MXPA97009289A - Metodos para incrementar la acumulacion de aminoacidos esenciales en semillas - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para incrementar los niveles de aminoácidos esenciales en semillas de plantas, por lo que se mejora el valor nutricional de las semillas. El método comprende manipular la trayectoria metabólica de los aminoácidos para proporcionar una fuente incrementada del aminoácido objetivo y, concomitantemente, sobre expresar un gen preseleccionado que codifica para la proteína que contiene el aminoácido objetivo, de tal forma que hay una acumulación del aminoácido objetivo, enlazado a la proteína. Se produce de esta forma una reserva de proteína complementario. La presente invención es particularmenteútil para incrementar los niveles de metionina, lisina y treonina en semillas.

Description

MÉTODOS PARA INCREMENTAR LA ACUMULACIÓN DE AMINOÁCIDOS ESENCIALES EN SEMILLAS. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona al campo de la nutrición animal. Específicamente, la presente invención se relaciona a métodos para mejorar el contenido nutricional de semillas utilizadas como alimentación. Se requieren formulaciones de alimentación para proporcionar nutrientes esenciales a los animales críticos para el crecimiento. Sin embargo, las plantas de cultivo son fuentes de alimento generalmente disminuidas de calidad nutricional deficiente ya que contienen bajas proporciones de varios aminoácidos los cuáles son esenciales para, pero no pueden ser sintetizados por, animales monogástricos. Por muchos años los investigadores han intentado mejorar el balance de aminoácidos esenciales en las proteínas de semillas de importantes cultivos a través de los programas de siembra. En cuanto llegue a ser más conocido sobre las proteínas almacenas en semillas y la expresión de los genes los cuáles codifican estas proteínas, y como se desarrollan los sistemas de transformación para una mayor variedad de plantas, los procedimientos moleculares para mejorar la calidad nutricional de las proteínas de semillas pueden proporcionar alternativas a los procedimientos más convencionales. De esta forma, los niveles de aminoácidos específicos pueden ser mejorados en un cultivo dado via biotecnología. Un método alternativo es expresar una proteína heteróloga de composición favorable de aminoácidos en niveles suficientes para obviar la suplementación de la alimentación. Por ejemplo, han sido identificadas un número de proteínas de semillas ricas en aminoácidos de azufre. Una clave para una buena expresión de tales proteínas implica los cassettes de expresión eficientes con promotores específicos de semillas. No solamente las regiones que controlan los genes deben dirigir la síntesis de altos contenidos de ARNm, el ARNm debe ser traducido en la proteina estable. Entre los aminoácidos esenciales necesarios para la nutrición animal, con frecuencia limitantes de las plantas para cultivo son, etionina, treonina y lisina. Han tenido un éxito mínimo los intentos para incrementar los niveles de estos aminoácidos libres por siembra, la selección de mutantes y/o cambiar la composición de las proteínas de almacenamiento acumuladas en las plantas para cultivo. Usualmente, la expresión de la proteína de almacenamiento transgénica no resulta en un incremento suficiente en los aminoácidos totales de la semillas. El cassette de expresión 2S del coquito de Brasil promovido por faseolina es un ejemplo de un gen específico a semilla quimérico efectivo. Sin embargo, a pesar de que la proteína del coquito de Brasil incrementa la cantidad de metionina total y metionina enlazada, por lo que se mejora el valor nutricional, parece haber una limitación de umbral en cuanto a la cantidad total de metionina que es acumulada en las semillas. Las semillas son insuficientes, como fuentes de metionina y se requiere suplementación de metionina en dietas que utilizan los frijoles de soya anteriores. Una alternativa para mejorar los niveles de aminoácidos específicos alterando los niveles de proteína que contienen el aminoácido deseado es la modificación de la biosíntesis de aminoácidos. Han sido aplicadas las tecnologías de ADN recombinante y transferencia de genes para alterar la actividad enzimática que cataliza las etapas claves en la trayectoria biosintética de aminoácidos. Glassman, Patente de los Estados Unidos No. 5,258,300; Galili, et al; Solicitud de Patente Europea No. 485970; (1992); Incorporada aquí en su totalidad. Sin embargo, la modificación de los niveles de aminoácidos en semillas no siempre se correlaciona con cambios en el nivel de proteínas que incorporan aquellos aminoácidos. Burrow, et al., Mol. Gen. Genet . ; Vol. 241: pág. 431-439; (1993); incorporada aquí en su totalidad para referencia. Los incrementos en los niveles de lisina libre en hojas y semillas han sido obtenidos por selección por los mutantes DHDPS o por expresar DHDPS de E^ Coli en plantas. Sin embargo, ya que el nivel de aminoácidos libres en semillas, en general, es solamente una fracción menor del contenido total de aminoácidos, estos incrementos han sido insuficientes para incrementar significativamente el contenido total de aminoácidos de la semilla. El gen LysC es un aspartato quinasa bacterial mutante el cuál es desensibilizado para inhibición de retroalimentación por lisina y treonina. La expresión de este gen resulta en un incremento en el nivel de la biosíntesis de metionina y treonina. Sin embargo, la expresión de éste gen con cassettes de expresión específico de semilla ha resultado en un incremento de solamente 6-7% en el nivel de treonina o metionina total en la semilla. Ver Karchi, et al., The Plant J.; Vol. 3; pág. 721-7; (1993); incorporado aquí en su totalidad para referencia. De esta forma, existe un impacto mínimo sobre el valor nutricional de las semillas, y todavía se requiere la suplementación con aminoácidos esenciales. En base a lo mencionado anteriormente, existe una necesidad para métodos para incrementar los niveles de aminoácidos esenciales en semillas de plantas. Como puede observarse de la técnica anterior, los procedimientos anteriores han llevado a incrementos insuficientes en los niveles de ambos aminoácidos libres y enlazados para mejorar significativamente el contenido nutricional de la alimentación. Existe una necesidad para incrementar los niveles de los aminoácidos esenciales por un 100%, duplicando los niveles existentes. Si esto se logra, no será más necesaria la suplementación . Es por lo tanto un objeto de la presente invención proporcionar métodos para modificar genéticamente las semillas de plantas para incrementar los niveles de los aminoácidos esenciales treonina, metionina y lisina en las semillas de tales plantas. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar semillas para alimento y/o alimentación con mayores niveles de los aminoácidos esenciales treonina, metionina y lisina, que las especies de tipo silvestre de las mismas semillas. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar semillas para alimento y/o alimentación de tal forma se duplica que el nivel de los aminoácidos esenciales, de esta forma obviando la necesidad para suplementación de la alimentación. La presente invención proporciona métodos para modificar genéticamente semillas de plantas para incrementar los niveles de los aminoácidos esenciales treonina, metionina y lisina. Los métodos actuales implican una combinación de proporcionar una fuente incrementada de una población de aminoácido libre objetivos con una reserva de proteína producido concomitantemente, complementario, el resultado de la cuál, es una acumulación incrementada no esperada de aminoácido objetivo, enlazado a proteína. Los métodos incluyen 1) manipulación de las trayectorias metabólicas de los aminoácidos en semillas para proporcionar un incremento en el nivel y/o disponibilidad de los aminoácidos esenciales tales como treonina, metionina y/o lisina; 2) y la sobre expresión de genes preseleccionados ya sea endógenos o heterólogos, que codifican para las proteínas de semillas que contienen aminoácidos esenciales tales como treonina, metionina y/o lisina. La síntesis del aminoácido objetivo libre suficiente como una fuente para incorporación en la proteína seleccionada concomitantemente sintetizada la cuál actúa como una reserva elimina la necesidad para suplementación de aminoácidos esenciales en la alimentación. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS. La Figura 1 Representa un diagrama de la trayectoria biosintética de la familia del aspartato. Como se utiliza aquí, "reserva" significa una proteína establemente acumulada que puede contener abundantes cantidades de aminoácidos objetivos. Como se utiliza aquí "fuente" significa los aminoácidos libres y disponibles para la biosíntesis de proteína. Estos son sintetizados de novo vía trayectorias biosintéticas.

Como se utiliza aquí, "aminoácidos libres" significa aminoácidos que no están modificados o son el resultado directo de su síntesis. Como se utiliza aquí, "aminoácido enlazado" significa aminoácidos que están modificados, por ejemplo incorporados en péptidos y proteínas. Como se utiliza aquí, "aminoácido objetivo" significa un aminoácido que será sobreproducido. Como se utiliza aquí, "proteínas seleccionadas" significa una proteína, o su equivalente genético, que contiene niveles elevados de aminoácido objetivo. Como se utiliza aquí, "modificado genéticamente" significa una célula vegetal que incorpora establemente una construcción de ácido nucleico introducida por métodos de transformación. El término " tipo silvestre" se refiere a una célula vegetal no transformada. Proteína "endógena" se refiere a la proteína nativa normalmente encontrada en su ubicación natural en la planta. Además, la invención comprende los métodos para preparar y utilizar las varias construcciones ADN de la presente invención. Las plantas, semillas y microorganismos transformados con las secuencias de ácidos nucleicos descritas son también modalidades de la invención. Las plantas preferidas que producen semillas en las que la proteína contenida puede ser mejorada por este método incluyen, pero no están limitadas a, frijol de soya, cañóla, maíz, girasol, trigo, cebada, avena, mijo, arroz, sorgo, y centeno. Las semillas pueden ser utilizadas directamente como alimentación o alimento, o puede ocurrir un procesamiento adicional. En la práctica de la presente invención, la semilla de planta más preferida es Glycine max. De acuerdo con ésta invención, se proporciona un proceso simple, rápido y confiable para la producción de plantas de frijol de soya transgénicas con acumulación incrementada de aminoácidos esenciales en las semillas resultantes. El método es independiente a genotipo y muestra una mejora substancial, no esperada sobre los sistemas utilizados anteriormente. Manipulación de las trayectorias metabólicas de aminoácidos . Recientes avances en las tecnologías de ADN recombinante y transferencia de genes han hecho posible aislar, secuenciar, manipular y reintroducir genes en los organismos. Ver por ejemplo Plant Biotechnolgy: Commercial Prospects and Problems, (1993), eds Prakash et el., Oxford & IBH Publishing Co., New Delhi, India; Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts, (1992), Heslot, et al., CRC Press, Inc., USA; y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; incorporados todos aquí en su totalidad para referencia. El uso de estas tecnologías permite la manipulación genética de trayectorias metabólicas, que llevan por último a cambios en las concentraciones de ciertos metabolitos. Ver Bailey, et al., "Toward a Science of Metabolic Engineering," Science; Vol. 252; pág. 1668-1675; (1991); Muller-Rober, et al., "Inhibition of the ADP-glucose Pyrophosphorylase in Transgenic Potatoes Leads to Sugar-storing Tubers and Influences Tuber Formation and Expression of Tuber Storage Protein Genes." The EMBO Journal; Vol. 11(4); pág. 1229-1238; (1992); Sonnenwald, et al., "Transgenic Tobacco Plants Expressing Yeast-derived Invertase in either the Cytosol, Vacuole or Apoplast: a Powerful Tool for Studying Sucrose Metabolism and Sink/source Interactions, " The Plant Journal, Vol. 1(1), pág. 95-106; (1991); y Tarczynski, et al., "Expression of Bacterial mtlD Gene in Transgenic Tobacco Leads to Production and Accumulation of Mannitol.," Proc. Nati. Acad. Sci., Vol. 89, pág. 2600-2604; (1992); Todos incorporados aquí en su totalidad para referencia . Los procedimientos estándar moleculares por los cuáles las trayectorias metabólicas para el metabolismo de treonina, metionina y lisina en semillas de plantas pueden ser alteradas son descritos posteriormente en la presente. La propuesta de estos procedimientos no limitantes es incrementar los suministros de estos aminoácidos esenciales.

Sobre expresión de un gen que codifica para una enzima objetivo. Este procedimiento incrementa la concentración de una enzima objetivo deseada la cuál es una enzima limitante en velocidad, usualmente regulada y en un punto de ramificación metabólico. Ver por ejemplo Van Schaewen, A., et al., EMBO J. ; Vol. 9; pág. 3033-3044; (1990); y Dickinson, C.D., et al., Plant Physiol.; Vol. 95; pág. 420-425; (1991) ambos incorporados aquí en su totalidad para referencia. La expresión incrementada del gen que codifica para la enzima objetivo puede ser lograda, por ejemplo, incrementando la resistencia del promotor utilizado para accionar la transcripción del gen y/o incrementar el número de copias del gen y sus elementos de regulación. La fuerte expresión del gen y copias múltiples del gen llevan a niveles incrementados ARNm y enzima objetivo. El incremento en la concentración de la enzima objetivo incrementa el flujo metabólico a través de la etapa limitante en velocidad. Por ejemplo, ha sido correlacionado un incremento en la cistationina gamma-sintasa ("CS") con la biosíntesis incrementada de metionina. Ver por ejemplo Thompson, et al., "Methionine Biosynthesis in Lemna, " Plant Physiol. ; Vol. 69: pág.1077-1083; (1982); incorporado aquí para referencia. CS cataliza la primera etapa de la biosíntesis de metionina ( ver Figura 1) . El substrato fisiológico aparente es O-fosfoho oserina, y de ésta forma CS compite por este substrato con treonina sintasa, una enzima implicada en la biosíntesis de treonina. Los niveles de CS están correlacionados inversamente con los niveles de metionina, indicando la regulación por metionina o compuestos relacionados. La sobre expresión de CS debe llevar a un flujo incrementado a través de CS, permitiendo la biosíntesis de metionina incrementada. Para la síntesis incrementada de treonina, puede ser sobre expresada, la metionina adenociltransferasa ("MAT") . Ha sido demostrado que el producto directo de MAT, S-adenocilmetionina ("SAM") activa fuertemente la treonina sintasa ("TS") in vitro. Incrementar la expresión MAT lleva a la síntesis incrementada de SAM, lo cuál permite una mayor concentración de TS para estar en forma activa. La actividad incrementada de TS lleva a un incremento en la biosíntesis de treonina. Debido a la co-expresión de la proteína de reserva, como se contempla por el tema de la invención, los niveles de treonina libres, no serán suficientemente altos durante la síntesis de proteína objetivo para afectar negativamente la actividad de la aspartato quinasa-homoserina deshidrogenasa o para promover las actividades catabólicas. Para la síntesis incrementada de lisina, es efectiva la sobre-expresión de dihidrodipicolinato sintasa ("DHPS") . Un substrato de DHPS, el semialdehido aspártico, es un intermediario del punto de ramificación, siendo un precursor para la biosíntesis de homoserina y para la biosíntesis de DHP. Un incremento en la actividad de DHPS, permite una conversión mayor hacia la biosíntesis de DHP, y de esta forma, la biosíntesis de lisina. La co-expresión de una proteína de reserva debe provocar que los niveles de lisina libre sean suficientemente bajos durante la síntesis de la proteína objetivo de tal forma que la actividad de DHPS o AK-HSD no se afecte negativamente. Baja expresión de un gen que codifica para una enzima objetivo. J Se logra una disminución en la concentración de una enzima objetivo, por ejemplo por el uso de una construcción sin sentido. Ver por ejemplo Temple, S.J., et al., "Modulation of Glutamine Synthetase Gene Expression in Tobacco by the introduction of an Alfalfa Glutamine Synthetase Gene in Sense and Antisense Orientation: Molecular and Biochemical analysis."' Molecular and General Genetics, Vol. 238 (2-3); pág. 315-325: (1993); Incorporado aqui para referencia. La expresión de una construcción de gen sin sentido lleva a una disminución en el ARNm traducible para la síntesis de enzima, por lo que lleva a una disminución en la concentración de enzima objetivo y flujo metabólico en la enzima objetivo. Por ejemplo, la treonina sintasa ("TS") cataliza la primera etapa obligada de la biosíntesis de treonina. El substrato fisiológico para TS es O-fosfohomoserina y de esta forma TS compite por este substrato con CS. La baja expresión de TS reduce el flujo a través de TS, y de esta forma proporciona el substrato adicional (O-fosfohomoserina) para CS, por lo que se incrementa el flujo metabólico hacia la biosíntesis de metionina. Adicionalmente, los niveles disminuidos de TS llevan a una disminución en la biosíntesis y concentración de treonina, lo cuál a su vez reduce el nivel de inhibición de retroalimentación por este metabolito sobre AK-HSD, otra vez resultando en la biosíntesis incrementada de metionina. De esta forma, el carbono y la energía metabólica son llevados desde la biosíntesis de treonina hacia la biosíntesis de metionina. Para la treonina, es efectiva la baja expresión de DHPS y CS, por las mismas razones como se discute anteriormente. Por ejemplo, los niveles reducidos de CS permiten una disponibilidad incrementada O-fosfohomoserina para TS, por lo que se incrementa la biosíntesis de treonina. Adicionalmente, una reducción en los niveles TS disminuye la biosíntesis de treonina y la inhibición de la actividad de AK-HSD por la treonina ya que los niveles de treonina libre son relativamente bajos. Estas acciones incrementan la biosíntesis de lisina (y metionina) . Ya que MAT tiene una influencia fuerte positiva sobre la actividad de TS, una supresión de su síntesis disminuye el nivel de TS activa y el efecto es similar a la baja expresión de TS. Generación de un punto de ramificación metabólico alternativo. Algunas veces es deseable volver a desviar el flujo metabólico desde un punto de ramificación principal en dónde un metabolito es compartido entre varias trayectorias de competición a una ruta más directa o a la producción de un metabolito nuevo. Esto puede ser llevado a cabo expresando un sólo gen- que codifica para la enzima objetivo o puede implicar la expresión de múltiples genes que codifican para múltiples enzimas. Ver por ejemplo. Tarzynski, M.C., et al., "Expression of a Bacterial mtlD Gene in Transgenic Tobacco Leads to Production and Accumulation of Mannitol," Proc. Nati. Acad. Sci. USA; Vol. 89; pág. 2600-2604: (1992); Incorporado aquí para referencia. Por ejemplo, la O-fosfohomoserina es fundamental por no decir que es el substrato fisiológico exclusivo para CS en plantas superiores. Las primeras enzimas obligadas en la biosíntesis de metionina (CS) y biosíntesis de treonina (TS) compiten por la O-fosfohomoserina. Para incrementar la biosíntesis de metionina, la homoserina puede ser desviada, en parte, hacia malonilhomoserina por la expresión de un gen que codifica la homoserina maloniltransferasa. La malonil-homoserina, además a O-fosfohomoserina, es un substrato para CS pero no para TS, y de esa forma los niveles incrementados del substrato deben estar disponibles para CS, llevando a un incremento en la síntesis de metionina. Alteración de las propiedades bioquímicas de una enzima objetivo. Las modificaciones del gen que codifica para la enzima objetivo son hechos de acuerdo a este procedimiento, alterando las características bioquímicas de la enzima. Ver por ejemplo la Patente de los Estados Unidos No. 5,367,110, presentada el 22 de Noviembre, de 1994 a Galili, et al., incorporada aquí para referencia. Existen varios métodos conocidos para alterar las propiedades bioquímicas de las enzimas. Estos métodos incluyen la mutagénesis dirigida al sitio. Ver por ejemplo, Deng, et al., "Site-Directed Mutagenesis of Virtually any Plasmid by Eliminating a Unique Site," Anal. Biochem; Vol. 200; pág. 81-88; (1992); incorporada aquí para referencia. Dependiendo del resultado de la alteración, el flujo metabólico puede ser incrementado o disminuido a través de la enzima objetivo. Ver por ejemplo, Shaul, et al., "Threonine Overproduction in Transgenic Tobacco Plants Expressing a Mutant Desensitized Aspartate Kinase of Escherichia coli," Plant Plys . ; Vol. 100; pág. 1157-1163; (1992); y Brzovic, et al., "Substitution of Glutamic Acid 109 by Aspartic Acid Alters the Substrate Specificity y Catalytic Activity of the Beta-subunit in the Tryptophan Synthase Bienzy e Complex from Salmonella Typhimurium, " Biochemistry; Vol. 31; pág. 1180-90; (1992); ambos incorporados aquí para referencia. AK-HSD cataliza la primera etapa en la biosíntesis del aspartato de la familia de los aminoácidos. Esta enzima es regulada normalmente por retroalimentación por lisina y treonina. Las formas mutantes de AK-HSD han sido seleccionadas tanto en E^ Coli y en plantas, estos organismos han mostrado que sobre producen treonina, metionina, lisina e isoleucina libres. Hay poco o ningún cambio en los contenidos de treonina, metionina, lisina e isolucina enlazadas. Ver por ejemplo, Galili et al., citado aquí anteriormente. Sobre expresión de un gen seleccionado. La presente invención implica adicionalmente modificar genéticamente una semilla de planta para expresar en forma preferencial una proteína preseleccionada. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, una proteína rica en metionina, una proteína rica en cisteina, una proteína rica en lisina, una proteína rica en glicina, una proteína rica en triptófano , y una proteína rica en tirosina. Como se utiliza aquí, "rico" significa que contiene un porcentaje mayor de aminoácidos que la proteína promedio. Como se utiliza aquí, "promotor" se refiere a una secuencia de ADN en un gen, usualmente corriente arriba (5 ) para su secuencia de codificación, el cuál controla la expresión de la secuencia de codificación proporcionando el reconocimiento para la ARN polimerasa y otros factores requeridos para la transcripción de promotor. Los promotores preferidos son aquellos que permiten la expresión de la proteína seleccionada específicamente en semillas para evitar cualquier efecto potencial dañino en órganos que no son semillas. Tales promotores serán bien conocidos para una persona experta en la técnica. Los ejemplos de promotores específicos a semillas incluyen, pero no están limitados a, los promotores de proteínas de almacenamiento en semillas, los cuales expresan estas proteínas en semillas en una forma altamente regulada. Thompson, et al., BioEssays; Vol. 10; pág. 108-113; (1989); incorporado aquí en su totalidad para referencia. Los varios promotores específicos a semillas para la expresión de proteínas en semillas de plantas dicotiledóneas que serán de uso particular incluyen B-faseolin, napin, B-conglicinin, y lectin de frijol de soya. En las plantas monocotiledóneas, serán particularmente útiles zein de maíz de 15 kD, zein, zein de 22 kD, ?-zein, waxy, shrunken 1, globulin 1, y shrunken 2 para producir la expresión de péptidos. Aquellos expertos en la técnica reconocerán otros promotores así como también proporcionarán construcciones para niveles incrementados de la proteína preseleccionada en la planta elegida para transformación.

En una modalidad altamente preferida, la proteína preseleccionada es una proteína de almacenamiento de semilla 2S rica en metionina tal como la proteína del coquito de Brasil (BNP) . Altenbach, et al., Plant Mol. Bio. ; Vol. 8; pág. 239-250; (1987); incorporado aquí en su totalidad para referencia. Se introduce un ADN natural o construido o una secuencia de ARN que codifica esta proteína en la células vegetales por cualquier método de transformación que incorpora establemente el gen en el genoma de la planta. Esto puede incluir una variedad de vectores, tales como vectores virales, vectores episomales, vectores de impulso, vectores de plásmidos Ti, y similares, todos de acuerdo con los procedimientos bien conocidos. Sun, et al., Sol. De Patente Europea EP No. 295,959; (1991) ; incorporada aquí en su totalidad para referencia. Un "vector" es un replicón, tal como una plásmido, cósmido o bacteriófago, a el cuál puede estar unido otro segmento ADN como para llevar a cabo la replicación del segmento unido, o para permitir su introducción en un huésped celular. Como se utiliza aquí con respecto a una proteína, el término "heterólogo" significa que el gen o fragmento de gen que codifica la proteína es obtenido de una o más fuentes, más que del genoma de las especies de las plantas dentro de la cual este se expresa por último. La fuente puede ser natural, por ejemplo, el gen puede ser obtenido de otra fuente de material vivo, tal como bacterias, levadura, hongo o similares, o especies diferentes de plantas. La fuente puede ser también sintética, por ejemplo, el gen o el segmento de gen puede ser preparado in vitro por síntesis química. Como se utiliza aquí con respecto a proteína preseleccionada el término "expresa" significa que el gen que codifica esta proteína se incorpora establemente en el genoma de las células, de tal forma que el producto codificado por el gen, por ejemplo, una proteína rica en metionina tal como la proteína de coquito de Brasil (BNP) , se produce dentro de las células. Por ejemplo, las plantas novedosas que resultan de la expresión de BNP, contienen niveles de BNP de semilla que pueden ser extraídas de 0.5%, y en forma preferida, al menos 2%. Las propiedades de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína preseleccionada pueden ser variadas y la modalidad preferida describe un número de características las cuales pueden ser ventajosas pero que una persona experta en la técnica reconocerá que no son absolutamente fundamentales . Estas incluyen la selección de una construcción y vector particulares para introducir la secuencia en la célula y producir la expresión de la proteína. Un técnico experto puede construir un cassette de expresión adecuado para la expresión de la proteína preseleccionada en el sistema celular elegido sin experimentación excesiva. El corazón de la invención es nivel de la proteína preseleccionada; por lo tanto, las copias adicionales de la secuencia del ácido nucleico resultaran normalmente en la inhibición incrementada de síntesis de la proteína endógena. Para forma de ejemplo, y sin limitación, aquellos expertos en la técnica apreciaran fácilmente que las proteínas adicionales, tales como zein de lOkDa y albúmina 2S de la alfalfa pueden ser sustituidas por la proteína BNP como la proteína de semilla preseleccionada. Ver por ejemplo, Mol. Gen. Genet. (1988) Vol. 211, pág. 477-484; y J^ Exp. Bot., Vol. 41, 233 pág. 1541-7, 1990, respectivamente; ambas incorporadas aquí en su totalidad para referencia. El técnico experto reconocerá que la elección de la proteína preseleccionada se basará en la composición de aminoácidos de la proteína y su capacidad para acumularse en las semillas. Esto incluye todas las clases de proteínas almacenas en semillas; las proteínas 2S, 7S, y US con o sin modificación para incrementar el contenido del aminoácido designado en la proteína. El aminoácido puede ser elegido por su valor nutricional para producir una característica agregada en valor a la planta así como también su propósito como una reserva para limitar la disponibilidad para la proteína endógena. Los ejemplos de fuentes adecuadas para secuencias de proteínas utilizables de acuerdo con la presente invención son plantas, en particular plantas superiores. Los aminoácidos deseables para características agregadas de valor así como también una fuente para limitar la síntesis de un proteína endógena incluyen, pero no están limitados a metionina, cisteina, glicina, lisina, triptófano, y tirosina. Como se utiliza aquí, "planta" se refiere a ya sea una planta entera, una parte de la planta, una célula vegetal, o un grupo de células vegetales. La clase de plantas las cuales pueden ser utilizadas en el método de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores que tienen semillas adecuadas para técnicas de transformación, incluyendo tanto plantas mocotiledoneas y dicotiledonas. La transformación de las plantas de acuerdo con la invención puede ser llevada a cabo en esencialmente cualquiera de las varias formas conocidas por aquellos expertos en la técnica de la biología molecular de plantas. Estos incluyen pero no están limitados a bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y transferencia de ADN mediada por Agrobacteriu . Después de la transformación, se implicará normalmente la regeneración para obtener una planta entera a partir de la proceso de transformación. Las técnicas para regenerar plantas a partir de un cultivo de tejido, tales como protoplastos o líneas celulares de callos, son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Phillips, et al., Plant Cell Tissue Organ Culture; Vol. 1; p. 123; (1981); Patterson, KE. and N.P. Everett, Plant Sci. ; Vol. 42; pág. 125-132; (1985); Wright, et al., Plant Cell Reports; Vol. 6; pág. 83-89; (1987); Barwale, et al., Planta; Vol. 167; pág. 473; (1986); todos incorporados aquí en su totalidad para referencia. La selección de un método apropiado está dentro de la experiencia del técnico. Los ejemplos de la práctica de la presente invención detallados aquí se relacionan específicamente a plantas de frijol de soya y vectores de expresión operables en dicotiledóneas. Se elige el frijol de soya como un sistema modelo para estos ejemplos fundamentalmente debido a la capacidad actual para regenerar plantas de frijol de soya a partir de células de frijol de soya individuales transformadas en una manera ahora conocida en técnica. Los vectores de expresión utilizados aquí son capaces en forma demostrativa de operar en células de muchas plantas dicotiledóneas ya sea en cultivo de tejido y en plantas enteras. La invención descrita aquí es operable de esta forma en especies de dicotiledóneas para transformar células vegetales individuales y para obtener plantas enteras, intactas en especies de plantas dicotiledóneas, las cuáles pueden ser regeneradas a partir de callos de plantas preseleccionadas y las cuales expresan las proteínas preseleccionadas de las semillas. Para aquellas especies no regenerables actualmente, la presente invención es totalmente operable cuando las técnicas para tal regeneración lleguen a ser desarrolladas. Además los vectores de expresión quiméricos que implican proteínas de semillas son también conocidos y han sido descritos en la literatura los cuales han sido mostrados para ser operables en células de monocotiledóneas, al menos en el cultivo de tejido. Es razonable entonces esperar que estos vectores serán operables también en plantas monocotiledóneas enteras cuando las técnicas para regenerar estas plantas sean perfeccionadas de tal forma que cualquier proteína de semilla preseleccionada pueda ser expresada en cualquier semilla de planta monocotiledénea. La presente invención se aplica de ésta forma a monocotiledóneas así como también dicotiledóneas. Por lo tanto, la práctica de esta invención puede ser utilizada para mejorar plantas de cultivo arroz, maíz, trigo y centeno con pocas modificaciones. Un ejemplo de tal modalidad podría ser la introducción de un derivado con alto contenido de lisina de a-hordotionina en una célula de centeno o de trigo para disminuir el contenido de purotionina de la semilla e incrementar su contenido de lisina. Las tioninas son proteínas antimicrobianas presentes en el endosperma de centeno, trigo, y otras especies de plantas. Florack, et al., Plant Mol. Biol. ; Vol. 24; pág. 83-96; (1994); incorporado aquí en su totalidad para referencia. La a-hordotionina nativa es rica en residuos de arginina y lisina, conteniendo cinco residuos (10%) de cada uno. Han sido hechos varios derivados de esta proteína en los cuales otros aminoácidos son reemplazados con lisina para producir un compuesto menos tóxico a hongos y significativamente más enriquecidos con lisina (29% lisina) . Las purotioninas son proteínas ricas en lisina, también pequeñas en el endosperma de trigo y otras varias especies de Gramineae. Wada, K. Plant Cell Physiol 23 (8), 1357-1361; (1982); incorporado aquí en su totalidad para referencia. Las purotioninas son letales para la levadura de los productores de cerveza y, como resultado, no pueden ser utilizados centeno o trigo con altos niveles de estas proteínas para elaborar cervezas de alta calidad. Sin embargo, de acuerdo a esta invención, puede ser utilizada una a-hordotionina con alto contenido de lisina u otra tionina maquinada genéticamente designada para el enriquecimiento de lisina y toxicidad reducida para microorganismos puede ser utilizada para disminuir los niveles de purotioninas e incrementar el contenido de lisina de centeno, trigo u otras plantas gramíneas. El residuo enriquecido en lisina puede ser vendido para alimentar después del proceso para elaborar la cerveza. Lo anteriormente mencionado es una descripción del alcance de la invención y un técnico experto reconocerá muchos otros ejemplos de mejoramiento de plantas a los cuales puede ser aplicada la invención. La presente invención puede ser entendida mejor por referencia a el siguiente ejemplo más detallado el cual ilustra sus varias aplicaciones, pero no se pretende de ninguna forma limitar el alcance de la misma. Alteración experimental de la trayectoria de aminoácidos. Con el fin lograr la expresión específica a semillas del gen AK y objetivar la enzima a el plásmido, se utiliza el procedimiento como se describe en Karchi, et al., "Seed-specific Expression of a Bacterial Desensitized Aspartate Kinase Increases the Production of Seed Threonina and Methionine in Transgenic Tobacco," The Plant Journal; Vol. 3(5); pág. 721-727; (1993); incorporado aquí en su totalidad para referencia. Se utiliza la construcción de faseolina. Transformación de Glycine max con una proteína de almacenamiento de semilla rica en metionina Transformación de la Planta. La semilla de frijol de soya (Glycine max) , variedad Pioneer 9341, se esteriliza superficialmente por exposición a gas de cloro dispersado en un tarro de campana de vidrio. Se produce el gas agregando 3.5 mi. de ácido clorhídrico (34-37% peso/peso) a 100 mi. de hipoclorito de sodio (5.25% peso/peso). La exposición es por 16-20 horas en un recipiente aproximadamente de pie cúbico (0.028 metros cúbicos) en volumen. Se almacena la semilla esteriliza superficialmente en cajas Petri a temperatura ambiente. Se hace germinar la semilla en una placa sobre un medio de agar solidificado de resistencia 1/10 de acuerdo a Gamborg [Medio basal B5 con mínimos compuestos orgánicos, Sigma Chemical Co., cat. no. G5893, 0.32 gm/L; sacarosa, 0.2% peso/volumen y ácido 2-[Nmorfolinojetansulfónico (MES), 3.0 mM] sin reguladores de crecimiento de plantas y cultivando a 28°C con una duración del día de 16 horas e iluminación fluorescente blanca fría de aproximadamente 20 mEm2Sl. Después de tres o cuatro días, puede ser preparada la semillas para cocultivación. Se elimina el recubrimiento de la semilla y se elimina el radical de prolongación 3-4 mm abajo de los cotiledones. Se mantienen diez semillas preparadas en cada una de varias cajas Petri. Construcción de los plásmidos. Para la construcción del plásmido pl2GUSBN17, que contiene una copia del gen de la proteína rica en metionina quimérico (BNP), se utiliza el plásmido pARC12 (Prosen D.E. and R.B. Simpson, Biotechnology Vol. 5, pág. 966-971; (1987); incorporado aquí en su totalidad). Este es un plásmido de 29.5 kb el cual es parte de un sistema de vector binario de una Agrobacteria y contiene el gen quimérico de la nopalina sintasa/neomicina fosfotransferasa II como un marcador seleccionable para células vegetales. Se inserta el gen quimérico, CaMV35S/ßglucoronidasa, obtenido del plásmido pB1221 (Jefferson, R.A., Plant Mol. Bio. Repórter; Vol. 5(4), pág. 387-405; (1987) : incorporado aquí en su totalidad para referencia) en PARC12, resultando en el plásmido pl2GUS-15. El plásmido pD3-8-12 (Altenbach, et al., Plant Mol. Biol . ; Vol. 13; pág. 513-522; (1989), incorporado aquí en su totalidad para referencia) contiene el gen de la BNP en el vector pTZ19U. El plásmido pD3-8-12 es cortado con Hind III y se inserta en el sitio Hind III del plásmido pl2GUS-15. El plásmido resultante pl2GUSBNl7 es aproximadamente de 36 kb en tamaño, contiene una copia del BNP, y confiere resistencia a la ampicilina y tetraciclina a el huésped bacteriano. Para la construcción de un plásmido que contiene cuatro copias del gen de la proteína rica en metionina, se utiliza el plásmido pD3-8-12 como el punto de partida. Se separa el gen de la BNP de pD3-8-12 por digestión con Eco Rl, Hind III, y Xmn l.Los extremos del fragmento se hacen romos con el fragmento Kenow de la ADN polimerasa, y se purifica por gel un fragmento de 3 kb que contiene el gen quimérico. Este fragmento se enlaza al plásmido pD3-8-12 el cuál ha sido digerido con Sma 1 y tratado con fosfatasa intestinal de ternera. El plásmido resultante, denominado pD3-8-12-2X contiene dos copias del gen de la BNP ric en metionina quimérico en un arreglo aleatorio.

Para producir el plásmido que contiene cuatro copias del gen quimérico, se digiere el plásmido pD3-8-12-12x con Eco Rl y Hind III y los extremos se hacen romos con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa. Se aisla un fragmento de 6 kb que contiene dos copias del gen quimérico. Este fragmento se enlaza el plásmido pK3-8-12-2X el cuál ha sido digerido con Sma I y tratada con fosfatasa intestinal de ternera. El plásmido resultante es pD3-8-12-4X. Los genes de la BNP quiméricos son insertados entonces en el vector pARC12 del plásmido Ti. Se separa un fragmento de 12 kb del pD3-8-12-4x por digestión con Eco Rl y Hind III y se enlaza a pARC12 el cual ha sido digerido con Eco Rl y Hind III. El plásmido resultante, pl2-4X, contiene cuatro copias del gen de la BNP entre los bordes del ADNt, así como también un gen quimérico de nopalina sintasa neomicina transferasa por selección en células vegetales. Se transfiere entonces el plásmido de E_;_ Coli a la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens por apareamiento triparental. Se confirman las identidades de las bacterias resultantes por el análisis de Southern Blot.

Preparación de Agrobacterium Tumefaciens LBA4404/pl2GUSBN17 y p!2-4x Se agrupan los cultivos de la noche de la cepa LBA 4404 de Agrobacterium tumefaciens que alojan al plásmido pl2GUSBN17 binario (DP1816, una copia de la secuencia de BNP) o pl2-4X (DP1813, cuatro copias de la secuencia de BNP) , cultivados en una fase log en un medio Minimal A que contiene tetraciclina, 1.0 mg/ml, y se toma una medición de la densidad óptica a 550 nm. Se coloca suficiente volumen del cultivo en tubos para centrífuga cónicos de 15 mi de tal forma que se recolecten después de la sedimentación entre 1.0 y 2.0x1010 células en cada tubo, en donde O.D.550 1.0=1.4x109 células/ml.

Se realiza la sedimentación por centrifugación a 6000 g por 10 minutos. Después de la sedimentación se decanta el sobrenadante y se mantienen los tubos a temperatura ambiente hasta que no se necesite por más de una hora del inoculo. Transformación Se llevan a cabo las inoculaciones en lotes de tal forma que cada placa de semilla es tratada con un granulo nuevamente resuspendido de Agrobacterium. Una vez que los granulos son resuspendidos en 20 mi de un medio de inoculación. El medio de inoculación consiste de sales B5 (G5893), 3.2 gm/L; sacarosa, 2.0% peso/volumen; 6-bencilaminopurina (BAP) , 44 mM; ácido indolbutírico (IBA), 0.5 mM; acetosiringona (AS), 100 mM y se amortigua a un pH de 5.5 con MES, 10 mM. La resuspensión es por rotación rápida. Se vacía el inoculo entonces en la caja Petri que contiene la semilla preparada y se maceran los nodos del cotiledón con una cuchilla quirúrgica. Esto se realiza dividiendo la semilla por la mitad en la sección longitudinal a través del ápice del brote que conserva dos cotiledones enteros. Las dos mitades del ápice del brote son separados entonces en sus cotiledones respectivos alzándolos con una cuchilla quirúrgica. El nodo del cotiledón se macera entonces con la cuchilla quirúrgica por marcado repetido a lo largo del eje de simetría. No se tiene cuidado al cortar totalmente a través del lado exterior de la planta a el lado abaxial. Se preparan veinte plantas cultivadas artificialmente en casi cinco minutos a temperatura ambiente sin agitación. Se preparan placas adicionales durante este período. Después de 30 minutos se transfieren las plantas cultivadas artificialmente a las placas del mismo medio solidificado con Gelrite (Merck & Co., Inc.), 0.2%, peso/volumen. Se embeben las plantas cultivadas artificialmente con el lado adaxial hacia arriba y a el nivel con la superficie del medio y se cultiva a 22°C por tres días bajo iluminación fluorescente blanca fría, aproximadamente 20 mEm2S1. Cultivo y Selección. Después de tres días se llevan las plantas cultivadas artificialmente a el medio de contraselección líquido. El medio de contraselección consiste de sales B5 (G5893) , 3.2 gm/L; sacarosa, 2.0% peso/volumen; BAP, 5.0 mM; IBA 0.5 mM; vancomicina, 200 mg/ml, cefotaxime, 500 mg/ml y se amortiguan a pH de 5.7 con MES, 3 mM. Se lavan diez plantas cultivadas artificialmente en cada caja Petri con agitación giratoria lenta, constante, a temperatura ambiente por cuatro días. Se reemplaza el medio de contraselección cuatro veces. Se llevan las plantas cultivadas artificialmente a un medio de selección solidificado de agarosa. El medio de selección consiste de sales B5 (G5893), 3.2 gm/L, sacarosa, 2.0%, peso/volumen; BAP, 5.0 mM; IBA, 0.5 mM; sulfato de kanamicina, 50 mg/ml; vancomicina, 100 mg/ml; cefotaxime, 30 mg/ml; timentina, 30 mg/ml y se amortigua a pH de 5.7 con MES, 3.0 mM. Se solidifica el medio de selección con agarosa SeaKem, 0.3 peso/volumen. Las plantas cultivadas artificialmente son embebidas en el medio, con el lado adaxial hacia abajo y se cultivan a 28°C con una duración de día de 16 horas e iluminación fluorescente blanca fría de 60-80 mEm2S1. Después de dos semanas se lavan otra vez las plantas cultivadas artificialmente con un medio líquido sobre el agitador giratorio. En este momento el lavado se lleva a cabo durante la noche en el medio de contraselección que contiene sulfato de kanamicina, 50 mg/ml. Al día siguiente las plantas cultivadas artificialmente son llevadas a el medio de selección solidificado de agarosa. Otra vez se embeben en el medio líquido, lado adaxial hacia abajo, se cultiva como se cultiva anteriormente por otro período de dos semanas. Regeneración Después de un mes el tejido transformado sobre los medios selectivos llega a ser visible como sectores de tejido de regeneración contra un origen de tejido blanco, menos saludable. Se eliminan las plantas cultivadas artificialmente sin sectores verdes, se transfieren las plantas cultivadas artificialmente con sectores verdes a el medio de prolongación. El medio de prolongación consiste de sales B5 (G5893), 3.2 gm/L; sacarosa, 2.0% peso/volumen; IBA, 3.3 mM; ácido giberélico, 1.7 mM; vancomicina, 100 mg/ml; cefotaxina, 30 mg/ml; y timentina, 30 mg/ml, se amortigua a pH de 5.7 con MES, 3.0 mM. Se solidifica el medio de prolongación con gelrite, 0.2% peso/volumen. Son embebidas con el lado adaxial hacia arriba y se cultivan como antes. Se continúa el cultivo sobre este medio con transferencia a placas frescas cada dos semanas. Cuando los brotes llegan a ser de 0.5 cm en longitud son separados en la base y colocados en un medio de formación de raíz en tubos de prueba de 13x100 mm. El medio para la formación de raíz consiste de sales B5 (G5893) , 3.2 gm/L; sacarosa, 15 gm/L; ácido nicotínico , 20 mM; ácido piroglutámico (PGA) , 900 mg/L y IBA, 10 mM. Se amortigua a un pH de 5.7 con MES, 3.0 mM y solidificado con Gelrite, 0.2% peso/volumen. Después de diez días se transfieren los brotes a el mismo medio sin IBA o PGA. Los brotes se hacen raices y se mantienen en estos tubos bajo las mismas condiciones ambientales como anteriormente. Cuando el sistema de raíz está bien establecido la forma de planta se transfiere a una mezcla de tierra estéril en cons de plantas (ICN Biomedicals, Inc., No. Cat. 26-720 & 1-02). La temperatura, el fotoperíodo y la intensidad de iluminación permanecen igual como anteriormente. Bajo estas condiciones los regenerantes llegan a ser plantas vigorosas, en su mayoría normales (aunque pequeñas) . Cuando sus sistemas de raíz llegan a ser bien establecidas una esquina del con de la planta se separa y las plantas son cultivadas en una cámara ambiental o invernadero. Finalmente son plantadas en una mezcla de tierra y crecen hasta madurar, teniendo semillas, en un invernadero. Crecimiento, Incremento y Cosecha de los frijoles de soya transgénicos Se plantaron la semilla de las plantas no transformadas y transformadas de la misma variedad (9341) en el verano de 1992 y se cosecharon en el otoño de 1992 en Iowa. Cada línea individual se mantiene separada mientras crece en una o más líneas de 10.5 pies (3.2 m) para crecimiento máximo. Las líneas de los eventos de transformación en las que se inserta un gen de la BNP son referidas como BNP1X. Las líneas en las cuales se insertan cuatro copias son designadas BNP4X.

La mayoría de semillas cosechadas BNP4X en el otoño de 1992 son incrementadas en Puerto Rico. Se plantó esta semilla por línea en Diciembre, de 1992 y se cosecharon por línea en Marzo, de 1993. Parte de las semillas incrementadas, cosechadas son regresadas para prueba de rendimiento y pruebas de laboratorio adicionales. El resto se replanta en serie en Marzo, de 1993 y se cosecharon en línea en Junio, de 1993 en Puerto Rico. El ciclo entero secundario se incrementa aproximadamente 2 acres, o un poco más de 0.1 A por línea. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de experiencia de aquellos expertos en la técnica a el cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan aquí para referencia en el mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera especifica e individualmente indicada para ser incorporada para referencia. Las variaciones sobre las modalidades anteriores están dentro de la habilidad de una persona con experiencia ordinaria en la técnica, y tales variaciones no se alejan del alcance de la presente invención como se describe en las siguientes reivindicaciones.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para incrementar el nivel de un aminoácido objetivo en la semilla de una planta caracterizado porque comprende: a) manipular la trayectoria metabólica del aminoácido para proporcionar una fuente adicional del aminoácido objetivo; y b) producir concomitantemente una reserva complementario sobre expresando un gen preseleccionado que codifica para la proteína que contiene el aminoácido objetivo, de tal forma que hay una acumulación del aminoácido objetivo, enlazado a la proteína.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el aminoácido objetivo es seleccionado del grupo que consiste de lisina, metionina, y treonina.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado porque la trayectoria metabólica es manipulada por sobre expresión de enzimas clave, baja expresión de enzimas clave, generación de puntos de ramificación metabólicos o alteración de las propiedades bioquímicas de la enzima.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado porque la semilla es seleccionada del grupo que consiste de frijoles de soya, cañóla, maíz, girasol, trigo, cebada, avena, mijo, arroz, sorgo y centeno.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4 caracterizado porque la trayectoria metabólica es manipulada por sobre expresión de enzimas clave, baja expresión de enzimas clave o alteración de las propiedades bioquímicas de la enzima.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5 caracterizado porque la semilla es seleccionada del grupo que consiste de frijoles de soya, cañóla, maíz, sorgo y girasol.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6 caracterizado porque la semilla es seleccionada del grupo que consiste de frijoles de soya, maíz y cañóla.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7 caracterizado porque la semilla es seleccionada del grupo que consiste de la semilla de frijol de soya.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 7 caracterizado porque la trayectoria metabólica es manipulada por alteración de las propiedades bioquímicas de la enzima.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 6 caracterizado porque se incrementa el nivel de la metionina en la semilla por: a) Sobre expresar un gen que codifica para la proteína del coquito de Brasil; y b) Sobre expresar una enzima clave, baja expresión de una enzima clave o alteración de las propiedades bioquímicas de la enzima.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10 caracterizado porque se incrementa el nivel de la metionina en la semilla por alteración de las propiedades bioquímicas de la enzima.
12. 12. Una semilla de planta que es modificada genéticamente para expresar niveles incrementados de un aminoácido objetivo, con relación a un tipo silvestre de las especies de la semilla, la modificación que se caracteriza porque comprende: a) manipular la trayectoria metabólica del aminoácido para proporcionar una fuente incrementada del aminoácido objetivo; y b) producir concomitantemente una reserva complementario sobre expresando un gen preseleccionado que codifica para la proteína que contiene el aminoácido objetivo, de tal forma que hay una acumulación del aminoácido objetivo, enlazado a la proteína.
13. 13. La semilla de conformidad con la reivindicación 12 caracterizada porque el aminoácido objetivo es seleccionado del grupo que consiste de lisina, metionina, y treonina.
14. 14. La semilla de conformidad con la reivindicación 13 caracterizada porque la trayectoria metabólica es manipulada por sobre expresión de enzimas clave, baja expresión de enzimas clave, generación de puntos de ramificación metabólicos o alteración de las propiedades bioquímicas de la enzima.
15. 15. La semilla de conformidad con la reivindicación 14 caracterizada porque la semilla es seleccionada del grupo que consiste de frijoles de soya, cañóla, maíz, girasol, trigo, cebada, avena, mijo, arroz, sorgo y centeno.
16. 16. La semilla de conformidad con la reivindicación 15 caracterizada porque la semilla es seleccionada del grupo que consiste de frijoles de soya, cañóla, maíz, sorgo y girasol.
17. 17. La semilla de conformidad con la reivindicación 16 caracterizada porque la semilla es seleccionada del grupo que consiste de frijoles de soya, maíz y cañóla.
18. 18. La semilla de conformidad con la reivindicación 17 caracterizada porque la semilla es frijol de soya.
19. 19. La semilla de conformidad con la reivindicación 18 caracterizada porque se incrementa el nivel de la metionina en la semilla por: a) Sobre expresar un gen que codifica para la proteína del coquito de Brasil; y b) Sobre expresión de enzimas clave, baja expresión de enzimas clave o alteración de las propiedades bioquímicas de la enzima.
20. 20. La semilla de conformidad con la reivindicación 19 caracterizada porque la trayectoria metabólica es manipulada por alteración de las propiedades bioquímicas de la enzima.