MXPA97001445A

MXPA97001445A - Enterotoxina mutante eficaz como adyuvante oral no toxico

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Publication number: MXPA97001445A
Application number: MXPA/A/1997/001445A
Authority: MX
Inventors: D Clements John; L Dickinson Bonny
Original assignee: The Administrators Of The Tulane Educational Fund
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1997-02-26
Publication date: 1998-10-23

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el uso de una forma mutante novedosa de enterotoxina termolábil de E. coli, la cual ha perdido su toxicidad pero conservado su actividad inmunológica. Esta enterotoxina se emplea en combinación con un antígeno no relacionado para lograr una respuesta inmunológica incrementada a dicho antígeno cuando se administra como parte de una preparación de vacuna oral.

Description

ENTERDTOXI A MUTANTE EFICAZ COMO ADYUVANTE ORAL NO TOXICO La investigación descrita en esta especificación fue apoyada en parte por la Marina de los Estados Unidos de América- No. de Beca N00014-83- -0192. El gobierno tiene ciertos derechos sobre esta invención. 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se enfoca directamente a un mutante genéticamente distinto de enterota:. ina termalábil de E. coli (LT) y a su. uso como adyuvante oral para inducir anticuerpos mucosales y séricos. Específicamente, la LT mutante se modifica por medio de una sustitución un aminoácido que anula su tonicidad inherente pero deja intactas las propiedades adyuvantes de la molécula. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Patógenos microbianos pueden infectar un huésped por uno de varios mecanismos. Pueden penetrar en una abertura en el integumento inducida por un trauma, pueden ser introducidos por transmisión vectoriana, o bien pueden interactuar con una superficie mucosal. La mayoría de los patógenos humanos inician una enfermedad por este mismo mecanismo, es decir, después de la interacción con superficies mucosales. Patógenos bacterianos virales que actúan a través de este mecanismo entran primero en contacto con la superficie mucosal donde pueden fijarse y después colonizar o bien pueden se absorbidos por células de absorción especial i zadas (células M) en el epitelio que recubre los parches de Peyer y otros folículos linfoides (Boc an y Cooper, 1973, Am. J. Ant. 136: 455-477; Ornen et al., 1986, J. Infect. Dis. 153:1108-1118). Los organismos que penetran en los tejidos linfaides pueden ser matados fácilmente dentro de los folículos linfoides, provocando así una respuesta in unológica potencialmente protectora cuando los antígenos se suministran a células inmunes dentro de los folículos (por ejemplo, Vibrio cholerae). Alternativamente, organismos patogénicos capaces de sobrevivir a mecanismos de defensa locales pueden esparcirse a partir de los folículos y provocar subsecuentemente una enfermedad local o sistémica (es decir, Sal onella spp., pol i virus, rotavirus en huéspedes inmunocomp ometidos) . Anticuerpos secretorios de IgA (slgA) dirigidos contra determinantes de virulencia específicos de organismos infecciosos desempeñan una función importante en la inmunidad mucosal global (Cebra et al., 1986, En: Vaccines 86, Brown et al. (ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, Ne<» York. págs. 129-133). En muchos casos, es posible evitar la infección inicial de las superficies ucasales mediante la estimulación de la producción de niveles del slgA mucosales enfocados hacia determinantes de virulencia relevantes del orga i mo infecc oso. Las IgA de secre ión pueden prevenir la interacción inicial del patógeno con la superficie mucosal mediante el bloqueo de la fijación y/o colonización, mediante la neutralización de las toxinas que actúan en la superficie, o bien evitando la invasión de las células huéspedes. Mientras se ha realizado una investigación importante para determinar la función de la inmunidad mediada por células y de los anticuerpos séricos en la protección contra agentes infecciosos, se sabe menos de la regulación, inducción, y secreción de slgA. Preparaciones de virus enteros o bien de células enteras desactivadas administradas parenteralmente son efectivas para provocar reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado de IgG sérica contra organismos que tienen una fase sérica significati a en su patogénesis (por ejemplo, Salmonella typhy, hepatitis B) . Sin embargo, vacunas parenterales no son efectivas para provocar respuestas mucosales de slgA y son inefectivas contra bacterias que interactúan con superficies mucosales y no invaden (por ejemplo, Vibrio cholerae). Sin embargo existen evidencias recientes según las cuales vacunas administradas parenteralmente pueden ser efectivas contra cuando menos un virus, rotavirus, que interactúa primariamente con superficies mucosales (Conner et al., 1993, J. Virol. 67:6633-6641). La protección resulta probablemente de la transudación de IgG específica de antígeno sobre superficies mucosales para la neutraliza ión de virus. Por consiguiente, mecanismos que estimulan tanto los anticuerpos séricos como mucosales son importantes para vacunas efectivas. Una inmunización oral puede ser efectiva para la inducción de respuestas slgA específicas y los antígenos son presentados a los ucositos T y B y células accesorias contenidas dentro de los parches de Peyer donde se inicia el desarrollo preferencial de las células B de IgA. Los parches de Peyer contienen células T cooperadoras íTH) que median el cambio de isotipo a células B directamente a partir de las células IgM a células B de IgA. Los parches contienen también células T que inician la diferenciación de las células B terminales. Las células B cebadas migran después hacia los nodos linfáticos mesentépcas y se someten a diferenciación, penetran el ducto torá ico, después la circulación general y subsecuentemente se dispersan en todos los tejidos secretorios del cuerpo incluyendo la lámina propia de los intestinos y del tracto respiratorio. La IgA se produce después por la células plasmáticas maduras, se compleja con el componente secretorio enlazado a membranas, y se transporta en la superficie mucosal donde se encuentra disponible para interactuar con patógenos invasores (Strober y Jacobs, 1985, En: Advances ín host defense mechanisms. Vol. 4 Mucosal Immu ty, Gallin y Faucí (ed.), Raven Press, New York. pA . 1-30; Tomasi y P_lut, 1985, En: Advances ín host defense echanisms. Vo] . 4. Mucosal I munity, Gallip y Fauci (ed.), Raven Press, New York. págs. 31-61). La existencia de este sistema in unológico mucosal común explica en parte el potencial de las vacunas orales vivas y de la inmunización oral para la protección contra organismos patogénicos que inicial la infección interactuando primero con las superficies mucasales. Se han desarrollado numerosas estrategias para la i munizción oral, incluyendo el uso de mutantes atenuados de bacterias (por ejemplo, Sal onella spp.) como vehículos de antígenos heterólogos (Cñardenas y Clements, 1992, Clin.

Microb iol. P.e . 5:328-342? elements et al., 1992, En: Recombinant DNA Vaccines: Rationale y Strategy, Isaacson (ed.), Marcel Decker, New York. págs. 293-321; Clements y Cárdenas, 1990, Res. Microbiol. 141:981-993; Clements y El-Morshidy, 1984, Infect. Im un. 46:564-569), encapsulación de antígenos en microesferas compuestas de pal i-DL-lactida-glicólido (PGL), polímeros, proteinóidos similares a proteínas (santiago et al., 1993, Pharmaceutical Research 10:1243-1247), cápsulas de gelatina, formulaciones diferentes de liposomas (Alving et al., 1986, Vaccine 4:166-172; Garcon y Six, 1993, J. Immunol. 146:3697-3702; Gould-Fogeri e y Mannino, 1993, En: Liposo e Tehcnolsgy 2nd Edition. Vol. III» Gregoriadis (ed.)), adsorción en nanopart ículas, uso de complejos de estimulación inmunol gica lipofí lieos (ISC0MS) (Mowat y Donachie, 191, I unology Today 12:383-385), y adición de productos bacterianos con propiedades adyuvantes conocidas (Clements et al., 1988, Vaccine 6:269-277; Elson, 19B9, Im unology Today 146:29-33; Lycfce y Hol gren, 1986, Immunolagy 59:301-308; Lycfee et al., 1992, Eur. J. I unol . 22:2277-2281). Los dos productos bacterianos con el potencial más importantes para funcionar como adyuvantes orales son la toxina de cólera (CT), producido por varias cepas de V. cholerae, y la enterotoxina ter olábil (LT) producidas por alguna cepa enterotoxigénica de Eschepchia co) i . Aún cuando LT y CT tienen muchas caracte ísticas en común, estas carcaterist icas son moléculas claramente distintas con diferencia bioquímica e ínmunológica que las hacen únicas. La dearrea extensiva del cólera es el resultantes de una exo-enterotoxina potente que provoca la activación de la adeni latciclasa y un incremento subsecuente de los niveles intracelulares de 3'-, 5 '-adenssxn onofosfato cíclico (cAMP). La enterotoxina de cólera (CT) es una protelna poli é ica de 84,000 daltones compuesta de dos regiones o dominios inmunoló i camente d istmos, principales, no covalentemente asociados ("cólera-A" y "cólera-B") (Finfcelstein y LoSpalluta, 1969, J. Exp. Med. 130:185-202). Entre ellas, la región de 56,000 daltones o bien coleragenoide es responsable del enlace de la toxina sobre el receptor de la membrana celular huésped, 6M1 (ceramida de g la osi 1-N-ac t i lgalactosa ini 1- (sial il ) -g lactosi 1-glucosilo), que se encuentra en la superficie de esencialmente todas las células eucariót icas. El colera fenoide se compone de 5 subunidades no covalmentemente asociadas, mientras que la región A (27,000 daltones) es responsable de varios efectos biológicos de la toxina. La relación de las dos subunidades de CT en cuanto a las propiedades inmunal g icas de la molécula ha sido un agente de debate considerable. Por una parte de CT es un excelente inmunógeno que provoca el desarrollo de respuestas de anticuerpos antitoxinas séricos y mucosa les cuando se administra oralmente. Este hallazgo no es nuevo en la medida en que los pacientes con cólera desarrollan unos incrementos en las titulaciones de anticuerpos antitoxina durante la convalescencia de cólera clínico (Finkelstein, 1975, Curr. Top. Microb iol. Immunol . 69:137-196). Un hallazgo esencial de las personas que investigan la naturaleza de esta respuesta fue la observación que CT, a diferencia de la mayoría de otros antígenos de proteina, no induce una tolerancia oral en su contra (Elson y Ealding, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897; Elson y Ealding, 1984, J. Immunol . 132:2736-2741). Se encontró que esto era cierto también cuando se alimentó solamente la subupidad B a ratones, una observaci? soportada por ensayos en el campo de las bacunas contra el cólera en Bangladesh en donde la in unizción oral con subunidad B combinada con células enteras muertas provocó unas respuestas de anticuerpo antitoxina sistémicas así como mucosales (Svennerholm et al., 1984, J. Infect. Dis. 149:884-893). Además de ser un inmunógepo oral potente, CT tiene numerosas otras propiedades inmunológica reportadas. Como arriba indicado, Elson y Ealding (Elson y Ealding, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897) observaron que la CT administrada oralmente no induce tolerancia en su contra. Además, la administración oral simultanea de CT con un ant igeno de proteína soluble, la he ocianina de lapa ( LH), resultó en el desarrollo de respuestas IgA secretorias tanto contra CT co o contra KLH y anuló también la inducción de tolerancia oral contra KLH. Estos hallazgos fueron subsecuentemente confirmados y extendidos por Lycke y Holmgren (Lycke y Holmgren, 1986, Im unology 59:301-308). La confusión surge cuando uno intenta definir la función de las subunidades A y B de CT en relación a las propiedades adyuvantes de la molécula. Las siguientes observaciones, de conformidad con lo resumido por Elson (Elson, 1989, Immunology Today 146:29-33), son la base de esta confusión: * CT no induce tolerancia oral en su contra (Elson y Ealding, 1984, J. Im unol. 133:2892-2897). •» CT no induce tolerancia or l en su contra (Elson y Ealding, 1984, J. I unol . 133:2892-2897).

* CT puede evitar la inducción de la tolerancia contra otros antigenos con los cuales se suministra simultáneamente y surge también como adyuvante para estos antigenos (Elson y Ealding, 1984, J. Im unol. 133:2892-2897; Lycke y Holmgren, 1986, Immunology 59:301-308). * CT puede actuar como adyuvante para CT-B (Elsan y Ealding, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897). * CT agregada térmicamente presenta poca toxicidad pero es un inmunógeno oral potente (Pierce et al., 1983, Infect. Immun. 40:1112-1118). * CT-B puede servir co o "vehículo" inmunalógica en una configuración tradicional de hapteno-vehículo (Cebra et al., 1986, En: Vaccines 86, Broin et al. (ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York. págs. 129-133; MeKenzie y Halsey, 1984, J. Im unol. 133:1818-1824). Numerosos investigadores llegaron a la conclusión a partir de estos hallazgos que la subunidad B debe poseer alguna actividad adyuvante inherante. Los hallazgos de Cebra et al. (Cebra et al., 1986, En: Vaccines 86, Brown et al. (ed.), Cold Spripg Harbor Laboratory, New York. págs. 129-133), Lycke y Holmgren (Lycke y Holmgren, 1986, Immunology 59:3 1-308), y Liang et al. (Liang et al., 1988, J. I munal . 141:1495-1501) argumenta ían contra esta conclusión. Cebra et al. (Cebra et al., 1986, En: Vaccines 86, Brown et al. (ed.), Cold Spring Harbor Labora ory, New York. págs. 129- 133) demostró que la CT-B purificada era efectiva para elevar la presencia de las células B de toxina anticalera especifica en parches de Peyer cuando se administraban de manera mtroduodenal pero, en contraste con CT, no resultó en números significa ivos de células B asignadas a IgA. Lycke y Holmgren (Lycke y Holmgren, 1986, I munology 59:301-308) compararon CT y CT-B para determinar su capacidad de incrementar 3a respuesta inmunológica ucosal de los intestinos a Kl H mediante la medición de las células que secretan inmuno lobina en la lámina propia de ratones oralmente inmunizados. No encontraron ningún incremento de las células que producen anti- LH en respuesta a las dosis de subunidad B probadas en su sistema. Finalmente Liang et al. (Liang et al., 1988, J. Immunol . 141:3495-1501) na encontró ningún efecto adyuvante cuando se administró oralmente CT-B en combinación con el virus desactivado de Senda i . Cuando se observó una actividad adyuvante para la subunidad B aislada, fue típicamente por una de dos razones. Primera, un método tradicional para la preparación de subunidad B fue someter una holotoxina cromatografía de disociación mediante filtración en gel en presencia de un agente de disociación (es decir, guamdina HCl o bien ácido fórmico). Las subunidades aisladas fueron después agrupadas y se removi el agente de disociación. La subunidad B preparada por esta técnica se encuentra invariablemente contamiada con cantidades pequeñas de subunidad B de tal manera que al renatural izarse se reconstituye una pequeña cantidad de holatoxina. La segunda razón tiene que ver con la definición de un vehículo inmunológico. Como muhcas otras proteínas solubles, la subunidad B puede servir como vehículo inmunológico para la presentación de antígenos al sistema inmunitario. Estos antígenos son suf ientemente pequeños para presentar caracteristicas inmunagénicas limitadas, pueden ser transformados para volverse inmunogénicos en una configuración tradicional de hapteno-vehículo. De la misma manera, existe un incremento inmunológico "teórico" asociado con la subunidad B, especialmente en el caso de la presentación oral, en la medida en que la subunidad B se enlaza a la superficie de las células epiteliales y puede inmovilizar un antígeno fijado para procesamiento por los tejidos linfoides asociados a los intestinos. Sin embargo, cualquier ventaja potencial de este mecanismo de estabilización de antígeno puede ser compenzado por la distribución del antlgeno en tejidos no i n unológ icamente relevantes, es decir, la superficie de las células epiteliales intestinales. En el contexto de la respuesta mucosal, los si ios i nmunoló icamente relevantes son los parches de Peyer, especialmente en el caso de la activación de las células B que dependen de las células T específicas para antigeno (Strober y Jacobs, 1985, En: Advances m host defense mech nisms. Vol. 4. Mucosal Immunity, Gallin y Faucí (ed.), Raven Press, New York. págs. 1-30; To asi y Plaut, 1985, En: Advances ín host defense mechanis s. Val. 4. Mucosal Immumt-y, Gal n y Faucí (ed.) , Raven Press, New York. pAgs. 31-36; Brandtzaeg, 1989, Curr. Top. Microbiol. ImmunoJ . 146:13-25). Por consiguiente, los eventos hasta cambio de isotipo a partir de las células IgM hasta las células B IgA ocurren en los parches de Peyer. Los antigenos indicados en la superficie de las células epiteliales pueden contribuir a la prolifera ión de las células B inducidas por antígeno en la medida en que las células epiteliales vellosas positivas de clase II pueden actuar como células de presentación de antígeno para al activación de las células T en el sitio secretorio, in rementando así la producción de citocmas, diferenciación de células B terminales, expresión incrementada del componente secretorio, así como transporte externo incrementado de IgA específica para antígeno (Toma i, T. B. , y A.G. Plaut. 1985, En: Advances ín host defense echanis s. Vol. 4. Mucosal I munity, G 111 n y Faucí (ed.), Raven Press, New York. págs. 31-61). La relación de estos eventos pudo no estar claramente definida para la subum ad B como vehículo de otros antígenos y el uso del término "adyuvante" podría parecer inapropiado por tal efecto.

Resulta claro que la propiedad adyuvante de la molécula se encuentra en la holotoxina en la cual se requiere la subunidad B para recono imiento de receptor y para facilitar la penetración de la subunidad A en la célula. La subunidad A requiere también de una actividad adyuvante, probablemente en función de su actividad enzimática de ribosilación de ADP y capacidad de incrementar los niveles intracelulares de cAMP (véase a continuación). La subunidad B sola puede actuar como vehículo de otros antigenos en la medida en que cuando se conjugan estos antígenos pueden ser inmovilizados para procesamiento por los tejidos linfaides asociados con los intestinos. Aún cuando LT y CT pueden tener características en común, estas son moléculas claramente distintas con diferencias bioquímicas e ir.munalógieas que las hacen únicas, incluyendo una diferencia del 20*/. en la homología de secuencia de nucleótidos y aminoácidos (Dallas y Falkow, 1980, Nature 288:49-501). Las dos toxinas tienen el misma número y arreglo de subunidades, el mismo mecanismo biológico de acción, y la misma actividad específica en mucho ensayos in vitra (Clements y Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769; Clements et al., 1980, Infect. Im un. 24:91-97). Sin embargo existen diferencias significativas entre estas moléculas que influencian no solamente sus propiedades enterotó ica , sino también su capacidad de funcionar como adyuvantes. Para empe.ar, a diferencia de la CT producida por V. cholerae, LT permanece asociada a la célula y es liberada solamente de E. col i durante la lisis celular (Clements y Fmkelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769). CT es secreatada a partir del vidrio tan pronto como es sintetizado y puede iden ificarse fácilmente en sobrenadantes de cultivo y purificarse a partir de dichos sobrenadantes. Por consiguiente, en contraste con CT, LT no es totalmente biológicamen e activa cuando se aisla primero de la célula. De forma consistente con el modelo A-B para toxinas bacterianas, LT requiere de proteolisis y de reducción disulfuro para ser activa. En ausencia del proceso proteol i ico, la porción Al enzimát icamente activa no puede disociarse del componente A2 y no puede alcanzar su sustrato blanco (adenilate ciclase) en la superficie basolateral de la célula epitelial intestinal. Esto también es cierto en el caso de CT , pero las proteasas en el sobrenadante de cultivo, a las cuales se encuentra expuesta la toxina durante la purifica ión, llevan a cabo la proteol ísis. Puesto que LT no es totalmente bioló icamente activa, es difícil identificarlas durante la purificación usando ensayos biológicos ni vitro como por ejemplo el ensayo de células de adrenal Y-l o bien el ensayo de factor de permeabí 1 idad , Esta diferencia en cuanto a la activación del materia] aislado resulta en diferencia en cuanto a umbrales de respuesta para LT y CT en sistemas biológicos. Por ejemplo, CT induce una secreción fluido neta detectable en el intestino de ratón en una dosis de 5-10 µg . LT induce una secreción neta detectable en el intestino de ratón en niveles superiores a 100 µ . En el bucle i leal ligado de conejo, la diferencia es dramática y clara. Además, en primates, LT no ha mostrado que indujeran una secreción de fluido en ninguna de las dosis probadas hasta 1 miligramo. Es decir 200 veces la cantidad de CT reportadas que induce un movimiento de fluido positivo en los seres humanos. Cuando se expone LT a enzimas proteol í ticas con una espe ificidad similar a la tripsina, la molécula se vuelve indistinguible de CT en un sistema de ensay biológico. Esto fue demostrado claramente por Clements y Finkelstein (Clements y Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769).

Además de las diferencias indicadas anteriores, LT tiene una afinidad no habitual para matrices que contienen carbohidratos. Específicamente LT, con un peso molecular de 90,000 se eluye de columnas Sephadex (glucosa) con un peso molecular aparente de 45,000 y a partir de columnas de Agarose (galactosa) con un peso molecular aparente de 0. Es decir, se enlaza sobre matrices y contienen galactosa y puede ser eluida a partir de estas matrices en forma pura mediante la aplicación de galactosa. LT se enlaza no solamente sobre la agarosa en columnas empleadas para purificación sino si es más importante, sobre otras moléculas biológicas que contienen galactosa, incluyendo gl icoproteínas y 1 ipopol isacaridas. Esta propiedad de enlace similar a la leetri na ds LT resulta en una distribu ión de receptores más amplia en las células de mamíferos para LT que para CT que se enlaza solmente con GM1. Esto puede explicar en parte las diferencias reportadas en cuanto a las capacidades de estas dos moléculas de inducir respuestas diferentes a los linfocitos de las células T cooperadoras (McGhee et al., 1994, Mucosa 1 Immunology Update, Spring 1994, Raven Press, New York. pág. 21). En estos estudios reportadas por McGhee et al. (McGhee et al., 1994, Mucosal Im unolog Update, Spring 1994, Raven Press, New York. pág. 21), se mostró que la inmunización oral de ratones con vacunas co o por ejemplo toxside de tétanos (TT) con CT como adyuvante mucosal induce selectivamente células de tipo TH2 en parches de Peyer y en bazos como se muestra por medio de células TH que producen IL-4 y IL-5, pero no IL-2 ni INF-gamma. (Para una reseña más completa de la red de citocina, véase Arai et al., 1990, Ann. Rev. Biochem. 59:783-836). En forma importante, cuando se empleó CT como adyuvante mucosal incrementó también las respuestas de IgE específica para antigeno además de la respuesta de IgA. Tal incremento de las respuestas IgE comprometen gravemente la seguridad de CT co o adyuvante mucosal debido a la perspectiva de inducir reacciones de hipersensibilidad de tipo inmediato. En contraste, LT induce tanta las células TH1 y TH2 y predominantemente las respuestas de IgA específica para ant igeno sin respuestas IgE cuando se emplea como adyuvante mucosal administrado oralmente. Las dos moléculas tienen también muchas diferencias inmunológicas, según lo demostrado por estudios de inmuna i fusión (Clements y finkelstein, 1978, Infect. I mun. 21:1036-1039; Clements y finkelstein, 1978, Infect. Im un. 22:709-713), estudios de neutralización in vitro, y la protección parcial contra LT asocada a la dearrea provocada por E. coli en voluntarios que reciben vacuna contra 1 el cólera de célula entera de subunidad B (Cle ens et al., 1988, J. Infect. Dis. 158:372-377). En conjunto, estos hallazgos demuestran que LT y CT son moléculas únicas, a pesar de sus simi laridades aparentes, y que LT es un adyuvante oral práctico mientras CT no lo es. La demostración de las propiedades adyuvantes de LT provienen de una investigación de la influencia de LT sobre el desarrollo de la tolerancia a antígenos oralmente administrados por uno de los presentes inventares. No se aclaró sí. o no LT tiene una influencia también sobre la inducción de la tolerancia oral o bien presenta los efectos adyuvantes demostrados para CT , dado las diferencias observadas entre las dos moléculas. Por consiguiente, los presentes inventores examinaron vanos parámetros, incluyendo al efecto de LT sobre la tolerancia oral a OVA y la función de las dos subunidades de LT en la respuesta observada, el efecto de variar el momento y la vía de administración de LT, el efecto de una exposición previa a OVA sobre la capacidad de LT para influenciar la tolerancia _ OVA, el uso de LT como adyuvante con dos antigenos no relaciónlos, y el efecto de la vía de inmunización sobre las respuestas anti-OVA. los resultados obtenidos a partir de estos estudios (Clements et al., 1988, Vaccine 6:26c?-277; Clements et al., 1988, Resumen No. B91, 88th Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol.) se resumen a continuación: 1. La administración simultánea de LT con OVA impidió la inducción de la tolerancia a OVA e incrementó la respuesta de IgG anti-OVA sérica de 30 a 90 veces en comparación con los animales cebadas con OVA y cebados con PBS, respecti amente. Este efecto se determinó como una función de la subunidad A enzimát icamente activa de la toxina puesto que la subunidad B sola no pudo influenciar la inducción de la tolerancia. 2. Animales que recibieron LT con OVA después de estar cebados ínicialmente con OVA desarrollaron una respuesta anti-OVA de IgG sérica y de IgA mucosal significativamente menor que los animales que re ibieron LT can OVA en la inmunización inicial, lo que indica que la exposición previa al antigeno reduce la efectividad de LT para influenciar la tolerancia y su capacidad de a.ctuar como adyuvante. LT no pudo anular la tolerancia una vez establecida. Esto también fue cierto para CT cuando animales fueron preinmuní zados con OVA antes de ovalbumina oral más CT y ofrece alguna explicación en cuanto a la observación benéfica que respuestas ant .corporales a antígenos de dieta no blanca no se incrementan cuando se emplean estos adyuvantes. 3. Las respuestas de IgG sérica y IgA mucosal en animales que reciben LT en una sola oportunidad, siendo dicha oportunidad de la primera exposición a antígeno, fueron equivalentes a las respuestas después de tres procesos de cebado OVA/LT, lo que indica que la dedicación a la respuesta ocurre de manera temprana y en la primera exposición al antígeno. Se demostró también que la dirección de la respuesta hacia de manera predominante o bien IgG sérica o bien IgA mucosal puede controlarse mediante la administración o no de una dosis de refuerzo parenteral. 4. la administración simultánea de LT con dos antígenos de proteínas solubles resulta en el desarrollo de anticuerpos séricos y mucosales contra ambos antígenos si el animal na t-iene ninguna experiencia ?nmuno3óg?ca previa con ellos. Esto fue un hallazgo importante puesto que una posible ?(í aplicación de IT co o adyuvante sería para el desarrollo de anticuerpos mucosales contra antígenos complejos, como por ejemplo bacterias o virus muertos, donde la capacidad de respuesta a antígenos múltiples sería importante. Estudios realizados por Tamura et al., (Ta ura et al., Patente Norteamericana No. 5,182,109) demostraron que LT y/o CT administrados i n ranasal mente incrementaban l a. titulación de anticuerpos contra un antlgena coadministrado. Sin embargo, no se presenta en ningún lado en Tamura et al. que estas toxinas pueden inducir una respuesta i nmunológ ica protectora cuando se administran oralmente. Claramente, LT tiene un potencial inmunoregulatorio significativo, tanto como una forma de evitar la inducción de la tolerancia a antigenos específicos y como adyuvante para antígenos oralmente administrados y provoca la producción tanto de IgG sérica como de IgA mucosal contra antlgenos con los cuales se suministra. Esto plantea la posibilidad de un programa de inmunización efectiva contra varios patógenos involucrando la admini ración oral de agentes muertos a atenuados o bien determinantes relevantes de la virulencia de agentes específicos. Sin embargo, el hecho que está "toxina" puede estimular una respuesta secretoria lu epal neta cuando están proteol í t icamente disociados, como las proteasas intes inales, o bien cuando se administran oralmente en concentraciones sufici ntemente elevadas, puede impedir la investigación de su potencial o bien evitar su uso bajo condiciones apropiadas. Este problema podria resolverse LT pudiese "deto?if icarse" sin disminuir las propiedades adyuvantes de las moléculas. Para observar cómo esto puede lograrse, es necesario analizar adicion lmente el mecanismo de acción de la LT y CT así como las relaciones estructurales y funcionales de estas moléculas. Cómo previamente indicado, tanto LT co o CT se sintetizan como toxinas de subunidades múltiples con componentes A y B. Después de la interacción inicial de la toxina con el receptor de membrana de célula huésped, la región B facilita la penetración de la subunidad A a través de la membrana celular. Al llevarse a cabo una reducción tiol, este componente A se disocia en dos cadenas más pequeñas de polipéptidos. Una de estas cadenas, la parte Al, cataliza la ADP-r ibosi lac ion de la prateina de enlace de GTP (Gs) estimulatoria en el complejo de la enzima adeni latciclasa en la superficie vaso lateral de la célula epitelial y esto resulta en un incremento de los niveles intracelulares de c MP . El incremento resultante de cAMP provoca la secreción de agua y electrolitos en el intestino delgado mediante interacción con dos mecanismos de transporte de iones sensibles a c MP que involucran 1) la cotransporta ion de NaCl a través del borde de cepillo de las células epiteliales vellosas, y 2) la secreción de Cl-dependiente de Na+ electrogénico por células de cripta (Field, 1980, In: Secretary diarrhea, Field et al. (ed.), Waverly Press, Baltimore. p. 21-30). La subunidad A es también la porción principal asociada con el incremento inmunológica por estas toxinas. Esta subunidad se vuelve después un blanco probable para manipulación para disociar las funciones tóxicas e inmuno!. óg icas de las moléculas. Un reciente reporte de Lycke et al, (Lycke et al., 1992, Eur. J. I mu.nol . 22:2277-2281) aclara que las alteraciones que afectan la actividad enzimática de ribosilación de ADP de la toxina y alteran la capacidad de incrementar los niveles intracelulares de cAMP evitan también que la molécula funcione como adyuvante. Por consiguiente, se debe explorar otro enfoque hacia la detoxif icación. 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en la observación sorprendente que una forma mutante de LT , que ha perdido su. efecto tóxico y na tiene la actividad ADP-ribosi 1 transferasa , sigue conservando su actividad como adyuvante inmunológico. La forma utante de LT difiere del tipo salvaje por una sustitución única de aminoácido, Argl92-Glyl92, lo que vuelve insensible el sitio sensible a la tripsina. La pérdida del sitio protealítica impide el procesamiento proteol i tico de la subunidacl A en su. forma tóxica. La LT nativa no es tóxica cuando se aisla primero de la bacteria pero tiene el potencial de ser totalmente tóxica cuando se expone a proteasas co o por ejemplo las encontradas en el intestino de mamíferos. La forma mutante de LT ya no tiene el potencial de volverse tóxica debido a la activación proteol í tica . Esta LT mutante (a continuación indicada como mLT) conserva la capacidad de incrementar la respuesta inmunológica de un animal (por ejemplo, IgG, IgA) a un antígeno no relacionado con LT o mLT sin efectos colaterales tóxicos. Datos expe i entales indican que mLT es útil como adyuvante para antígenos oralmente admini trados; tal administración resulta en la producción de IgG sérica y/o slgA mucosal contra el antígeno con el cual se suministra mLT. La presente invención proporciona un método para la inducción de una respuesta inmunológica sérica y/o mucosal en un huésped a un antigeno oralmente administrado que comprende la administración al huésped de una cantidad efectiva de mLT en combinación con la administra ión oral de una cantidad efectiva del antígeno. De preferencia, el antígeno y mLT se administran inicia 1 mente en una dosis simultánea. El presente método y composiciones proporcionan un modo mejorado de inmunización oral para el desarrollo de anticuerpos séricos y mucasales contra microorganismos patogénicos. La producción de respuestas de anticuerpo IgA contra microorganismos patogénicos que penetran o invaden a través cte las superficies mucosales puede dirigirse hacia esta superficie, mientras que se puede desarrollar una respuesta de anticuerpo séricos significativa para evitar la infección por microorganismos patogénicos contra los cuales el anticuerpo sérico proporciona protección. La presente invención es útil para cualquier antígeno específico en donde una respuesta de anticuerpos neutr lizantes específicas sería útil para eliminar el estado fisiológico o enfermizo relacionado con este antígeno. La presente invención proporciona también una composición útil como componente de una vacuna contra organismos bacterianos eterstóxicos que expresan enterotoxinas similares al cólera, y métodos para su uso. La invención proporciona también una composición útil en estos métodos. La composición comprende una cantidad efectiva de mLT en combinación con una cantidad efectiva de ant ígeno. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se entenderá de forma más caval con referencia a la siguiente descripción detallada de la invención, ejemplos de modalidades específicas de la invención así como la relación con las figuras anexas en donde: La figura 1 es un diagrama esquemático del plásmido pBD94, que codifica ambas subunidades A y B bajo el control del promotor lac. El plásmido pBD95 contiene la sustitución de base única en el residuo 192 de aminoácidos de la subunidad A, que codifica para Gly en lugar de Arg, que conserva la estructura de lectura pero elimina el sitio proteol í tico. Se muestra la secuencia de aminoácidos que corresponde a la región de sensibilidad a tripsina y el sitio de la sustitución de aminoácido Argl92~Glyl92. La figura 2 es una demostración gráfica del incremento dependiente de la dosis en cuanto a los niveles de ADP-ribos i lagmat ina en función de cantidades crecientes de CT.

La figura 3 es la acumulación de fluido después de la alimentación de 125 µg de LT nativa pero no después de l alimentación de 125 µg de mLT a ratones. La proporción entre intestino y cadáver se define como el peso intestinal dividido por el peso del resto del cadáver. La figura 4 muestra la capacidad de mLT para actuar como adyuvante inmunoló ico. La figura 4A muestra la capacidad de mLT para inducir una respuesta de IgG sérica a OVA. La figura 4B muestra la capacidad de mLT para inducir una respuesta slgA mucos l a OVA. La figura 5 es una demostración experimental que mLT conserva la capacidad de evitar la inducción de la tolerancia oral a LT. La figura 5A muestra la capacidad de mLT para inducir una respuesta de IgG sérica a LT. La figura 5B muestra la capacidad de mLT para inducir una respuesta slgA mucosal a IT. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención abarca una composición y métodos para su uso para promover l a producción de anticuerpos mucosales y séricos contra antigenos simultáneamente administrados oralmente con una toxina bacteriana genéticamente modi f icada . La toxina modificada es una forma de la enterotoxina termolábil (LT) de F.. coli que por medio de ingeniería genética ha perdido su sitio sensible a tripsina volviendo la molécula no tóxica pero sin embargo, de manera inesperada, la molécula conserva su capacidad de actuar como adyuvante i nmunoló ico. La LT mutante se conoce en el presente documento como mLT. La invención se basa en el descubrimiento que mLT es igualmente efectiva que LT como adyuvante inmunológico, un resultado sorprendente e inesperado. mLT ya no tiene la actividad enzimática de pbosi lación de ADP porque la subuinidad A ya no puede ser procesada proteo! í t icamente. En contraste con los estudios publicados de Lycke y colegas, que aclaran que alteraciones que afectan la actividad de pbosi lación de ADP de LT impiden también que la molécula fun ione como un adyuvante inmunaló ico (Lycke et al., 1992, Fur. J. Immunal. 22:2277-2281), la mLT descrita aquí conserva su actividad como adyuvante inmunológico aún cuando, como se demuestra en los efectos, no tiene la actividad de ribosilaeión de ADP. La forma mutante novedosa de la enterotaxina termolábil de E. coli mLT, aquí descrita, se comporta como un adyuvante y provoca la producción tanto de IgG sérica como de slgA mucosa 1 contra antígenos con los cuales se suministra. La utilidad de este descubrimiento sorprendente es que una cantidad efectiva adyuvante de mLT puede emplearse en un programa de inmunización efectiva contra varios patógenos que involucran la administ ación oral de una cantidad efectiva de adyuvante mLT mezclado con patógenos muertos o atenuados o bien determinantes de virulencia relevante de patógenos específicos sin temor a los efectos colaterales tóxicos reales o potenciales asociados con la administración oral de CT o LT. La presente invención supera la técnica anterior en la medida en que la presente invención puede emplearse en varias aplicaciones inmunológicas donde CT, LT, o bien subunidades de CT o LT pueden haber sido empleadas, pero ahora con mLT no existen efectos colaterales reales ni potenciales, como por ejemplo dearrea, en relación con su uso. En contraste con LT que aún cuando no es tóxica cuando se aisla primero de la bacteria, tiene el potencial de ser totalmente tóxica cuando se expone a proteasas co o las encontradas en intestinos de mamífero, mLT no tiene potencial de volverse tóxica debido a la activación proteol í tic . Otra modalidad de la presente invención es un componente de la vacuna contra organismos enteras tóxicos que expresan toxinas similares al cólera. Los presente inventores han mostrado que mLT no se encuentra sujeta a tolerancias in unológicas oralmente inducidas cuando se administra (véase a continua ión), por consiguiente mLT puede funcionar y es altamente deseable como componente de vacunas dirigidas contra organismos enterotóx i eos. La tecnología actual proporciona vacunas contra organismos que expresan toxinas similares al cólera que contienen células enteras muertas y la subu idad B de la toxina. Mediante el reemplazo de la subunidad B con mLT en la vacuna, se mejora la vacuna de dos maneras diferentes. Primero mlT, que tiene tanto las subunidades A como B inducirá ahora una respuesta inmune no solamente para la subunidad B sino también para la subunidad A. Esto proporciona un mayor número de epítopos para neu rali ación efectiva. Segundo, la actividad adyuvante inherente en mLT incrementará 3a respuesta inmunológica contra el componente de célula entera muerta de la vacuna.

Además, otros investigadores (Hase et al., 1994, Infect. Immun. 62:3051-3057) han mostrado que la subunidad A, modificada de tal manera que ya no sea tóxica mediante la alteración del sitio activo de la actividad enz?m_tt?ca de pbosilación de ADP, (en oposición al sitio proteológico que es el. tema de la presente invención) puede inducir una respuesta inmunalógica contra la subunidad A de tipo salvaje. Sin embargo, la subunidad A modificada de esta forma ya no tiene actividad adyuvante inmunalógica y por consiguiente es menos deseable como componente de vacuna que mLT. Además, puesto que anticuerpos con mLT reaccionan en forma cruzada con LT y CT, mLT puede emplearse en vacunas dirigidas contra muchos tipos de organismos bacterianos enterstóxicos que expresan toxinas similares al cólera, como por ejemplo Escherichia spp. y Vibrio spp- 5.1 PRODUCCION DE mLT La toxina LT de tipa salvaje es codificada en un plásmido que ocurre naturalmente que se encuentra en cepas de E. coli enterotoxigénico capaz de producir esta toxina. Los presentes inventores han previamente clonado el gen de LT a partir de un aislado humano de E. coli designado H10407. Este sube Ion consiste de un fragmento de ADN de 5.2 kb a partir del plásmida de enterotoxina de H10407 insertado en el sitio PstI del plásmido pBR.322 (Clements et al, 1983, Infect. Immun. 40:653). Este plásmido recombinante, designado pDF82, ha sido extensivamente caracterizado y expresa LT bajo el control del promotor de LT nativo. El siguiente paßo en este proceso fue la colocación del gen de LT bajo el. control de un promotor fuerte, en este caso el promotor lac en el plásmido pUC18. Esto se logró mediante el aislamiento de los genes para LT-A y LT-B separadamente y su recornbi nac i ón en un cassette en el plásmido vector. Esto fue un pasa importante porque permitió la purificación de cantidades razonables de LT y la derivación de mutantes para análisis subsecuente. Este plás ido, designado pBD94, se presenta di gramát icamente en la figura 1. Tanto CT co o LT se sintetizan con un enlace de péptido sensible a la tripsina que enlaza las parte Al y A2. Este enlace de péptido debe ser cortado para que la molécula sea "tóxica". Esto es también cierto en el caso de la toxina de la difteria, la toxina A-B prototípica, y para varias otras toxinas bacterianas. Si el enlace A1-A2 no es removido, ya sea mediante proteasa bacteriana o bien proteasas intestinales en el lumen del intestion, la parte Al no puede alcanzar su blanco en la superficie basolateral de la célula epitelial intestinal. En contraste con CT, LT no es totalmente biológicamente activa cuando se aisla primero de la célula. LT requiere también de proteólisis para estar totalmente activa y la activación proteolítica no puede ocurrir dentro de la bacteria. Por consiguiente, una forma de alterar la toxicidad de la molécula sin afectar la actividad enzimática de pbos lación de ADP sería la remoción por manipulación genética de los aminoácidos sensibles a la tripsina que unen los componentes A3 y A2 de la subunidad A. Si la molécula no puede ser proteol ít icamente disociada, no será tóxica. Un experto en la material podría predecir que la molécula, sin embargo, retiene su. actividad enzimática de ribosilación de ADP y por consiguiente su función adyuvante. La figura 1 muestra la secuencia de la región subtendida por disulfido que seprara las partes Al y A2. Dentro de esta región se encuentra un residuo único de Arginina que se cree es el sitio de disociación necesario para activar las propiedades tóxicas de la molécula. Esta región fue cambiada por mutagénesis enfocada hacia sitio de tal manera que la molécula se torne insensible a la digestión proteolítica y, por consiguiente se vuelve no tóxica. La mutagénesis enfocada hacia sitio se logra mediante la hibridación sobre un ADN de hebra única de un oligonucleótido sintético com lement rio del templado de hebra única excepto en relación con una región de no correspondencia cerca del centro. Es esta región que contiene el cambio o bien los cambios de núcleotido deseados. Después de la hibridación con el ADN blanco de hebra única, se extiende el oligonucleótido con polimerasa de ADN para crear una estructura de doble hebra. El corte es después sellado con ADN ligasa y la estructura dúplex se transforma en un huésped E. coli. El rendimiento teórico de los mutantes usando este procedi iento es del 50*4 debido al modo semiconservador de la repl icación de ADN. En la práctica, el rendimiento es mucho menor. Sin embargo, existen numerosos métodos disponibles para incrementar el rendimiento y para seleccionar mutantes dirigidos por ol igonucleót idos, E3 sistema empleado utilizó un segundo sl íganucleót ido mutagénico para crear sitios de restricción alterados en una estrategia de doble mutación. El siguiente paso fue la sustitución de otro aminoácido por Arg (es decir, GGA = Gly reemplaza AGA = Arg), conservando de esta forma la estructura de lectura mientras se elimina el sitio proteol it ico. Se purificó después mLT mediante cromatografía por afinidad en agarasa a partir de un mutante (pBD95) que había sido confirmado por secuenc la iento. Métodos alternativos de purificación serán evidentes a los expertos en la materia. Este» mLT utanto, llamado LTÍR192G) fue después examinado por electroforesis en gel de SDS-pol i cp lamida para modificación del enlace sensible a la tripsina. Se examinaron muestras con y sin exposición a la tripsina y dichas muestras fueron comparadas con LT nativa (sin modificaciones). mLT no se divide en Al y A2 cuando se incuba con tripsina, lo que indica que se ha removido la sensibilidad a la proteasa. 5.2 M0D0D DE ADMINISTRACIÓN DE mLT Y ANTIGENOS NO RELACIONADOS De conformidad con la piesente invención, se puede administrar mLT en combinación con cualquier antigeno y/o vacuna iológicamente relevante, de tal manera que se logre una respuesta inmuno! ógi ca incrementada a dicho antígeno y/o vacuna. En una modalidad preferida, la mLT y el antígena se administran si ultáneamente en una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de mLT y una cantidad efectiva de antlgeno. El modo de admi istración es oral. Las cantidades respectivas de mLT y de aptígeno varían según la identidad del antigeno empleado y las espe ies del animal a inmunizar. En una modalidad, la administración inicial de ml.T de antígeno es seguida por un refuerzo del antígeno relevante. En otra modalidad, no se administra ningún refuerzo. El tiempo de administ ación de refuerzo puede variar, según el antígeno y la especie a tratar. Las modificaciones en cuanta al rango de oxidación y el tiempo de aplicación de refuerzo para una especia y antígeno específico son fácilmente determinables mediante experimentación de rutina. El refuerzo puede ser de antígeno solo o bien en combinación con mLT. El modo de administración del refuerzo puede ser oral, nasal, o parenteral; sin embargo, si se emplea mLT en el refuerzo, la administraci n es de preferencia oral. Los métodos y composiciones de la presente invención tienen el objeto de emplearse tanto en vertebrados inmaduros como maduros, especi lmente aves, mamífero-,, y seres humanos.

Antígenos útiles, a titulo de ejemplo y no con propósito limitativo, podrían incluir antígenos de cepas patogénicas de bacterias (Streptococcus pyogenes, Strpstococcus pneumoruae, Neissepa gonorrheae, Neissepa meningí t idis, Corynebacter lum diphtepae, Clostpdium botí l.? num, Clostpdium perfpngens, Clostpdium tetam , Hemophilus influenzae, Klebsiella pneu oniae, Klebsiella ozaenae, lebsiella rh moscleromot ís, Staphylococcus aureus, Vibro col eva.es , Eschepchia coli, Pseudomonas aerugmosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocol i t ic , Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysentepae, Shigella flexnep, Shigella sannei , Salmanella typhimupu , Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneu , Borre! la vincentii, Borre! ía burgdarfep, Leptospira icteroemorrhag íae, Mycobactepum tubeculosis, To^oplasma gondii, Pneumocystis capnii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Br?cell elitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazek i , Rickettsia tsutsugu ushi , Chlamydia app.); hongos patogénicos (Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blasto yces dermat 11 ídis, Cryptococcus n aformans, Histoplas a capsulatum); protozoapos (Entomoeba histolytica, Tricho onas tenas, Tpchomonas hominis, Tpchomonas vaginalis, Trypanssoma gambiense, Trypanosoma rhoderi íepse, Trypanasoma cruzi, Leish aní- donovapi , Leish ania trópica, Leish ania bra_ i l lensi , Pneumocystis pneumonía, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria); o bien helmintos (Enterobius vermí cul ar ís, Tpchuris tpchiura, Ascaps lumbr icoides , Tp chine lia sp ira lis, Strongy laides stercoralis, Schistoso a japonicu , Schistosoma ansoni , Schistosoma haem tobium, así como anquí losto a ) , presentados ya sea al sistema in unológico en forma de células enteras o bien en partes aisladas de los cultivos diseñados para cultivar dichos organismos que son bien conocidos en la técnica, o bien antígenos protectores que dichos organismos obtenidos mediante técnicas de ingeniería genética o mediante síntesis qu . ic . Otros antígenos relavantes son virus patogénicos (a título de ejemplo, pero no con afán de limitación: Poxvipdae, Herpes i pdae, H rpses Si plex viurs 1, Herpes Simplex virus 2, Adenovipdae, Papovavir idae, Enteroví pdae, Picornavir idae, Parvov ir idae, Reovipdae, Petrov i ridae, virus de la gripe, virus de la para influenz , paperas, sarampión, virus sincitial res iratorio, rubéola, Arbovipdae, Rhabdovir idae, Arenav i pdae, virus de la hepatitid A, virus de la hepatitis B, irus de la hepatitis C, virus de l hepatitis E, virus de la hepatitis no A/no B, Rhinoví ri dae, Coron_ i idae, Potoviridae, así como virus de la inmunodef i ci encia humana) ya sea presentados al sistema inmunoló ica en su totalidad o bien en parte aislada de cultivos diseñados para cultivar tales virus que son bien conocidos en la técnica o bien antígenos protectores de los mismos obtenidos mediante técnicas de ingeniería genética o mediante síntesis química. Ejemplos adicionales de antígenos relevantes incluyen vacunas, pero sin limitarse a ellas. Ejemplos de tales vacunas incluyen, sin limitarse a ellas, vacunas contra la gppa, vacuna contra la tos ferina, vacuna contra la difteria y el toxoide de tétanos combinada con tos ferina, vacuna contra la hepatitis A, vacuna contra la hepatitis B, vacuna contra la hepatitis C, vacuna contra la hepatitis E, vacuna contra la encefalitis japonesa, vacuna contra herpes, vacuna contra sa pión, vacuna contra rub ola, vacuna contra paperas, vacuna mixta contra sarampión, paperas y rubéola, vacuna contra papi 1 lo avi rus, vacuna contra parvovirus, vacuna contra el virus sineitial res iratorio, vacuna contra la enfermedad de Ly e, vacuna contra la polio, vacuna contra la malaria, vacuna contra la vapcella, vacuna contra la gonorrea, vacuna contra VIH, vacuna contra esquistosamiasis, vacuna contra rota, vacuna contra icoplasma, vacuna pneu ococcal , vacuna meningococcal y otras. Estas pueden producirse por procesos comunes conocidos. En términos generales, tales vacunas comprenden ya sea el organismo entero o bien el vi us cultivado y aislado por t cnias bien conocidas por parte de los expertos en la materia o bien comprenden antígenos relevantes de estos organismos o bien i us que son producidos µor técnicas de ingeniería genética o b en síntesis química. S<< producción se ilustra por medio de lo siguiente, sin limitarse a ello: Vacuna contra la gripe: una vacuna que comprende la totalidad o parte de he agg lut mi na , neuraminidasa, nucleoµroteín y proteína de matriz que se ob binen mediante la purificación de un virus, que se cultiva en huevos emb nonadas, con éter y detergentes, o bien por medio de técnicas de ingeniería genética o bien síntesis química. Vacuna contra Tos ferina: un vacuna que comp nde la totalidad o bien una parte de la toxina de tos ferina, hemag lu i ni na , K-agglu ina que se obtienen a partir de una toxinina avilurente con formalina que se extrae mediante precipitación por aplicación de sal o bien ul racentpfugación a partir del caldo de cultivo o bien de células bacterianas de Bordetella pertussis, o bien mediante técnicas de ingeniería genética a bien síntesis química. Vacuna contra la diftep. y toxoide de tétanos combinado con tos ferina: una vacuna mixta con vacuna contra tos ferina, difteria y toxoide de tétanos. Vacuna contra la encefalitis japonesa: una vacuna que comprende l^t totalidad o bien fase de una proteína antigénica que se obtiene mediante el cultivo i pt racerebral de un virus en ratones, y mediante la purificación de las partículas de virus mediante centrifugación o bien alcohol etílico y desactivación de las mismas, a bien mediante técnicas de ingeniería genética o bien síntesis química.

Vacuna contra la hepatitis B: una vacuna que comprende la totalidad o bien una parte de una proteína de antígeno que se obtiene mediante el aislamiento y la purificación del antígeno HBs mediante la precipi ación por aplicación de sal o bien ul tracentr i fugación, obtenida de la sangre que lleva hepatitis, o por técnicas de ingeniería genética o bien por síntesis química. Vacuna contra el sarampión: un vacuna que comprende la totalidad o bien parte de un virus cultivado en células de e bpo de pollo cultivado o bien hueva e bponado, o bien un antlgena protector obtenido mediante ingeniería genética o bien mediante síntesis química. Vacuna de la rubéola: una vacuna que comprende la totalidad o bien una parte de un virus cultivado en células de embpo de pollo cultivadas o bien huevo embrionado, o bien un antígeno protector obtenido mediante técnicas de ingeniería genética o bien síntesis química. Vacuna contra paperas: una vacuna que comprende la totalidad o bien parte de un virus cultivado en células de conejo cultivadas o bien huevo embponado, o bien un antígeno protector obtenido por técnicas de ingeniería genética bien síntesis química. Vacuna mixta contra sarampión, rub ola y paperas: una vacuna producida mediante la mezcla de vacuna contra sarampión, ruberola y paperas. Vacuna contra rota: una vacuna que comprende la totalidad o bien parte de un i us cultivado en células MA 104 cultivadas o bien aislado de las heces de un paciente, o bien un antígeno protector obtenido mediante técnicas de ingeniería genética o bien síntesis química. Vacuna contra i cap 1 asma: una vacuna que comprende la totalidad o bien parte de células de «neoplasma cultivadas en un medio de cultivo líquido para micaplasma o bien un antígeno protector obtenido por técnicas de ingeniería genética o bien síntesis química. Las condiciones para las cuales se puede lograr una prevención efectiva por medio del presente método serán evidentes para los expertos en la materia. Las composiciones de preparación de vacuna de la presente invención pueden prepararse mediante la mezcla de los antígenos ilustrados arriba y/o vacunas con mLT en una proporción deseada. La preparación debe realizarse de manera extr ictamente aséptica, y c<_da componente debe también manejarse de manera aséptica. Pirógenos o alérgenos detien natural ente removerse la m_>s totalmente posible. La preparación de antígenos de la presente invención puede emplearse mediante la preparación del antígeno perse y de L sep radamente. Además, la presente invención abarca un conjunto de implementos que comprende una cantidad efectiva de antígeno y una cantidad efectiva adyuvante de mLT. En usa, los componentes del conjunto de implementos pueden ya sea mezclarse juntos y después administrarse oralmente o bien los componentes pueden administrarse oralmente separadamente dentro de un corto período entre la administra ión de ellos. Las composiciones de preparación de vacuna de la presente invención pueden combinarse ya sea con un vehículo farmacéutico líquido o sólido, y l s composiciones pueden tener forma de tabletas, cápsulas, polvos, gr nulos, suspensiones o bien soluciones. Las composiciones pueden también contener conservadores adecuados, agentes colorantes y saborizantes, o bien agentes que producen una liberación lenta. Vehículos potenciales que pueden emplearse en la preparación de las composi iones farmacéuticas de esta invención incluyen, sin limitación, cápsulas de gelatina, azúcares, derivaciones de celulosa, por ejemplo ca rbaximet i Icelulosa de sodio, gelatina, talco, eßtearato de magnesio, aceite vegetal como por ejemplo aceite de cacahuate, etc., gl icen na, sorbí oi, agar y agua. Los vehículos pueden también servir como aglomerantes para facilitar la formación cíe tabletas de las composi iones para una administración oral cómoda. La composición de preparaci n de vacuna de esta invención puede mantenerse en una forma de lmacenamiento estable para un uso fácil mediante 1 laf i ] i za i n o bien otros medios bien conocidos por parte de los expertos en 3a materia. Para su admi rustrac ion oral, la preparación de vacuna puede reconstituirse en forma de una suspensión en una solución salina amort iguad , leche, o bien cualquier otro medio líquido fisiológicamente compatible. El medio puede hacerse más agradable mediante la adición de agentes adecuados colorantes y sabop zantes según se desea. La administración de las composiciones de preparación de vacuna puede ser precedida por una dosificación oral de una cantidad efectiva de un agente de neutralización de ácidos gástricos. Mientras se pueden emplear vanos compuestos para este propósito, se prefiere el bicarbonato de sodio. Alternativamente, las composiciones de vacuna pueden administrarse en cápsulas con recubrimiento entérico (es decir, cápsulas que se disuelven solamente después de haber atravesado el estómago) . 6. EJEMPLO Los siguientes ejemplos se presentan con el objeto de ilustrar solamente la presente invención pero n de limitar el alcance de esta invención de ninguna manera. 6.1 CONSTRUCCIÓN DE mLT La toxina LT de tipo salvaje está codificada en un plásmido que ocurre naturalmente y que se encuentra en cepas de E. coli enteroto igénico capaz de producir esta toxina. Los presentes inventores han clonado previamente el gen de LT a partir de un aislado humano de E. coli designado H10407. Este subclón consiste de un fragmento de ADN de 5.2 kb a partir del plásmido de enteroto i na de H10407 insertado en el sitio PstI del plásmido pB322 (Clements et al., 1983, Infect. Immun. 40: 653). Este plásmido recombinante, llamado pDF82, ha sido extensi amente caracterizado y expresa LT bajo control del promotor LT nativo. El siguiente paso en este proceso fue la colocación del gen de LT bajo el control de un promotor fuerte, en este caso, el promotor lac en el plásmido pUC18. Esto fue logrado mediante el aislamiento de los genes de LT-A y LT-B separadamente y mediante su recombinación en un cassette en el plás ido vector. Esto fue un paso importante porqué permitió la purificación de cantidades razonables de LT y la derivación de mutantes para análisis subsecuente. Este plás ido, designado pDF94, se presenta diagra aticamente en la figura 1. Tanto CT como LT se sintetizan con un enlace de péptidos sensible a tripsina que enlaza las partes a Al y A2. Este enlace de péptido debe cortarse para que la molécula no sea "tóxica". Esto es también cierto en el caso que la toxina de la difteria, la toxina A-B protot íp ica , y para varias otras toxinas bacterianas. Si no se remueve el enlace A1-A2, ya sea por proteasas bacterianas o bien por proteasas intestin les en el lumen del intestino, es decir, el procesamiento o bien la activación proteol i ica , la parte Al na puede alcanzar su blanco en la superficie baso lateral de la célula epitelial intestinal. En contraste con CT, LT no se encuentra totalmente bioló icamente activa cuando se aisla primero de la célula. LT requiere también de proteólisis para estar totalmente activa y la activación proteolítica no ocurre dentro de la bacteria. Por consiguiente, un medio de alterar la toxicidad de la molécula sin afectar la actividad enzimática de ribosilación ADP sería la remoción por manipulación genética de los aminoácidos sensibles a tripsina que enlazan los componentes Al y A2 de la subunidad A. Si la molécula na puede ser proteol i ticamente disociada, no será tóxica. Un experto en la materia puede predecir que la molécula conservará sin embargo su actividad enzimática de ribosilación de ADP y por consiguiente su función adyuvante. La figura 1 muestra la secuencia de la región subtendida por disulfido que separa las partes Al y A2. Dentro de esta región se encuentra un residuo de arginina que se considera que es el sitio de disociación necesaria para activar las propiedades tóxicas de la molécula. Esta región fue cambiada mediante mutagénesis enfocada hacia sitio de tal manera que la molécula se vuelva insensible a la digestión prateolítica y, por consiguiente, no tóxica. La mutagénesis enfocada hacia sitio se logra mediante la hibridación a ADN de hebra única de un ol igsnuc leo t ido sintético complementario del templado de hebra única excepto en cuanto a una región que no corresponde cerca del centro. Es esta región que contiene el cambio o bien los cambios de nucleótidos deseados. Después de la hibridación con el ADN blanco de hebra única, se extiende el oli onucleótido con polimerasa de ADN para crear una estructura de doble hebra. El corte se sella después con ADN 1 igasa y la estructura dúplex se transforma en un huésped E. coli. El rendimiento teórico de mutantes usan este procedimiento es del 50!. debido al modo de se iconservac ion de una replicacióp de ADN. Sin embargo, en 3 práctica, el rendimiento es mucho menor. Sin embargo, existen varios métodos disponibles para incrementar el rendimiento y para seleccionar mutantes dirigidos hacia oligonucleótidos. El sistema usado emplea un segundo oligonucleótido mutagénico para crear sitios de restricción alterados en una estrategia de doble mutación. El siguiente paso fue sustituir otro aminoácido por Arg íes decir, GGA = Gly reemplaza AGA = Arg), conservando así la estructura de lectura mientras e e3?mina el si io proteol í tico. mLT se purificó después mediante cromatografí por afinidad en agarosa a partir de un mutante (pBD95) que había sido confirmado mediante secuenciamiento. Métodos alternativos de pur i f icac i ón serán aparentes a los expertos en la materia. Es LT mutante, llamado LT (R192G) fue después examinado mediante electrofóre is en gel de SDS-pol iacp lamida para modificación del enlace sensible a tripsina. Se examinaron muestras con y sin exposición a tripsina y se compararon con LT nativa (no modificado). mLT no se divide1 en Al y A2 cuando se incuba con tripsina, indicando de esta forma que l a sensibilidad a la proteasa ha sido eliminada. 6.2 EFECTO DE mLT SOBRE CÉLULAS ADRENALES Y-l Se podía predecir por parte de un experto en la materia que mLT no seria activa en el ensayo de células adrenales Y-l. Esta predicción se basaría en hallazgos previos (Clements and Finkelstein, 1979, Infect. Im un. 24:760-769) según las cuales LT no cortada era más de 1000 veces menos activa en este sistema de ensayo que CT y que LT activada por tratamiento con tripsina en el mismo nivel de actividad biológica de CT en este ensayo. Se consideraba que la actividad residual de LT observada en este ensaya en ausencia de activación con tripsina dependía de cierta actividad proteasa residual que no podía explicarse. Por ejemplo, se emplea tripsina en el proceso del subcultivo de células adrenales Y-l. Por consiguiente se consideraba que una LT que no podía ser cortada sería totalmente inactiva en el ensayo de células adrenales Y-l . Los resultados aparecen en la Tab3 a I . TABLA I TOXINA TRIPSINA ACTIVADA ACTIVIDAD ESPECIFICA (a) toxina de cólera - 15 LT - 60 LT + 15 LT (R1 2G) - 48,800 LT (R192G) + 48,800 (a) Dosis mínima (picogramos por pozo) requerida para producir redondeo celular (,>50*/í). La Tabla I demuestra el hallazgo inesperado que mLT conservó un nivel basal de actividad en el ensayo de células adrenales Y-l, aún cuando no podía ser proteol í t icamente procesada. Camo se muestra en la Tabla I, CT y LT nativa tratada con tripsina presentan el mismo nivel de actividad (15 pg ) en células adrenales Y-l. En contraste, mLT (48,000 pg) fue más de l-OOO veces menos activa que CT o bien LT nativa y no pudo activarse can tripsina. La actividad basal residual refleja sin duda una diferencia y una vía a la fehca desconocida de activación de células adrenales en la vía que requiere de separación del enlace Al - A2. 6.3. ACTIVIDAD ENZIMATICA DE RJB0SILACI0N DE ADP DE mLT Debido al hecho que la mutación que reemplaza Argl92 con Glyl92 no altera el sitio enzimático de 3a porción Al, un experto en la materia podría predecir que mLT conservase su actividad enzimática de pbosilación de ADP. Para examinar esta propiedad, se empleó el ensayo de ADP-ribos i 11 ransferasa de NAD-Agmaa 11 na (Moss et al., 1993, J. Bial . Chem. 268: 6383-6387). Como se puede observar en la figura 2, CT produce un incremento dependiente de la dosis en cuanto a los niveles de ADP -pbssi lagmat ina , una función de la actividad de ADP-p bosi 1 ranßferasa de esta molécula. TABLA II Actividad ADP-pbosi 1 transf rasa de CT, LT nativa, y LT (R192G) Expíen menta 1 2 3 4 mean ±SEM No tox i na ND 9.12 5.63 14.17 9.64+2.48 llµµgg CCTT N NDD 17.81 17.60 25.75 20.39±2.68 lOµg CT ND 107.32 111.28 104.04 107.55±2.09 lO µg CT 3 35511..5Í5 361.73 308.09 ND 340.46±16.45 3 0 µg LT 1 177..3:2 14.48 13.86 ND 15.22±1.07 lOOµg LT + 164.10 189.89 152.96 ND 168.98±10.94 tripsina lOOµg 14.58 12.34 9.30 ND 12.07±1.53 lOOµg LT 14.73 8.90 10.47 ND 11.37±1.74 (P192G) + tr i psi na ND - No se rea 11 z 6 datos expresados en fMoles m?n-1 La Tabla II demuestra en forma tabula el hallazgo inesperado que mi T no presentó ninguna actividad enzimática ADP-ribosilante detectable, con o sin activación de tripsina, aún cuando el sitio enzimático na había sido alterado y existía un ni el basal demostrable de actividad en el ensayo de células adrenales Y-l. 6.4 ACTIVIDAD ENTEROTO ICA DE mLT Debido al hallazgo inesperado que mLT no tiene ninguna actividad enzimática ADP-pbosi lante detectable, con o sin activación por tripsina, aún cuando el sitio enzimático no ha sido alterado y el hallazgo adicional que existe un nivel basal de actividad en el ensayo de células adrenales Y-l, resultó incierto si mLT podía conservar algunas de sus propiedades enterotó icas. Una formulación adyuvante ideal de mLT conservaría su capacidad de actuar como adyuvante inmunológico pero no tendría los efectos colaterales reales o potenciales, como por ejemplo diarrea, asociados con el uso de LT o CT . La figua 3 demuestra que mLT no induce una secreción neta de fluidos en el modelo de ratón, aún en dosis de 125µg. Esta dosis es más de 5 veces mayor que la dosis efectiva de adyuvante para LT en este modelo. Es importante observar que se puede ver una toxicidad potencial de LT nativa en _> e nivel. 41? 6.5 ACTIVIDAD ADYUVANTE DE mLT Un experto en la materia podría predecir que puesto que mLT no posee ninguna actividad ADP-pbasi 1 transferasa demostrable y no es enterotó ic , na tendría una actividad adyuvante. Esta predicción se basaría en el reporte de Lycle et al., (Lyche et al., 1992, Eur. J. Im unol. 22:2277-2281) donde se aclara que alteraciones que afectan la actividad enzimática ADP-pbosi lante de la toxina y alteran la capacidad de incrementar los niveles intracelul ares de cAMP impiden también que la molécula funcione como adyuvante. Como arriba demostrado, mLT na tiene ninguna actividad enzimática de pbosilación de ADP solamente cierta actividad basal indefinida en células adrenales Y-l, y no induce ninguna secreción neta de fluido en el modelo de ratón de patente. Para examinar la actividad adyuvante de mLT, se llevó a cabo el siguiente experimento. Tres grupos de ratones BALB/c fueron inmunizados. Los animales fueron inoculados de manera mtragástpca con una aguja de alimentación de punta chata (Popper Sons, Inc., New Hyde Park, New York). El dia 0, rada grupo fue inmunizado oralmente de la siguiente manera: el grupo A recibió 0,5 ml de PBS que contenía 5 mg de OVA, el grupo B recibió 0.5 ml de PBS que contenía 5 mg de OVA y 25 µg de LT nativa, y el grupo C recibió 0.5 mi de PBS que contenia 5 mg de OVA y 25 µg de mLT. Cada régimen fue o administrado otra vez los días 7 y 14. El día 21, todos los animales recibieron un refuerzo i.p. con 1 µg de OVA en Maalox 20*/.. Una semana después de la inoculación í.p. los animales fueron sacrificados y ensayados para determinar anticuerpos de IgG sérica y IgA mucosal dirigidos contra OVA y LT por medio de ELISA. Los reactivos y los antisueros de ELISA fueron obtenidos de Sigma Chemical Ca. Muestras para ELISA fueran diluidas en sene en una solución salina amortiguada con fosfato (pH 7.2)-0.05*/, de Tween 20 (PBS-TWEEN). Para determina iones de anti-LT, placas de microt i tulación fueron prerevest idas con 1.5 µg por pozo de gangliósidos mixtos (tipo III), después con un 1 µg por pozo de LT purificada. Se determinó anti-OVA en las placas de microt i tulac ion prerevest i das con 10 µg por pozo de OVA. An i-LT y OVA séricos fueron determinados con antisuero de conejo contra IgG de ratón conjugada con fosfatasa alcalina. Se ensayaron las IgA anti-OVA y anti-LT mucosales con antisuero de cabra contra IgA de ratón 'especifico para cadena alfa) seguido por antisuero de conejo contra IgG de cabra conjugada con fosfatasa alcalina. Se suspendieron las reacciones con NaOH 3N. Los valores para IgG y IgA fueron determinados a partir de una curva estándar con proteínas de ieloma de ratón purificada (M0PC 315, gA (IgA12>; M0PC 21, gGl : Litton Bionetics, Inc., Charleston, SC ) . 6.5.1 IgG SÉRICA ANTI-OVA Como se muestra en la figura 4A, los animales cebados oralmente con OVA y LT desarrollaron una respuesta anti-OVA de IgG s?pc. significativamente más elevada después de la inmunización µarenteral subsecuente con OVA (4.058 µg/ml) que los animales cebados con OVA sola y subsecuentemente inmunizados) parenteralmente con OVA (ninguna respuesta anti-OVA detectable) (prueba t de Student p = .031). Significa ivamente, los animales cebados oralmente con OVA y mLT des rrollaron también una respuesta ant i-OVA de IgG sérica significat vamente más elevada después de la inmuni ación parenteral subsecuente con OVA (1.338 µg/ml) que los animales cebados con OVA sola y subsecuentemente inmunizados parenteralmente con OVA (ninguna respuesta anti-OVA detectable) (prueba t de Student p = .0007). 6.5.2 slgA MUCOSAL ANTI-OVA Como se muestra en la figura 4B, se obtuvieron resultados similares cuando se compararon respuestas de IgA anti-OVA dentro de los mismos grupos de animales. Los animales cebados oralmente con OVA y LT desarrollaron una respuesta anti-OVA de IgA mucosal significativamente más elevada después de la inmunización parenteral subsecuente con OVA (869 ng/ml) que los animales cebados con OVA sola y subse uentemente inmunizados parenteralmente con OVA (ninguna respuesta anti-OVA detectable) (prueba t de Student p - .0131). Co o arriba, los animales cebados oralmente con OVA y mLT des rroll ron también una respuesta anti-OVA de IgA mucosa! significativamente más elevada después de una inmunización parenteral subsecuente con OVA (230 pg/ml) que los animales cebados con OVA sola y subsecuentemente inmunizados parenteralmente con OVA (ninguna respuesta anti-OVA detectable) (prueba t de Student p =.0189). 6.5.3 IgG SÉRICA ANTI-LT La capacidad de IT y mLT para provocar una respuesta anticorporal ant?~LT en estos mismos animales se examinó también. Esto fue importante en la medida en que proporcionaría una indicación de sí la LT mutante podía impedir la inducción de la tolerancia hacia si misma además de funcionar como adyuvante para otras proteínas. Como se muestra en la figura 5A, los animales cebados oralmente con OVA y LT desarrollaron una respuesta anti-LT de IgG sérica significativamente más elevada después de una inmunización parenteral subsecuente con OVA (342 µg/ml) que los animales cebados con OVA sola y subsecuentemente inmunizados parenteralmente con OVA (ninguna respuesta anti-LT detectable) (prueba t de Student p =.0005). Los animales cebados oralmente con OVA y mLT desarrollaron también una respuesta anti-LT de IgG sérica significativamente más elevada después de inmunización parenteral subsecuente con OVA (552 µg/ml) que los animales cebados con OVA sola v subsecuentemente inmunizados parenter lmepte con OVA (ninguna respuesta anti-LT detectable) (prueba t de Student p = .0026) . 6.5.4 sl A MUCOSAL ANTI-LT Como se muestra en la figura 5B, se obtuvieron resultados similares cuando se compararon respuestas de IgA anti-LT con las respuestas de los mismos grupos de animales. Los animales cebados oralmente con OVA y LT desarrollaron una respuesta anti-LT de IgA mucosal si nificati amente más elevada después de la inmunización parenteral subsecuente con OVA (4.328 ng/ml) que los cebados con OVA sola y subsecuentemente inmunizados p renteralmente con OVA (ninguna respuesta anti-LT detectable) (prueba t de Student p = .0047). Como arriba, los animales cebados oralmente con OVA y mLT desarroll on también una respuesta anti-LT de IgA mucosal significativamente más elevada después de la inmunización parenteral subsecuente con OVA (1.463 ng/ml) que los animales cebados con OVA sala y subsecuentemente inmunizados parenteralmente con OVA (ninguna respuesta anti-LT detectable) (prueba t de Student p = .0323). 7. DEPOSITO DE MICROORGA ISMOS El siguiente plásmido fue depositado con la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, el día 18 de Agosto de 1994, y ha recibido el número de acceso indicado: Plásmido Número de acceso pBD95 en E. coli LTR192G ATCC 69683 La invención descrita y reclamada aquí na se limita en cuanto a su alcance a las modalidades específicas presentadas aquí puesto que estas modalidades tienen solamente el objeto de ilustrar varios aspectos de la invención. Cualquier modalidad equivalente se encuentra dentro del alcance de esta invención. Vanas modi icaciones a la presente invención además de las modalidades presentadas y descritas aquí serán evidentes a los expertos en la materia en base a la descripción anterior. Tales modificaciones tienen también el objeto de encontrarse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Se debt? también entender que todos los números y tamaños de pares de bases y residuos de aminoácidos presentados para nucleótidos y péptidos son números y cantidades aproximadas y se emplean con el objeto de describir la presente invenc i n. Numerosas referencias se mencionan en la presente, las cuales se incorporan aquí en su totalidad, por referencia.

Número de Solicitud Internacional: PCT/ / MICROORGANISMOS Hoja opcional en relación al microorganismo indicado en las páginas 32-33 renglones 35-37 y 1-3 de la descripción (en el documento original en inglés. En la traducción página 53 reglones 22-25 y página 54 renglón 1) A. IDENTIFICACIÓN DEL DEPOSITO Depósitos adicionales se identifican en una hoja adicional Nombre de la institución depositaría American Type Culture Collection Dirección de la institución depositaría (incluyendo cródigo postal y país) 12301 Park lawn Drive Rock vi lie, ND 20852 US Fecha de depósito: 18 de Agosto de 1994 Número de acceso: 69683 B. INDICACIONES ADICIONALES (Dejar en blanco si no son aplicables). Esta información continua en una hoja anexa separada: - C. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS CUALES SE HACEN INDICACIONES: D. SUMINISTRO SEPAPADO DF INDICACIONES (dejar en blanco si na es api icable) :-Las indicaciones que aparecen en la siguiente lista serán sometidas ante la Oficina Internacional m_-s adelante (Especificar Id naturaleza general de las in ica iones, por ejemplo "número de acceso de depósito" ):- E ( ) Esta hoja fue recibida con la solicitud Internac on l 5 cuando se presentó (a revisar por parte de la oficina receptor ) Elñora Rivera, Especialista Para legal Oficina Receptora PCT (708) 305 3185 10 (Firmado) (Oficial Autorizado) ( ) La fecha d** recep ión (del solicitante) por la Oficina Internacional fue: - (Ofici l autori ado) 15 Formato PCT/PO/134 (Enero de 1981) .O _-

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una composición que comprende una forma mutante de una enterotoxina bacteriana, halotoxina que tienen una toxicidad reducida en una dosis adyuvante efectiva, pero conserva su actividad adyuvante i munoló ica .
2. La composición de la rei indicación 1, que es tornad-a insensible a la activación proteo] í t ica .
3. La composición de la reivindica ión 1, que es una forma ?tante de una enterotoxina termolábil de E. eoli, holotoxina que es. distinta de la LT nativa en la medida en que tiene una actividad adyuvante i nmunológ ica pero una actividad de ribos i lac ion de ADP reducida.
4. La composición de la reivindicación t, que es una forma mutante de una enteroto i na termolábil de E. coli, holotoxina que es distinta de la LT nativa en la medida en que la subunidad A de la holotoxina es tornada insensible a la activación proteolítica.
5. La composición de la rei indicación 1, que se encuentra codificada por el plásmido pE*D95 contenido en E. coli LTP192G que tiene el número de acceso de ATCC 69683, que expresa tanto 3a subunidad A como la subunidad B de la enterotox ina ter olábil de E. coli.
6. Una preparación de vacuna que comprende un ant f geno en combinación con la composición de conformidad con 3a rei indicación 1.
7. Una preparación de vacuna oral que comprende un antígeno en combina ión con la composición de conformidad con la reivin icación 1.
8. La preparación de vacuna de la reivindicación 6 o 7, en donde el antigeno es un antigeno bacteriano de bacterias patogénicas seleccionadas dentro del grupo que consiste de Streptococcus spp., Neissepa spµ., Corynebacter íu spp., Clostndium spp., Hemophilus spp., lebsiella spp., Staphylococcus spp., Vibrio spp., Esche ichi spp., Pseudomonas spp., Campylabacter spp., Aeromonas spp., Bacillus spp., Edwardsiella spp., Yersinia spp., Shigella spp., Sal onella spp., Treponema spp., Borrelia spp., Leptospira spp., Mycobactenum spp., Toxoplasma spp., Pneu ocystis spp., Francisella spp., Brucella spp., Mycoplasma spp., Pickettsia spp., y Chlamydia spp.
9. La preparación de vacuna de la reivindicación 6 o 7, donde el antígeno se selecciona dentro del grupo que consiste de vacuna contra la gripe, vacu a contra la varice] la, toxoide de difteria, toxoide de tétanos, vacuna contra tos ferina, vacuna contra la encefalitis japonesa, vacuna mixta contra tos ferina, toxaide de difteria y toxoide de tétanos, vacuna contra la enfermedad de Ly e, vacuna contra la polio, vacuna contra la malaria, vacuna contra herpes, vacuna contra VIH, vacuna contra papi 1 lomaví rus, vacuna contra la hepatitis B, vacuna contra rotavirus, vacuna contra Ca p lobac ter , vacuna contra el cólera, vacuna contra E. coli enterap togénico, vacuna contra E. col i enterotóx ico, vacuna contra Salmonella, vacuna contra Shigella, vacuna contra esqu istosomiasis, vacuna contra sarampión, vacuna contra rubéola, vacuna contra paperas, vacuna combinada contra sarampión, rubéola y paperas, y vacuna contra micoplasma.
10. Una composición útil para la producción de una respuesta i nmunoló ica protectora contra un patógeno en un huésped que comprende una mezcla de una cantidad efectiva de un antígeno y una cantidad efectiva de un adyuvante de la composición de conformidad con la rei indicac ón 1.
11. Una composici n oral útil para la producción de una respuesta inmunológica protectora contra un patógeno en un huésped, que comprende una mezcla de una cantidad efectiva de un antígena y una cantidad adyuvante efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 1.
12. Una enteratoxma mutante, de conformidad con la reivindicación 1, para su uso en medicina.
13. Un conjunto de elementos útiles para producir una respuesta inmunoló ica protectora en un huésped contra un patógeno que comprende dos componentes: (a) una cantidad efectiva de antígeno y (b ) una cantidad adyuvante efectiva de una enteroto ina termolábil de E. col i mutante, holotoxina que es distinta de LT y CT nativa en la medida en que la subunidad A de la holoto ina ha sido tornada insensible a la activación proteolítica, pero la holotoxina conserva su actividad adyuvante inmunológica, donde ambos componentes se encuentran en un vehículo oralmente aceptable y dichos componentes pueden administrarse o bien después de haber sido mezclados juntos o bien separadamente dentro de un periodo de tiempo corto entre dichas administraciones.
14. La composición de la reivi dicación 1 o bien 10, en donde al aminoácido Argl92 de la enterotoxina termolábil de E. cali de tipa salvaje se encuentra reemplazada por Glyl92.
15. La preparación de vacuna de conformidad con la rei indicación 6 o bien 7, en donde el aminoácido Argl92 de la ertterotaxina termolábil de E. coli de tipo salvaje se encuentra reemplazado por Glyl92.
16. El conjunto de elementos de la reivindicación 13, en donde al aminoácido Argl92 de la enterotaxina termilábil de E. cali de tipo salvaje se encuentra reemplazado por Glyl92.
17. Un método para crear o bien conservar una respuesta inmunalógica protectora o bien adaptación a un antígeno en un huésped, que comprende la administración oral de una mezcla de una cantidad efectiva del antígeno y una cantidad efectiva adyuvante de una enterotaxina termolábil de E. coli mutante, holoto i na que es distinta de la LT y CT nativa en la medida en que la subunidad A de la holotoxina ha sido tornada insensible a la activación proteolítica, pero la holotoxina conserva su actividad adyuvante inmunológica en un vehículo farmacéutico oralmente aceptable.
18. El método de la reivindicación 17, donde se produce una respuesta sérica.
19. El método de la reivindicación 17, donde se produce una respuesta mucosal.
20. El método de la reivindicación 17, donde se proporciona un refuerzo subsecuente de antígeno.
21. El método de la reivindicación 17, donde el antígeno se deriva del grupo que consiste de bacterias, virus, protozaanos, hongos, helmintos y otros patógenos mic ab í nos.
22. El método de la reivindicación 17, donde la mezcla se suministra en una dosis única.
23. Un método para la inducción de una respuesta inmunológica protectora contra un organismo bacteriano enterotóxica que comprende la utilización de mLT como componente de una vacuna enfocada contra el organismo bacteriano enterotó ica.
24. El método de la reivindicación 23, donde el organismo bacteriano enterotó ico se selecciona dentro del grupo que consiste de organismos bacterianos enterotó icos que expresan toxinas similares al cólera.
25. El método de la reivindicación 24, donde el organismo bacteriano enterotóxico se selecciona dentro del grupo que consiste de Eschepchia spp. y Vibrio spp.