MXPA97002011A - Microorganismos y metodos para la sobreproduccion de dahp mediante el gen pps clonado - Google Patents

Abstract

La presente invención utiliza elementos genético que comprenden vectores de expansión y un gen que codifica para sintasa de fosfoenol piruvato, para mejorar la diversión de recursos de carbono en la trayectoria aromática común y trayectoria que se ramifican de la misma. La sobreexpresión de sintasa de fosfoenol piruvato incrementa la producción de DAHP a rendimientos casi teóricos.

Description

MICROORGANISMOS Y MÉTODOS PARA LA SOBREPRODUCCIÓN DE DAHP MEDIANTE EL GEN PPS CLONADO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Este trabajo fue apoyado en parte por The National Science Foundation (Grant BCS-9257351 ) (Fundación Nacional de Ciencia), The Welch Foundation (Grant A-1251 ) (Fundación Welch) , y The Texas Higher Education Coordinating Board (Grant 999903-084) (Despacho de Educación Superior de Texas). El Gobierno de los Estados Unidos puede poseer los derechos no exclusivos en y para la invención. La presente invención se refiere a la producción biosintética de compuestos químicos orgánicos. En particular, la presente invención se refiere a métodos para incrementar la producción de 3-desoxi-D-arabino-hetulosonato 7-fosfato (DAH P) en microorganismos a través de alteraciones genéticas. La presente invención también se refiere a métodos para mejorar la producción de metabolitos cíclicos y aromáticos derivados de DAH P en microorganismos a través de alteraciones genéticas. Por ejemplo, la biosíntesis de DAH P es el primer paso en la trayectoria aromática común, a partir de la cual se forman la tirosina, triptofanoo , fenilalanina y otros metabolitos aromáticos. También, las trayectorias que se ramifican de la trayectoria aromática común proveen dichos productos químicos útiles como catecol y orgánicos quinoides, tales como ácido quínico, benzoquinona, e hidroquinona. Además, el aspartame y el Índigo pueden ser producidos a partir de productos derivados de la trayectoria aromática común. La producción de productos químicos a partir de microorganismos ha sido durante mucho tiempo una aplicación importante de la biotecnología. Típicamente, los pasos involucrados en el desarrollo de una cepa de producción de microorganismo incluyen: (i) seleccionar un microorganismo huésped apropiado, (ii) eliminar las trayectorias metabólicas que conducen a subproductos, (iii) desreglar dichas trayectorias tanto en el nivel de actividad de enzima como en el nivel transcripcional , y (iv)sobreexpresar enzimas apropiadas en las trayectorias deseadas. Los últimos tres pasos ahora puede lograrse mediante el uso de una variedad de métodos in vivo y in vitro. Estos métodos son particularmente condescendientes para el usuario en microorganismos bien estudiados tales como Escherichia coli (E. coli). Por lo tanto, se ha publicado muchos ejemplos de microorganismos sometidos a estudio técnico para la caracterización fisiológica y producción de metabolitos. En muchos casos, el primer objetivo para el proceso mediante ingeniería es la trayectoria terminal que conduce al producto deseado, y los resultados son usualmente exitosos. Sin embargo, mejoras adicionales de productividad (régimen de formación de producto) y rendimiento (porcentaje de conversión) de productos deseados requieren de la alteración de trayectorias metabólicas centrales, las cuales suministran los precursores y la energía necesarios para las biosíntesis deseadas de aquellos productos. Los metabolitos cíclicos y aromáticos tales como triptofano, fenilalanina, tirosina, quinonas, y similares, siguen sus biosíntesis hacia la reacción de condensación del fosfoenolpiruvato (PEP) y 4-fosfato de D-eritrosa (E4P) para formar DAH P. La biosíntesis de DAH P es el primer paso obligado en la trayectoria aromática común. La biosíntesis de DAH P es mediada por tres sintasas o isoenzimas de DAH P. Estas isoenzimas son codificadas por los genes aroF, aroG, y aroH, cuyos productos de gen son inhibidos por la retroalimentación mediante tirosina, fenilalanina y triptofano, respectivamente. Después de la biosíntesis de DAH P, algo de DAH P es convertido a corismato. El corismato es un intermediario en las trayectorias biosintéticas que finalmente conduce a la producción de compuestos aromáticos tales como fenilalanina, triptofano, tirosina, folato, melanina, ubiquinona, menaquinona, ácido prefénico (utilizado en la producción de la bacilisina antibiótica) y enteroquelina. Debido al gran número de trayectorias biosintéticas que dependen del corismato , la trayectoria biosintética utilizada por organismos para producir corismato es por lo regular conocida como la "trayectoria aromática común" . Además de su uso en la producción de corismato, DAH P también puede ser convertido a ácido quínico, hidroquinona, benzohidroquinona o catecol , como se describe por Draths ef al.

(Draths, K. M. , Ward , T. L. , Frost, J .W. , "Biocatalysis and Nineteenth Century Organic Chemistry: conversión of D-Glucose into Quinoid Organics", J . Am. Chem. Soc , 1992 , 1 14, 1925-26). Estas trayectorias biosintéticas se ramifican de la trayectoria aromática común antes de que se forme el siquimato. La producción eficiente de DAH P mediante un microorganismo es importante para la producción de metabolitos aromáticos, ya que DAH P es el precursor en la mayoría de las trayectorias que produce los metabolitos aromáticos. Los tres aminoácidos aromáticos, además de ser bloques esenciales de desarrollo para proteínas, son químicos precursores útiles para otros compuestos tales como aspartame, el cual requiere de la fenilalanina . Además, la trayectoria de triptofano puede ser genéticamente modificada para producir índigo. La producción de triptofano y fenilalanina mediante E. coli ha estado bien documentada. Por ejemplo, Aiba et al. (Aiba, S. H . , Tsunekawa y T. Imanaka, "New Approach to Tryptophan Production by Escherichia coli: Genetic Manipulation of Composite Plasmids In vitro", (Nuevo Aspecto para la Producción de Triptofano mediante Escherichia coli: Manipulación Genética de Plásmidos Mixtos In Vitro) , Appl . Env. Microbiol.. 1982, 43:289-297) han reportado un sobreproductor de triptofano que contiene genes sobreexpresados en el operon de triptofano en una cepa huésped que es trpR y tna (que codifica triptofanoasa) negativa. Además, varias enzimas, tales como el producto del gen trpE, han sido mutadas para resistir la inhibición por retroalimentación . Un trabajo similar ha sido reportado para la producción de fenilalanina. En el pasado, el compromiso mejorado de fuentes de carbono celular que entran y que fluyen a través de la trayectoria aromática común se ha logrado solamente con un éxito modesto (es decir, dichos intentos han fallado muy por abajo del rendimiento teórico). Típicamente, las mejoras se lograron, transfiriendo hacia células huésped, elementos genéticos que codifican enzimas que dirigen el flujo de carbono hacia y/o a través de la trayectoria aromática común. Dichos elementos genéticos pueden estar en la forma de plásmidos, cósmidos, fagos extracromosomales, u otras réplicas capaces de transformar elementos genéticos a la célula huésped. La patente de E. U .A. No. 5, 168,056 de Frost, describe el uso de un elemento genético que contiene un vector de expresión y un gen que codifica para transcetolasa (Tkt), el gen tkt. Este elemento genético puede ser integrado al cromosoma de los microorganismos para proveer la sobreexpresión de la enzima Tkt. Ejemplos adicionales incluyen: Miller et al. (Miller, J . E. , K. C. Backman, J . M. O'Connor, y T. R. Hatch, "Production of phenylalanine and organic acids by PEP carboxylase-deficient mutants of Escherichia coli" (Producción de fenilalanina y ácidos orgánicos mediante mutantes deficientes de carboxilasa de PEP de Escherichia coli) , J . Ind. Microbiol.. 1987, 2: 143- 149) , quienes intentaron dirigir más flujo de carbono hacia la trayectoria de aminoácido mediante el uso de un mutante deficiente de carboxilasa de fosfoenolpiruvato (codificada por ppc); Draths et al. (Draths, K. M. , D. L. Pompliano, D. L. Conley, J .W. Frost, A. Berry, G. L. Disbrow, R.J . Staversky, y J .C. Lievense, "Biocatalytic synthesis of aromatics from D-glucose: The role of transketolase" (Síntesis biocatalítica de aromáticos a partir de D-glucosa: El papel de la transcetolasa), J . Am. Chem . Soc , 1992, 1 14:3956-3962), quienes reportaron que la sobreexpresión de transcetolasa (codificada por tkt A) y una sintasa de DAH P resistente a la retroalimentación (codificada por aroGfbr) dieron como resultado la producción mejorada de DAH P a partir de glucosa . La sobreproducción de transcetolasa en células transformadas tkt se ha encontrado que provee un flujo incrementado de recursos de carbono a la trayectoria aromática común con relación a la utilización del recurso de carbono en células completas que no habitan dichos elementos genéticos. Sin embargo, el flujo de carbono incrementado puede ser mejorado adicionalmente mediante la manipulación adicional de la cepa huésped. De esta manera, es deseable desarrollar cepas genéticamente procesadas por ingeniería de microorganismos que sean capaces de mejorar la producción de DAHP casi a un rendimiento teórico. Dichas cepas genéticamente procesadas por ingeniería, pueden ser entonces utilizadas para la producción selectiva de DAH P o en combinación con otro material genético incorporado para la producción selectiva de metabolitos deseados . La producción biosintética eficiente y de costo efectivo de corismato, ácido qu ínico, hidroquinona, benzohidroquinona , catecol , o derivados de estos químicos requiere que fuentes de carbono tales como glucosa, lactosa, galactosa, xilosa, ribosa, u otros azúcares, sean convertidos al producto deseado en altos rendimientos. Por consiguiente, es valioso desde el punto de vista de la producción biosintética industrial de metabolitos incrementar el influjo de fuentes de carbono para la biosíntesis de células de DAHP y sus derivados. La presente invención provee cepas genéticamente procesadas por ingeniería de microorganismos que sobreexpresa el gen pps para incrementar la producción de DAHP muy cerca de los rendimientos teóricos. La presente invención también provee cepas genéticamente procesadas por ingeniería de microorganismos, en donde por lo menos uno de los plásmidos pPS341, pPSL706, pPS706, o derivados de los mismos es transformado en un microorganismo para incrementar la producción de DAHPmuy cerca de los rendimientos teóricos. La presente invención además provee un método para incrementar el flujo de carbono para la biosíntesis de DAHP en una célula huésped, que comprende los pasos de: transformar en el ADN recombinante de célula huésped, que comprende un gen pps, de manera que Pps es expresado a niveles mejorados con relación a células huésped de tipo silvestre, concentrar las células transformadas a través de centrifugación, volver a suspender las células en un medio escaso nutriente, mínimo, fermentar las células resuspendidas, y aislar DAHP del medio. La presente invención además provee métodos para incrementar el flujo de carbono en la trayectoria aromática común de una célula huésped , que comprende el paso de transformar la célula huésped con ADN recombinante que comprende un gen pps, de manera que Pps es expresado en un punto apropiado en las trayectorias metabólicas a niveles mejorados con relación a células huésped de tipo silvestre. La presente invención además provee métodos para mejorar una producción biosintética de células huésped de compuestos derivados de la trayectoria aromática común con relación a la producción biosintética de células huésped de tipo silvestre de dicho compuesto, dicho método comprende el paso de incrementar la expresión en una célula huésped de una proteína que cataliza la conversión de piruvato de PEP. La presente invención también provee métodos para sobreexpresar Pps en cepas de microorganismos, las cuales utilizan DAHP en la producción de DAH P de metabolitos. La presente invención además provee un cultivo que contiene un microorganismo caracterizado por la sobreexpresión de Pps, en donde el cultivo sea capaz de producir metabolitos de DAH P muy cerca de los rendimientos teóricos bajo fermentación en una resuspensión acuosa, medio escaso de nutriente, mínimo que contiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y substancias inorgánicas. La presente invención también provee un elemento genético que comprende un gen pps y uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de un gen aroF, un gen aroG, un gen aroH y un en aroB. La presente invención además provee una molécula de ADN que comprende un vector que lleva un gen que codifica para Pps. Figura 1. La sobreexpresión de Pps incrementa la producción de DAHP. La cepa huésped utilizada fue AB2847 y los plásmidos utilizados son como se marcan en la Figura. Observar que pPSX1 y pUHE denotan pPS341 X1 y pUHE23-2, respectivamente. Estas cepas fueron cultivadas primero en el medio YE (un medio rico) para retrasar la fase estacionaria, y después lavar y resuspender en un medio mínimo. (A) Las concentraciones de DAH P se midieron a 10 y 27 horas después de la resuspensión. (B) Las actividades de sintasa de DAHP (aroG) y Pps se midieron 27 horas después de la resuspensión. Figura 2. Producción de DAH P 10 y 27 horas después de la resuspensión. (A) Cepa AB2847 con plásmidos marcados en la abcisa. pPSX1 y pU H E denotan pP341 X1 y pU H E23-2 , respectivamente. (B) Cepas AB2847 (marcada como AB), JCL1283ppc: : Km (marcada como ppc) , y JCL1362 pps::MudK (marcada como pps) con plásmidos marcados en la abcisa. Figura 3. Las trayectorias de reacción para la conversión máxima de glucosa a DAH P para (A) cepas sin Pps, (B) cepas sobreexpresando Pps. Los números son los flujos relativos requeridos para convertir 7 moles de glucosa en DAH P. Las abreviaturas son: G6P, glucosa 6-P; F6P, fructosa 6-P; 1 .6F DP, difosfato de 1 ,6-fructosa; DAH P, fosfato de dihidroxiacetona; GAP, gliceraldehído 3-P, R5P, ribosa 5-P; X5P, xilulosa 5-P; S7P, sedoheptulosa 7-P. Figura 4. Se muestra la trayectoria aromática común, por lo que E4P y PEP sufren una reacción de condensación para iniciar la trayectoria aromática común. Figura 5. La construcción de pPSL706. Se restringieron los plásmidos pPS706 y pGS103 con EcoRI y Seal. Los fragmentos que contienen pps de pPS706 y el fragmento que contiene luxl se purificaron y ligaron para generar pPSL706. El plásmido pPS706 se construyó insertando un fragmento PCR de pps al vector de clonación 9 pJ F1 18EH . Figura 6. Efectos de la actividad de Pps en la producción de DAHP a partir de glucosa a diferentes concentraciones de I PTG y autoinductor. Las cepas son AB2847/p PSL706/pAT1 y AB2847/pPSL706/pRW5. El plásmido pGS 104 se utilizó para substituir pPSL706 como un control, y los datos son el punto más a la izquierda en cada gráfica. Muchos microorganismos sintetizan precursores aromáticos y compuestos aromáticos a partir de la reacción de condensación de PEP y E4P para producir DAH P. Esta reacción de condensación para formar DAH P , es el primer paso obligado en la trayectoria biosintética, conocida como la trayectoria aromática común, A parti r de esta trayectoria, las células sintetizan muchos metabolitos cíclicos, metabolitos pre-aromáticos, y metabolitos aromáticos, tales como los aminoácidos aromáticos , las biomoléculas de quinona, y moléculas relacionadas aromáticas y cíclicas. El inventor ha encontrado que se pueden desarrollar líneas de célula que incrementen el flujo de carbono hacia la producción de DAHP y obtener rendimientos casi teóricos de DAH P mediante la sobreexpresión de sintasa de fosfoenolpiruvato (Pps) en las líneas de célula. La sobreexpresión de Pps puede incrementar la concentración final y la producción de DAH P tanto como dos veces, a un máximo teórico cercano, comparado las líneas de célula de tipo silvestre. La sobreexpresión de Pps se logra transformando una línea de célula con ADN recombinante que comprende un gen pps, de manera que Pps es expresado a un nivel mejorado con relación a la línea de célula de tipo silvestre y, de manera que, la producción de DAH P se acerca a su valor teórico. Generalmente, la presente invención mejora la expresión en una célula huésped de Pps con relación a una célula huésped de tipo silvestre, ya sea mediante la transferencia y la incorporación estable de un elemento genético extracromosomal hacia la célula huésped, o mediante la transferencia del elemento genético hacia el genoma de la célula huésped . Los productos de gen expresados son enzimas configuradas para proveer sitios catal íticos apropiados para la conversión de substrato de compuestos de trayectoria aromática común . Además del uso del gen pps, la presente invención también provee transferir elementos genéticos que comprenden el gen tkt, el gen que codifica para sintasa de DAH P(aroF en E. coli) , el gen que codifica para sintasa de 3-deshidroquinato (aroB en E. coli), u otros genes que codifican enzimas que catalizan reacciones en la trayectoria aromática común. Dicha transformación de célula puede lograrse transfiriendo uno o más plásmidos que contienen genes que codifican para enzimas, que incrementan el flujo de carbono para la síntesis de DAHP y para la síntesis subsecuente de otros metabolitos cíclicos, pre-aromáticos y aromáticos deseados. Como resultado de esta transferencia de elementos genéticos, más carbono entra y se mueve a través de la trayectoria aromática común con relación a células huésped de tipo silvestre que no contienen los elementos genéticos de la presente invención . En una modalidad, la presente invención comprende un método para incrementar el flujo de carbono hacia la trayectoria aromática común de una célula huésped, incrementando la producción de DAH P a través de la sobreexpresión de Pps en el punto apropiado en la trayectoria aromática común para proveer PEP adicional en el punto, en donde PEP se condensa con E4P. Para poder incrementar el flujo de carbono, se requiere el paso de transformar la célula huésped con ADN recombinante que contiene un gen pps, de manera que Pps es sobreexpresado a niveles mejorados con relación a las células huésped de tipo silvestre. Después, DAH P es producido mediante la fermentación de la célu la transformada en un medio nutriente, en donde el DAH P puede ser extraído del medio en un procedimiento de extracción intermitente o continuo.

En otra modalidad, la presente invención involucra la co-sobreexpresión de un gen pps y otros genes que codifican para enzimas de la trayectoria aromática común, en donde el material genético adicional es transformado en la célula huésped. Los genes transferidos pueden incluir el gen tkt, el gen de sintasa de DAH P, y el gen de sintasa de DHO (preferiblemente, los genes aroF o aroB, respectivamente). Aunque el trabajo, hasta ahora, se ha centrado alrededor de la transformación de ciertas cepas de célula huésped de E. coli, tales como AB2847 aroB, esta célula huésped particular puede no ser la célula huésped preferida de la producción comercial de DAH P o de metabolitos de DAH P a través de la sobreexpresión de Pps. Otra modalidad de la presente invención es un método para mejorar una producción biosintética de células huésped de compuestos derivados de la trayectoria aromática común. Este método implica el paso de incrementar la expresión de Pps en la célula huésped con relación a una célula huésped de tipo silvestre. El paso de incrementar la expresión de Pps puede incluir la transferencia, hacia la célula huésped, de un vector que lleva el gen pps. La sobreexpresión de Pps da como resultado forzar el flujo de carbono incrementado hacia la biosíntesis de DAH P. En otro modalidad de la presente invención , se provee un método para mejorar una producción biosintética de célula huésped de compuestos derivados de la trayectoria aromática común con relación a la producción biosintética de célula huésped de dicho compuesto. Este método requiere el paso de incrementar la expresión en una célula huésped de una conversión de canalización de proteína de piruvato a PEP. La expresión de dicho proteína puede implicar la transferencia hacia el ADN recombinante de célula huésped incluyendo un gen pps. En otra modalidad preferida, la presente invención comprende un elemento genético que comprende el gen pps y un gen seleccionado del grupo que consiste de un gen aroF, un gen aroB, y un gen tkt. Dicho elemento genético puede comprender el plásmido pPS341, un vector que lleva un gen pps. Para canalizar más flujo de carbono hacia la trayectoria aromática común, se ha encontrado que se debe incrementar la producción de PEP en una línea de célula dada. Este incremento puede obtenerse desactivando las trayectorias que compiten para PEP o recirculando piruvato de regreso a PEP. Además de utilizarse en la biosíntesis de DAHP, PEP es utilizado como un donador de fosfato en el sistema de fosfotransferasa (PTS), el cual es responsable del consumo de glucosa. Adicionalmente, PEP puede ser convertido a piruvato mediante quinasas de piruvato y a oxaloacetato mediante fosfoenolpiruvato. Todas estas trayectorias de competencia limitan la disponibilidad de PEP para la biosíntesis de DAHP y todos los metabolitos derivados de la trayectoria aromática común o trayectorias que se derivan de los mismos. Una vez que PEP es convertido a piruvato ya sea por PTS o por quinasas de piruvato, el piruvato generalmente no es recirculado de regreso a PEP, debido a un alto costo de energ ía. Como resultado, una gran cantidad de flujo de carbono es canalizada desde PEP a través de piruvato y finalmente hacia ácidos orgánicos, dióxido de carbono o masa de célula. PEP es crítico para la biosíntesis de DAH P y los metabolitos de DAHP incluyendo todos los metabolitos de la trayectoria aromática común. El primer paso obligado de la trayectoria aromática común implica la formación de DAH P a partir de la condensación de E4P y PEP. Esta condensación involucra una condensación de aldol entre un carbanion intermediario de C-3 de PEP y el carbonilo C- 1 de E4P. La mayoría de las moléculas de PEP reaccionan esteroespecíficamente con respecto a la configuración sobre C-3. Un componente clave de los métodos de la presente invención dirigido al compromiso de flujo incrementado de carbono hacia DAH P y metabolitos de DAH P, es la recirculación de piruvato hacia PEP. El piruvato está disponible en células huésped como un producto final de la glicólisis. En la glicólisis, la energía libre de degradación de glucosa a piruvato es utilizada para sintetizar ATP. Hablando en general , este procedimiento involucra una inversión de ATP para formar un compuesto fosforilo (FBP) de la glucosa, el cual es dividido en dos unidades C3. La energía libre de esta reacción es utilizada en la oxidación de GAP, el cual es utilizado después para sintetizar un fosfato de acilo, un intermediario de "alta energ ía" (1 ,3-BPG) . 1 , 3- BPG es utilizado para fosforilar ADP a ATP. El segundo compuesto de "alta energía" de la trayectoria, PEP, el cual es producido a partir de 2 PG, también fosforila ADT a ATP. De esta manera, la degradación de glucosa vía la trayectoria glicolítica produce piruvato. La reacción total de la glicólisis es, por lo tanto: Glucosa + 2ADP + 2P + 2NAD+ > 2 piruvato + 2ATP + 2NADH + 4H + 2H20 El primer paso de la glicólisis es la transferencia de un grupo fosforilo de un grupo ATP a glucosa para formar 6-fosfato de glucosa (G6P) en una reacción catalizada mediante hexoquinasa. La hexoquinasa es una enzima relativamente no específica contenida en todas las células que catalizan la fosforilación de hexosas, tal como D-glucosa , D-manosa y D-fructosa. El segundo substrato para la hexoquinasa, como con otras quinasas, es un complejo Mg2+ - ATP. En realidad, ATP sin complejo es un inhibidor competitivo potente de la hexoquinasa. La hexoquinasa tiene un mecanismo Aleatorio Bi Bi, en el cual la enzima forma un complejo ternario con la glucosa y Mg2* - ATP, antes de que ocurra la reacción. Con la formación de complejo con los átomos de fosfato-oxígeno , el Mg2+ se cree que protege sus cargas negativas, haciendo al átomo de fósforo más accesible para el ataque nucleofílico del grupo C(6)-OH de glucosa. Después, G6P es convertido a 6-fosfato de fructosa (F6P) mediante isomerasa de fosfoglucosa (PG I) . Esta reacción es una isomerización de una aldosa a cetosa . Ya que G6P y F6P ambos existen predominantemente en sus formas cíclicas , la reacción requiere la abertura de anillo, seguido por la isomerización, y subsecuente cierre de anillo. Toda la reacción se cree que ocurre mediante catálisis a base de ácido general mediada por enzima. Después, la fosfofructoquinasa (PFK) fosforila F6P para producir 1 ,6-bisfosfato (FBP o F1 , 6P). La PFK cataliza el ataque nucleofílico mediante el grupo C(1 )-OH de F6P sobre el átomo electrofílico ?-fósforo del complejo de Mg2+ - ATP. La PFK juega un papel central en el control de la glicólisis, ya que ésta cataliza una de las reacciones de determinación de régimen de trayectoria. En muchos organismos, la actividad de PFK es mejorada aloestéricamente mediante varias substancias, incluyendo AMP, y es inhibida aloestéricamente por varias otras substancias, incluyendo ATP y citrato. Las propiedades regulatorias de PFK son intensamente complejas. Después, la aldolasa cataliza la escisión de FBP para formar las dos triosas gliceraldehído-3-fosfato (GAP) y fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) . Esta reacción es una escisión de aldol (lo contrario de una condensación de aldol). La escisión de aldol entre C(3) y C(4) de FBP requiere un carbonilo en C(2) y un hidroxilo en C(4). Solamente uno de los productos de la reacción de la escisión de aldol , GAP, continua a lo largo de la trayectoria glicol ítica. Sin embargo, DHAP y GAP son isómeros de ceosa-aldosa , tal como lo son F6P y G6P. Por lo tanto, es posible la interconversión de GAP y DHAP vía un intermediario de enediolato análogo a la reacción de la fosfoglucomutasa. La triosa isomerasa de fosfato (TIM) cataliza este procedimiento. En este punto, la glucosa, la cual ha sido transformada a dos GAPs, ha completa la etapa preparatoria de la glicólisis. Este procedimiento ha requerido del gasto de dos ATPs. Sin embargo, esta inversión ha dado como resultado la conversión de una glucosa a dos unidades C3, cada una de las cuales tiene un grupo fosforilo que, con un poco de tecnología química, puede ser convertido a un compuesto de "alta energía", cuya energía libre de hidrólisis puede ser acoplada a la síntesis de ATP. Esta inversión de energía doblemente será reparada en la etapa final de la glicólisis, en donde las dos unidades fosforiladas de C3 son transformadas a dos piruvatos con la síntesis acoplada de cuatro ATPs por glucosa. El siguiente paso en la glicólisis implica la oxidación y la fosforilación de GAP por NAD+ y P, ya que son catalizados por gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). En esta reacción, la oxidación del aldehido, una reacción exergónica, dirige la síntesis del fosfato 1,3-difosfiglicerato de acrilo (1,3-BPG). La siguiente reacción de la trayectoria glicolítica da como resultado la primera formación de ATP junto con 3-fosfoglicerato (3PG) en una reacción catalizada por fosfoglicerato quinasa (PGK). Después, 3PG se convierte a 2-fosfoglicerato (2PG) mediante mutasa de fosfoglicerato (PGM). Esta reacción es necesaria para la preparación de la siguiente reacción en la glicóiisis, la cual genera un compuesto de fosforilo de "alta energía" para utilizarse en la síntesis de ATP. Subsecuentemente, 2PG es deshidratado a fosfoenolpiruvato (PEP) en una reacción catalizada por enolasa. La enzima forma un complejo con un catión divalente, tal como Mg2+ antes de que el substrato se una. El ion de fluoruro inhibe la glicólisis con la acumulación de 2 PG y de 3PG. Lo hace inhibiendo fuertemente la enolasa en presencia de P¡. La especie inhibidora es el ion de fluorofosfato (FPO33"), el cual probablemente forma complejos con Mg2+ unido a la enzima, inactivando así la enzima . El substrato de enolasa 2PG, por lo tanto, se desarrolla y a medida que hace esto, se equilibra con 3PG mediante PGM . Finalmente, la quinasa de piruvato (PK) acopla la energía libre de la hidrólisis de PEP para la síntesis de ATP para formar piruvato. En este momento, la glicólisis ha producido PEP, uno de los precursores para la producción de DAHP y el camino de entrada a la trayectoria aromática común. Además la biosíntesis de PEP, DAHP, así como de otros productos derivados de la trayectoria aromática común y trayectorias que se ramifican de la misma, dependen de la biosíntesis de E4P. Haciendo referencia a la Figura 4, E4P es un intermediario biosintético de la trayectoria de fosfato de pentosa. La trayectoria de fosfato de pentosa está situada entre la glicólisis y una variedad de diferentes cascadas biosintéticas. Esta trayectoria produce E4P vía una ramificación no oxidante de la trayectoria. La trayectoria de fosfato de pentosa no oxidante convierte 6-fosfato de D-fructosa a equivalentes variables de 5-fosfato de D-ribosa, 7-fosfato de D-sedoheptulosa, y E4P. Los primeros dos productos extremos están asociados con la biosíntesis de nucleótidos lipopolisacáridos bacterianos gram-negativos, respectivamente, mientras que E4P es un precursor de los aminoácidos aromáticos: fenilalanina, tirosina y triptofano. El sifonamiento inicial de intermediarios a partir de la glicólisis mediante la trayectoria del fosfato de pentosa implica la transferencia catalizada de transcetolasa de un grupo cetol a partir de 6-fosfato de D-fructosa a 3-fosfato de D-gliceraldehído para formar E4P y 5-fosfato de D-xilulosa. Después, la epimerasa de fosfato de pentosa convierte el 5-fosfato de D-xilulosa al 5-fosfato de D-ribulosa seguido por la transformación mediada por la isomerasa de fosfato de pentosa del 5-fosfato de D-ribulosa a 5-fosfato de D-ribosa. En esta etapa, el 5-fosfato de D-ribosa puede ser explotado mediante transcetolasa como un aceptor de un grupo cetol derivado de otra molécula de 6-fosfato de D-fructosa formando una segunda molécula de E4P y 7-fosfato de D-sedohetulosa. Finalmente, la transaldolasa de enzima cataliza la transferencia de un grupo dihidroacetona a partir de 7-fosfato de D-sedoheptulosa a 3-fosfato de D-gliceraldehído produciendo la tercera molécula de E4P y 6-fosfato de D-fructosa. De esta manera, la trayectoria de fosfato de pentosa no oxidante logra una conversión neta de dos moléculas de 6-fosfato de D-fructosa a tres moléculas de E4P. La condensación de PEP y E4P es catalizada por la sintasa de DAH P de enzima. Muchos microorganismos, incluyendo E. coli, producen tres isoenzimas de sintasa de DAH P: sintasa de DAH P sensible a la fenilalanina (phe), sintasa de DAH P sensible a la tirosina (tyr) , y sintasa de DAH P sensible al triptofano (trp). La sintasa de DAH P tetramérica (phe) tiene un peso molecular subunitario de 35, 000. La sintasa de DAH P dimérica (tyr) y la sintasa de DAHP (trp) tienen pesos moleculares subunitarios que se acercan a 40,000. Las formas nativas de las enzimas son probablemente aductos de proteína-PEP. En E. coli, los genes estructurales para la sintasa de DAH P (tyr), sintasa de DAH P (phe) y sintasa de DAH P (trp) son aroF, aroG, y aroH, respectivamente. Estos genes están ubicados en a 56, 17 y 37 minutos, respectivamente, sobre el mapa de unión de E. coli. En E. coli de tipo silvestre, 80% del total de la actividad de sintasa de DAH P es contribuido por la isoenzima sensible a la fenilalanina, mientras que el 20% es contribuido por la isoenzima sensible a la tirosina. Solamente existen trazas de la sintasa de DAH P (trp) en E. coli. Después de la condensación de PEP y E4P, la siguiente reacción de la trayectoria aromática común es un intercambio intramolecular del oxígeno del anillo DAH P con C-7, acompañado por una oxidación en C-6 y una reducción en C-2. La escisión del fosfoéster provee la fuerza im pulsora para formar 3-deshidroquinato (DAH) . Esta reacción es catalizada por la sintasa de deshidroquinato (sintasa de DAH). La sintasa de DAH pura es una cadena de polipéptido individual que tiene un peso molecular de 40, 000-44,000. La enzima requiere de Co y de NAD para la actividad , esta última en cantidades catalíticas. La formación de 3-deshidroquinato a partir de DAH P es esteroespecífica y prosigue con inversión en C-7 de DAH P sin intercambio de hidrógeno con el medio de crecimiento. Se forman orgánicos quinoides de las trayectorias que se ramifican de la aromática común y utilizan DAH . U na sin-deshidratación estereoespecífica de 3-deshidroquinato introduce el primer doble enlace del sistema de anillo aromático para producir 3-deshidrosicimato. La reacción es catalizada por 3-deshidroquinato deshidratasa. La formación de base Schiff entre la enzima y el substrato ocasiona un cambio conformacional en el substrato (cápsula torcida) que conduce al curso estereoespecífico de la reacción. La biosíntesis de siquimato a partir de 3-deshidrosiquimato es catalizada mediante deshidrogenasa de siquimato. Esta enzima específica de NADP facilita la transferencia de hidrógeno a partir del lado A de NADPH . El siquimato es fosforilado a siquimato 3-fosfato mediante quinasa de siquimato. La quinasa de siquimato es un polipéptido de 10,000 daltons que se forma en complejos con la sintasa de DAH P-mutasa de corismato bifuncional. La quinasa , sólo activa en el complejo, ha sido purificada a homogeneidad . Ya que la enzima se inhibe por el corismato, prefenato, ADP, y 5-enolpiruvoilsiquimato 3-fosfato son desreprimidos mediante el crecimiento sobre tirosina limitante, se cree que la quinasa de siquimato representa un punto de control alostérico clave de la trayectoria en algunos tipos de células huésped . El siquimato-3-fosfato reacciona con PEP para formar siquimato-3-fosfato de 5-enolpiruvoilo y fosfato inorgánico. La reacción catalizada por la enzima , reversible es una transferencia de una porción de enolpiruvoilo sin cambio de PEP. La protonación de C-3 de PEP combinado con un ataque nucleofílico del 5-hidroxilo de siquimato conduce a un intermediario presumido a partir del cual se obtiene siquimato-3-fosfato de 5-enolpiruvoilo en una 1 ,2-eliminación del ortofosfato. La reacción se cataliza mediante la sintasa de siquimato-3-fosfato de 5-enolpiruvoilo. El segundo doble enlace en el sistema de anillo aromático se introduce a través de una trans- 1 ,4-eliminación del ortofosfato a partir de siquimato-3-fosfato de 5-enolpiruvoilo para producir corismato. La reacción es catalizada por medio de sintasa de corismato. A partir del corismato, el punto final de la trayectoria aromática común, es posible la biosíntesis de un diverso número de compuestos aromáticos. Por ejemplo, como se indica en la Figura 4, los aminoácidos aromáticos triptofano, tirosina , y fenilalanina pueden ser sintetizadas de corismato a lo largo de sus trayectorias biosintéticas respectivas. Como se observó previamente, también se pueden producir otros compuestos aromáticos comercialmente importantes a partir de corismato e incluyen folatos, aspartame, melanina, ácido prefénico y Índigo. Además de la trayectoria aromática común, otras trayectorias que utilizan DAHP producen otros metabolitos aromáticos. Por ejemplo, el catecol y los orgánicos quinoides, tales como ácido quínico, benzoquinona e hidroquinona, pueden ser producidos de trayectorias que se ramifican de la trayectoria aromática común. De acuerdo con los análisis teóricos, el inventor cree que la producción máxima de DAHP y aminoácidos aromáticos a partir de la glucosa puede ser incrementada el doble si el piruvato es recirculado de regreso a PEP. La producción máxima puede calcularse asumiendo que las trayectorias ramificadas son bloqueadas y que el flujo de carbono es dirigido por las trayectorias más eficientes con una pérdida mínima para el dióxido de carbono y otros metabolitos. Bajo estas condiciones y bajo condiciones de estado estable, el flujo relativo a través de cada paso se puede calcular equilibrando los flujos de entrada y de salida de cada depósito de metabolito. Como se muestra en la Figura 3A, para un rendimiento máximo de la producción de DAHP mediante cepas sin la sobreproducción de Pps, se necesitan 7 moles de glucosa para producir 3 moles de DAHP (rendimiento de 43% molar) y 7 moles de piruvato, el cual es adicionalmente metabolizado. El flujo relativo a través de cada paso intermediario, también se muestra en la Figura 3A. La formación de piruvato es necesaria debido a la estequiometría del sistema de fosfotransferasa para el consumo de glucosa . En presencia de glucosa, el piruvato no es recirculado de regreso a PEP, eficientemente, ya que la enzima Pps no es inducida. Se ha encontrado que el piruvato es efectivamente recirculado hacia PEP vía Pps sobreexpresado, aún en presencia de glucosa, dando como resultado un incremento doble en DAH P, el cual se acerca, sino es que obtienen , a los niveles teóricos para la síntesis de DAH P. Como se muestra en la Figura 3B, al máximo teórico, se pueden producir 6 moles de DAH P a partir de 7 moles de glucosa (rendimiento del 86% molar). La parte no oxidante de la trayectoria de pentosa provee E4P, mientras que la sobreexpresión de Pps recircula al piruvato de regreso a PEP. Los datos descritos anteriormente y mostrados en las Figuras 3A y 3B van de acuerdo con este modelo de distribución de flujo. Los controles con Pps inactivo y sin Pps demuestran que la actividad mejorada, a través de la sobreexpresión de Pps, es requerida para obtener altas producciones de DAH P y, por supuesto, de metabolitos de DAH P, incluyendo metabolitos de la trayectoria aromática común.

En trabajos previos, se demostró que la sobreexpresión de Pps en células huésped cultivadas en un medio conteniendo glucosa, rico en nutrientes, condujo a la inhibición del crecimiento, consumo incrementado de glucosa y excreción de piruvato y acetato. Este estudio previo también demostró que los efectos de la sobreexpresión de Pps en la producción de DAH P, en cultivos activamente en crecimiento, no son tan significativos, y que los efectos adversos de la sobreexpresión de Pps sobre el crecimiento de célula, negaron cualesquiera efectos benéficos en la producción de DAH P. La estimulación del consumo de glucosa, en el trabajo previo , fue atribuida a la relación alterada de PEP/piruvato. Se realizó la hipótesis de que la relación incrementada de PEP/piruvato estimula el sistema de fosfotransferasa para el consumo incrementado de glucosa, el cual a su vez, da como resultado la excreción del piruvato. El inventor descubrió que el problema del deterioro de crecimiento puede superarse a través del uso de cultivos de resuspensión de alta densidad que crecen en medios de glucosa , escasos de nutrientes. Dichos cultivos de resuspensión logran una alta actividad metabólica con bajos regímenes de crecimiento. Este descubrimiento condujo a producciones de DAH P que se acercan a los valores teóricos. En la presente invención , PEP se volvió a dirigir a la trayectoria aromática, y, de esta manera, se disminuyó la relación de PEP/piruvato. Esta redirección de flujo explica la insensibilidad del régimen de consumo de glucosa específico para la sobreexpresión de Pps en el sistema experimental de la presente invención . La producción incrementada de DAH P a partir de la glucosa, causada por la sobreexpresión de Pps, también sugiere que Pps en realidad funciona en su dirección fisiológica (de piruvirato a PEP) in vivo, aún bajo condiciones glicolíticas. PEP también es un precursor para las trayectorias que utilizan la enzima Ppc codificada por el gen ppc. Se ha reportado que la eliminación de ppc incrementó la producción de la fenilalanina y el acetato. Además, se ha demostrado que la sobreexpresión de Ppc en un huésped de tipo silvestre reduce la producción de acetato. Ambos resultados pueden indicar que le flujo a través de Ppc (de PEP a OAA) es razonablemente significativo bajo aquellas condiciones, y por lo tanto, la modulación del nivel de expresión de Ppc puede afectar la utilización de PEP. Sin embargo, en la presente invención, la eliminación del gen ppc cromosomal no tuvo un efecto positivo sobre la producción de DAH P, sugiriendo que el flujo a través de Ppc no es importante en los métodos de la presente invención. Una modalidad preferida de la presente invención abarca la modificación de una célula huésped para ocasionar la sobreexpresión de una enzima que tiene las propiedades catal íticas de Pps derivado naturalmente, y, de esta manera reducir al mínimo la producción de DAH P a los rendimientos casi teóricos. Las enzimas que tienen actividad catalítica de Pps incluyen, pero no se limitan a, Pps producido por la expresión en células completas de un gen pps derivado naturalmente, enzimas producidas por la expresión en células completas de un gen pps derivado naturalmente, modificado por la eliminación o la adición de la secuencia, de manera que la enzima expresada tiene una secuencia de aminoácido que varía de Pps no modificado, abzimas producidas que tienen sitios catalíticos con propiedades estéricas y electrónicas que corresponden a sitios catalíticos de Pps, u otras proteínas producidas que tienen la capacidad de catalizar la conversión de piruvato a PEP mediante cualquier otro medio reconocido en la técnica. En otra modalidad preferida, el inventor ha observado que el efecto de Pps sobre la producción de DAH P es mejorado mediante la sobreexpresión simultánea de Tkt. Dicha sobreexpresión simultánea asegura que ambos precursores, necesarios para la biosíntesis de DAH P, son sobreproducidos. Aunque la sobreexpresión de Pps y Tkt puede requerirse para obtener rendimientos casi teóricos de DAH P, la sobreexpresión de Pps sólo en los métodos de la presente invención mejoraron significativamente la producción de DAH P sobre la sobreexpresión sola de Tkt (Figura 2A). Este resultado puede sugerir que sin una recirculación del piruvato mediada por Pps (Figura 3A), no se puede obtener un flujo suficiente de PEP para la síntesis de DAH P. Además, la transformación de ADN , incluyendo el gen pps, a microorganismos procesados por ingeniería para la sobreexpresión de otros substratos, y/o la sobreexpresión o la desrepresión de enzimas en el fosfato de pentosa o la trayectoria aromática común , puede ser utilizada para diseñar el microorganismo para obtener rendimientos casi teóricos de dichos metabolitos de DAH P , tales como tirosina, triptofano, fenilalanina y otros metabolitos aromáticos tales como Índigo, catecol y orgánicos quinoides tales como ácido quínico, benzoquinona e hidroquinona. Las enzimas que catalizan reacciones en el fosfato de pentosa o en la trayectoria aromática común incluyen aquellas enzimas producidas mediante la expresión en células completas de fosfato de pentosa derivada naturalmente o genes de trayectoria aromática común, las enzimas producidas por la expresión de fosfato de pentosa derivado naturalmente o genes de la trayectoria aromática común que han sido modificados por la eliminación o adición de secuencia, de manera que la enzima expresada tienen una secuencia de aminoácido que difiere de la enzima natural, o abzimas que tienen sitios catalítico con propiedades estéricas y electrónicas que corresponden a sitios catalíticos de una enzima natural en la trayectoria aromática común o fosfato de pentosa. Pps o las enzimas que tienen actividad catalítica similar a Pps pueden sobreexpresarce con relación a la producción de Pps en células de tipo silvestre (según medido mediante ensayos de actividad de sintasa de PEP, normales, conocidos en la técnica y descritos en el Ejemplo 1 ) junto con cualquier número de otras enzimas en la trayectoria aromática común o trayectorias que se ramifican de la misma . Por ejemplo , la sobreexpresión de Pps, sintasa de DAH P, y transcetolasa; Pps, sintasa de DHQ y transcetolasa; Pps, sintasa de DAH P, sintasa de DHQ y transcetolasa; Pps, transcetolasa y quinasa de siquimato; Pps, transcetolasa (Tkt) , y mutasa de corismato ; o cualesquiera otras enzimas de trayectoria aromática común junto con Pps, la sobreproducción puede mejorar la entrada de fuente de carbono a y/o a través de toda la trayectoria aromática común. La expresión mejorada de genes que codifican para proteínas capaces de realizar o controlar el fosfato de pentosa y las funciones enzimáticas de la trayectoria aromática común , es mediada por elementos genéticos transferibles a una célula huésped. Los elementos genéticos, como se definen en la presente, incluyen ácidos nucleicos (generalmente ADN o ARN) que tienen secuencias de codificación expresables para productos tales como proteínas, apoproteínas o ARN antisentido, que pueden realizar o controlar al fosfato de pentosa o las funciones enzimáticas de la trayectoria aromática común. Las proteínas expresadas pueden funcionar como enzimas, como agentes represores o desrepresores, o para controlar la expresión de enzimas. Los ácidos nucleicos que codifican estas secuencias expresables pueden ser ya sea cromosomales (por ejemplo, integradas a un cromosoma de célula huésped mediante recombinación homologa) o extracromosomales (por ejemplo, llevadas por plásmidos, cósmidos, etc.) . Además, los elementos genéticos se definen para incluir secuencias de control de expresión opcionales, que incluyen promotores, represores y mejoradores que actúan para controlar la expresión o desrepresión de secuencias que codifican para proteínas, apoproteínas , o ARN antisentido . Por ejemplo, dichas secuencias de control pueden ser insertadas a células huésped de tipo silvestre para promover sobreexpresiones de enzimas seleccionadas ya codificadas en el genoma de célula huésped, o alternativamente pueden ser utilizadas para controlar la síntesis de enzimas extracromosomalmente codificadas. Los elementos genéticos de la presente invención pueden ser introducidos a una célula huésped mediante un agente genético q ue incluye, pero no se limita a, plásmidos, cósmidos, fagos, cromosomas artificiales de Levadura u otros vectores que pueden mediar la transferencia de los elementos genéticos a una célula huésped, o mezclas de los mismos. Estos vectores pueden incluir un origen de replicación junto con elementos de control de acción cis, que controlan la replicación del vector y de los elementos genéticos llevados por el vector. En el vector pueden estar presentes marcadores seleccionables para ayudar a la identificación de células huésped, dentro de las cuales se han introducido los elementos genéticos. Por ejemplo, los marcadores seleccionables pueden ser genes que confieren resistencia a antibióticos particulares tales como la tetraciclina, ampicilina , cloranfenicol , canamicina o neomicina. Se utilizan medios para introducir los elementos genéticos a una célula huésped de un vector de plásmido de copias múltiples, extracromosomal , a los cuales se han insertado los elementos genéticos , de acuerdo con la presente invención . El plásmido q ue lleva la introducción del elemento genético a las células huésped implica una escisión inicial de un plásmido con una enzima de restricción, seguido por la ligación del plásmido y los elementos genéticos de acuerdo con la presente invención. Bajo la recirculación del plásmido recombinante ligado, se utiliza la transformación u otros mecanismos para la transferencia del plásmido (por ejemplo, electroporación, microinyección, etc.) para transferir el plásmido a la célula huésped. Los plámidos adecuados para la inserción de elementos genéticos a la célula huésped incluyen, pero no se limitan a, pBR322 y sus derivados tales como pAT153, pXf3, pBR325, y PBR327, vectores pUC, pACYC y sus derivados, pSC101 y sus derivados, y ColEi. La patente de E.U.A. No. 5,168,056, incorporada aquí por referencia, enseña la incorporación del gene tkt, el cual codifica para la enzima Tkt a la célula huésped. Tkt cataliza la conversión de 6-fosfato de D-fructosa de la fuente de carbono a E4P, un precursor de DAHP. Las células huésped adecuadas para utilizarse en la presente invención son miembros de aquellos géneros capaces de ser utilizados para la producción biosintética industrial de compuestos aromáticos deseados. Por consiguiente, las células huésped pueden incluir procariotes que pertenecen al género Escherichia, Corynebacterium, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus, o Serratia. También se pueden utilizar células huésped eucariótica, siendo preferidas las levaduras del género Saccharomyces o Schizosaccharomyces. Más específicamente, las células huésped procarióticas adecuadas para utilizarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli, Corybacterium glutamicum, Corybacterium herculis, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lichenformis, Bacillusmegaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus pumilis, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas angulata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas tabaci, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces a vermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces kasugensis, Streptomyces la vendulae, Streptomyces lipmanii, Streptomyces lividans, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus saprophyticus, o Serratia marcescens y sus cepas genéticamente procesadas mediante ingeniería o mezclas de los mismos. Las células huésped eucarióticas preferidas incluyen Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces carlsbergensis y sus cepas genéticamente procesadas mediante ingeniería o mezclas de los mismos. Para la producción industrial de metabolitos primarios derivados de corismato (tales como aminoácidos aromáticos) , se prefieren cepas de mutante desregulado de ias especies antes mencionadas que carecen de la inhibición de retroalimentación de una o más enzimas en la trayectoria biosintética metabólica. Dichas cepas pueden ser creadas mediante mutagénesis aleatoria o dirigida, o están comercialmente disponibles. Ejemplos de cepas de E. coli que tienen sintasa de DAH P, deshidratasa de prefenato o inhibición de retroalimentación de mutasa de corismato removida, se describen en la patente de E. U .A. No 4,681 ,852 de Tribe y patente de E.U .A . No. 4, 753, 883 de Backman et al. , incorporadas aquí por referencia. Para superar las limitaciones estequiométricas en la condensación de E4P y PEP, la presente invención sobreexpresa Pps en presencia de glucosa y dirige más flujo de carbono hacia la producción de DAHP. La siguiente lista de abreviaturas para compuestos comúnmente observados en la especificación y Ejemplos se presenta como sigue: DHQ 3-deshidroquinato DAH ácido 3-desoxi-D-arabino-heptulosónico DAHP 7-fosfato de ácido 3-desoxi-D-arabino-heptulosónico TSP sal de sodio 2 ,2, 3, 3-d-sub 4 ácido 3-(trimetilsilil) propionico PEP piruvato de fosfoenol NADH beta-nicotinamida adenina dinucléotido fosfato, forma reducida Kan canamicina Ap ampicilina Te tetraciclina Cm cloranfenicol Cepas y plásmidos Se utilizó Escherichia coli AB2847 aroB mal T6r, obtenido del Centro de Abastecimiento Genético de E. coli (E. coli Genetic Stock Center) , Universidad de Yale, como la cepa huésped preferida para la producción de DAH P. Para la identificación del clon tkt se utilizó BJ502 tkt-2 fhuA22 garB IO ompF627 fadL 701 relA I pit- 10 spo T1 mcrB1 phoM510, también del Centro de Abastecimiento Genético de E. coli. Como se describió anteriormente se construyó ppc: : Km, insertando un cassette da canamicina en un gen ppc clonado, ei cual se integró después al cromosoma mediante recombinación homologa . Se construyó el plásmido pPS341 (disponible del Departamento de Ingeniería Química, U niversidad de Texas A & M, Estación de Colegio, Texas, E. U .A.) mediante la clonación de un fragmento de ADN cromosomal de E. coli conteniendo el gen pps al vector de expresión inducido por IPTG, pUHE23-2 (un derivado de pBR322) como es enseñado por Patnaik et al . , y los contenidos de las cuales se incorporan aquí por referencia. El plásmido pPS341 X1 , que contiene el producto de gen inactivo de pps se construyó mediante mutagénesis de inserción de codon , los detalles de la cual se describen completamente en Patmaick et al. El gen pps sobre pPS341 se insertó con un Mu dlll 1734 lac* Kmr (Mud K), de acuerdo al protocolo publicado de Castiho et al. , los contenidos de la cual se incorporan aquí por referencia. En resumen, se hizo un lisato de Mu a partir de una cepa donadora POII 1734/pPS341 , el cual fue lisogenizado por el elemento mini-Mu y un Mu cts. El lisato se utilizó para infectar un lisogen Mu de HG4 pps pck, y se seleccionaron colonias para Apr y Kmr simultáneamente para asegurar que el elemento mini-Mu llevado al plásmido. Las colonias además se clasificaron para el fenotipo Pps' (inhabilidad para crecer del piruvato). El análisis de restricción del ADN de plásmido confirmó además la inserción del elemento MudK al gen pps sobre el plásmido pPS341. El 20% de estas colonias seleccionadas mostró expresión dependiente de IPTG de ß-galactosida, indicando una inserción en el marco. El plásmido de una de dichas colonias se denominó pPS1734, el cual después fue linearizado en el sitio Seal, y después transformado a la cepa JC7632 recB21 recC22 sbcB15. Los transformantes fueron seleccionados para Kmr y se clasificaron para la sensibilidad de Ap. Dichas colonias presumiblemente contuvieron pps::MudK sobre el cromosoma. Mediante el uso de la transducción de P1, este sitio fue movido a AB2847 y los transductores Kmr fueron clasificados adicionalmente para la inhabilidad de crecimiento de piruvato. Una de dichas colonias se designó como JCL1362 y se utilizó para estudios posteriores. La inserción de MudK al pps cromosomal se confirmó además mediante la frecuencia de cotransducción (89%) con el marcador Tef de la cepa CAG12151 zd7-925::Tn70. El plásmido pRW5, Genencor International, South San Francisco, CA, es derivado pACYC y contiene aroGfbr Este plásmido también contiene un gen lacl, y el aroGrbr es expresado de un promotor lac. Para construir el plásmido pAT1 que contiene tanto aroGrbr como tktA, un fragmento 5-Kb BamH1 de ADN de E. coli se cortó del fago 473 del minigrupo de Kohara (National Institute of Genetics, Japón), y se insertó al sitio -3amH 1 de pRW5. Se reportó que este fragmento contiene el gen tktA, y se confirmó, mediante su habilidad, que complementa una cepa tkt (BJ502) para crecimiento sobre ribosa, y también de la distancia de migración del producto de gen como se juzgó sobre 12% de SDS-PAG E (peso molecular de aproximadamente 72,500).

Construcción de pPS706 y el control Se construyó el plásmido pPS706 insertando un fragmento de PCR de 2.4 kb conteniendo el gen pps menos promotor en el vector pJ F1 18EH . Los cebadores fueron diseñados de la secuencia de pps publicada y contuvo un sitio EcoRI y un extremo 5' de sitio de unión de ?10 ribosoma de la secuencia pps y un extremo 3' de sitio de BamK l de la secuencia. El producto de PCR se clonó después a los sitios de EcoRI u Bam \ de pJF1 18EH . Se seleccionaron clones positivos con base en la complementación de HG4 pps para el crecimiento sobre piruvato. La expresión de pps, de esta construcción, se controló por medio del promotor tac inducible mediante IPTG . El plásmido pPSL706 se construyó después de pPS706, como se muestra en la Figura 5. En resumen, un fragmento de ScalEcoR , conteniendo el gen pps, se cortó de pPS706 y se purificó del regulador de pH de restricción . Este fragmento después se clonó a un fragmento purificado de Scal-EcoR\ , conteniendo el promotor luxl de pGS 103, dado amistosamente al inventor por Tom Baldwin . Departamento de Bioquímica y Biofísica, Universidad de Texas A & M. La expresión, que utiliza este sistema, se controló por el autoinductor (Al) en los medios de cultivo. pPSL706 es ampicilina resistente y compatible con otros derivados de pACY184, tales como pRW5 y pAT1 Las cepas y los plásmidos utilizados se resumen en el Cuadro I y en el Cuadro I I .

CUADRO I Cepas Bacterianas CUADRO II Plásmidos Medios y Condiciones de crecimiento Todos los procedimientos de clonación se realizaron en un medio de Luria-Bertani . El medio YE contuvo K2H PO4 (14 g/L), KH2PO4 (16 g/L) , (N H4)2SO4 (5 g/L), MgSO4 (1 g/L), extracto de levadura (15 g/L), y D-glucosa (15 g/L). El medio mínimo utilizado para cultivos de resuspensión de célula de alta densidad contiene por litro, K2HPO4 (14 g) , KH2PO4 (16 g), (N H4)2SO4 (5 g), MgSO4 (1 g), D-glucosa (15 g) y también se suplemento con tiamina (1 mg), ácido siquímico (50 mg), L-tirosina (8 mg), L-fenilalanina (8 mg), y L- triptofano (4 mg). El medio mínimo se suplemento con succinato (0.1 g/L), cuando creció el mutante ppc y su control . Para el mantenimiento estable de los plásmidos, se añadieron al medio de cultivo, ampicilina (100 mg/ml), cloranfenicol (50 mg/ml). La concentración de los antibióticos se redujo a la mitad cuando se utilizó el medio mínimo. Se hicieron crecer cultivos durante la noche en el medio YE a 37°C en un tambor de rodillo y después se subcultivaron en el mismo medio con capacitación apropiada. Se hicieron crecer cultivos en matraces de agitación de 250 ml, a 37°C en un baño giratorio de agua, agitado a 200 rpm . Después de cuatro horas de incubación (ODS50: 2-3) los cultivos se indujeron con isopropil-ß-D-tiogalacto-piranosida, IPTG ( 1 M). Las células se cosecharon a partir de la última fase estacionaria mediante centrifugación a 6000 x G , y se lavaron dos veces con medio mínimo antes de la resuspensión en el mismo medio mínimo suplementado con capacitación apropiada de I PTG (1 mM). Los OD5so de los cultivos de resuspensión de alta densidad fueron de aproximadamente 4.0. La densidad óptica puede ser mayor que 4.0. En otros términos, los medios pueden contener por lo menos 5 x 109 células/mL. Las muestras de los cultivos de resuspensión fueron retiradas periódicamente para analizar la concentración de DAH(P) y glucosa en el medio.

Determinación de glucosa y DAHP Se removieron células de muestras mediante centrifugación y los sobrenadantes se almacenaron a 4°C hasta que las muestras se recogieron. Se determinó la glucosa residual en el sobrenadante del cultivo mediante el ensayo de ácido dinitrosalicílico para el total de azúcares reductores. Para información adicional de este ensayo, ver Miller (Millet, G. L. 1958. Uso del reactivo de ácido dinitrosalicílico para la determinación de azúcares reductores. Anal. Chem. 31 :426-428) y Patnaik et al . (Patnaik, R. , W. D. Roof, R. F. Young, y J.C. Liao. 1992. Estimulación del catabolismo de glucosa en Escherichia coli mediante un ciclo fútil potencial. J . Bacteriol. 174: 7527-7532) , los contenidos de los cuales se incorporan aquí por referencia. La concentración de DAH(P) en el sobrenadante se determinó mediante el ensayo de tiobarbiturato. Para información adicional de este ensayo, ver Draths et al . , y Gollub et al. (Gollub, E. , H . Zaikin, y D. B. Springson, 1971 . Ensayo para Sintasa de 7-fosfato de Acido 3-desoxi-D-arabino-hetulosónico. Métodos en Enzimiología 17A: 349-350) , los contenidos de ios cuales se incorporan aquí por referencia, este ensayo no distingue entre DAH y DAH P.

Ensayos de enzima Se cosecharon células mediante centrifugación a 6000 x G y se lavaron y se resuspendieron en un regulador de pH de fosfato de potasio (50 mM) pH , 7 o 5 mM de Tris-CI-1 mM de MgCI2 (pH 7.4), para el ensayo de sintasa de DAHP o sintasa de PEP, respectivamente. Se prepararon extractos de células rompiendo las células a través de una célula de presión French (S LM Aminco, Urbana, Y1 1 ) a 1 1248 kg/cm2. Se analizó la actividad de sintasa de DAH P mediante el procedimiento de Schoner, como se describe más completamente en Schoner et al. (Schoner, R . y K. M . Herrmann . 1976. Sintasa de 7-fosfato de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato. J . Biol. Che. 251 :5440-5447), los contenidos de la cual se incorporan aquí por referencia. Se analizó la actividad de Pps como se describió previamente. Se determinó la proteína total con el reactivo seco de Bio-Rad (ensayo de Bradford) con albúmina de suero de bovino como el normal.

Efectos sobre Pps en la producción de DAHP a partir de glucosa El propósito de construir pPS706 fue expresar Pps con un promotor inducible no afectado por I PTG. Este plásmido, junto con pRW5, proveyó un medio para variar las actividades de las enzimas, Pps y AroG, independientemente bajo el control de dos diferentes promotores. La tercera enzima, TktA , estuvo bajo el control de su promotor natural y de esta manera variable solamente en el modo de encendido/apagado (presencia o ausencia del gen), este sistema entonces permitió la examinación del efecto de Pps sobre una amplia variedad de condiciones. Además, es posible que este sistema pueda mostrar un punto óptimo, en donde las actividades de la enzima fueran lo suficientemente altas para proveer una producción máxima de DAH P, pero tan altas que ejerza una carga de proteína sobre el sistema, reduciendo la producción de DAH P como resultado. Por lo tanto, se midió la producción de DAHP mediante AB2847/pRW5/pPS706 y AB2847/pAT 1 pPS706 en un medio de glucosa a concentraciones variables de ITPG y autoinductor (N-(3-xox-hexanoil)-humoserina lactona) .

La Figura 6 muestra el efecto de Pps a varias concentraciones de Al de IPTG en un medio de glucosa . A concentraciones bajas de IPTG (actividades bajas de AroG), Pps tiene poco o ningún efecto. Cuando la concentración de I PTG excedió 50 mM, se empezó a mostrar el efecto de Pps. Como un control se utilizó el plásmido pGS104, isogénico con pPS706, excepto para el sitio de pps, y no se mostró ningún efecto con o sin la adición de Al. El efecto de Pps fue más significativo en la cepa que sobreexpresa TktA, y no fue debido a una variación en las actividades de AroG o TktA, ya que las actividades de AroG y TktA mostraron ser constantes con o sin sobreexpresión de Pps. A partir de la medición de glucosa residual (datos no mostrados), las producciones de DAH P a partir de glucosa alcanzaron 100% , lo cual corresponde a 70-80% después de ajustar la sobreestimación de DAH P. El último valor es consistente con aquel predicho por el análisis estequiométrico, que indica un rendimiento teórico máximo de 86% a partir de la glucosa, cuando se hizo recircular piruvato hacia PEP mediante Pps. Aunque se observaron incrementos en los niveles de DAH P y las producciones con Pps, no se hizo evidente una caída con una actividad superior de Pps, lo podría haber provisto un pico. Los niveles de DAHP más bien parecen alcanzar la saturación con inducción adicional de Pps.

Formación de subproductos Para obtener un discernimiento en la distribución de flujo metabólico, el caldo de cultivo se analizó para la fermentación de subproductos, mediante el uso de H PLC. Se tomaron muestras de los cultivos en medios de glucosa con actividades variables de Pps, AroG y TktA. Los resultados indican que la cepa huésped AB2847 produjo acetato, succinato y formiato, como los subproductos principales, cuando ni AroG ni Pps se sobreexpresaron. La producción de estos ácidos generalmente se redujo con el incremento en la concentración de I PTG, excepto formiato. Esta reducción se correlaciona con el incremento en la producción de DAHP. Cuando se cultivó AB2847/pAT1 /pPS706 en glucosa con una concentración de IPTG más allá de 50 mM, el caldo presentó niveles inaceptables de estos ácidos (datos no mostrados) . Mientras que los niveles de ácido fórmico y de ácido acético se redujeron con el incremento en la actividad de Pps, el ácido succínico o se mantuvo constante (OµM IPTG) o se incrementó (10.50µM IPTG) con un incremento en la actividad de Pps. Este incremento puede ser contribuido al incremento inducido por Pps en el nivel de PEP, el cual es vertido a través de carboxilasa de PEP y finalmente a succinato.

EJEMPLO 1 Producción de DAHP Este ejemplo demuestra que E. coli AB2847 es incapaz de utilizar DAH P, y acumula DAH P en el medio, si se sobreexpresa la sintasa de DAH P. Esta cepa se utilizó como un huésped para detectar el flujo depositado a las trayectorias aromáticas. Ya que Draths et al . (Draths, K. M . , D. L. Pompliano, D. L. Conley, J .W. Frost, A. Berry, G. L. Disbrow, R.J. Staversky, y J .C. Lievense, "Síntesis Biocatalítica de aromáticos a partir de D-glucosa: El papel de la Transcetolasa". J . Am . Chem. Soc . 1992, 1 14, 3956-3962) han mostrado una posible limitación en la producción de DAHP por E4P, pAT1 (conteniendo tanto aroGfrb como tktA) se transformó a AB2847 para eliminar la limitación de E4P. Para probar si el suministro de PEP limita la producción de DAH P, la sintasa de PEP (Pps) se sobreexpresó en AB2847/pAT1 transformando el plásmido pP341 a esta cepa. Se expresaron 20-70 copias del gen pps en las células huésped. Como un control, se substituyó pPS341 por pPS341 X1 , el cual codifica un producto de gen pps inactivo, pero estable. El uso de Pps inactivo permitió la discriminación entre el efecto de la actividad de Pps y aquella de la sobreexpresión de la proteína. También se utilizaron A B2847/pAT1 /pUH E23-2 y AB2847/pAT1 sin ningún otro plásmido, como controles adicionales para identificar el efecto del vector de clonación , pUH E23-2 , en la producción de DAHP. Como se describió anteriormente, las cepas se hicieron crecer en un medio enriquecido (YE) con I PTG y se resuspendieron en un medio mínimo. Ya que la sobreexpresión de Pps bajo condiciones g Neolíticas puede ocasionar la inhibición del crecimiento, se utilizaron cultivos de resuspensión para reducir al mínimo el efecto del crecimiento de célula en la conversión biocatal ítica. Después de la resuspensión , se midieron periódicamente el DAH P excretado y la glucosa residual. A las 27 horas después de la resuspensión, se tomaron muestras para los ensayos de Pps y de AroG. La Figura 1 A muestra la cepa que sobreexpresa Pps activo incrementó la producción de DAHP casi el doble. Las cepas que contienen pPS341 X1 o pU HE23-2 produjeron la misma cantidad de DAH P, como el único conteniendo solamente pAT1 . La Figura 1 B muestra que, como se esperaba, la actividad Pps se sobreexpresó 10 veces en la cepa que contiene pPS341 , mientras que la actividad de aroG en todas las cepas permaneció casi constante. Estos datos sugieren fuertemente que la actividad de Pps es responsable del incremento en la producción de DAHP, mientras que el Pps inactivo o el vector de clonación no tuvo ningún efecto observable en la producción de DAH P. Los regímenes específicos de consumo de glucosa de estas cepas no se vieron influenciados por la presencia de Pps activo o inactivo, ni por el vector de clonación (datos no mostrados). Por lo tanto, la cepa que sobreexpresa Pps mostró un incremento, de casi el doble, en la producción total de DAH P (aproximadamente 90% molar), comparado con los controles (aproximadamente 52% molar) , sugiriendo que Pps mejora tanto la productividad como el rendimiento de la producción de DAHP. El rendimiento teórico máximo de glucosa a DAH P es de 86% , el cual es ligeramente menor que el rendimiento medido de la cepa que sobreexpresa Pps. Debido a que las mediciones tanto de la glucosa como de DAHP fueron razonablemente reproducibles, la discrepancia puede atribuirse a la inexactitud del coeficiente de extinción utilizado para calcular la concentración de DAH P. Sin embargo, el coeficiente de extinción ha sido calibrado mediante DAHP biosintetizado a partir del extracto de célula y de cantidades conocidas de E4P y de PEP. Los resultados muestran que el coeficiente de extinción está absolutamente dentro de un 30% de exactitud. Por lo tanto, el rendimiento de DAH P está razonablemente cerca del máximo teórico, aunque puede ser y probablemente es menor que el valor teórico. Para determinar si también el efecto de Pps requiere de transcetolasa sobreexpresada (Tkt) , se utilizó el plásmido pRW5, el cual contiene solamente aroGfbr, en lugar de pAT1 en los experimentos anteriores. Se encontró que la sobreproducción de Pps no incrementó la producción de DAHP (Figura 2A) sin la actividad elevada de Tkt. Por lo tanto, en cuanto a lo que concierne la limitación de pequeñas moléculas en la biosíntesis de DAH P, la primera limitación surge del suministro de E4P. Este obstáculo cambia al suministro de PEP cuando se sobreexpresa Tkt, el cual se cree que incrementa el suministro de E4P.

EJEMPLO 2 Como se observó anteriormente, la sobreexpresión de Pps mejoró la producción de DAH P a partir de glucosa. Existe un gran interés en saber si el nivel basal de la expresión de Pps, en el medio de glucosa, contribuyó a la producción de DAH P. Por lo tanto , el gen pps cromosomal en la cepa AB2847 fue suprimido. La cepa resultante (JCL1362) se utilizó como el huésped para repetir los experimentos anteriores. Los resultados muestran que la inactivación de pps cromosomal no afectó significativamente la producción de DAH P en cepas que contienen pRW5 o pAT1 (figura 2B). De esta manera, el nivel basal de la expresión de pps, en el medio de glucosa, no contribuyó a la producción de DAH P. Ya que PEP también se convirtió a OAA por Ppc, la eliminación de esta enzima puede incrementar el suministro de PEP. Así, el gen ppc sobre el cromosoma AB2847 fue inactivado para determinar si la producción de DAH P puede ser incrementada sin la sobreexpresión de Pps. Esto se realizó mediante la transducción de AB2847 con un lisato P 1 crecido sobre JCL1242ppc: : Km . El transductor resultante, JCL1283 aroB ppc: : Km fue entonces transformado con pAT1 o pRW5 y se probó para la producción de DAH P en el cultivo de resuspensión, como se describió anteriormente. Para evitar la limitación de OAA en la cepa ppc, el medio de cultivo se suplemento con succinato, el cual mostró no tener ningún efecto sobre la producción de DAH P (datos no mostrados). Contrario a lo que se esperaba, la mutación de ppc no incrementó la producción de DAH P (Figura 2B), sugiriendo que el flujo metabólico de PEP a OAA no fue significativo bajo las condiciones experimentales probadas aquí. De hecho, la mutación de ppc en realidad redujo la producción de DAH P por razones desconocidas.

EJEMPLO 3 Producción de Triptofano Las tecnologías existentes para la producción de triptofano utilizan ya sea microorganismos de existencia natural , microorganismos mutados o microorganismos genéticamente procesados por ingeniería. Estos microorganismos incluyen , pero no se limitan a, Escherichia coli, Brevibacteria, Corynebacteria, y levadura. Las trayectorias alteradas pueden incluir: (1 ) la eliminación de trayectorias que se ramifican hacia fenilalanina y tirosina; (2) la eliminación de quinasas de piruvato (pyk) ; (3) la eliminación de carboxilasa de PEP (ppc) ; (4) la eliminación de isomerasa de fosfoglucosa (pgi); (5) desensibilización de la inhibición de retroalimentación de enzimas en la trayectoria de corismato y el operon trp; (6) la eliminación del represor, trpR, y la secuencia de atenuación en el operon trp; (7) la eliminación de enzimas de degradación de triptofano; (8) la sobreexpresión de las enzimas de operon trp; (9) la sobreexpresión de AroF, AroG o AroH de tipo silvestre o resistentes a la retroalimentación , o cualquier enzima en la trayectoria de corismato; (10) la sobreexpresión de SerA; y ( 1 1 ) la sobreexpresión de TktA o TktB. Para producir triptofano, se puede utilizar como un huésped la cepa ATCC31743, la cual contiene marcadores cromosomales, tales como trpR ?(trAE) tna. Esta cepa también contiene un plásmido pSC 102trp, el cual habita el operon trpE. Los plásmidos pAT1 y pPS341 (o pPS706 o pPSL706) pueden ser transformados a esta cepa. El gen SerA puede ser clonado a cualquiera de los plásmidos. Alternativamente, estos genes clonados (trpAE, aroG, tktt, pps, o serA) pueden ser consolidados a uno o dos plásmidos. La cepa resultante se hizo crecer en un medio MT, el cual contiene, por litro: KH2PO4, 3g; K2HPO4, 3g ; K2H PO4, 7 g; N H4CL, 3g ; MgSO4, 0.2 g ; FeSO4 7H2O, 10 mg, glucosa 0 a 30 g. La tecnología de Pps es compatible con todas las alteraciones anteriores en metabolismo. Las alteraciones que favorecen el suministro de E4P, tales como la eliminación de isomerasa de fosfoglucosa, pueden eliminar la necesidad de la sobreexpresión de Tkt asociada con Pps en la modalidad preferida. Los niveles más altos de AroG también pueden eliminar la necesidad de la sobreexpresión de Tkt. La tecnología de Pps puede ser utilizada en microorganismos, tales como Brevibacteria y Corybacteria.

EJEMPLO 4 Producción de Fenilalanina Las alteraciones de trayectoria para la producción de fenilalanina son similares a las anteriores, excepto en las trayectorias terminales que conducen a la fenilalanina. Estas incluyen (1 ) la sobreexpresión de las enzimas de corismato a fenilalanina; (2) eliminación de operon de trayectoria; y (3) eliminación de enzimas de degradación de fenilalanina, y (4) desenbilización de todas las enzimas de DAHP a fenilalanina, de manera que no sean inhibidas por la última. Para producir fenilalanina, se puede utilizar como un huésped un mutante de E. coli (W3110 Atrp Atyr Aphe) (ref: Forberg, Eliaeson y Haggstrom, 1988). Los plásmidos pAT1 y pPS341 (o pS706, pPSL706) entonces pueden ser transformados a esta cepa. Además, el gen phefbr del plásmido pJN6 (misma ref) puede ser cortado y ligado ya sea a pPS341 o pAT1. La cepa resultante puede cultivarse en el siguiente medio que contiene, por litro, NH4CL, 5g; K SO4, 0.8g; KH2PO4, 0.5 G; NaHPO4, 1 G; citrato de Na, 2.5 g; FeCL36H2O, 0.01 g; CaCI2 2H2O, 0.20; MgCI2 6H2O, 0.8 g; tirosina, 0.05 g; triptofano, 0.025 g, glucosa 10-30 g.

EJEMPLO 5 Producción de Tirosina Las alteraciones de trayectoria para la producción de tirosina son similares a las anteriores, excepto en las trayectorias terminales que conducen a la tirosina. Estas incluyen: (1) la sobreexpresión de ias enzimas de corismato a tirosina; (2) la eliminación del operon trp y la ramificación de fenilalanina; (3) la eliminación de enzimas de degradación de tirosina; y (4) la desensibilización de todas las enzimas de DAHP a tirosina, de manera que no son inhibidas por la última.

EJEMPLO 6 Producción de índigo La producción de índigo puede lograrse convirtiendo triptofano o un intermediario de la trayectoria tpr a índigo, ya sea in vitro o in vivo. Ya que la tecnología de Pps incrementa la producción de DAH P, también incrementará el suministro de cualquier metabolito que sirva como el precursor para índigo. Para producir índigo, la cepa productora de triptofano, descrita anteriormente, puede ser utilizada como huésped. Sin embargo, la cepa necesita hacerse tna+ y sobreexpresando dioxigenasa de naftaleno de Pseudomonas putida. En esta cepa, el triptofano producido será generado por la triptofanoasa a indol, el cual se convierte después a cis-indol-2, 3-dihidrodiol por la dioxigenasa de naftaleno clonada. Este cis-indol-2 , 3-dihidrodiol producido es espontáneamente convertido a índigo en presencia de oxígeno. ATCC31743 es la cepa utilizada en la conversión de DAHP a triptofano.

EJEMPLO 7 Producción de orgánicos quinoides Los orgánicos quinoides pueden derivarse de deshidroquinato, el cual es un metabolito de extremo 3' de DAHP. Para producir ácido quínico, se puede utilizar como un huésped E. coli AB2848 aroD que aloja pTW8090A, el cual contiene el gen qad (deshidrogenasa de ácido quínico de Klebsiella pneumoniae) (ref: Draths, Ward, y Frost, 1992, JACS, 1 14, 9725-9726), y pKD136 (ref: igual que la anterior), el cual contiene genes tkt, aroF, y aroB. El gen pps puede ser clonado a uno de estos plásmidos y puede ser simultáneamente sobreexpresado. Se ha reportado que por lo menos 80 mM de D-glucosa puede ser convertida a 25 mM de ácido qu ínico. Después de la remoción de célula, el ácido quínico, en el sobrenadante, puede ser convertido a benzoquinona, después de la adición de ácido sulfúrico y dióxido de manganeso (IV) de grado técnico, y calentando a 100°C durante 1 hora. En ausencia de la acidificación , las soluciones acuosas de ácido qu ínico purificado se convirtieron a hidroquinona en un rendimiento del 10% bajo calentamiento a 100°C durante 18 horas, con dióxido de manganeso de grado técnico.

EJEMPLO 8 Producción de Catecol La producción de catecol puede lograrse transformando pps a E. coli expresando pKD 136. Ya que la tecnología de Pps incrementa la producción de DAH P, también incrementará el suministro de cualquier metabolito que sirva como el precursor para catecol.

EJEMPLO 9 Caracterización de la Expresión de pps dirigida por luxl' Para caracterizar la expresión de pps dirigida por luxl', se transformó pPS706 a AB2847/pRW5 y AB2847/pAT1 , y se midió la actividad de Pps cuando las cepas se cultivaron en un medio ya sea de glucosa o de xilosa. La actividad de Pps se incrementó con la concentración del autoinductor (N-(3-xox-hexanoil)-hemoserina lactona) y se alcanzó la saturación cuando se utilizó 1 µM de autoinductor. La actividad de Pps, en la misma cepa que creció en un medio de xilosa, fue igual a aquella en la glucosa. La actividad Pps fue independiente de la concentración de I PTG (datos no mostrados) . Por lo tanto, el inventor logró la modulación independiente de tres enzimas clave en la producción de aromáticos: AroG (I PTG-inducible), TktA (encendido/apagado o presencia/ ausencia) y Pps (autoinductor-inducible) . Aunque de acuerdo con los estatutos de la patente, el mejor modo y las modalidades preferidas de la invención han sido descritos, se debe entender que la invención no está limitada a la misma, sino que más bien va a ser medida por el alcance y el espíritu de las reivindicaciones anexas.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES 1 .- Un método para incrementar el flujo de carbono hacia la trayectoria aromática común de un microorganismo, dicho método comprende modificar un microorganismo para eliminar el paso de limitar la producción de PEP. 2.- Un método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la modificación del microorganismo es tal que incrementa la expresión de una proteína que cataliza la conversión de piruvato PEP. 3.- Un método de acuerdo con la reivindicación 2 , en donde la proteína es Pps. 4.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, o 3, en donde el microorganismo es modificado por la transformación con un vector que comprende un gen Pps. 5.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además el paso de cultivar el microorganismo modificado en un medio. 6.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la célula huésped es transformada con un plásmido, el cual es pPS341 , PSL706, pPS706. 7.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho método es para mejorar la producción biosintética de célula huésped de compuestos derivados de la trayectoria aromática común . 8.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho método es para mejorar una producción biosintética de célula huésped de compuestos derivados de DAH P. 9.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho método es un método para la producción de un metabolito aromático, el cual es triptofano, tirosina, fenilalanina, catecol , índigo, ácido quínico, benzoquinona o hidroquinona. 10.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho método es un método para la producción de un metabolito cíclico, en donde el microorganismo modificado es un cepa genéticamente procesada por ingeniería adaptada para producir dicho metabolito cíclico. 1 1.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho método es un método para producir DAMP. 12.- Un método de acuerdo con la reivindicación 1 1 , en donde dicho método comprende además el paso de aislar DAMP. 13.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el cual comprende además el paso de modificar el microorganismo con el fin de incrementar la expresión de una segunda enzima que cataliza una reacción adicional en la trayectoria aromática común . 14.- Un método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la enzima es sintasa de DAM P, sintasa de DHQ , sintasa de PEP o Tkt. 15.- Un método de acuerdo con la reivindicación 12 , 13 o 14 en donde el microorganismo es modificado mediante la transformación del microorganismo con un vector que comprende un gen que codifica para dicha enzima. 16.- Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el gen es aroF o aroB. 17.- Un método de acuerdo con la reivindicación 15 o 16, en donde el vector es el plásmido PAT1 . 18.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el microorganismo es una cepa de E. coli. 19.- Un método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la cepa de E. coli es AB2847AROB. 20.- El producto de un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19. 21 .- Un vector que comprende un gen que codifica para Pps. 22.- Un vector de acuerdo con la reivindicación 21 , que comprende además un gen aroF o un gen aroB. 23.- Un vector de acuerdo con la reivindicación 21 o 22 , el cual es el plásmido pPSL706 , pPS706 o pPS341 . 24.- Una molécula de ADN que comprende un plásmido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23. 25 - Una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende además un gen que codifica sintasa de DAHP o Tkt. 26.- Un método para producir un microorganismo que tiene niveles incrementados de DAH P, dicho método comprende el paso de modificar un microorganismo con el fin de eliminar el paso de limitación de la producción de PEP. 27.- Un método de acuerdo con la reivindicación 26, en donde la eliminación del paso de limitación de la producción de PEP es efectuada incrementando la expresión de una proteína que cataliza la conversión de piruvato a PEP. 28.- El método de acuerdo con la reivindicación 27, en donde la proteína que cataliza la conversión de piruvato a PEP es Pps. 29.- Un método de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende transformar el microorganismo con un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23. 30.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en donde el microorganismo es una cepa genéticamente procesada por ingeniería para utilizar niveles incrementados de DAH P para producir un producto deseado. 31 .- U n método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, en donde comprende además el paso de modificar el microorganismo con el fin de incrementar la expresión de una o más enzimas para utilizar los niveles incrementados de DAH P para producir un producto deseado. 32 - U n método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 31 , en donde el producto deseado es triptofano, tirosina, fenilalanina, catecol, índigo, ácido quínico, benzoquinona o hidroquinona. 33.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31 , en donde comprende además el paso de modificar el microorganismo con el fin de incrementar la expresión de Tkt. 34.- U n método de acuerdo con la reivindicación 32 , en donde el microorganismo es transformado con pAT1 . 35.- Un microorganismo que se puede producir mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 26 a 34. 36.- Un cultivo que comprende un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 35. 37.- Un método para producir metabolitos cíclicos que comprende los pasos de: (a) transformar a un microorganismo para sobreexpresar Pps y Tkt; y (b) incluir glucosa para cultivar el microorganismo transformado en un medio. 38.- El método de acuerdo con la reivindicación 37, que comprende además el paso de aislar el DAH P. 39.- El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde Pps es sobreexpresado acoplando el gen Pps con u na secuencia promotora. 40.- El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el microorganismo es Escherichia coli AB2847. 41.- El producto del procedimiento de la reivindicación 37. 42.- El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el paso de sobreexpresar el Pps comprende transformar un plásmido seleccionado del grupo que consiste de pPS341, pPSL706 y pPS706 al microorganismo. 43.- El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde Tkt es provista por la sobreexpresión del gen Tkt transformando el plásmido pAT1 al microorganismo. 44.- Un cultivo que contiene un microorganismo modificado con ADN, que comprende un gen pps y un gen tkt, dicho cultivo es capaz de producir niveles incrementados de DAHP por la fermentación en un medio nutriente acuoso que contiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y substancias inorgánicas. 45.- El método de acuerdo con la reivindicación 44, en donde el microorganismo está adaptado para utilizar DAHP para producir metabolitos cíclicos. 46.- El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde los metabolitos se seleccionan del grupo que consiste de triptofano, tirosina, fenilalanina, catecol, Índigo, ácido quínico, benzoquinona e hidroquinona. 47.- Un elemento genético que comprende un gen Pps y un gen seleccionado del grupo que consiste de un gen aroF y un gen aroB. 48.- Un vector que lleva el elemento genético de la reivindicación 47. 49.- El ADN de la reivindicación 48, en donde el vector es un plásmido seleccionado del grupo que consiste de pPSL706 y pPS706. 50.- El ADN de la reivindicación 49, que comprende además un gen que codifica para sintasa de DAH P. 51 .- El ADN de la reivindicación 50, que comprende además un gen que codifica para Tkt. 52.- Un método para mejorar una producción biosintética de célula huésped de compuestos derivados de DAH P con relación a la producción biosintética de célula huésped de tipo silvestre de dichos compuestos, dicho método comprende el paso de incrementar la expresión en una célula huésped de una proteína que cataliza la conversión de piruvato a PEP. 53.- El método de acuerdo a la reivindicación 52 , que comprende además el paso de incrementar la expresión en la célula huésped de una proteína que cataliza reacciones en la trayectoria aromática común. 54.- El método de acuerdo a la reivindicación 53, en donde la proteína exhibe actividad de sintasa de DAH P o actividad de sintasa de DHQ. 55.- El método de acuerdo a la reivindicación 53, en donde la proteína exhibe actividad de sintasa de PEP.