MX2014011558A - Operaciones de cosecha mejoradas para proteinas recombinadas. - Google Patents

Abstract

La presente invención contempla un método para la producción de una proteína recombinada que comprende (a) la fermentación de una célula huésped procariota, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada, y (b) la cosecha de dicha proteína recombinada en condiciones donde los niveles de dO2 son superiores a 0%, y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un volumen filtrado, donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de DHNA-proteína recombinada, medida por un ensayo de IEC a 310 nm. La presente invención además contempla un método para la producción de una proteína recombinada que comprende (a) la fermentación de una célula huésped procariota con deleción del gen menE, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada, (b) la cosecha de dicha proteína recombinada; y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un volumen filtrado, donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de DHNA-proteína recombinada, medida por un ensayo de IEC a 310 nm, y donde el rendimiento de proteína recombinada se incrementa alrededor de 20% o más.

Description

OPERACIONES DE COSECHA MEJORADAS PARA PROTEÍNAS RECOMBINADAS REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Nro. 61/616.297, presentada el 27 de marzo de 2012, incorporada en la presente solicitud a modo de referencia, en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a métodos mejorados para el cultivo de proteínas recombinadas en células huéspedes procariotas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Es necesaria la purificación de proteínas económica y a gran escala para la obtención de productos biotecnológicos viables. En general, las proteínas son producidas por cultivos de células, usando o bien estirpes celulares mamíferas o bacterianas, diseñadas para la producción de proteína de interés mediante la inserción de un plásmido recombinado que contiene el gen para dicha proteína. Debido a que las estirpes celulares utilizadas son organismos vivos, deben ser alimentadas con un medio de crecimiento complejo que, habitualmente, contiene una mezcla de sales, azúcares, aminoácidos, vitaminas, oligoelementos y peptonas. La separación de la proteína deseada de la mezcla de compuestos alimentada a las células y de los subproductos de las células en sí mismos, a una pureza suficiente para el uso como un producto terapéutico humano plantea un desafío formidable.

Las Proteínas terapéuticas recombinadas comúnmente son producidas en varias estirpes celulares huéspedes, que incluyen células huéspedes mamíferas, tales como células NSO de mieloma murino y células de ovario de hámster chino (CHO, según su sigla en inglés) (Anderson, D. C and Krummen, L. (2002), Curr. Opin. Biotech., 13: 117-123; Chu, L. and Robinson, D. K. (2001), Curr. Opin. Biotechnol., 12: 180-187) y células huéspedes bacterianas que incluyen Escherichia coli (E. coli). Cada estirpe de células posee ventajas y desventajas, en términos de productividad y de las características de las proteínas producidas por las células. La Escherichia coli ha sido utilizada más exhaustivamente para la producción a gran escala de proteínas terapéuticas, que no requieren la compleja glicosilación para la bioactividad. Las proteínas heterólogas expresadas por E. coli pueden acumularse como producto soluble o como agregados insolubles. En general, a fin de aislar las proteínas, las células pueden someterse a tratamientos para la extracción periplásmica, o pueden ser Usadas a fin de liberar productos intracelulares que son de otro modo inaccesibles. Los avances en las técnicas de fermentación y de cultivos de células han aumentado en gran medida las valoraciones de las proteínas recombinadas objetivo.

Las elecciones de las estirpes celulares de producción comercial a menudo equilibran la necesidad de alta productividad con la capacidad de suministrar los atributos de calidad de producto requeridos para un determinado producto. Con los procedimientos de fermentación de cGMP (Buenas Prácticas de Manufactura actuales, según su sigla en inglés), la calidad se construye en el proceso entero, de modo de garantizar el cumplimiento de los requisitos de las agencias regulatorias en términos de seguridad, identidad de producto, calidad y pureza. Sin embargo, ocasionalmente, surgen cuestiones en las cuales un determinado producto no cumple con sus especificaciones. El desafío consiste en desarrollar un proceso resistente en el cual identificar y aislar la cuestión, luego, mitigar la cuestión, de manera tal de poder mantener los controles del proceso dentro de rangos de parámetros establecidos, y asegurarse de que el proceso produzca de manera uniforme un producto que cumple con las especificaciones del producto. Existe la necesidad en la técnica de mitigar o eliminar la incidencia de productos que no cumplan con las especificaciones.

SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN La presente invención contempla un método para la producción de una proteína recombinada que comprende: (a) la fermentación de una célula huésped procariota, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada; Y (b) la cosecha de dicha proteína recombinada en condiciones donde los niveles de oxígeno disuelto (dÜ2) son superiores a 0%, y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un volumen filtrado para el almacenamiento (FBS, según su sigla en inglés), donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de 1,4-dihidroxi-2-naftoato (DHNA)-proteína recombinada, medida por un ensayo de cromatografía de intercambio iónico (IEC, según su sigla en inglés) a 310 nm. En una forma de realización, en el método descripto con anterioridad, el ensayo analítico es por HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento, según su sigla en inglés), RP HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa, según su sigla en inglés), HIC HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento de interacción hidrófoba, según su sigla en inglés), RMN (resonancia magnética nuclear), espectrometría de masa, o espectroscopia de UV.

La presente invención contempla un método para la producción de una proteína recombinada, que comprende (a) la fermentación de una célula huésped procariota, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada, y (b) la cosecha de dicha proteína recombinada en condiciones donde los niveles de d02 son superiores a 0%; y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un FBS, donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de DHNA-proteína recombinada, medida por un ensayo de IEC a 310 nm, donde dicha proteína recombinada es un polipéptido recombinado o un anticuerpo aislado.

La presente invención contempla un método para la producción de una proteína recombinada que comprende (a) la fermentación de una célula huésped procariota, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada, y (b) la cosecha de dicha proteína recombinada en condiciones donde los niveles de dO2 son superiores a 0%; y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un FBS, donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de DHNA-proteína recombinada, medida por un ensayo de IEC a 310 nm, donde la fermentación es independiente de la escala.

La presente invención contempla un método para la producción de una proteína recombinada que comprende (a) la fermentación de una célula huésped procariota, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada, y (b) la cosecha de dicha proteína recombinada en condiciones donde los niveles de d02 son superiores a 0%, y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un FBS, donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de DHNA-proteína recombinada, medida por un ensayo de IEC a 310 nm, donde dicha célula huésped procariota es Escheríchia cofi (E. cotí), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla y Paracoccus.

La presente invención contempla un método para la producción de una proteína recombinada que comprende (a) la fermentación de una célula huésped procariota, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada, y (b) la cosecha de dicha proteína recombinada en condiciones donde los niveles de d02 son superiores a 0%, y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un FBS, donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de DHNA-proteína recombinada, medida por un ensayo de IEC a 310 nm, donde dicho d02 se mantiene en niveles superiores a 0% en forma continua durante todas las operaciones de cosecha de la etapa (b). En una forma de realización en el método descripto con anterioridad, las operaciones de cosecha comprenden una etapa de homogeneización. En otra forma de realización, el d02 se mantiene a alrededor de 30% a alrededor de 75%, antes de la homogeneización. Aun en otra forma de realización, el d02 se mantiene en niveles superiores a 75% antes de la homogeneización. Incluso en otra forma de realización, el d02 se mantiene a alrededor de 50% después de la homogeneización. En otra forma de realización, el d02 se mantiene en niveles superiores a 50% después de la homogeneización. En una forma de realización, el d02 se mantiene durante un período de tiempo superior o igual a 1,5 horas. Incluso en otra forma de realización, el d02 se mantiene durante un período de tiempo superior o igual a 2 horas.

La presente invención contempla un método para la producción de una proteína recombinada que comprende (a) la fermentación de una célula huésped procariota, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada, y (b) la cosecha de dicha proteína recombinada en condiciones donde los niveles de d02 son superiores a 0%, y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un FBS, donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de DHNA-proteína recombinada, medida por un ensayo de IEC a 310 nm, donde el d02 se mantiene con aire extendido o rociado, con incrementada presión inversa, o con agitación (es decir, sacudido). En una forma de realización, el aire extendido es de alrededor de 0,4 vvm (volumen por volumen por minuto) a alrededor de 0,8 vvm. En otra forma de realización, el aire extendido es dirigido a 0,6 vvm. En otra forma de realización, la mayor presión inversa es entre alrededor de 6,8 y alrededor de 206,8 kPa (alrededor de 1 ,0 y alrededor de 30 psi). En una forma de realización, la mayor presión se dirige a 131 kPa (19 psi). Incluso en otra forma de realización, el índice de agitación es de alrededor de 6 Vatios/I a alrededor de 8 vatios/l. Aun en otra forma de realización, el índice de agitación es de por lo menos 6 vatios/1. En otra forma de realización, el índice de agitación está dirigido a 6 vatios/1.

En otro aspecto de la presente invención, se contempla un método para la producción de una proteína recombinada que comprende (a) la fermentación de una célula huésped procariota con deleción del gen menE, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada, (b) la cosecha de dicha proteína recombinada; y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un FBS, donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de DHNA-proteína recombinada, medida por un ensayo de IEC a 310 nm. Como una forma de realización adicional al método que se describe anteriormente, el rendimiento de proteína recombinada se incrementa alrededor de 20% o más, alrededor de 30% o más, alrededor de 40% o más, alrededor de 50% o más, alrededor de 60% o más, en comparación con el rendimiento usando una célula huésped procariota de control.

En otro aspecto de la presente invención, se contempla un método para la producción de una proteína recombinada que comprende (a) la fermentación de una célula huésped procariota con deleción del gen menE, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada, (b) la cosecha de dicha proteína recombinada; y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un FBS, donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de DHNA-proteína recombinada, medida por un ensayo de IEC a 310 nm, donde el rendimiento de proteína recombinada se incrementa alrededor de 20% o más, alrededor de 30% o más, alrededor de 40% o más, alrededor de 50% o más, alrededor de 60% o más, en comparación con el rendimiento usando una célula huésped procariota de control, donde la fermentación es independiente de la escala.

En otro aspecto de la presente invención, se contempla un método para la producción de una proteína recombinada que comprende (a) la fermentación de una célula huésped procariota con deleción del gen menE, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada, (b) la cosecha de dicha proteína recombinada; y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un FBS, donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de DHNA-proteína recombinada, medida por un ensayo de IEC a 310 nm, donde el rendimiento de proteína recombinada se incrementa alrededor de 20% o más, alrededor de 30% o más, alrededor de 40% o más, alrededor de 50% o más, alrededor de 60% o más, en comparación con el rendimiento usando una célula huésped procariota de control, donde dicha proteína recombinada es un polipéptido recombinado o un anticuerpo aislado.

En otro aspecto de la presente invención, se contempla un método para la producción de una proteína recombinada que comprende (a) la fermentación de una célula huésped procariota con deleción del gen menE, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada, (b) la cosecha de dicha proteína recombinada; y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un FBS, donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de DHNA-proteína recombinada, medida por un ensayo de IEC a 310 nm, donde el rendimiento de proteína recombinada se incrementa alrededor de 20% o más, alrededor de 30% o más, alrededor de 40% o más, alrededor de 50% o más, alrededor de 60% o más, en comparación con el rendimiento usando una célula huésped procariota de control, donde dicha célula huésped procariota es Escheríchia coli (E. coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla y Paracoccus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los resultados del ensayo COC de tres operaciones de fabricación de un producto en el cual dos operaciones, Operación 2 y Operación 3, no cumplieron con los resultados esperados para el ensayo COC. PW = agua purificada, C = control de operación de desarrollo, 1 = Operación 1 , 2 = Operación 2, y 3 = Operación 3.

La Figura 2A muestra los espectros de UV/vis (10 cm) para las Operaciones 1-3 -UV Cercano, donde se representan las Operaciones 1-3. Se observaron nuevos picos de absorbancia aproximadamente a 320 nm y a 460 nm, que no eran evidentes para la Operación 1. La Figura 2B muestra los espectros de UV/vis para la Operación 3 menos Operación 1 , donde la diferencia de los picos de absorbancia para las Operaciones 2 y 3 puede distinguirse de la Operación 1.

La Figura 3 muestra un ensayo de IEC monitoreado a 310 nm para las Operaciones 1-3. Se observó un leve pico saliente detrás del pico principal para las Operaciones 2 y 3, mientras que el perfil para la Operación 1 fue comparable al material de referencia.

La Figura 4 muestra un análisis 2D de LC-MS (cromatografía liquida-espectrometría de masa, según su sigla en inglés) de las Operaciones 1-3 intactas, monitoreadas a 280 nm y 310 nm. Se observó una masa esperada para la Operación 1 , mientras que se observaron la masa esperada y una masa adicional a 157 Da para las Operaciones 2 y 3.

La Figura 5 muestra un análisis 2D-LC MS y una identificación de masa por cartografía péptida tríptica con detección de MS de una fracción recogida del aducto marrón -se recogió un pico menor del ensayo de IEC. Del análisis 2D LC-MS, además de la masa esperada, se observó una masa de +156 Da para el pico saliente fraccionado.

La Figura 6 muestra que el análisis de LC-MS-MS del nuevo pico de aducto marrón observado a 48,8 minutos a 310 nm se determinó como el péptido T20 con Cys182 modificado con +154,006 Da. Se detectaron además péptidos T6 y T16 modificados (en cisteína, +154,006 Da) y libres por extracción de masa.

La Figura 7 compara la información de 1 H-15N HSQC (Coherencia Cuántica Única Heteronuclear, según su sigla en inglés) de producto para un péptido sintético (NH2-IVQCR-COOH), que mostró que faltaba una correlación de NH de Cys en la muestra de producto.

La Figura 8 muestra la estructura propuesta confirmada por nOe fuerte observada entre el CH de Cys y el NH de arginina.

Sobre la base de los datos de RMN recogidos, la estructura propuesta del aducto marrón se presenta en la Figura 9.

La Figura 10 muestra la vía de biosíntesis en células procariotas para la elaboración de menaquinonas.

La Figura 11 muestra un producto recombinado de volumen filtrado representativo evaluado para la formación de aducto marrón por la cromatografía de intercambio iónico a 310 nm, y no mostró formación de aducto mensurable.

La Figura 12 muestra un esquema ejemplar de los mejoramientos de proceso de Hi-dO implementados alrededor de las operaciones de cosecha.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN I. DEFINICIONES.

A menos que se establezca lo contrario, los siguientes términos y frases, tal como se utilizan en la presente solicitud, tienen el propósito de tener los siguientes significados.

El término "índice de agitación" significa la mezcla del caldo de cultivo o del homogenado, que, habitualmente, se mide como revoluciones por minuto (r. p. m.). En una forma de realización, el índice de agitación puede medirse por la "potencia por unidad de volumen". Por ejemplo, a 200 r. p. m. en un fermentador de 1000 litros, el índice de agitación tiene un valor de aproximadamente 6 vatios/l.

El término "anticuerpo", en la presente solicitud, se usa en el sentido más amplio, y cubre, específicamente, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada. Los anticuerpos pueden ser murinos, humanos, humanizados, quiméricos, o derivados de otra especie. El término "anticuerpo", tal como se usa en la presente solicitud, además se refiere a una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir, una molécula que contiene un sitio de unión de antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de un blanco de interés o una de sus partes, donde dichos blancos incluyen, sin limitación, células cancerosas o células que producen anticuerpos autoinmunitarias asociados con una enfermedad autoinmunitaria. La inmunoglobulina revelada en la presente solicitud puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), clase (por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2) o subclase de moléculas de inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas pueden derivar de cualquier especie. Sin embargo, en un aspecto, la inmunoglobulina es de origen humano, murino, o de conejo.

Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, en general, su región variable o de unión de antígeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; fragmentos producidos por una genoteca de expresión Fab, anticuerpos antiidiotípicos (anti-ld), CDR (regiones determinantes de complementariedad, según su sigla en inglés), ECD (dominio extracelular, según su sigla en inglés) y fragmentos de unión de epítopo de cualquiera de los anteriores, que se unen inmunoespecíficamente a antígenos de células cancerosas, antígenos virales o antígenos microbianos, moléculas de anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

El "Ensayo de claridad, opalescencia y coloración (COC)" se define como el uso de tubos de ensayo idénticos de vidrio incoloro, transparente y neutro, con una base llana y un diámetro interno de 15-25 mm, a fin de comparar el líquido por ser analizado, con una suspensión de referencia recién preparada como se describe a continuación, donde la profundidad de la capa es de 40 mm. Pueden usarse las soluciones de color modelos citadas en la Farmacopea de los Estados Unidos 2012 (USP Monograph 631, Color and Achromicity) (Monografía USP 631 , Color y Acromicidad) o en la Farmacopea Europea 5.0 (EP Method 2.2.2, Degree of Coloration of Liquids) (Método EP 2.2.2, Grado de Coloración de Líquidos) para la confirmación de la asignación de color apropiada.

El término "1,4-dihidroxi-2-naftoato (DHNA)" es un producto químico derivado de células de E. coli. Okada, Y., Tsuzuki, Y., Miyazaki, J., Matsuzaki, K., Hokari, R., Komoto, S., et al. (2006) Gut, 55: 681-8. DHNA es un intermediario en la vía de biosíntesis de menaquinona (MK), también conocida como vitamina K2, de células de E. coli. Neidhardt, F. C. (2010), Escherichia coli and Salmonella (online versión: Module 3.2.2 pp. 36-37); Inledew, W. J. & R. K. Poole (1984), "The respiratory chains of Escherichia coli". Microbiological reviews., 48: 222-271 ; Nowicka, B. & J. Cruk (2010), "Occurrence, Biosynthesis and Function of Isoprenoid Quiñones". Biochimica et Biophysica Acta, 1797: 1587-1605.

El término "oxígeno disuelto" (d02) es una medida relativa de la cantidad de oxígeno disuelta o portada en un medio determinado. Puede medirse con una sonda de oxígeno disuelto, tal como un sensor de oxígeno en medios líquidos.

El término "fermento" o "de fermentación", tal como se usa en la presente solicitud, significa el proceso de cultivo de células huéspedes procariotas que han sido transformadas a fin de inducir la producción de una proteína recombinada de interés.

El término "volumen filtrado" o "sustancia de volumen filtrado (FBS)" significa el producto de proteína recombinada de interés luego de la cosecha y la purificación, donde la proteína ha sido liberada de la célula huésped, centrifugada y/o filtrada de modo de eliminar cualquier resto celular, purificada sobre columnas de cromatografía adecuadas, y posteriormente concentrada por un proceso de filtración.

El término "fluido de cultivo celular cosechado", también representado como HCCF, significa fluido de cultivo celular procarioto o eucarioto del cual se han eliminado las células, por medios que incluyen la centrifugación o la filtración. El cultivo de células es el proceso por el cual se cultivan células procariotas o eucariotas, en condiciones controladas. El término "cultivo celular" o "cultivo de células" se refiere al cultivo de células derivadas de eucariotos multicelulares, que incluyen células de animales o procariotos monocelulares, que abarcan bacterias y levaduras. Los cultivos de células eucariotas incluyen células mamíferas tales como células de ovario de hámster chino, hibridomas y células de insectos. Con un recipiente de cultivo celular apropiado, pueden obtenerse proteínas secretadas de células dependientes del anclaje o estirpes celulares de suspensión. Los cultivos celulares mamíferos incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) o células NSO.

El término Operaciones de cosecha" o "cosecha" significa, sin limitación, un proceso que comprende la lisis u homogeneización, y luego, la centrifugación y/o filtración de un cultivo celular huésped procarioto fermentado, que se ha transformado de manera de producir una proteína recombinada de interés, a fin de comenzar el aislamiento y la purificación de dicha proteína de interés.

El término "Hi-dO", como se usa en la presente solicitud, se refiere a un proceso mejorado, como se describe en la presente solicitud, que es el mantenimiento de un nivel de oxígeno disuelto superior a 0% durante las operaciones de cosecha. Para lograr este objetivo, la presente invención contempla una combinación de aire extendido, presión inversa e índice de agitación que puede usarse para mantener el nivel de d02 en un punto establecido, o sobre dicho punto, es decir, superior a 0%, o a aproximadamente 30% a alrededor de 75%, o en niveles superiores a 75%, o a alrededor de 50%, o en niveles superiores a 50%. En otra forma de realización, los expertos en la técnica además podrán rociar aire u oxígeno puro en el caldo directamente, a fin de lograr Hi-dO de niveles de oxígeno disuelto superiores a 0%.

El término "homogeneización", tal como es utilizado en la presente solicitud, significa un proceso de lisado o de lisis celular mecánica de células huéspedes procariotas, transformadas con una proteína recombinada de interés a fin de liberar dicha proteína de la célula huésped.

El término "mayor presión inversa" se usa para aumentar el índice de transferencia de oxígeno a través del caldo de cultivo. La presión inversa habitualmente se mide en psi o bar.

"Menaquinonas (MK)" son homólogos de vitamina K2, y sirven como moléculas de lanzamiento de electrones en la cadena respiratoria entre complejos de proteínas ligados a membrana en condiciones microaeróbicas y/o anaeróbicas. El término "rnenE' es un gen en la vía de la biosíntesis para la elaboración de menaquinonas.

El término "fermentación microbiana" significa el cultivo celular de bacterias o levaduras genéticamente diseñado para producir proteínas y moléculas pequeñas (por ejemplo, metabolitos secundarios). La fermentación se usa para propagar levaduras y bacterias recombinadas, al igual que otros microorganismos, y producir proteínas de valor. La productividad celular y el crecimiento de estos organismos son maximizados mediante el suministro de medios de crecimiento particulares y el control de diversos factores ambientales (como el pH, la temperatura y la aireación). El fluido de fermentación bacteriana puede derivar de cultivos de E. coli.

El término "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en la presente solicitud, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos; es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto posibles mutaciones naturales que pueden presentarse en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son convenientes, en términos de que pueden ser sintetizados sin contaminación por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, en términos de ser obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe ser interpretado como la necesidad de la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales por ser usados de acuerdo con la presente invención pueden prepararse por el método de hibridoma descripto por primera vez por Kohler et al. (1975) Nature, 256: 495, o pueden prepararse por métodos de ADN recombinado (Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de genotecas de anticuerpos de fagos, usando las técnicas que se describen, por ejemplo, en las referencias de Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks eí a/ (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597.

El término "aire extendido" significa aire soplado desde la parte superior del fermentador que contiene el caldo de cultivo. Habitualmente, se suministra oxígeno a un fermentador mediante el burbujeo de aire a través del medio de cultivo líquido, a menudo, acompañado de agitación vigorosa a fin de efectuar una dispersión de burbujas fina.

El término "célula huésped procariota", como se usa en la presente invención, abarcará aquellas células que utilizan la vía de biosíntesis de menaquinona. En una forma de realización, las células huéspedes procariotas abarcan, por ejemplo, Archaebacteria y Eubactería, tales como organismos gram-negativos o gram-positivos. Ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli), Bacilli (por ejemplo, B. subtilis), especies de Enterobacteria, Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, o Paracoccus. En una forma de realización, se usan células gram-negativas. En otra forma de realización, se usan células de E. coli como huéspedes para la invención (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D. C: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; Depósito ATCC Nro. 27.325) y sus derivados, que incluyen la cepa 33D3 que tiene el genotipo W31 0 AfhuA (AtonA) ptr3laclqlacL8 AompT A(nmpC-fepE) degP41 kanR (Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.639.635). Naturalmente, otras cepas y sus derivados, tales como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E. coli 1776 (ATCC 31.537) y E. coli RV308 (ATCC 31.608) son también adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos, y no limitativos. Los métodos para la construcción de derivados de cualquiera de las bacterias mencionadas con anterioridad que tienen genotipos definidos son conocidos en la técnica, y son descriptos, por ejemplo, en la referencia de Bass er a/. (1990), Proteins, 8: 309-314. Naturalmente, es necesario seleccionar las bacterias apropiadas considerando la capacidad de replicación del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, adecuadamente, pueden usarse especies de E. coli, Serratia o Salmonella como huéspedes, cuando se usan plásmidos bien conocidos, tales como pBR322, pBR325, pACYC177, o pKN410 para suministrar el replicón.

Tal como se usa en la presente solicitud, una "proteína recombinada" se refiere, generalmente, a péptidos y proteínas, que incluyen anticuerpos. Dichas proteínas recombinadas son "heterólogas", es decir, extrañas respecto de la célula huésped utilizada, tal como una proteína humana producida por E. coli. El pollpéptido puede ser producido como un agregado insoluble o como un polipéptido soluble en el espacio periplásmico o citoplasma.

El término "independiente de la escala" significa que la capacidad de volumen del proceso de fermentación de la presente invención puede lograrse usando cualquier escala, por ejemplo, de alrededor de 1 litro o más, o alrededor de 10 litros o más, o alrededor de 100 litros o más, o alrededor de 500 litros o más, o alrededor de 1000 litros o más, o alrededor de 10.000 litros o más, o alrededor de 100.000 litros o más.

II. MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN.

La presente invención se refiere a métodos mejorados de producción recombinada de proteínas en un sistema procarioto. La invención se basa en la prevención de la formación de un aducto marrón descubierto durante la elaboración de una proteína recombinada, lo que causó que ciertos lotes del producto no cumplieran con las especificaciones. Como se ilustra en los ejemplos proporcionados en la presente solicitud, el problema del aducto marrón fue la consecuencia de un potencial redox (reducción-oxidación) no uniforme durante las operaciones de cosecha. Ahora se ha descubierto, de manera sorprendente, que la formación del aducto marrón puede ser evitada mediante el mantenimiento de un entorno de oxígeno disuelto superior a cero, durante las operaciones de cosecha; alternativamente, mediante la deleción genética del gen menE en el genoma de la célula huésped procariota utilizada para la producción recombinada de la proteína recombinada de interés.

Producción recombinada de proteínas recombinadas en células procariotas. En la primera etapa de los procesos mencionados, el ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) empleado para producir la proteína recombinada de interés es adecuadamente insertado en un vector replicable para la expresión en la bacteria bajo el control de un promotor adecuado para bacterias. Pueden obtenerse muchos vectores para este propósito, y la selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico por ser insertado en el vector y la célula huésped particular por ser transformada con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, conforme a su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y la célula huésped particular con la cual es compatible. Los componentes del vector para la transformación bacteriana pueden incluir una secuencia de señal para el polipéptido heterólogo, e incluirán una secuencia de señal y también incluirán un promotor inducible para el polipéptido heterólogo. Además, en general, incluyen un origen de replicación y uno o más genes marcadores, descriptos en la presente solicitud.

Si el polipéptido heterólogo debe ser secretado, el ADN que codifica el polipéptido heterólogo de interés en la presente solicitud contiene una secuencia de señal, tal como una en el término N del polipéptido heterologo maduro. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN del polipéptido heterologo que se inserta en el vector. La secuencia de señal heteróloga seleccionada debe ser aquella reconocida y procesada (es decir, disociada por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para células huéspedes bacterianas que no reconocen ni procesan la secuencia de señal de polipéptido heterologo nativa, la secuencia de señal es sustituida por cualquier secuencia de señal bacteriana comúnmente conocida.

Los vectores de expresión contienen una secuencia de ácido nucleico que permite la replicación del vector en una o más células huéspedes seleccionadas. Dichas secuencias son bien conocidas para una diversidad de bacterias. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gram-negativas.

Los vectores de expresión además contienen, generalmente, un gen de selección, también denominado un marcador de selección. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células huéspedes transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huéspedes no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes decisivos que no pueden obtenerse de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza una droga para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son exitosamente transformadas con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármacos y, en consecuencia, sobreviven al régimen de selección.

El vector de expresión para la producción de un polipéptido heterólogo además contiene un promotor inducible que es reconocido por el organismo bacteriano huésped y está funcionalmente ligado al ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo de interés. Además contiene un promotor separado inducible o de baja expresión basal funcionalmente ligado al ácido nucleico que codifica las enzimas líticas. Los promotores inducibles adecuados para el uso con huéspedes bacterianos incluyen los sistemas de promotores de .beta.-lactamasa y lactosa (Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281 : 544 (1979)), el sistema de promotor de arabinosa, que incluye el promotor de araBAD (Guzman et al., J. Bacterio!., 174: 7716-7728 (1992); Guzman et al., J. Bacteriol., 177: 4121-4130 (1995); Siegele and Hu, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94: 8168-8172 (1997)); el promotor de rhamnosa (Haldimann et al., J. Bacteriol., 180: 1277-1286 (1998)); el promotor de fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (? ) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 ( 980) y EP 36.776); los promotores de P.sub.LtetO-1 y P.sub.lac/are-1 (Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res., 25: 1203-1210 (1997)), y promotores híbridos tales como el promotor tac, deBoer ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983). Sin embargo, son adecuados otros promotores inducibles bacterianos y promotores de baja expresión basal conocidos. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, a fin de permitir al experto en la técnica su ligación funcional al ADN codificador del polipéptido heterólogo de interés o a los ácidos nucleicos que codifican enzimas líticas (Siebenlist et al.., Cell, 20: 269 (1980)), usando conectores o adaptadores para el suministro de cualquier sitio de restricción requerido. Si se utiliza un promotor fuerte y altamente permeable, tal como el promotor trp, generalmente se usa solo para la expresión del ácido nucleico codificador del polipéptido heterólogo, y no para el ácido nucleico codificador de la enzima lítica. Los promotores tac y PL podrían usarse para cualquiera de los dos, pero no para ambos. En una forma de realización, se usa el promotor de fosfatasa alcalina {phoA) para el producto, y el promotor de arabinosa (ara), para las enzimas líticas.

Los promotores para el uso en sistemas bacterianos, además, en general, contienen una secuencia de Shine-Dalgarno (SD) funcionalmente ligada al ADN codificador del polipéptido heterólogo de interés. El promotor puede ser eliminado del ADN de fuente bacteriana por medio de la digestión de enzimas de restricción, e insertado en el vector que contiene el ADN deseado. El promotor de phoA puede ser removido del ADN de fuente bacteriana por medio de la digestión de enzimas de restricción, e insertado en el vector que contiene el ADN deseado.

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes citados anteriormente emplea técnicas de ligación convencionales comúnmente conocidas por el experto en la materia. Se disocian plásmidos aislados o fragmentos de ADN, se adaptan y se ligan nuevamente, en la forma deseada para la generación de los plásmidos requeridos.

Las células huéspedes procariotas adecuadas para la invención reivindicada incluyen cualquiera que utilice la vía de biosíntesis para la elaboración de menaquinonas, como se define en la presente solicitud. Algunos ejemplos no limitativos pueden incluir, por ejemplo, Escheríchia coli (E. coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla y Paracoccus.

La transformación significa la introducción de ADN en el huésped procarioto, de modo que el ADN sea replicable, ya sea como un elemento extracromosómico, ya sea como un integrante cromosómico. De acuerdo con la célula huésped utilizada, la transformación se realiza usando técnicas convencionales apropiadas para dichas células. En general, se usa el tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio, para células bacterianas que contienen barreras sustanciales de paredes celulares. Otro método para la transformación emplea polietilenglicol/DMSO. Aun otra técnica utilizada es la electroporación.

Las células procariotas utilizadas para la producción de los polipéptidos de la invención se cultivan en medios conocidos en la técnica, y adecuados para el cultivo de las células huéspedes seleccionadas. Ejemplos de medios adecuados incluyen el caldo de Luria-Bertani (LB) más suplementos de nutrientes necesarios. En ciertas formas de realización, el medio además contiene un agente de selección, seleccionado sobre la base de la construcción del vector de expresión, a fin de permitir de manera selectiva el crecimiento de células procariotas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, se agrega ampicilina al medio para el crecimiento de células que expresan el gen de resistencia a ampicilina. Puede incluirse también cualquier suplemento necesario además de fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico, en concentraciones apropiadas introducidas solas o como una mezcla con otro suplemento o medio, tal como una fuente de nitrógeno compleja.

Para la acumulación de un producto génico expresado, la célula huésped se cultiva en condiciones suficientes para la acumulación del producto génico. Dichas condiciones incluyen, por ejemplo, las condiciones de temperatura, nutrientes y densidad celular que permiten la expresión de proteína y su acumulación por la célula. Además, dichas condiciones son aquellas en las cuales la célula puede realizar funciones celulares básicas de transcripción, traducción y pasaje de proteínas de un compartimiento celular a otro, para las proteínas secretadas, como son conocidas por los expertos en la técnica.

Las células huéspedes procariotas son cultivadas a temperaturas adecuadas. Para el cultivo de E. coli, por ejemplo, los rangos típicos de temperatura son de alrededor de 20°C a alrededor de 39°C. En una forma de realización, la temperatura es de alrededor de 25°C a alrededor de 37°C. En otra forma de realización, la temperatura es de alrededor de 30°C.

El pH del medio de cultivo puede ser cualquier pH de alrededor de 5-9, de acuerdo, principalmente, con el organismo huésped. Para E. coli, el pH es de alrededor de 6,8 a alrededor de 7,4, o alrededor de 7,0.

Para la inducción, habitualmente, las células son cultivadas hasta lograr una cierta densidad óptica, por ejemplo, una A550 de alrededor de 80—100, en cuyo momento, se inicia la inducción (por ejemplo, mediante la adición de un inductor, mediante el agotamiento de un represor, supresor, o componente del medio, etc.) a fin de inducir la expresión del gen que codifica el polipéptido heterólogo.

Luego de la acumulación de producto, opcionalmente, antes de la recuperación de producto, el lisado del caldo se incuba durante un período de tiempo suficiente para liberar el polipéptido heterólogo contenido en las células. En una forma de realización alternativa, o posterior a la precedente, las células presentes en el cultivo pueden lisarse en forma mecánica, usando cualquier medio mecánico conocido en la técnica, que puede incluir, por ejemplo, la lisis química o el choque osmótico, a fin de liberar dicha proteína de la célula huésped.

Una vez producida la lisis, el lisado u homogenado puede transferirse a un tanque de mantenimiento, donde puede aguardar la adición de más lotes de lisado/homogenado, y/o donde puede realizarse el procesamiento adicional, por ejemplo, la dilución con agua, la adición de reguladores o floculantes, el ajuste del pH, o la alteración o el mantenimiento de la temperatura del lisado/homogenado en la preparación para las posteriores etapas de recuperación.

En una etapa posterior, el polipéptido heterólogo, como un producto soluble o insoluble liberado de la matriz celular, es recuperado del lisado, u homogenado, de una manera que minimice la recuperación conjunta de restos celulares con el producto. La recuperación puede realizarse por cualquier medio, si bien, en una forma de realización, puede comprender la sedimentación de partículas refractivas que contienen el polipéptido heterólogo, o la recolección del sobrenadante que contiene producto soluble. Un ejemplo de sedimentación es la centrifugación. En este caso, la recuperación tiene lugar antes de la adsorción de lecho expandido (EBA, según su sigla en inglés) o la sedimentación, en presencia de un agente que interrumpe la pared celular externa a fin de incrementar la permeabilidad y permitir la recuperación de una mayor cantidad de sólidos. Ejemplos de dichos agentes incluyen un agente quelante tal como ácido acetilendiaminatetraacético (EDTA), o un zwitterión tal como un detergente iónico dipolar como el detergente ZWITTERGENT 316™. En una forma de realización, la recuperación tiene lugar en presencia de EDTA.

Si se emplea la centrifugación para la recuperación, la fuerza centrífuga relativa (RCF, según su sigla en inglés) es un importante factor. La RCF se ajusta de manera de minimizar la sedimentación conjunta de restos celulares con las partículas refractivas liberadas de la pared celular en la lisis. La RCF específica utilizada para este propósito variará, por ejemplo, con el tipo de producto por ser recuperado, si bien es de por lo menos alrededor de 3000 x g, más preferentemente, alrededor de 3500-6000 x g, o alrededor de 4000-6000 x g.

La duración de la centrifugación dependerá de varios factores. El índice de sedimentación dependerá, por ejemplo, del tamaño, la forma y la densidad de la partícula refractiva y de la densidad y viscosidad del fluido. El tiempo de la sedimentación para los sólidos dependerá, por ejemplo, del índice y la distancia de sedimentación. Es razonable esperar que las centrífugas continuas de discos apilados funcionen bien para la recuperación de los agregados de polipéptido heterólogo liberados, o para la eliminación de restos celulares en gran escala, ya que estas centrífugas pueden procesar a altas velocidades de fluido debido a su fuerza centrífuga relativamente grande y la distancia de sedimentación relativamente pequeña.

El polipéptido heterólogo capturado en la etapa de recuperación inicial puede entonces ser adicionalmente purificado de la proteína contaminante. En una forma de realización, el polipéptido heterólogo agregado es aislado, y luego se realiza una solubilización y replegado del polipéptido simultáneos como se describe en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.288.931. Alternativamente, el producto soluble es recuperado por medio de técnicas convencionales, como se describe a continuación.

Los métodos cromatográficos generales y su uso son conocidos por el experto en la técnica. Ver, por ejemplo, Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentáis and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification Principies and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; o Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wíley & Sons, Inc., New York. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados para el polipéptido heterólogo soluble liberado del periplasma o del citoplasma, y son bien conocidos en la técnica: fraccionación sobre columnas de intercambio iónico o inmuno-afinidad; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; cromatofocalización; SDS-PAGE (electroforesis de gel de poliacrilamida y dodecil sulfato de sodio, según su sigla en inglés); precipitación de sulfato de amonio; y filtración de gel usando, por ejemplo, SEPHADEX™ G-75.

En un aspecto de la invención, la producción de anticuerpo se conduce en gran cantidad, por medio de un proceso de fermentación. Pueden obtenerse diversos procedimientos de fermentación de alimentación de lotes de gran escala, para la producción de proteínas recombinadas. Las fermentaciones de gran escala tienen por lo menos 1000 litros de capacidad, preferentemente, alrededor de 1000 a 100.000 litros de capacidad. Estos termentadores utilizan propulsores agitadores para distribuir oxígeno y nutrientes, en especial, glucosa (la fuente preferida de carbono/energía). La fermentación de pequeña escala se refiere generalmente a la fermentación en un fermentador que no tiene más de aproximadamente 20 litros de capacidad volumétrica.

Como se describe en la presente solicitud, la invención reivindicada puede usarse para la producción de proteínas recombinadas, que incluyen, por ejemplo, péptidos y proteínas, que incluyen anticuerpos.

Ejemplos de péptidos y proteínas recombinados que pueden producirse con el método de la invención incluyen, sin limitación, moléculas tales como renina, una hormona de crecimiento, que incluye la hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento bovina, factor de liberación de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante tiroidea; lipoproteínas; a1-antitripsina; insulina cadena A; insulina cadena B; proinsulina; trombopoyetina; hormona folículoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, factor de tejido y factor de von Willebrands; factores anticoagulantes, tales como proteína C; factor natriurético atrial; surfactante pulmonar; un activador de plasminógeno tal como activador de plasminógeno de tipo tejido (t-PA), u orina humana o uroquinasa; bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; una albúmina sérica tal como albúmina sérica humana; sustancia inhibitoria mulleriana; relaxina cadena A; relaxina cadena B; prorrelaxina; péptido asociado con gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, según su sigla en inglés); receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoideos; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, según su sigla en inglés), neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-ß; cardiotrofinas (factor de hipertrofia cardíaca) tal como cardiotrofina-1 (CT-1); factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, según su sigla en inglés); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF, según su sigla en inglés); factor de crecimiento de transformación (TGF, según su sigla en inglés) tal como TGF-alfa y TGF-beta, que incluyen TGF-ß? , TGF- 2, TGF- 3, TGFH34, o TGF-ßd; factor de crecimiento de tipo insulina I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-l (IGF-I cerebral), proteínas de unión de factor de crecimiento de tipo insulina; proteínas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP, según su sigla en inglés); un interferón tal como interferón-alfa, -beta y -gamma; factores estimulantes de colonias (CSF, según su sigla en inglés), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleuquinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-13; anticuerpo anti-HER-2; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana de superficie; factor acelerante de la descomposición; antígeno viral, tal como una porción de la membrana del virus del sida; proteínas de transporte; receptores de homing; adresinas; proteínas reguladoras.

Los anticuerpos producidos por la invención reivindicada pueden ser anticuerpos monoclonales que son poblaciones homogéneas de anticuerpos respecto de un determinante antigénico particular (por ejemplo, un antígeno de célula cancerosa, un antígeno viral, un antígeno microbiano, una proteína, un péptido, un carbohidrato, un agente químico, un ácido nucleico, o sus fragmentos). Un anticuerpo monoclonal (MAb, según su sigla en inglés) para un blanco de interés puede prepararse usando cualquier técnica conocida en el campo, que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por estirpes celulares continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, sin limitación, la técnica de hibridoma originalmente descripta por Kóhler y Milstein (1975), Nature, 256: 495-497); la técnica de hibridoma de célula B humanas (Kozbor et al., (1983) Immunology Today 4: 72) y la técnica de hibridoma de EBV (Colé et al. (1985) en Monoclonal antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, que incluye IgG, IgM, IgE, IgA e IgD y cualquiera de sus subclases. El hibridoma productor de los MAb para el uso en esta invención puede cultivarse in vitro o in vivo.

Los anticuerpos monoclonales útiles incluyen, sin limitación, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados, fragmentos de anticuerpos, o anticuerpos monoclonales quiméricos de humano-ratón (u otras especies). Los anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse por cualquiera de numerosas técnicas conocidas en el campo (Teng ef al. (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A, 80: 7308-7312; Kozbor et al. (1983) Immunology Today, 4: 72-79; y Olsson ef al. (1982) Methods in Enzymology, 92: 3-16).

El anticuerpo además puede ser un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos pueden tener una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida, con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena liviana de inmunoglobulina híbridas (que proporciona una segunda especificidad de unión), en el otro brazo. Esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado, de combinaciones de cadenas de inmunoglobulinas indeseadas, ya que la presencia de una cadena liviana de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación (WO 94/04690; Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology, 121 : 210; Rodrigues ef al. (1993) J. of Immunology, 151 : 6954-6961; Cárter et al. (1992) Bio Technology 10: 163-167; Cárter ef al (1995), J. of Hematotherapy, 4: 463-470; Merchant et al. (1998) Nature Biotechnology, 16: 677-681. Los métodos para la elaboración de anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica (Milstein et a/ (1983) Nature, 305: 537-539; WO 93/08829; Traunecker et al. (1991) EMBO J. 10: 3655-3659. Mediante la utilización de dichas técnicas, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos para la conjugación como un conjugado de fármaco y anticuerpo (ADC, según su sigla en inglés), en el tratamiento o la prevención de enfermedades como se define en la presente solicitud.

El anticuerpo, tal como es definido, puede ser un fragmento funcionalmente activo, un derivado u análogo de un anticuerpo que se une de manera inmunoespecífica a antígenos de células cancerosas, antígenos virales, o antígenos microbianos, u otros anticuerpos ligados a matriz o células tumorales. En este sentido, el término "funcionalmente activo" significa que el fragmento, derivado o análogo es capaz de producir anticuerpos anti-anti-idiotípicos que reconocen el mismo antígeno que el anticuerpo del cual deriva el fragmento, derivado o análogo reconocido. Específicamente, en una forma de realización ejemplar, la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina puede aumentarse mediante la deleción de secuencias de marco y CDR que son C-terminales con respecto a la secuencia CDR que reconoce de manera específica el antígeno. A fin de determinar las secuencias CDR que se unen al antígeno, pueden usarse péptidos sintéticos que contienen las secuencias CDR, en ensayos de unión con el antígeno, por cualquier método de ensayo de unión conocido en la técnica, por ejemplo, el ensayo de BIA core (Kabat et al. (1991) en Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.; Kabat et al. (1980) J. of Immunology, 125(3): 961-969).

Otros anticuerpos útiles incluyen fragmentos de anticuerpos tales como, sin limitación, fragmentos F(ab')2, que contienen la región variable, la región constante de cadena liviana y el dominio CH1 de la cadena pesada, que pueden producirse mediante la digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo, y fragmentos Fab, que pueden generarse mediante la reducción de los puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Otros anticuerpos de utilidad son dímeros de cadena pesada y de cadena liviana de anticuerpos, o cualquiera de sus fragmentos mínimos, tales como Fv o anticuerpos de cadena única (SCA, según su sigla en inglés) (por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.946.778; y en las referencias de Bird (1988), Science, 242: 423-42; Huston et al., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 85: 5879-5883; y Ward et al. (1989) Nature, 334: 544-54), o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo.

El anticuerpo puede ser una proteína de fusión de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionalmente activos, por ejemplo, donde el anticuerpo se fusiona por medio de un enlace covalente (por ejemplo, un enlace péptido), o bien en el término N o en el término C, a una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o una de sus porciones, por ejemplo, una porción de por lo menos 10, 20 o 50 aminoácidos de la proteína) que no es el anticuerpo. El anticuerpo o su fragmento puede ligarse covalentemente a la otra proteína en el término N del dominio constante.

Los anticuerpos monoclonales en la presente solicitud incluyen, específicamente, anticuerpos "quiméricos", en los cuales una porción de la cadena pesada y/o de la cadena liviana es idéntica u homologa a correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clases o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de las cadenas son idénticas u homologas a correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clases o subclase de anticuerpo, al igual que fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.816.567; y la referencia de Morrison er a/. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 81 : 6851-6855). Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones derivan de diferentes especies de animales, tales como aquellos anticuerpos que tienen una región variable derivada de anticuerpo murino monoclonal y regiones constantes de inmunoglobulina humana (Patentes de los Estados Unidos de América Nros. 4.816.567; 4.816.397). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos "primatizados", que comprenden secuencias de unión de antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del viejo mundo, simio, etc.) y secuencias de región constante humanas.

Los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto porciones humanas como no humanas, pueden prepararse empleando técnicas convencionales de ADN recombinado (WO 87/02671 ; EP 184.187; EP 171.496; EP 173.494; WO 86/01533; Patente de los Estados Unidos de América Nro. 4.816.567; EP 12.023; Berter ef al. (1988) Science, 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Cáncer. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature, 314: 446-449; y Shaw eí al. (1988) J. Nati. Cáncer Inst. 80: 1553-1559; Morrison (1985) Science, 229: 1202-1207; Oi et al. ( 986) BioTechniques, 4: 214; Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.225.539; Jones eí al. (1986) Nature, 321 : 552-525; Verhoeyan eí al. (1988) Science, 239: 1534; y Beidler eí al. (1988), J. Immunol., 141: 4053-4060; cada una de las cuales se incorpora en la presente solicitud a modo de referencia, en su totalidad.

Los anticuerpos monoclonales terapéuticos que pueden ser producidos por los métodos de la invención incluyen, sin limitación, trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., Cárter eí al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 89: 4285-4289; Patente de los Estados Unidos Nro. 5.725.856); anticuerpos anti-CD20 tales como anti-CD20 quimérico "C2B8" (Patente de los Estados Unidos Nro. 5.736.137); rituximab (RITUXAN®), ocrelizumab, una variante quimérica o humanizada del anticuerpo 2H7 (Patente de los Estados Unidos Nro. 5.721.108; WO 04/056312) o tositumomab (BEXXAR®); anti-IL-8 (St John eí al. (1993) Chest, 103: 932, y WO 95/23865); anticuerpos que se dirigen a otras interleuquinas, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL— 13; anticuerpos anti-VEGF que incluyen anticuerpos anti-VEGF humanizados y/o madurados por afinidad, tales como el anticuerpo humanizado anti-VEGF huA4.6.1 bevacizumab (AVASTIN®, Genentech, Inc., Kim et al. (1992) Growth Factors, 7: 53-64, WO 96/30046, WO 98/45331); anticuerpos anti-PSCA (antígeno de célula madre prostético, según su sigla en inglés) (WO 01/40309); anticuerpos anti-CD40, que incluyen S2C6 y sus variantes humanizadas (WO 00/75348); anti-CD11a (Patente de los Estados Unidos Nro. 5.622.700; WO 98/23761; Steppe ef al. (1991) Transplant Intl. 4:3-7; Hourmant et al. (1994) Transplantation 58: 377-380); anti-lgE (Presta et al. (1993) J. Immunol. 151 : 2623-2632; WO 95/19181); anti-CD18 (Patente de los Estados Unidos Nro. 5.622.700; WO 97/26912); anti-lgE, que incluye E25, E26 y E27 (Patentes de los Estados Unidos de América Nros. 5..714.338; 5.091.313; WO 93/04173; Patente de los Estados Unidos Nro. 5.714.338); anticuerpo de receptor anti-Apo-2 (WO 98/51793); anticuerpos anti-TNF-alfa que incluyen cA2 (REMICADE®), CDP571 y MAK-195 (Patente de los Estados Unidos Nro. 5.672.347; Lorenz et al. (1996) J. Immunol. 156 (4): 1646-1653; Dhainaut er a/. (1995) Crit. Care Med. 23 (9): 1461-1469); factor antitisular (TF, según su sigla en inglés) (EP 0 420 937 B1); alfa 4 beta 7 integrina antihumana (WO 98/06248); anti-EGFR, anticuerpo 225 quimerizado o humanizado (WO 96/40210); anticuerpos anti-CD3 tales como OKT3 (Patente de los Estados Unidos Nro. 4.515.893); anticuerpos anti-CD25 o anti-tac tales como CHI-621 SIMULECT® y ZENAPAX® (Patente de los Estados Unidos Nro. 5.693.762); anticuerpos anti-CD4 tales como el anticuerpo cM-7412 (Choy et al. ( 996) Arthritis Rheum., 39 (1): 52-56); anticuerpos anti-CD52 tales como CAMPATH-1H (Riechmann er a/. (1988) Nature, 332: 323-337); anticuerpos antirreceptor Fe tales como el anticuerpo M22 dirigido contra Fe gamma Rl, como en la referencia de Graziano et al. (1995), J. Immunol. 155 (10): 4996-5002; anticuerpos antiantígeno carcinoembriogénico (CEA, según su sigla en inglés) tales como hMN-14 (Sharkey et al. (1995) Cáncer Res., 55 (23 Supl.): 5935s- 5945s; anticuerpos dirigidos contra células epiteliales mamarias que incluyen huBrE-3, hu-Mc 3 y CHL6 (Ceriani et al. (1995) Cáncer Res. 55 (23): 5852s-5856s; y Richman ef al. (1995) Cáncer Res. 55 (23 Sup.): 5916s-5920s); anticuerpos que se unen a células de carcinoma de colon tales como C242 (Litton et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26 (1): 1-9); anticuerpos anti-CD38, por ejemplo, AT 13/5 (Ellis et al. (1995) J. Immunol. 155 (2): 925-937); anticuerpos anti-CD33 tales como Hu M195 (Jurcic et al. (1995) Cáncer Res., 55 (23 Supl.): 5908s-5910s y CMA-676 o CDP771; anticuerpos anti-CD22 tales como LL2 o LymphoCide (Juweid et al. (1995) Cáncer Res., 55 (23 Supl.): 5899s-5907s); anticuerpos anti-EpCAM tales como 17-1A (PANOREX®); anticuerpos anti-Gpllb/llla tales como abciximab o c7E3 Fab (REOPRO®); anticuerpos anti-RSV tales como MEDI-493 (SYNAGIS®); anticuerpos anti-CMV tales como PROTOVIR®); anticuerpos anti-HIV tales como PR0542; anticuerpo contra la hepatitis tales como el anticuerpo anti-Hep B OSTAVIR®); anticuerpo anti-CA 125 OvaRex; anticuerpo anti-idiotípico GD3 BEC2; anticuerpo anticarcinoma de célula renal humana tal como ch-G250; ING-1; anticuerpo anti-17-1A humano (3622W94); anticuerpo antitumor colorrectal humano (A33); anticuerpo antimelanoma humano R24 dirigido contra gangliosida GD3; anticuerpo anticarcinoma de célula escamosa humano (SF-25); y anticuerpos antiantígeno leucocitario humano (HLA, según su sigla en inglés) tales como Smart ID10 y el anticuerpo anti-HLA DR Oncolym (Lym-1).

III. MÉTODOS Y ENSAYOS.

MÉTODOS/ENSAYOS ANALÍTICOS.

Ensayo de claridad, opalescencia y coloración (COC).

El grado de opalescencia además puede determinarse mediante la medición instrumental de la luz absorbida o diseminada como representaciones de heterogeneidades de densidad óptica submicroscópica de suspensiones y soluciones opalescentes. Dichas técnicas son la nefelometría y la turbidimetría. Para la medición de turbiedad de muestras coloreadas, se usan la turbidimetría de relación y la nefelometría con relación seleccionada. El efecto de diseminación de luz de partículas suspendidas puede medirse mediante la observación de o bien la luz transmitida (turbidimetría) o la luz diseminada (nefelometría). La turbidimetría de relación combina los principios de la nefelometría y de la turbidimetría. La turbidimetría y la nefelometría son útiles para la medición de suspensiones levemente opalescentes. Deben usarse suspensiones de referencia producidas en condiciones bien definidas. Las soluciones de color convencionales se citan en la Farmacopea de los Estados Unidos 2012 (Monografía USP 631, Color y Acromicidad), o en la Farmacopea Europea 5.0 (Método EP 2.2.2, Grado de Coloración de Líquidos), para la confirmación de la asignación de color apropiada. Para las mediciones cuantitativas, la construcción de curvas de calibración es esencial, ya que la relación entre las propiedades ópticas de la suspensión y la concentración de la fase dispersada es, como máximo, semiempírica. La determinación de la opalescencia de líquidos coloreados se realiza con turbidímetros de relación o nefelometros con selección de relación, ya que el color proporciona una interferencia negativa, atenuando tanto la luz incidente como la diseminada y disminuyendo el valor de turbiedad. El efecto es tan grande incluso para muestras moderadamente coloreadas, que no pueden usarse nefelómetros convencionales. La evaluación instrumental de claridad y opalescencia proporciona un ensayo más discriminatorio que no depende de la agudeza visual del analista. Los resultados numéricos son más útiles para el monitoreo de la calidad y el control del proceso, en especial, en estudios de estabilidad. Por ejemplo, la información numérica previa sobre la estabilidad puede ser proyectada a fin de determinar si un lote determinado de formulación de dosificación o ingrediente activo farmacéutico excederá los límites de vida útil antes de la fecha de expiración.

Ensavo de HPLC.

La cromatografía líquida de alto rendimiento, también conocida como cromatografía líquida de alta presión, abreviada como HPLC (según su sigla en inglés), es una forma especial de cromatografía líquida, y actualmente, es utilizada con frecuencia en bioquímica y la química analítica. El analito es introducido a través de una columna de la fase estacionaria en un líquido (fase móvil) a alta presión, lo que disminuye el tiempo que los componentes separados permanecen en la fase estacionaria y, en consecuencia, el tiempo que tienen para difundirse dentro de la columna. Esto conduce a picos más estrechos en el cromatograma resultante, y en consecuencia, a la mejor resolución y sensibilidad, en comparación con la LC (cromatografía líquida, según su sigla en inglés). La fase móvil se selecciona de manera de garantizar la solubilidad de los solutos de la muestra. Para la fase estacionaria, preferentemente, se usa sílice en micropartículas (pura o químicamente modificada), ya que su alta área de superficie acentúa las diferencias en las interacciones de fase estacionaria-soluto. El uso de una fase estacionaria que ¡nteractúa fuertemente con solutos en relación con las interacciones de soluto-fase móvil logrará tiempos de retención muy largos, una situación que no es analíticamente útil. En consecuencia, la fase estacionaria debe seleccionarse de manera de proporcionar interacciones de solutos débiles a moderadas, en relación con aquellas en la fase móvil. Por lo tanto, la naturaleza del soluto gobierna el tipo de LC seleccionada. Las interacciones más fuertes deberán producirse en la fase móvil a fin de garantizar la solubilidad de la muestra y la fácil elución, mientras que la fase estacionaria debe ser sensible a diferencias más sutiles entre los solutos. Por ejemplo, los compuestos neutros polares son habitualmente mejor analizados usando una fase móvil polar junto con una fase estacionaria no polar, que distingue diferencias sutiles en el carácter dispersivo de los solutos. Uno de los aspectos poderosos de la HPLC es que la fase móvil puede variarse a fin de alterar el mecanismo de retención. Pueden agregarse modificadores a la fase móvil a fin de controlar la retención. Por ejemplo, el pH es una importante variable en las fases móviles acuosas.

La cromatografía de fase inversa (RP-HPLC) exige el uso de una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar (compuesta de uno o más de los solventes polares, por ejemplo, agua, metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano).

HPLC cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). Este método cromatográfico es bueno para el análisis de proteínas o bioconjugados de anticuerpo/proteína sobre la base de su hidrofobicidad. La teoría detrás de la cromatografía de interacción hidrófoba es que las proteínas se ligan a la resina mediante el empleo de una fase móvil de alta sal acuosa. Las condiciones salinas contribuyen a un efecto liotrópico que permite la unión de las proteínas a la cobertura de superficie inferior de un ligando hidrófobo. Las proteínas son eluidas mediante la simple técnica de la disminución de la concentración de sal. La mayoría de los blancos terapéuticos son eluidos en un regulador de bajo contenido salino, o sin sal. En consecuencia, el compuesto puede ser eluido en un entorno más polar y menos desnaturalizante. Por ejemplo, se ha utilizado la HIC exhaustivamente para el análisis de la carga de fármaco en conjugados de anticuerpo-fármaco o proteína-fármaco.

Ensayo de RMN.

La detección de resonancia magnética nuclear (RMN) se basa en el hecho de que ciertos núcleos con masas de números impares, que incluyen H y 13C, giran alrededor de un eje de una manera aleatoria. Sin embargo, cuando se colocan entre polos de un imán fuerte, los giros son alineados paralelos o antiparalelos al campo magnético, con la orientación paralela favorecida, ya que es levemente inferior en términos de energía. Los núcleos son entonces irradiados con radiación electromagnética, que es absorbida y coloca los núcleos paralelos en un estado de mayor energía; en consecuencia, están ahora en "resonancia" con la radiación. Cada H o C producirá diferentes espectros, de acuerdo con su ubicación y moléculas adyacentes, o los elementos en el compuesto, que todos los núcleos en las moléculas están rodeados por nubes de electrones que cambian el campo magnético circundante y, por lo tanto, alteran la frecuencia de absorción.

Espectrometría de masa.

La espectrometría de masa es una técnica analítica utilizada para medir la relación de masa a carga (m/z o m/q) de iones. Se usa con mayor frecuencia para analizar la composición de una muestra física mediante la generación de un espectro de masa que representa las masas de componentes de la muestra. La técnica posee varias aplicaciones, que incluyen la identificación de compuestos desconocidos por medio de la masa del compuesto y/o sus fragmentos, la determinación de la composición isotópica de uno o más elementos en un compuesto, la determinación de la estructura de los compuestos mediante la observación de la fragmentación del compuesto, la cuantificación de la cantidad de un compuesto en una muestra usando métodos cuidadosamente diseñados (la espectrometría de masa no es inherentemente cuantitativa), el estudio de los principios de la química de iones de la fase gaseosa (la química de iones y neutros en vacío), y la determinación de otras propiedades físicas, químicas, o incluso biológicas, de los compuestos con una variedad de otros enfoques.

Un espectrómetro de masa es un dispositivo empleado para la espectrometría de masa, que produce un espectro de masa de una muestra para el análisis de su composición. Esto se logra normalmente mediante la ionización de la muestra y la separación de iones de masas diferentes, y el registro de su abundancia relativa mediante la medición de las intensidades de flujo de iones. Un espectrómetro de masa típico comprende tres partes: una fuente de iones, un analizador de masa, y un detector.

La clase de fuente de iones es un factor contribuyente que afecta fuertemente los tipos de muestras que pueden ser analizados por medio de la espectrometría de masa. La ionización de electrones y la ionización química se usan para gases y vapores. En las fuentes de ionización química, el analito es ionizado mediante reacciones químicas de ion y molécula, durante las colisiones en la fuente. Dos técnicas utilizadas con frecuencia con muestras biológicas líquidas y sólidas incluyen la ionización de electropulverización (ESI, según su sigla en inglés) y la desorción/ionización de láser asistida por matriz (MALDI, según su sigla en inglés). Otras técnicas abarcan el bombardeo atómico veloz (FAB, según su sigla en inglés), la termopulverización, la ionización química de presión atmosférica (APCI, según su sigla en inglés), la espectrometría de masa iónica secundaria (SI S, según su sigla en inglés) y la ionización térmica.

Espectroscopia de UV.

La espectroscopia de ultravioleta visible o espectrofotometría de ultravioleta visible (UV-Vis o UV/Vis) se refiere a la espectroscopia de absorción o espectroscopia de reflexión en la región espectral de ultravioleta visible. Esto significa que utiliza luz en los rangos visibles y adyacentes (UV cercano e infrarrojo cercano (NIR, según su sigla en inglés)). La absorción o reflexión en el rango visible afecta directamente el color percibido de los productos químicos involucrados. En esta región del espectro electromagnético, las moléculas sufren transiciones electrónicas. Esta técnica es complementaria a la espectroscopia de fluorescencia, en términos de que la fluorescencia tratar con las transiciones del estado excitado al estado base, mientras que la absorción mide las transiciones del estado de base al estado excitado. Un espectrómetro de UV es un instrumento que utiliza un haz de luz de una fuente de luz visible y/o de luz UV (de color rojo), que es separada en sus longitudes de onda componentes por un prisma o una rejilla de difracción. Cada haz monocromático (longitud de onda única) es, a su vez, dividido en dos haces de igual intensidad por un dispositivo de medio espejo. Un haz, el haz de muestra (de color magenta), pasa a través de un pequeño recipiente transparente (probeta) que contiene una solución del compuesto estudiado en un solvente transparente. El otro haz, la referencia (de color azul), pasa a través de una probeta idéntica que contiene solo el solvente. Las intensidades de cada uno de estos haces de luz entonces se miden con detectores electrónicos, y se comparan. La intensidad del haz de referencia, que debería haber sufrido escasa o nula absorción de luz, se define como 10. La intensidad del haz de muestra se define como I. Durante un corto período de tiempo, el espectrómetro barre en forma automática todas las longitudes de onda componentes, de la manera descripta. La región ultravioleta (UV) barrida normalmente es de 200 a 400 nm, y la porción visible es de 400 a 800 nm.

IV. EJEMPLOS.

Los que siguen son ejemplos de métodos y composiciones de la invención.

Se entiende que pueden ponerse en práctica diversas formas de realización adicionales, dada la descripción general proporcionada con anterioridad.

Ejemplo 1. Detección de aducto.

Durante la fabricación de una proteína recombinada particular, se produjeron siete volúmenes filtrados para almacenamiento (FBS), donde se obtuvieron resultados típicos contra los criterios de apariencia del producto para cinco de los siete volúmenes. Conforme a la especificación de fabricación, las instrucciones de ensayo específicas de producto requieren el uso de la serie de color Amarillo (Y) para la evaluación de las muestras de producto por el ensayo COC, un método para la determinación de la claridad y el grado de opalescencia, el grado de coloración y la apariencia. Sin embargo, dos volúmenes (Operaciones 2 y 3) tuvieron una apariencia de color marrón, y no cumplieron con el criterio esperado de la serie de color Amarillo de = Y7 para el ensayo COC. Una comparación de los resultados del ensayo COC para las Operaciones 1-3 se muestra en la Figura 1. Con el objetivo de investigar adicionalmente la discrepancia, las siete muestras de FBS se concentraron a fin de aumentar la intensidad del color. Las muestras concentradas se compararon contra todas las soluciones de color Modelos que se citan en la Farmacopea de los Estados Unidos 2012 (USP Monografía 631 , Color y Acromicidad), o en la Farmacopea Europea 5.0 (Método EP 2.2.2, Grado de coloración de líquidos), para la confirmación de la asignación de color apropiada. Las muestras se compararon en luz de día difusa 5 min después de la preparación de la muestra de referencia, observando verticalmente contra un fondo negro. La difusión de luz debe ser tal que la muestra de referencia I pueda ser fácilmente distinguida de agua, y que la suspensión de referencia II pueda ser distinguida con facilidad de la suspensión de referencia I. Un líquido se consideró claro si su claridad era la misma que aquella de agua R o del solvente utilizado cuando se examinó en las condiciones descriptas anteriormente, o si su opalescencia no era más pronunciada que aquella de la muestra de referencia I.

Debido a que la causa de la coloración era desconocida para las Operaciones 2 y 3, se completaron múltiples estudios de investigación a fin de determinar la fuente y la causa del color marrón atípico. Las muestras de las Operaciones 1-3 se analizaron en términos de metales, oligoelementos (diferentes de metales) y cromóforos. Estos estudios sugirieron que la coloración observada en las Operaciones 2 y 3 no se debían a metales ni a otros oligoelementos (información no expuesta).

Con el objetivo de determinar si los cromóforos se asociaban con el color inesperado observado en el FBS, se analizaron las Operaciones 1 - 3 usando la espectroscopia de ultravioleta y visible (UV/vis) con una probeta de longitud de 1 cm de recorrido. Los espectros de UV (200 - 600 nm) no exhibieron ninguna diferencia significativa en el perfil de observancia para las muestras analizadas.

A fin de aumentar la sensibilidad del espectrofotómetro de UV, se repitió el experimento usando una probeta de 10 cm de longitud de recorrido. La probeta de 10 cm ofrece mayor sensibilidad respecto de la probeta de 1 cm, debido a que la absorbancia de una muestra es proporcional a la cantidad de moléculas absorbentes en el haz de luz del medidor del espectrofotómetro. Las muestras se barrieron entre 200 - 700 nm a fin de determinar el espectro de absorción de las Operaciones 1 - 3. La forma de los espectros para las Operaciones 2 y 3 fue diferente de aquella de la Operación 1: se observaron nuevos picos de absorbancia aproximadamente a 320 nm y a 460 nm, que no eran evidentes para la Operación 1 (Figura 2A). Esta diferencia puede observarse con mayor claridad cuando el espectro de la Operación 1 es sustraído del espectro de la Operación 3 (Figura 2B). El pico observado a 460 nm para las Operaciones 2 y 3 es consecuente con una huella de flavina (por ejemplo, vitamina).

Sobre la base de los resultados de UV/vis de 10 cm, se efectuó el análisis del espectro completo para RP-HPLC e IEC con opciones para la detección de MS en FBS, de las Operaciones 1 - 3.

Usando la detección de espectro completo para la RP-HPLC, no se observaron diferencias cromatográficas para las Operaciones 1-3 (información no expuesta). Sin embargo, para la IEC a 310 nm, se observaron diferencias menores. Tal como se expone en la Figura 3, se observa un leve pico detrás del pico principal para las Operaciones 2 y 3, mientras que el perfil para la Operación 1 es comparable con el material de referencia.

Se sometieron muestras intactas a la LC-MS 2D y se controlaron tanto a 280 como a 310 nm. El análisis 2D LC-MS consiste en dos partes - la primera dimensión es la separación por RP-HPLC, donde la segunda dimensión consiste en picos fraccionados para el análisis de espectrometría de masa. De este experimento, se observó la masa esperada para la Operación 1 , mientras que se observaron la masa esperada y una masa adicional de aproximadamente +157 Da para las Operaciones 2 y 3 (Figura 4).

Ejemplo 2. Elucidación del aducto.

A fin de mejor elucidar el aducto, se seleccionó la Operación 3 para la fraccionacion (se recogió el pico menor del ensayo IEC (Figura 3)) y se analizó adicionalmente por 2D-LC MS e identificación de masa mediante la cartografía péptida tríptica con detección de MS.

Del análisis 2D LC-MS (Figura 5), además de la masa esperada, se observó nuevamente un incremento de masa de aproximadamente +156 Da, para el pico saliente fraccionado. Con la reducción en línea (con DTT) de la muestra, se observó la masa reducida esperada. Los cuatro Daltones adicionales observados entre los análisis reducidos y nativos se deben a la descomposición de los enlaces de disulfuro y a la adición de cuatro hidrógenos. Se observó nuevamente masa adicional, lo que sugiere que la modificación era no reversible o covalente.

De la cartografía péptida tríptica, se recogió la muestra tanto a 214 nm como a 310 nm. Como se muestra en la Figura 6, los picos nuevos son aumentados en la región de 45-55 minutos. Se determinó que el análisis de LC-MS-MS del nuevo pico observado a 48,8 minutos a 310 nm era el péptido T20 con el residuo cisteína modificado con +154,006 Da. Se detectaron también péptidos modificados (en cisteína, +154,006 Da) y libres T6 y T16 por medio de la extracción de masa. No se detectaron T32 reducido o T21 modificado, si bien este hecho puede haberse debido a los bajos niveles presentes. Los otros dos picos observados que eluyeron entre 50 y 56 minutos a 310 nm no contenían ninguna especie única, en comparación con la referencia.

Se recogió el análisis 1 D y 2D 1H RMN a fin de determinar la estructura del aducto. Se adquirieron datos adicionales usando TOCSY (Espectroscopia de Correlación Total, según su sigla en inglés), HSQC (Coherencia Cuántica Única Heteronuclear, según su sigla en inglés), HMBC (Correlación de Enlace Múltiple Heteronuclear, según su sigla en inglés) y ROESY (Espectroscopia de Efecto Overhasuer de Marco Giratorio, según su sigla en inglés (nOe)).

TOCSY crea correlaciones entre todos los protones que se acoplan entre sí, al igual que todos los otros protones dentro de un sistema de giro determinado. El experimento de HSQC correlaciona los desplazamientos químicos de núcleos directamente ligados (es decir, dos tipos de núcleos químicos), mientras que el experimento de HMBC correlaciona los desplazamientos químicos de dos tipos de núcleos separados entre sí con dos o más enlaces químicos. ROESY utiliza nOe, que usa el espacio, no a través de enlaces químicos, para confirmar una conformación molecular precisa (es decir, la estructura tridimensional de una molécula). El péptido recogido observó acoplamiento 1 H-13C de largo rango entre protones aromáticos (quinona) y C = O a 182 ppm. Los desplazamientos químicos de 1H-13C HSQC para el péptido recogido en la región aromática coinciden cercanamente con aquellos observados para el compuesto modelo sintético ligado a naftaleno-1 ,4-diona. Los datos de TOCSY asignan las resonancias Q, V y R en el producto. La comparación de los datos de 1H-15N de HSQC del producto con un péptido sintético (NH2-IVQCR-COOH) mostró que faltaba una correlación de NH de Cys de la muestra de producto, como se muestra en la Figura 7. La estructura propuesta es confirmada por el fuerte nOe observado entre el CH de Cys y el NH de Arg (Figura 8). Sobre la base de los datos de RMN recogidos, se presenta la estructura propuesta en la Figura 9.

La identificación de las especies coloreadas como 1,4-dihidroxi-2-naftoato (DHNA), que formaba el aducto marrón-proteína recombinada se basó en MS, RMN y en los datos genéticos. La información de RMN confirmó que DHNA se unía a la proteína recombinada por medio de residuos cisteína. DHNA es un producto derivado de la vía de biosíntesis de menaquinona de células de E. coli (Figura 10). La menaquinona se presenta en E. coli, si bien su producción se incrementa cuando el cultivo se presenta en una condición anaeróbica y/o microaeróbica. La menaquinona se usa para el transporte de electrones en entornos de limitado oxígeno, y se utiliza para el retorno de la proteína formadora de enlace de disulfuro DsbB al estado oxidado activo en condiciones anaeróbicas (microaeróbicas).

Ejemplo 3. Proceso de Hi-dO para mitigar la formación de aducto de DHNA-producto.

Se desarrolló una estrategia de control a fin de evitar la generación de tioles libres de un producto, y la subsiguiente formación del aducto de DHNA-producto. Se determinó que la causa de la formación de color era el resultado de un entorno de baja redox (oxidación-reducción) durante las operaciones de cosecha; debido a que las Operaciones 2 y 3 exhibían las más altas valoraciones y densidades celulares, y se sometieron ambas a tiempos de mantenimiento más largos para sus homogenados diluidos, sostuvieron más largas duraciones para que los homogenados lograran una temperatura inferior al objetivo de 15°C y tuvieran tiempos e índices de mezcla de homogenado subóptimos (información no expuesta). Estos factores contribuyeron a la generación de un entorno de bajo oxígeno que favoreció la reducción de los enlaces de disulfuro del producto y permitió la oportunidad de la unión de DHNA a los tioles libres del producto de proteína.

Debido a que el aducto de DHNA-proteína se formó en el entorno de baja redox durante las operaciones de cosecha que condujeron a reducidos enlaces de disulfuro (es decir, tioles libres), se desarrolló un enfoque con la finalidad de evitar la generación de tioles libres y la formación del aducto de DHNA-producto. Este control de proceso mejorado, denominado Hi-dO, mantiene los niveles de oxígeno disuelto en las operaciones de cosecha a más de cero (>0%), de manera de eliminar el entorno reductor (es decir, no hay generación de tioles libres).

La formación del aducto de DHNA-producto es una compleja reacción biológica que requiere la combinación de múltiples eventos a través de las operaciones de fermentación y cosecha. El rendimiento del proceso de fermentación es la producción de considerables niveles y/o disponibilidad de DHNA. El esquema a continuación muestra las tres etapas principales de una operación de cosecha típica: etapa de posfermentación, una etapa de homogeneización, y luego, una etapa de poshomogeneización.

Caldo de cél. enteras Homogenado (WCB) Homogeneiza(HMG) Tanque ción mantenim.

Posfermentación Poshomogeneización Se evaluaron varias etapas de proceso de manera posfermentación/prehomogeneización, y se evaluaron luego en forma poshomogeneización, a fin de determinar si dichas acciones mitigaban el entorno reductor o la generación de tioles libres. Dichos mejoramientos de proceso evaluados se muestran en la Tabla 1 y en la Figura 12.

Tabla 1. Mejoramientos de proceso (Hi-dO).

Los resultados del mejoramiento del proceso reseñado en la Tabla 1 y en la Figura 12 se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Análisis de calidad de producto de operaciones de desarrollo efectuadas con los controles de proceso mejorados de Hi-dO Se llevó a cabo un análisis de causa raíz a fin de comprender los orígenes de la coloración marrón. Este análisis logró la identificación de la especie coloreada (DHNA), su unión a un producto de proteína recombinada, la estructura del aducto (DHNA-proteína), su origen y el mecanismo propuesto de la manera y el momento en que DHNA se une al producto durante el proceso de producción. Como resume la Tabla 1 , se implemento una estrategia de mitigación a fin de evitar la formación del aducto marrón, mediante el mantenimiento del nivel de oxígeno disuelto superior a cero (> 0%) durante todas las operaciones de cosecha, a fin de eliminar el entorno reductor y evitar la formación de tioles libres de producto. En consecuencia, como se muestra en los análisis de IEC, como el % de pico anómalo demostró ser 0%, la formación de aducto marrón no fue detectada en el FBS (Tabla 2).

Ejemplo 4: Generación de células huéspedes de E. coli con deleción del gen menE.

Además del proceso de cosecha de Hi-dO de la invención, se llevó a cabo otro enfoque con el objetivo de mitigar la formación de aducto marrón. Este enfoque involucró el diseño genético de la célula huésped procariota, de modo tal que el gen menE fuera deleteado del genoma, a fin de evitar la producción de cualquier intermediario de DHNA de la vía de biosíntesis de menaquinona que pudiera unirse al producto recombinado.

Las células huéspedes con deleción del gen menE se generaron como una muíante de noqueo (knockout: inactivación de genes específicos como modelo de enfermedad; una muíante individual donde se ha reemplazado un solo gen funcional por una forma no funcional del gen) de un solo gen en marco, siguiendo los méíodos descriplos en la referencia de Baba et al.., "Conslrucíion of E. coli K- 12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection", Molecular Systems Biology, vol. 21 , p. 1-10 (2006), incorporada en la presente solicitud a modo de referencia. El gen menE fue apuntado para la mutagénesis con productos de PCR que contenían un cásete de resistencia (tal como kanamicina) flanqueado por sitios blanco de reconocimiento de FLP (flipasa) y homologías de 50 pares de bases a las secuencias cromosómicas adyacentes.

La mutagénesis produjo aproximadamente 10-1000 colonias de resistencia a kanamicina, cuando las células huéspedes fueron incubadas en forma aeróbica a 37°C en agar de caldo de Luria-Bertani (LB) que contenía 30 µg/ml de kanamicina.

Ejemplo 5. Producción de proteínas recombinadas usando células huéspedes de E. coli con deleción del gen menE.

Se evaluó la capacidad de las células huéspedes de E. coli con deleción del gen menE para producir proteína recombinada que no exhibiera aducto de proteína asociado con DHNA. En síntesis, las células de E. coli con deleción del gen menE fueron transformadas con construcciones plásmidas que codificaban para dos proteínas recombinadas, PROT 1 y PROT 2, y dos anticuerpos recombinados, AB 1 y AB2, por técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en el campo (ver, por ejemplo, la referencia de Simmons et al.., "Expression of full— length immunoglobulins in E. coli: rapid and efficient production of aglycosylated anticuerpos", J. of Immunol. Methods, 263 pp. 133-147 (2002)). La fermentación de las cuatro proteínas recombinadas/anticuerpos procedió como se describe en la presente solicitud (ver, además, Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6.979.556, que se incorpora en la presente solicitud a modo de referencia).

El producto recombinado de volumen filtrado para las cuatro proteínas recombinadas/anticuerpos se evaluó a fin de establecer la formación de aducto de DHNA-proteína por medo del ensayo IEC a 310 nm, y no mostró formación detectable de aducto de DHNA-proteína (ver Figura 11 para los resultados ejemplares para PROT 1).

De manera sorprendente, se halló que el rendimiento de producto recombinado como consecuencia del uso de las células de El coli con deleción del gen menE incrementó en forma apreciable alrededor de 20% a 50%, en comparación con el rendimiento usando células huéspedes de E. coli con un gen de tipo silvestre intacto menE. La Tabla 3 muestra estos resultados.

Rendimientos de proteína recombinada usando células huéspedes con deleción del gen menE

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la producción de una proteína recombinada que comprende (a) la fermentación de una célula huésped procariota, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada, y (b) la cosecha de dicha proteína recombinada en condiciones donde los niveles de oxígeno disuelto (dOí) son superiores a 0%, y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un volumen filtrado para el almacenamiento (FBS), donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de 1 ,4-dihidroxi-2-naftoato (DHNA)-proteína recombinada, medida por un ensayo de cromatografía de intercambio iónico (IEC) a 310 nm.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicho ensayo analítico es HPLC, RP HPLC, HIC HPLC, RMN, espectrometría de masa o espectroscopia de UV.

3. El método de la reivindicación 1, donde dicho d02 se mantiene en niveles superiores a 0% en forma continua durante todas las operaciones de cosecha de la etapa (b).

4. El método de la reivindicación 3, donde las operaciones de cosecha comprenden una etapa de homogeneización.

5. El método de la reivindicación 4, donde dicho d02 se mantiene a alrededor de 30% a alrededor de 75% antes de la homogeneización.

6. El método de la reivindicación 4, donde dicho d02 se mantiene en niveles superiores a 75% antes de la homogeneización.

7. El método de la reivindicación 4 o 5, donde dicho d02 se mantiene a alrededor de 50% después de la homogeneización.

8. El método de la reivindicación 4 o 5, donde dicho d02 se mantiene en niveles superiores a 50% después de la homogeneización.

9. El método de la reivindicación 5, donde dicho d02 se mantiene durante un período superior o igual a 1 ,5 horas.

10. El método de la reivindicación 6, donde dicho d02 se mantiene durante un período superior o igual a 2 horas.

11. El método de la reivindicación 1 , donde dicho d02 se mantiene con aire extendido o rociado, con mayor presión inversa, o con índice de agitación.

12. El método de la reivindicación 11 , donde el aire extendido es de alrededor de 0,4 wm a alrededor de 0,8 wm.

13. El método de la reivindicación 12, donde el aire extendido es dirigido a 0,6 wm.

14. El método de la reivindicación 11 , donde la mayor presión inversa es entre alrededor de 6,8 y alrededor de 206,8 kPa (alrededor de 1,0 y alrededor de 30 psi).

15. El método de la reivindicación 14, donde la mayor presión inversa es dirigida a 131 kPa (19 psi).

16. El método de la reivindicación 11, donde el índice de agitación es de alrededor de 6 vatios/l a alrededor de 8 vatios/l.

17. El método de la reivindicación 16, donde el índice de agitación es dirigido a alrededor de 6 vatios/l.

18. Un método para la producción de una proteína recombinada que comprende (a) la fermentación de una célula huésped procariota con deleción del gen menE, donde dicha célula huésped procariota ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica dicha proteína recombinada, (b) la cosecha de dicha proteína recombinada; y (c) la purificación de dicha proteína recombinada hasta un FBS, donde dicho volumen filtrado no contiene una cantidad detectable de aducto de 1,4-dihidrox¡-2-naftoato (DHNA)-proteína recombinada, medida por un ensayo de cromatografía de intercambio iónico (IEC) a 310 nm.

19. El método de la reivindicación 18, donde el rendimiento de proteína recombinada se incrementa alrededor de 20% o más, alrededor de 30% o más, alrededor de 40% o más, alrededor de 50% o más, alrededor de 60% o más, en comparación con el rendimiento usando una célula huésped procariota de control.

20. El método de las reivindicaciones 1-19, donde la fermentación es independiente de la escala.

21. El método de la reivindicación 1 o 18, donde dicha proteína recombinada es un polipéptido recombinado o un anticuerpo aislado.

22. El método de la reivindicación 1 o 18, donde dicha célula huésped procariota es Escherichia coli (E. coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla y Paracoccus.