recuperación, monitorear el estado patológico o la recurrencia de la enfermedad, determinar un régimen terapéutico preferido para el paciente y dirigir- una terapia anti tumoral. El rnetodo para detectar cáncer de ama comprende hibpdizar un polinucleof ido a ARNm de células de neoplasia de narna. II pol nucleotido comprende el complemento de SEC ID N0:1 o un derivado do SEC ID NO : I „ Por derivado do La secuencia de nucloo ido se entiende que la secuencia de nuoleotido derivada os subst ane lalmente la mi ma que la secuencia a partir' de la cual se deriva en que la secuencia de nucleotí do depvada tiene una secuencia suficiente compl mentaria a la secuencia de K. cual se deriva para h bridizar Al.Nin a partir de células de nooµLasia de mama bajo las mi mas condiciones est netas que La secuencia <Je l a c al ,e deriva hibpdiza a ARNm a par-tir de células de neoplasia de mama,. La secuencia de nucleotidos derivada no necesariamente es físicamente derivada de la secuencia de nucí eot idos, sino que puede ser- generada de cualquier manera mcluyendo, por- ejemplo, síntesis química de ?epl?cacion o trascripción inversa o transcripción de flDN. Par-a detectar la presencia de AR m que codifica marnaglobina en un sistema de detección para c ncer- de a a, se obtiene una muestra de un paciente. La muestra puede ser una muestra de biopsia de tejido o una muestra de sangre, plasma, suero o similar. La muestra se puede tratar- para extraer los ácidos nucleicos contenidos en la misma. Fl acido nucleico resultante de La mezcla es sornetLdo a electroforesis de gel u otras técnicas de separación por tamaño. La detección implica poner en contacto los ácidos nucleicos y en particular el ARNm de la muestra con una secuencia de ADN que sirve corno una sonda para formar duplicados híbridos. El termino "sonda" se refiei e a una estructura compuesta de un polinuclootí do que forma una estructural híbrida con una secuencia objetivo, debulo a la cornpleinentapedad de La secuencia de sonda con una secuencia en la regi n ob ot ?vo. La detecci n del dúplex resultante? generalmen e se logra mediante el uso de sondas etiquetadas. Altor-nat vamente, la sonda puede ser no etiquetada, pero puede ser- detectahle por medio de enlace especifico con un li 'jando que os etiquet do, ya sea directa o indirectamente. Las etiquetas adecuadas y los métodos para etiquetar sondas y 1 igandos son conocidos en la técnica, e me luyen por- ejemplo etiquetas radiornarcadas que pueden ser incorporadas por métodos conocidos (v.gr, traducción oportuna o cmasion), biotma, grupos fluorescentes, grupos quirniol umimeentes (v.gr, dioxetan?s, particularmente dioxetanos activados) enzimas, anticuerpos y similares. Cuando se us ADNc que codifica nainaglobma u otro derivado e la misma corno una sonda, se pueden usar condiciones de alta rigurosidad a fin de evitar' falsos positivos. Cuando se usan secuencias derivadas de mainaglobina, se pueden usar condiciones de menor rigurosidad. La rigurosidad de hibridación se determina por un numero de factores dur-ante la hibridación y durante cl procedimiento el lavado, incluyendo tempera tur-a, concentración iónica, duración y concentración de formármela. Estos factores se delinean, por ejemplo, en Sambrook y otros (Molecular cloning: a Laboratoru Manual, 2d ed, 1989). -> -> Va\ incrementar La sensibil dad de La detección en una muestra do ARNm que codLfica marnaglobi na , l a técnica de transcripción i nversa/r«accion de . adona de polimerizaci n (RT/PCR) se puede usar' par-a ampli icar flDNe t anscr o a partir ¡Je f. Nin que codifica rnarnagiob na., El método (Je RT/PCR es bien conocido en la t cnica (por ejemplo, véase Uat on y Fleming, supra ) . El rnetodo de RT/PCR se puede i ealizar como sigue. Fl ARN celular total se aisla, por e Templo, por- el método de L otiocianat o do guanid o normal y el ARN total es transcrito por' ranscripción inversa. El método de transcripción inversa Lrnplica la síntesis de ADN sobre un plantilla de ARN usando una onzima de t ranscriptasa inversa y un miciador (Je extremo 3'. Típicamente, el iniciador- contiene una secuencia ol go (dT). El ADNc asi producido es después amplificado usando el método de PCR o iniciadores específicos de rnarnaglobina. (Belyavsky y otros, Nucí Acid Res 17:2919-2932, 1989; Drug y Berger, Methods in Enzyrnology, Acadern c Press, N.Y., Vol. 152, pp.316-325, 1987, que se incorpora aquí por referencia). El método de reacción de cadena de polimerasa se realiza usando dos iniciadores de oligonucleotidos que son complementarios a la dos regiones blanqueador-as del segmento de ADN que se va a amplificar-. Los iniciadores hacia el extremo 3' y hacia el extremo 5' son típicamente de 20 a 30 pares de bases de Longitud e hibridizan a las regiones flanqueadoras para replicacion de la secuencia de nucleotidos. La polimerización es catalizada por una ADN µolunerasa ^n presencia de trifosfatos de desox i ucleotí os o análogos de nucleotidos para producir moléculas de ADN de doble cadena. Las dobles cadenas después se separan por- algún método de desnaturalización incluyendo física, química o enzimat i ca,. Comunmente, se us el método de desnaturalizaci n física que implica el calentamiento del acido nucleico, t icamen e a temperaturas de aproximadamente 00°C a 1U5°C dur-ante tiempos que varían de aliededor de 1 a 10 minutos. LL procedimiento se repite pa ra ei nurnero de cicios desea<los. Los iniciadores se seleccionan para hacer substanciilmenfe complementarios a la cadena de ADNc que esta siendo ampl ficada., Por lo tanto, los iniciadores no necesitan reflejar la secuencia exacta de La plantilla, sino que deben ser suficientemente complementarios para hi bp dizarse select vamente con la cadena que esta siendo amplificada. Después de la amplificaci n, el producto de PCR después es detectado por tinción de bromuro de etidio (Sambr-ook, y otros 1989, supra). En otra modalidad de la presente invención, la secuencia de ADNc de rnarnaglobma o derivado de la misma se puede usar para caracterizar cualquier alteración del gen de inarnaglobina (es decir, redi posieion de genes ampl ficación de genes o eliminación de genes) en un espécimen de un paciente con cáncer de mama. Esto provee un rnetodo por el cual especímenes o muestr-as de un paciente, que no contienen ARNrn intacto, aun pueden se examinados para cambios . n estructura de genes. En una aplicación de esta tecmc<_, la secuencia do ADNc de marnagiobina o derivado de la misma es hibpdizado al ADN genornico de un paciente que ha sido aislado de tumor de un paciente, tejido normal o linfocito y digerido con una o rnas endonucleasas de i est p ccion. Usando el protocolo de Southern biot, que es bien conocido en la t cnica, esta prueba determina si un paciente o un tumor- do mama de un paciente tiene un gen de rnarnagobl a, que fue eliminado, reordenado o ampli icado. La detección de estos cambios puede entonces proveer información importante útil para predicci n de pronostico y para manejo del paciente. En una segunda aplicación de este técnica, uno o rnás pares de iniciadores de oligonucleótidos en la secuencia de ADNc de rnarnaglobina o derivados de La rnisrna se podrían usar en la reacción de cadena de poiirnerasa para amplificar- segmentos del gen de marnaglobina a partir- de una muestra del paciente. El análisis de los productos de PCR resultantes indican si un segmento particular del gen de rnarnaglob a es eliminado o reordenado. Dicha información es útil para el pronostico y el manejo del paciente. La presente invención provee ademas métodos para detectar la presencia del polipepti o, rnarnaglobina, en una muestra obtenida de un paciente. Se puede usar cualquier método conocido en la técnica para detectar proteínas. Dichos métodos incluyen pero no se limitan a mrnunod fusi n, i nmunoelect roforesis, métodos mmunoqui mieos, pruebas de enlazador- ligando, técn cas i nmunohi stoquir cas, aglutinaci n pruebas de complemento (por ejemplo véase BasLC and Olin cal Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton il ange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991, que se incorpora aquí por' referencia). Se prefieren métodos de inmunoensayo de enlazador- L L ando incluyendo anticuerpos reactivos con opLtope o epLtopes de mamaglubma y competitivamente desplazando una µrotoina de inamaglobma et?µ,?etada o der-ivado (Je l a misma» Tal corno se emplea en la presente, un derivado de marnag Lobina se refiere a un polipeptido que contiene aminoácidos o aminoácidos modificados en los cuales el derivado de poliµeptido reacciona en forma cruzada con un anticuerpo anti -marnaglobina. Por reacción cruzada se entiende que un anticuerpo- reacciona con un ant igeno distinto al que indujo su forrnadon. Numerosos mrnunoensayos de enlace de prote ina compe itivos y no competitivos son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos empleados en dichos ensayos pueden ser-no etiquetados, por ejemplo, corno se usa en pruebas de aglut inacion, o etiquetados para usar' una amplia variedad de métodos de prueba. Las etiquetas que se pueden usar incluyen radionucleotidos, enzimas, fluorescentes, quirmofl uorescentes, substratos de enzimas o cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, partículas, colorantes y similares para usarse en radLOinrnunoensayo (RTA), munoensayos de enzimas, v.gr., prueba mrnunoadsorbente ligada a enzima (ELISA), i nrnunoonsayos fluorescen es y similares. Los anticuerpos pol i clónales o monoclonales par'a marnaglobina o un epitope del misino se pueden hacer para usarse en inrnunoensayos por- cualquier' numero de métodos conocidos en la técnica. Por- opitope se hace referencia a un determi ante rtntigenico de un polipeptido. Un epLtope podrid (.emprender tres aminoácidos en una conformaci n espacial (jue es nica par-a el ep tope. Generalmente un ep tope consiste de por lo menos 5 aminoácidos de este tipo. Los métodos para determina- la conformación espacial de amino cidos son conodicos en la técnica e incluyen por ejemplo cristalogra ía de rayos X y resonancia magnética nuclear- bidinensLonal. Un enfoque para preparar anticuerpos para una protema es la selección y preparación de una secuencia de aminoácidos de toda o una parte de la proteina, químicamente sintetizando la secuencia e inyectándola en un animal apropiado, generalmente un conejo o un ratón. Los métodos para la preparación de rnarnaglob a o un epi ope de la misma incluyen pero no se limitan a síntesis química, técnicas de ADN recornbinante o aislamiento de muestras biológicas. La síntesis química de un peptido se puede analizar, por ejemplo, por el m todo clásico de Merriteld de una síntesis de peptido de faee solida (Mamfeld, 3 Am Chein Soc 85:2149, 1963, que incorpora aquí por referencia) o la estrategia de FMOC en un sistema de síntesis de pep idos múltiples automatizada rápida (DuPont Company, Uilm ngt o , DE) (Caprino and Han, J. Org Chem 37:3404, 1972, que so incorpora aquí por referencia s ,, Los anticuerpos pol i clónales se pueden preparar inmuni ando conejos mediante inyecci n ¡Je <_.i"it?gono en los nodos linfáticos popí iteales seguido de incrementos subsecuentes en intervalos de dos semanas con inyección i ntraµep t oneal de <.nt?geno. A los animales se les extrae sangre y suero probado con ra proteína amaglobi na purificada generalmente por' ELISA,. Se pueden preparar anticuerpos rnonoclonales despu s del método de Milstem y Kohler fusionando esplenocitos de ratones inmunizados con replicacion continua de células tumorales tales corno células de mielona o lirnfoma. (Milstein y Kohler Nature 256 :.95-497, 1975; Gul fr'e y Milstein, Methods Enzymology: Trninunochemical Techmques 73:1-46, Langone y Banat s eds, Acadernic Press, 1981, que se incorporan aquí por referencia). Las células de hibridorna asi formadas después son clonadas limitando los métodos de dilución y los sobrenadantes probados para producción de anticuerpos por ELISA o RÍA. La capacidad única de anticuerpos para reconocer y enlazarse específicamente a antigenos objetivo expresados poruña célula turnoral provee un enfoque para el tratamiento de cáncer (para revisión véase LoBuglio y Saleh, Am 3 Med Sci 304:214-224, 1992; Bagshawe, Adv Pharmacol 24:99-121, 1993 que se incorpora aquí por referencia. Por lo tanto, otro aspecto de la presente mvencion provee un m todo para prevenir el inicio y para tratar cáncer de mama en un animal basado en el uso de ant i cuoi pos para marnaglobina que se ha descubierto que son sobreexpresados por células do c ncer de rnarna. Los anticuerpos específicos para rnamaglobi na, ya sea policlonales o rnonoclonales, son producidos por cualquier rnetodo conocido en la técnica. Por ejemplo, anticuerpos monoclonales uri os o humanos pueden producirse por- tecnología de hibp dorna. Alternat vamente, la mamaglo i a, o un fragmento i nmunolo í ca ente activo de l a misma o un anticuerpo anti idiotipjco, o fragmento del mismo se puede administrar a un animal para inducir la prOduccion de anticuerpo capaz de reconocer' las células que expresan marnaglobina. Los anticuerpos asi producidos o fragmentos de los mis os son etiquetados con una o mas substancias oncoliticas tales corno radionuclidos, toxinas o fármacos citotoxicos y admin strados a un paciente que se sospecha que tiene cáncer de rnarna. El enlace del anticuerpo etiquetado para la rnamaglobina que esta siendo sobreexpresada por la célula de c ncer de mama producirá muerte de la célula cancerosa. Cualquiera de una variedad de substancias oncolíticas conocidas en la técnica se puede usar- para producir- dichos anticuerpos etiquetados. Por ejemplo, las inrnunotox as se pueden hacer copulando toxinas vegetales y bacterianas a anticuerpos. Dichas toxinas incluyen, por ejemplo, ricina, toxina de difteria y endotoxina A de Pseudornonas. También se pueden hacer conjugados de f rmaco -an i cuerpo on los cuales agentes quimoterapeuti eos son ligados al anticuerpo. Los agentes quimotorapeut icos adecuados para dicho uso incluyen, por- ejemplo, tornoxifeno, doxorrub cma , metotrexato, clorambucil , alcaloides de Vinca y rnitomic a „ Ademas, se pueden hacer- radioinmunoconjugados en los cuales un radionuelido es es ablemente Ligado al anticuerpo. Los radionucl i dos adecuados para hacer i adío i ninunoeonjugados incluyen, por- ejemplo, (.-emisores tales co o 131 í , iß-Re, ißßR , 67 u, 9?? v 47sc; -ern sor'es tales corno 21_H., 212 «i, y 212 p ; emisores de electrones barrenador-es tales corno 125 r y 77 Br* y nuclidos fisionables tales corno 10 B. Las modalidades preferidas de la invenci n se describen en los siguientes ejemplos., Otras modalidad dentro del alcance de las re vindicaciones de la presente serán evidentes para un experto en la técnica a partir de la consideraci n de l a memoria descriptiva o practica de la invenci n corno se describe aquí. Se pretende que la memoria descriptiva, junto con los ejemplos, se consideren únicamente ilustrativos, siendo indicados el alcance y espíritu de la invención por Las reivindicaciones que siguen a los ejemplos. En los siguientes ejemplos, se obtuvieron lineas celulares del deposito de cultivo tipo americano (American Type Culture Collection) y se cultivaron en un medio esencial mínimo de Dulbecco complementado con suer-o de ternera fetal al 10%. Se obtuvieron especímenes de biopsia de tejido a partir de una red de tej i do c ooperat ivo humano ( LiVols y ot ros Cánce r 7 1 : 1391 1394 , 1993 ) que se i ncorpora aquí por i ferencia ) , EJEMPLO 1 Este ejemplo ilustra ol aislamiento de ADNc de mamaglob a. ARN celular total de la linea eol ul ar MDA-II141 b" se aislo usando el método de isof íooianat o do quanidiruo normal. (Belyavsky y otros supra) „ Este ARN se uso en el procedimiento de RACE PCR empleando el equipo ílrnplif índer (Clonetech) y siguiendo el protocolo del fabricante. La síntesis de ADNc de primera cadena se realizo en una reacción normal que contenía 1 µg de ARN, 10 µM de iniciador de rnamaglobina especifico D2R (5'-ATA AGA AAG AGA AGG FGT GG-3')(SEC TD N0:4), 4 µl de regulador- de pl-l 5X RT (250 rnM TrisCl pH8.3, 375rnM Kcl, IdrnM MgCl2 ) , 2 JJl de DTT, 1 µl de dNTPs y 200 unidades de t ransenptasa inversa up rscp pt M n (Gibco/BRL) en un volumen de reacción de 20 µl. La reacción procedió durante 1 hora 45°C y se termino incubando a 95°C durante 5 minutos. El ARN se hidrolizo con 400 µM de NaOH a 65°C durante 30 minutos y se neutralizo con 400 µM de acido acético. La reacción después se a adio a 3 volúmenes de Nal a 6M y 10 µl de esferas de vidrio tratadas. Las esferas se lavar-on 3 veces con EtOH al 80% y acido nucleico se eluyo de las esferas en 45 µk de agua. Despu s se precipito y se volvió a suspender acido nucleotido en 10 µl de aqua. III ADNc de primera cadena purificado se 1 iqo al (-1 i gonucleot i do de anclaje provisto por el fabricante (SEC lü NO: 9, [. ' -Cf.C GAA FTC ACT ATC GAT TCT GGA ACC TTC AGA GG--3'), usando ARN l gasa do a 27°C durant > 20 horas. Una décima parte de una reacci n de ligación se uso para ampli icación de PCR on una reacción de 50 µl que contenía 1 µM del iniciador de anclaje del fabricante (SEC ID NO: 10,5' -CTG GTT CGG CCC ACC TCÍ GAA GO I" TCC AGA A l"C GAT AG-3'), 1 µM de iniciador' especifico de rnarnaglobi na D2RI> (SEC ID NO: 11, 5' -fifií CCG TAG TTG G'l T TCT CAC 0-3'), 200 µM dNTPs, 5 unidades de ADN Vent.TM ?? regulador de pH de poiimeí sa (lOrnM Kcl, 20mM Tpscal, 10 mM ( Nl-U ) 2 0¿ , 2 mil MgSOi , 0.1% Trmton X-100),, la reacción se incubo a 94°C dur-ante 2 minutos y después a 94°C dur-ante .5 segundos, 50° durante l minuto y ^"C durante 90 segundos para un total de 40 veces. Los ol igonucleotí dos alojados arnaglobma específicos hacia el extremo '•> ' también uso por recomendación del fabricante, D2F (5' -CTT TCT GCA AGA CCT TTG GC-3') (SEC ED N0:12). Todas las amplif caciones de PCR se realizaron con ADN poluneraza Vent (New England Biolabs). El producto de RACE amplificado se digirió con EcoRI y se ligo hacia los sitios de EcoRI y Srnal del vector' de plasrnido pGEM7Z (Prornega). Toda la secuenciacion se realizo usando el equipo de secuenciacion de ciclo térmico de ADN polirnerasa Taq por protocolo del fabricante (Prornega). Brevemente, el procedimiento usado es corno sigue. pinol de ol igonuc leotí do especifico de secuencia se etiqueto en ol ex remo con 10 prnol de 32P-t ATP (3,000 Ci/rnrnol y 10 mCi/ml) usando pol inucleot ido cmasa T en una i eaccion de 1(1 j,?l dur-ante 30 minutos a 37°C. Una reacción de pol niier'izacion (jue contenía 100 ng de plantilla de µlasrnido, 1.5 prnrnoles de iniciador- de secuenciacion etiquetado, y 5 unidades (je polimeraza íaq de grado de secuencí ación se creo en 1 7 µl (Jel regulador de pH de secuenciacion provisto por el fabricante. Esta reacción so aplico corno alícuota a una serie de . tubos de reacción ¡jue contenían mezcla provisto por- el fabricante de deoxinucleotidos y ya sea de didesox -A, 0, G, o T. La sene de 4 tubos se incubo a 95°C durante 2 minutos y después, a 94°C durante 45 segundos, 45°C durante 30 segundos y 72"C durante 1 inmuto par-a 30 veces. Después de completarse las reacciones, se añadieron 3 µl de forrnamida al 80%/azul de bromo fenol a cada tubo. Las muestras se calentaron a ?0°C durante 2 minutos y se cargaron sobre acrilar da al 6%/gel de secuenciacion de urea a 7.5 M y se dejaron funcionar- durante 2-4 horas y una potencia constante de 60 U. El gel se seco y después se expuso a una pelicula de r-ayos X Kodak XAR5 dur-ante 2 a 24 horas. La secuencia asi obtenida fue un fragmento de 403 pares de bases (SEC ID NO: 5) como se muestra en la figura 2, en barra solida. En un trabajo anterior, se aislo la secuencia DEST002 Tag (Ulatson and Fleming, supra). Esta secuencia fue un fragmento de 206 pares de bases (SEC EN NO: 6) corno se muestra en la figura 2, en barra abierta. Combinando la información de esas 2 secuencias permitió que se dedujera la longitud completa de 503 par-es de base de ADNc de mamaglo ina (figura 2). EJEMPLO 2 Este ejemplo demuestra que la expresión de l?iarnag lobina es restringida a células turno r-a les de glándula mamaria y a un menor grado células de gl ndulas mamaria normales. Las muestras de ARN celular se aislaron usando el método de isotiocianato de guamdinio y se trataron con ADNasa libre de ARNasa (Promega). Para análisis de RT/PCR, un micrograrno de ARN total indicado fue transcrito por transeppcion inversa con oligo dT2i (SEC ID N0:13) y transen ptasa inversa Superscript II (Gibco/BRL) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Doscientos ng de o l igo (IT21 (SEC ED NO: 13) y 1 µl de ARN total se incubaron a 65°C durante 5 minutos en un volumen tje 10 µl. La muestra se enfrio sobre hielo y se anadio al mismo en donde 4 µl de regulador de pH 5X RT (250 rnM TpsCl ?H8.3 375 rnM Kol, 15 rnM MgCl2 ) , 2 µl de DTT a lOOrnM, 1 µl de dNTPs y 200 unidades de tranecpptasa inversa Superscppt r. n (Gibco/BRL). La reacción procedió durante 1 hora a 45°C y se terminó incubando a 95°C durante 5 minutos. Una decima parte de cada reacción de RT se sometió a análisis de PCR usando iniciadores específicos de rnarnaglobina D2R fS'-ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG- ' ) (SEC ID NO : 4 ) y (12102 (5' -CAO CGG C T 1 GA ICC TTG -V ) (SEC TD NO : 3 ) y condiciones de i eaccion normales durante 40 cieLos a 94° . 30 seq. /55o x 1 m?n./72° x l min. Par-a análisis de Northern, 20 imcrograrnos del ARN total se analizaron corno se describi anteriormente (Uatson y Fleming, supra) usando La sonda de ADNc de amaglobina de longitud eornpLeta. La integridad y la carga igual de cada muestra de ARN se evaLuo mediante tinción con bromuro de e< i dio. Corno se muestra en la figura 4A, el mensaje de rnarnaglobma de 500 pares de bases es fácilmente detectado en espécimen de tumor 2410 (de cuyo tejido se aislo DEST original) y a un grado mucho menor- en tejido de mama humano pero no en la Linea celular- B5-589, epitelial de mama inmortalizada, o en pulmón humano, placenta, útero y ovario (Fig 4A). Después de la amplificación usando análisis de RT/PCR, la expresi n de marnaglob a aun no se detectaba en 15 tejidos estudiados (Fig 4B) . La detección de mensaje de 3-fosfato de gliceraldehido deshidrogenase (GAPDH) (Figura 4B) y mensaje de receptor de EGF (datos no mos rados) en estas reacciones demostraron que la ausencia de expresión no se debió a ARN degradado u otras explicaciones triviales. De esta manera, la expresión de ARNrn de mamaglobina es relativamente espec fica para tejido mamario.

J5 EJEMPLO 3 Este ejemplo demuestra que el ADNc de mamag lobina codifica una secuencia de nucleotidos traducible que da por resultado un producto de proteina de masa molecular' apropiadamente predicho. Se r-ealizaron traducciones i n v 11 ro usando equipo de traducción de reticulocí os de conejo TNTTM con ARN polimerasa T7 (Pr'ornega) y 3£ S-Methionine (>1000 C /rnmol; 10 mC /ml, Ainersham) de acuerdo con el protocolo el fabricante. A 25 µl de l sado de ret ículocí o de conejo TMTTM se añadieron 2 µl de r-egulador- de pH de reacción preparada por el fabricante, ARN polirnerasa T7, mezcla de 20µM de amino cido rnenos rnetionina, . OµCi^S S-rnetionma (1,000 Ci/minol y 10 mCi/mi), 40 unidades de inhibidor de pbonucleasa, un micro-gramo de rnarnagiobina/plasrnido ?GEM7, y suficiente agua tratada con DEPC para crear un volumen de reacción final de 50 JJÍ. Esta reacción se incubo a 30°C durante 60 minutos. 5µl de esta reacción se removieron en 20µl de regulador de pH de gel de SDS, se hirvieron durante 2 minutos y se cargaron sobre gel de SDS-poliacri lamida al 17.5%. El usado de reticulocito de conejo programado con ADNc de rnarnaglobina produjo 6 D de prote a mientras que el programado sin el ADNc no produjo ningún producto de proteina. 1 EJEMPLO 4 Este ejemplo ilustra la prevaLon' ia do sohrooxpresion de inarnagLobina es carcinoma (Je mama primario. Para determinar- la frecuencia de sobroexprosion de arnagLob a en carcinomas de rnarna, se examino un panel de 15 carcinomas de mama primario de etapa I de tipos histol gicos diferentes usando hibri ación de Northern biot con La sonda de ADNc de rnamaglobin » s muestras do to Ldo d mama normales igualadas a los pacientes también se compararon en tejidos de dos pacientes (Figura C> ) . El ARNrn de mainaglobma de 500 par-es de bases detectado en tejido de mama normal y tumor 2410 y en otros tres tumores, dos de los cuales se probaron demo traro poca o ninguna expresión en tejido normal igualado al paciente (B015 v. B016; B022 v. B023) (FIG 6). En todos, 4 de 15 (27%) de los t mores examinados sobreexpresaron ARNrn de marnaglobma. listos datos indican que la sobreexpresi n de rnarnaglobi na no es única para un espécimen de un solo tumor- y, de hecho, es relativamente frecuente entr-e tumores de mama primarios. Ademas, el hecho de que todos los tumores examinados fueran de etapa T sugiere que esta disregulacion ocurre relativamente temprano en el progreso de neoplasia de ama. '1 EJEMPLO 5 El siguiente ejemplo ilustra la detecci n de proteina arnaglobina usando anticuerpo pol clona!. Se preparo anticuerpo polLdonal copulando un pept ido correspondien e a los 16 aminoácidos C- terminales predichos a partir de ADNc (Je mamaglobi na (Glu Val- Pho-Mot -01 n-l eu- r le-Tyr-Asp-Ser- Ser-Leu-Cys-Asp-Leu- Phe, SEO ID NO: i .) a hernociamna de lapa o inyectando on conejos con adyuvante de Freund. Los conejos inoculados se incrementaron a intervalos de tres semanas y en la semana 12, a los conejos se les ex t r-a o sangre y el suero se sometió a prueba para su capacidad par-a detectar narnaglobina. Medio acondicionado sin suero se cosecho de linea celular de tumor' de marna MDA-MB-.15 y MCF-7 (recolecciones de 24 hor-as). MDA-MB-415 se había identificado anteriormente co o una linea celular que sopreexµresa el mensaje de rnarnaglobma y I1CF-7 se ha identificado corno una linea celular- que produce arnag lobina no detectable. El medio acondicionado se resolvió en un gel de acp lamida de SDS al 12% ba o condiciones reductoras, se sometió a prueba de biot en un filtro de nitran y se analizo mediante protocolos de Uestern blot normales usando el anticuerpo descrito al peptLdo C-terrninal corno el anticuerpo primario en esta prueba. Después del enlace de anticuerpo primario, la mancha se lavo y se añadió anticuerpo secundario (anti conejo de cabra). Complejos de inarnaglobma-anti cuerpos se visualizaron por quirnolurnimsencia ligada a 30 encima (ECL Uestern Tilottmg Detecting Reagent , fimershain, Arl gton Heights, II. ). El medio acondicionado para Ja Linea celular MDA-MB-.15 mostró una banda do rnarnaglobi na de peso molecular' aparente de 20 kd v esta banda no se detecto on el 5 medio acondicionado de la linea celular- MCF-i7,. De esta manera, células MDA-MB-415 secretan prote a arnagi obi na pero las células MCF-7 no lo hacen. Para ilust ar ademas la especif idad de esta prote a, (íl medio acond cionado y el lisado de células de la l nea celular MDA-MB 415 so probaron por análisis de Uestern biot , con el anticuerpo al µeptido C-terminal, en presencia y ausencia del peptido competidor' usado par'a generar el ant icuerpo. La visual izac on de complejos de marnaglobina- anticuerpo fueron corno se describi antes. Corno se ve en la figura 7 , en ausencia de peptido competidor- (-), los medios acondicionados (S) tienen la banda de 20 kd represen ativa de la protema marnaglobma. El lisado de células (C) mostró varias bandas a 14 kd, 20 kd, y un peso molecular superior. La banda de 14 kd probablemente r-epresenta rnarnaglobina en la forma no procesada. El ADNc par-a marnaglobina tiene un sitLO de N- glicosilacion de consenso y la forma de 20 kd secretada, observada, probablemente representa alguna forrna procesada de la prote a. Aunque se realizo Uestern biot en presencia del pept do competidor ( + ) , la forrna secretada y las formas : r. intracelulares de rnamaglob a no se visualizan, indicando que estas proteínas contienen el peptido para el cual se sintetizo el a t i cuerpo., Este anticuerpo para el peptido 0 terminal también ha detectado bandas similares en 1 isados de teluias de especímenes ¡Je tumor- de mama primarios ( figura 8) . Ademas, el anticuerpo mostró reactividad a células de tumor de mama mediante tinción i nmunoh stoquimi ca de secciones fijadas .on par-afina de eancer (Je mama obtenido do un espécimen del [)ac?ent.e ( figura 9). La t inci n i nrnunohistoquim ca se r c-al izo usando el an icuerpo par-a el peptido de marnaglobi na y anticuerpo ant i onej etiquetado con perox i dasa de rábano y tetraclorhidrato de 3,3' diarmno benceno (DAB) corno substrato. Las células que expresan la proteina rnarnaglob a mostraron una tinción cafe. A part ir de estos resultados, se cree que la rnarnaglobma es una proteina secretada, que la p rote ina rnarnaglobina es sintetizada corno una µ rote ina precursora y modificaciones post-t raduccion incrementan su peso molecular aparente necesario antes de la secreción; y que La µrotema rnarnaglobi na puede ser detectada en especímenes de tumor de ma a humano. La detección de una protema marnaglobma es aplicable en diagnósticos de cáncer usando proteina marnaglobma como un marcador de tumor- de rnarna, en la evaluación de recaída de tumor de mama, en el rnonitoreo de transplantes análogos de medula osea/celulas madre para contaminar células tumorales, en vacunas de tumores de rnarna, y en la dirección de células de tumor- de mama para intervención terapéutica a » raves de complejos mediados por anticuerpo.

En vista de lo anterior, se vera que se logran las diversas vent jas de l nvención y se obtienen otros resul t ados vent ajosos. Puesto (jue se pueden hacer' varios cambios en los métodos y composiciones anteriores sin apartarse del alcance de la invención, se pretende que todo el material contenido en la descripción anterior y mostrado en los dibujos anexos se interprete corno ilust i ativo y no en un sentido limitante.

LISTfi DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICT TANTE: UATSON, MARK A. FLEMING, l'TMOTHY P. (ll) TITULO DE LA INVENCIÓN: SECUENCIA DE ADN Y PROTEINA CODIFICADA DE CÁNCER DE MAMA ESPECTFTCA DE MAMA (lll) NUMERO DE SECUENCIAS: 14 (A) DESTINATARIO: POGERS, HOUEI. I. R HAFERKAMP (B) CALLE: 7733 FORSYTH EOULEVARD, SUITE 1400 (C) CIDUDAD: ST. LOUIS (D) ESTADO: MISSOURI (E) PAÍS: I..U.fi. (F) CÓDIGO POSTAL: 63105-1817 (iv) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC IBM COMPATIBLF (C) SISTEMA OPERATIVO: PC -DOS/MS-DOS (D) SOFTUARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: .2 (viü) INFORMACIÓN SOBRE EIL APODERADO/AGENTE (A) NOMBRF: HOLLAND, DONAl D R. (B) NUMERO DE REGISTRO: 35,197 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO: í364706 (íx) INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES (A) TELEFONO: (31.) P27-5188 (B) TELEFAX: (314) 727-6092 Lü (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA NO, (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 503 pares de bases (B) TIPO: acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal 20 (ll) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNrn (ill) HIPOTÉTICO: NO (IV) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. DE SECUENCIA NO: 1: GACAGCGGCT TCCTTGATCC TTGCCACCCG CGACTGAACA CCGACAGCAG CAGCCTCACC 60 ATGAAGTTGC TGATGGTCCT CATGCTGGCG GCCCTCTCCC AGCACTGCTA CGCAGGCTCT 120 GGCTGCCCCT TATTGGAGAA TGTGATTTCC AAGACAATCA ATCCACAAGT GTCTAAGACT 180 GAATACAAAG AACTTCTTCA AGAGTTCATA GACGACAATG CCACTACAAA TGCCATAGAT 240 OAATTGAAGG AATGTTTTCT TAACCAAACG GATGAAACTC TGAGCAATGT TGAGGTGTTT 300 ATGCAATTAA TATATGACAG CAGTCTTTGT GATTTATTTT AACTTTCTGC AAGACCTTTG 360 GCTCACAGAA CTGCAGGGTA TGGTGAGAAA CCAACTACGG ATTGCTGCAA ACCACACCTT 420 CTCTTTCTTA TGTCTTTTTA CTACAAACTA CAAGACAATT GTTGAAACCT GCTATACATG 480 TTTATTTTAA TAAATTGATG GCA 503 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA NO. 2 (l) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 93 amino cidos (B) TIPO: aminoácido (O TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (III) HIPOTÉTICO: NO ( x i ) J)ESCR I PC IÜN DE SECUE NCIA : T D . DE SECUENCIA NO : 2 • Met Lys Leu Leu Met Val Leu Met Leu Ala Ala Leu Ser Gln His Cys 1 5 10 15 Tvr Ala Gly Ser Gly Cys Pro Leu Leu Glu Asn Val He Ser Lys Thr * 20 25 30 He Asn Pro Gln Val Ser Lys Thr Glu Tyr Lys Glu Leu Leu Gln Glu 35 40 45 Phe He Asp Asp Asn Ala Thr Thr Asn Ala He Asp Glu Leu Lys Glu 50 55 60 Cvs Phe Leu Asn Gln Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Val Glu val Phe 65 70 75 80 Met Gln Leu He Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe 85 90 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA NO, (l) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ll) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (lll) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (IX) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. DE SECUENCIA MO: 3: GAGCGGCTTC CTTGATCCTT G 21 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA NO. 4: (I) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (lll) HIPOTÉTICO: NO dv) ANT1SENT IDO: NO (i?) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. DE SECUENCIA NO: 4 ATAAGAAAGA GAAGGTGTGG 20 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA NO. 5 (l) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 403 pares de bases (B) TIPO: acido nucleico (O TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal .6 (H ) ?PO DL" MOLÉCULA ADNc a flRNrn (111) HI OIG?CO NO ( iv ) ANJ I GN?DO: NO (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. DE SECUENCIA NO : %: GACAGCGGCT TCCTTGATCC TTGCCACCCG CGACTGAACA CCGACAGCAG CAGCCTCACC 60 ATGAAGTTGC TGATGGTCCT CATGCTGGCG GCCCTCTCCC AGCACTGCTA CGCAGGCTCT 120 GGCTGCCCCT TATTGGAGAA TGTGATTTCC AAGACAATCA ATCCACAAGT GTCTAAGACT 180 GAATACAAAG AACTTCTTCA AGAGTTCATA GACGACAATG CCACTACAAA TGCCATAGAT 240 3AATTGAAGG AATGTTTTCT TAACCAAACG GATGAAACTC TGAGCAATGT TGAGGTGTTT 300 ATGCAATTAA TATATGACAG CAGTCTTTGT GATTTATTTT AACTTTCTGC AAGACCTTTG 360 GCTCACAGAA CTGCAGGGTA TGGTGAGAAA CCAACTACGG ATT 40 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA NO. 6: (l) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 203 pares de bases (B) TIPO: acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal ll) TIPO DE MOLÉCULA; ADNc a ARNm (III) HIPOTÉTICO: NO (IV) NTISENflDO: NO (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. DE SECUENCIA NO: b TTTATGCAAT TAATATATGA CAGCAGTCTT TGTGATTTAT TTTAACTTTC TGCAAGACCT 60 TTGGCTCACA GAACTGCAGG GTATGGTGAG AAACCAACTA CGGATTGCTG CAAACCACAC 120 CTTCTCTTTC TTATGTCTTT TTACTACAAA CTACAAGACA ATTGTTGAAA CCTGCTATAC ATGTTTATTT TAATAAATTG ATGGCA 206 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA NO. 7 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 95 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal ( n) TIPO DE MOLÉCULA: pro eina (ni) HIPOTÉTICO: NO ( X l ) DESC I PCTON DE SECUENCIA : I D . DE SECUE NCIA NO : 7 : Met Lvs Leu Val Phe Leu Phe Leu Leu Val Thr He Pro He Cys Cys 1 5 10 15 Tvr Ala Ser Gly Ser Gly Cys Ser He Leu Asp Glu Val He Arg Gly 20 25 30 Thr He Asn Ser Thr Val Thr Leu His Asp Tyr Met Lys Leu Val Lys 35 40 45 Pro Tyr Val Gln Asp His Phe Thr Glu Lys Ala Val Lys Gln Phe Lys 50 55 60 Qln Cys Phe Leu Asp Gln Thr Asp Lys Thr Leu Glu Asn Val Gly Val 65 70 75 80 Met Met Glu Ala He Phe Asn Ser Glu Ser Cys Gln Gln Pro Ser 85 90 95 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA NO. H (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 91 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (il) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (lll) HIPOTÉTICO: NO .9 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. DE SECUENCIA NO: 0 Met Lve Leu Ala Val Thr Leu Thr Leu Val Thr Leu Ala Leu Cys Cys l 5 10 15 Ser Ser Ala Ser Ala Glu He Cys Pro Ser Phe Gln Arg Val He Glu 20 25 30 Thr Leu Leu Met Asp Thr Pro Ser Ser Tyr Glu Ala Ala Met Glu Leu 35 40 45 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA NO. 9: (I) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: Lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (lll) HIPOTÉTICO: NO dv) ANTISENTIDO: NO (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. DE SECUENCIA NO: 9 CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG 35 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DF SECUENCIA NO. 10: (I) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) I ONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA: AÜNe (lll) HIPOTÉTICO: NO (lv) ANTISEN1IDO: NO (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. DE SECUENCIA NO: 10 CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA NO. 11 (l) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 par-es de bases (B) TIPO: acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (?? DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: TD. ÜE SECUENCIA NO: 11: AATCCGTAGT TGGTTTCTCA CC 22 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA NO. L2: (I) CARACTFRTSTTCAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: ind vidual (D) TOPOLOGÍA: lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (lll) HIPOTÉTICO: NO dv) ANT ISENTIDO: NO (IX) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. DE SECUENCIA NO: 12: CTTTCTGCAA GACCTTTGGC 20 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA NO. 13: (l) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm (lli) HIPOTÉTICO: NO 1.9 (IV) ANT T EN r IDO: MO (íx) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. DE SECUENCIA NO: 13: ttttTTTTTT tttttttttt T 21 (2) INFORMACIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCLA NO. 14: (l) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGTTUD: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) riPO DK CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (11) TTPO DE MOLÉCULA: protema (ni) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. DE SECUENCIA NO: 14 Glu Val Phe Met Gln Leu He Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe

Claims (6)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un pol inucleot do aislado y purificado que codifica rnarnaglobi na, o un fragmento de dicho polinucleotido que hibpdiza especifícamele al complemento de SEC ID NO: i.

2.- El pol nucleotido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado demas porque ol pol inucJeoHdo comprende SEC U) NO:l.

3.- El polinucleotido de conformidad con la reivindicación I, caracterizado ademas porque el polmucleo+ido codifica la secuencia de aminoácidos de SErc ID NO: 2.

4.- Un polipeptido de rna aglobina aislado y purificado, dicho polipeptido comprendiendo la secuencia de amino cidos de SEC ID NO: 2 o un derivado de la misma.

5.- El polipeptido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado ademas por-que dicho derivado comprende por- lo rnenos cinco aminoácidos de SFC ID NO: 2.

6.- Un rnetodo para detectar la presencia de c ncer de mama en un paciente que comprende detectar- y/o euantificar la presencia de un ARNc que codifica un polipeptido de narnaglobina en una muestra del paciente, en donde dicho polipéptido de rnamaglobina compr-ende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 o un derivado de la misma y en donde una concentración elevada e dicho ARNrn por arriba de la concentración para un individuo sano indica la presencia de células de c ncer de mama „ ? . - Ll método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado ademas porque el paso de detección y/o cuant i ficacion compr-ende ademas los pasos de: (a) proveer- un pol i nucleotido que hibridiza específicamente a SEC ID N0:1, (b) incubar- el polinucleot ido con la muestra bajo condiciones en las cuales el pol ucLeot ido puede hibpdizar especí icamente con ARNrn de células de neoplasia de mama, y (c) detectar- la existencia de un complejo de hibridación de pol ucloo. i do-ARN. 8.- El rnetodo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado ademas por-que el polmucleotido es el complemento de SEC ID N0:l. 9.- El método de conformidad con la reiv ndicación 7, caracterizado ademas porque el polinucleotído es ADNc que codifica polipep-tido de rnarnaglobma que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2. 10.- Un equipo para detectar la presencia de células de neoplasia de rnarna en una muestra que comprende un pol ucleotido que hibridiza específicamente a SEC TD N0:1 empacada en un contenedor. 11.- Un equipo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado ademas porque el polinucleotido es el complemento de SEC ID N0:1. 12.- Un equipo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado ademas porque el polinucleótido es ADNc que '_5 codifica polipeptido (Je ntarnaglobma que consiste de la secuencia de amino cidos do SEC ID NO: . 13. 1 1 m todo de confor idad < on La reivindicación 8, caracteri ado ademas porque el paso de detección y/o cuant i icacion comprende ademas Los pasos de: (a) producir un ADNc que codifica polipeptido de rnainaglobma a partir de ARNm usando el método de t ranscp tasa inversa, (b) proveer dos oli oineros que hibpdizan específicamente al ADNc para definir una legión del ñ\) \c tµie ha de ser amplificado por el rnetodo de reacción de cadena de polunerasa, en donde dichos ol?<jonucleot idos hibpdizan especí icamente al ADNc que codifica SEC ID N():2, (c) amplificar La re<jion de ADNc por ol rnetodo de reacción de cadena (je polunerasa usando los dos oligonucleo idos corno iniciadores, y (d) detectar la p rese e La de l a región de ADNc ampli icada. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado ademas porque uno de los dos oligonucieotidos comprende SEC ID NO: 3 y el otro compr'ende SEC TD NO: 4. 15.- Un equipo par'a detectar la presencia de células de neoplasia de ama en una muestra que compr'ende dos oligonucleotí dos corno iniciadores para el método de reacción de cadena de polunerasa empacado en un contenedor, en donde dichos oligonucleótidos hibridiza específicamente a ADNc que codifica SEC ID NO:2 para definir una regi n quer ha de ser amplificada. 16. - El equipo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado ademas porque uno de los dos oligonucleotidos '.6 compi-ondon SEC rD NO: 3 y ei otro (emprende SFC ID NO: 4. 1/.. Un m todo para detoetai la presencia de c ncer de mama en un paciente que comprende detectar y/o cuant Lficar la presencia de un polipeptido de inamaqlobma en un muestra del paciento, en donde dicho polipeptido de mamaglobma comprendo l a secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: o un derivado de la misma y en donde una concen raci n elevada de dicho polipeptido de ainaglobma por- arriba de la concentraci n para un individuo sano indica la presencia de cáncer de mama. 1 ü . - El método de conform dad con La reivindicaci n 17, caracterizado ademas porque el paso de detección y/o cuanti (" cacion comprende ademas hacer reaccionar con el polipéptido de mainaglobina un anticuerpo purificado y detectar un enlace del polipeptido de rnamaglobina con el anticuerpo, en donde dicho anticuerpo es especifico para un epitope de marna lobina que comprende por lo rnenos cinco amino cidos de SEC 1 D NO : 2 ,. 19.- El método de conformidad con la reivi ndicaeion 18, caracteri ado ademas porque el anticuerpo puri icado es un anticuerpo policlonal y el epitope de rnarnaglobma comprende SEC TD NO: l .. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado ademas porque el anticuerpo purificado es un anticuerpo monoclonal y el epitope de marnaglobina comprende SEC ID NO: 14. 21.- Un equipo para detectar la presencia de células de cáncer de mama en una muestra que compr'ende un an icuerpo pun f i cado que reacciona con un pol peptido de arnaq Lobina empacado en un contenedor, en donde dicho polipeptido de amag Lobina compr-ende SEC ID NO: 2 o un derivado del mismo y dicho anticuerpo es especi fico para epitope de inarnaglobma que cornpr-ende un epitope de rnainaglobina que compr'ende por- lo rnenos cinco aminoácidos de SEC ID NO: 2. 22.- El equipo de conformidad con la reivindi aci n 21, caracterizado ademas porque ol anticuerpo purificado es un anticuerpo pol clona l y el epitope de marnaglobina comprende SEC ID NO: 14. 23.- El equipo de conformidad con la i ei vindicación 21, caracterizado ademas porque el anticuerpo purificado es un anticuerpo monoclonal y el epitope de rnamaglobma comprende SEC ID NO: 14. 24.- Un poli nucleotí do complement rio para el pol mucleotido aislado y purificado de la reivindicación 1. 25.- Un polinucleotido aislado y purificado que hibpdiza específicamente a SEC ID N0:L, o el complemento de dicho pol nucloo. ido.