MXPA97008030A

MXPA97008030A - Nuevo homologo de captecina c

Info

Publication number: MXPA97008030A
Application number: MXPA/A/1997/008030A
Authority: MX
Inventors: J Seilhamer Jeffrey; Coleman Roger; Michael Braxton Scott
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-04-19
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 1998-07-03

Abstract

La presente invención proporciona secuencias de mucleótidos y aminoácidos que identifican y codifican un nuevo homólogo de catepsina C (RCP) expresado en células THP-1. La presente invención también proporciona moléculas antisentido para las secuencias de nucleótidos que codifican RCP, vectores de expresión para la producción de RCP purificada, anticuerpos capaces de enlazarse específicamente a RCP, sondas de hibridación u oligonucleótidos para la detección de secuencias de nucleótidos que codifican RCP, células huéspedes genéticamente traslapadas para la expresión de RCP, pruebas de diagnóstico para la activación de monocito/macrófagos basados en moléculas deácido nucleico que codifican RCP, y uso de la proteína para producir anticuerpos capaces de enlazarse específicamente con la proteína y uso de la proteína para seleccionar inhibidores.

Description

NUEVO HOMOLOGO DE CAPTECINA C CAMPO TÉCNICO La presente invención es en el campo de la biología molecular; más particularmente, la presente invención describe las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de un nuevo homólogo de catepsina C derivado de células THP-l activadas.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA Catepsina C La catepsina C, o dipeptidil-aminopeptidasa I, o dipeptidil-transferasa es una proteinasa de cisteína lisosomal que es capaz de remover dipéptidos secuencialmente del término amino de los sustratos de péptido y proteína e interviene en la degradación de la proteína celular. La catepsina C está implicada en las funciones del tracto alimentario, el crecimiento celular y la activación de la neuraminidasa (Kuribayashi, 1993, J.Biochem., 113:441-449). La actividad de la catepsina C está presente en niveles -más altos en los linfocitos citotóxicos y en las células mieloides, lo que indica su intervención en la inducción, el desarrollo o diferenciación de las células efectoras citolíticas (Thiele y colaboradores, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:83-87). Kominami y colaboradores (1992, Biol. Chem. 373:367- 373) reportaron la presencia de ARNm de catepsina C de rata en casi todos los tejidos de la rata. Grandes cantidades de transcrito prevalecieron en hígado, bazo, intestino delgado y grueso, pulmón y riñon; cantidades moderadas en esófago, estómago, y corazón, y pequeñas cantidades en cerebro, páncreas, glándula adrenal y testículos. La prevalencia de transcrito parece correlacionarse con la presencia esperada y la actividad de monocito/macrófagos en la función del tejido normal . Se han usado macrófagos cultivados para estudiar el procesamiento de catepsina C a partir de su síntesis como propéptido para la enzima oligomérica madura. Tanto el precursor como la catepsina C madura se fosforilan y glicosilan, y parece que se presenta oligomerización antes de la entrada al lisosoma (Muño D y colaboradores (1993) Arch. Biochem. Biophy. 306:103-10). En estudios que utilizan sustratos sintéticos, la catepsina C mostró que funciona como una endopeptidasa en la degradación de la proteína intracelular y como una exopeptidasa (dipeptidilamino-peptidasa) en el crecimiento celular y la activación de la neuraminidasa (Kuribayashi M y colaboradores, supra) . La catepsina C juega un papel en la degradación del colágeno, laminina, elas ina y otras proteínas estructurales que comprenden la matriz extracelular de los huesos. En cuanto el hueso se debilita, es aún más susceptible a la reabsorción de hueso, la invasión de tumores y metástasis.

La catepsina C forma estructuras oligoméricas de aproximadamente 200 kDa, y se compone de ocho subunidades. La actividad de dipeptidil-aminopeptidasa de la catepsina C requiere ion haluro así como grupos sulfhidrilo para la actividad (Kuribayashi, supra) . Las secuencias de nucleótidos para la dipeptidil-peptidasa-I humana de bazo humano se describen en la Publicación Internacional Número WO 93/24634-A, publicada el 9 de diciembre de 1993. WO 93/24634-A describe una secuencia de dipeptidil-peptidasa-I humana que carece de una secuencia señal y una secuencia de proproteína y describe métodos y composiciones para inhibir estados inflamatorios. Kominami, supra, discute que las proteasas de cisteína pueden existir como dos formas de cadena producidas por disociación de la enzima madura y reporta que el análisis N-terminal de la catepsina C purificada de rata mostró dos secuencias diferentes de N-términos las cuales probablemente representan la secuencia N-terminal de cada una de las cadenas. Células THP-1 La THP-1 es una línea de células leucémicas humanas con distintas características monocíticas derivadas de la sangre de un niño varón de 1 año de edad con leucemia monocítica aguda (Tsuchiya S y colaboradores (1980) Int. J. Cáncer 26:171-176). La naturaleza monocítica de la THP-l se identificó a través de actividad estearasa de butirato a-naf ilico el cual se pudo inhibir mediante NaF (fluoruro de sodio) ; la producción de lisozima; fagocitosis (el engolfamiento de materiales extracelulares) de partículas de látex y células de glóbulos rojos de oveja sensibilizadas,- y la capacidad de las células THP-1 tratadas con mitomicina C para activar linfocitos T después del tratamiento con concanavalina A. Morfológicamente, el citoplasma contenía pequeños granulos azurofílicos, el núcleo estaba indentado y en forma irregular con pliegues profundos, y la membrana celular tenía receptores Fe y C3b que probablemente funcionan en la fagocitosis. Los monocitos típicos se desarrollan de monoblastos a través de los promonocitos en la médula ósea y en su forma madura tienen una vida media de aproximadamente tres días. Aproximadamente el 75 por ciento de la combinación de monocitos circulantes se encontró a lo largo de las paredes de los vasos sanguíneos, aunque estas células migran aleatoriamente dentro de los tejidos y se vuelven células que presentan antígeno, o células fagocíticas. Los monocitos que presentan antígeno incluyen la interdigitación de las células dendríticas reticulares y foliculares de los nodulos linfáticos y la piel. Los monocitos fagocíticos son prominentes como las células de Kupffer del hígado y en los alveolos pulmonares y médula ósea. Mucho mieloide humano y líneas celulares mielomonocíticas retienen alguna habilidad para diferenciarse en fenotipos más maduros como respuesta a varios estímulos internos incluyendo factores de crecimiento, linfocinas, citocinas, derivados de vitamina D, y promotores de tumores y agentes extermos como traumatismo, fumar, radiación UV, exposición al asbesto, y esteroides. Las células THP-1 tratadas con el promotor de tumor acetato de- 12-0-tetradecanoil-forbol-13 (TPA) se inducen para detener la proliferación y se diferencian en células parecidas a macrófagos las cuales imitan macrófagos derivados de monocitos nativos tanto morfológicamente como fisiológicamente. Estas células monocito/parecidas a macrófagos exhiben cambios en la expresión de genes como la coinducción de C-fos, c-jun y la regulación hacia abajo de c-myb (Auwerx J (1991) Experientia 47:22-31), aumento en densidad del receptor C3b complemento, y disminución en tanto el FcR como en la molécula de adhesión, CD4. Además, las células THP-1 producen lipasa lipoproteína y apolipoproteína E, asociadas con las lesiones ateroscleróticas, secretan varias citocinas proinflamatorias, incluyendo la IL-13 y TNF (Cochran FR y Finch-Arietta MB (1989) Agents and Actions 27:271-273), y pueden elaborar poderosos oxidantes y proteasas que destruyen tejidos, como las catepsinas. La artritis reumatoide es sólo un ejemplo de un desorden monocito/macrófago; en otros, los macrófagos participan de otras maneras. Por ejemplo, en la arteriesclerosis, los macrófagos acumulan el colesterol de las lipoproteínas de la sangre y se vuelven las células espuma de las lesiones ateroscleróticas humanas. Los monocitos activados renegados también han sido implicados en la defensa defectuosa contra la infección, daño al intestino, osteoporosis, síndrome de choque tóxico, y lupus eritematoso sistémico. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con novedosas secuencias de nucleótidos y aminoácidos para un homólogo novedoso de catepsina C inicialmente encontradas en una biblioteca de ADNc hecha de ARN aislado de células THP-1 cultivadas durante 48 horas con 100 ng/mililitro de éster forbólico (PMA) , seguido por un cultivo de 4 horas en medio que contiene 1 ug/mililitro de LPS. THP-1 (ATCC TIB 202) es una línea de promonocito humano derivado de la sangre periférica de un niño varón de 1 año de edad con leucemia monocítica aguda (ref: Int. J. Cáncer 26 (1980) :17l) . El nuevo gen, el cual se designa en la presente como rep (Incyte Clone 14284) , codifica el polipéptido designado RCP, una catepsina C novedosa. La presente invención se relaciona con el uso de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de RCP en el estudio, diagnóstico y tratamiento de estados de enfermedad relacionados con enfermedad inflamatoria; enfermedad autoinmune; y malignidad de origen celular mieloide en estados de enfermedad como arteriosclerosis, leucemia, lupus eritematoso sistémico, osteoporosis, artritis reumatoide, y síndrome de choque tóxico así como rechazo a los injertos y enfermedad de injerto contra huésped. La presente invención se basa en parte en la homología de nucleótidos y aminoácidos que comparte RCP con la catepsina C de rata aislada de ADNc de riñon de rata (Kominami E y colaboradores (1912) Biol Chem 373:367-73); la presencia de los residuos conservados de la triada catalítica, Cys en 258, His en 405, y Asn en 427, y el sitio de glicosilación NNS en la región hidrofóbica que son comunes a la captesina C; y en parte en la presencia de secuencias de nucleótidos para RCP en la biblioteca de ADNc de THP-1 hecha de una fuente de leucemia monocítica. La presente invención se basa, por lo tanto, en el descubrimiento de un homólogo de catepsina C novedoso que se asocia con monocitos. RCP y las secuencias de nucleótidos que lo codifican y oligonucleótidos, ácido nucleico de péptido (PNA) , fragmentos, porciones o moléculas antisentido de los mismos, proporcionan la base para métodos de diagnóstico para la detección temprana y precisa y/o cuantificación del RCP asociado con enfermedad inflamatoria; enfermedad autoinmune; y malignidad del origen de célula mieioide en estados de enfermedad como, arteriosclerosis, leucemia, lupus eritematoso sistémico, osteoporosis, artritis reumatoide, y síndrome de choque tóxico así como rechazo de injerto y enfermedad de injerto contra huésped. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos RCP descritas en la presente, las cuales codifican el RCP, o fragmentos del mismo, se pueden usar en ensayos de hibridización de células biopsiadas o tejidos o fluidos corporales para diagnosticar anormalidades en individuos que las tienen o están en riesgo por inflamación. Un nivel anormal de secuencias de nucleótidos que codifican al RCP en una muestra biológica puede reflejar una aberración cromosómica, como una supresión de ácido nucleico o mutación. De conformidad con lo anterior, las secuencias de nucleótidos que codifican RCP proporcionan la base para las sondas que se pueden usar a manera de diagnóstico para detectar aberraciones cromosómicas como supresiones, mutaciones o transposiciones cromosómicas en el gen que codifica al RCP. La expresión del gen RCP se puede alterar en esos estados de enfermedad o puede haber una aberración cromosómica presente en la región del gen que codifica al RCP. La presente invención también proporciona moléculas antisentido RCP o antagonistas RCP que se pueden usar para bloquear la actividad del RCP, es decir, actividad de proteasa, en condiciones donde es deseable bloquear la degradación de proteína, como la inflamación. La presente invención también se relaciona con lo vectores de expresión y las células huésped tratadas por ingeniería genética que comprenden secuencias de nucleótidos RCP para la producción in vi tro o in vivo de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Adicionalmente, la presente invención se relaciona con el uso de un polipéptido de RCP, o un fragmento o variante del mismo, para producir anticuerpos anti-RCP y para buscar antagonistas o inhibidores del polipéptido RCP que se pueden usar a manera de dignóstico para detectar y cuantificar los niveles de proteína de RCP en estados de enfermedad. La presente invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de inhibidores o antagonistas de la proteína RCP o ácido nucleico antisentido para su uso en condiciones donde es deseable reducir la actividad de la catepsina C humana descrita en la presente, por ejemplo, en el tratamiento de inflamación y otros estados de enfermedad. La invención proporciona además ensayos y equipos de diagnóstico para la detección de RCP en células y tejidos que comprenden un RCP purificado el cual se puede usar como un control positivo, y anticuerpos anti-RCP.4 Esos anticuerpos se pueden usar en tecnologías basadas en solución, basadas en membrana, o basadas en tejido para detectar cualquier estado o condición de enfermedad relacionada con la expresión de la proteína o la expresión de supresiones o variantes de la misma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras la-Ib representan la secuencia de nucleótidos para rcp (SEQ ID NO:l) y la secuencia de aminoácidos prevista (SEQ ID NO: 2) del polipéptido RCP. Las Figuras 2a-2b muestran la alineación de aminoácidos de RCP con captecina C de rata. Las alineaciones mostradas en las Figuras 2 y 4 sé produjeron usando el programa de alineación de multisecuencia de software de DNASTAR (DNASTAR Inc., Madison, Wl) . La Figura 3 representa un análisis de la hidrofobicidad de RCP basado en la secuencia y composición de aminoácidos previstos. La Figura 4 representa la alineación de RCP con la dipeptidil peptidasa-I (DPI) humana descrita en WO 93/24634.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un homólogo novedoso de la captesina C, designado en la presente como RCP, la secuencia de nucleótidos del cual se encontró inicialmente entre las secuencias de una biblioteca de ADNc hecha de ARN aislado de células THP-l cultivadas durante 48 horas con 100 ng/mililitro de éster forbólico (PMA) , seguido por un cultivo de 4 horas en medio que contiene 1 ug/mililitro de LPS . La THP-l (ATCC TIB 202) es una línea de pro onocito humano derivada de la sangre periférica de un niño varón de 1 año de edad con leucemia monocítica aguda (ref: Int. J. Cáncer 26 (1980) :171) . La presente invención se relaciona con el uso de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos descritas en la presente en el estudio, diagnóstico y tratamiento de estados de enfermedad asociados con enfermedad inflamatoria,-enfermedad autoinmune; y malignidad de origen de célula mieloide en estados de enfermedad tales como arteriosclerosis, leucemia, lupus eritematoso sistémico, osteoporosis, artritis reumatoide, y síndrome de choque tóxico así como rechazo a los injertos y enfermedad de injerto contra huésped. La presente invención también se relaciona con el uso de RCP y las células huéspedes tratadas mediante ingeniería genética que expresan RCP para evaluar y seleccionar sustancias y compuestos que modulan la actividad del RCP. La presente invención se basa en parte en la presencia de secuencias de nucleótidos que codifican RCP en una muestra aleatoria de 2214 secuencias utilizables en una biblioteca de ADNc hecha de células THP-l- tratadas con 100 ng/mililitro de éster forbólico, seguido por un cultivo de 4 horas en un medio que contiene l ug/mililitro de LPS. La presente invención se basa además en parte en la homología de aminoácidos que RCP comparte con la catepsina C de rata, como se ilustra en la Figura 2. Basado en la secuencia de la catepsina C de rata descrita en Kominami, supra, además de la combinación de hidrofobicidad representada en la Figura 3, la secuencia de señal para la catepsina homologa representada en las Figuras 1A-1B parece terminar en la región entre los residuos de aminoácidos 21 (Ala) y 22 (Val) y la región entre los residuos de aminoácidos 28 (Ala) y 29 (Asn) . Por lo tanto, la región de proproteína del homólogo de Catepsina C humana representada en las Figuras 1A-1B parece comenzar entre los residuos de aminoácidos 22 y 28, inclusive, y terminar en el residuo de aminoácido 230 (His) . Basado 3en la s3ecuencia de captesina C de reta, la secuencia de la proteína madura para la Captesina C humana, representada en las Figuras lA y IB comienza en el residuo de aminoácido 231 (Leu) y termina en el residuo de aminoácido 463 (Leu) . Kominami, supra, discute que las proteasas de cisteína pueden existir como dos formas de cadena producidas por disociación de la enzima madura y reporta que el análisis N-terminal de la catepsina C purificada de rata mostró dos secuencias diferentes de N-términos las cuales probablemente representan la secuencia N-terminal de cada una de las cadenas. Además, la Catepsina C a partir de células de hepatoma 7777 se reporta ser sintetizada y procesada en formas maduras de 18 kDa y 6 kDa. Por homología con la Captesina C de rata, la homologa de Captesina C humana madura representada en las Figuras 1A-1B, parece contener dos secuencias diferentes de N-términos que pueden representar la secuencia N-terminal de cada una de las dos cadenas. La presente invención, por lo tanto, se basa en la identificación de una nueva homologa de la Captesina C, RCP, que se asocia con inflamación y enfermedad. En una modalidad específica en la presente, la región de proproteína de la homologa de Catepsina C que comienza entre los residuos de aminoácidos 22 y 29, inclusive, y termina en el residuo de aminoácido 230, se administra como un antagonista del homologa de la catepsina C en condiciones en donde es deseable bloquear su actividad tal como en la enfermedad inflamatoria; enfermedad autoinmune; y malignidad de origen de célula mieloide en estados de enfermedad tales como arteriosclerosis, leucemia, lupus eritematoso sistémico, osteoporosis, artritis reumatoide, y síndrome de choque tóxico así como rechazo a los injertos y enfermedad de injerto contra huésped. "Secuencia de ácidos nucleicos" como se emplea en la presente se refiere a una secuencia de oligonucleótidos, nucleótidos o polinucleótidos, y fragmentos o porciones de las mismas, y a ADN o ARN de origen genómico o sintético que pueden ser de cadena doble o de cadena sencilla, ya sea representando la cadena con sentido o de antisentido. Como se emplea en la presente "secuencia de aminoácidos" se refiere a secuencias de péptidos o proteínas o porciones de los mismos.

Como se usa en la presente, "rcp" con minúsculas se refiere a secuencia de ácidos nucleicos, mientras que "RCP" con mayúsculas se refiere a secuencia de proteína. Como se emplea en la presente, ácido nucleico péptido (PNA) se refiere a una clase de moléculas de información que tienen una estructura neutra "parecida a péptido" con nucleobases que dejan a las moléculas hibridizarse con ADN o ARN. complementarios con una afinidad y especificidad mayores que los oligonucleótidos correspondientes (PerSeptive Biosystems 1-800-899-5958) . Como se emplea en la presente, RCP abarca RCP de cualquier fuente humana, en ocurrencia natural o en forma de variante, o a partir de fuentes naturales, sintéticas, semisintéticas o recombinantes. Como se emplea en la presente, el término "monocitos activados" se refiere a los monocitos maduros o macrófagos, activados encontrados en tejidos activos inmunológicamente. Como se emplea en la presente, el término "desórdenes de monocito/macrófago" incluye, pero no se limita a arteriosclerosis, leucemia, lupus eritematoso sistémico, osteoporosis, artritis reumatoide, y síndrome de choque tóxico. Como se emplea en la presente, "que ocurre naturalmente" se refiere a RCP con una secuencia de aminoácidos que se encuentra en la naturaleza, y "activo biológicamente" se refiere a RCP que tiene las funciones estructurales, reguladoras o bioquímicas del RCP que ocurre naturalmente, incluyendo la actividad inmunológica. RCP que ocurre naturalmente también abarca los RCP que surgen de las modificaciones posteriores a la traducción del polipéptido incluyendo pero no limitado a acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación.- Como se emplea en la presente, "actividad inmunológica" se define como la capacidad del RCP natural, recombinante o sintético o cualquier oligopéptido del mismo, de inducir una respuesta inmune específica en los animales o células apropiados y de unirse con anticuerpos específicos. El término "derivado" como se emplea en la presente se refiere a la modificación química de un RCP. Ilustrativo de esas modificaciones es el reemplazo de hidrógeno por un grupo alquilo, acilo, o amino. Un derivado de polipéptido RCP retiene características biológicas esenciales de un RCP que ocurre naturalmente. Un derivado de RCP también se refiere a los polipéptidos RCP derivados de RCP que ocurre naturalmente mediante modificaciones químicas tales como ubiquitinación, etiquetado (v. gr. con radionuclidos, diversas enzimas, etc.) pegilación (derivación con glicol de polietileno) , o mediante la inserción o sustitución por síntesis química de aminoácidos tales como ornitina, que no ocurren normalmente en las proteínas humanas . Como se emplea en la presente, el término "purificado" se refiere a moléculas, ya sea de secuencias de nucleicos o aminoácidos, que se remueven de su ambiente natural y se aislan o separan de cuando menos otro componente con el cual éstas están asociadas naturalmente. "RCP variante recombinante" se refiere a cualquier polipéptido de RCP que difiere del RCP que ocurre naturalmente mediante inserciones, supresiones' y sustituciones de aminoácidos creadas usando técnicas de ADN recombinante . La guía para determinar cuáles residuos de aminoácidos se pueden reemplazar, añadir o suprimir sin abolir las actividades de interés, tales como adhesión celular y quimiotaxis, se pueden encontrar comparando la secuencia del RCP particular con el de las citocinas homologas y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos hechos en las regiones de homología alta. Preferiblemente, "sustituciones" de aminoácidos son el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas, tales como el reemplazo de leucina con una isoleuc'ina o valina, un aspartato con un glutamato, o una treonina con una serina, o sea, reemplazos de aminoácidos conservador. Las "Inserciones" o "supresiones" están típicamente en el rango de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse experimentalmente haciendo sistemáticamente inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos en una molécula RCP usando técnicas de ADN recombinante y probando la actividad de las variantes recombinantes resultantes. Cuando se desea, una "secuencia señal o encabezadora" puede dirigir al polipéptido a través de la membrana de una célula. Esta secuencia puede estar naturalmente presente en los polipéptidos de la presente invención o proporcionarlos de fuentes de proteína heteróloga mediante técnicas de ADN recombinante . Como se usa en la presente, una referencia a "fragmento", "porción", o "segmento" de RCP es una extensión de residuos de aminoácidos que tiene suficiente longitud para desplegar actividad biológica y/o inmunogénica y en las modalidades preferidas contendrá cuando menos aproximadamente 5 aminoácidos, cuando menos 7 aminoácidos, cuando menos aproximadamente de 8 a 13 aminoácidos, y, en modalidades adicionales, aproximadamente 17 o más aminoácidos. Como se usa en la presente, un "oligonucleótido" o "fragmento", "porción", o "segmento" de polinucleótido se refiere a cualquier extensión de residuos de aminoácido que tiene la longitud suficiente para desplegar actividad biológica y/o inmunogénica y en las modalidades preferidas contendrán cuando menos a 5 aminoácidos, cuando menos aproximadamente 7 aminoácidos, cuando menos aproximadamente 8 aminoácidos, y, en modalidades adicionales, aproximadamente 17 o más aminoácidos.

Como se emplea en la presente, un "oligonucleótido" o "fragmento" "porción" o "segmento" de polinucleótido, se refiere a cualquier extensión de ácidos nucleicos que codifican RCP que es de la longitud suficiente para usarse como un cebador en la reacción de cadena de polimerasa (PCR) o diversos procedimientos de hibridización conocidos por los expertos en la técnica, con el fin de 'identificar o amplificar ácidos nucleicos idénticos o relacionados. La presente invención incluye polipéptidos de RCP purificados a partir de fuentes naturales o recombinantes, vectores y células huéspedes transformadas con moléculas de ácidos nucleicos que codifican RCP. Diversos métodos para el aislamiento de los polipéptidos de RCP se pueden obtener por procedimientos muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, esos polipéptidos se pueden purificar mediante cromatografía por inmunoafinidad empleando los anticuerpos proporcionados por la presente invención. Varios otros métodos de purificación de proteínas muy conocidos en la técnica incluyen los descritos en Deutscher M. (1990) Methods in Enzymology, Vol. 182, Academic Press, San Diego,- y Scopes R. (1982) Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, NYC, ambos incorporados en la presente mediante referencia. Como se emplea en la presente, el término "recombinante" se refiere a un polinucleótido que codifica RCP y se prepara usando técnicas de ADN recombinante. El polinucleótido que codifica RCP también puede incluir variantes alélicos o recombinantes y mutantes de los mismos. Como se emplea en la presente, el término "sonda" o "sonda de ácido nucleico" o "sonda de oligonucleótido" se refiere a una porción, fragmento, o segmento de RCP que es capaz de ser hibridizado con respecto a una secuencia de nucleótido meta deseada. Una sonda se puede usar para detectar, amplificar o cuantificar los ADNc o ácido nucleico endógeno que codifica RCP, empleando técnicas convencionales en biología molecular. Una sonda puede ser de longitud variable, preferiblemente desde a 10 nucleótidos hasta varios cientos de nucleótidos. Como entenderán los expertos en la técnica, las condiciones de hibridización y el diseño de la sonda variará dependiendo del uso prentendido. Por ejemplo, una sonda pretendida para usarla en PCR será de aproximadamente 15 a 60 nucleótidos de longitud y puede ser parte de una combinación de sondas degeneradas, o sea, oligonucleótidos que toleran errores de apareamiento pero se adaptan a unirse a una secuencia desconocida,- en donde una sonda para usarse en hibridizaciones de Southern o northern pueden ser una secuencia de nucleótidos sencilla, específica, que tiene varios cientos de nucleótidos de longitud. Las sondas de ácidos nucleicos pueden comprender porciones de la secuencia que tiene menos nucleótidos de aproximadamente 6 kb y usualmente menos de 1 kb. Las sondas de oligonucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención se pueden usar para determinar si el ácido nucleico que codifica RCP está presente en una célula o tejido o para aislar secuencias de ácidos nucleicos idénticas o similares a partir de ADN cromosómico como lo describen Walsh PS y colaboradores (1992 PCR Methods Appl 1:241-250) . De acuerdo con lo anterior, .una sonda preferida para la detección específica de RCP comprenderá un fragmento de polinucleótido u oligonucleótido a partir de una región de nucleótidos no conservada de la SEQ ID NO:l. Como se emplea en la presente, el término "región de nucleótidos no conservada" se refiere a una región de nucleótidos que es exclusiva de la SEQ ID NO:l y no comprende una región que se conserva en catepsina C. Las sondas pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble y pueden tener especificidad en hibridizaciones basadas en solución, célula, tejido o membrana, incluyendo tecnologías in si tu y parecidas a ELISA. Las sondas de ácidos nucleicos de la presente invención se pueden derivar de ácidos nucleicos que ocurren naturalmente o de ácidos nucleicos recombinantes de cadena sencilla o de cadena doble, o ser sintetizados químicamente. Estos se pueden etiquetar mediante traducción de muescas, reacción de relleno de Klenow, PRC u otros métodos muy conocidos en la técnica. Las sondas de la presente invención, su preparación y/o etiquetado se elaboran en Sambrook J. y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; o Ausubel FM y colaboradores (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYC, ambos incorporados a la presente mediante referencia. Alternativamente, las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de la presente invención se pueden sintetizar o identificar a través de técnicas de hibridización conocidas por los expertos en la técnica haciendo uso de la "redundancia" en el código genético. Se pueden introducir diversas sustituciones de codones, tales como los cambios silenciosos que producen varios sitios de restricción, para optimizar la clonación dentro de un vector de plásmido o viral o expresión en un sistema procariótico o eucariótico. También se pueden introducir mutaciones para modificar las propiedades del polipéptido, por ejemplo, para cambiar la degradación del polipéptido y la velocidad de vuelco. Descripción Secuencias de codificación de RCP La secuencia de nucleótidos de la RCP humana (SEQ ID NO:l) se muestra en la Figura l. Parte de la región de codificación para RCP se identificó inicialmente dentro de la biblioteca de ADNc hecha a partir de células THP-l tratadas con PMA y LPS (biblioteca INCYTE THP1PLB01) , en donde se encontró una vez en aproximadamente 2214 secuencias utilizables. Como se emplea en la presente, el término "secuencias utilizables" se refiere al número total de clonas en una biblioteca de ADNc después de la remoción del vector, repeticiones de nucleótidos, contaminación y ADN mitocóndrico. Una búsqueda BLAST (Basical Local Alignment Search Tool; Altschul SF (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul SF y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410) que compara los ADNc de la biblioteca THP1PLB01 contra la base de datos de primate de GenBank identificada la Clona Incyte 14284 identificada como una catepsina C. Las secuencias de nucleótidos que codifican RCP se han encontrado en bibliotecas de ADNc hechas de tejido de vejiga (biblioteca INCYTE BLADNOT01) ,- células mononucleares (2 horas de cultivo) adherentes a plástico, aisladas de unidades de recubrimiento de regulador obtenidas a partir del banco de Sangre Stanford (biblioteca INCYTE MPHGNOT03) ,- tejido sinovial de cadera reumatoide (librería INCYTE SYNORAB01) ; placenta normal (biblioteca INCYTE PLACNOB01) ; células mononucleares adherentes a plástico recolectadas el segundo día de un cultivo de linfocito mezclado (MLR) (biblioteca INCYTE MMLR2DT01) ; células THP-l cultivadas durante 48 horas con 100 ng/mililitros de éster forbólico (PMA) (biblioteca INCYTE THP1PEB01) ,• tejido sinovial de codo reumatoide (biblioteca INCYTE SYNORAT01) ; línea celular hNT2 derivada de un tetracarcinoma humano, que exhibía propiedades características de un precursor neuronal comprometido en un estadio de desarrollo temprano, tratado con lOµm de ácido retinóico durante 24 horas antes del aislamiento del ARN (biblioteca INCYTE HNT2RAT01) ; 1infoblastos T/B de una fuente leucémica (biblioteca INCYTE TBLYNOT01) ,- queratinocitos neonatales derivados de piel de pierna (biblioteca INCYTE KERANOT01) ,-células mononucleares de sangre periférica no adherentes y adherentes, reacción de linfocitos mezclados 96 horas (MLR) (biblioteca INCYTE TMLR3DT01) ,- línea celular hNT2 derivada de un tetracarcinoma humano (biblioteca INCYTE HNT2NOT01) ,- tejido pulmonar (biblioteca INCYTE LUNGNOT01) ,- células de sangre periférica aféresis de un paciente varón de 48 años de edad diagnosticado con Síndrome hipereosinofílico (biblioteca INCYTE EOSIHET01) ; células mononucleares derivadas de una población de donadores combinada después de centrifugación Ficoll Hypaque y 72 horas de cultivo in vivo flibrería INCYTE MMLR3DT01) ,- y tejido de colon sigmoide de un individuo que tiene enfermedad de Crohn (biblioteca INCYTE COLNNOT05) . Debido a que RCP se expresa en células THP, o sea, monocitos de leucemia monocítica, la sangre de un individuo con Síndrome Hipereosinofílico, tejido de colon de un individuo que tiene enfermedad de Crohn, células derivadas de un tetratocarcinoma humano, células T/B de leucemia y sinovia reumatoide, los ácidos nucleicos (rcp) , polipéptidos (RCP) y anticuerpos contra RCP son útiles para ensayos de diagnóstico para la detección de secuencias de nucleótidos o aminoácidos de RCP asociados con inflamación y enfermedad y puede acelerar diagnósticos y el tratamiento apropiado. Los métodos para secuenciamiento de ADN se conocen bien en la técnica y emplean enzimas como el fragmento de Klenow de polimerasa I de ADN, Sequenase® (US Biochemical Corp. Cleveland OH), Taq polimerasa' (Perkin Elmer, Norwalk CN) , polimerasa T7 termoestable (Amersham, Chicago IL) , o combinaciones de polimerasas recombinantes y exonucleasas de prueba de lectura como el Sistema de Amplificación ELONGASE comercializado por Gibco BRL (Gaithersburg MD) . Métodos para extender el ADN de un cebador oligonucleótido recocido correspondiente al templado de ADN de interés se han desarrollado tanto para templados de cadena simple como de cadena doble. Los productos de la reacción de terminación de la cadena se separaron usando electroforesis y se detectaron vía sus precursores etiquetados, incorporados. Mejoramientos recientes en la preparación de la reacción mecanizada, secuenciamiento y análisis han permitido la expansión en el número de secuencias que se pueden determinar por día. Preferiblemente, el proceso se automatiza con máquinas como la Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno NV) , Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown MA) y el Catalizador ABI Catalyst 800 y secuenciadores de ADN 377 y 373 (Perkin Elmer, Norwalk CN) .

La calidad de cualquier biblioteca de ADNc particular en la cual se encuentran los polinucleótidos que codifica el RCP se puede determinar realizando un análisis a escala piloto de los ADNc y verificando porcentajes de clonas que contiene vector, lambda o ADN de E. coli , ADN mitocóndrico o repetitivo, y clonas con coincidencias exactas u homologas con respecto a bases de datos públicas. Las secuencias de nucleótidos que codifican RCP (o su complemento) tienen numerosas aplicaciones en técnicas conocidas para los expertos en la técnica de biología molecular. Estas técnicas incluyen el uso como sondas de hibridización, el uso en la construcción de oligómeros para PCR, el uso de mapeo de cromosoma y gen, uso en la producción recombinante de RCP, y uso en generación de ADN o ARN antisentido, sus análogos químicos y similares. Los usos de nucleótidos que codifican RCP descritos en la presente son ejemplares de técnicas conocidas y no pretenden limitar su uso en ninguna técnica conocida a una persona de experiencia ordinaria en la técnica. Además, las secuencias de nucleótidos descritas en la presente se pueden usar en técnicas de biología molecular que no se han desarrollado todavía, a condición de que las nuevas técnicas se basen en propiedades de secuencias de nucleótidos que se conocen actualmente, por ejemplo, el código genético de triplete y las interacciones específicas de pares dé bases.

Los expertos en la técnica apreciarán que como resultado de la degeneración del código genético, se puede producir una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican RCP, algunas que llevan la homología mínima a la secuencia de nucleótidos de cualquier gen conocido y que se presenta naturalmente. La invención ha contemplado específicamente cada una y toda variación posible de secuencia de nucleótidos que puede codificar RCP seleccionando combinaciones basadas en posibles elecciones de codón. Estas combinaciones se hacen de acuerdo con el código genético estándar de triplete como se aplica a la secuencia de nucleótidos de RCP que se presenta naturalmente, y todas estas variaciones se considerarán como que se están describiendo específicamente . Aunque las secuencias de nucleótidos que codifican RCP y/o sus variantes son preferiblemente capaces de hibridizar a la secuencia de nucleótido del RCP que se presenta naturalmente bajo condiciones estrictas, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifican RCP o sus derivados que poseen un uso de codón sustancialmente diferente. Se pueden seleccionar codones para aumentar la velocidad a la cual se presenta la expresión del péptido en un huésped de expresión procariótico o eucariótico particular de acuerdo con la frecuencia con la cual el huésped utiliza codones particulares. Otras razones para alterar sustancialmente la secuencia de nucleótidos que codifica RCP y/o sus derivados sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada incluyen la producción de transcritos de ARN que tienen más propiedades deseables, como una mayor vida media, que los transcritos producidos de la secuencia que se presenta naturalmente . Las secuencias de nucleóti?os que codifican RCP se pueden unir a una variedad de otras secuencias de nucleótidos mediante técnicas de ADN recombinante bien establecidas (cf Sambrook J. y colaboradores supra) . Secuencias de nucleótidos útiles para unir al RCP incluyen una clasificación de vectores de clonación, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, derivados de fago lambda, fagomidas, y similares que son muy conocidos en la técnica. Los vectores de interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas, vectores de secuenciamiento, y similares. En general, los vectores de interés pueden contener un origen de replicación funcional en cuando menos un organismo, sitios sensibles de endonucleasa de restricción convenientes, y marcadores seleccionables para la célula huésped. El conocimiento de la secuencia completa, correcta, de ADNc del nuevo gen de captesina C permitirá su uso en tecnología antisentido en la investigación de la función del gen. Oligonucleótidos, fragmentos genómicos o de ADNc que comprenden la cadena antisentido de rcp se pueden usar ya sea in vitro o en vivo para inhibir la expresión de la proteína. Esta tecnología se conoce bien en la técnica y se pueden diseñar sondas en varios lugares a lo largo de la secuencia de nucleótidos. Mediante el tratamiento de las células o de animales de prueba enteros con estas secuencias antisentido, el gen de interés se puede efectivamente parar. Frecuentemente se puede comprobar la función del gen observando el comportamiento a nivel celular, del tejido u organismo (por ejemplo letalmente, pérdida de función diferenciada, cambios en morfología, etcétera) . Además de usar secuencias construidas para interrumpir la transcripción del cuadro de lectura abierto, se pueden obtener modificaciones de la expresión del gen designando secuencias antisentido en regiones de intrón, promotor/elementos mejoradores, o aún transactivando genes reguladores . De manera similar se puede lograr la inhibición usando metodología de pares de base Hogeboom, también conocida como apareamiento de base de "triple hélice". Un aspecto de la presente invención es proporcionar sondas de hibridización de ácido nucleico específica para RCP capaces de hibridización con secuencias de nucleótidos que se presentan naturalmente que codifican RCP. Estas sondas también se pueden usar para la detección de secuencias similares que codifican catepsina C y deberán preferiblemente contener cuando menos 50 por ciento de los nucleótidos de la SEQ ID N0:1. Las sondas de hibridización de la presente invención se pueden derivar de las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID N0:1 o de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos mejoradores y/o intrones posibles de los RCP respectivos que se presentan naturalmente. Las sondas de hibridización se pueden etiquetar mediante una variedad de grupos reporteros, incluyendo radionüclidos como J P o JS . o etiquetas enzimáticas como fosfatasa alcalina acoplada con la sonda vía sistemas de acoplamiento avidina/biotina, y similares. La reacción de cadena de polimerasa como se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números : 4,683,195; 4,800,195; y 4 , 965 , 188 proporciona usos adicionales para oligonucleótidos basados en la secuencia de nucleótidos que codifica RCP. Estas sondas usadas en reacción de cadena de polimerasa pueden ser de origen recombinante, pueden sintetizarse químicamente, o una mezcla de ambas y comprende una secuencia de nucleótidos discreta para uso de diagnóstico o una combinación degenerada de secuencias posibles para la identificación de secuencias genómicas cercanamente relacionadas . Otro medio para producir sondas de hibridización específicas para ADN de RCP incluye la clonación de secuencias de ácidos nucleicos que codifican RCP o derivados de RCP en vectores para la producción de sondas de ARNm. Estos vectores se conocen en la técnica y están disponibles comercialmente y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de la polimerasa de ARN adecuada como polimerasa de ARN T7 o SP6 y los nucleótidos etiquetados radioactivamente adecuados . Ahora es posible producir una secuencia de ADN, o porciones de la misma, que codifica RCP y sus derivados enteramente mediante química sintética, después de lo cual el gen se puede insertar en cualquiera de los muchos vectores de ADN disponibles usando reactivos, vectores y células que se conocen en la técnica en el momento de la presentación de esta solicitud. Más aún, se puede usar química sintética para introducir mutaciones en las secuencias de RCP de cualquier porción de la misma. ° La secuencia de nucleótidos se puede usar en cualquier ensayo para detectar inflamación o enfermedad asociada con niveles anormales de expresión de RCP. La secuencia de nucleótidos se puede etiquetar mediante métodos conocidos en la técnica y añadir a un fluido o muestra de tejido de un paciente, como por ejemplo sinovia reumatoide, bajo condiciones de hibridización. Después de un período de incubación, se lava la muestra con un fluido compatible que opcionalmente contiene un tinte (u otra etiqueta que requiera un revelador) si el nucleótido ha sido etiquetado con una enzima. Después de que el fluido compatible se enjuaga, el tinte se cuantifica y se compara con un estándar. Si la cantidad de tinte es significativamente elevada, la secuencia de nucleótido se ha hibridizado con la muestra, y la prueba indica la presencia de inflamación y/o enfermedad. La secuencia de nucleótidos para RCP se puede usar para construir sondas de hibridización para mapear ese gen. La secuencia de nucleótidos proporcionada en la presente se puede mapear en un cromosoma particular o en regiones específicas de ese cromosoma usando técnicas de mapeo genético y/o cromosómico muy conocidas. Estas técnicas incluyen hibridización en el sitio, análisis de enlace contra marcadores cromosómicos conocidos, análisis de hibridización con bibliotecas, preparaciones cromosómicos clasificadas por flujo, o construcciones de cromosomas artificiales, construcciones YAC o Pl . Se ha descrito la técnica de hibridización fluorescente in situ de propagaciones de cromosomas y otras técnicas físicas de mapeo de cromosomas se pueden correlacionar con datos de mapeo genético adicional. Ejemplos de datos de mapeo genético se pueden encontrar en el 1994 Genome Issue of Science (265,-l981f) . La correlación entre la localización de RCP en un mapa cromosómico físico y una enfermedad específica (o predisposición a una enfermedad específica) puede ayudar a delimitar la región de ADN asociada con esa enfermedad genética. La secuencia de nucleótidos de la presente invención se puede usar para detectar diferencias en la secuencia del gen entre individuos normales y portadores o afectados . Expresión de RCP Se pueden usar las secuencias de nucleótidos que codifican RCP para producir RCP purificados usando métodos muy conocidos de tecnología de ADN recombinante. En una modalidad se expresa el ácido nucleico que codifica el RCP maduro, en otra modalidad, se expresa el ácido nucleico que codifica la secuencia de proproteína y el RCP maduro, y en todavía otra modalidad, se expresa el ácido nucleico que codifica la secuencia de proproteína. Entre las muchas publicaciones que muestran métodos para la expresión de genes después de que han sido aislados está Goeddel (1990) Gene Expression Technology, Methods and Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego CA. El RCP se puede expresar en una variedad de células huésped, ya sea procarióticas o eucarióticas . Las células huésped pueden ser de las misma especie de la cual son endógenas las secuencias de nucleótidos de RCP o de una especie diferente. Las ventajas de producir'RCP por tecnología de ADN recombinante incluye obtener cantidades adecuadas de la proteína para purificación y la disponibilidad de procedimientos de purificación simplificados. La expresión de RCP puede elevarse a cabo subclonando los ADNc en vectores de expresión adecuados y transfectando los vectores en huéspedes de expresión adecuada. En una modalidad, un vector de expresión es uno que provee la expresión de una proteína de fusión que comprende RCP y contiene ácido nucleico que codifica 6 residuos de histidina seguidos de tiorredoxina y un sitio de disociación de enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación en IMIAC (cromatografía de afinidad de iones de metal inmovilizados como se describe en Porath y colaboradores (1992) Protein Expression and Purification 3:263-281) mientras que el sitio de disociación de enteroquinasa proporciona un medio para purificar la quemoquina de la proteína de fusión. El vector de clonación previamente usado para la generación de la biblioteca de tejido también provee la expresión de la secuencia de RCP en E. coli . Ya que las inserciones de clonas de ADNc se generan mediante un proceso esencialmente aleatorio, hay una oportunidad en tres que el ADNc incluido caiga en el cuadro correcto para la traducción adecuada. Si el ADNc no está en el cuadro de lectura adecuado, se puede obtener por supresión o inserción del número adecuado de bases mediante métodos muy conocidos que incluyen mutagénesis in vi tro, digestión con exonucleasa III o nucleasa de frijol mungo, o una inclusión de enlace de oligonucleótidos. El ADNc de RCP se puede transportar en otros vectores conocidos por ser útiles para la expresión de proteína en huéspedes específicos. Los amplímeros de oligonucleótidos que contienen sitios de clonación así como un segmento de ADN suficiente para hibridizar en estiramientos en ambos extremos del ADNc objetivo (25 bases) se puede sintetizar químicamente mediante métodos estándar. Estos cebadores se pueden usar luego para amplificar los segmentos de gen deseados mediante reacción de cadena de polimerasa. Los segmentos de gen nuevos resultantes pueden ser digeridos con enzimas de restricción adecuadas bajó condiciones estándar y aislarlas mediante electroforesis en gel. Alternativamente, se pueden producir segmentos de gen similares mediante la digestión del ADNc con enzimas de restricción adecuadas y llenar los segmentos de gen que faltan con oligonucleótidos sintetizados químicamente. Los segmentos de la secuencia de codificación de más de un gen se pueden ligar entre sí y clonarse en vectores adecuados para optimizar la expresión de la secuencia recombinante. Huéspedes de expresión convenientes para estas moléculas quiméricas incluyen pero no se limitan a células de mamíferos como Ovario de Hámster Chino (CHO) y células 293 humanas, células de insectos como las células Sf9, células de levaduras como Saccharomyces cerevisiae, y bacterias como E. coli . Para cada uno de estos sistemas de célula, se puede incluir un vector de expresión útil como origen de replicación para permitir la propagación en bacterias y un marcador seleccionable como el gen de resistencia al antibiótico ß -lactamasa para permitir la selección en bacterias. Además, los vectores pueden incluir un segundo marcador seleccionable como el gen de fosfotransferasa de neomicina para permitir la selección en células huéspedes eucarióticas transfectadas. Los vectores para su uso en huéspedes de expresión eucarióticas pueden requerir elementos de procesamiento de ARN como secuencias de 3' poliadenilación si estas no son parte del ADNc de interés . Adicionalmente, el vector puede contener promotores o mejoradores que aumentan la expresión del gen. Estos promotores son específicos de huésped e incluyen promotores MMTV, SV40, o metalotionina para células de ovario de hámster chino,- promotores trp, lac o T7 de huéspedes bacterianos, o promotores de factor alfa, oxidasa de alcohol o PGH para levadura. Los mejoradores de transcripción, como el mejorador de virus sarcoma de rous (RSV) , se pueden usar en células huéspedes de mamíferos. En cuanto los cultivos homogéneos de células recombinantes se obtienen a través de métodos de cultivo estándar, grandes cantidades de RCP producidos recombinantemente se pueden recuperar del medio condicionado y analizar usando métodos cromatográficos conocidos en la técnica. Las células transformadas con ADN que codifica RCP se pueden cultivar bajo condiciones convenientes para la expresión de catepsina C y la recuperación de la proteína del cultivo celular. RCP producido por una célula recombinante se puede secretar o puede estar contenida intracelularmente, dependiendo de la construcción genética particular usada. En general, es más conveniente preparar proteínas recombinantes en forma secretada. Los pasos de purificación varían con el proceso de producción y la proteína particular producida. El RCP se puede expresar como una proteína quimérica con uno o mas dominios de polipépti-do adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína. Estos dominios de facilitación de la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metal como módulos de histidina-triptofano que permiten la purificación sobre metales inmóviles, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmóvil, y el dominio utilizado en el sistema de purificación FLAGS de extensión/afinidad (Immunex Corp., Seattle WA) . La inclusión de una secuencia de enlazador disociable como el Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego CA) entre el dominio de purificación y la secuencia de RCP puede ser útil para facilitar la expresión de RCP. Además de la producción de recombinantes, los fragmentos de RCP se pueden producir mediante síntesis de péptidos directa, usando técnicas de fase sólida (cf . Steward y colaboradores (1989) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco, CA, Merrifield J (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154. La síntesis de proteína in vi tro se puede realizar usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos 431A de Applied Biosyste s (Foster City, California CA) de acuerdo con las instrucciones proporcionados por el fabricante. Varios fragmentos de RCP se pueden sintetizar químicamente por separado y combinado usando métodos químicos para producir la molécula de longitud completa. RCP anticuerpos El RCP para la inducción de anticuerpos no requiere actividad biológica,- sin embargo, la proteína debe ser antígena. Los péptidos usados para inducir anticuerpos específicos pueden tener una secuencia de aminoácido que consiste en cuando menos cinco aminoácidos, preferiblemente cuando menos 10 aminoácidos. Deberán imitar una porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína y pueden contener la secuencia de aminoácidos entera de una molécula pequeña que se presenta naturalmente como el RCP . Los tramos cortos de aminoácidos de RCP se pueden fundir con lss de otra proteína como la hemocianina limpeto de ojo de cerradura y la molécula quimérica usada para la producción de anticuerpos. Los anticuerpos específicos para RCP se pueden producir mediante la inoculación de un animal adecuado con el polipéptido o un fragmento de antígeno. En la presente invención el polipéptido puede ser la secuencia del RCP maduro, la secuencia de proproteína o la secuencia de proproteína y de RCP maduro o un polipéptido que comprende una secuencia de señal, la secuencia de proproteína y la secuencia madura. Un anticuerpo es específico para RCP si se produce contra un epítope de un polipéptido y se une a cuando menos parte de la proteína natural o recombinante. La producción de anticuerpos incluye no solamente la estimulación de una respuesta inmune por inyección en animales, sino también pasos análogos en la producción de anticuerpos sintéticos u otras moléculas de enlace específico como la selección de bibliotecas de inmunoglobulina recombinante (cf . Orlandi R y colaboradores (1989) PNAS 86:3833-3837, o Huse WD y colaboradores (1989) Science 256:1275-1281) o la estimulación in vi tro de poblaciones de linfocitos. La tecnología actual (Winter G y Milstein C (1991) Nature 349:293-299) proporciona un número de reactivos de enlace altamente específicos basados en los principios de la formación de anticuerpos. Estas técnicas se pueden adaptar para producir moléculas que enlazan específicamente RCP. Los expertos en la técnica conocen varios métodos para preparar anticuerpos monoclonales y policlonales para RCP. En una forma de aproximación, RCP desnaturalizado de la separación de cromatografía de líquida de alto rendimiento de fase inversa se obtiene y usa para inmunizar ratones o conejos usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

Aproximadamente 100 microgramos son adecuados para la inmunización de un ratón, mientras que se podría usar hasta 1 miligramo para la inmunización de un conejo. Para identificar hibridomas de ratón, se puede radioyodinizar la proteína desnaturalizada y usarla para seleccionar hibridomas potenciales de células B murinas potenciales para aquellos que prevén anticuerpo. Este procedimiento requiere solamente pequeñas cantidades de proteína, de manera que 20 miligramos serían suficientes para etiquetar y seleccionar varios miles de clonas. En otra forma de aproximación, la secuencia de aminoácidos de RCP, como se deduce de la traducción de la secuencia de ADNc, se analiza para determinar regiones de alta inmunogenicidad. Los oligopéptidos que comprenden regiones hidrofílicas, como se muestra en la Figura 3, se sintetizan y usan en protocolos de inmunización convenientes para cultivar anticuerpos. Los análisis para seleccionar los epítopes adecuados se describe por Ausubel FM y colaboradores (1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYC) . Las secuencias de aminoácidos óptimas para la inmunización usualmente están en el C-término, el N-término y las regiones de intervención, hidrofílicas del polipéptido que más probablemente se van a exponer al ambiente externo cuando la proteína está en su forma natural . Típicamente, los péptidos seleccionados, aproximadamente de 15 residuos de longitud, se sintetizan usando un sintetizador de péptidos Modelo 431A de Applied Biosystems usando fmoc-química y acoplado a hemocianina de limpeto de ojo de cerradura (KLH, Sigma) mediante la reacción con éster M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimídico (MBS; cf. Ausubel FM y colaboradores, supra) . Si es necesario, se puede introducir una cisteína en el N-término del péptido para permitir el acoplamiento con KLH y animales pueden ser inmunizados con el complejo de péptido-KLH en adyuvante de Freund completo. El antisuero resultante se puede probar para ver si hay actividad antipéptido enlazando el péptido a plástico, bloqueando con 1 por ciento de albúmina de suero bovino, haciendo reaccionar con antisuero, lavando y reaccionando con inmunoglobulina anti-conejo específica de cabra, de afinidad purificada, etiquetada radiactiva o fluorescente) . Los hibridomas también se pueden preparar y analizar usando técnicas estándar. Los hibridomas de interés se pueden detectar seleccionando con RCP etiquetada para identificar las fusiones que producen el anticuerpo monoclonal con la especificidad deseada. En un protocolo típico, pozos de charolas (FAST; Becton-Dickinson, Palo Alto, CA) se recubren con anticuerpos específicos de conejo antirratón con afinidad purificada (o Ig antiespecie conveniente) a 10 miligramos/mililitro. Los pozos recubiertos se bloquearon con 1 por ciento de albúmina de suero bovino, se lavaron y expusieron a sobrenadantes de hibridomas . Después de la incubación, se expusieron los pozos a RCP etiquetada a 1 miligramo/mililitro. Las clonas que producen anticuerpos se unieron una cantidad de RCP etiquetada la cual es detectable por encima del fondo. Estas clonas se pueden expandir y someter a 2 ciclos de clonación a1 dilución limitante (1 célula/3 pozos) . Los hibridomas clonados se inyectan en ratones tratados con prisano para producir ascitos, y se puede purificar anticuerpo monoclonal a partir de fluido ascítico de ratón por cromatografía por afinidad usando proteína A. Los anticuerpos monoclonales con afinidades de cuando menos 10° M" , preferiblemente 109 a 1010 o más fuerte, típicamente estarán hechos por procedimientos estándar como se describe en Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory New York; y en Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, New York City, ambos incorporados en la presente mediante referencia. Usos de secuencias de nucleótidos y aminoácidos para RCP Anticuerpos, inhibidores, o antagonistas de RCP (u otros tratamientos para la producción excesiva de RCP) pueden proporcionar diferentes efectos cuando se administran terapéuticamente en el tratamiento de enfermedades inflamatorias; enfermedades autoinmunes, y malignidades de origen de células mieloides en estados de enfermedad como arteriosclerosis, leucemia, lupus eritematoso sistémico, osteoporosis, artritis reumatoide, y síndrome de choque tóxico así como rechazo al injerto y enfermedad de injerto contra huésped. Los tratamientos por producción excesiva de RCP, como anticuerpos, inhibidores, o antagonistas de RCP se formularán en un medio vehículo acuoso no tóxico, inerte, farmacéuticamente aceptable, preferiblemente a un pH de aproximadamente 5 a 8, más preferiblemente de 6 a 8, aunque el pH puede variar de acuerdo con las características del anticuerpo, inhibidor, o antagonista que se está formulando y la condición que se va a tratar. En una modalidad específica en la presente, el antagonista es la secuencia de proproteína que comienza entre los residuos de aminoácidos 22 y 29 y termina en el residuo de aminoácidos 230 de la SEQ ID NO: 2. Características de esos tratamientos incluyen solubilidad de la molécula, vida media y an igenicidad/inmuno-genicidad; éstas y otras características pueden ayudar para definir un vehículo efectivo. Las proteínas humanas nativas se prefieren como tratamientos de producción excesiva ' de RCP, pero las moléculas sintéticas u orgánicas que son resultado de discriminación de fármacos pueden ser igualmente efectivas en situaciones particulares. Los tratamientos por producción excesiva de RCP se pueden administrar por rutas conocidas de administración incluyendo pero sin limitarse a cremas y gels tópicas; rocío y aerosol transmucoso, parche y vendaje transdérmico; inyectable, formulaciones intravenosas y de lavado,- y líquidos y pildoras administrados oralmente, formulados particularmente para resistir ácido y enzimas del estómago. La formulación particular, dosis exacta, y ruta de administración serán determinadas por el médico tratante y variarán de acuerdo con cada situación específica. Estas determinaciones se hacen considerando múltiples variables como la condición que se va a tratar, el tratamiento que se va a administrar, y el perfil farmacocinético del tratamiento particular. Factores adicionales que se pueden tomar en cuenta incluyen estado de enfermedad (por ejemplo, severidad) del paciente, edad, peso, género, dieta, tiempo de administración, combinación de fármacos, sensibilidades de reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia. Las formulaciones de actuación prolongada se podrían administrar cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas dependiendo de la vida media y leí régimen de alivio de tratamiento particular. Las cantidades de dosis normales pueden variar de 0.1 a 100,000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 gramo, dependiendo de la ruta de administración. La guía respecto a dosis particulares métodos de administración se proporciona en la literatura; ver las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números : 4,657,760; 5,206,344; o 5,225,212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes tratamientos y que la administración sistémica puede necesitar aplicación de una manera diferente de la de la administración localizada. Los ejemplos más adelante se dan a manera de ilustración y no se incluyen con el fin de limitar la invención. APLICABILIDAD INDUSTRIAL I Aislamiento de ARNm y construcción de bibliotecas de ADNc La secuencia de nucleótido rcp fue identificada entre las secuencias que comprenden la biblioteca THP-l humana. La THP-l es una línea celular humana leucémica derivada de la sangre de un niño varón de 1 año de edad con leucemia monocítica aguda. Las células usadas para la biblioteca PMA-LPS se cultivaron durante 48 horas con 100 nm PMA en DMSO y durante 4 horas con 1 µg/mililitro de LPS. La biblioteca THP-l fue construida especialmente por Stratagene (Stratagene, 11099 M. Torrey Pines Rd., La Jolla, CA 92037) esencialmente como se describe más adelante. Stratagene preparó la biblioteca de ADNc usando cebador oligo d(T) . Los oligonucleótidos adaptadores sintéticos se ligaron con las moléculas de ADNc permitiéndoles ser insertadas en el sistema de vector Uni-ZAP (Stratagene) . Esto permitió la construcción de biblioteca lambda de alta eficiencia unidireccional (orientación en sentido) y la conveniencia de un sistema de plásmido con selección de color azul/blanco para detectar clonas con inserciones de ADNc. La calidad de la biblioteca de ADNc se exploró usando sondas de ADN, luego, se separó el fagémido pBluescript® (Stratagene) . Este fagémido permite el uso de un sistema de plásmido para la caracterización fácil de la inserción, secuenciamiento, mutagénes'is dirigida al sitio, la creación de supresiones unidireccionales y la expresión de polipéptidos de fusión. Posteriormente, las partículas de fagos de bibliotecas construidas a la medida se infectaron en la cepa de huésped de E. coli XLl-Blue® (Stratagene) . La alta eficiencia de transformación de esta cepa bacteriana aumenta la probabilidad de que la biblioteca de ADNc contendrá clonas raras, subrepresentadas . Los vectores unidireccionales alternativos podrían incluir, pero no se limitan a, pcDNAI (Invitrogen, San Diego CA) y pSHlox-1 (Novagen, Madison Wl) . II Aislamiento de clonas de ADNc Las formas fagémidas de clonas individuales de ADNc se obtuvieron por el proceso de separación en vivo, en el cual el XL1-BLUE se coinfectó con un fago ayudante fl. Las proteínas derivadas tanto de 1 fago lambda como del fago ayudante fl iniciaron nueva síntesis de ADN a partir de secuencia s definidas en el ADN objetivo de lambda y crean una molécula de ADN fagémida circular de cadena simple, más pequeña, que incluye todas las secuencias de ADN del plásmido pBluescript y el inserto de ADNc. El fagémido ADN se liberó de las células y se purificó, luego se usó para reinfectar células huésped bacterianas frescas (SOLR, Stratagene Inc) , en donde se produjo el ADN fagémido de cadena doble. Debido a que el fagémido lleva el gen para la /3-lactamasa, las bacterias nuevamente transformadas se seleccionaron en el medio que contiene ampicilina. El ADN fagémido se purificó usando el Sistema de Purificación de Plásmido QIAWELL-8 del Sistema de Purificación de ADN Qiagen®. Esta técnica proporciona un método rápido y confiable de producción alta para Usar las células bacterianas y aislar ADN fagémido altamente purificado. El ADN eluido de la resina de purificación fue conveniente para el secuenciamiento de ADN y otras manipulaciones analíticas. Los insertos de ADNc a partir de aislados aleatorios de la biblioteca de THP-l se secuenciaron en parte. Los ADNc se secuenciaron mediante el método de Sanger F. y AR Coulson (1975; J. Mol. Biol . 94:441f), usando un Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno NV) en combinación con cuatro Peltier Thermal Cyclers (PTC200 de MJ Research, Watertown MA) y Sistemas de Secuenciamiento de ADN 377 o 273 de Applied Biosystems (Perkin Elmer) y se determinó de cuadro de lectura.

IV Búsqueda de homología de clonas de ADNc y proteínas deducidas Cada secuencia así obtenida se comparó con secuencias en el Gen Bank usando un algoritmo de búsqueda desarrollado por Applied Biosystems Inc. y se incorporaron en el Sistema de Análisis de Secuencia INHERIT™ 670. En este algoritmo, se usó el lenguaje de especificación de patrón (desarrollado por TRW Inc.) para determinar regiones de homología. Los tres parámetros que determinan como las comparaciones de secuencias operan son tamaño de ventana, desplazamiento de ventana, y tolerancia al error. Usando una combinación de estos tres parámetros, la base de datos de ADN, y las secuencias adecuadas se califican con un valor inicial. Posteriormente, estas regiones homologas se examinan usando gráficas de homología de matriz de puntos para distinguir regiones de homología de coincidencias de oportunidad. Los alineamientos de Smith-Waterman de la secuencia de proteína se usaron para desplegar los resultados de la búsqueda de homología. Las homologías de secuencias de péptidos y proteínas se comprobaron usando el Sistema de Análisis de Secuencias INHERIT 670 de una manera similar a la usada en las homologías de secuencias de ADN. El Lenguaje de Especificación de Patrones y las ventanas parámetros se usaron para buscar bases de datos de proteínas para secuencias que contienen regiones de homología que fueron calificadas con un valor inicial . Las gráficas de homología de matriz de puntos se examinaron para distinguir regiones de homología significativa a partir de coincidencias oportunas . BLAST, que por sus siglas en inglés es Herramienta de Búsqueda de alineamiento local básico (Altschul SF (1993) J. Mol. Evol 36:290-300; Altschul, SF y colaboradores (1990) J. Mol. Biol 215:403-10), se usó para buscar alineamientos de secuencias locales. BLAST produce alineamientos tanto de secuencias de nucleótidos como de aminoácidos para determinar la similaridad de secuencias. Debido a la naturaleza local de los alineamientos, BLAST es especialmente útil para determinar coincidencias exactas o para identificar homólogos . BLAST es útil para coincidencias que no contienen huecos. La unidad fundamental de la salida del algoritmo de BLAST es el Par de Segmento de Alta Calificación (HSP) . Un par de segmento de alta calificación consiste en dos fragmentos de secuencias de longitudes arbitrarias pero iguales cuyo alineamiento es localmente máximo y para el cual la calificación de alineamiento llega o excede un umbral de calificación de corte fijado por el usuario. El enfoque BLAST es para buscar pares de segmentos de alta calificación entre una secuencia consultada y una secuencia de base de datos, para evaluar la significancia estadística de cualquier coincidencia encontrada, y reportar solamente las coincidencias que satisfacen el umbral seleccionado por el usuario de significancia. El parámetro E establece el umbral estadísticamente significativo para reportar las coincidencias de la secuencia de la base de datos . E se interpreta como el límite superior de la frecuencia esperada de la ocurrencia de oportunidad de un par de segmento de alta calificación (o par de segmento de alta calificación fijo) dentro del contexto de la búsqueda de base de datos entera cualquier secuencia de base de datos cuya coincidencia satisface E se reporta en la salida del programa. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para la región de codificación entera del homólogo de catepsina C humana, RCP, se muestran en la Figura l. V Identificación y secuenciamiento de longitud total de los genes De todas las clonas elegidas al azar y secuenciadas de la biblioteca de THP-l, la secuencia rcp fue homologa a pero claramente diferente de cualquier molécula de catepsina C conocida. La secuencia de nucleótidos completa para rcp se tradujo, y la traducción dentro del cuadro se muestra en la Figura 1. Cuando las tres posibles traducciones previstas de la secuencia se buscan contra bases de datos de proteínas como SwissProt y PIR, no se encontraron coincidencias exactas a las traducciones posibles de rcp. La Figura 2 muestra la comparación de la secuencia de aminoácidos de RCP con catepsina C de rata. Las regiones sustanciales de homología entre estas moléculas incluyen los residuos de triada catalíticos C25g, H405, y N42? y sitio276_27g e glicosilación NNS común entre las proteasas de cisteína. Las gráficas de hidrofobicidad para RCP se muestran como la Figura 3. VI Análisis antisentido La secuencia de RCP, o cualquier parte de la misma, se usa para inhibir in vivo o in vi tro la expresión de RCP endógeno. Aunque el uso de oligonucleótidos antisentido, que consiste en aproximadamente 20 pares de bases, se describe específicamente, esencialmente el mismo procedimiento se usa con fragmentos de ADNc más grandes. Un oligonucleótido basado en la secuencia de codificación de RCP se usa para inhibir la expresión de RCP endógeno. Usando Oligo 4.0, el oligonucleótido complementario se diseña a partir de la secuencia 5 ' conservada y usada para inhibir cualquier transcripción, enviando la unión del promotor con la secuencia no traducida corriente arriba, o la traducción de un transcrito RCP evitando que el ribosoma se una al ARNm. Vil Prueba de diagnóstico usando anticuerpos específicos para RCP Los anticuerpos particulares RCP son útiles para el diagnóstico de condiciones , y enfermedades crónicas o agudas que se caracterizan por diferencias en la cantidad o distribución de RCP. RCP inicialmente se encontró en una línea celular THP-l y se puede usar para detectar anormalidades o patologías que activan monocitos. Las pruebas de diagnóstico para RCP incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y una etiqueta para detectar RCP en fluidos corporales humanos, tejidos o extractos de estos tejidos. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se etiquetarán uniéndolos, ya sea covalentemente o no covalentemente, con una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce y ha sido reportada una amplia variedad de etiquetas y técnicas de conjugación tanto en la literatura científica como de patentes. Las etiquetas convenientes incluyen las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números: 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241. También se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número: 4,816,567, incorporada en la presente mediante referencia. Se conocen en la técnica una variedad de protocolos para medir RCP soluble o unido a la membrana, usando ya sea anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para la proteína respectiva. Los ejemplos incluyen prueba inmunosorbente de enzima enlazada (ELISA) , prueba radioinmune (RÍA) y clasificación de célula activada fluorescente (FACS) . Se prefiere una prueba inmunológica basada monoclonal de dos sitios que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopes que no interfieren en RCP, pero se puede emplear una prueba de unión competitiva. Estas pruebas se describen, entre otros lugares, en Maddox, DE y colaboradores (1983, J.Exp. Med. 158:1211) . VIII Purificación de RCP nativo usando anticuerpos específicos RCP RCP nativo o recombinante se purifica mediante cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para RCP. En general, una columna de inmunoafinidad se construye acoplando covalentemente el anticuerpo anti-RCP para una resina cromatográfica activada. Las inmunoglobulinas policlonales se preparan de suero inmune ya sea por precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación en Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) . De la misma forma, los anticuerpos monoclonales se preparan de fluido de ascitos de ratón mediante la precipitación de sulfato de amonio o cromatografía en Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina purificada parcialmente se une de manera covalente a una resina cromatográfica como Sefarosa activada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology) . El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea, y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estas columnas de inmunoafinidad se utilizan en 1 purificación de RCP al preparar una fracción de las células que contienen RCP en una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante la solubilización de la célula entera o de una fracción subcelular obtenida vía la centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o mediante otros métodos muy conocidos en la técnica. Alternativamente, el RCP soluble que contiene una secuencia señal se secreta en cantidad útil en el medio en el cual se cultivan las células. Una preparación soluble que contienen RCP se hace pasar sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava bajo condiciones que permiten la absorbencia preferencial de catepsina C (por ejemplo, reguladores fuertes muy iónicos en presencia de detergente) . Entonces, la columna se eluye bajo condiciones que interrumpen la unión anticuerpo/RCP (por ejemplo, un regulador de pH 2-3 o una concentración alta de un caotropo como urea o ion de tiocianato) , y se recolecta RCP. IX Actividad de RCP La actividad de RCP purificado o expresado se puede probar mezclando una cantidad conocida de enzima con un material matriz como colágeno en un medio biológicamente aceptable y dejando que el RCP digiera el colágeno durante un período de tiempo. Un zimogramo, que consiste en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante remojado en colágeno sobre el cual se depositan distintas concentraciones, preferiblemente entre 10 y 100 ng/µl, de RCP, se puede usar para demostrar la actividad RCP. La mancha del gel por proteína después de la digestión demostrará estos depósitos en los cuales se ha reducido la concentración de colágeno (mancha más clara) o completamente aclarada (Paech y colaboradores (1993) Anal. Biochem. 208:249-54). XIII Discriminación de fármacos Esta invención es particularmente útil para discriminar compuestos usando polipéptido RCP o fragmentos de unión del mismo en cualquier variedad de técnicas de discriminación de fármacos. El polipéptido RCP o el fragmento empleado en esta prueba puede estar libre en solución, fijo a un soporte sólido, llevado en una superficie celular o ubicado intracelularmente . Un método de discriminación de fármaco utiliza células huéspedes eucarióticas o procarióticas que se transforman establemente con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido o fragmento. Los fármacos se discriminan contra estas células transformadas en pruebas de enlace competitivos. Estas células, ya sea en forma viable o fija, se pueden usar para pruebas de enlace estándar. Uno puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre RCP y el agente que se está probando. Alternativamente, uno puede examinar la disminución en formación de complejo entre el RCP y su célula, por ejemplo un monocito, causado por el agente que se está probando. Así, la presente invención proporciona métodos de discriminación de fármacos o cualquier otro agente que puede afectar la inflamación y la enfermedad. Estos métodos comprenden poner en contacto el agente con un polipéptido RCP o fragmento del mismo y probar (i) para ver la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido o fragmento de RCP, o (ii) para ver la presencia de un complejo entre el polipéptido RCP o fragmento y la célula, mediante métodos muy conocidos en la técnica. En estas pruebas de enlace competitivo, el polipéptido RCP o fragmento es típicamente etiquetado. Después de la incubación conveniente, el polipéptido o fragmento RCP libre se separa del que está presente en forma de enlace, y la cantidad de etiqueta libre o no complejado es una medida de la capacidad del agente particular para enlazarse con RCP o para interferir con el RCP y el agente complejo. Otra técnica para discriminar fármacos proporciona alta discriminación de producto para compuestos que tienen afinidad de enlace conveniente con el polipéptido RCP y se describe en detalle en la Solicitud de Patente Europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984, incorporada en la presente mediante referencia. En pocas palabras, se sintetizan grandes números de diferentes pequeños compuestos de prueba de péptidos en un sustrato sólido, como clavos de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de prueba de péptido se hacen reaccionar con polipéptido RCP y se lavan. El polipéptido RCP enlazado entonces se detecta mediante métodos muy conocidos en la técnica. El RCP purificado también se puede recubrir directamente sobre placas para su uso en las técnicas de discriminación de fármacos antes mencionadas. Además se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar al péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido. Esta invención también contempla el uso de pruebas de discriminación de fármacos competitivos en los cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de unir el RCP específicamente competen con un compuesto de prueba para enlazar a los polipéptidos RCP o fragmentos del mismo. De esta manera, los anticuerpos se pueden usar para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antígenos con RCP. De conformidad con lo anterior, la presente invención proporciona un método para discriminar una pluralidad de compuestos para ver su afinidad de enlace específico con el polipéptido de la Reivindicación 8 o cualquier porción del mismo, que comprende los pasos de proporcionar una pluralidad de compuestos,- combinar RCP con cada uno de una pluralidad de compuestos durante un tiempo suficiente para permitir el enlace bajo condiciones convenientes;M y detectar el enlace de RCP con cada uno de la pluralidad de compuestos, identificando mediante esto los compuestos que específicamente enlazan RCP. XIV Diseño de fármaco racional La meta del diseño de fármaco racional es producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés o de moléculas pequeñas con las cuales interactúan, por ejemplo, agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos se puede usar para diseñar fármacos que sean más activos o formas más estables del polipéptido o que aumenten o interfieran con la función de un polipéptido en vivo (cf. Hodgson J (1991) Bio/Technology 9:19-21, incorporado en la presente mediante referencia) . En una forma de aproximación, la estructura en tres dimensiones de una proteína de interés, o de un complejo inhibidor de proteína, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante modelo por computadora, o, más típicamente, mediante una combinación de estos dos enfoques . Tanto la forma como las cargas del polipéptido se comprueban para dilucidar la estructura y para determinar los sitios activos de 1 molécula. Se obtiene información útil con respecto a la estructura de un polipéptido modelando basado en la estructura de proteínas homologas. En ambos casos se usa información estructural relevante para diseñar moléculas de catepsina C análogas o para identificar inhibidores eficientes. Ejemplos útiles de diseño racional de fármacos incluyen moléculas que tienen actividad o estabilidad mejorada como se muestra en Braxton S. y Wells JA (1992 Biochemistry 31:7796-7801) o que actúa como inhibidores, agonistas, o antagonistas de péptidos nativos como se muestra en Athauda SB y colaboradores (1993 J.

Biochem 113:742-746), incorporada en la presente mediante referencia. También es posible aislar un anticuerpo específico objetivo, seleccionado por prueba funcional, como se describe anteriormente, y luego resolver su estructura de cristal. Esta forma de aproximación, en principio, da un farmanúcleo sobre el cual se puede basar el diseño de fármaco posterior. Es posible desviar cristalografía de proteína junto con generar anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) para un anticuerpo farmacológicamente activo, funcional. Como una imagen en el espejo de una imagen en el espejo, el sitio de enlace de los anti-ids se esperaría que sean analógicos del receptor original. El anti-id podrían entonces usarse para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos químicamente o biológicamente producidos . Los péptidos aislados actuarían entonces como el farmanúcleo. En virtud de la presente invención, se puede hacer disponible suficiente cantidad de polipéptido para realizar estudios analíticos como cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de RCP proporcionada en la presente proporcionará guía a los que emplean técnicas de modelaje por computadora en lugar de o además de cristalografía con rayos X. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la anterior especificación se incorporan en la presente mediante referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos descritos y sistemas la invención serán aparentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en relación con las modalidades específicas preferidas, deberá entenderse que la invención como se reclama no deberá de ninguna manera limitarse a estas modalidades específicas. Sin duda, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias para los expertos en biología molecular o campos relacionados se pretende que estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: INCYTE PHARMACEUTICALS , INC. (Ü) TITULO DE LA INVENCIÓN: "NUEVO HOMOLOGO DE CATEPSINA C" (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 2 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Incyte Pharmaceuticals, Inc. (B) CALLE: 3174 Porter Drive (C) CIUDAD: Palo Alto (D) ESTADO: CA (E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE NORTEAMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL: 94304 (v) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0 , Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: A ser asignada (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-abril-1996 (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/REPRESENTANTE: (A) NOMBRE: Luther, Barbara J. (B) NUMERO DE REGISTRO: 33954 (C) REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE: PF-0032 PCT (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: 415-855-0555 (B) TELEFAX: 415-852-0195 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID. NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1389 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA : lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADNc (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: THP-l (B) CLONA: 14284 {xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO: 1: ATGGGTGCTG GGCCCTCCTT GCTGCTCGCC GCCCTCCTGC TGCTTCTCTC CGGCGACGGC 60 GCCGTGCGCT GCGACACACC TGCCAACTGC ACCTATCTTG ACCTGCTGGG CACCTGGGTC 120 TTCCAGGTGG GCTCCAGCGG TTCCCAGCGC GATGTCAACT GCTCGGTTAT GGGACCACAA 180 GAAAAAAAAG TAGTGGTGTA CCTTCAGAAO CTGGATACAG CATATGATGA CCTTGGCAAT 240 TCTGGCCATT TCACCATCAT TTACAACCAA GGCTTTGAGA TTsTGTTGAA TGACTACAAG 300 TGGTTTGCCT TTTTTAAGTA TAAAGAAGAG GGCAGCAAGG TGACCACTTA CTGCAACGAG 360 ACAATGACTG GGTGGGTGCA TGATGTGTTG GGCCGGAACT GGGCTTGTTT CACCGGAAAG 420 AAGGTGGGAA CTGCCTCTGA GAATOTOTAT GTCAACACAG CACACCTTAA GAATTCTCAG 480 GAAAAGTATT CTAATAGGCT CTACAAGTAT GATCACAACT TTGTsAAAGC TATCAATGCC 540 ATTCAGAAGT CTTGGACTGC AACTACATAC ATGGAATATG AGACTCTTAC CCTGGGAGAT 600 ATGATTAGGA G?AGTGGTßO CCACAGTCGA AAAATCCCAA GGCCCAAACC TGCACCACTG 660 ACTGCTGAAA TACAGCAAAA GATTTTGCAT TTGCCAACAT CTTGGGACTß GAGAAATGTT 720 CATGGTATCA ATTTTGTCAß TCCTGTTCGA AACCAAGCAT CCTGTGGCAG CTGCTACTCA 780 TTGCTTCA TGGGTATGCT AGAAGCGAßA ATCCGTATAC TAACCAACAA TTCTCAGACC 840 CCAATCCTAA GCCCTCAGGA GGTTGTGTCT TGTAGCCAGT ATGCTCAAGG CTGTGA?GGC 900 GGCTTCCCAT ACCTTATTGC AGG?AAGTAC GCCCAAGATT TTGGGCTGGT GGAAGAAGCT 960 TGCTTCCCCT ACACAGGCAC TGATTCTCCA TGCAAAATGA AGGAAGACTG CTTTCGTTAT 1020 TACTCCTCTG AGTACCACTA TGTAGGAGGT TTCTATGGAO GCTGCAATGA AGCCCTGATG 1080 AAGCTTGAGT TGGTCCATCA TGGGCCC?Tß GCAßTTGCTT TTGAAGTAT? TGATG?CTTC 1140 CTCCACTACA AAAAGGGGAT CTACCACCAC ACPGGTCTAA GAGACCCTTT CAACCCCTTT 1 00 GAGCTGACTA ATCATGCTGT TCTGCTTOTß GGCTATGGCA CTG?CTCAGC CTCTGGGATG 1260 GATTACTGGA TTGTTAAAAA CAGCTGGOGC ACCGOCTGGO GTGAGAATGG CTACTTCCGG 1320 ATCCGCAGAG GAACTGATGA GTGTGCAATT GAGAOCATAß CAGTGOCAGC CACACCAATT 1380 CCTAAATTG 1389 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID. NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 463 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA : lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA : proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. NO: 2: Mee Gly Ala Gly Pro Ser Leu Leu Leu Ala Ala iu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Gly Aap Gly Ala Val Arg Cyß Aap Thr Pro Ala Aßn Cya Thr Tyr 20 25 30 Leu Asp Lau Lau Gly Thr Trp Val Phß Gln Val Gly Ser Sar Gly Ser 35 40 45 Gln Arg Asp Val Asn Cyß Ser Val Mae ßly Pro Gln Glu Lys Lyß Val 50 55 60 Val Val Tyr Leu Gln Lya Leu Asp Thr Ala Tyr Asp Asp Leu Gly Asn 65 70 75 80 Ser Gly His Phe Thr lie lie Tyr Aßn Gln Gly Phß Glu lie Val Leu 85 90 95 Asn Asp Tyr Lyß Trp Phe Ala Phß Phß Lyß Tyr Lyß Glu Glu Gly S r 100 105 110 Lys Val Thr Thr Tyr Cys Asn Glu Thr Mßt Thr Gly Trp Val His ?sp 115 120 125 Val Leu Gly Arg Asn Trp Ala Cyß Phß Thr Gly Lys Lys Val Gly Thr 130 135 140 Ala Ser Glu Aßn Val Tyr Val Asn Thr Ala His Leu Lys Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Lys Tyr Ser Aßn Arg Leu Tyr Lys Tyr Asp His Asn Phe Val Lys 165 170 175 Ala lie Asn Ala ?lß Gln Lys Ser Trp Thr Ala Thr Thr Tyr Met Glu 180 185 190 Tyr Glu Thr Leu Thr Leu Gly Asp Met He Arg Arg Ser Gly Gly His 195 200 205 Ser Arg Lys He Pro Arg Pro Lyß Pro Ala Pro Leu Thr Ala Glu lie 210 215 220 Gln Gln Lya Ha Leu Hiß Leu Pro Thr Ser Trp Aßp Trp Arg ?ßn Val 225 230 235 240 Hiß Gly ?lß Aßn Phß Val Ser Pro Val Arg Aßn Gln Ala Ser Cyß Gly 245 250 255 Ser Cyß Tyr Ser Phß Ala Ser Met Gly Mß Leu ßlu Ala Arg He Arg 260 265 270 He Leu Thr Asn ?ßn Ser Gln Thr Pro ?lß Leu Ser Pro Gln ßlu Val 275 280 285 Val Ser Cyß Ser Gln Tyr Ala Gln Gly Cyß Glu Gly ßly Phe Pro Tyr 290 295 300 Leu He Ala ßly Lyß Tyr Ala Gln ?ßp Phe Gly Leu Val Glu Glu ?la 305 310 315 320 Cyß Phe Pro Tyr Thr ßly Thr ?ßp Ser Pro Cyß Lyß Met Lyß ßlu ?ßp 325 330 335 Cyß Phe ?rg Tyr Tyr Ser Ser ßlu Tyr Hiß Tyr Val ßly ßly Phß Tyr 340 345 350 Gly Gly Cyß ?ßn ßlu ?la Leu.Met Lyß Leu ßlu Leu Val Hiß Hiß ßly 355 360 , 365 Pro Met ?la Val ?la Phß ßlu Val Tyr ?sp ?ßp Phß Leu Hiß Tyr Lyß 370 375 380 Lyß ßly He Tyr His Hiß Thr ßly Leu ?rg ?ßp Pro Phß ?ßn Pro Phß 385 390 395 400 Glu Leu Thr ?ßn Hiß ?la Val Leu Leu Val ßly Tyr ßly Thr ?ßp Ser 405 410 415 ?la Ser ßly Mee ?ßp Tyr Trp Zlß Val Lyß ?ßn Ser Trp ßly Thr ßly 420 425 430 Trp Gly Glu ?ßn Gly Tyr Phß ?rg He ?rg ?rg ßly Thr ?ßp ßlu Cyß 435 440 445 Ala He Glu Ser He ?la Val ?la ?la Thr Pro He Pro Lyß Leu 450 455 460

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al polipéptido que tiene la secuencia como se representa en la SEQ ID NO: 2, o su complemento.
2. El polinucleótido de la reivindicación 1 en donde la secuencia de ácidos nucleicos consiste en la SEQ ID N0:1.
3. Un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al polipéptido que tiene la secuencia como se representa en la SEQ ID NO: 2, comenzando en entre el residuo 22 y 29, inclusive, y terminando en el residuo 463. 5. Un polinucleótido purificado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido que tiene la secuencia como se representa en la SEQ ID NO: 2, comenzando en el residuo de aminoácido 231 y terminando en el residuo de aminoácido 463. 6. Un vector de expresión que comprende al polinucleótido de la reivindicación 1. 7. Un vector de expresión que comprende al polinucleótido de la reivindicación 3. 8. Un vector de expresión que comprende al polinucleótido de la reivindicación 5. 9. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 6. 10. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 7. 11. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 8. 12. Una sonda de ácido nucleico que comprende un fragmento no conservado del polinucleótido de la reivindicación 2. 13. Un método para producir un polipéptido que comprende la secuencia como se representa en la SEQ ID NO: 2, comprendiendo el método: a) cultivar las células huéspedes de la reivindicación 6 bajo condiciones convenientes para la expresión del polipéptido, y b) recuperar el polipéptido del cultivo celular. 14. Un polipéptido purificado que tiene la secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO : 2. 15. Un polipéptido purificado que tiene la secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 2 a partir del residuo de aminoácido que comienza entre el residuo 22 y 29, inclusive y que termina con el residuo de aminoácido 230. 16. Un polipéptido purificado que tiene la secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO : 2 a partir del residuo de aminoácido que comienza entre el residuo 22 y 29, inclusive y que termina con el residuo de aminoácido 463. 17. Un polipéptido purificado que tiene la secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO : 2 a partir del residuo de aminoácido que comienza en el residuo 231 y termina en el residuo de aminoácido 463. 18. Un anticuerpo específico para el polipéptido purificado de la reivindicación 14. 19. Un anticuerpo específico para el polipéptido purificado de la reivindicación 17. 20. Una composición de diagnóstico para la detección de secuencias de aminoácidos que codifican Catepsina C que comprende el polinucleótido de la reivindicación 5. 21. Una prueba de diagnóstico para la detección de secuencias de ácido nucleico que codifican RCP en una muestra biológica, que comprende los pasos de: a) combinar la muestra biológica con un polinucleótido el cual comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l, o un fragmento de la misma, en condiciones convenientes para la formación de un complejo de hibridización de ácidos nucleicos entre la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO:l y una secuencia de ácidos nucleicos complementaria en dicha muestra, b) detectar el complejo de hibridización, y c) comparar la cantidad del complejo de hibridización con un estándar en donde la presencia de un nivel anormal del complejo de hibridización correlaciona positivamente con una condición asociada con inflamación. 22. Una prueba de diagnóstico para la detección de secuencias de nucleótido que codifican RCP en una muestra biológica, que comprende los pasos de: a) combinar la muestra biológica con cebadores de reacción de cadena de polimerasa bajo condiciones convenientes para la amplificación del ácido nucleico, en donde los cebadores comprenden fragmentos de regiones no conservadas de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:l: b) detectar secuencias de nucleótidos amplificadas; y c) comparar la cantidad de secuencias de nucleótidos amplificadas en la muestra biológica con un estándar determinando mediante esto si la cantidad de secuencias de nucleótidos varía del estándar, en donde la presencia de un nivel anormal de la secuencia de nucleótidos se correlaciona positivamente con una condición asociada con inflamación. 23. Un método para discriminar una pluralidad de compuestos para ver afinidad de enlace específico con el polipéptido de la Reivindicación 14 o cualquier porción del mismo, que comprende los pasos de: a) proporcionar una pluralidad de compuestos,- b) combinar RCP con cada uno de una pluralidad de compuestos durante un tiempo suficiente para permitir el enlace bajo condiciones convenientes; y c) detectar el enlace de RCP con cada uno de la pluralidad de compuestos, identificando mediante esto los compuestos que específicamente se enlazan al RCP.