MX2015001907A

MX2015001907A - Anticuerpos anti-pcsk9 con caracteristicas de union dependientes del ph.

Info

Publication number: MX2015001907A
Application number: MX2015001907A
Authority: MX
Inventors: Andrew J Murphy; George D Yancopoulos; Nicholas J Papadopoulos; Neil Stahl
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2012-08-13
Filing date: 2013-08-12
Publication date: 2015-06-05
Also published as: AU2013302925A1; CN104540852B; CA2881679C; NZ704771A; EP2882778B1; TWI596115B; MX363213B; EA028244B1; JP6309521B2; US20140044730A1; KR20150041662A; IL236785B; CA2881679A1; UY34975A; HK1211603A1; TW201420605A; JP2015526440A; US9540449B2; AR092098A1; EP2882778A1

Abstract

La presente invención provee anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que específicamente se unen a proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. Los anticuerpos de la invención pueden poseer uno o más cambios de aminoácidos en comparación con los anticuerpos que no presentan propiedades de unión dependientes del pH. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-PCSK9 que poseen una o más sustituciones de histidina en una o más regiones determinantes de la complementariedad. Los anticuerpos de la invención, con propiedades de unión dependientes del pH, permanecen en la circulación y exhiben actividad reductora del colesterol en sujetos animales durante períodos de tiempo prolongados en comparación con los anticuerpos anti-PCSK9 que no presentan propiedades de unión dependientes del pH. Por lo tanto, los anticuerpos de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con concentraciones elevadas de colesterol HDL, por lo que los anticuerpos de la invención se pueden administrar a un paciente en dosis más bajas y/o con menos frecuencia en comparación con los anticuerpos que no exhiben propiedades de unión dependientes del pH.

Description

ANTICUERPOS ANTI-PCSK9 CON CARACTERÍSTICAS DE UNIÓN DEPENDIENTES DEL pH Campo de la invención La presente invención se refiere a moléculas de unión a antigeno que interactúan específicamente con proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), y al uso de tales moléculas para tratar la hipercolesterolemia y otros trastornos relacionados que se caracterizan por niveles elevados de colesterol.

Antecedentes de la invención La proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) es una proproteína convertasa perteneciente a la subfamilia de las proteinasas K de la familia de las subtilasas secretoras. La proteína codificada se sintetiza como un zimógeno soluble que se somete a procesamiento autocatalítico intramolecular en el retículo endoplásmico. La PCSK9 circulante se une al receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR) en la superficie de los hepatocitos y apunta al mismo para su destrucción. Este proceso reduce la capacidad del hígado para unirse y eliminar el colesterol LDL (LDL-C) y por lo tanto da lugar a un aumento de los niveles de LDL-C. Se ha demostrado que los anticuerpos que se unen específicamente a PCSK9 y bloquean su interacción con el receptor de LDL son terapéuticamente útiles para reducir los niveles de LDL-C en suero en sujetos humanos. (Ver, por ejemplo, Stein et al., New Engl . J. Med. 2012; 366:1108-1118).

La dosis y/o la frecuencia de administración de un anticuerpo necesaria para producir un efecto terapéutico generalmente son determinadas por el número de antigenos que pueden ser neutralizados por una sola molécula de anticuerpo. Por ejemplo, si un anticuerpo puede unir y neutralizar un solo antigeno antes de que el anticuerpo sea identificado para su degradación dentro del huésped, para producir un efecto terapéutico se debe administrar una cantidad relativamente grande del anticuerpo y/o el anticuerpo se debe administrar con una frecuencia relativamente alta. Por otro lado, si un único anticuerpo puede unirse repetidamente a múltiples antigenos antes de su degradación, para lograr una respuesta terapéuticamente eficaz es necesario administrar menos anticuerpo y se lo puede administrar con una frecuencia menor.

Existe una necesidad en la téenica de contar con nuevas moléculas terapéuticas capaces de unirse a PCSK9 que puedan producir una respuesta terapéutica eficaz durante un periodo de tiempo más largo y/o con una cantidad de dosificación menor que lo que se requiere con los antagonistas de PCSK9 actualmente conocidos y disponibles.

Sumario de la invención La presente invención provee anticuerpos y fragmentos de unión a antigeno de los mismos que exhiben unión dependiente del pH a la proproteina convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9). Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos y fragmentes de unión a antigeno de los mismos que se unen a PCSK9 con mayor afinidad cuando el pH es neutro que cuando el pH es ácido (es decir, la afinidad de unión se reduce cuando el pH es ácido). Como se ilustra en los ejemplos que se exponen en este documento, los anticuerpos anti-PCSK9 con afinidad de unión reducida a pH ácido poseen diversas características biológicas mejoradas/aumentadas en comparación con los anticuerpos que no exhiben afinidad de unión reducida a pH ácido. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PCSK9 de la presente invención con afinidad de unión reducida a pH ácido tienen semividas en circulación más largas cuando se los administra a sujetos animales (incluso a pacientes humanos) en comparación con los anticuerpos anti-PCSK9 que no presentan afinidad de unión reducida a pH ácido. En otras palabras, los anticuerpos anti-PCSK9 de la presente invención con afinidad de unión a PCSK9 reducida a pH ácido se eliminan de la circulación más lentamente que los anticuerpos anti-PCSK9 que carecen de unión dependiente del pH. La eliminación más lenta de los anticuerpos (es decir, una mayor semivida en la circulación) se correlaciona con la eficacia prolongada de los anticuerpos de la presente invención para reducir el colesterol. Por lo tanto, los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar a un sujeto con menos frecuencia y/o en dosis más bajas, no obstante lo cual exhibirán una eficacia equivalente (o mejor) que los anticuerpos anti-PCSK9 que no tienen afinidad de unión reducida a pH ácido.

Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que los anticuerpos anti-PCSK9 con menor afinidad de unión a PCSK9 a pH ácido (en comparación con pH neutro) se disocian a partir del antígeno en el ambiente ácido del endosoma y se recielan hacia el plasma donde pueden experimentar rondas adicionales de unión a antígeno terapéutico. Este fenómeno se conoce como "reciclaje de anticuerpo" o "captura y liberación" y puede mejorar mucho la potencia de un anticuerpo in vivo debido a que una sola molécula de anticuerpo se puede unir a, y neutralizar, múltiples antígenos. Por el contrario, los anticuerpos que se unen a PCSK9 con igual o mayor afinidad a pH ácido (en comparación con pH neutro) se dirigen hacia el lisosoma para su degradación después de apenas una única ronda de unión anticuerpo-antígeno en virtud de su fuerte unión con antígeno en el endosoma.

Las características de unión de un anticuerpo anti-PCSK9 se pueden cuantificar in vitro, por ejemplo, mediante resonancia de plasmón superficial, la cual provee valores numéricos de las propiedades de unión (por ejemplo, ka, kd, KD, t½, etc.) para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH neutro y a pH ácido. Estos parámetros se pueden utilizar para determinar si un anticuerpo se une a PCSK9 con características de unión dependientes del pH. La presente invención incluye, por lo tanto, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a PCSK9 con al menos 5 veces mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial (o, como se indica a la inversa, anticuerpos que se unen a PCSK9 con al menos 5 veces menor afinidad a pH ácido que a pH neutro tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial). La presente invención también incluye anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a PCSK9 con una t½ a pH ácido que es al menos 5 veces más corta que la t½ para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH neutro medida mediante resonancia de plasmón superficial (o, dicho a la inversa, anticuerpos que se unen a PCSK9 con una t a pH neutro que es al menos 5 veces más larga que la t para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH ácido, medida mediante resonancia de plasmón superficial). De acuerdo con ciertas modalidades, se proveen anticuerpos anti-PCSK9 que se unen a PCSK9 con al menos 5 veces mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido y que se unen a PCSK9 con una t½ a pH ácido que es al menos 5 veces más corta que la t para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH neutro.

De acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, se proveen anticuerpos anti-PCSK9 que, al ser administrados a un sujeto en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg, reducen el LDL-C en suero al menos un 25% con respecto a la linea de base y mantienen la reducción del LDL-C en suero durante al menos 20 dias.

Los anticuerpos anti-PCSK9 de la presente invención de pueden obtener, por ejemplo, mediante mutación de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-PCSK9 parenteral que no presenta unión dependiente del pH o que sólo muestra unión dependiente del pH intermedia para crear asi una variante de anticuerpo anti-PCSK9 que exhibe unión dependiente del pH. Por ejemplo, uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo anti-PCSK9 parenteral se pueden cambiar a un residuo de histidina y el anticuerpo variante resultante con histidina se puede ensayar para determinar si exhibe unión dependiente del pH (por ejemplo, afinidad reducida por PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro).

Un ejemplo de anticuerpo anti-PCSK9 parental que, de acuerdo con la presente invención, se puede modificar a nivel de la secuencia de aminoácidos para producir variantes de anticuerpos anti-PCSK9 ccoonn propiedades de unión dependientes del pH mejoradas es el anticuerpo denominado 300N. Alternativamente, cualquier anticuerpo anti-PCSK9 que comprenda los dominios variables de cadena pesada y ligera (HCVR/LCVR) del anticuerpo 300N (es decir, que comprenda las SEQ ID NO:218/226), o que comprenda las CDR de cadena pesada y ligera (HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) del anticuerpo 300N (es decir, que comprenda las SEQ ID NO:220-222-224-228-230-232), se puede utilizar como un anticuerpo parental del que se pueden derivar anticuerpos anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH mediante mutagénesis por sustitución con histidina. Además, cualquier anticuerpo anti-PCSK9 o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR, o las secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 como se muestra en la Tabla 1 de este documento, se puede utilizar como un anticuerpo parental del que se pueden derivar anticuerpos anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH mediante mutagénesis por sustitución con histidina.

La presente invención incluye métodos para el tratamiento de enfermedades y trastornos que son tratables y/o mejoran al antagonizar la PCSK9, por ejemplo, bloqueando la interacción de la PCSK9 con el receptor de LDL (LDLR). Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-PCSK9 o un fragmento de unión a antigeno del mismo con características de unión dependientes del pH. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención se pueden usar para tratar, por ejemplo, hipercolesterolemia y otras enfermedades o trastornos relacionados como se describe en otra parte de este documento.

La presente invención también incluye regímenes de administración terapéuticos que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite múltiples dosis de un anticuerpo anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH. De acuerdo con ciertas modalidades dentro de este aspecto de la invención, las dosis individuales del anticuerpo anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH se pueden administrar a un sujeto con una frecuencia menor que una vez al mes (por ejemplo, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, etc.).

La presente invención incluye anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos con características de unión dependientes del pH para usarse en el tratamiento de enfermedades y trastornos que son tratables y/o mejorados mediante antagonismo de PCSK9, por ejemplo, al bloquear la interacción de PCSK9 con receptor de-LDL (LDLR), incluyendo cualquiera de las enfermedades o trastornos relacionados con PCSK9 ilustrativos mencionados en este documento. Los anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de unión a antigeno de los mismos con características de unión dependientes del pH de la presente invención se pueden administrar de acuerdo con los regímenes de administración terapéutica enseñados en este documento.

La presente invención incluye composiciones farmacéuticas para usarse en el tratamiento de enfermedades y trastornos que son tratables y/o mejorados mediante antagonismo de PCSK9, por ejemplo, al bloquear la interacción de PCSK9 con receptor de LDL (LDLR), preferiblemente aquellas enseñadas en este documento con respecto a los métodos de tratamiento de enfermedades y trastornos que son tratables y/o mejoradós mediante antagonismo de PCSK9. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con este aspecto de la invención pueden comprender un anticuerpo anti-PCSK9 o fragmento de unión a antígeno del mismo con características de unión dependientes del pH para usarse en el tratamiento de enfermedades y trastornos que son tratables y/o mejorados mediante antagonismo de PCSK9. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de acuerdo con los regímenes de administración terapéutica enseñados en este documento Otras modalidades serán evidentes a partir dé una revisión de la descripción detallada consecuente.

Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra la concentración en suero de anticuerpos anti-PCSK9 medida en ratones que expresan sólo PCSK9 de ratón (es decir, que no expresan PCSK9 humana) en diferentes puntos de tiempo después de la administración subcutánea de anticuerpos anti-PCSK9 en una dosis de 1 mg/kg.

Las .Figuras 2A, 2B y 2C muestran 1a concentración en suero de anticuerpos anti-PCSK9 medida en ratones que expresan PCSK9 humana (en lugar de PCSK9 de ratón) en diferentes puntos de tiempo después de la administración subcutánea de anticuerpos anti-PCSK9 en una dosis de 1 mg/kg. En la Tabla 5 de este documento se muestra una descripción de los anticuerpos usados en los experimentos representados en las Figuras 2A, 2B y 2C.

Las Figuras 3A-3G muestran sensogramas de experimentos de unión con resonancia de plasmón superficial en los que se permitió que los anticuerpos anti-PCSK9 se asociaran con antigeno de PCSK9 humana a pH neutro (pH 7.4) seguido por un cambio a reguladores de pH con diferentes valores de pH (7.4, 7.2, 6.0 y 5.75) para la fase de disociación Los anticuerpos que se ensayaron en estos experimentos son los siguientes: 316P(vl) y 300N(v2) (Figura 3A); VH-D106H y VK-L30H (Figura 3B); VH-D106H/VK-L30H y Comparador 1 (Figura 3C); Comparador 2 y Comparador 3 (Figura 3D); Comparador 4 y Comparador 5 (Figura 3E); Comparador 6 y Comparador 7 (Figura 3F); y Comparador 8 y Comparador 9 (Figura 3G) . Las lineas individuales en cada gráfico representan las respuestas de unión a diferentes concentraciones de los respectivos anticuerpos. La Tabla 5 de este documento muestra una descripción de los anticuerpos utilizados en estos experimentos. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 37°C. Los valores de semivida disociativa (t½) se indican sobre los respectivos sensogramas.

Descripción detallada de la invención Antes de describir la presente invención, se debe comprender que esta invención no se limita a los métodos particulares y condiciones experimentales descritos, ya que tales métodos y condiciones pueden variar. También se debe comprender que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos téenicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entienden los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. De acuerdo con el uso que se le da en la presente, el término "aproximadamente", cuando se utiliza con referencia a un valor numérico mencionado en particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor mencionado en no más del 1%. Por ejemplo, tal como se utiliza en este documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, etc.).

Aunque en la práctica o la prueba de la presente invención se pueden utilizar cualesquier métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, ahora se describirán los métodos y materiales preferidos.

Definiciones generales Tal como se utilizan en el presente documento, las expresiones "proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9", "PCSK9", "fragmento de PCSK9" y similares se refieren a la proteina PCSK9 humana o a un fragmento de la misma, a menos que se especifique que es de una especie no humana (por ejemplo, "PCSK9 de ratón", "fragmento de PCSK9 de ratón", "PCSK9 de mono", "fragmento de PCSK9 de mono", etc.). PCSK9 humana (en este documento a veces abreviada como "hPCSK9") tiene el aminoácido como se establece en SEQ ID NO: 755).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" significa cualquier molécula de unión a antigeno o complejo molecular que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente a, oo qquuee iinntteerraaccttúúaa ccoonn,, un antígeno particular (por ejemplo, PCSK9). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptidicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro, asi como multimeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (en este documento abreviada como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (en este documento abreviada como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio (CL1). Las regiones VH y VL se pueden subdividir aún más en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, del inglés framework regions). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes modalidades de la invención, las FR del anticuerpo (o porción de unión a antigeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la linea germinal humana, o pueden ser modificadas natural o artificialmente. Se puede definir una secuencia de consenso de aminoácidos sobre la base de un análisis lado a lado de dos o más CDR.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" también incluye fragmentos de unión a antigeno de moléculas de anticuerpo completas. De acuerdo con el uso que se les da en la presente, los términos "porción de unión a antigeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antigeno" de un anticuerpo y similares incluyen cualquier polipéptido o glicoproteina de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o diseñado mediante ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo se pueden derivar, por ejemplo, a partir de moléculas de anticuerpo completas utilizando cualquier téenica estándar adecuada, tales como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica los dominios variables y opcionalmente constantes del anticuerpo. Tal ADN es conocido y/o se puede conseguir fácilmente, por ejemplo, de fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (entre ellas, por ejemplo, bibliotecas de anticuerpos de fagos), o bien se puede sintetizar. El ADN se puede secuenciar y manipular químicamente o mediante el uso de técnicas de biología molecular, por ejemplo, para organizar uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear residuos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.

Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antigeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2 ; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los residuos de aminoácido que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada tal como un péptido CDR3), o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas diseñadas mediante ingeniería genética, tales como los anticuerpos específicos para un dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos a los cuales se les ha eliminado un dominio, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc), pequeños immunofármacos modulares (SMIP, del inglés small modular immunopharmaceuticals), y dominios IgNAR variables de tiburón, ·también están comprendidos dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno" tal como se usa en el presente documento.

Típicamente un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo comprende al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que es adyacente a, o que se encuentra en el marco con, una o más secuencias de marco. En fragmentos de unión a antigeno que tienen un dominio VH asociado con un dominio VL, los dominios VH y VL pueden estar situados uno con relación a otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener dimeros VH-VH, VH-VL o VL-VL. Alternativamente, el fragmento de unión a antigeno de un anticuerpo puede contener un dominio VH o VL monomérico.

En ciertas modalidades, un fragmento de unión a antigeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a por lo menos un dominio constante. Los ejemplos de configuraciones de dominios variables y constantes que se pueden encontrar dentro de un fragmento de unión a antigeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen las siguientes, aunque no se limitan a las mismas: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; y (xiv) VL-CL. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluso en cualquiera de los ejemplos de configuraciones enumeradas en el párrafo precedente, los dominios variables y constantes pueden estar directamente unidos entre si o bien pueden estar unidos por una región bisagra total o parcial o por una región de enlace. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes en una única molécula de polipéptido. En ciertas modalidades, la región de bisagra consta de entre 2 y 60 aminoácidos, por ejemplo, entre 5 y 50 o entre 10 y 40 aminoácidos. Por otra parte, un fragmento de unión a antigeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homo-dimero o hetero-dimero (u otro multimero) de cualquiera de las configuraciones de dominios variables y constantes enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre si y/o con uno o más dominios VH o VL monoméricos (por ejemplo, mediante enlace(s) disulfuro).

Tal como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo humano" pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivados de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis in vitro aleatoria o especifica de un sitio o por mutación somática in vivo) , por ejemplo en las CDR y en particular en la CDR3. Sin embargo, tal como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo humano" no pretende incluir anticuerpos en los cuales se han injertado secuencias de CDR derivadas de la linea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias marco humanas. En ciertas modalidades, un anticuerpo humano puede ser un anticuerpo humano recombinante, como se define más adelante en este documento.

Tal como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo humano recombinante" pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos que se expresan usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedera (lo cual se describe más adelante), anticuerpos que se aíslan de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes (lo cual se describe más adelante), anticuerpos que se aíslan de un animal (por ejemplo, de un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucí. Acids Res.20:6287-6295) o anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. No obstante, en ciertas modalidades tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de, y están relacionadas con, las secuencias VH y VL de la linea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la linea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que se asocian con la heterogeneidad de la bisagra. En una de las formas, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción estable de cuatro cadenas de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dimeros se mantienen unidos mediante un enlace disulfuro de cadena pesada entre cadenas. En una segunda forma, los dimeros no están unidos mediante enlaces disulfuro entre cadenas y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una cadena ligera y una pesada acopladas covalentemente (medio anticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de la purificación por afinidad.

La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intactos se debe, pero no limita, a diferencias estructurales asociadas con el isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una única sustitución de aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) a niveles normalmente observados usando una bisagra de IgGl humana. La presente invención abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra CH2 o CH3 que pueden ser deseables, por ejemplo, en producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo aislado" significa un anticuerpo que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o eliminado a partir de al menos un componente de un organismo, o a partir de un tejido o célula donde el anticuerpo existe de forma natural o se produce de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los propósitos de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Anticuerpos aislados son anticuerpos que han sido sometidos al menos a una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con ciertas modalidades, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o productos químicos.

Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo "neutralizante" o "de bloqueo" se refiere a un anticuerpo cuya unión a PCSK9 reduce o inhibe de forma detectable la interacción entre la PCSK9 y el receptor de LDL (LDLR) o un fragmento extracelular del LDLR.

Los anticuerpos anti-PCSK9 descritos en este documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 inserciones, y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 deleciones) en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la linea germinal correspondiente a partir de la cual se derivaron los anticuerpos. Tales mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos aquí descritas con secuencias de la linea germinal disponibles, por ejemplo, de bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. En otra parte en este documento se discuten detalladamente cambios de aminoácidos específicos que confieren características de unión dependientes del pH a los anticuerpos anti-PCSK9 de la invención. La presente invención incluye anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se derivan de cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en este documento, donde uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) dentro de una o más regiones marco y/o CDR se mutan al/a los residuo(s) correspondiente(s) de la secuencia de la línea germinal de la que se derivó el anticuerpo, o al/a los residuo (s) correspondiente(s) de otra secuencia de la linea germinal humana, o a una sustitución conservadora de aminoácidos del/de los residuo(s) correspondiente(s) de la linea germinal (en este documento, tales cambios de secuencia se denominan colectivamente "mutaciones de la linea germinal"). D partir de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera descritas en este documento, una persona versada en la téenica puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antigeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la linea germinal o combinaciones de las mismas. En ciertas modalidades, todos los residuos de regiones marco y/o CDR dentro de los dominios VH y/o se mutan nuevamente a los residuos que se encuentran en la secuencia de la linea germinal original a partir de la cual se derivó el anticuerpo. En otras modalidades, solo ciertos residuos se mutan nuevamente a la secuencia de la linea germinal original, por ejemplo, solo los residuos mutados que se encuentran dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o solo los residuos mutados que se encuentran dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otras modalidades, uno o más residuos de las regiones marco y/o CDR se mutan al/a los residuo (s) correspondiente (s) de una secuencia de linea germinal diferente (es decir, una secuencia de linea germinal diferente de la secuencia de linea germinal a partir de la cual el anticuerpo se derivó originalmente). Además, los anticuerpos de la presente invención pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de linea germinal en las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, donde ciertos residuos individuales se mutan al residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal en particular, mientras que ciertos otros residuos que difieren de la secuencia de línea germinal original se mantienen o se mutan al residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de línea germinal se pueden ensayar fácilmente para determinar si tienen una o más propiedades deseadas, tales como una mejor especificidad de unión, un aumento de la afinidad de unión, mejores o mayores propiedades biológicas antagonistas o agonistas (según corresponda), menor inmunogenicidad, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera en general están comprendidos dentro de la presente invención.

La presente invención también incluye anticuerpos anti-PCSK9 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR, y/o CDR descritas en este documento que tienen una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-PCSK9 que tienen secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc. sustituciones conservadoras de aminoácidos en relación con cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR y/o CDR descritas en la presente.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antigeno especifico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocido como un paratopo. Un solo antigeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas de un antígeno y pueden tener efectos biológicos diferentes. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional es producido por aminoácidos de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal yuxtapuestos espacialmente. Un epítopo lineal es un epítopo producido por residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En ciertas circunstancias, un epítopo puede incluir grupos funcionales de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

El término "identidad sustancial" o "sustancialmente idénticos", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea óptimamente con inserciones o deleciones nucleotídicas apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencias nucleotidicas en al menos aproximadamente 95%, y más preferentemente en al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% de las bases nucleotidicas, medida utilizando cualquier algoritmo de identidad de secuencia conocido, tales como FASTA, BLAST o Gap, como se discute a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en ciertos casos, codificar un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos o una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la del polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

Cuando se aplica a los polipéptidos, el término "similitud sustancial" o "sustancialmente similares" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean óptimamente, como por ejemplo con los programas GAP o BESTFIT utilizando pesos de hueco por defecto, comparten al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia. Cuando los porcentajes de identidad de secuencia están indicados para secuencias de aminoácidos en la presente descripción, se pretende que dichos porcentajes sean calculados en relación con la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia respectiva a menos que se indique específicamente lo contrario. Preferentemente, las posiciones de los grupos funcionales que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la cual un residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservadora no cambia sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la téenica. Ver, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales alifáticas-hidroxilo: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina, e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Alternativamente, una sustitución conservadora es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de log-probabilidades PAM250 descrita en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de log-probabilidades PAM250.

La similitud de secuencia para los polipéptidos, que también se conoce como identidad de secuencia, típicamente se mide usando software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteínas busca secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones, entre ellas las sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que se pueden utilizar con los parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Ver, por ejemplo, GCG Versión 6.1. También se pueden comparar secuencias polipeptídicas usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) provee alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones que mejor se superponen entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferido para comparar una secuencia de la invención contra una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando los parámetros por defecto. Ver, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

Anticuerpos anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH La presente invención provee anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que exhiben características de unión dependientes del pH. Tal como se utiliza en este documento, la expresión "unión dependiente del pH" significa que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo exhibe "unión a PCSK9 reducida a pH ácido en comparación con pH neutro" (para los propósitos de la presente descripción, las dos expresiones se pueden utilizar en forma indistinta). Para el ejemplo, anticuerpos "con características de unión dependientes del pH" incluye los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a PCSK9 con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En ciertas modalidades, los anticuerpos y fragmentos de unión a antigeno de la presente invención se unen a PCSK9 con al menos 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, o más veces mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. La frase anticuerpos "con características de unión dependientes del pH" también incluye a los anticuerpos con "características de unión dependientes del pH intermedias", tal como dicha expresión se define en este documento.

Para los fines de la presente divulgación, la "afinidad" de un anticuerpo por un antígeno (por ejemplo, PCSK9) se expresa en términos de la KD del anticuerpo. La KD de un anticuerpo se refiere a la constante de disociación en equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno. Cuanto mayor sea el valor de KD para la unión de un anticuerpo a su antígeno, más débil será la afinidad de unión de dicho anticuerpo con respecto a ese antígeno en particular. En consecuencia, tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido" (o la expresión equivalente "unión dependiente del pH") significa que la KD para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH ácido es mayor que la KD para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH neutro. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención, se considera que un anticuerpo se une a PCSK9 con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido si la KD para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH ácido es al menos aproximadamente 3 veces mayor que la KD para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH neutro. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antigeno de los mismos que se unen a PCSK9 a pH ácido con una KD que es al menos aproximadamente 3, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, -30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, o más veces mayor que la KD para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH neutro (lo que significa que los anticuerpos o fragmentos de unión a antigeno de los mismos se unen a PCSK9 a pH neutro con una afinidad que es al menos aproximadamente 3, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, o más veces mayor que a pH ácido).

Las propiedades de unión de un anticuerpo para un antígeno en particular también se pueden expresar en términos de la kd del anticuerpo. La kd.de un anticuerpo se refiere a la constante de velocidad de disociación del anticuerpo con respecto a un antigeno en particular y se expresa en términos de segundos recíprocos (es decir, seg-1). Un aumento en el valor de kd significa una unión más débil de un anticuerpo a su antígeno. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos que se unen a PCSK9 con un mayor valor de kd a pH ácido en comparación con pH neutro. La presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a PCSK9 a pH ácido con una kd que es al menos aproximadamente 3, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, o más veces mayor que la kd para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH neutro.

Las propiedades de unión de un anticuerpo para un antigeno en particular también se pueden expresar en términos de la t½ del anticuerpo. La t ½ de un anticuerpo se refiere a la semivida de la interacción anticuerpo-antigeno. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, un anticuerpo con "características de unión dependientes del pH" (o la expresión equivalente "unión a PCSK9 reducida a pH ácido en comparación con pH neutro") incluye anticuerpos que se unen a PCSK9 a pH ácido con una t más corta que a pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos o fragmentos de unión a antigeno de los mismos que se unen a PCSK9 con una t½ a pH ácido que es al menos 5 veces más corta que la t½ para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antigeno de los mismos que se unen a PCSK9 a pH ácido con una t que es al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, o más veces más corta que la t½ para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH neutro. A modo de ejemplo ilustrativo, si un anticuerpo anti-PCSK9 exhibe una t½ de 21 minutos a pH neutro, y una t½ de 3 minutos a pH ácido, para los propósitos de la presente descripción, el anticuerpo se une a PCSK9 a pH ácido con una t½ que es 7 veces [es decir, 21 minutos dividido por 3 minutos] más corta que la t½ para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH neutro.

En ciertos casos, una "unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro" se expresa en términos de una relación entre el valor KD del anticuerpo que se une a PCSK9 a pH ácido y el valor KD del anticuerpo que se une a PCSK9 a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, para los propósitos de la presente invención se puede considerar que un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo exhibe "unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro" si el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo exhibe una relación KD ácido/neutro de aproximadamente 3.0 o mayor. En ciertos ejemplos de modalidad, la relación KD ácido/neutro para un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno de la presente invención puede ser de aproximadamente 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 o mayor.

En ciertos casos, una "unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro" se expresa en términos de una relación entre el valor kd del anticuerpo que se une a PCSK9 a pH ácido y el valor kd del anticuerpo que se une a PCSK9 a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, para los propósitos de la presente invención se puede considerar que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo exhibe "unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro" si el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo exhibe una relación kd ácido/neutro de aproximadamente 3.0 o mayor. En ciertas modalidades, la relación KD ácido/neutro para un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno de la presente invención puede ser de aproximadamente 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 o mayor.

En ciertos casos, una "unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro" se expresa en términos de una relación entre el valor de la t del anticuerpo que se une a PCSK9 a pH ácido y el valor de la t½ del anticuerpo que se une a PCSK9 en pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, para los propósitos de la presente invención se puede considerar que un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo exhibe "unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro" si el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo exhibe una relación t½ ácido/neutro de aproximadamente 0.20 o menos. En ciertos ejemplos de modalidad, la relación t½ ácido/neutro para un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno de la presente invención puede ser de aproximadamente 0.20, 0.15, 0.14, 0.12, 0.10, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01 o menos.

Los anticuerpos de la presente invención pueden, en ciertos casos, unirse a PCSK9 tanto con una afinidad más baja (es decir, una KD mayor) y una t más corta a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que se unen a PCSK9 con al menos 5 veces mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido, y con una t½ a pH ácido que es al menos 5 veces más corta que la t para el anticuerpo que se une a hPCSK9 a pH neutro. Sin embargo, en ciertos casos, un anticuerpo que exhibe unión a PCSK9 con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido (según lo indica el valor de KD) puede no necesariamente exhibir una t½ más corta a pH ácido en comparación con pH neutro.

Tal como se utiliza en este documento, la expresión "pH ácido" significa un pH de 6.0 o menos (por ejemplo, menos de aproximadamente 6.0, menos de aproximadamente 5.5, menos de aproximadamente 5.0, etc.). La expresión "pH ácido." incluye valores de pH de aproximadamente 6.0, 5.95, 5.90, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0, o menos.

Tal como se utiliza en este documento, la expresión "pH neutro" significa un pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 7.4. La expresión "pH neutro pH" incluye valores de pH de aproximadamente 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, y 7.4.

Si cualquier característica (por ejemplo, valor de KD, valor de Kd, tiempo t½, valores de IC50, etc.) de un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo de la presente invención se determina a un pH ácido y se compara con la misma característica a un pH neutro (o viceversa), las mediciones comparativas deben considerarse como siendo determinadas a un pH ácido de 6.0 y un pH neutro de 7.4, y a una temperatura de 25°C, a menos que se especifique lo contrario.

Los valores de KD, los valores de kd y los tiempos t½, tal como aquí se expresan, se pueden determinar usando un biosensor basado en resonancia de plasmón superficial para caracterizar las interacciones antícuerpo-antígeno. (Ver, por ejemplo, el Ejemplo 3 del presente documento). Los valores de KD, los valores de kd y los tiempos t se pueden determinar a 25°C o 37°C.

Se ha descubierto que los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que exhiben unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas con respecto a los anticuerpos y fragmentos de unión a antigeno de los mismos que no muestran unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, como lo demuestran los ejemplos de trabajo provistos en este documento, ciertos anticuerpos de la invención que exhiben unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro, al ser administrados a sujetos animales, exhiben una eliminación más lenta de la circulación en comparación con los anticuerpos anti-PCSK9 que no presentan características de unión dependientes del pH. De ·acuerdo con este aspecto de la invención, se proveen anticuerpos con unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro que muestran una eliminación de la circulación al menos 2 veces más lenta en relación con los anticuerpos que no poseen unión reducida.a PCSK9 a pH ácido en comparación a pH neutro. La velocidad de eliminación se puede expresar en términos de la semivida del anticuerpo, siendo que una eliminación más lenta se corresponde con una semivida más larga. La presente invención también incluye anticuerpos anti-PCSK9 con unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro, donde los anticuerpos, cuando se administran en una dosis de aproximadamente 1 g/kg a un animal (por ejemplo, un ratón) que expresa PCSK9 humana, son detectables en el suero del animal en una concentración superior a aproximadamente 1.0 mg/ml durante al menos 30 días después de la administración.

También se ha descubierto que los anticuerpos y fragmentos de unión a antigeno de los mismos que exhiben una unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro tienen actividades reductoras del colesterol mejores y más prolongadas en relación con los anticuerpos y fragmentos de unión a antigeno de los mismos que no presentan unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente invención provee anticuerpos anti-PCSK9 que proveen·capacidades reductoras del LDL-C prolongadas en comparación con los anticuerpos y fragmentos de unión a antigeno de los mismos que no presentan unión reducida a PCSK9 a pH ácido. De acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, se proveen anticuerpos anti-PCSK9 que, al ser administrados a un sujeto en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg, reducen el LDL-G en suero al menos un 25% con respecto a la linea de base y mantienen esta reducción del nivel de LDL-C en suero durante al menos 25 dias. En ciertos casos, se proveen anticuerpos anti-PCSK9 que, al ser administrados a un sujeto en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg, reducen el nivel de LDL-C en suero al menos un 25% con respecto a la linea de base y mantienen esta reducción del nivel de LDL-C en suero durante, por ejemplo, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 o más dias. Tal como se utiliza en este documento, el término "linea de base" cuando se refiere al LDL-C (o a otro parámetro relevante) significa el nivel de LDL-C en el suero de ün sujeto, medido inmediatamente antes del momento en que se administra un anticuerpo anti-PCSK9 (u otra intervención terapéutica comparable) al sujeto.

Los presentes inventores han descubierto que, al menos en determinadas circunstancias terapéuticas, puede ser perjudicial que un anticuerpo exhiba un grado demasiado alto de sensibilidad al pH para la unión a PCSK9. Es decir, bajo ciertas circunstancias, puede ser deseable que el anticuerpo se una con menor afinidad a pH ácido en comparación con pH neutro, pero que, sin embargo, mantenga un cierto .grado de afinidad de unión por la PCSK9 a pH ácido. Por lo tanto, de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, se proveen anticuerpos anti-PCSK9 que exhiben características de unión dependientes del pH intermedias.

Tal como se utiliza en este documento, la expresión "características de unión dependientes del pH intermedias" significa que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una relación KD ácido/neutro mayor que 3.0 pero menor que 8.0. En ciertos ejemplos de modalidad, la relación KD ácido/neutro para un anticuerpo con "características de unión dependientes del pH intermedias" está comprendida entre 3.5 y 8.0, entre 4.0 y 8.0, entre 4.5 y 8.0, entre 5.0 y 8.0, entre 5.5 y 8.0; entre 6.0 y 8.0; entre 6.5 y 8.0; entre 3.0 y 7.5; entre 3.0 y 7.0; entre 3.0 y 6.5; entre 3.0 y 8.0; entre 3.5 y 7.5; entre 4.0 y 7.0; entre 4.5 y 7.0; entre 5.0 y 7.0; o entre 4.5 y 6.5. En ciertos ejemplos de modalidad, la relación KD ácido/neutro para un anticuerpo con "características de unión dependientes del pH intermedias" es de aproximadamente 3.0, aproximadamente 3.5, aproximadamente 4.0, aproximadamente 4.5, aproximadamente 5.0, aproximadamente 5.5, aproximadamente 6.0, aproximadamente 6.5, aproximadamente 7.0, aproximadamente 7.5, o aproximadamente 8.0. Los anticuerpos anti-PCSK9 con "características de unión dependientes del pH intermedias" también pueden tener una relación t ácido/neutro menor que aproximadamente 1.0 pero mayor que aproximadamente 0.15. Para el propósito de determinar si un anticuerpo exhibe "características de unión dependientes del pH intermedias" tal como se define en este documento, la relación KD ácido/neutro y/o la relación t ácido/neutro se pueden determinar por resonancia de plasmón superficial a 25°C. Como se indica en otra parte en este documento, la relación KD ácido/neutro y/o la relación t½ ácido/neutro se pueden determinar a un pH ácido de 6.0 y a un pH neutro de 7.4, o alternativamente, a un pH ácido de 5.75 y a un pH neutro de 7.2.

Tal como se utiliza en este documento, un anticuerpo anti-PCSK9 con "características de unión dependientes del pH intermedias" también incluye los anticuerpos y fragmentos de unión a antigeno que se unen a PCSK9 a pH ácido (por ejemplo, pH 6.0) y 25°C con una t½ menor que aproximadamente 35 minutos pero mayor que aproximadamente 10.5 minutos, medida por resonancia de plasmón superficial. Por ejemplo, la presente invención incluye los anticuerpos anti-PCSK9 con "características de unión dependientes del pH intermedias" que se unen a PCSK9 a pH ácido (por ejemplo, pH 6.0) y 25°C con una t menor que aproximadamente 20 minutos y mayor que aproximadamente 10 minutos; menor que aproximadamente 20 minutos y mayor que aproximadamente 11 minutos, menor que aproximadamente 20 minutos y mayor que aproximadamente 12 minutos, menor que aproximadamente 20 minutos y mayor que aproximadamente 13 minutos, menor que aproximadamente 20 minutos y mayor que aproximadamente 14 minutos, menor que aproximadamente 20 minutos y mayor que aproximadamente 15 minutos, menor que aproximadamente 30 minutos y mayor que aproximadamente 11 minutos, menor que aproximadamente 25 minutos y mayor que aproximadamente 12 minutos, menor que aproximadamente 18 minutos y mayor que aproximadamente 14 minutos, menor que aproximadamente 16 minutos y mayor que aproximadamente 13 minutos, o menor que aproximadamente 16 minutos y mayor que aproximadamente 14 minutos.

Un anticuerpo con "características de unión dependientes del pH intermedias" también incluye anticuerpos que se unen a PCSK9 a pH ácido (por ejemplo, pH 6.0) y a 25°C con una t de aproximadamente 10.5 minutos, aproximadamente 11.0 minutos, aproximadamente 11.5 minutos, aproximadamente 12.0 minutos, aproximadamente 12.5 minutos, aproximadamente 13.0 minutos, aproximadamente 13.5, aproximadamente 14.0 minutos, aproximadamente 14.5 minutos, aproximadamente 15.0 minutos, aproximadamente 15.5 minutos, aproximadamente 16.0 minutos, aproximadamente 16.5 minutos, aproximadamente 17.0 minutos, aproximadamente 17.5 minutos, aproximadamente 18.0 minutos, aproximadamente 18.5 minutos, aproximadamente 19.0 minutos, aproximadamente 19.5 minutos, aproximadamente 20.0 minutos, aproximadamente 20.5 minutos, aproximadamente 21.0 minutos, aproximadamente 22.0 minutos, aproximadamente 23.0 minutos, aproximadamente 24.0 minutos, aproximadamente 25.0 minutos, aproximadamente 26.0 minutos, aproximadamente 27.0 minutos, aproximadamente 28.0 minutos, aproximadamente 29.0 minutos, aproximadamente 30.0 minutos, aproximadamente 31.0 minutos, aproximadamente 32.0 minutos, aproximadamente 33.0 minutos, aproximadamente 34.0 minutos, o aproximadamente 35.0 minutos.

Anticuerpos anti-PCSK9 dependientes del pH con sustituciones con histidina La presente invención provee anticuerpos anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH, donde dichos anticuerpos poseen una o más diferencias de aminoácidos en comparación con un anticuerpo anti-PCSK9 parental. Tal como se utiliza en este documento, un anticuerpo anti-PCSK9 "parental" es un anticuerpo anti-PCSK9 que no presenta características de unión dependientes del pH o que solo presenta características de unión dependientes del pH intermedias (por ejemplo, donde la afinidad de unión del anticuerpo parental a PCSK9 a pH neutro es no más de 3 veces mayor que la afinidad de unión del anticuerpo a PCSK9 a pH ácido, o donde el anticuerpo parental se une a PCSK9 con una t a pH ácido que es no más de 3 veces más corta que la t para la unión del anticuerpo a PCSK9 a pH neutro). En algunos casos, un anticuerpo anti-PCSK9 "parenteral" puede ser un anticuerpo anti-PCSK9 que exhibe una unión mejorada a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PCSK9 "parental" es un anticuerpo que se obtiene mediante métodos convencionales de producción/aislamiento de anticuerpos (por ejemplo, inmunización de ratones, expresión en fagos, etc.) sin ningún tipo de modificaciones de aminoácidos introducidas artificialmente en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR).

De acuerdo con este aspecto de la invención, los anticuerpos anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH pueden poseer una o más variaciones de aminoácidos en relación con el anticuerpo anti-PCSK9 parenteral. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH puede contener una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más) sustituciones o inserciones de histidina, por ejemplo, en una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6) CDR de un anticuerpo anti-PCSK9 parental. Por lo tanto, de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, se provee un anticuerpo anti-PCSK9 que comprende secuencias de aminoácidos de CDR (por ejemplo, regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada y ligera) que son idénticas a las secuencias de aminoácidos de CDR de un anticuerpo anti-PCSK9 parenteral, a excepción de la sustitución de uno o más aminoácidos de una o más CDR del anticuerpo parental por un residuo de histidina. Los anticuerpos anti-PCSK9 con unión dependiente del pH pueden poseer, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó más sustituciones con histidina, ya sea dentro de una única CDR de un anticuerpo parental o distribuidas a lo largo de múltiples CDR (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o 6) de un anticuerpo anti-PCSK9 parental. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-PCSK9 con unión dependiente del pH que comprenden una o más sustituciones de histidina en HCDR1, una o más sustituciones de histidina en HCDR2, una o más sustituciones de histidina en HCDR3, una o más sustituciones de histidina en LCDR1, una o más sustituciones de histidina en LCDR2, y/o una o más sustituciones de histidina en LCDR3, de un anticuerpo anti-PCSK9 parental.

Los ejemplos de anticuerpos anti-PCSK9 "parentales" que pueden ser modificados, mutados, o de otro modo diseñados para que posean características de unión dependientes del pH (o características de unión dependientes del pH mejoradas) incluyen los anticuerpos anti-PCSK9 que comprenden cualquiera de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o dominios variables de cadena pesada y ligera (HCVR/LCVR) tal como se describe en la Patente Estadounidense No.8,062,640 (los cuales también se resumen en el Ejemplo 1, Tabla 1, de este documento). Un ejemplo específico de un anticuerpo anti-PCSK9 parental que solo exhibe características de unión dependientes del pH intermedias es el anticuerpo que en este documento (y en la Patente de Estadounidense No.8,062,640) se denomina "300N". El 300N comprende secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR que tienen las SEQ ID NO: 218/226, y secuencias de CDR de cadena pesada y ligera (HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) que tienen las SEQ ID NO: 220, 222, 224, 228, 230, 232, respectivamente. Por lo tanto, cualquier anticuerpo anti-PCSK9 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR de las SEC ID NO: 218/226, o las secuencias de aminoácidos HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 de las SEQ ID NO: 220, 222, 224, 228, 230, 232, es un anticuerpo "parental" adecuado que se puede modificar a nivel de las secuencias de aminoácidos (por ejemplo, con una o más sustituciones y/o inserciones de histidina en una o más CDR) para producir un anticuerpo anti-PCSK9 o un fragmento de unión a antigeno del mismo con características de unión dependientes del pH.

Alternativamente, cualquier anticuerpo anti-PCSK9 o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR, o las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 de cualquiera de los ejemplos de anticuerpos anti-PCSK9 que se presentan en la Patente Estadounidense No. 8,062,640 (los cuales también se resumen en el Ejemplo 1, Tabla 1, de este documento), es también un anticuerpo "parental" adecuado que se puede modificar a nivel de las secuencias de aminoácidos (por ejemplo, con una o más sustituciones y/o inserciones de histidina en una o más CDR) para producir un anticuerpo anti-PCSK9 o un fragmento de unión a antígeno del mismo con características de unión dependientes del pH.

En ciertas modalidades, la presente invención provee anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que presentan características de unión dependientes del pH, y que comprenden una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR), donde la HCVR comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 266, 282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382, 386, 402, 406, 410, 426, 430, 434, 450, 454, 458, 474, 478, 482, 498, 502, 506, 522, 526, 530, 546, 550, 554, 570, 574, 578, 594, 598, 602, 618, 622, 626, 642, 646, 650, 666, 670, 674, 690, 694, 698, 714, 718, 722, 738 y 742, o una variante de cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores en la que uno o más aminoácidos dentro de una o más CDR de cadena pesada está sustituido por un residuo de histidina, y donde el LCVR comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380, 384, 394, 404, 408, 418, 428, 432, 442, 452, 456, 466, 476, 480, 490, 500, 504, 514, 524, 528, 538, 548, 552, 562, 572, 576, 586, 596, 600, 610, 620, 624, 634, 644, 648, 658, 668, 672, 682, 692, 696, 706, 716, 720, 730, 740 y 744, o una variante de cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores en la que uno o más aminoácidos dentro de una o más CDR de cadena ligera está sustituido por un residuo de histidina.

En ciertas modalidades la presente invención provee anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de unión a antigeno de los mismos que presentan características de unión dependientes del pH, y que comprenden una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR), donde el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR comprende el par de secuencias de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 1 14/1 16, 1 18/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/560, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500, 502/504, 506/514, 522/524, 526/528, 530/538, 546/548, 550/552, 554/562, 570/572, 574/576, 578/586, 594/596, 598/600, 602/610, 618/620, 622/624, 626/634, 642/644, 646/648, 650/658, 666/668, 670/672, 674/682, 690/692, 694/696, 698/706, 714/716, 718/720, 722/730, 738/740 y 742/744, o una variante de cualquiera de los pares de secuencias de aminoácidos anteriores en los cuales uno o más aminoácidos dentro de una o más CDR de cadena pesada y/o CDR de cadena ligera es/son sustituidas con un residuo de histidina.

Por ejemplo, la presente invención provee variantes del ejemplo de anticuerpo anti-PCSK9 parenteral llamado "300N" (es decir, variantes de un anticuerpo que comprenden el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR de las SEC ID NO: 218/226). En particular, la presente invención provee un anticuerpo anti-PCSK9 o un fragmento de unión a antigeno del mismo que exhibe características de unión dependientes del pH, y que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR), donde la HCVR comprende la SEQ ID NO: 218 o una variante de la SEQ ID NO: 218 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N52H, Q53H, I100H, V101H, V104H, D106H, M107H, D108H, y Y112H, y donde la LCVR comprende la SEQ ID NO: 226 o una variante de la SEQ ID NO: 226 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en L29H, L30H, N33H, G34H, Y37H, L97H, T99H y P100H.

De acuerdo con un ejemplo de modalidad, la presente invención provee un anticuerpo anti-PCSK9 o un fragmento de unión a antígeno del mismo que exhibe características de unión dependientes del pH, y que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR), donde la HCVR comprende una variante de la SEQ ID NO: 218 que comprende una sustitución de aminoácidos D106H, y donde la LCVR comprende la SEQ ID NO: 226. La sustitución de aminoácidos D106H se encuentra dentro de la CDR3 de cadena pesada (HCDR3). La variante de HCDR3 que comprende la sustitución de aminoácidos D106H se representa mediante la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 788, tal como se ilustra en la Tabla 3 de este documento.

De acuerdo con otro ejemplo de modalidad, la presente invención provee un anticuerpo anti-PCSK9 o un fragmento de unión a antigeno del mismo que exhibe características de unión dependientes del pH, y que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR), donde la HCVR comprende la SEQ ID NO:218, y donde la LCVR comprende una variante de la SEQ ID NO:226 que comprende una sustitución de aminoácidos L30H. La sustitución de aminoácidos L30H se encuentra dentro de la CDR1 de cadena ligera (LCDR1). La variante de LCDR1 que comprende la sustitución de aminoácidos L30H se representa mediante la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 802, tal como se ilustra en la Tabla 3 de este documento De acuerdo con otro ejemplo de modalidad, la presente invención provee un anticuerpo anti-PCSK9 o un fragmento de unión a antígeno del mismo que exhibe características de unión dependientes del pH, y que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR), donde la HCVR comprende una variante de la SEQ ID NO: 218 que comprende una sustitución de aminoácidos D106H, y donde la LCVR comprende una vari-ante de la SEQ ID NO: 226 que comprende una sustitución de aminoácidos L30H.

En ciertas modalidades, la presente invención provee anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de unión a antigeno de los mismos que presentan características de unión dependientes del pH, y que comprenden 3 regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y 3 regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3), donde la HCDR1 comprende la SEQ ID NO: 220 (parental); donde la HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NO: 222 (parental), 772 (N52H) y 773 (Q53H); donde la HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NO: 224 (parental), 782 (I100H), 783 (V101H), 786 (V104H), 788 (D106H), 789 (M107H), 790 (D108H) y 794 (Y112H); donde la LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NO: 228 (parental), 801 (L29H), 802 (L30H), 804 (N33H), 805 (G34H) y 808 (Y37H); donde la LCDR2 comprende la SEQ ID NO: 230 (parental), y donde la LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NO: 232 (parental), 815 (L97H), 817 (T99H), y 818 (P100H).

De acuerdo con ciertas modalidades, la presente invención provee anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de unión a antigeno de los mismos que presentan características de unión dependientes del pH, y que comprenden 3 regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y 3 regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3), donde la HCDR1 comprende la SEQ ID NO: 220 (parental); donde la HCDR2 comprende la SEQ ID NO: 222 (parental); donde la HCDR3 comprende las SEQ ID NO: 224 (parental) o 788 (D106H ); donde la LCDRl comprende las SEQ ID NO: 228 (parental) o 802 (L30H); donde la LCDR2 comprende la SEQ ID NO: 230 (parental); y donde la LCDR3 comprende la SEQ ID NO: 232 (parental).

De acuerdo con ciertas modalidades, la presente invención provee anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de unión a antigeno de los mismos que presentan características de unión dependientes del pH, y que comprenden 3 regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y 3 regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDRl, LCDR2 y LCDR3), donde la HCDRl comprende la SEQ ID NO: 220 (parental); donde la HCDR2 comprende la SEQ ID NO: 222 (parental); donde la HCDR3 comprende la SEQ ID NO: 788 (D106H); donde la LCDRl comprende la SEQ ID NO: 228 (parental); donde la LCDR2 comprende la SEQ ID NO: 230 (parental); y donde la LCDR3 comprende la SEQ ID NO: 232 (parental).

De acuerdo con ciertas modalidades, la presente invención provee anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de unión a antigeno de los mismos que presentan características de unión dependientes del pH, y que comprenden 3 regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y 3 regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3), donde la HCDR1 comprende la SEQ ID NO: 220 (parental); donde la HCDR2 comprende la SEQ ID NO: 222 (parental); donde la HCDR3 comprende la SEQ ID NO: 224 (parental); donde la LCDRl comprende la SEQ ID NO: 802 (L30H); donde la LCDR2 comprende la SEQ ID NO: 230 (parental); y donde la LCDR3 comprende la SEQ ID NO: 232 (parental).

De acuerdo con ciertas modalidades, la presente invención provee anticuerpos anti-PCSK9 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que presentan características de unión dependientes del pH, y que comprenden 3 regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y 3 regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDRl, LCDR2 y LCDR3), donde la HCDR1 comprende la SEQ ID NO: 220 (parental); donde la HCDR2 comprende la SEQ ID NO: 222 (parental); donde la HCDR3 comprende la. SEQ ID NO: 788 (D106H); donde la LCDRl comprende la SEQ ID NO: 802 (L30H); donde la LCDR2 comprende la SEQ ID NO: 230 (parental); y donde la LCDR3 comprende la SEQ ID NO: 232 (parental).

Anticuerpos anti-PCSK9 que comprenden variantes de Fe De acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, se proveen anticuerpos anti-PCSK9 que comprenden un dominio Fe que comprende una o más mutaciones que mejoran o disminuyen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-PCSK9 que comprenden una mutación en una región CH2 o CH3 del dominio Fe, donde la o las mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fe por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH está comprendido entre aproximadamente 5.5 y aproximadamente 6.0). Los ejemplos no limitantes de tales modificaciones al Fe incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T), y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T), o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y), o una modificación en la posición 250 y/o 428, o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F), y 434. En una modalidad, la modificación comprende una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 2591 (por ejemplo, V259I), y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y una modificación 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T, y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F or 308P).

La presente invención incluye anticuerpos anti-PCSK9 que comprenden tanto: (1) una secuencia variante de CDR que comprende una o más sustituciones de histidina que reducen la afinidad de unión del anticuerpo a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro, y (2) una secuencia variante de dominio Fe que comprende una o más mutaciones que aumentan la afinidad del dominio Fe por FcRn a pH ácido en comparación con pH neutro. De acuerdo con este aspecto de la invención, se puede construir un anticuerpo anti-PCSK9 que comprenda cualquiera de las regiones variables de cadena pesada o ligera (HCVR/LCVR) o CDR sustituidas con histidina como se describe en este documento (ver, por ejemplo, la Tabla 3), y un dominio Fe que comprenda cualquiera de las mutaciones expuestas anteriormente que obligan al dominio Fe a unirse a la FcRn con mayor afinidad a pH ácido. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-PCSK9 que comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR, por ejemplo, del anticuerpo anti-PCSK9 variante con histidina aquí denominado "VH-D106H", y un dominio Fe que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: T250Q/M248L; M252Y/S254T/T256E; M428L/N434S; y H433K/N434F. La presente invención también incluye anticuerpos anti-PCSK9 que comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR de, por ejemplo, el anticuerpo anti-PCSK9 variante con histidina aquí denominado "VK-L30H", y un dominio Fe que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: T250Q/M248L; M252Y/S254T/T256E; M428L/N434S; y H433K/N434F Todas las posibles combinaciones de mutaciones de CDR por sustitución con histidina y mutaciones del dominio Fe descritas en este documento se contemplan dentro del alcance de la presente invención.

Características biológicas de los anticuerpos Además de tener características de unión dependientes del pH, los anticuerpos anti-PCSK9 de la presente invención también pueden poseer una o más propiedades biológicas beneficiosas adicionales. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-PCSK9 que bloquean efectivamente la interacción entre la PCSK9 y el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR). En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención bloquean la interacción entre la PCSK9 y el LDLR a pH neutro con una IC50 menor que aproximadamente 1 nM, por ejemplo, menor que aproximadamente 900 pM, menor que aproximadamente 800 pM, menor que aproximadamente 700 pM,· menor que aproximadamente 600 pM, menor que aproximadamente 500 pM, menor que aproximadamente 400 pM, menor que aproximadamente 300 pM, menor que aproximadamente 200 pM, o menor que aproximadamente 100 pM, por ejemplo, según se determina usando un ensayo ELISA de bloqueo tal como se describe en el Ejemplo 4 en este documento, o un formato de ensayo sustancialmente similar.

En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención pueden bloquear la interacción PCSK9/LDLR con mayor potencia a pH neutro que a pH ácido (por ejemplo, reflejando la menor unión de los anticuerpos a PCSK9 a pH ácido). La capacidad de un anticuerpo anti-PCSK9 de bloquear la interacción PCSK9/LDLR se puede expresar cuantitativamente en términos de un valor de IC50, por ejemplo, a pH neutro y ácido. (Ver, por ejemplo, el Ejemplo 4 del presente documento). El grado en que un anticuerpo bloquea la interacción PCSK9/LDLR a pH neutro en comparación con pH ácido se puede expresar en términos de la relación entre el valor de IC50 para el anticuerpo medida a pH ácido y el valor de IC50 para el anticuerpo medida a pH neutro. En este tipo de formatos de ensayo, una mayor relación entre la IC50 a pH ácido/pH neutro refleja una menor capacidad de bloquear la interacción PCSK9/LDLR a pH ácido en comparación con pH neutro. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos anti-PCSK9, donde los anticuerpos bloquean la interacción PCSK9/LDLR con una relación IC5o ácido/neutro mayor que aproximadamente 1, mayor que aproximadamente 5, mayor que aproximadamente 10, mayor que aproximadamente 20, mayor que aproximadamente 30, mayor que aproximadamente 32, mayor que aproximadamente 34, mayor que aproximadamente 36, mayor que aproximadamente 38, mayor que aproximadamente 40, mayor que aproximadamente 50, mayor que aproximadamente 60, mayor que aproximadamente 70, mayor que aproximadamente 80, mayor que aproximadamente 90, mayor que aproximadamente 100, mayor que aproximadamente 110, mayor que aproximadamente 120, mayor que aproximadamente 130, mayor que aproximadamente 140, mayor que aproximadamente 150, mayor que aproximadamente 160, mayor que aproximadamente 170, mayor que aproximadamente 180, mayor que aproximadamente 190, mayor que aproximadamente 200, mayor que aproximadamente 210, mayor que aproximadamente 220, mayor que aproximadamente 230, o más, medida usando el formato de ensayo del Ejemplo 4, o un ensayo sustancialmente similar. En ciertas modalidades, la relación entre la IC50 a pH ácido/pH neutro se determina a un pH ácido de 6.0 y a un pH neutro de 7.4, y a una temperatura de 25°C. En otras palabras, la relación entre la IC50 a pH ácido/pH neutro se determina a un pH ácido de 5.75 y a un pH neutro de 7.2, y a una temperatura de 25°C.

La presente invención también incluye anticuerpos anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH donde los anticuerpos bloquean la inhibición de la captación de LDL mediada por PCSK9. Se pueden utilizar ensayos de captación de LDL celular como el que se muestra en el Ejemplo 5 de este documento para determinar si un anticuerpo anti-PCSK9 es capaz de bloquear la inhibición de la captación de LDL mediada por PCSK9 y, en tal caso, en qué medida. De acuerdo con ciertas modalidades, se proveen anticuerpos anti-PCSK9 que tienen características de unión dependientes del pH, donde los anticuerpos son capaces de bloquear la inhibición de la captación de LDL mediada por PCSK9 con una IC50 menor que aproximadamente 40 nM, menor que aproximadamente 35 nM, menor que aproximadamente 30 nM, menor que aproximadamente 25 nM, menor que aproximadamente 20 nM, menor que aproximadamente 15 nM o menor que aproximadamente 10 nM, por ejemplo, determinada utilizando un ensayo de captación de LDL in vitro tal como se indica en el Ejemplo 5 de este documento, o una formato de ensayo sustancialmente similar.

Los anticuerpos de la presente invención pueden tener una o más de las características biológicas antes mencionadas, o cualquier combinación de las mismas. La lista de características biológicas de los anticuerpos de la invención precedente no pretende ser exhaustiva. Otras características biológicas de los anticuerpos de la presente invención serán evidentes para los expertos en la téenica a partir de una revisión de la presente divulgación, incluidos los Ejemplos de trabajo que aquí se presentan.

Métodos para generar anticuerpos con características de unión dependientes del pH La presente invención también provee métodos para generar anticuerpos con características de unión dependientes del pH. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden la exploración en busca de anticuerpos que presentan al menos características de unión dependientes del pH intermedias y luego someter dichos anticuerpos a mutagénesis adicional para mejorar la dependencia del pH del anticuerpo a su antígeno. La etapa de exploración puede comprender cualquier método o proceso que permita identificar un anticuerpo que tiene características de unión dependientes del pH intermedias dentro de una población de anticuerpos específicos para un antígeno particular. En ciertas modalidades, se obtiene una población inicial de anticuerpos mediante la inmunización de un animal ·o mediante la exploración de una biblioteca de expresión en fagos en busca de anticuerpos que se unan específicamente a un antígeno de particular interés. En ciertas modalidades, tales anticuerpos pueden ser anticuerpos totalmente humanos. En ciertas modalidades, la etapa de exploración comprende la medición de uno o más parámetros de unión (por ejemplo, KD o t½) de anticuerpos individuales dentro de una población inicial de anticuerpos tanto a pH ácido como a pH neutro. Los parámetros de unión de los anticuerpos se pueden medir utilizando, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, o cualquier otro método analítico que permita la evaluación cuantitativa o cualitativa de las características de unión de un anticuerpo a un antígeno particular. De acuerdo con ciertas modalidades de este aspecto de la invención, la etapa de exploración comprende la identificación de un anticuerpo que se une a un antígeno con una relación KD ácido/neutro mayor que aproximadamente 3.0 pero menor que aproximadamente 8.0. Alternativamente, la etapa de exploración puede comprender la identificación de un anticuerpo que se une a un antígeno con una relación t ácido/neutro menor que aproximadamente 1.0 pero mayor que aproximadamente 0.15. En aún otras modalidades, la etapa de exploración puede comprender la identificación de un anticuerpo que exhibe una t a pH ácido (por ejemplo, pH 6.0) menor que 40 minutos pero mayor que 20 minutos (por ejemplo, a 25°C). De acuerdo con ciertas modalidades de este aspecto de la invención, la relación entre la IC50 a pH ácido/pH neutro y/o la relación de t a pH ácido/pH neutro se determina a un pH ácido de 6.0 y a un pH neutro de 7.4, y a una temperatura de 25°C. De acuerdo con otras modalidades, la relación entre la IC50 a pH ácido/pH neutro y/o la relación de t a pH ácido/pH neutro se determina a un pH ácido de 5.75 y a un pH neutro de 7.2, y a una temperatura de 25°C.

Una vez que se identifica un anticuerpo con características de unión dependientes del pH intermedias, el anticuerpo así identificado se somete a mutagénesis para mejorar la unión dependiente del pH del anticuerpo al antígeno. "Unión dependiente del pH mejorada" significa que la versión mutada del anticuerpo exhibe una mayor relación KD ácido/neutro, o una menor relación t½ ácido/neutro, que la versión original "parental" (es decir, con dependencia intermedia del pH) del anticuerpo antes de la mutagénesis*. En ciertas modalidades, "unión dependiente del pH mejorada" significa que la t del anticuerpo que se une a su antígeno a pH ácido (por ejemplo, pH 6.0) es menor que la t½ del anticuerpo antes de la mutagénesis. En ciertas modalidades, "unión dependiente del pH mejorada" significa que la t½ del anticuerpo que se une a su antígeno a pH ácido (por ejemplo, pH 6.0) es menos de aproximadamente 16 minutos, menos de aproximadamente 10 minutos, menos de aproximadamente 5 minutos, menos de aproximadamente 2 minutos o menos de aproximadamente 1.5 minutos (por ejemplo, a 25°C).

De acuerdo con este aspecto de la invención, la etapa de mutagénesis puede comprender una eliminación, sustitución o adición de un aminoácido dentro de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo. De acuerdo con ciertas modalidades, la mutagénesis se lleva a cabo dentro de uno o más dominios variables del anticuerpo, por ejemplo, dentro de una o más CDR. Por ejemplo, la mutagénesis puede comprender la sustitución de un aminoácido dentro de una o más CDR del anticuerpo por otro aminoácido. En ciertas modalidades, la mutagénesis comprende la sustitución de uno o más aminoácidos en al menos una CDR del anticuerpo por una histidina.

En los ejemplos de trabajo que se presentan en este documento, se generaron anticuerpos anti-PCSK9 (por ejemplo, anticuerpos anti-PCSK9 totalmente humanos) con características de unión dependientes del pH utilizando una metodología de exploración/mutagénesis como se describió anteriormente; sin embargo, los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención se puede utilizar para generar anticuerpos con características de unión dependientes del pH que se unan a cualquier antígeno para el que las características dependientes del pH serían útiles o deseables. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención se pueden utilizar para generar anticuerpos con semividas en suero prolongadas cuando se administran a un sujeto o paciente.

Mutagénesis de "doble histidina" (His-His) para producir anticuerpos dependientes del pH Sobre la base de ciertos experimentos presentados en este documento, se descubrió de forma inesperada que introducir una sustitución de histidina en una CDR de un anticuerpo en un residuo adyacente a (por ejemplo, inmediatamente en dirección 5' o en dirección 3' del mismo) un residuo de histidina presente de forma natural, para producir asi una secuencia de aminoácidos His-His, puede convertir un anticuerpo con características de unión dependientes del pH intermedias en un anticuerpo con características de unión dependientes del pH más pronunciadas. Tal como se utiliza en este documento, "características de unión dependientes del pH más pronunciadas" significa que el anticuerpo, después de la introducción de una sustitución de histidina, presenta una o más de las siguientes: (a) una mayor relación KD ácido/neutro; (b) una mayor relación k ácido/neutro, y/o (c) una menor relación t ácido/neutro, que el anticuerpo antes de la introducción de la sustitución de histidina. Por ejemplo, el anticuerpo que en este documento se denomina 300N tiene características de unión dependientes del pH intermedias y contiene una sola histidina presente de forma natural en la quinta posición de aminoácido de LCDR1 (ver SEQ ID NO: 228). Al introducir una sustitución de histidina en la cuarta posición de aminoácido de LCDR1 (obteniéndose el anticuerpo "VK-L30H" que comprende una LCDR1 con la SEC ID NO: 802), se encontró que el anticuerpo resultante posee características de unión dependientes del pH mucho más pronunciadas que el 300N, tal como se muestra en los Ejemplos 3A y 3B de este documento. Esta estrategia de mutación "doble-His" puede ser una metodología de aplicación general para producir anticuerpos con características de unión dependientes del pH pronunciadas. Por lo tanto, la presente invención incluye métodos para mejorar las propiedades dependientes del pH de un anticuerpo que comprende la selección de un anticuerpo con características de unión dependientes del pH intermedias, y la introducción de una sustitución de histidina en una o más CDR del anticuerpo en una posición de aminoácido adyacente a un residuo de histidina existente, creando así un anticuerpo con características de unión dependientes del pH más pronunciadas (por ejemplo, con una relación KD ácido/neutro mayor que la del anticuerpo parental antes de la introducción de la « sustitución de histidina). Esta metodología también se puede aplicar a anticuerpos que normalmente carecen de residuos de histidina en una CDR, por ejemplo, mediante la introducción de dos o más sustituciones de histidina en posiciones de aminoácido adyacentes dentro de una o más CDR.

Mapeo de epitopos y teenologías relacionadas La presente invención incluye anticuerpos anti-PCSK9 que interactúan con uno o más aminoácidos que se encuentran dentro del pro-dominio de la PCSK9 (aminoácidos 1 a 152 de la SEQ ID NO: 755). La presente invención también incluye anticuerpos anti-PCSK9 que interactúan con uno o más aminoácidos que se encuentran dentro del dominio catalítico de la PCSK9 (aminoácidos 153 a 425 de la SEQ ID NO: 755). La presente invención también incluye anticuerpos anti-PCSK9 que interactúan con uno o más aminoácidos que se encuentran dentro del dominio C-terminal de la PCSK9 (aminoácidos 426 a 692 de la SEQ ID NO: 755). En ciertos casos, los anticuerpos anti-PCSK9 de la presente invención interactúan con los aminoácidos que se encuentran dentro de dos dominios adyacentes de la PCSK9. El epítopo al que se unen los anticuerpos puede consistir en una única secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos ubicados dentro de uno o más dominios de la PCSK9. Alternativamente, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos (o secuencias de aminoácidos) no contiguos ubicados dentro de uno o más dominios de la PCSK9.

Se pueden utilizar diferentes técnicas conocidas por los expertos en la técnica para determinar si un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Estas téenicas incluyen, por ejemplo, un ensayo de bloqueo cruzado de rutina, tal como el que se describe en Antibodies, Harlow y Lañe (Coid Spring Harbor Press, Coid Spring Harb., NY), análisis mutacional de escaneo de alanina, análisis de blot de péptidos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol.248:443- 63), y análisis de escisión de péptidos. Además, se pueden emplear métodos tales como la escisión de epítopos, la extracción de epítopos y la modificación química de los antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Otro método que se puede utilizar para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el cual interactúa un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio de hidrógeno/deuterio implica marcar con deuterio la proteína deseada, seguido por la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo proteína/anticuerpo se transfiere al agua para permitir que se produzca el intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los residuos excepto en los residuos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión de la proteasa y a una espectrometría de masas, revelando así los residuos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Ver, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen y Smith (2001) Anal . Chem. 73:256A-265A.

La presente invención también incluye .anticuerpos anti-PCSK9 que se unen al mismo epitopo que cualquiera de los ejemplos de anticuerpos específicos descritos en este documento. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-PCSK9 que se unen al mismo epitopo que cualquiera de los anticuerpos variantes por sustitución con histidina listados en la Tabla 3 de este documento (por ejemplo, VH-G26H, VH-F27H, VH-T28H, VH-F29H, VH-S30H, VH- S31H, VH-W33H, VH-I51H, VH-N52H, VH-Q53H, VH-D54H, VH-G55H, VH-S56H, VH-E57H, VH-K58H, VH-A97, VH-R98H, VH-D99H, VH- I100H, VH-V101H, VH-L102H, VH-M103H, VH-V104H, VH-Y105H, VH- D106H, VH-M107H, VH-D108H, VH-Y109H, VH-Y110H, VH-Y111H, VH- Y112H, VH-G113H, VH-M114H, VH-D115H, VH-V116H, VK-Q27H, VK- S28H, VK-L29H, VK-L30H, VK-S32H, VK-N33H, VK-G34H, VK-N35H, VK-N36H, VK-Y37H, VK-L55H, VK-G56H, VK-S57H, VK-M94H, VK- Q95H, VK-T96H, VK-L97H, VK-Q98H, VK-T99H, VK-P100H, VK-L101H, VK-T102H). Del mismo modo, la presente invención también incluye anticuerpos anti-PCSK9 que compiten por la unión a PCSK9 con cualquiera de los anticuerpos variantes por sustitución con histidina listados en la Tabla 3 de este documento (por ejemplo, VH-G26H, VH-F27H, VH-T28H, VH-F29H, VH-S30H, VH-S31H, VH- 33H, VH-I51H, VH-N52H, VH-Q53H, VH- D54H, VH-G55H, VH-S56H, VH-E57H, VH-K58H, VH-A97, VH-R98H, VH-D99H, VH-I100H, VH-V101H, VH-L102H, VH-M103H, VH-V104H, VH-Y105H, VH-D106H, VH-M107H, VH-D108H, VH-Y109H, VH-YllOH, VH-Y111H, VH-Y112H, VH-G113H, VH-M114H, VH-D115H, VH-V116H, VK-Q27H, VK-S28H, VK-L29H, VK-L30H, VK-S32H, VK-N33H, VK-G34H, VK-N35H, VK-N36H, VK-Y37H, VK-L55H, VK-G56H, VK-S57H, VK-M94H, VK-Q95H, VK-T96H, VK-L97H, VK-Q98H, VK-T99H, VK-P100H, VK-L101H, VK-T102H).

Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epitopo que un anticuerpo anti-PCSK9 de referencia, o si compite por la unión al mismo, utilizando métodos de rutina conocidos en la téenica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epitopo que un anticuerpo anti-PCSK9 de la invención de referencia, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteina PCSK9. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la molécula de PCSK9. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a PCSK9 luego de su unión hasta la saturación con el anticuerpo anti-PCSK9 de referencia, se puede concluir que el anticuerpo de ensayo se une a un epitopo diferente que el anticuerpo anti-PCSK9 de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a la molécula de PCSK9 luego de su unión hasta la saturación con el anticuerpo anti-PCSK9 de referencia, entonces puede que el anticuerpo de ensayo se una al mismo epítopo que el epitopo al cual se une el anticuerpo anti-PCSK9 de la invención de referencia. Luego se pueden realizar experimentos de rutina adicionales (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la falta de unión del anticuerpo de ensayo observada realmente se debe a la unión al mismo epitopo que el anticuerpo de referencia o si la falta de unión observada se debe a un bloqueo estérico (u otro fenómeno). Se pueden realizar experimentos de este tipo utilizando ELISA, RIA, Biacore, citometria de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la téenica. De acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, dos anticuerpos se unen al mismo epitopo (o a epitopos superpuestos) si, por ejemplo, un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100 veces un anticuerpo inhibe la unión del otro por lo menos un 50%, pero preferentemente un 75%, un 90% o incluso un 99%, medida en un ensayo de unión competitiva (ver, por ejemplo, Junghans et al., Cáncer Res.1990:50:1495-1502). Alternativamente, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epitopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antigeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión de la otra. Se considera que dos anticuerpos tienen "epitopos superpuestos" si solamente un subconjunto de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión de la otra.

Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-PCSK9 de referencia, la metodología de unión anteriormente descrita se lleva a cabo en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una molécula de PCSK9 en condiciones saturantes y luego se evalúa la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de PCSK9. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula de PCSK9 en condiciones saturantes y luego se evalúa la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de PCSK9. Si en ambas orientaciones solo el primer anticuerpo (saturante) es capaz de unirse a la molécula de PCSK9, se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a PCSK9. Como podrán apreciar los expertos en la téenica, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede no necesariamente unirse al mismo epitopo que el anticuerpo de referencia, pero puede bloquear esféricamente la unión del anticuerpo de referencia al unir un epitopo superpuesto o adyacente.

Preparación de anticuerpos humanos Los métodos para generar anticuerpos monoclonales, entre ellos anticuerpos monoclonales totalmente humanos, son conocidos en la téenica. Cualquiera de los métodos conocidos se puede utilizar en el contexto de la presente invención para producir anticuerpos que se unen específicamente a PCSK9 humana. Luego tales anticuerpos se pueden utilizar como anticuerpos párenteles a partir de los cuales se pueden derivar anticuerpos variantes con sustitución por histidina (por ejemplo, anticuerpos variantes con sustitución por histidina que presentan propiedades de unión dependiente del pH).

Usando la tecnología de VELOCIMUNE™ o cualquier otro método conocido para la generación de anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de elevada afinidad por la PCSK9 que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Los anticuerpos se caracterizan y seleccionan según sus características deseables, incluyendo su afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se sustituyen por una región constante humana deseada, por ejemplo, IgGl o IgG4 silvestre o modificada, para generar anticuerpos totalmente humanos. Si bien la región constante seleccionada .puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y de especificidad residen en la región variable.

Bioequivalentes Además de las sustituciones de histidina específicamente ejemplificadas en este documento, la presente invención también abarca anticuerpos que tienen secuencias de aminoácidos que varían respecto de las de los anticuerpos descritos pero que retienen la capacidad de unirse a PCSK9 humana con propiedades de unión dependientes del pH. Tales anticuerpos y fragmentos de anticuerpo variantes comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia descrita, pero exhiben una actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Del mismo modo, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-PCSK9 de la presente invención abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia descrita, pero que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-PCSK9 que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-PCSK9 de la invención.

Dos proteínas, o anticuerpos, de unión a antígeno se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya tasa y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran en la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, ya sea en dosis única o en dosis múltiples. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en cuanto a su absorción aunque no en cuanto a su tasa de absorción; tales anticuerpos pueden ser considerados bioequivalentes debido a que dichas diferencias en la tasa de absorción son intencionales y se reflejan en el etiquetado, no son esenciales para lograr concentraciones eficaces del fármaco en el cuerpo, por ejemplo, con un uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el fármaco particular estudiado.

En una modalidad, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en cuanto a su seguridad, pureza, y potencia.

En una modalidad, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiar una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, entre ellos un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o una eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin tales cambios.

En una modalidad, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por uno o más mecanismos de acción comunes para la condición o condiciones de uso, en la medida en que se conocen tales mecanismos.

La bioequivalencia se puede demostrar mediante métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) una prueba in vivo en seres humanos u otros mamíferos, donde se mida la concentración del anticuerpo o de sus metabolitos en la sangre, el plasma, el suero u otro fluido biológico en función del tiempo; (b ) un ensayo in vitro que se haya correlacionado y que sea razonablemente predictivo de·los datos de biodisponibilidad in vivo en humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos donde se mida el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su objetivo) en función de tiempo, y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establezca la seguridad, eficacia, biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.

Las variantes bioequivalentes de los anticuerpos anti-PCSK9 de la invención se pueden construir, por ejemplo, realizando diferentes sustituciones de residuos o secuencias o eliminando residuos o secuencias terminales o internos que no son necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos de cisteína que no son esenciales para la actividad biológica se pueden eliminar o reemplazar por otros aminoácidos para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos durante la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpos anti-PCSK9 que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de glicosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan la glicosilación.

Selectividad de especies y reactividad cruzada entre diferentes especies De acuerdo con ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos anti-PCSK9 se unen a PCSK9 humana pero no a PCSK9 de otras especies. La presente invención también incluye anticuerpos anti-PCSK9 que se unen a PCSK9 humana y a PCSK9 de una o más especies no humanas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PCSK9 de la invención se pueden unir a PCSK9 humana y se pueden unir o no, según sea el caso, a uno o más entre PCSK9 de ratón, rata, cobayo, hámster, gerbillo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, macaco cangrejero (Macaca fascicularis), tití, mono Rhesus o chimpancé.

Anticuerpos multiespecificos Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecificos o multiespecif icos. Los anticuerpos multiespecificos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Ver, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos anti-PCSK9 de la presente invención pueden estar enlazados a, o co-expresarse con, otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteina. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede estar funcionalmente enlazado (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos biespecífíeos en los que un brazo·de una inmunoglobulina es específico para la PCSK9 humana o un fragmento de la misma, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para una segunda diana terapéutica o está conjugado con un grupo terapéutico.

Un ejemplo de formato de anticuerpos biespecíficos que se puede utilizar en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio CH3 de una inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio CH3 de Ig, donde el primer y el segundo dominio CH3 de Ig difieren uno del otro en al menos un aminoácido, y donde al menos una diferencia de aminoácidos reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la Proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácidos. En una modalidad, el primer dominio CH3 de Ig se une la Proteína A y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o elimina la unión a la Proteina A tal como una modificación H95R (según la numeración de exones del IMGT; H435R según la numeración de la UE). El segundo CH3 también puede comprender una modificacón Y96F (según el IMGT; Y436F según la UE). Otras modificaciones que se pueden encontrar dentro del segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, y V82I (según el IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, y V422I según la UE) en el caso de anticuerpos IgGl; N44S, K52N, y V82I (según el IMGT; N384S, K392N, y V422I según la UE) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, y V82I (según el IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, y V422I según la UE) en el caso de anticuerpos IgG4. Las variaciones del formato de anticuerpos biespecificos descrito anteriormente están comprendidas dentro del alcance de la presente invención.

Formulación y administración terapéutica La presente invención provee composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-PCSK9 de la presente invención o fragmentos de unión a antigeno de los mismos. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con vehículos adecuados, excipientes, y otros agentes que proveen una mejor transferencia, suministro, tolerancia, y similares. En el vademécum conocido por todos los químicos farmacéuticos se puede encontrar una multitud de formulaciones apropiadas: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicas o aniónicas) (tales como LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos, y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Ver también Powell et al. "Compehdium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

La dosis de anticuerpo administrado a un paciente puede variar dependiendo de la edad y del tamaño del paciente, de la enfermedad objetivo, de las condiciones, de la vía de administración, y similares. La dosis preferida típicamente se calcula de acuerdo con el peso corporal o el área de superficie corporal. Las dosis y programas de administración de anticuerpos anti-PCSK9 eficaces se pueden determinar empíricamente, por ejemplo, se puede monitorear el progreso del paciente mediante una evaluación periódica, y la se puede ajustar en consecuencia. Por otra parte, se pueden proyectar las dosis de una especie a otra utilizando métodos bien conocidos en la téenica (por ejemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmace ut . Res. 8:1351).

Se conocen diferentes sistemas de entrega que se pueden usar para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, microparticulas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (ver, por ejemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición se puede administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, la mucosa oral, la mucosa rectal e intestinal, etc.) y se puede administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

Una composición farmacéutica de la presente invención se puede suministrar por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa estándares Además, con respecto a la administración subcutánea, para suministrar una composición farmacéutica de la presente invención se puede utilizar fácilmente un dispositivo de administración tipo bolígrafo. Tal dispositivo de administración tipo bolígrafo puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de administración tipo bolígrafo reutilizable generalmente utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que toda la composición farmacéutica contenida en el cartucho ha sido administrada y el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede ser desechar fácilmente y sustituir por un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo de administración tipo bolígrafo puede entonces ser reutilizado. En un dispositivo de administración tipo bolígrafo desechable, no hay ningún cartucho reemplazable. Más bien, el dispositivo de administración tipo bolígrafo desechable viene previamente llenado con la composición farmacéutica en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de composición farmacéutica, todo el dispositivo se desecha.

Existen numerosos dispositivos de administración tipo bolígrafo y autoinyectores reutilizables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los bolígrafos AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc. , Woodstock, Reino Unido), DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), HUMALOG MIX 75/25™, HUMALOG™, HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por solo nombrar algunos. Los ejemplos de dispositivos de administración tipo bolígrafo desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los bolígrafos SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), y KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICKTM (Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLETTM (Haselmeiér, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dcy, L.P.), y el HUMIRATM (Abbott Labs, Abbott Park IL), por solo nombrar algunos.

En ciertas situaciones, la composición farmacéutica se puede administrar en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:201). En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos; ver, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres, Boca Ratón, Florida. En aún otra modalidad, se puede colocar un sistema de liberación controlada en proximidad de la diana de la composición, con lo cual se requiere apenas una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, 1984, Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para administración intravenosa, subcutánea, intracutánea e intramuscular, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables se pueden preparar por métodos conocidos públicamente. Por ejemplo, las preparaciones inyectables se pueden preparar, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descritos anteriormente en un medio acuoso estéril o en un medio oleoso convencionalmente utilizado para preparar inyecciones. Como medio acuoso para las inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que se pueden utilizar en combinación con un agente solubilizante adecuado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensoactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 moles) de aceite de ricino hidrogenado], etc. Como medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que se pueden utilizar en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se llena preferentemente en una ampolla apropiada.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificación en dosis unitarias adecuadas en las que quepa una dosis de los ingredientes activos. Tales formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, pildoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo antes mencionado que contienen es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; se prefiere especialmente que las inyecciones contengan de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg del anticuerpo antes mencionado y las demás formas de dosificación de aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg.

Usos terapéuticos de los anticuerpos La presente invención provee anticuerpos anti-PCSK9 y fragmentos de unión a antigeno de los mismos, incluyendo anticuerpos anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH, para usarse en medicina. La presente invención incluye métodos que comprenden administrar a un sujeto que la necesite una composición terapéutica que comprende un anticuerpo anti-PCSK9 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PCSK9 que tiene características de unión dependientes del pH). La composición terapéutica puede comprender cualquiera de los anticuerpos anti-PCSK9, o fragmentos de los mismos, como se describen en este documento. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "un sujeto que la necesite" significa un animal humano o no humano que presenta uno o más síntomas o signos de la hipercolesterolemia o que ha sido diagnosticado con hipercolesterolemia, o que de otro modo se beneficiaría de una reducción del colesterol en suero total, LDL, triglicéridos o VLDL, o que se beneficiaría de un aumento del HDL. La presente invención también incluye métodos para reducir los niveles de lipoproteína (a) [Lp (a)] mediante la administración de un anticuerpo anti-PCSK9 de la invención (por ejemplo, un anticuerpo anti-PCSK9 que tiene características de unión dependientes del pH).

En algunos casos, el paciente que se trata con una formulación terapéutica de la presente invención es por lo demás sano, excepto porque presenta elevados niveles de colesterol, triglicéridos, lípidos o lipoproteínas. Por ejemplo, el paciente puede no presentar ningún otro factor de riesgo de enfermedades o trastornos cardiovasculares, trombóticos o de otro tipo en el momento del tratamiento. Sin embargo, en otros casos el paciente se selecciona sobre la base de haber sido diagnosticado con, o estar en riesgo de desarrollar, una enfermedad o trastorno que es causado por, se correlaciona con, o es accesorio a niveles elevados de colesterol en suero, lípidos, lipoproteínas o triglicéridos. Por ejemplo, en el momento o antes de la administración de la composición farmacéutica de la presente invención, el paciente puede haber sido diagnosticado con o identificado como en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno cardiovascular, tal como, por ejemplo, enfermedad arterial coronaria, infarto agudo de miocardio, aterosclerosis carotidea asintomática, accidente cerebrovascular, enfermedad oclusiva de la arteria periférica, etc. En algunos casos, la enfermedad o trastorno cardiovascular es hipercolesterolemia. Por ejemplo, un paciente puede ser seleccionado para el tratamiento con una composición farmacéutica de la presente invención si el paciente ha sido diagnosticado con o identificado como como en riesgo de desarrollar un trastorno de hipercolesterolemia, tal como, por ejemplo, hipercolesterolemia familiar heterocigota (HeFH), hipercolesterolemia familiar homocigótica (HFH), asi como incidencias de hipercolesterolemia diferentes de la hipercolesterolemia familiar (nonFH).

En otros casos, en el momento o antes de la administración de la composición farmacéutica de la presente invención, el paciente puede haber sido diagnosticado con o identificado como en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno trombótico oclusivo, tal como, por ejemplo, embolia pulmonar, oclusión de la vena central de la retina, etc. En ciertas modalidades, el paciente se selecciona sobre la base de haber sido diagnosticado con o estar en riesgo de desarrollar una combinación de dos o más de las enfermedades o trastornos mencionados anteriormente. Por ejemplo, en el momento o antes de la administración de la composición farmacéutica de la presente invención, el paciente puede haber sido diagnosticado con o identificado como en riesgo de desarrollar enfermedad de la arteria coronaria y embolia pulmonar. Otras combinaciones de diagnósticos (por ejemplo, aterosclerosis y oclusión de la vena central de la retina, HeFH y accidente cerebrovascular, etc.) también se incluyen en la definición de las poblaciones de pacientes que se pueden tratar con una composición farmacéutica de la presente invención.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también son útiles para el tratamiento de la hipercolesterolemia o dislipidemia causada por o relacionada con una enfermedad o trastorno subyacente seleccionado del grupo que consiste en síndrome metabólico, diabetes mellitus, hipotiroidismo, síndrome nefrótico, insuficiencia renal, síndrome de Cushing, cirrosis biliar, enfermedades de almacenamiento de glucógeno, hepatoma, colestasis, deficiencia de la hormona del crecimiento. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también son útiles para el tratamiento de la hipercolesterolemia o dislipidemia causada por o relacionada con un régimen terapéutico anterior, tal como una terapia de estrógeno, terapia de progestina, beta bloqueadores, o diuréticos.

En aún otros casos, el paciente que se va a tratar con una composición farmacéutica de la presente invención se selecciona sobre la base de uno o más factores seleccionados del grupo que consiste en la edad (por ejemplo, mayor de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 o 80 años), la raza, el género (masculino o femenino), los hábitos de ejercicio (por ejemplo, persona que realiza ejercicio en forma regular, no deportista), otras condiciones médicas preexistentes (por ejemplo, diabetes tipo II, hipertensión arterial, etc.), y el estado de medicación actual (por ejemplo, persona que actualmente toma estatinas [por ejemplo, cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, etc.], beta bloqueadores, niacina, etc.). La presente invención incluye métodos que comprenden administrar una composición de la presente invención (por ejemplo, una composición que comprende in anticuerpo anti-PCSK9 que tiene características de unión dependientes del pH) a un paciente que es intolerante a estatinas, alérgico a estatinas o que responde de manera incompleta o inadecuada a terapia con estatinas convencional. Los potenciales pacientes se pueden seleccionar sobre la base de uno o más de estos factores (por ejemplo, a través de un cuestionario, una evaluación de diagnóstico, etc.) antes de ser tratados con los métodos de la presente invención.

La presente invención también incluye métodos para aumentar la excreción de colesterol transintestinal (TICE) en un sujeto mediante la administración de un inhibidor de PCSK9 al sujeto. Por ejemplo, la presente invención provee métodos para aumentar la TICE en un sujeto mediante la administración al sujeto de un anticuerpo anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH. De acuerdo con ciertas modalidades, la presente invención incluye métodos que comprenden la identificación de un sujeto que se beneficiaría de una TICE mejorada, o la identificación de un sujeto que presenta una TICE deficiente, y la administración de un inhibidor de PCSK9 al sujeto.

Se sabe que las estatinas regulan al alza los niveles de PCSK9 en los pacientes (ver, por ejemplo, Dubuc et al., Aug. 2004, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24:1454-1459). Los pacientes tratados con estatinas que reciben agentes terapéuticos anti-PCSK9 convencionales muestran una eliminación de PCSK9 del suero más rápida que los pacientes que no están en tratamiento con estatinas. Sin pretender imponer ninguna teoría, se propone que los elevados niveles de PCSK9 en los pacientes que toman estatinas pueden conducir a una eliminación más rápida de los anticuerpos anti-PCSK9 a través del proceso de eliminación mediado por la diana. Por lo tanto, los pacientes tratados con estatinas pueden requerir dosis más altas y/o dosis más frecuentes de los agentes terapéuticos anti-PCSK9 convencionales (por ejemplo, anticuerpos anti-PCSK9) para lograr una reducción óptima del colesterol. Tal como se utiliza en este documento, el término "agentes terapéuticos anti-PCSK9 convencionales" significa cualquier molécula de unión a PCSK9 que no exhibe características de unión dependientes del pH, es decir, una molécula que no exhibe unión reducida a PCSK9 a pH ácido en comparación con pH neutro. Los presentes inventores han concebido que se puede evitar o eludir el fenómeno de eliminación inducida por estatinas y mediada por la diana mediante el uso de anticuerpos anti-PCSK9 que se recielan eficazmente dentro del cuerpo de los pacientes que están en una terapia de estatinas. En consecuencia, la presente invención incluye métodos para superar/evitar la eliminación inducida por estatinas y mediada por la diana de agentes de unión anti-PCSK9 mediante la administración a un sujeto que está recibiendo un régimen terapéutico con estatinas una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-PCSK9 que tiene características de unión dependientes del pH. La presente invención también incluye métodos para reducir la cantidad de agente anti-PCSK9 que se debe administrar a un paciente que toma estatinas para lograr efectos reductores del colesterol adecuados, y/o métodos para reducir la frecuencia con la que un agente anti-PCSK9 se administra a un paciente que toma estatinas, donde dichos métodos comprenden modificar el régimen de dosificación terapéutico de un paciente reemplazando un agente anti-PCSK9 convencional que se administra inicialmente a un paciente por un anticuerpo anti-PCSK9 que exhibe características de unión dependientes del pH. Cualquiera de los anticuerpos anti-PCSK9 dependientes del pH descritos en este documento se pueden utilizar en el contexto de los métodos precedentes.

Terapias de combinación La presente invención también provee métodos terapéuticos que comprenden la administración de una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los ejemplos de anticuerpos anti-PCSK9 descritos en este documento en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los ejemplos de agentes terapéuticos adicionales que se pueden administrar en combinación con un anticuerpo anti-PCSK9 de la presente invención incluyen, por ejemplo, estatinas (atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina, etc.), niacina, ácido fíbrico, secuestradores de ácido biliar (por ejemplo, colestiramina), colesevelam, colestipol, ezetimibe, antihipertensivos, antidiabéticos, antagonistas de proteina 3 de tipo angiopoyetina (ANGPTL3) o proteina 4 de tipo angiopoyetina (ANGPTL4), (por ejemplo, un anticuerpo anti-ANGPTL3 [por ejemplo, un anticuerpo anti-ANGPTL3 como se describe en W02008/073300 o en US 7,935,796] o un anticuerpo anti-ANGPTL4 [por ejemplo, un anticuerpo anti-ANGPTL4 como se describe en W02006/0074228 o en W02007/109307 o en WO 2011/079257]), asi como combinaciones de cualquiera de los agentes terapéuticos adicionales antes mencionados.

El o los agentes terapéuticamente activos adicionales se puede administrar inmediatamente antes, en forma simultánea o poco después de la administración de un anticuerpo anti-PCSK9 de la presente invención; (para los propósitos de la presente divulgación, tales regímenes de administración consideran la administración de un anticuerpo anti-PCSK9 "en combinación con" un agente terapéuticamente activo adicional). La presente invención incluye composiciones farmacéuticas en las que un anticuerpo anti-PCSK9 de la presente invención se formula conjuntamente con uno o más de los componentes terapéuticamente activos adicionales tal como se describe en otra parte en este documento.

La presente invención también provee métodos terapéuticos que comprenden la administración de una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los ejemplos de anticuerpos anti-PCSK9 descritos en este documento a un paciente que está recibiendo un régimen terapéutico para el tratamiento de la hipercolesterolemia o una condición relacionada, en el momento, o inmediatamente antes, de la administración de una composición farmacéutica de la invención. Por ejemplo, un paciente que ha sido previamente diagnosticado con hipercolesterolemia puede haber sido recetado y estar tomando un régimen terapéutico estable de otro medicamento antes de y/o en forma concurrente con la administración de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-PCSK9 de la presente invención. El régimen terapéutico previo o concurrente puede comprender, por ejemplo,. (1) un agente que induce un agotamiento celular de la síntesis de colesterol mediante la inhibición de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG CoA) reductasa, tales como una estatina (por ejemplo, cerivastatina, atorvastatina, simvastatina, pitavastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, etc.); (2) un agente que inhibe la captación de colesterol y/o la reabsorción de ácido biliar; (3) un agente que aumenta el catabolismo de lipoproteínas (por ejemplo, niacina), y/o (4) activadores del factor de transcripción de LXR que juega un papel en la eliminación de colesterol, tal como 22-hidroxicolesterol. En ciertas modalidades, el paciente, antes de o simultáneamente con la administración de un anticuerpo anti-PCSK9 está recibiendo una combinación fija de agentes terapéuticos tales como ezetimiba más simvastatina; una estatina con una resina biliar (por ejemplo, colestiramina, colestipol, colesevelam); niacina más una estatina (por ejemplo, niacina con lovastatina), o con otros agentes reductores de lípidos tales como los ésteres etílicos de ácidos grasos omega-3 (por ejemplo, Omacor).

Dosificación La cantidad de anticuerpo anti-PCSK9 que se administra a un sujeto de acuerdo con los métodos y regímenes de administración de la presente invención es generalmente una cantidad terapéuticamente eficaz. Tal como se utiliza en este documento, la frase "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una dosis de anticuerpo anti-PCSK9 que da por resultado una reducción detectable del LDL-C en suero, o una dosis de anticuerpo anti-PCSK9 que inhibe, evita, disminuye o retrasa la progresión de la hipercolesterolemia y/o enfermedades relacionadas. En el caso de un anticuerpo anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH, una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser de aproximadamente 0.05 mg a aproximadamente 600 mg, por ejemplo, aproximadamente 0.05 mg, aproximadamente 0.1 mg, aproximadamente 1.0 mg, aproximadamente 1.5 mg, aproximadamente 2.0 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 90 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 110 mg, aproximadamente 120 mg, aproximadamente 130 mg, aproximadamente 140 mg, aproximadamente 150 mg, aproximadamente 160 mg, aproximadamente 170 mg, aproximadamente 180 mg, aproximadamente 190 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 210 mg, aproximadamente 220 mg, aproximadamente 230 mg, aproximadamente 240 mg, aproximadamente 250 mg, aproximadamente 260 mg, aproximadamente 270 mg , aproximadamente 280 mg, aproximadamente 290 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 310 mg, aproximadamente 320 mg, aproximadamente 330 mg, aproximadamente 340 mg, aproximadamente 350 mg, aproximadamente 360 mg aproximadamente 370 mg aproximadamente 380 mg, aproximadamente 390 mg aproximadamente 400 mg, aproximadamente 410 mg aproximadamente 420 mg, aproximadamente 430 mg aproximadamente 440 mg, aproximadamente 450 mg aproximadamente 460 mg, aproximadamente 470 mg aproximadamente 480 mg, aproximadamente 490 mg aproximadamente 500 mg, aproximadamente 510 mg aproximadamente 520 mg, aproximadamente 530 mg, aproximadamente 540 mg, aproximadamente 550 mg, aproximadamente 560 mg, aproximadamente 570 mg, aproximadamente 580 mg, aproximadamente 590 mg, o aproximadamente 600 mg, del anticuerpo anti-PCSK9 La cantidad de anticuerpo anti-PCSK9 contenida dentro de las dosis individuales se puede expresar en términos de miligramos de anticuerpo por kilogramo de peso corporal del paciente (es decir, mg/kg). Por ejemplo, el anticuerpo anti-PCSK9 se puede administrar a un paciente en una dosis de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del paciente.

Regímenes de administración De acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, se pueden administrar a un sujeto múltiples dosis de un anticuerpo anti-PCSK9 de la invención (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprenda un anticuerpo anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH) durante un período de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden la administración secuencial a un sujeto de múltiples dosis de un anticuerpo anti-PCSK9. Tal como se utiliza en este documento, "administración secuencial" significa que cada dosis de anticuerpo anti-PCSK9 se administra al sujeto en un punto de tiempo diferente, por ejemplo, en diferentes dias separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, dias, semanas o meses). La presente invención incluye métodos que comprenden la administración secuencial al paciente de una dosis única inicial de un anticuerpo anti-PCSK9, seguida de una o más dosis secundarias del anticuerpo anti-PCSK9 y, opcionalmente, seguida de una o más dosis terciarias del anticuerpo anti-PCSK9.

Los términos "dosis inicial", "dosis "secundarias" y "dosis terciarias" se refieren a la secuencia temporal de la administración del anticuerpo anti-PCSK9. Por lo tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al comienzo del régimen de tratamiento (también conocida como la "dosis de referencia"), las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis inicial, secundarias y terciarias y pueden contener todas la misma cantidad de anticuerpo anti-PCSK9, pero por lo general diferirán unas de otras en términos de la frecuencia de administración. Sin embargo, en ciertas modalidades la cantidad de anticuerpo anti-PCSK9 contenida en las dosis inicial, secundarias y/o terciarias pueden diferir unas de otras (por ejemplo, ajustadas hacia arriba o hacia abajo según corresponda) durante el curso del tratamiento. En ciertas modalidades, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) dosis se administran al comienzo del régimen de tratamiento como "dosis de carga", seguidas de dosis posteriores que se administran con menor frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento"). Las dosis de carga se pueden administrar con una frecuencia de, por ejemplo, una vez a la semana, una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez al mes, una vez cada 2 meses, una vez cada 3 meses, etc.

En un ejemplo de modalidad de la presente invención, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 60 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60 o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. Tal como se utiliza en este documento, la frase "la dosis inmediatamente anterior" significa, en una secuencia de múltiples administraciones, la dosis de anticuerpo anti-PCSK9 que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia sin ninguna dosis intermedia.

Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención pueden comprender administrar a un paciente cualquier número de dosis secundarias y/o terciarias de un anticuerpo anti-PCSK9. Por ejemplo, en ciertas modalidades, solo se administra una única dosis secundaria al paciente. En otras modalidades, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias al paciente. Del mismo modo, en ciertas modalidades, solo se administra una única dosis terciaria al paciente. En otras modalidades, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias al paciente. En algunos casos, se pueden administrar dosis secundarias y/o terciarias con una frecuencia determinada por muchos años o durante toda la vida de un sujeto.

En las modalidades que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria se puede administrar con la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria se puede administrar al paciente de 1 a 60 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. Del mismo modo, en las modalidades que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria se puede administrar con la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria se puede administrar al paciente de 1 a 60 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. Alternativamente, la frecuencia con la que las dosis secundarias y/o terciarias se administran a un paciente puede variar en el curso del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ser ajustada por un médico durante el curso del tratamiento dependiendo de las necesidades del paciente individual luego de un examen clínico.

Ejemplos Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proveer a los expertos en la téenica una exposición y descripción completas de cómo realizar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran .su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, las cantidades, temperaturas, etc.), no obstante lo cual deben tenerse en cuenta algunas desviaciones y errores experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura se expresa en grados Celsius, y la presión es la presión atmosférica o está próxima a la misma.

Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra la PCSK9 humana Se generaron anticuerpos anti-PCSK9 humana como se describe en la Patente Estadounidense No.8,062,640. La Tabla 1 muestra los identificadores de secuencia para los pares de secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de aminoácidos de las CDR, de anticuerpos anti-PCSK9 seleccionados y sus correspondientes designaciones de anticuerpos. Las secuencias de ácido nucleico están representadas por identificadores de secuencia en números nones correspondientes a los identificadores de secuencia en números pares en la Tabla 1. Por ejemplo, SEQ ID N0:1 es la secuencia de.nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:2; SEQ ID NO:3 es la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:4, etc.

Tabla 1: Identificadores de secuencias de aminoácidos para anticuerpos anti-PCSK9 seleccionados Cualquiera de los anticuerpos anti-PCSK9 que figuran en la Tabla 1, que se refieren a las secuencias de aminoácidos de sus respectivos dominios variables de cadena pesada y ligera y/o CDR, se puede utilizar como un anticuerpo parental a partir del cual se pueden derivar anticuerpos variantes con sustitución de histidina dependientes del pH, como se ilustra en los siguientes ejemplos de trabajo no limitativos.

Ejemplo 2. Construcción de mutantes con sustitución de histidina de un anticuerpo anti-PCSK9 humana Se sabe que el anticuerpo anti-PCSK9 denominado 300N tiene propiedades de unión dependientes del pH intermedias, con disminución de la afinidad de unión por la PCSK9 a pH ácido, y una farmacocinética mejorada (ver Patente Estadounidense No. 8,062,640). En un intento de generar variantes del 300N con incluso mayores propiedades de unión dependientes del pH (es decir, unión reducida a pH bajo en comparación con pH neutro) y mejor eficacia in vivo (por ejemplo, mayor semivida del anticuerpo en suero, actividad reductora del colesterol prolongada, etc. ) , se construyó una serie de anticuerpos variantes. En particular, se construyeron versiones mutantes de 300N en las que cada aminoácido dentro de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del 300N se mutó individualmente a histidina. Como se muestra en la Tabla 1, la región variable de cadena pesada (HCVR) del anticuerpo 300N parental comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 218, y la región variable de cadena ligera (LCVR) del anticuerpo 300N parental comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 226. Las secuencias de las CDR del anticuerpo 300N parental se muestran en la Tabla 2. Las mutaciones con sustitución His se muestran en la Tabla 3 junto con las designaciones correspondientes para los anticuerpos variantes con sustitución de histidina derivados del 300N (por ejemplo, VH-G26H, VH-F27H, etc.).

Tabla 2: Secuencias de las CDR de mAb 300N Tabla 3: Secuencias de las CDR modificadas de las variantes con sustitución de histidina del mAb 300N Para cada anticuerpo variante listado en la Tabla 3, todas las secuencias de CDR son idénticas a las del anticuerpo 300N parental (que comprende secuencias de CDR de las SEC ID NO: 220, 222, 224, 228, 230, 232) excepto por la secuencia de CDR mutada.como se indica en la Tabla. Por ejemplo, el anticuerpo variante con sustitución de histidina denominado "VH-D106H" comprende las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 220, 222, 788, 228, 230, 232 (donde la secuencia de la HCDR3 de SEQ ID NO:224 se reemplaza por la secuencia de la HCDR3 variante de SEQ ID NO:788). Del mismo modo, el anticuerpo variante con sustitución de histidina denominado "VK-L30H" comprende las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 220, 222, 224, 802, 230, 232 (donde la secuencia de la LCDR1 de SEQ ID NO:228 se reemplaza por la secuencia de la LCDR1 variante de SEQ ID NO:802).

Ejemplo 3A. Propiedades de unión de los anticuerpos anti-PCSK9 variantes a pH neutro y ácido Los anticuerpos variantes con sustitución de histidina del Ejemplo 2 se ensayaron para determinar su unión a PCSK9 humana dependiente del pH utilizando un ensayo con biosensor de resonancia de plasmón superficial (Biacore T200) realizado a 25°C, tanto a pH 5.75 como a pH 7.2. El propósito de este experimento fue determinar cuál de los anticuerpos variantes con sustitución de histidina presentaban unión reducida a PCSK9 humana a pH ácido comparada con pH neutro.

Se derivatizó un chip sensor Biacore CM4 con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Fc humano para capturar anticuerpos humanos. Los anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina se capturaron sobre la superficie del sensor de Fe anti-humano del medio de cultivo luego de su expresión transitoria en células de ovario de hámster chino (CHO). Se inyectaron diferentes concentraciones comprendidas entre 3.125 nM a 500 nM de PCSK9 humana (SEC ID NO: 755) con una etiqueta myc-myc-hexahistidina C-terminal (hPCSK9-mmH) sobre la superficie del anticuerpo monoclonal anti-PCSK9 capturado con una tasa de flujo de 50 ml/min. Se controló la asociación anticuerpo-antigeno durante 4 o 5 minutos y luego se controló la disociación del antigeno del anticuerpo monoclonal capturado durante 5 u 8 minutos. Se determinaron las constantes de asociación (ka) y disociación (kd) cinética procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa para ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constante de equilibrio de disociación de la unión (KD) y las semividas disociativas (ti/2) de la unión se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinética de la siguiente manera: KD (M) = kd/ka; y tl/2 (min) = (In2/(60*kd).

La Tabla 4 muestra los valores de KD y ti2 para cada uno de los anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina que se unieron a la PCSK9 humana a pH 7.2 (neutro) y pH 5.75 (ácido), así como las relaciones pH 5.75/pH 7.2 para estos valores respectivos. En la última fina de la tabla también se muestran los valores para el anticuerpo 300N parenteral. Los valores de KD se expresan en molares (M) y los valores de t½ se expresan en minutos (min).

Tabla 4: Valores de KD y t para los anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina Como se muestra en la Tabla 4 (todas las mediciones corresponden a 25°C), el anticuerpo parenteral (300N) mostró una moderada afinidad de unión (KD ~0.9 - 1.0 nM) tanto a pH 7.2 como a pH 5.75, y tl/2 se redujo más de tres veces a pH 5.75 en comparación con pH 5.75; relación pH 5.75/pH7.2 = 0.26).

Varias de las sustituciones de una.sola histidina dieron lugar a una unión sustancialmente reducida tanto a pH 5.75 como a pH 7.2, mientras que otras sustituciones tuvieron un efecto mínimo sobre la unión dependiente del pH en comparación con la secuencia original. Sin embargo, es importante destacar que varias de las mutaciones de una sola histidina dieron lugar a anticuerpos que exhibían velocidades de disociación sustancialmente más rápidas a un pH de 5.75 en comparación con un pH de 7.2 con respecto al anticuerpo parental (11/2 a pH 5.75 al menos 5 veces menor que ti/2 a pH 7.2). Tales anticuerpos con características de unión dependientes del pH incluyen anticuerpos con sustituciones de CDR de cadena pesada: VH-W33H, VH-Q53H, VH-I100H, VH-V104H, VH-D106H, VH-M107H y VH-Y112H; y anticuerpos con sustituciones de CDR de cadena ligera: VK-L29H, VK-L30H, VK-N33H, VK-L97H, VK-T99H, y VK-P100H. Los anticuerpos variantes con sustitución de histidina VH-D106H y VK-L30H exhibieron una unión dependiente del pH especialmente pronunciada y se seleccionaron para su estudio adicional.

Para investigar más a fondo las características de unión dependientes del pH de los anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina VH-D106H y VK-L30H, así como de una variante con doble sustitución de histidina (VH-D106H/VK-L30H), los anticuerpos se purificaron y se ensayaron para determinar su unión a PCSK9 humana a pH neutro (pH 7.4) (Tabla 6) y a pH ácido (pH 6.0) (Tabla 7) usando condiciones similares a las descritas anteriormente. Las relaciones entre las propiedades de unión a pH ácido y pH neutro se muestran en la Tabla 8. En estos experimentos también se incluyeron varios anticuerpos de control/comparadores. La Tabla 5 muestra un resumen de los anticuerpos ensayados. Todas las mediciones se realizaron a 25°C.

Tabla 5: Anticuerpos ensayados para determinar sus propiedades de unión dependientes del pH Tabla 6: Propiedades de unión de anticuerpos purificados seleccionados a PCSK9 humana a pH 7.4 (pH neutro) Tabla 7: Propiedades de unión de anticuerpos purificados seleccionados a PCSK9 humana a pH 6.-0 (pH ácido) *= la constante se fijó en 1.00E-05 s-1 debido a la duración de la recolección de los datos; por lo tanto, en la Tabla 7 los valores de KD y ti2 se informan como valores limites superiores e inferiores, respectivamente.

Tabla 8: Relación entre las propiedades de unión de anticuerpos purificados seleccionados a PCSK9 humana a pH 6.0 / pH 7.4 (relación ácido/neutro) ?— para la medición a pH 6.0 la constante se fijó en 1.00E-05 s-1 debido a la duración de la recolección de los datos; por lo tanto, en la Tabla 8 las relaciones de KD y ti/2 se informan como valores límites superiores e inferiores, respectivamente.

Un valor elevado de las relaciones kd y KD ácido/neutro (por ejemplo, mayor que aproximadamente 12) y un valor bajo de la relación t neutro/ácido (por ejemplo, menor que aproximadamente 0.20) indican unión dependiente del pH. De acuerdo con estos criterios, el anticuerpo variante con sustitución de histidina VK-L30H y el doble mutante VH-D106H/VK-L30H exhibieron las características de unión dependientes del pH más importantes entre todos los anticuerpos ensayados. En particular, cada uno de estos anticuerpos exhibió relaciones kd ácido/neutro mayores que aproximadamente 28, relaciones KD ácido/neutro mayores que aproximadamente 14, y relaciones t ácido/neutro menores que 0.05.

Ejemplo 3B. Propiedades de unión de los anticuerpos variantes anti-PCSK9 con histidina a PCSK9 humana: Asociación a pH neutro y disociación a un rango de pH neutros y ácidos Con el fin de evaluar aún más las características de unión dependientes del pH de los anticuerpos anti-PCSK9 de la invención, se realizaron experimentos de unión en los que se observó la fase de asociación anticuerpo/antígeno a pH neutro y la fase de disociación de anticuerpo/antigeno para un rango de pH neutros o ácidos a 37°C.

Se derivatizó un chip sensor Biacore CM4 con un anticuerpo policlonal anti-Fc humano Fab'2 para capturar anticuerpos humanos. Se capturaron anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina purificados seleccionados (VH-D106H, VK-L30H y VH-D016H/VK-L30H) junto con anticuerpos parentales (316P y 300N) y anticuerpos de referencia (Comparadores 1-7, ver Tabla 5) sobre la superficie del sensor anti-Fc humano. Diferentes concentraciones comprendidas entre 3.125 nM y 50 nM de PCSK9 humana con una etiqueta myc-myc-hexahistidina C-terminal (hPCSK9-mH) se inyectaron sobre la superficie del anticuerpo monoclonal anti-PCSK9 capturado con una tasa de flujo de 30 ml/min. Se controló la asociación anticuerpo-antigeno a pH 7.4 durante 6 minutos y luego se controló la disociación del antigeno del anticuerpo monoclonal capturado durante 5 minutos ya sea a pH 7.4, 7.2, 6.0, o 5.75. Se determinaron las constantes de velocidad de disociación (kd) procesando y ajustando los datos usando el programa para ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las semividas disociativas (ti/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad de disociación de la siguiente manera: ti/2 (min) = (ln2/kd)/60. Las Figuras 3A a 3G muestran gráficamente sensogramas que representan las características de asociación/disociación de los anticuerpos bajo las diversas condiciones de pH.

Los resultados de estos experimentos confirman que los anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina VH-D106H, VK-L30H y VH-D016H/VK-L30H exhiben una disociación mucho más rápida del antigeno PCSK9 cuando el pH es bajo (indicada en las Figuras 3A-3G como una rápida disminución del nivel de respuesta en el segundo punto 360 en los experimentos a pH 6.0 y 5.75) en comparación con los anticuerpos parentales.

Ejemplo 4. Actividad bloqueadora de los receptores de los anticuerpos anti-PCSK9 variantes Primero se ensayaron anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina seleccionados para determinar su capacidad para bloquear la unión de PCSK9 humana recombinante a LDLR humano (hLDLR) a pH neutro usando un inmunoensayo basado en ELISA.

En pocas palabras, se usó el dominio A tipo factor de crecimiento epidérmico de la LDLR humana (aminoácidos 313-355 de la SEQ ID NO:758) expresado con una etiqueta Fe humana C-terminal ("hLDLR EGFA-hFc") a 2 mg/ml en PBS para recubrir una placa de microtitulación de 96 pocilios durante la noche a 4°C seguida de bloqueo con una solución de 0.5% (p/v) de BSA en PBS. Esta placa se utilizó para medir la PCSK9 libre en soluciones de hPCSK9-mmH previamente equilibradas con concentraciones variables de anticuerpos anti-hPCSK9 (parentales o variantes con sustitución de histidina) a pH neutro (pH 7.2) como se muestra en la Tabla 9A.

Como experimento inicial para determinar las propiedades bloqueantes de los anticuerpos a pH neutro (pH 7.2), se premezcló hPCSK9-mmH (ver el Ejemplo 3) a una concentración final fija de 500 pM con diluciones seriadas de anticuerpos comprendidas entre 0 y aproximadamente 100 nM seguida de 1 hora de incubación a temperatura ambiente para permitir que la unión alcanzara el equilibrio. Luego las soluciones de muestra equilibradas se transfirieron a la placa recubierta con LDLR EGFA-hFc preparada como se describió anteriormente. Después de 1 hora de incubación, la placa recubierta de receptor se lavó, la hPCSK9-mmH unida a la placa se detectó utilizando un anticuerpo secundario anti-myc conjugado con HRP (Novus, # NB600-341), y se desarrollaron señales colorimétricas utilizando un sustrato de TMB HRP (BD Biosciences, # 555214). Se registró la absorbancia a 450 nm para reflejar las concentraciones de hPCSK9-mmh libre en las soluciones de PCSK9-anticuerpo previamente equilibradas disponibles para unirse al receptor LDLR recubriendo la placa. Los valores de IC5o, definida como la concentración de anticuerpo con la que se obtiene una reducción del 50% de la señal de unión de hPCSK9-mmH de la muestra sin anticuerpo, se determinaron a partir de los datos usando software de Prism (GraphPad) y se muestran en la Tabla 9A. (Se realizaron dos experimentos independientes; no todos los anticuerpos fueron ensayados en ambos experimentos, tal como se indica por medio de guiones [— ] en la Tabla 9A).

Tabla 9A: ELISA con bloqueo de PCSK9 a pH neutro El anticuerpo parental 300N mostró un valor de IC50 de aproximadamente 0.20 nM. En general los anticuerpos variantes con sustitución de histidina mostraron una leve reducción de la potencia en comparación con el 300N, pero todos mantuvieron valores de IC50 < 1.0 nM. La variante VK-L30H mantuvo una potencia bloqueadora cercana a la del anticuerpo parental (valores de IC50 de 0.17 y 0.20 nM en dos mediciones independientes).

Luego se ensayaron un subconjunto de anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina de la invención y anticuerpos de referencia para determinar su capacidad para bloquear la unión de PCSK9 humana recombinante a LDLR humano (hLDLR) en condiciones de pH neutro y bajo usando un inmunoensayo basado en ELISA.

En pocas palabras, se usó hLDLR EGFA-hFc a 2 mg/mL en PBS para recubrir una placa de microtitulación de 96 pocilios durante la noche a 4°C seguida de bloqueo con una solución al 0.5% (p/v) de BSA en PBS. Esta placa se utilizó para medir la hPCSK9-mmH libre en soluciones de hPCSK9-mmH previamente equilibradas con concentraciones variables de anticuerpos anti-hPCSK9 a pH neutro (pH 7.2) o bajo (pH 5.75).

Como experimento para el bloqueo, se premezcló hPCSK9-mmH (ver el Ejemplo 3) a una concentración final fija de 500 pM con diluciones seriadas de anticuerpos comprendidas entre 0 y aproximadamente 200 nM seguida de 1 hora de incubación a temperatura ambiente para permitir que la unión alcanzara el equilibrio. Un conjunto de estas mezclas se preunió en reguladores de pH a pH 7.2 y un segundo conjunto se pre-unió en reguladores de p’H a pH 5.75. Luego las soluciones de muestra equilibradas se transfirieron a la placa recubierta con LDLR EGFA-hFc. Después de 1 hora de incubación, la placa recubierta de receptor se lavó, la hPCSK9-mmH unida a la placa se detectó utilizando un anticuerpo secundario anti-myc conjugado con HRP (Novus, # NB600-341), y se desarrollaron señales colorimétricas utilizando un sustrato de TMB HRP (BD Biosciences, # 555214). Se registró la absorbancia a 450 nm para reflejar las concentraciones de hPCSK9-mmh libre y se gráfico en función de las concentraciones del anticuerpo. Los valores de IC50, definida como la concentración de anticuerpo con la que se obtiene una reducción del 50% de la señal de hPCSK9-mmH libre sin la presencia de anticuerpo, se determinaron a partir de los datos usando software de Prism (GraphPad). La linea de base se estableció como la absorbancia de la solución tampón a 450 nm en la ausencia de hPCSK9-mH. La Tabla 9B muestra los valores de IC50 para los dos ensayos junto con una relación calculada que refleja la dependencia del pH de la capacidad bloqueadora.

Tabla 9B: ELISA con bloqueo de PCSK9 a pH neutro y pH ácido Los datos de IC5o informados como <1.25E-10 tienen valores calculados por debajo del limite inferior teórico del ensayo suponiendo que un anticuerpo puede unir dos sitios de unión a ligando. Para generar las relaciones se utilizaron los valores reales entre paréntesis.

No concluyente = no se pudo calcular la IC50 debido a la forma irregular de las curvas de distribución normal de la relación dosis-respuesta al anticuerpo.

Como se muestra en la Tabla 9B, la mayoría de los anticuerpos de referencia mostraron ninguna o muy poca reducción de la actividad bloqueadora a pH ácido en comparación con pH neutro (ver, por ejemplo, los Comparadores 2, 5, 6, 7, 8 y 9, todos ellos con reducciones menores que 3 veces en la actividad de bloqueo a pH ácido en comparación con pH neutro). Los Comparadores 3 y 4 mostraron reducciones moderadas de la capacidad bloqueadora, con relaciones IC50 ácido/neutro de 35.9 y 19.2, respectivamente. Por el contrario, dos ejemplos de anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina de la invención, VK-L30H y VH-D106H/VK-L30H, mostraron una drástica reducción de la actividad bloqueadora de PCSK9/LDLR a pH ácido, con relaciones IC50 ácido/neutro mayores que aproximadamente 200.

Los resultados de este experimento confirman que las características de unión dependientes de los anticuerpos anti-PCSK9 variantes con histidina de la invención reflejan el grado en que estos anticuerpos son capaces de bloquear la interacción entre la PCSK9 y el LDLR a pH neutro y ácido.

Ejemplo 5. Capacidad de los anticuerpos anti-PCSK9 variantes para bloquear la inhibición mediada por PCSK9 de la captación de LDL in vitro La capacidad de anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina seleccionados de aumentar la captación de LDL in vitro se determinó utilizando una línea celular de carcinoma hepatocelular humano (HepG2, ATCC # HB-8065). Se sembraron células HepG2 en placas de 96 pocilios a razón de 2 x 104 células/pocillo en suero deficiente en lipoproteinas al 5% (LPDS, Millipore, # LP4) en DMEM y se incubaron a 37°C, 5% de CO2, durante la noche para formar monocapas de HepG2. Se añadieron 2 nM de PCSK9 humana recombinante (SEQ ID NO:755, expresada con una etiqueta myc-myc-hexahistidina C-terminal y una mutación D374Y; "hPCSK9- D374Y-mmH") o 50 nM de PCSK9 recombinante de macaco cangrejero (Macaca fascicularis) (expresada con una etiqueta myc-myc-hexahistidina C-terminal; MfPCSK9-mmH; SEQ ID NO:761) junto con concentraciones de anticuerpo variables (de 50 nM a 0.098 nM en diluciones seriadas) en medio LPDS. Luego de incubar durante una noche, se añadió BODIPY-LPL (Invitrogen, L3483) en medio LPDS las células hasta obtener una concentración final de 0.01 mg/mL. La captación de la BODIPY-LPL se detectó con un lector de placas para fluorescencia (Molecular Devices Flexstation III) luego de 6 horas de incubación a 37°C usando filtros de excitación/emisión configurados para 390nm/520n . La Tabla 10 muestra los valores de IC50 para cada anticuerpo anti-PCSK9 ensayado (IC50 = concentración de anticuerpo para la cual la captación de LDL aumenta un 50%).

Tabla 10: Inhibición de la actividad de la PCSK9 por los anticuerpos anti-PCSK9 in vitro Como se muestra en la Tabla 10, todos los anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina sometidos a este ensayo bloquearon la inhibición de la captación de LDL mediada por hPCSK9-D374Y-mmH (es decir, promovieron la captación de LDL) con valores de IC50 menores que 5 nM, y bloquearon la inhibición de la captación de LDL mediada por MfPCSK9-mmH (es decir, promovieron la captación de LDL) con valores de IC50 menores que 22 nM.

La capacidad de un subconjunto de los anticuerpos anti-PCSK9 de la invención y de los anticuerpos de referencia (ver Tabla 5) de aumentar la captación de LDL in vitro también se determinó usando el mismo protocolo de ensayo en linea celular de carcinoma hepatocelular humano descrito anteriormente, pero con PCSK9 humana silvestre recombinante (SEC ID NO: 755, expresada con una etiqueta myc-myc-hexahistidina C-terminal; "hPCSK9-mmh")· Se añadieron 100 nM constantes de hPCSK9-mmH junto con concentraciones de anticuerpo variables (de 2000 nM a 0.034 nM en diluciones seriadas) en medio LPDS. La Tabla 11A muestra los valores de IC50 para cada anticuerpo anti-PCSK9 ensayado (IC50 concentración de anticuerpo para la cual la captación de LDL aumenta un 50%).

Tabla 11A: Inhibición de la actividad de la PCSK9 por los anticuerpos anti-PCSK9 in vitro Como se muestra en la Tabla 11A, diez de los anticuerpos anti-PCSK9 ensayados inhibieron la hPCSK9-mh con valores de IC50 comprendidos entre 26 nM y 37 nM. El Comparador 1 solo inhibió parcialmente la hPCSK9-mmh con un valor de IC50 de 18 nM.

También se determinó la capacidad de un anticuerpo anti-PCSK9 de la invención y de un subconjunto de anticuerpos de referencia (ver Tabla 5) para aumentar la captación de LDL in vitro usando el mismo protocolo de ensayo en linea celular de carcinoma hepatocelular humano descrito anteriormente usando PCSK9 humana silvestre recombinante (SEQ ID NO:755, expresada con una etiqueta myc-myc-hexahistidina C-terminal; "hPCSK9-m h"), PCSK9 humana (SEQ ID NO:755, expresada con una etiqueta myc-myc-hexahistidina C-terminal y una mutación D374Y; "hPCSK9-D374Y-mmH"), o PCSK9 recombinante de macaco cangrejero (Macaca fascicularis (expresada con una etiqueta myc-myc-hexahistidina C-terminal; MfPCSK9-mH; SEQ ID NO:761). Se añadieron 50 nM constantes de hPCSK9-mmH, 2 nM constantes de hPCSK9-D374Y-m H, o 50 nM constantes de MfPCSK9-mmH junto con concentraciones variables de anticuerpo (concentraciones de anticuerpo desde 500 nM con diluciones seriadas 1:2 para el bloqueo de hPCSK9-mmH o MfPCSK9-mmH; concentraciones de anticuerpo desde 50nM con diluciones seriadas 1:2 para el bloqueo de hPCSK9-D374Y-mmH) en medio LPDS. La Tabla 11B muestra los valores de IC50.para cada anticuerpo anti-PCSK9 ensayado (IC50 = concentración de anticuerpo para la cual la captación de LDL aumenta un 50%).

Tabla 11B: Inhibición de la actividad de la PCSK9 por los anticuerpos anti-PCSK9 in vitro Como se muestra en la Tabla 11B, el VK-L30H bloqueó la hPCSK9-mmH con un valor de IC50 de 9 nM, mientras que el 316(vi) y el 300N(v2) bloquearon la hPCSK9-mmH con valores de IC50 de 7.8 nM y 10.3 nM, respectivamente. Los anticuerpos de referencia sometidos a este ensayo bloquearon la hPCSK9-mmH con valores de IC50 comprendidos entre 8.9 nM y 39.3nM. El VK- L30H bloqueó la hPCSK9-D374Y-mmH con un valor de IC50 de 3.3 nM, mientras que tanto 316(vi) como el 300N(v2) bloquearon la hPCSK9-mmH con un valor de IC50 de 2 nM. El Comparador 7 bloqueó la hPCSK9-D374Y-mmH con un valor de IC50 de 0.97 nM, mientras que el Comparador 9 bloqueó parcialmente la hPCSK9- D374Y-mmH con un valor de IC50 de 10.6 nM y el Comparador 8 no demostró ningún bloqueo medible de la hPCSK9-D374Y-mmH. El VK-L30H bloqueó la MfPCSK9-mmH con un valor de IC50 de 26.4 nM, mientras que el 316(vi) y el 300N(v2) bloquearon la MfPCSK9-mmH con valores de IC50 de 10.3 nM y 15.7 nM, respectivamente. Los Comparadores 7 y 9 bloquearon la MfPCSK9-mmH con valores de IC50 de 10.4nM y 33.9nM, respectivamente, mientras que el Comparador 8 bloqueó parcialmente la fPCSK9-m H con un valor de IC50 de 77.2 nM.

Ejemplo 6. Análisis farmacocinético de los anticuerpos anti-PCSK9 variantes en ratones silvestres y humanizados con PCSK9 Se realizó una comparación de las velocidades de eliminación fármacocinéticas de tres anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina (VH-D106H, VK-L30H y VH-D106H/VK-L30H) contra la molécula de su anticuerpo parental (300N) en ratones silvestres (WT) y ratones homocigotos para la expresión de PCSK9 humana en vez de PCSK9 de ratón (ratones humanizados con PCSK9) con las mismas cepas antecedentes para todos los ratones (75% C57BL6 y 25% 129Sv). Cada anticuerpo se ensayó en 5 ratones WT y 5 ratones PCSK9 humanizados con PCSK9. Todos los anticuerpos se administraron en forma subcutánea en una dosis de 1 mg/kg. Se recogieron sangrados posteriores a la inyección a las 6 horas, 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14, 21, 30, 39, 50, 60, y 74 dias, además del sangrado recogido un día antes de inyectar el anticuerpo (sangrado previo). Se separaron fracciones de suero de los sangrados y se sometieron a un análisis de anticuerpos totalmente humanos usando un inmunoensayo ELISA. En pocas palabras, se usó anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch, # 109-005-098) para recubrir placas de 96 pocilios mediante incubación durante la noche a 4°C a una concentración de 1 gg/mL. El dia siguiente las placas se bloquearon con BSA y después se lavaron. Muestras de suero en diluciones seriadas de seis dosis y estándares de referencia de los respectivos anticuerpos en diluciones seriadas de 12 dosis se añadieron luego a las placas y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar para eliminar los anticuerpos que no se unieron, se detectaron los anticuerpos humanos capturados por las placas usando un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jac son ImmunoResearch, # 109-035-098). Las placas se lavaron y luego se desarrollaron con sustrato colorimétrico de tetrametilbencidina (TMB) de acuerdo con la recomendación del fabricante (BD Pharmingen). Se midió la absorbancia a 450 nm y se calculó la concentración de IgG humana en muestras de suero usando la curva estándar de referencia generado en la placa de muestra. Los resultados se ilustran en las Figuras 1 y 2A que muestran la evolución temporal de los cambios en la concentración de los cuatro anticuerpos anti-PCSK9 ensayados en ratones WT y humanizados, respectivamente. La evolución temporal de las concentraciones de anticuerpos en suero medias (g/ml ± SEM) para cada cohorte se muestran en las Tablas 12 (dias 14, 21 y 30), 13 (dia 39, 50 y 60), y 14 (dia 74).

Tabla 12: Concentraciones de anticuerpos en suero (Dias 14, 21 y 30) Tabla 13: Concentraciones de anticuerpos en suero (Dias 39, 50 y 60) Tabla 14: Concentraciones de anticuerpos en suero (Día 74) Como se ilustra en la Figura 1, los cuatro anticuerpos ensayados alcanzaron una Cmax similar alrededor del día 1-2, y mostraron velocidades de eliminación similares en ratones WT con perfiles farmacocinéticos superpuestos. En los ratones humanizados con PCSK9 (Figura 2A) el anticuerpo parental, 300N, presentó una eliminación más rápida comparada con los anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina ensayados. Las concentraciones de anticuerpos del 300N estuvieron por debajo del limite de detección (< 0.02 pg/ml) el día 14 en los ratones humanizados con PCSK9 en contraste con aproximadamente 8 mg/ml en los ratones WT, lo que sugiere una rápida eliminación mediada por PCSK9 humana para el anticuerpo parental. El anticuerpo variante con sustitución de histidina VH-D106H mostró una velocidad de eliminación más lenta que el anticuerpo parental en los ratones humanizados con PCSK9, con una concentración de anticuerpos media el día 14 de aproximadamente 0.7 pg/ml en los ratones humanizados con PCSK9. Las concentraciones del anticuerpo VH-D106H cayeron por debajo del limite de detección alrededor del día 50 en los ratones humanizados con PCSK9. Los anticuerpos variantes con sustitución de histidina VK-L30H y VH-D106H/VK-L30H mostraron velocidades de eliminación más lentas en los ratones humanizados con PCSK9 en comparación tanto con el VH-D106H como con el anticuerpo parental, con concentraciones de anticuerpos medias en suero de aproximadamente 10 mg/ml y 5 pg/ml, respectivamente, el día 14. Los niveles de anticuerpos en suero para el VK-L30H y el VH-D106H/VK-L30H se mantuvieron en el rango detectable (> 0.02 pg/ml) al menos hasta el día 74. En particular, la concentración en suero del VK-L30H se mantuvo por encima de 0.25 pg/ml hasta el dia 74 en los ratones humanizados con PCSK9.

A continuación, las velocidades de eliminación farmacocinéticas de VH-D106H y VK-L30H se compararon con su anticuerpo parental (300N) y con seis anticuerpos anti-PCSK9 de referencia (Comparadores 1, 2, 3, 4, 5 y 6, tal como se definen en la Tabla 5). Este conjunto de experimentos se llevó a cabo en ratones humanizados con PCSK9 con un antecedente de cepas de 75% de C57BL6 y 25% de 129Sv. Cada anticuerpo se ensayó en un grupo de 5 ratones y todos los anticuerpos se administraron por vía subcutánea en una dosis de 1 mg/kg. Se recogieron sangrados posteriores a la inyección a las 6 horas, 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14, 21, 30, 45, y 74 dias, además del sangrado recogido un dia antes de inyectar el anticuerpo (sangrado previo). El análisis del anticuerpo humano total en las muestras individuales se llevó a cabo usando un ensayo ELISA para detectar Fe de IgG humana. En la Figura 2B se grafican los resultados como una evolución temporal de los niveles totales de anticuerpos humanos. La evolución temporal de las concentraciones de anticuerpos en suero medias para cada cohorte (pg/ml ± SEM) se muestran en la Tabla 15 (días 14, 21 y 30) y la Tabla 16A (días 45 y 74).

Tabla 15: Concentraciones de anticuerpos en suero (Días 14,21 y 30) Tabla 16A: Concentraciones de anticuerpos en suero (Días 45 y 74) Comparador 6 | <0.02 <0.02 ] Como se muestra en la Figura 2B, todos los anticuerpos ensayados alcanzaron una concentración máxima en suero (Cmax) alrededor del día 1-2, con seis de los anticuerpos (300N, VH-D106H, VK-L30H, Comparador 1, Comparador 3, y Comparador 4) exhibiendo una Cmax similar; y los otros tres anticuerpos (Comparador 2, Comparador 5, y Comparador 6) exhibiendo una Cmax aproximadamente 2-3 veces menor. Los anticuerpos 300N, Comparador 2, Comparador 5, y Comparador 6 exhibieron una eliminación más rápida en comparación con los otros anticuerpos ensayados. Como se muestra en la Tabla 15, las concentraciones de anticuerpos de estos cuatro anticuerpos estuvieron por debajo de limite de detección (<0.02 ug/ml) el dia 14. Por el contrario, los anticuerpos VH-D106H, Comparador 1, y Comparador 4 exhibieron concentraciones en suero comprendidas entre 0.5 mg/mL y 2 pg/mL el dia 14; y los anticuerpos VK-L30H y Comparador 3 exhibieron concentraciones en suero de aproximadamente 7 pg/mL el dia 14. El dia 30, los anticuerpos VH-D106H, Comparador 1, VK-L30H, y Comparador 3 aún eran detectables con una concentración en suero del fármaco para cada grupo de 0.07, 0.07, 1.04 y 1.85 pg/mL, respectivamente. Los niveles de anticuerpos en suero para el VK-L30H y el Comparador 3 se mantuvieron en el rango detectable (> 0.02 pg/mL) al menos hasta el dia 74 (Tabla 16A).

A continuación se realizó un estudio adicional para comparar las velocidades de eliminación farmacocinéticas de los anticuerpos anti-PCSK9, entre ellos el 316P(vl), 316P (v2), 300N (vi), 300N(v2), VK-L30H, y tres anticuerpos anti-PCSK9 de referencia (Comparadores 7, 8 y 9 como se define en la Tabla 5). Este conjunto de experimentos se llevó a cabo en ratones humanizados con PCSK9 con un antecedente de cepas de 75% de C57BL6 y 25% de 129Sv. Cada anticuerpo se ensayó en un grupo de 5 ratones y todos los anticuerpos se administraron por via subcutánea en una dosis de 1 mg/kg. Se recogieron sangrados posteriores a la inyección a las 6 horas, 1, 2, 3, 4, 8, 10, 14, 21, y 30 dias, además del sangrado recogido un día antes de inyectar el anticuerpo (sangrado previo). El análisis del anticuerpo humano total en las muestras individuales se llevó a cabo usando un ensayo ELISA para detectar Fe de IgG humana. En la Figura 2C se grafican los resultados como una evolución temporal de los niveles totales de anticuerpos humanos. La evolución temporal de las concentraciones de anticuerpos en suero medias para cada cohorte (pg/ml ± SEM) se muestran en la Tabla 16B (dias 14, 21 y 30).

Tabla 16B: Concentraciones de anticuerpos en suero (Dias 14, 21 y 30) Como se muestra en la Figura 2C, todos los anticuerpos ensayados alcanzaron una concentración máxima en suero (Cmax) alrededor del día 1, con seis de los anticuerpos [316P(vi), 316(v2), 300N(vl), 300N(v2), Comparador 7, Comparador 8, y Comparador 9] exhibiendo una Cmax similar; y VK-L30H exhibiendo una Cmax aproximadamente 1.5 o 2 veces mayor. Los anticuerpos 316P(vl), 316P(v2), 300N(v2) y Comparador 7 exhibieron una eliminación más rápida en comparación con los otros anticuerpos ensayados. Como se muestra en la Tabla 16B, las concentraciones de anticuerpos de estos cuatro anticuerpos estuvieron por debajo de límite de detección (<0.02 ug/mL) el día 14. Por el contrario, los anticuerpos 300N(vl), Comparador 8, y Comparador 9 exhibieron concentraciones en suero comprendidas entre 0.4 mg/mL y 0,7 pg/mL el dia 14; y el anticuerpo VK-L30H exhibió concentraciones en suero de aproximadamente 7 pg/mL el dia 14. El día 30, los anticuerpos VK-L30H, y Comparador 8 aún eran detectables con una concentración en suero del fármaco para estos dos grupos de 3.34 y 0.09 pg/mL, respectivamente.

Este Ejemplo muestra que los anticuerpos anti-PCSK9 con características de unión dependientes del pH (por ejemplo, VH-106H, VK-L30H y VH-D106H/VK-L30H) exhiben propiedades farmacocinéticas mejoradas (por ejemplo, mayores niveles de anticuerpos en suero durante períodos de tiempo más prolongados) en comparación con los anticuerpos anti- PCSK9 que no poseen características de unión dependientes del * pH o que solo poseen características de unión dependientes del pH intermedias (por ejemplo, 300N y Comparadores 2, 5 y Ejemplo 7. Actividad reductora del colesterol de los anticuerpos anti-PCSK9 variantes in vivo Se determinó el efecto de los anticuerpos anti-PCSK9 humana sobre los niveles de LDL-C en suero in vivo en ratones homocigotos para la expresión de PCSK9 humana en lugar de PCSK9 de ratón y también heterocigotos para la expresión de LDLR de ratón ( Pcsk9hum/hum Ldlr+/ ) . Los ratones se sometieron a sangrado previo 5 dias antes del experimento y se clasificaron en grupos de tratamiento sobre la base de sus niveles de LDL-C, de manera que la media del nivel de LDL-C en todos los grupos era la misma. A continuación, los ratones se inyectaron por vía subcutánea ya sea con un anticuerpo anti-PCSK9 o con un anticuerpo de control de isotipo con especificidad irrelevante en una dosis de 10 mg/kg en el Día 0 del estudio. Para este estudio, se utilizaron dos anticuerpos anti-PCSK9 parentales no modificados (316P y 300N) y dos anticuerpos anti-PCSK9 variantes con sustitución de histidina (VK-L30H y VH-D106H). En este Ejemplo se utilizaron dos versiones de 316P, 316P(vl) y 316P(v2). El 316P(vl) posee una Fe de IgGl humana, mientras que el 316P(v2) posee una Fe de IgG4 humana. Todos los demás anticuerpos ensayados tenían una Fe de IgG4 humana. (El anticuerpo "300N" utilizado en este Ejemplo es el mismo que el anticuerpo "300N(v2)" utilizado en el Ejemplo 3 en este documento). Para cada grupo de tratamiento se utilizaron cinco ratones.

Los ratones se sangraron los días 4, 7, 14, 20, 26, 33, 42, 46 y 52 después de la inyección. Los niveles de LDL-C en suero se determinaron usando un Sistema de Química ADVIA® 1800 (Siemens). A continuación se calculó el LDL-C medio en suero para cada uno de los puntos de tiempo para cada grupo de tratamiento; los resultados, expresados como (media ± SEM), se muestran en la Tabla 17. Los valores se expresan como niveles de LDL-C medios (mg/dL) (± SEM). La Tabla 18 muestra el porcentaje de reducción de los niveles de LDL-C respecto de la linea de base.

Tabla 17: Niveles de LDL-C (mg/dL) en ratones Pcs7c5hum/hum Ldlr+/ tratados con anticuerpos anti-PCSK9 Tabla 18: Cambio porcentual de los niveles de LDL-C con respecto a la linea de base [Dia 5] Como se muestra en las Tablas 17 y 18, la administración de una dosis única de 10 mg/kg de los anticuerpos variantes con sustitución de histidina (VK-L30H y VH-D106H) a ratones Pcs 9hum/hum Ldlr+/ llevó, cada una de ellas, a una reducción del LDL-C mayor que aproximadamente 45% con respecto a la linea de base el dia 7, y mayor que aproximadamente 44% con respecto a la linea de base el dia 14. Por otra parte, los ratones tratados con una dosis única de VK-L30H mostraron una reducción sostenida del LDL-C de al menos 33% con respecto a la linea de base por hasta 33 dias. Los niveles de LDL-C para los ratones tratados con VK-L30H se mantuvieron casi un 20% por debajo de la linea de base el dia 46 después de una dosis única de 10 mg/kg. Los ratones dosificados con VH-D106H tuvieron una reducción inicial del LDL-C similar a la del VK-L30H, pero el nivel de LDL-C se redujo apenas aproximadamente un 13% con respecto a la linea de base el dia 33. Una dosis única de 316P(vl) también dio lugar a aproximadamente la misma reducción porcentual inicial del LDL-C con respecto a la linea de base que el VK-L30H (logrando una reducción de aproximadamente 49% con respecto a la linea de base el dia 7 después de la administración del anticuerpo) pero el efecto reductor del LDL-C no fue tan prolongado como en el caso de los mutantes con sustitución de histidina. 316P -(v2) y 300N mostraron el mayor efecto reductor de LDL-C a corto plazo (una reducción de aproximadamente 58% con respecto a la linea de base el día 7 para cada anticuerpo), pero tuvieron un efecto sostenido más corto en comparación con los mutantes de sustitución de histidina.

También se determinaron los niveles de anticuerpos humanos circulantes de ratones de cada grupo de tratamiento usando un ensayo ELISA estándar. Las placas se recubrieron con un anticuerpo anti-Fc humana de cabra (Jackson ImmunoResearch, # 109-005-098) a 1 mg/ml en PBS durante 18 horas a 4°C. Luego las placas se bloquearon durante 3 horas a temperatura ambiente (RT). Para generar curvas estándares, cada anticuerpo se añadió a las placas en una serie de diluciones de 1/2. El suero de ratón de los dias 4, 7, 14, 20, 26, 33, 42 y 46 posteriores a las inyecciones de anticuerpo se añadió a las placas en diluciones de 1:100, 1:200, 1:500, 1:2000, 1:4000, y 1:8000 y luego se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Los anticuerpos capturados se detectaron usando un anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch, #109-035-098) y se desarrollaron señales colorimétricas usando un sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (MP Biomedicals, #152346). La reacción se detuvo con 2.0M H2S04 y luego se registró la absorbancia a 450 nm para medir las cantidades totales de anticuerpos humanos en el suero de ratón. Se calcularon los niveles medios de anticuerpos para cada uno de los puntos de tiempo en los grupos de tratamiento ensayados, y los resultados se muestran en la Tabla 19. Los Valores se expresan como niveles medios de anticuerpos en suero (mg/dL) (± SEM).

Tabla 19: Niveles totales en suero (qg/mL) de anticuerpos humanos en ratones Pcsk9hum/hum Ldlr / Los anticuerpos parentales 316P(vl), 316P(v2) y 300N se habían eliminado de la circulación los días 14, 20 y 26, respectivamente, ya que no se detectaron anticuerpos humanos en las muestras de suero de los ratones tratados con estos anticuerpos en los puntos de tiempo indicados. Por el contrario, en las muestras de suero de los ratones tratados con los anticuerpos variantes con sustitución de histidina VK y VH-L30H-D106H se detectaron anticuerpos humanos hasta al menos el día 55. Los niveles de anticuerpos humanos se correlacionaron aproximadamente con el grado de la reducción del colesterol observado en los diferentes puntos de tiempo. Por lo tanto, los anticuerpos variantes con sustitución de histidina de la presente invención permanecieron en la circulación de los animales tratados durante un período de tiempo mayor que los anticuerpos parentales y redujeron el LDL-C en suero durante períodos de tiempo correspondientemente más largos que los anticuerpos parentales.

Por último, se midió la cantidad total de PCSK9 humana en el suero de los ratones de cada grupo de tratamiento en cada punto de tiempo. Los resultados, expresados en términos de ng/mL de PCSK9 humana, se muestran en la Tabla 20.

Tabla 20: Niveles totales de PCSK9 humana (mg/dL) en ratones PcsA-9hum/huin Ldlr+/ tratados con anticuerpos anti- PCSK9 Los niveles totales de PCSK9 permanecieron por encima de 1500 ng/mL en los ratones tratados con los anticuerpos variantes con sustitución de histidina VK-L30H y VH-D106H durante al menos 42 dias después de la administración de los anticuerpos. Por el contrario, en todos los demás grupos de tratamiento, los niveles totales de PCSK9 habían caído por debajo de 1000 ng/mL el día 20 o antes.

A continuación, el anticuerpos anti-PCSK9 variante con sustitución de histidina VK-L30H se evaluó en relación con diferentes anticuerpos anti-PCSK9 de referencia (Comparadores 1, 2, 3, y 4 tal como se definen en la Tabla 5) en términos de sus efectos sobre los niveles de LDL-C en suero usando ratones Pcs 9hum/hum Ldlr+/ . Los ratones se sometieron a sangrado previo 8 días antes del experimento y se clasificaron en grupos de tratamiento sobre la base de sus niveles de LDL-C, de manera que la media del nivel de LDL-C en todos los grupos era la misma. A continuación, a los ratones (n= 5/grupo de tratamiento) se les inyectó un anticuerpo anti-PCSK9 o un anticuerpo de control de isotipo (hIgG4) con especificidad irrelevante en una dosis de 10 mg/kg por vía subcutánea el Día 0 del estudio. Los se sangraron los días 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63 y 77 después de la inyección de los anticuerpos y se determinaron los niveles de LDL-C en suero se determinaron usando un Sistema de Química ADVIA® 1800 (Siemens). A continuación se calculó 5 el LDL-C medio en suero para cada uno de los puntos de tiempo para cada grupo de tratamiento; los resultados, expresados como niveles medios de LDL-C (mg/dL) (± SEM), se muestran en la Tabla 21. La Tabla 22 muestra el porcentaje de reducción de los niveles de LDL-C con respecto a la línea de base (es 0 decir, el Día 8).

Tabla 21: Niveles de LDL-C (mg/dL) en ratones Pcsk9hum/hum Ldlr+/ tratados con anticuerpos anti-PCSK9 Tabla 22: Cambio porcentual de los niveles de LDL-C con respecto a la línea de base [Día 8] Como se muestra en las Tablas 21 y 22, la administración de una dosis única de 10 mg/kg del anticuerpo variante con sustitución de histidina VK-L30H a ratones Pesie9hum/hum Ldlr+/ llevó a una reducción del LDL-C mayor que un 30% con respecto a la línea de base el día 14. En comparación, los ratones dosificados con el Comparador 2 lograron una máxima reducción del LDL-C de aproximadamente 40% el día 7 después de la administración del anticuerpo, pero el alcance de esta reducción no era evidente 14 días después de la administración del anticuerpo ni en ningún punto de tiempo posterior. Una dosis única de Comparador 1 presentó una reducción prolongada del LDL-C (con una reducción porcentual máxima de aproximadamente 37% con respecto a la linea de base el día 14), pero el alcance de la reducción del LDL-C con respecto a la línea de base fue de apenas 9% a 24% a partir del día 42 y hasta el final del experimento el día 77. Los Comparadores 3 y 4 no demostraron 5 una eficacia medible para reducir el LDL-C, aunque la presencia de los anticuerpos en la circulación fue confirmada por ELISA.

Los niveles de anticuerpos humanos circulantes de ratones de cada grupo de tratamiento se determinaron usando 0 un protocolo ELISA para detectar la Fe de IgG humana total.

Se calcularon los niveles medios de anticuerpo para el suero de ratón de los días 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63, y 77 en los grupos de tratamiento ensayados, y los resultados, expresados como niveles medios de anticuerpos en suero 5 (ug/mL) (± SEM) se muestran en la Tabla 23.

Tabla 23: Niveles totales en suero (pg/mL) de anticuerpos humanos en ratones Pcsk9hum/hum Ldlr+/ Los Comparadores 2 y 4 se habían eliminado de la circulación los días 28 y 77, respectivamente, ya que no se detectaron anticuerpos humanos en las muestras de suero de los ratones tratados con estos anticuerpos en los puntos de tiempo indicados. Por el contrario, en las muestras de suero de los ratones tratados con el anticuerpo variante con sustitución de histidina VK-L30H, así como con los Comparadores 1 y 3, se detectaron anticuerpos humanos el día 77. El día 77 el grupo de tratamiento con VK-L30H tuvo el nivel de anticuerpo humano medible más alto en comparación con los demás grupos de tratamiento.

Por último, se midió la cantidad total de PCSK9 humana en el suero de los ratones de cada grupo de tratamiento en cada punto de tiempo. Los resultados, expresados como niveles medios de PCSK9 humana (ng/mL)(± SEM), se muestran en la Tabla 24.

Tabla 24: Niveles totales de PCSK9 humana (mg/dL) en ratones Pcs79hum/hum Ldlr+/ tratados con anticuerpos anti- PCSK9 En este experimento, los niveles totales de PCSK9 humana permanecieron por encima de 2500 ng/mL en los ratones tratados con el anticuerpo variante con sustitución de histidina VK-L30H y el Comparador 3 durante al menos 77 dias después de la administración de los anticuerpos. Por el contrario, los grupos de tratamiento con Comparador 2 y Comparador 4 tuvieron niveles totales de PCSK9 que habían caído por debajo de 1000 ng/mL el día 21 y 42, respectivamente. Los niveles totales de PCSK9 del grupo de tratamiento con Comparador 1 nunca subieron por encima de lOOOng/mL.

La presente invención no está limitada en su alcance por las modalidades especificas descritas en este documento. En efecto, diversas modificaciones de la invención adicionales a las descritas en este documento serán evidentes para los expertos en la téenica a partir de la descripción anterior y las figuras que se acompañan. Tales modificaciones están destinadas a caer dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 humana (PCSK9) con una afinidad al menos 13 veces mayor a pH neutro que a pH ácido, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a PCSK9 con una afinidad al menos 14 veces mayor a pH neutro que a pH ácido.

3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 2, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a PCSK9 con una afinidad al menos 15 veces mayor a pH neutro que a pH ácido.

4. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 humana (PCSK9), donde la relación KD ácido/neutro para el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a PCSK9 a 25°C es mayor que aproximadamente 12.5, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

5. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 humana (PCSK9), donde la relación kd ácido/neutro para el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que se une a PCSK9 a 25°C es mayor que aproximadamente 7.5, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

6. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 humana (PCSK9), donde la relación t ácido/neutro para el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a PCSK9 a 25°C es menor que aproximadamente 0.14, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

7. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 humana (PCSK9) a 25°C y pH ácido con una semivida disociativa (t½) menor que aproximadamente 4.5 minutos, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a PCSK9 a 25°C y pH neutro con una t½ mayor que aproximadamente 35 minutos.

8. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 7, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a PCSK9 a 25°C y pH ácido con una semivida disociativa (t½) menor que aproximadamente 2 minutos, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a PCSK9 a 25°C y pH neutro con una t mayor que aproximadamente 35 minutos.

9. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 8, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo se une a PCSK9 a 25°C y pH ácido con una semivida disociativa (t½) menor que aproximadamente 1.5 minutos, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo se une a PCSK9 a 25°C y pH neutro con una t mayor que aproximadamente 35 minutos.

10. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a PCSK9 con una t a pH ácido que es al menos 10 veces más corta que la t½ para el anticuerpo que se une a PCKS9 a pH neutro, tal como se mide mediante resonancia de plasmón superficial.

11. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 10, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo se une a PCSK9 con una t a pH ácido que es al menos 15 veces más corta que la t½ para el anticuerpo que se une a hPCKS9 a pH neutro.

12. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 11, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo se une a PCSK9 con una t a pH ácido que es al menos 20 veces más corta que la t para el anticuerpo que se une a PCKS9 a pH neutro.

13. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión antígeno del mismo que se une a PCSK9 con una afinidad al menos 12 veces mayor a pH neutro que a pH ácido, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo se une a PCSK9 con un t½ a pH ácido que es al menos 10 veces más corta que la t½ para el anticuerpo que se une a PCSK9 a pH neutro.

14. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión antigeno del mismo que bloquea la interacción entre la proproteina convertasa subtilisina/kexina tipo 9 humana (PCSK9) y el receptor de lipoproteinas de baja densidad (LDLR) a pH neutro con una IC50 que es al menos 36 veces menor que el valor de IC50 con bloqueo de PCSK9/LDLR del anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo a pH ácido.

15. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo, al ser administrado a un sujeto en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg, reduce el LDL-C en suero al menos un 33% con respecto a la linea de base, y donde la reducción del LDL-C en suero se mantiene por al menos 26 dias luego de la administración.

16. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 15, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo, al ser administrado a un sujeto en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg, reduce el LDL-C en suero al menos un 33% con respecto a la linea de base, y donde la reducción del LDL-C en suero se mantiene por al menos 33 dias luego de la administración.

17. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo, al ser administrado a un sujeto en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg, reduce el LDL-C en suero al menos un 15% con respecto a la linea de base, y donde la reducción del LDL-C en suero se mantiene por al menos 42 dias luego de la administración.

18. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 17, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo, al ser administrado a un sujeto en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg, reduce el LDL-C en suero al menos un 15% con respecto a la linea de base, y donde la reducción del LDL-C en suero se mantiene por al menos 55 dias luego de la administración.

19. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR), donde la HCVR comprende la SEQ ID NO:218 o una variante de la SEQ ID NO:218 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N52H, Q53H, I100H, V101H, V104H, D106H, M107H, D108H, y Y112H; y donde la LCVR comprende la SEQ ID NO:226 o una variante de la SEQ ID NO:226 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en L29H, L30H, N33H, G34H, Y37H, L97H, T99H y P100H.

20. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 19, donde la HCVR comprende una variante de la SEQ ID NO:218 que comprende una sustitución de aminoácidos D106H; y donde la LCVR comprende la SEQ ID NO:226.

21. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 19, donde la HCVR comprende la SEQ ID NO:218; y donde la LCVR comprende una variante de la SEQ ID NO:226 que comprende una sustitución de aminoácidos L30H.

.22. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 19, donde la HCVR comprende una variante de la SEQ ID NO:218 que comprende una sustitución de aminoácidos D106H; y donde la LCVR comprende una variante de la SEQ ID NO:226 que comprende una sustitución de aminoácidos L30H.

23. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo comprende 3 regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDRl, HCDR2 y HCDR3) y 3 regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3), donde la HCDRl comprende la SEQ ID NO:220 (parental); donde la HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:222 (parental), 772 (N52H) y 773 (Q53H); donde la HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:224 (parental), 782 (I100H), 783 (V101H), 786 (V104H), 788 (D106H), 789 (M107H), 790 (D108H) y 794 (Y112H); donde la LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:228 (parental), 801 (L29H), 802 (L30H), 804 (N33H), 805 (G34H) y 808 (Y37H); donde la LCDR2 comprende la SEQ ID NO:230 (parental); y donde la LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:232 (parental), 815 (L97H), 817 (T99H), y 818 (P100H).

24. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 23, donde la HCDR2 comprende la SEQ ID NO:222 (parental); la HCDR3 comprende las SEQ ID NO:224 (parental) o 788 (D106H); la LCDR1 comprende las SEQ ID NO:228 (parental) u 802 (L30H); y la LCDR3 comprende la SEQ ID NO:232 (parental).

25. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 24, donde la HCDR3 comprende la SEQ ID NO:788 (D106H), y la LCDR1 comprende la SEQ ID NO:228 (parental).

26. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 24, donde la HCDR3 comprende la SEQ ID NO:224 (parental), y la LCDR1 comprende la SEQ ID NO:802 (L30H).

27. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 24, donde la HCDR3 comprende la SEQ ID NO:788 (D106H), y la LCDR1 comprende la SEQ ID NO:802 (L30H).

28. Un método de reducir los niveles de LDL-C en suero en un sujeto, método que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.

29. El método de la reivindicación 28, donde el nivel de LDL-C en suero del sujeto se reduce al menos un 33% con respecto a la linea de base después de la administración de la composición farmacéutica, y donde la reducción del LDL- C en suero se mantiene durante al menos 26 dias después de la administración.

30. El método de la reivindicación 29, donde el nivel de LDL-C en suero del sujeto se reduce al menos un 33% con respecto a la linea de base después de la administración de la composición farmacéutica, y donde la reducción del LDL-C en suero se mantiene durante al menos 33 dias después de la administración.

31. El método de la reivindicación 28, donde el nivel de LDL-C en suero del sujeto se reduce al menos un 15% con respecto a la linea de base después de la administración de la composición farmacéutica, y donde la reducción del LDL-C en suero se mantiene durante al menos 42 dias después de la administración.

32. El método de la reivindicación 31, donde el nivel de LDL-C en suero del sujeto se reduce al menos un 15% con respecto a la linea de base después de la administración de la composición farmacéutica, y donde la reducción del LDL-C en suero se mantiene durante al menos 55 dias después de la administración.

33. Un método para el tratamiento de la hipercolesterolemia que comprende administrar a un paciente que lo necesite una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.

34. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a proproteina convertasa subtilisina/kexina tipo 9 humana (PCSK9), donde la relación KD ácido/neutro para el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que se une a PCSK9 a 25°C está comprendida entre 3.0 y 8.0, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

35. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 34, donde la relación KD ácido/neutro para el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que se une a PCSK9 a 25°C está comprendida entre 4.0 y 7.0, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

36. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 35, donde la relación KD ácido/neutro para el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que se une a PCSK9 a 25°C está comprendida entre 5.0 y 7.0, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

37. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, donde la relación t½ ácido/neutro para el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que se une a PCSK9 a 25°C es menor que aproximadamente 0.14, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

38. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 37, donde la relación t ácido/neutro para el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que se une a PCSK9 a 25°C es menor que aproximadamente 0.13, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

39. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une a proproteina convertasa subtilisina/kexina tipo 9 humana (PCSK9) a pH 6.0 y 25°C con una t½ menor que aproximadamente 35 minutos y mayor que aproximadamente 10.5 minutos, tal como se mide mediante resonancia de plasmón superficial.

40. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 39, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo se une a PCSK9 humana a pH 6.0 y 25°C con una t menor que aproximadamente 20 minutos y mayor que aproximadamente 12 minutos, tal como se mide mediante resonancia de plasmón superficial.

41. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de la reivindicación 40, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo se une a PCSK9 humana a pH 6.0 y 25°C con una t½ menor que aproximadamente 16 minutos y mayor que aproximadamente 14 minutos, tal como se mide mediante resonancia de plasmón superficial.

42. Un método para generar un anticuerpo con características de unión dependientes del pH, método que comprende: (a) explorar una población de anticuerpos para identificar uno o más anticuerpos que presentan al menos características de unión dependientes del pH intermedias; y (b) someter los anticuerpos identificados en (a) a mutagénesis para mejorar la unión dependiente del pH del anticuerpo al antígeno

43. El método de la reivindicación 42, donde la etapa de exploración (a) comprende identificar un anticuerpo que se une al antígeno con una relación KD ácido/néutro mayor que aproximadamente 3.0 pero menor que aproximadamente 8.0.

44. El método de la reivindicación 42, donde la etapa de exploración (a) comprende identificar un anticuerpo que se une al antígeno con una relación t ácido/neutro menor que aproximadamente 1.0 pero mayor que aproximadamente 0.15.

45. El método de la reivindicación-43, donde la relación KD ácido/neutro se determina usando un ensayo· de resonancia de plasmón superficial a un pH ácido y a un pH neutro.

46. El método de la reivindicación 44, donde la relación t ácido/neutro se determina usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial a un pH ácido y a un pH neutro.

47. El método de cualquiera de las reivindicacions 42 a 46, donde la etapa de mutagénesis (b) comprende la sustitución de uno o más aminoácidos en al menos una región determinante de complementariedad (CDR) del anticuerpo por una histidina.

48. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 42 a 47, donde el anticuerpo resultante de las etapas (a) y (b) muestra una relación KD ácido/neutro mayor o igual que aproximadamente 4.0, y/o una relación t½ ácido/neutro menor o igual que aproximadamente 0.14.

49. Un método para generar un anticuerpo con características de unión dependientes del pH, método que comprende: (a) explorar una población de anticuerpos para identificar uno o más anticuerpos que presentan unión dependiente del pH a un antígeno con una t½ a pH 6.0 mayor que aproximadamente 20 minutos pero menor que aproximadamente 40 minutos; y (b) someter los anticuerpos identificados en (a) a mutagénesis para generar un anticuerpo que mantiene la unión dependiente del pH pero con una t a pH 6.0 menor que aproximadamente 20 minutos.

50. El método de la reivindicación 49, donde la etapa de mutagénesis (b) genera un anticuerpo con una t a pH 6.0 menor que aproximadamente 5 minutos.

51. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 a 50, donde el antígeno es PCSK9.

52. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 o 34 a 41 para usarse en medicina.

53. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antigeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 o 34 a 41 para usarse en el tratamiento de hipercolesterolemia o para reducir los niveles de LDL-C en el suero.

54. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antigeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 o 34 a 41 para usarse en el tratamiento de hipercolesterolemia o para reducir los niveles de LDL-C en el suero. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee anticuerpos y fragmentos de unión a antigeno de los mismos que específicamente se unen a proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. Los anticuerpos de la invención pueden poseer uno o más cambios de aminoácidos en comparación con los anticuerpos que no presentan propiedades de unión dependientes del pH. Por ejemplo, la pre-sente invención incluye anticuerpos anti-PCSK9 que poseen una o más sustituciones de histidina en una o más regiones determinantes de la complementariedad. Los anticuerpos de la invención, con propiedades de unión dependientes del pH, permanecen en la circulación y exhiben actividad reductora del colesterol en sujetos animales durante períodos de tiempo prolongados en comparación con los anticuerpos anti-PCSK9 que no presentan propiedades de unión dependientes del pH. Por lo tanto, los anticuerpos de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con concentraciones elevadas de colesterol HDL, por lo que los anticuerpos de la invención se pueden administrar a un paciente en dosis más bajas y/o con menos frecuencia en comparación con los anticuerpos que no exhiben propiedades de unión dependientes del pH.