MXPA97009270A - Homologo de enzima de conversion de interleucina-1 humana - Google Patents

Abstract

La presente invención provee secuencias de nucleótido y de aminoácido que identifican y codifican un nuevo homólogo de enzima de conversión de interleucina-1 humana (ICEY). La invención también provee moléculas antisentido a las secuencias de nucleótido, las cuales codifican a ICEY, vectores de expresión para la producción de ICEY purificada, anticuerpos capaces de unirse específicamente a ICEY, sondas de hibridación u oligonucleótidos para la detección de secuencias de nucleótido que codifican a ICEY, células huésped genéticamente diseñadas por ingeniería para la expresión de ICEY, pruebas de diagnóstico para la activación de monocito/macrógrafos a base de moléculas deácido nucleico que codifican ICEY, y el uso de proteína para producir anticuerpos capaces de unirse específicamente a la proteína y el uso de la proteína para clasificar los inhibidores.

Description

HOMOLOGO DE ENZIMA DE CONVERSIÓN DE INTERLEUCINA-1 HUMANA CAMPO TÉCNICO La presente invención está en el campo de la biología molecular; más particularmente, la presente invención describe las secuencias de ácido nucleico y de aminoácido de una enzima de conversión de interleucina- 1 novedoso derivado de células THP-1 activadas.

SOLICITUDES RELACIONADAS Y COPENDIENTES Esta solicitud es una continuación en parte de la Serie No. 08/443,865 de E. U .A . , presentada el 31 de Mayo de 1995, la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Para entender la enzima de conversión de interleucina- 1 (ICE), es de gran ayuda examinar primero el papel de la interleucina- 1 (I L-1 ), su substrato enzimático. I L- 1 facilita la inmunidad natural huésped, predominantemente aquellos aspectos relacionados con la iniciación de reacciones inflamatorias que protegen al cuerpo contra infección bacteriana. (Ayala y otros , (1994) , J . Immunol . 53: 2592- 2599). A concentraciones bajas en la corriente sanguínea, la IL-1 media la inflamación local induciendo la síntesis de otras citoquinas, tales como IL-6 y IL-8, y la síntesis de proteínas que median la adhesión de leucocito, y producción de prostaglandina. (Abbas y otros (1994) Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Company). A concentraciones intermediarias, IL-1 entra a la corriente sanguínea y puede inducir fiebre, la síntesis de proteínas de plasma aguda por el hígado, y desecho metabólico (caquexia) (Abbas, supra). A concentraciones aún más altas, IL-1 ha sido implicada en la destrucción de tejido observada en numerosas enfermedades relacionadas con la inflamación, incluyendo artritis reumatoide, choque séptico enfermedad inflamatoria del intestino y diabetes mellitus dependiente de insulina. (Li y otros (1995) Cell 80: 401-411). La actividad de IL-1 resulta de la expresión y liberación de dos productos de gen, IL-1a e IL-1ß, predominantemente de monocitos activados. (Howard y otros (1991) J. Immunology 147:2964-2969). Ambos productos de gen son inicialmente sintetizados como precursores inactivos de aproximadamente 31 kDa en monocitos. Pre- IL-1ß se divide a una forma activa de 17 kDa a través de la enzima de conversión IL-1ß (ICE) antes de liberarse de los monocitos activados. Pre- IL-1a probablemente se divide a una forma activa de 17kDa a través de una enzima de conversión de IL-1a similar a calpaína antes de la liberación. (Carruth y otros (1991) J. Biol. Chem. 266:12162-12167). Además, ICE ha sido implicada en la liberación de IL-1a de los monocitos activados pero el mecanismo no es entendido (Li , supra). El producto de gen IL-1 ß es la forma predominante de IL-1 que está presente a altas concentraciones en la corriente sanguínea durante enfermedades inflamatorias, tales como artritis reumatoide, choque séptico, enfermedad inflamatoria del intestino, y diabetes mellitus dependiente de insulina (Li, supra). Ya que la escisión de pre- I L- 1 ß a través de ICE se acopla a la liberación de IL-1 ß y a la actividad de IL-1 incrementada en la corriente sanguínea, la actividad de la ICE puede ser más alta en estas condiciones patológicas. La importancia de regular la actividad de ICE para modular la concentración de I L-1 ß para efectuar la respuesta inmune huésped ha sido confirmada recientemente. El producto de gen crmk del virus de viruela evita la activación proteolítica de I L- 1 ß e inhibe la respuesta inflamatoria huésped. El virus de la viruela que contiene el gen crmk es incapaz de suprimir la respuesta inflamatoria, dando como resultado una reducción de células infectadas por el virus y menos daño al huésped. (Miura y otros, (1993) Cell 75: 653.-660). ICE es una proteasa de cisteína novedosa que es conocida porque específicamente separa al precursor IL- 1 ß inactivo a su forma activa. (Ayala, supra). Esta proteasa reconoce la presencia de Asp-X, en donde x es preferiblemente un residuo de aminoácido hidrofóbico pequeño, y separa la unión entre Asp y X. Sin embargo , muchos de los enlaces Asp-X no son reconocidos por ICE sugiriendo que frecuencias de flanqueo u otros criterios, tales como accesibilidad, son también requeridas para el reconocimiento y escisión. En el caso de IL-1 ß , la ICE separa el precursor para formar I L-1 ß activa en dos enlaces de secuencia específica, el enlace entre los residuos Asp-27 y Gly-28 y el enlace entre los residuos Asp-1 16 y Ala-1 17. La misma ICE es sintetizada y mantenida en las células como un precursor de 45 kDa inactivo, el cual es procesado a la ICE activa consistiendo de 20- y 10-kDa subunidades, p20 y p10. (Ayala , supra) . Ambas unidades se derivan del precursor de 45 kDa, el cual se separa en cuatro diferentes fragmentos, un dominio precursor de 13 kDa, la subunidad p20, un separador de 2 kDa , y la subunidad p 10. Ya que todos estos fragmentos de polipéptido son flanqueados por los residuos Asp-X en el precursor de 45 kDa intacto , es posible que el precursor de ICE sea activado autocatalíticamente. (Ayala, supra). La estructura tridimensional de ICE ha sido determinada a partir de estudios cristalográficos. (Walker y otros, (1994) Cell 78: 343-352). En primer lugar, es evidente que la forma activa de ICE es un homodímero de dominios catalíticos, cada uno de los cuales consiste de las subunidades p20 y p10. En segundo lugar, aunque el residuo de cisteína de sitio activo está ubicado en p20, tanto p20 como p10 con esenciales para la actividad. Las estructuras de las subunidades p20 y p10 están entrelazadas con el fin de crear un único núcleo de lámina beta de 6 cadenas flanqueado en ambos lados por hélices alfa. Las primeras 4 cadenas beta están contribuidas por p20, mientras que las 2 cadenas beta restantes están contribuidas por p10. Los genes de la ICE de varias formas han sido secuenciados y poseen una homología total de aminoácido de 29% al producto ced-3 del gen Caenorhabditis elegans, un gen con un posible papel en la apoptosis (Yuan y otros (1993) Cell 75:641 -652). Además, el gen de la ICE contiene una región de secuencia, que codifica residuos 166 a 287, que comparte una homología de 43% con ced-3. No se sabe si ced-3 actúa como una proteasa de cisteína , pero contiene los residuos catalíticos supuestos que están ubicados en el sitio activo de ICE (Cys285 y His237) . El pentapéptido de aminoácido, Glu-Ala-Cys-Arg-Gly (QACRG) , que contiene la cisteína de sitio activo, es el péptido más largo conservado entre ICE, de ratones y seres humanos, y CDE-3, de tres diferentes nemátodos. Además, ced-3 contiene los mismos cuatro residuos cuyas cadenas laterales son implicadas en la unión del grupo aspartato-carboxilato del substrato en el sitio catalítico (Arg-179, Gln-283, Ser 347 y Arg-341 ) (Yuang, supra). Los inhibidores con crnA inhibidor de ICE específica bloquea apoptosis inducida por TN F y FAS . Por lo tanto, la ICE o un homólogo se cree que está implicado en la apoptosis inducida por TN F y FAS. Además, la ICE posee un grado de homología al gen de mamífero Nedd-2/lch- 1 , un producto de gen con un posible papel en la embriogénesis, que es expresado durante el desarrollo de cerebro embriónico y es regulado en el cerebro de adulto. (Yuan, supra). Nedd-2, ced-3 y los productos de gen de la ICE son aproximadamente 27% homólogos. El término carboxi de CED- y p10 posee el grado más alto de homología para Nedd-2. El producto de gen Need-2 no contiene la cisteína altamente conservada ni el pentapéptido QACRG altamente conservado encontrado en la ICE y es probablemente no una proteasa de cisteína . Para confirmar el papel de la ICE en enfermedades relacionadas con la inflamación controlando los niveles de IL- 1 ß activa, Li, supra, creó ratones de choque deficientes en ICE. Estos ratones genéticamente diseñados por ingeniería fueron fisiológicamente normales pero carecieron de la habilidad de procesar al percusor IL-1 ß a su forma activa cuando los monocitos fueron activados con productos microbianos, tales como lipopolisacárídos (LPS). Además, la producción de IL- 1 a se redujo, y el nivel de otras citoquinas, factor de necrosis tumoral (TN F) y I L-6, implicadas en respuestas inflamatorias a productos microbianos fue un poco reducida. Estos ratones fueron resistentes a los efectos letales de choque séptico, cuando se expusieron a LPS (Li, supra) . Por lo tanto, la inhibición de la actividad de la ICE para reducir la concentración de I L- 1 ß en la corriente sanguínea puede ser un método para tratar enfermedades relacionadas con la inflamación. La ICE puede ser utilizada para ayudas a identificar pacientes quienes son susceptibles a estas enfermedades. Ya que la ICE comparte la homología de secuencia a ced-3 y la sobreexpresión de la ICE parece inducir apoptosis, los estudios de ratones deficientes de ICE fueron importantes, ya que los ratones parecieron normales en términos de su desarrollo. Si la ICE jugara un fuerte papel en la apoptosis durante el desarrollo, los ratones deficientes de ICE podrían haber tenido anormalidades superiores en el cerebro, intestinos, tejidos linfoides y de cerebro (Li , supra). Sin embargo, la ICE puede realizar funciones diferentes a la escisión del precursor de IL-1 ß . El ARNm de ICE ha sido detectado en una variedad mayor de tejidos que el ARN m de IL-1 ß (Miura , supra). La ICE ha atraído interés como un objetivo para fármacos novedosos anti-inflamatorios, ya que la citoquina, la cual activa, IL-1 ß , es pro-inflamatoria y ha sido implicada en la patofisiología de varias enfermedades , incluyendo artritis reumatoide, choque séptico, enfermedad inflamatoria del intestino y diabetes mellitus dependiente de insulina (Dinarello y Wolf (1993) N Engl J . Med. 328: 106-13) . La provisión de un nuevo gen de ICE y polipéptido además será una búsqueda de fármaco para clasificar y diseñar inhibidores más efectivos y más específicos a esta substancia pro-inflamatoria. NO sorprendentemente, este homólogo de ICE se encontró en una colección de células monocíticas activadas, principalmente, células THP- 1 tratadas con forbol y endotoxina .

Células THP-1 THP- 1 es una línea de célula leucémica humana con características monocíticas distintas, derivada de la sangre de un niño de un año de edad con leucemia monocítica aguda (Tsuchiya S. y otros (1980) Int. J . Cáncer 26: 171 -176). La naturaleza monocítica de TH P- 1 fue establecida utilizando los siguientes criterios citológicos y citoquímicos: 1 ) una actividad de esterasa de butirato de a-naftilo, la cual podría ser inhibida por NaF (fluoruro de sodio) , 2) producción de lisozima, 3) fagocitosis (la absorción de materiales extracelulares) de partículas de látex y células de sangre pura de oveja sensibilizada, y 4) habilidad de las células THP-1 tratadas con mitomicina C para activar loa linfocitos T después de un tratamiento con concanavalina A. Morfológicamente, el citoplasma contuvo pequeños granulos azurofílicos, el núcleo estaba indentado con forma irregular con dobleces profundos, y la membrana de la célula tuvo receptores Fc y C3b, los cuales probablemente funcionan en la fagocitosis. Los monocitos se desarrollan de monoblastos a través de promocitos en la médula espinal y en su forma madura tienen una vida media de aproximadamente 3 días. Aproximadamente un 75% del depósito de monocito en circulación se encontró a lo largo de las paredes de los vasos sanguíneos, aunque estás células aleatoriamente emigraron hacia tejidos antígenos presentes o fagocíticos. Los monocitos de antígeno presente incluyen células reticulares de interdigitalización y dendríticas foliculares de los nodos de linfa y piel. Los monocitos fagocíticos son prominentes como las células Kupffer del hígado y en los alvéolos y médula espinal. Ya que los monocitos precursores son ricos en granulos citoplásmicos que contienen peroxidasa, azurofílicos, los macrófagos tienen numerosos receptores de superficie de célula mediante los cuales verifican su ambiente. Estos incluyen receptores para inmunoglobulina, complemento, factores de crecimiento, lipoproteínas, péptidos y polisacáridos. La unión de ligandos a estos receptores activa la proliferación del macrófago , quimiotaxis , secreción y fagocitosis . Muchas líneas de célula mieloides y mielomonocíticas humanas retienen algo de habilidad para diferenciarse a fenotipos más maduros en respuesta a varios estímulos internos, incluyendo factores de crecimiento, linfoquinas, citoquinas, derivados de vitamina D, y promotores de tumores y agentes externos tales como trauma, fumar, irradiación de UV, exposición al asbesto, y esteroides. Las células TH P- 1 tratadas con el promotor de tumor acetato de 12-O-tetradecanoil-forbol-13 (TPA) son inducidas a detener la proliferación y diferenciarse a célu las de tipo macrófago , las cuales se asemejan a macrófagos derivados de monocito nativo, tanto morfológica como fisiológicamente. Estas células de tipo monocito/macrófago exhiben cambios en la expresión de gen, tal como la coinducción de C-fos y c-jun y la regulación reducida de c-myb (Auwerx (1991 ) Experientia 47:22-31 ) , incrementan la densidad del receptor C3b de complemento , y reducen tanto la FcR como la molécula de adhesión , CD4. Además, las células TH P- 1 producen lipasa de lipoproteína y polípoproteína E asociada con lesiones ateroscleróticas, secretan varias citoquinas pro-inflamatorias, incluyendo IL- 1 ß y TN F (Cochran FR y Finch-Arietta MB (1989) Agents and Actions 27:271 -273) , y pueden elaborar oxidantes y proteasas de destrucción de tejido potentes, tales como la enzima de conversión de I L- 1 .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención objeto provee una secuencia única de nucleótido, la cual codifica un homólogo de ICE humana novedoso. El nuevo gen , también conocido como ICEY, el cual fue codificado dentro del clon Incyte 14775, codifica al polipéptido ICEY y representa una proteasa de cisteína humana. La invención también comprende pruebas de diagnóstico para la actividad fisiológica o patológica de monocitos o macrófagos activados, las cuales incluyen los pasos de probar una muestra o un extracto de la misma con ADNc que codifica un homólogo de ICE, fragmentos u oligómeros del mismo. Otros aspectos de la invención incluyen el antisentido de icey; vectores de clonación o expresión que contienen icey; células u organismos huéspedes transformados con vectores de expresión que contienen icey; un método para la producción y recuperación de polipéptidos de ICEY purificados de células huéspedes; polipéptido de ICEY purificado; anticuerpos e inhibidores para ICEY, y compuestos farmacológicos que utilizan anticuerpos ICEY.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1 A y 1 B representan la secuencia de nucleótido para el homólogo de ice y la secuencia de aminoácido predicha del homólogo de ICE (SEC ID NO:5 y SEC ID NO:6, respectivamente) . Las Figuras 2A y 2B muestran la alineación del aminoácido del homólogo novedoso de ICE con la ICE humana (Gen Bank locus HSU13697); Número Gl 717040) . La alineaciones mostradas fueron producidas utilizando el programa de alineación de secuencias múltiples del software DNASTAR (DNASTAR I nc. , Madicson Wl) . La Figura 3 presenta un análisis de regiones alfa del homólogo ICE (A), regiones beta (B) , regiones de regreso (T), regiones de bobina (C), gráfica de carácter hidrofílico (H) , regiones alfa amfipáticas (AA) , regiones beta amfipáticas (BA), índice antigénico (Al) y punto de probabilidad de superficie (S) basado en la secuencia de aminoácido predicha y composición . La Figura 4 representa la alineación de las secuencias parciales de ADNc con el gen de icey completo.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Definiciones Como se utiliza en la presente, el término "homólogo de ICE" o "ICEY", se refiere al polipéptido descrito en la SEC I D NO:6, o a un fragmento activo del mismo, el cual es codificado por un ARNm transcrito del ADNc del homólogo de ice de SEC ID NO:5. ICEY puede ser de existencia natural o químicamente sintetizado. Como se utiliza en la presente, la "icey" en letras minúsculas se refiere a una secuencia de ácido nucleico, mientras que una "ICEY" en mayúsculas se refiere a una proteína, péptido o secuencia de aminoácido. Como se utiliza en la presente, el término "activo" se refiere a aquellas formas de ICEY, las cuales retienen las actividades biológicas y/o inmunológicas de ICEY de existencia natural. Como se utiliza en la presente, el término "ICEY de existencia natural" se refiere a ICEY producida por células humanas que no han sido genéticamente diseñadas por ingeniería y específicamente contemplan varias formas de ICEY que surgen de modificaciones post-tranaslacionales del polipéptido, incluyendo, pero no limitándose a, acetilación , carboxilación , glicosilación , fosforilación , lipidación y acilación . Como se utiliza en la presente, el término "derivado" se refiere a polipéptidos derivados de ICEY de existencia natural a través de modificaciones químicas tales como ubiquitinación, marca (v. gr. , con radionúclidos, varias enzimas, etc.), pegilación (derivatización con glicol polietilénico) o mediante la inserción o substitución a través de síntesis química del aminoácido tal como ornitina, la cual normalmente no ocurre en proteínas humanas. Como se utiliza en la presente, el término "variante" o "variante recombinante" o "mutante" se refiere a cualquier polipéptido diferente de una ICEY de existencia natural a través de inserciones de aminoácido, eliminaciones, y substituciones, creado utilizando técnicas de ADN recombinante. La guía para determinar que residuos de aminoácido pueden ser reemplazados, añadidos o eliminados sin abolir las actividades de interés , tal como la actividad enzimática, puede encontrarse comparando la secuencia de la ICEY particular con aquella de moléculas homologas y reduciendo al mínimo el número de cambios de secuencia de aminoácido hechos en regiones de alta homología o regiones de actividad conocida. Preferiblemente, las "substituciones" de aminoácido son el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, en aspartato con glutamato, o una treonina con una serina, es decir, reemplazos de aminoácido conservador. Las "inserciones" o "eliminaciones" están típicamente en la escala de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede ser experimentalmente determinada haciendo sistemáticamente inserciones, eliminaciones o substituciones de aminoácido en ICEY utilizando técnicas de ADN recombinante y analizando las variantes recombinantes resultantes para actividad. Cuando se desee, el ácido nucleico que codifica ICEY o una variante de ICEY puede ser genéticamente diseñado mediante ingeniería para contener una "secuencia de señal o líder" que puede dirigir al polipéptido a través de la membrana de una célula. Como será entendido por aquellos expertos en la técnica , dicha secuencia puede ser de existencia natural en los polipéptidos de la presente invención o provista de fuentes de proteína heteróloga medíante técnicas de ADN recombinante. Como se utiliza en la presente , un "fragmento" de ICEY, "porción", o "segmento" se refiere a una estiramiento de los residuos de aminoácido, el cual tiene una longitud suficiente para exhibir actividad biológica y/o inmunogénica y en modalidades preferidas contendrá por lo menos aproximadamente 5 aminoácidos, por lo menos 7 aminoácidos, por lo menos aproximadamente 8 a 13 aminoácidos, y, en modalidades adicionales, aproximadamente 17 o más aminoácidos. Como se utiliza en la presente, un "oligonucleótido" o "fragmento de polinucleótido, "porción", o "segmento" se refiere a cualquier estiramiento de ácidos nucleicos que codifica ICEY, el cual es de una longitud suficiente para utilizarse como un iniciador en la reacción de cadena de polimerasa (PCR) o varios procedimientos de hibridación conocidos por aquellos expertos en la técnica , para el propósito de identificar o amplificar ácidos nucleicos idénticos o relacionados.

La presente invención incluye polipéptidos de ICEY purificados de fuentes naturales o recombinantes, vectores y células huésped transformadas con moléculas de ácido nucleico recombinante que codifica ICEY. Varios métodos para el aislamiento de los polipéptidos de ICEY pueden ser logrados mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, dichos polipéptidos pueden ser purificados mediante cromatografía de inmunoafinidad empleando los anticuerpos provistos por la presente invención. Varios otros métodos de purificación de proteína bien conocidos en la técnica incluyen aquellos descritos en Deutscher M (1990) Methods in Enzymology, Vol . 182, Academic Press, San Diego; y Scopes R (1982) Protein Purification: Principies and Practice . Spring-Verlag , Nueva York, ambos incorporados aquí por referencia. Como se utiliza en la presente, el término "recombinante" se refiere a un polinucleótido, el cual codifica ICEY y se preparara utilizando técnicas de ADN recombinante. El polinucleótido que codifica ICEY también puede incluir variantes alélicas o recombinantes y mutantes de las mismas. Como se utiliza en la presente, el término "sonda" o "sonda de ácido nucleico" o "sonda de oligonucléotido" se refiere a una porción , fragmento, o segmento de icey que sea capaz de ser hibridizado a una secuencia de nucleótido objetivo deseada. U na sonda puede ser utilizada para detectar, amplificar o cuantificar ADNcs o ácido nucleico endógeno que codifica ICEY empleando técnicas convencionales en biología molecular. Una sonda puede ser de longitud variable, preferiblemente de alrededor de 10 nucleótidos hasta varios cientos de nucleótidos. Como será entendido por aquellos expertos en la técnica, las condiciones de hibridación y diseño de sonda variarán dependiendo del uso pretendido. Por ejemplo, una sonda pretendida para usarse en PCR generalmente será de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos de longitud , y puede incluir hasta 60 nucleótidos, y puede ser parte de un depósito de sondas de degeneración , es decir, oligonucleótidos que toleran el desajuste de nucleótido pero adapta la unión a una secuencia desconocida; mientras que una sonda para utilizarse en hibridaciones Southern o Northern puede ser una secuencia de nucleótido específica, individual , que es varios cientos de nucleótidos de longitud . Por consiguiente, una sonda preferida para la detección específica de icey comprenderá un fragmento de polinucleótido u oligonucleótido de una región de nucleótido no conservada de SEC I D NO:5. Como se utiliza en la presente, el término "región de nucleótido no conservada" se refiere a una región de nucleótido que es única a SEC I D NO: 5, y no comprende una región que sea conservada en la familia de genes de ICE. Las sondas puede ser de cadena individual o de cadena doble y puede tener un carácter específico en hibridaciones a base de solución, célula, tejido o membrana, incluyendo in situ tecnologías de tipo ELISA . La presente invención abarca oligonucleótidos, fragmentos o porciones de los polinucleótidos descritos en la presente, o sus cadenas complementarias utilizadas como sondas. Las sondas de ácido nucleico pueden comprender porciones de la secuencia que tiene menos nucleótidos que aproximadamente 6 kd y usualmente menores que aproximadamente 1 kb . Las sondas de oligonucleótidos y de ácido nucleico de la presente invención pueden ser utilizadas para determinar si el ácido nucleico que codifica ICEY, está presente en una célula o tejido o para aislar secuencias de ácido nucleico idénticas o similares de A DN cromosomal , como se describe por Walsh PS y otros (1992 PCR Methods Appl 1 :241 -250) Las sondas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser derivadas de ácidos nucleicos de existencia natural o de cadena individual o doble recombinante o ser químicamente sintetizadas . Pueden ser marcadas a través de translación de ranura, reacción de relleno Klenow, PCR u otros métodos bien conocidos en la técnica . Las sondas de la presente invención, su preparación y/o marcación se elaboran en Sambrook J . y otros (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; o Ausubel FM y otros (1989) Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYC, ambos incorporados aquí por referencia. Alternativamente, las variantes recombinantes que codifican los polipéptidos de la presente invención o polipéptidos relacionados pueden ser sintetizadas o identificadas a través de técnicas de hibridación conocidas por aquellos expertos en la técnica haciendo uso de la "redundancia" en el código genético. Varias substituciones de codon, tales como los cambios silenciosos que producen varios sitios de restricciones, pueden ser introducidas para optimizar la clonación a un plásmido o vector viral o expresión, en un sistema procariótico o eucariótico particular. También se pueden introducir mutaciones para modificar las propiedades del polipéptido, para cambiar las afinidades de unión de ligando, afinidades de intercadena, degradación de polipéptido o rapidez de renovación . Un ejemplo implica insertar un codon de tope a la secuencia de nucleótido para limitar el tamaño de ICEY con el fin de proveer una unión, un ligando no activado de masa molecular más pequeña, la cual podría servir para bloquear la actividad de la ICEY natural. "Monocitos activados", como se utiliza en la presente, se refiere a los monocitos o macrófagos activados, maduros, encontrados en tejidos inmunológicamente activos. "Trastornos de monocito/macrófago" incluyen , pero no se limitan a, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, artritis reumatoide y sepsis. "Animal" , como se utiliza en la presente, puede ser definido para incluir seres humanos, animales domésticos o agrícolas (gatos, perros, vacas, ovejas, etc.) o especies de prueba (ratón, rata , conejo, etc.) . La presente invención incluye polipéptidos ICEY purificados de fuentes naturales o recombinantes, células transformadas con moléculas de ácido nucleico recombinante que codifica ICEY. Varios métodos para el aislamiento de los polipéptidos de ICEY pueden lograrse a través de procedimientos bien conocidos en la técnica .

Por ejemplo, dichos polipéptidos pueden ser purificados a través de cromatografía de inmunoafinidad empleando los anticuerpos provistos por la presente invención. Varios otros métodos de purificación de proteína, bien conocidos en la técnica, incluyen aquellos descritos en Deutscher M (1990) Methods in Enzymology, Vol. 182, Academic Press, San Diego, CA; y Scopes R (1982) Protein Purifaction: Principies and Practice, Springer-Verlag, Nueva York, ambos incorporados aquí por referencia. "Inhibidores de ICE", o moléculas de tipo ICE que unen I L- 1 , pero no la activan , pueden ser sintetizados recombinantemente substituyendo la cisteína por otros aminoácidos naturales (tales como alanina) o sintéticos en el sitio de pentapéptido activo. Alternativamente, la cisteína puede ser químicamente modificada mediante métodos de rutina en la técnica, con el fin de inhibir la activación. Los homólogos de ICE, con un carácter específico modificado, pueden ser fácilmente sintetizados substituyendo los residuos sin cisteína del pentapéptido conservado, GLU ALA CYS ARG GLY. La preparación de dichos mutantes recombinantes es bien conocida en la técnica. La substitución de los cuatro aminoácidos sin cisteína del pentapéptido con otros aminoácidos naturales o sintéticos puede ser fácilmente realizada por aquellos expertos en la técnica. La actividad de os mutantes de ICE puede ser probada a través de métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. La presente invención provee una secuencia de nucleótido encontrada dentro del clon I ncyte 14775 únicamente identificando un homólogo de ICE humana, nueva (ICEY) de la familia de proteasa de cisteína, la cual inicialmente se encontró expresada en células TH P-1 tratadas con éster de forbol. Ya que ICEY es expresado en monocitos, los ácidos nucleicos (icey) , polipéptidos (ICEY) y anticuerpos para ICEY, son útiles en ensayos de diagnóstico con base en la identificación de ICEY asociada con procedimientos inflamatorios o de enfermedad inflamatoria. También se encontró que ICEY se expresó en colecciones de ADNc hechas de macrófagos; tumor de ovario; colon; placenta fetal; pecho; tumor de próstata; sinovio de una rodilla reumatoide, una rodilla osteoartrítica y una muñeca reumatoide; linfocitos; linfocitos de una reacción de linfocito mezclado de 24 horas; bazo; columna vertebral ; cervix; pulmón; granulocitos de sangre periférica tratados con fM LP; ganglioneuroma; hígado/bazo fetal; placenta neonatal; y eosinofil is de un individuo que tenga hiper eosinofilia. La expresión excesiva de ICEY puede conducir a daño de tejido o destrucción. Por lo tanto, una prueba de diagnóstico para ICEY puede acelerar la diagnosis y el tratamiento apropiado de numerosos trastornos inflamatorios incluyendo trastornos de monocito activado , tales como enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, artritis reumatoide, choque séptico y problemas patológicos similares. Las secuencias de nucleótido que codifican ICEY (o su complemento) tienen numerosas aplicaciones en técnicas conocidas por aquellos experto en el campo de la biología molecular. Estas técnicas incluyen el uso como sondas de hibridación, el uso en la construcción de oligómeros para PCR, el uso para mapeo de cromosoma y gen, el uso en producción recombinante de ICEY, y el uso en la generación de ADN o ARN anti-sentido, sus análogos químicos y similares. Los usos de nucleótidos que codifican I CEY descritos en la presente, son ilustrativos de técnicas conocidas y no se pretende limitar su uso a ninguna técnica conocida a algún experto ordinario en el campo. Además, las secuencias de nucleótido descritas aquí, pueden ser utilizadas en técnicas de biología molecular que aún no han sido desarrolladas, siempre que las nuevas técnicas se basen en propiedades de secuencias de nucleótido que sean actualmente conocidas, v. gr. , el código genético de triplete y las interacciones de pares de base específicas. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que como resultado de la degeneración del código genético, una multitud de secuencias de nucleótido que codifica ICEY, algunas llevando homología mínima a la secuencia de nucleótido de cualquier gen conocido y de existencia natural, puede ser producida. La invención ha contemplado específicamente cada una de las posibles variaciones déla secuencia de nucleótido que se pueden hacer seleccionando combinaciones con base en posibles elecciones de codon . Estas combinaciones se hacen de acuerdo con el código genético de triplete normal como se aplica a la secuencia de nucleótido de icey de existencia natural , y se considera que todas estas variaciones están específicamente descritas. Aunque las secuencias de nucleótido, las cuales codifican ICEY y/o sus variantes, son preferiblemente capaces de la hibridación a la secuencia de nucleótido de icey de existencia natural bajo condiciones severas, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótido que codifican ICEY o sus derivados poseyendo un uso de codon substancialmente diferente. Los codones pueden ser seleccionados para incrementar el régimen al cual ocurre la expresión del péptido en una expresión procariótica o eucariótica particular huésped de acuerdo con la frecuencia con la cual los codones son utilizados por el huésped . Otras razones para alterar substancialmente la secuencia de nucleótido que codifica ICEY y/o sus derivados sin alterar la secuencia de aminoácido codificada incluyen la producción de transcriptores de ARN que tengan propiedades más deseables, tales como una vida media mayor, que los transcriptores producidos de la secuencia de existencia natural . Las secuencias de nucleótido que codifican ICEY pueden unirse a otras secuencias de nucleótido a través de técnicas de ADN recombinante bien establecidas (cf. Sambrook J . y otros, supra) . Las secuencias de nucleótido para unión a icey incluyen una clasificación de vectores de clonación, v. gr. , plásmidos, cósmidos , derivados de fago lambda, fagémidos, y similares, que son bien conocidos en la técnica. Los vectores de interés incluyen vectores de expresión , vectores de replicación , vectores de generación de sonda, vectores de secuenciación, y similares. En general, los vectores de interés pueden contener un origen funcional de replicación en por lo menos un organismo, sitios sensibles de endonucleasa de restricción , y marcadores seleccionables para la célula huésped. Otro aspecto de la presente invención es proveer sondas de hibridación de ácido nucleico específico para icey capaces de la hibridación con secuencias de nucleótido de existencia natural que codifican ICEY. Dichas sondas también pueden ser utilizadas para la detección de secuencias que codifican ICEY similares y de preferencia deben contener por lo menos un 50% de los nucleótidos de la región conservada o sitio activo. Las sondas de hibridación de la presente invención pueden derivarse de las secuencias de nucleótido de las Figuras 1 A y 1 B o de secuencias genómicas incluyendo promotores, elementos mejoradores y/o posibles introns de las iceys de existencia natural respectivas. Las sondas de hibridación pueden ser marcadas a través de una variedad de grupos reportadores, incluyendo radionúclidos tales como 3 P o 35S , o marcas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda vía sistemas de acoplamiento de avidina/biotina, y similares. La PCR como se describe en las patentes de E. U .A. Nos . 4,683, 195 ; 4,800, 195; y 4,965 , 188 provee usos adicionales para los oligonucleótidos con base en la secuencia de nucleótido que codifica ICEY. Dichas sondas utilizadas en la PCR pueden ser de origen recombinante, pueden ser químicamente sintetizadas , o una mezcla de ambos, y comprenden una secuencia de nucleótido discreta para uso de diagnóstico o un depósito de degeneración de posibles secuencias para la identificación de secuencias genómicas estrechamente relacionadas. Otros medios para producir sondas de hibridación específicas para ADNs de icey incluyen la clonación de secuencias de ácido nucleico que codifica ICEY o derivados de ICEY a vectores para la producción de sondas de ARNm. Dichos vectores son conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles y pueden ser utilizados para sintetizar sondas ARN in vitro a través de la adición de la polimerasa de ARN apropiada como polimerasa de ARN de T7 o SP6 y los nucleótidos marcados radioactivamente apropiados. Ahora es posible producir una secuencia de ADN , o porciones de la misma , que codifica ICEY y sus derivados completamente mediante química sintética, después de lo cual el gen puede ser insertado a cualquiera de muchos los vectores de ADN disponibles utilizando reactivos, vectores y células que son conocidos en la técnica en el momento de la presentación de esta solicitud. Además, se puede utilizar la química sintética para introducir mutaciones en las secuencias icey o cualquier porción de las mismas. La secuencia de nucleótido del ácido nucleico que codifica ICEY puede ser confirmada a través de técnicas de secuenciación de ADN . En la técnica son bien conocidos los métodos para secuenciar ADN . Los método enzimáticos convencionales emplearon un fragmento de Klenow de polimerasa de ADN, SEQUENASE® (US Biochemical Corp. , Cleveland, OH) o polimerasa Taq para extender las cadenas de ADN del iniciador de oligonucleótido fortalecido a la plantilla de ADN de interés. Se han desarrollado métodos para el uso de plantillas de cadena tanto individual como doble. Los productos de reacción de terminación de cadena fueron electroforeados sobre geles de urea-acrilamida y detectados ya sea mediante autoradiografía (para precursores marcados con radionúclido) o mediante fluorescencia (para precursores marcados con fluorescente). Las recientes mejoras en la preparación de reacción mecanizada, la secuenciación y el análisis utilizando el método de detección fluorescente han permitido la expansión en el número de secuencias que pueden ser determinadas por día (utilizando máquinas tales como el Catalizador 800 y el secuenciador de ADN Applied Biosystems 377 o 373) . La secuencia de nucleótido puede ser utilizada en un ensayo para detectar la inflamación o enfermedad asociada con niveles anormales de expresión de ICEY. La secuencia de nucleótido puede ser marcada a través de métodos conocidos en la técnica y añadirse a un fluido o una muestra de tejido de un paciente bajo condiciones de hibridación. Después de un período de incubación, la muestra es lavada con un fluido compatible, el cual opcionalmente contiene un colorante (u otra marca que requiere de un revelador) si el nucleótido ha sido marcado con una enzima. Después de que el fluido compatible es enjuagado, el colorante es cuantificado y comparado con un normal. Si la cantidad de colorante es significativamente elevada , la secuencia de nucleótido se ha hibridizado con la muestra, y el ensayo indica la presencia de inflamación y/o la enfermedad . La secuencia de nucleótido para icey puede ser utilizada para construir sondas de hibridación para el mapeo de aquel gen. la secuencia de nucleótido provista en la presente, puede ser mapeada a un cromosoma particular o a regiones específicas de aquel cromosoma utilizando técnica bien conocidas de mapeo genético y/o cromosomal. Estas técnicas incluyen la hibridación in situ, el análisis de ligadura contra marcadores cromosomales conocidos, clasificación por hibridación con colecciones, preparaciones cromosomales seleccionadas por flujo, o construcciones de cromosoma artificial YAC, P1 o BAC. La técnica de hibridación in situ fluorescente de las extensiones de cromosoma ha sido descrita, entre otros lados, en Verma y otros (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York. La técnica de hibridación in situ fluorescente de preparaciones cromosomales y otras técnicas de mapeo de cromosoma físico pueden estar correlacionadas con datos de mapa genéticos. Ejemplos de datos de mapa genéticos pueden encontrarse en Genome Issue of Science 1994 (265: 1981 f) . La correlación entre la ubicación de icey en un mapa cromosomal físico y una enfermedad específica (o la predisposición a una enfermedad específica) puede ayudar a delimitar la región de ADN asociado con aquella enfermedad genética. La secuencia de nucleótido de la presente invención puede ser utilizada para detectar la diferencia en la secuencia de gen entre normal y portador o individuos afectados.

Las secuencias de nucleótido que codifican ICEY pueden ser utilizadas para producir ICEY purificada utilizando métodos bien conocidos de tecnología de ADN recombinante. Entre las muchas purificaciones que enseñan métodos para la expresión de genes después de que han sido aislados es Goeddel (1990) Gene Expression Technology, Methods and Enzymology, Vol . 185, Academic Press, San Diego CA . ICEY puede ser expresada en una variedad de células huésped , ya sea procariótcas o eucarióticas. Las células huésped pueden ser de la misma especie en donde las secuencias de nucleótido de icey don endógenas o de una especie diferente. Las ventajas de producir ICEY mediante tecnología de ADN recombinante incluyen obtener cantidades adecuadas de la proteína para la purificación y la disponibilidad de procedimientos de purificación simplificados. Las células transformadas con ADN que codifica ICEY pueden ser cultivadas bajo condiciones adecuadas para la expresión de ICEY y la recuperación de la proteína del cultivo de célula . La ICEY producida a través de una célula recombinante puede ser secretada o puede estar contenida intracelularmente, dependiendo de la secuencia de ICEY y la construcción genética usada . En general , es más conveniente preparar proteínas recombinantes en forma secretada. Los pasos de purificación varían con el procedimiento de producción y la proteína particular producida. Además de la producción recombinante, se pueden producir fragmentos de ICEY a través de síntesis de péptido directa utilizando técnicas de fase sólida (cf. Stewart y otros (1969) Solid-Phase Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco CA); Merrifield J (1963) J . Am . Chem. Soc. 85:2149-2154). La síntesis de proteína in vitro puede realizarse utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automática puede lograrse, por ejemplo, utilizando el Applied Biosystems 431 A Peptide Synthetizer (Foster City, California CA) de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante . Varios fragmentos de ICEY pueden ser químicamente sintetizados en forma separada y combinados utilizando métodos químicos para producir la molécula de longitud completa. La ICEY para inducción de anticuerpo no requiere de actividad biológica; sin embargo, la proteína debe ser antigénica. El péptido utilizado para inducir anticuerpos específicos puede tener una secuencia de aminoácido consistiendo de por lo menos cinco aminoácidos y preferiblemente por lo menos 10 aminoácidos. Estos deben asemejarse a una porción de la secuencia de aminoácido de la proteína y pueden contener toda la secuencia de aminoácido de una molécula de existencia natural pequeña tal como ICEY. Estiramientos cortos de aminoácido de ICEY pueden ser fusionados con aquellos de otra proteína tal como una hemocianina de limpeto de llave y la molécula quimérica utilizada para la producción de anticuerpo . Varios métodos son conocidos por aquellos expertos en la técnica para preparar anticuerpos monoclonales y policlonales para ICEY. En un aspecto, se obtiene una ICEY desnaturalizada de la separación mediante HPLC de fas inversa y se puede utilizar para inmunizar ratones o conejos utilizando técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia . Aproximadamente 100 microgramos son adecuados para la inmunización de un ratón , mientras que hasta 1 mg se utiliza para la inmunización de un conejo. Para identificar hibridomas de ratón , la proteína desnaturalizada puede ser radioyodada y utilizada para clasificar hibridomas de célula B de murino potenciales para aquellos que producen el anticuerpo. Este procedimiento requiere solamente de pequeñas cantidades de proteína, tal como 20 mg podrían ser suficientes para marcar y clasificar los varios miles de clones . En otro aspecto, la secuencia de aminoácido de ICEY, como se dedujo de la translación de la secuencia de ADN , es analizada para determinar regiones de alta inmunogeneicidad . Por ejemplo, los oligopéptidos que comprenden regiones hidrofílícas, como se muestra en la Figura 3 , pueden ser sintetizados y utilizados en protocolos de inmunización adecuados para producir anticuerpos. El análisis para seleccionar epítopes apropiados se describe en Ausubel FM y otros (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Jonh Wiley & Sons, NYC). Las secuencias de aminoácido óptimas para la inmunización están usualmente en el término C , el término N y aquellas regiones hidrofílicas de intervención del polipéptido, las cuales probablemente serán expuestas al ambiente externo cuando la proteína está en sus conformación natural . Típicamente, los péptidos seleccionados, aproximadamente 15 residuos en longitud, son sintetizados utilizando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer Modelo 431A utilizando química fmoc y acoplado a la hemocianina de limpeto de llave (KLH , Sigma) mediante la reacción con éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxi-succinimida (MBS; cf. Ausubel FM y otros, supra). Si es necesario, se puede introducir una cisteína en el término N del péptido para permitir el acoplamiento a KLH y se pueden inmunizar animales con el complejo de péptido-KLH en un auxiliar completo de Freund . Los antisueros resultantes pueden ser tratados para actividad de antipéptido uniendo el péptido al plástico, bloqueando con 1 % de BSA, haciendo reacciona con antisueros, lavando y haciendo reaccionar con IgG anti-conejo de cabra específico, purificado por afinidad, marcado (radioactivo o fluorescente). También se pueden preparar y clasificar hibridomas utilizando técnicas normales. Los hibridomas de interés pueden ser detectados clasificando con ICEY marcada para identificar aquellas fusiones que producen el anticuerpo monoclonal con el carácter específico deseado. En un protocolo típico, las cavidades de las placas (FAST; Becton-Dickinson, Palo Alto, CA) son revestidas con anticuerpos conejo-anti-ratón específicos (o Ig anti-especies adecuado) a 10 mg/ml. Las cavidades revestidas son bloqueadas con 1 % de BSA, lavadas y expuestas a sobrenadantes de hibridomas. Después de la incubación , las cavidades son expuestas a ICEY marcada a 1 mg/ml . Los anticuerpos de producción de clones unirán una cantidad de ICEY marcada, la cual es detectable por arriba del antecedente. Dichos clones pueden ser expandidos y sometidos a 2 ciclos de clonación a una dilución limitante (1 célula/3 cavidades). Los hibridomas clonados son inyectados a ratones tratados con pristano para producir ascitos, y ei anticuerpo monoclonal puede ser purificado del fluido ascítico de ratón mediante cromatografía de afinidad utilizando la Proteína A. Los anticuerpos monoclonales con afinidades de por lo menos 108 M* 1 , preferiblemente de 109 a 1010 o más fuerte, típicamente se harán a través de procedimientos normales como se describe en Harlow y Lañe (1988) Antibodies; A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York; y en Goding (1986)Monoclonal Antibodies: Principies and Practice , Academic Press, Nueva York, ambas incorporadas aquí por referencia. Los anticuerpos específicos para ICEY pueden ser producidos mediante inoculación de una animal apropiado con el polipéptido o un fragmento antigénico. Un anticuerpo es específico para ICEY si éste es producido contra toda o una parte de ICEY y se une a toda o a una parte de ICEY. La inducción de anticuerpos incluye no solamente la estimulación de una respuesta inmune mediante inyección a los animales , sino que también pasos análogos en la producción de anticuerpos sintéticos u otras moléculas de unión específica tales como la clasificación de colecciones de inmunoglobulina recombinante (Orlandi T y otros (1989) PNAS 86:3833-3837, o Huse WD y otros (1989) Science 256: 1275-1281 ) o la estimulación in vitro de poblaciones de linfocito . La tecnología actual (Winter G y Milstein (1991 ) Nature 349:293-299) provee un número de reactivos de unión altamente específicos con base en los principios de la formación de anticuerpos. Estas técnicas pueden ser adaptadas para producir moléculas que unen específicamente a ICEY. Una modalidad adicional de la presente invención es el uso de anticuerpos específicos para ICEY, inhibidores, receptores o sus análogos como agentes bioactivos para tratar trastornos de monocito activado, tales como enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de la insulina , artritis reu matoide, choque séptico u problemas patológicos similares. Las composiciones bioactivas que comprenden agonistas, antagonistas, receptores o inhibidores de ICEY pueden ser administradas en una dosis terapéutica adecuada determinada por cualquiera de las varias metodologías incluyendo estudios clínicos en especies de mam íferos para determinar la dosis máxima tolerable y en sujetos seres humanos normales para determinar la dosis segura. Además, el agente bioactivo puede ser formado en complejo con una variedad de compuestos bien establecidos o composiciones, los cuales mejoran la estabilidad o propiedades farmacológicas tales como vida media. Se contempla que la com posición terapéutica , bioactiva puede ser suministrada a la corriente sanguínea a través de infusión intravenosa o cualquier otro medio efectivo que pueda ser utilizado para tratar condiciones asociadas con la producción y función de IC EY. Los anticuerpos, inhibidores, o antagonistas de ICEY (u otros tratamientos para la producción excesiva de ICEY, de aquí en adelante denominados "tratamientos"), pueden proveer diferentes efectos cuando se administran terapéuticamente. Los tratamientos serán formulados en un medio de vehículo no tóxico, inerte, acuoso, farmacéuticamente aceptable, preferiblemente a un pH de alrededor de 5 a 8, muy preferiblemente de 6 a 8, aunque el pH puede variar de acuerdo con las características del anticuerpo, inhibidor, o antagonista que se está formulando y la condición que será tratada. Las características de los tratamientos para la producción excesiva de ICEY incluyen la solubilidad de la molécula , vida media e inmunogeneicidad; estas y otras características pueden ayudar a definir un vehículo efectivo. Se prefieren proteínas humanas nativas como tratamientos para la producción excesiva de ICEY, pero las moléculas orgánicas o sintéticas que resultan de clasificaciones de fármaco pueden ser igualmente efectivas en situaciones particulares.

Los tratamientos para la producción excesiva de ICEY pueden ser suministrados a través de rutas de administración conocidas incluyendo, pero no limitándose a, cremas y geles tópicos, parches y vendajes transdérmicos; formulaciones inyectables, intravenosas y de lavado; y líquidos y pildoras oralmente adm in istrados, particularmente formulados para resistir el ácido y enzimas del estómago. La formulación particular, la dosis exacta , y ruta de administración serán determinadas por el médico que atiende y variarán de acuerdo con cada situación específica . Dichas determinaciones se hacen considerando variables múltiples tales como la condición que será tratada, el tratamiento que será administrado, y el perfil farmacocinético del tratamiento particular. Los factores adicionales que pueden ser tomados en cuenta incluyen el estado de enfermedad (v. gr. , severidad) del paciente, edad, peso, género , dieta, tiempo de administración , combinación del fármaco, sensibilidades de reacción , y tolerancia/ respuesta a la terapia. Las formulaciones de larga acción pueden ser administradas sólo una vez por día, o aún con menos frecuencia: cada 3 a 4 d ías, cada semana, o cada dos semanas, dependiendo de la vida media y el régimen de claro de los tratamientos particulares.

Las cantidades de dosis normal pueden variar de 0.1 a 100 ,000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g , dependiendo de la ruta de administración . La guía para las dosis particulares y los métodos de suministro se provee en la literatura; ver patentes de E. U .A. Nos. 4,657,760; 5,206, 344; 0 5,225,212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes tratamientos y que la administración sistemática puede necesitar el suministro en una forma diferente de aquella de la administración local a un órgano específico o tejido. Se contempla que las condiciones o enfermedades que activan monocitos, macrófagos y posiblemente leucocitos pueden precipitar el daño que es tratable con anticuerpos , inhibidores o antagonistas de ICEY. Los trastornos de monocito activado específicamente pueden ser diagnosticados mediante las pruebas discutidas anteriormente, y dichas pruebas pueden ser realizadas en casos de sospecha de enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, artritis reumatoide, sepsis y problemas fisiológicos/patológicos similares. Los Ejemplos que se presentan a continuación se proveen para ilustrar la presente invención. Estos ejemplos se proveen sólo a manera de ilustración y no son incluidos con el propósito de limitar la invención.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL I. Aislamiento de ARNm y Construcciones de Colecciones de ADNc Se identificó la secuencia de icey entre las secuencias únicas 14775 (SEC ID NO:1) y 157811 (SEC ID NO:2) obtenidas de colecciones de THP-1 activada humana. La THP-1 es una línea de célula leucémica humana derivada de la sangre de un niño de un año de edad con leucemia monocítica aguda. Las células utilizadas para la colección activada (o PMA + LPS) fueron cultivadas durante 48 horas con 100 nm de PMA en DMSO y durante 4 horas con 1µg/ml de LPS. La colección de THP-1 activada fue construida como de costumbre mediante Stragene (Stragene, 11099 M. Torrey Pines Rd., La Jolla, CA 92037) esencialmente como se describe más adelante. El Stragene preparó la colección de ADNc utilizando iniciación oligo d(T). Los oligonucleótidos de adaptador sintético se ligaron sobre las moléculas de ADNc permitiéndoles que sean insertadas al sistema de vector de Uni-ZAP™ (Stragene). Esto permitió una construcción de colección de lambda de eficiencia unidireccional (orientación de sentido) y la conveniencia de un sistema de plásmido con selección de color azul/blanco para detectar clones con inserciones de ADNc. La calidad de la colección de ADNc se clasificó utilizando sondas de ADN , y después, se separó el fagémido pBluescript® (Stragene). Este fagémido permite el uso de un sistema de plásmido para facilitar la caracterización de inserto, secuenciación , mutagénesis dirigida al sitio, la creación de eliminaciones unidireccionales y expresión de polipéptidos de fusión . Subsecuentemente, las partículas de fago de colección construidas como de costumbre fueron infectadas a XL1 -Blue® (Stragene) de la cepa huésped E. coli. La alta eficiencia de transformación de esta cepa bacteriana incrementa la probabilidad de que la colección de ADNc contendrá clones raros, sub-representados. Los vectores unidireccionales alternativos pueden incluir, pero no se limitan a, pcDNAl (Invitrogen, San Diego CA) y pSHIox-1 (Novagen, Madison Wl).

II. Aislamiento de Clones de ADNc Las formas de fagémido de ADNc individual fueron obtenidos mediante el procedimiento de excisión in vivo, en donde se coinfectó XL1 -BLU E con un fago auxiliar f1 . Las proteínas derivadas tanto del fago lambda como del fago auxiliar f 1 iniciaron la nueva síntesis de ADN de las secuencias definidas en el ADN objetivo de lambda y crearon una molécula de ADN de fagémido circular de cadena individual, más pequeña que incluye todas las secuencias de ADN del plásmido de pBluescript y el inserto de ADNc. El ADN de fagémido fue liberado de las células y purificado, después fue utilizado para re-infectar células huésped bacterianas frescas (SOLR, Stragene Inc.), en donde se produjo el ADN de fagémido de cadena doble. Ya que el fagémido lleva el gen para ß-lactamasa, las bacterias nuevamente transformadas fueron seleccionadas del medio conteniendo penicilina. Se purificó el ADN de fagémido utilizando el Sistema de Purificación de Plásmido QIAWELL-8 de QIAGEN® DNA Purification System. Esta técnica provee un método rápido y confiable de alta producción para Usar las células bacterianas y aislar el ADN de fagémido altamente purificado. El ADN eluido de la resina de purificación fue adecuado para la secuenciación de ADN y otras manipulaciones analíticas. lll. Secue 1nciación de Clones de ADNc Los insertos de ADNc de los aislados aleatorios de la colección de THP-1 fueron secuenciados en parte. Los ADNcs fueron secuenciados mediante el método de Sanger F. y AR Coulson (1975; J. Mol. Biol. 94:441f), utilizando un Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno NV) en combinación con cuatro ciclizadores Peltier Thermal Cyclers (PCT200 de MJ Research , Waterown MA) y Applied Biosystems 377 o 373 DNA Sequencing Systems (Perkin Elmer) y el marco de lectura determinado.

IV. Búsqueda de Homología de Clones de ADNc y Proteínas Deducidas Cada secuencia así obtenida se comparó con secuencias en GenBank utilizando un algoritmo de búsqueda desarrollado por Applied Biosystems I nc. , e incorporado en el sistema I N H ER IT™ 670 Sequence Analysis System. En este algoritmo, se utilizó un Lenguaje de Especificación de Patrón (desarrollado por TRW Inc.) para determinar las regiones de homología. Los tres parámetros que determinan cómo las comparaciones de secuencia realizaron ta mañ o de ventana, desviación de ventana, y tolerancia de error. Utilizando una combinación de estos tres parámetros, la base de datos de ADN se buscó para secuencias que contengan regiones de homología a la secuencia objetivo, y las secuencias apropiadas fueron clasificada s con un valor inicial. Subsecuentemente, estas regiones homologas fueron examinadas utilizando gráficas de homología de matriz dot para distinguir las regiones de homología de las coincidentes de oportunidad . Se utilizaron alineaciones de Smith-Waterman de la secuencia de proteína para exhibir los resultados de la búsqueda de homología. Este método no identificó inmediatamente un homólogo de ICEY. Subsecuentemente, la secuencia de ICEY humana se obtuvo de GenBank Gl número 717040 y se comparó con las secuencias en la base de datos de LI FESEQ ™ (Incyte Pharmaceuticals, I nc.) . Los clones de Incyte 14775 y 15781 1 fueron determinados para tener homología a la secuencia de Gen Bank , Gl 717040. La presencia de icey en la colección de TH P- 1 activada, la cual representa macrófagos activados, es consistente con su expresión en tejidos con defensas inmunológicas activas, particularmente tejidos inflamados y enfermos, incluyendo aquellos previamente definidos con relación de trastornos por monocito activado. Las homologías de secuencia de péptido y de proteína fueron averig uadas utilizando el Sistema de Análisis de Secuencia INHERIT 670 en una forma similar a aquella utilizada en homologías de secuencia de A DN . El Lenguaje de Especificación de Patrón y las ventanas de parámetros fueron utilizados para buscar las bases de datos de proteína para secuencias que contienen regiones de homología, las cuales se clasifican con un valor inicial. Se examinaron las gráficas de homolog ía de matriz dot para distinguir las regiones de homolog ía significativa de coincidentes de oportun idad. Las secuencias de nucleótido y de aminoácido para toda la región de codificación del homólogo de ICE humana, reclamadas en esta invención se muestran en las Figuras 1 A y 1 B.

V. Identificación y Secuenciación de Longitud Completa de los Genes Los clones de Incyte 14775 y 15781 1 (SEC I D NOS: 1 y 2 , respectivamente), fueron resecuenciados con M 13 e iniciadores inversos M 13 para obtener una secuencia de nucleótido 3' y 5' adicional . Las secuencias adicionales no se traslaparon, indicando que la región de codificación fue incompleta. Ya que solamente el clon 14775 pareció tener la región de codificación completa , que el clon sólo fue iniciado con los oligos nuevamente designados (S EC I D NOS: 3 y 4) para obtener una secuencia interna para acabar la secuencia de nucleótido del gen . La secuencia adicional, la cual ha sido obtenida del clon 15781 1 se utilizó para confirmar y editar las secuencias del clon 14775. La secuencia de icey confirmada fue homologa a, pero claramente diferente de cualquier molécula I CE conocida . La secuencia de nucleótido completa para icey fue traducida , y la translación en marco se muestra en las Figuras 1 A y 1 B . Cuando todas las tres translaciones predichas posibles de la secuencia fueron buscadas contra bases de datos de proteína , tales como SwissProt y PI R, no se encontraron coincidentes exactos a cualquiera de las translaciones posibles de icey. Las Figuras 2A y 2B muestran la comparación de la secuencia de aminoácido de ICEY con el número Gl 717040 de GenBank de ICE humana. Los aminoácidos de acuerdo están resaltados en negro. La estructura expresada /alfa, beta , y regiones flexibles) , a sí como gráficas de carácter hidrofílico y de antigenicidad para ICEY se muestran en la Figura 3. La Figura 4 muestra las alineaciones de la secuencia de gen completa (línea superior) (SEC I D N0: 5) con las secuencias de ADNc parciales de los clones enumerados 14775 y 15781 1 (SEC I D NOS: 1 y 2, respectivamente) . La alineación de secuencia de SEC I D NO : 1 se muestra a la izquierda y aquella de SEC I D NO:2 a la derecha.

VI. Análisis Antisentido El conocimiento de la secuencia de ADNc correcta, completa del gene de icey nueva permite su uso en la tecnolog ía de antisentido en la investigación de la función del gen . Los oligonucleótidos , fragmentos genómicos o de ADNc que comprenden la cadena de antisentido de icey son utilizados ya sea in vitro o m vivo para inhibir la expresión de la proteína . Dicha tecnología es ahora bien conocida en la técnica, y se diseñan sondas en varias ubicaciones a lo largo de la secuencia de nucleótido icey. Mediante el tratamiento de células o de animales de prueba completos con dichas secuencias antisentido, el gen de interés puede ser efectivamente cerrado. Frecuentemente, la función del gen es averiguada observando el comportamiento a nivel celular, de tejido o de organismo (v. gr. , letalidad , pérdida de función diferenciada o cambios en morfología, por ejemplo) . Además de utilizar secuencias construidas para interrumpir la transcripción del marco de lectura abierto, se obtienen modificaciones de la expresión de gen diseñando secuencias de antisentido a regiones intron , elementos promotores/mejoradores, o aún para trans-actuar genes de regulación . Similarmente, la inhibición de actividad se logra utilizando la metodología de pares de base de Hogeboom, también conocida como pares de base de "hélice triple".

Vil. Expresión de ICEY La expresión de icey se logra subclonando los ADNcs a vectores de expresión apropiados y transfectando los vectores a huéspedes de expresión apropiados. El vector de clonación utilizado para la generación de la colección de tejido se utiliza para la expresión de la secuencia icey en E^ coli. Corriente arriba del sitio de clonación , este vector contiene un promotor para ß-galactosidasa , seguido por la secuencia de nucleótido que codifica la Met amino terminal y los 7 subsecuentes residuos de ß-galatosidasa . Inmediatamente después de estos ocho residuos se encuentra un promotor bacteriófago diseñado por ingeniería útil para iniciación artificial y transcripción y un número de sitios de restricción únicos, incluyendo Eco Rl , para clonación . La inducción de la cepa de bacterias aisladas , transfectadas , con I PTG utilizando métodos normales produce una proteína de fusión que corresponde a los primeros siete residuos de ß-galactosidasa, aproximadamente 15 residuos del "eslabonador" , y la proteína codificada por el ADNc. Ya los insertos del clon de ADNc son generados mediante un procedimiento esencialmente aleatorio, existe la oportunidad en tres de que el ADNc incluido se encuentre en el marco correcto para la translación apropiada. Si el ADNc no está en el marco de lectura apropiado, el marco de lectura apropiado es obtenido mediante la eliminación o inserción del número apropiado de bases a través de métodos bien conocidos incluyendo mutagénesis in vitro, digestión con exonucleasa l l l o nucleasa de "mung bean", o inclusión del eslabonador de oligonucleótido. El ADNc de icey es lanzado hacia otros vectores que se sabe que son útiles para la expresión de proteína en huéspedes específicos. Los amplimeros de oligonucleótido que contienen sitios de clonación así como un segmento de ADN suficiente para la hibridación de estiramientos en ambos extremos del ADNc objetivo (25 pares de base) son sintetizados químicamente mediante métodos normales . Estos iniciadores son utilizados para amplificar los segmentos de gen deseados mediante PCR. Los segmentos de gen nuevos resultantes son digeridos con enzimas de restricción apropiadas bajo condiciones normales y aislados mediante electroforesis en gel . Alternativamente, se producen segmentos de gen similares mediante la digestión del ADNc con enzimas de restricción apropiadas y llenado en los segmentos de gen faltantes con oligonucleótidos químicamente sintetizados. Los segmentos de más de un gen son ligados conjuntamente y clonados en vectores apropiados para optimizar la expresión de la secuencia recombinante. Los huéspedes de expresión adecuados para dichas moléculas quiméricas incluyen pero no se militan a células de mamífero tales como células de Ovario de Hámster Chino (CHO) y las células 293 humanas, células de insecto tales como células Sf9, células de levadura tales como Saccharomyces cerevisiae, y bacterias tales como E. coli. Para cada uno de estos sistemas de cél ula, un vector de expresión útil también incluye un origen de replicación para permitir la propagación en bacteria y un marcador seleccionable , tal como el gen de resistencia antibiótica de ß-lactamasa , para permitir la selección en bacterias. Además, los vectores pueden inclui r un segundo marcador seleccionable, tal como el gen de fosfotransferasa de neomicina para permitir la selección en células huésped eucarióticas transfectadas . Los vectores para utilizarse en huéspedes de expresión eucarióticos pueden requerir de elementos de procesamiento de ARN tales como secuencias de poliadenilación 3' , si tales no son parte del ADNc de interés . Adicionalmente, el vector puede contener promotores o mejoradores, los cuales incrementan la expresión del gen. Dichos promotores son huéspedes específicos e incluyen MMTV, SV40 , o promotores de metalotionina para células CHO; promotores trp, lac, o T7 para huéspedes bacterianos; o factor alfa, oxidasa de alcohol o promotores PGH para levadura. Los mejoradores de transcripción , tales como el mejorador del virus de sarcomo rous (RSV), se utilizan en células huésped de mam ífero. U na vez que los cultivos homogéneos de cél ulas recombinantes son obtenidos a través de métodos de cultivo normales, se recuperan grandes cantidades de ICEY recombinantemente producida del medio acondicionado y analizadas utilizando métodos cromatográficos conocidos en la técnica, ya que la expresión de la proteína de ICEY puede ser letal a ciertos tipos de célula , se debe tener cuidado en la selección de un especie h uésped adecuada y condiciones de crecimiento. Alternativamente, la proteína es expresada en la forma inactiva , tal como en cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión se separan de las células, la proteína se solubiliza y se duplica a una forma activa .

VIII. Aislamiento de ICEY Recombinante La purificación de ICEY se logra creando una proteína quimérica teniendo uno o más dominios de polipéptido agregados a los aminoácidos de ICEY para facilitar la purificación de la proteína . Dichos dominios que facilitan la purificación incluyen , pero no se limitan a, péptidos quelatadores de metal tales como módulos de histidina-triptofano, que permiten la purificación de dominios de proteína A, de metales inmovilizados, que permiten la purificación de inmunoglobulina inmovilizada , y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad de FLAGS (Immunex Corp. Seattle WA) . La inclusión de una secuencia eslabonadora de escisión tal como el Facto XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego CA) entre el dominio de purificación y la secuencia icey se utiliza para purificar ICEY del complejo de proteína de fusión .

IX. Prueba de Diagnóstico Utilizando Anticuerpos Específicos de ICEY Los anticuerpos ICEY particulares son útiles para el diagnóstico de condiciones prepatológicas, y enfermedades crónicas o agudas, las cuales se caracterizan por diferencias en la cantidad o distribución de ICEY. La ICEY se ha encontrado en la colección de THP- 1 activada y de esta manera está asociada con anormalidades o patologías, las cuales activan monocitos . Las pruebas de diagnóstico para ICEY incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y una marca para detectar la ICEY en fluidos del cuerpo humano, tejidos o extractos de dichos tejidos. Los polipéptidos y los anticuerpos de la presente invención son utilizados con o sin modificación . Frecuentemente, los polipéptidos y los anticuerpos serán marcados u niéndolos, ya sea covalente o no covalentemente, con una substancia, la cual provee una señal detectable. Una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación son conocidas y han sido reportadas extensamente en la literatu ra tanto científica como de patentes . Las marcas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de dichas marcas incluyen las patentes de E . U .A. Nos. 3,817,837; 3 ,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275, 149; y 4,366,241 . También , pueden ser producidas las inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en la patente de E. U .A. No. 4,816,567, incorporada aquí por referencia. Una variedad de protocolos para medir ICEY soluble o de unión de membrana, utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para la proteína respectiva, es conocida en la técnica . Los ejemplos incluyen el ensayo inmunoabsorbente enlazado a la enzima (ELISA), radio-inmunoensayo (RÍA) y clasificación de cél ula activada fluorescente (FACS) . Se prefiere un inmunoensayo de base monoclonal de dos sitios utilizando anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopes sin interferencia en ICEY, pero se puede emplear un ensayo de unión competitiva. Estos ensayos se describen , entre otras partes, en Maddox, DE y otros (1983, J . Exp . Med. 158: 121 1 ) .

X. Purificación de ICEY Nativo Utilizando Anticuerpos Específicos La ICEY nativa o recombinante se purificó mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para ICEY. En general, se construye una columna de inmunoafinidad acoplando covalentemente el anticuerpo anti-ICEY a una resina cromatográfica activada .

La inmunoglobulinas policlonales se prepararan de suero inmune ya sea mediante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) . Los anticuerpos monoclonales se preparan de ascitos de ratón mediante precipitación de sulfato de amonio o cromatografía sobre Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada está covalentemente unida a una resina cromatográfica tal como CnBr-Sepharose activada (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo está acoplado a la resina, la resina es bloqueada , y la resina derivativa es lavada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dichas columnas de inmunoafinidad se utilizan en la purificación de ICEY mediante la preparación de una fracción de células conteniendo ICEY en una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante solubilización de la célula completa o de una fracción sub-celular obtenida vía centrifugación diferencial por la adición de detergente o mediante otros métodos bien conocidos en la técnica . Alternativamente, la ICEY conteniendo una secuencia de señal, es secretada en una cantidad útil al medio en el cual las células crecen. Una preparación que contiene ICEY soluble se hace pasar sobre la columna de inmunoafinidad , y la columna es lavada bajo condiciones que permiten la absorbancia preferencial de ICEY (v. gr. , reguladores de pH de alta resistencia iónica en presencia de detergente). Después , la columna es el uida bajo condiciones que rompen la unión del anticuerpo/ICEY (v. gr. , un regulador de pH con pH de 2-3 o una alta concentración de un chaotropo al como urea o tiocíanato (ion) , y ICEY es recolectada. XI. Actividad ICEY La actividad de ICEY purificada o expresada se prueba a través de métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Un método aconseja la estimulación de macrófagos con LPS para ind ucir la expresión de pre-I L- 1 ß y después tratar con ATP y ICEY. Los niveles de I L- 1 ß en el medio son medidos a través del inmunoensayo inmunoabsorbente enlazado a la enzima (ELISA) , como se describe en Li y otros (1995) Cell 80: 401 -41 1 .

XII. Clasificación de Fármaco ICEY, o fragmentos inmunológicamente activos de la misma , se utilizan para seleccionar compuestos en cualquier variedad de técnicas de clasificación de fármacos. El polipéptido de ICEY o fragmento empleado en dicha prueba está ya sea libre en solución , fijo a un soporte sólido, sale de una superficie de célula, o se ubica intracelularmente. U n método para clasificar fármacos utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas, las cuales son establemente transformadas con ácidos nucleicos recombinantes que expresan ICEY o un fragmento de la misma. Los fármacos son clasificados contra dichas células transformadas en ensayos de unión competitivos. Dichas células, ya sea en forma viable o fija, pueden ser utilizadas para ensayos de unión normales. Uno puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre ICEY y el agente que se está probando. Alternativamente, uno puede examinar la disminución en la formación de complejo entre ICEY y su célula objetivo, el monocito o macrófago, causada por el agente que se está tratando. Así, la presente invención provee métodos para clasificar fármacos, inhibidores naturales o cualesquiera oros agentes que pueden afectar la inflamación y enfermedad . Estos métodos comprenden poner en contacto dicho agente con un polipéptido de ICEY o fragmento del mismo y analizar, 1 ) la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido de ICEY o fragmento, o 2)la presencia de un complejo entre el polipéptido de ICEY o fragmento y la célula, a través de métodos bien conocidos en la técnica . En dichos ensayos de unión competitivos, el polipéptido de ICEY o fragmento es típicamente marcado. Después de una incubación adecuada, el polipéptido de ICEY o fragmento se separó de aq uel presente en forma de unión , y la cantidad de marca libre o en complejo es una medida de la habilidad del agente particular para unirse a ICEY o para interferir con el complejo ICEY/célula y complejo de agente. Otra técnica para clasificar el fármaco provee una clasificación de alta producción para compuestos que tengan afinidad de u nión adecuada al polipéptido de ICEY y se describe con detalle en la solicitud de patente europea 84/03564 , publicada el 1 3 de Septiembre de 1984, incorporada aqu í por referencia. En resumen , una pluralidad de diferentes compuestos de prueba de péptido son sintetizados en un substrato sólido, tal como púas de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de prueba de péptido se hacen reaccionar con el polipéptido de ICEY y se lavan . El polipéptido de ICEY unido después es detectado a través de métodos bien conocidos en la técnica. La ICEY purificada también puede ser también colocada como revestimiento directamente sobre placas para utilizarse en las técnicas de clasificación de fármaco antes mencionadas. Además , se pueden utilizar anticuerpos sin neutralización para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido. Esta invención también contempla el uso de ensayos de clasificación de fármaco competitivos en donde los anticuerpos de neutralización capaces de unir ICEY, específicamente compiten con un compuesto de prueba para unirse a polipéptidos de IC EY o un fragmento del mismo. De esta manera, los anticuerpos pueden ser utilizados para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con ICEY.

XIV. Diseño de Fármaco Racional El objetivo del diseño de fármaco racional es producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés o de moléculas pequeñas con las cuales interactúan , por ejem plo, agonistas, antagonistas, o inhibidores . Cualquiera de estos ejemplos puede ser utilizado para diseñar fármacos, los cuales son formas más activas o estables del polipéptido o que mejoran o interfieren con la función de un polipéptido in vivo (cf. Hodgson (1991 ) Bio/Technology 9: 19-21 , incorporada aquí por referencia) . En un aspecto, la estructura tridimensional de una proteína de interés, o de un complejo inhibidor de proteína, se determina a través de cristalografía de rayos x, a través de modelación por computadora o, más típicamente, mediante una combinación de los dos aspectos. Tanto la forma como las cargas del polipéptido deben ser averiguadas para ver la estructura y para determinar los sitios activos de la molécula. La información útil con respecto a la estructura de un polipéptido puede ser ganada a través de la modelación con base en la estructura de proteínas homologas . La estructura de cristal de una proteína ICE (Walker, 1994, supra) puede ser utilizada como u n punto de partida. La información estructural relevante se utiliza para diseñar moléculas de tipo ICEY análogas o para identificar inhibidores eficientes. Ejemplos útiles de diseño de fármaco racional incluyen moléculas que tienen un carácter específico diferente o una actividad o estabilidad mejorada como se muestra por Braxton S y Wells JA ( 1992 Biochemistry 31 :7796-7801 ) o la cual actúa como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos como se muestra por Athauda SB y otros (1993 J . Biochem. 1 13: 742-746) , incorporada aquí por referencia.

También es posible aislar un anticuerpo específico en el objetivo, seleccionado mediante ensayo funcional, como se describió anteriormente, y para resolver su estructura de cristal. Este aspecto, en principio, produce un farmanúcleo en donde se puede basar el diseño de fármaco subsecuente. Es posible derivar la cristalografía de proteína generando anticuerpos anti-yodotípicos (anti-ids) a una anticuerpo funcional, farmacológicamente activo. Como una imagen de espejo de una imagen de espejo, el sitio de unión de los anti-ids podría esperarse que sea un análogo del receptor original. El anti-id entonces puede ser utilizado para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos química o biológicamente producidos. Los péptidos aislados entonces podrían actuar como el farmanúcleo. Utilizando los métodos descritos infra. una cantidad suficiente de ICEY puede hacerse disponibles para realizar dichos estudios analíticos como cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácido de ICEY provista en la presente, proveerá la guía para aquellos que emplean técnicas de modelación por computadora en lugar de o además de la cristalografía de rayos X. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior se incorporan aquí por referencia. La especificación escrita anterior se considera suficiente para permitir que un experto en la técnica practique la invención. En realidad, varias modificaciones de los modos descritos anteriormente, las cuales son fácilmente evidentes para aquellos expertos en el campo de la biología molecular o campos relacionados pretenden estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: INCYTE PHARMACEUTICALS, INC. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: HOMOLOGO DE ENZIMA DE CONVERSIÓN DE INTERLEUCINA-1 HUMANA (iii) NUMERO DE SECUENCIAS : 6 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: INCYTE PHARMACEUTICALS, INC. (B) CALLE: 3330 Hillview Avenue (C) CIUDAD: Palo Alto (D) ESTADO: CA (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO: 94304 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DEL MEDIO: disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS ACTUALES DE SOLICITUD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: será cedido (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: presentada con la misma (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) SERIE NO. DE SOLICITUD: 08/443,865 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 31 de Mayo de 1995 (viii) INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: LUTHER, BARBARA J. (B) NUMERO DE REG. : 33954 (C) NO. DE REF. /APODERADO: PF-0037 PCT (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: 415-855-0555 (B) TELEFAX: 415-852-0195 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 303 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) COLECCIÓN: THP-1 (B) CLON: 014775 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:1: ACASTCTTTA CTTTTATTOA AATACCAAAT ATTGACTATG CAAQCTATAC TGßTAAA OT 60 CTCTTTOATG TTGACAG?ßß AGOGCTOGOC TGCCTGTGQT TTCATTTTCA ATTOCCAaQA 1 0 AAGAGQTAG? AATCTCTTGT CAAGsTTGCT CGTTCTATGG. TOßGCATCTQ QOCTTTAßCC 180 TßTGGAACTT CAAATSATTT CTQTACCTTC CQAAATATTT CCATTAGOTQ OCAGCAOCAA 240 G-AATATTTCT GOAAOCATOT OATGAOTTCC OTAATGAGAT GOAGCCCCTT TOCßOTCTCT 300 TTC 303 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 167 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) FUENTE ORIGINAL: (E) HAPLO TIPO: THP-1 (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) COLECCIÓN: 157811 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:2: CAAACACTTC TCAATATOOA CCA???OATC ACCAGTGTAA AACCTCTTCT GCAAATCGAß 60 OCTQOCCACC TOCAOCAOAT CTCAAATATA CTCAAACTTT OTCCTCßTOA AOA?TTCCTO 120 ASACTGTGTA A?AAAAATC? TGATOAGATC TATCCAAT?? AAAAOAO 167 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:3: CCCCCAOGTT CTCAGATGAC TQT 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:4: ACAGTCATCT GAOAACCTGO 000 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1274 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) COLECCIÓN: THP-1 (B) CLON: 014775 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:5: TOCATTCOßA COAGOTTAOC TATOOCTOAA GACAACCACA AAAAAAAAAC AGTTAAß?TQ 60 TTOGAAT?CC TGaßCAAAOA TOTTCTTCAT GOTOTTTTTA ATTATTTOßC AAAACACQAT 120 • GTTCTOACAT TaAAGQAAOA GGAAAAaAAA AAATATTATQ ATACCAAAAT TOAAGACAAO 180 OCCCTOATCT TOOTAflACTC TTTsQAAAOA ATCOCßTGßT CATCAAATQT TTACCCAAAC 240 ACTTCTCAAT ATsOACCAAA ASATCACCAO TQTAAAACCT CTTCTOCAA? TCAQOTOß? 300 CCACCTOAOT CAOCAOAATC TAC???TAT? CTCAAACTTT OTCCTCOTOA AßAATTCCTO 360 AGACTGTGTA AAAAAAATCA TQATQAQATC TATCCAATAA AAAAGAOAQA GGACCGCAGA 420 CGCCTOGCTC TCATCATATG CAATACAAAG TTTGATCACC TßCCTOCAAß OAATGßOOCT 480 CACTATß?C? TCOTOOQOAT OA???aaCTO CTTCAAOOCC TGGGCTAC?C TGTOGTTGCC 540 GAAAAGAATC TCACAGCCAO Oa?T?TQß?S TCAGTOCTOA GaGCATTTQC TOCCAß?CC? 600 GAQCAC??QT CCTCTOACAO C?COTTCTTO OTACTCATOT CTCATOGCAT CCTAGAGOGA 660 ATCTOCOaAC CTOCOCATAA AA?O?????? CCGßATQTOC TGCTTTATQA C?CC?TCTTC 720 CAGATATTCA ACAACCOCAA CTGCCTCAGT CTA??Gß?CA AACCCAAOOT CATCATTOTC 780 CAGOCCTOCA GAGGTOAAAA ?CATGQOAAC TCTGGTCAGA OACTCTCCAC ACCTTQCATC 840 ATCTCTTCAC AGTCATCTGA GAACCTOOAG QCAOATTCTO TTTTCAAGAC CCCQAQOAQA 900 AGQACTTCAT TGCTOTTCTQ TTCTTCAACA CCACATAACQ TßTCCTGG?O ?OACCGCAC? 960 AOGOQCTCCA TCTTCATTGO GQAACTCATG CACATGCTTC CAGAAATATT CTTCTCTCCA 1020 CCTAATOOAA ATATTTCQO? GOTACAG?AA TCATTTGAAG TTCCAC?ßOC T??AGCCCAG 1080 ATGCCCACCA TAGAACGAGC AACCTTGACA AGAGATTTCT ACCTCTTTCC TGGCAATTGA 1140 A??TGAAACC ACAGGCAQCC CAGCCCTCCT CTGTCAACAT CAAAGAGCAC ATTTACCAGT 1200 ATASCTTOCA TAGTCAATAT TTGJTATTTC AATAAAAGTA AAOACTQTAT CTTTTTAAAA 1260 AAAA??A??? AAAA 1274 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 372 aminoácidos (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:6: Met ?la Olu ?ßp ?sn Hiß Lyß Lyß Lyß Thr Val Lys Mat Leu Glu Tyr 1 5 10 15 Leu Gly Lys ?sp Val Leu Hlß ßly Val Phe ?ßn Tyr Leu ?la Lyß Hiß 20 25 30 Aßp Val Leu Thr Leu Lyß Glu ßlu Glu Lyß Lyß Lyß Tyr Tyr Aßp Thr 35 40 45 Lyß Xle Glu ?ßp Lyß ?la Leu Xle Leu Val ?ßp Ser Leu ßlu ?rg Xle 50 55 60 ?la Trp Ser Ser ?ßn Val Tyr Pro ?ßn Thr Ser Oln Tyr Gly Pro Lyß 65 70 75 80 Aßp Hiß ßln Cyß Lys Thr Ser Ser ?la ?ßn ?rg Gly Gly Pro Pro ßlu 85 90 95 Ser ?la Glu Ser Thr ?an Xle Leu Lyß Leu Cyß Pro Arg ßlu ßlu Phe 100 105 110 Leu Arg Leu Cyß Lyß Lyß ?ßn Hiß ?ßp Glu Xlß Tyr Pro Xle Lyß Lyß 115 120 125 Arg Glu Aßp Arg ?rg ?rg Leu ?la Leu lie Xle Cyß ?ßn Thr Lyß Phe 130 135 140 ?ßp Hiß Leu Pro ?la ?rg ?ßn Gly ?la Hiß Tyr ?ßp Xle Val Gly Met 145 150 155 160 Lyß ?rg Leu Leu Gln ßly Leu ßly Tyr Thr Val Val ?la ßlu Lyß Aßn 165 170 175 Leu Thr ?la ?rg Aßp Met ßlu Ser Val Leu Arg ?la Phe ?la ?la ?rg 180 185 190 Pro ßlu Hiß Lys Ser Ser Aßp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met Ser Hiß 195 200 205 Gly lie Leu Glu Gly lie Cyß Gly Pro Ala Hiß Lyß Lys Lyß Lyß Pro 210 215 220 ?ßp Val Leu Leu Tyr Aßp Thr lie Phe Gln Xle Phe Aßn Aßn ?rg ?ßn 225 230 235 240 Cyß Leu Sßr Leu Lyß ?sp Lyß Pro Lys Val lie lie Val Gln ?la Cyß 245 250 255 Arg Qly Glu Lys Hiß Gly Aßn Ser Gly Gln ?rg Leu Ser Thr Pro Cys 260 265 270 Xle Xle Ser Ser Gln Ser Ser Glu ?ßn Leu Glu ?la ?ßp Ser Val Phe 275 280 285 Lyß Thr Pro ?rg ?rg ?rg Thr Ser Leu Leu Phe Cyß Ser Ser Thr Pro 290 295 300 Hiß ?ßn Val Ser Trp ?rg ?ßp ?rg Thr ?rg Gly Ser lie Phe Xle Gly 305 310 315 320 Glu Leu Met His Met Leu Pro Glu Xle Phe Phe Ser Pro Pro ?ßn Gly 325 330 335 ?ßn Xle Ser Glu Val ßln Lyß Ser Phe Glu Val Pro sln ?la Lya ?la 340 345 350 Oln Met Pro Thr lie Olu ?rg ?la Thr Leu Thr ?rg ?ßp Phe Tyr Leu 355 360 365 Phe Pro Oly ?ßn

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1 . - Un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al polipéptido que tiene la secuencia presentada en SEC I D NO: 6 , o su complemento. 2 - El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la secuencia de ácido nucleico consiste de SEC I D NO: 5. 3.- Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación

2. 4 - Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación

3. 5. - Una sonda de ácido nucleico que comprende un fragmento no conservado del polinucleótido de la reivindicación 2. 6. - U na molécula antisentido que com prende una secuencia de polinucleótido complementario a por lo menos una porción del polinucleótido de la reivindicación 2. 7 - Un método para producir un polipéptido que comprende la secuencia como se representa en SEC I D NO:6, dicho método comprende: a) cultivar las células huésped de la reivindicación 4 bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido, y b) recuperar dicho polipéptido del cultivo de célula. 8 - Un homólogo de enzima de conversión de interleucina purificada (ICEY) que tiene la secuencia de aminoácido presentada en SEC I D NO:6. 9 - Un anticuerpo específico para el polipéptido purificado de la reivindicación 8. 10.- Una composición de diagnóstico para la detección de secuencias de ácido nucleico que codifican al homólogo de enzima de conversión de interleucina (ICEY) que comprende la sonda de ácido nucleico de la reivindicación 5. 11.- Una prueba de diagnóstico para la detección de secuencias de nucleótido que codifican al homólogo de enzima de conversión de interleucina (ICEY) en una muestra biológica, a) combinando la muestra biológica con un polinucléotido, el cual comprende la secuencia de nucleótido de SEC ID NO:5 o un fragmento del mismo, en donde dicho fragmento se deriva de una región no conservada de dicho nucleótido, bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo de hibridación de ácido nucleico entre la secuencia de ácido nucleico SEC ID NO:5 y una secuencia de ácido nucleico complementaria en dicha muestra; b) detectando dicho complejo de hibridación; y c) comparando la cantidad de dicho complejo de hibridación con una normal, en donde la presencia de un nivel anormal de dicho complejo de hibridación se correlaciona positivamente con una condición asociada con inflamación. 12 - La prueba de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el polinucleótido es marcado con una molécula reportadora y el complejo de hibridación es detectado midiendo dicha molécula reportadora. 13.- Una prueba de diagnóstico para la detección de secuencias de nucleótido que codifican al homólogo de enzima de conversión de interleucina (ICEY) en una muestra biológica , que comprende los pasos de: a) combinar la muestra biológica con iniciadores de reacción de cadena de polimerasa bajo condiciones adecuadas para la amplificación de ácido nucleico, en donde dichos iniciadores comprenden fragmentos de regiones no conservadas de la secuencia de nucleótido de SEC I D NO:5; b) detectar las secuencias de nucleótido amplificadas; y c) comparar la cantidad de las secuencias de nucleótido amplificadas en dicha muestra biológica con una normal determinando así si la cantidad de dicha secuencia de nucleótido varía de dicha normal , en donde la presencia de un nivel anormal de dicha secuencia de nucleótido se correlaciona positivamente con una condición asociada con inflamación. 14.- Un método para clasificar una pluralidad de compuestos para afinidad de unión específica con el polipéptido de la reivindicación 8 o cualquier porción de la misma, que comprende. a) proveer una pluralidad de compuestos; b) combinar el homólogo de enzima de conversión de interleucina (ICEY) con cada uno de una pluralidad de compuestos durante un tiempo suficiente para permitir la unión bajo condiciones adecuadas; y c) detectar la unión de ICEY a cada uno de la pluralidad de compuestos, identificando así los compuestos que específicamente unen ICEY.